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特表2024-527810ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質スキャフォールド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質スキャフォールド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240719BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240719BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240719BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240719BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240719BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240719BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20240719BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20240719BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C40B40/10 ZNA
C12N1/15
C12N1/21
C12N1/19
C12N5/10
C07K14/78
A61K38/39
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503371
(86)(22)【出願日】2022-07-19
(85)【翻訳文提出日】2024-02-15
(86)【国際出願番号】 US2022037586
(87)【国際公開番号】W WO2023003874
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/203,343
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522149186
【氏名又は名称】アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ロナルド・ヴィー・スワンソン
(72)【発明者】
【氏名】ジャンナ・ドルジーナ
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ・シン
(72)【発明者】
【氏名】カリン・オニール
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065CA60
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA23
4C084DA40
4H045AA10
4H045BA21
4H045CA40
4H045EA60
(57)【要約】
代替結合表面設計を有するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに基づくタンパク質スキャフォールドおよびスキャフォールドライブラリー、タンパク質スキャフォールドをコードする単離核酸、ベクター、宿主細胞、それらを作製する方法、ならびに疾患および障害の処置ならびに診断のための治療分子としての使用。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖を含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有する複数のフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメイン（ポリペプチド）を含むライブラリーであって、ポリペプチドは、下記：ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列または配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含み、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である、ライブラリー。
【請求項2】
Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項3】
ポリペプチドは、多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖のうちの１つもしくはそれ以上、またはそのそれぞれにおいて配列番号２４と比較した場合に少なくとも１つの突然変異アミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載のライブラリー。
【請求項4】
複数のポリペプチドは、配列番号２４の３２、３４、３６、３８、３９、４０、４１、４６、４８、６８、７０、７２、７８、７９、８１、８５、および／または８７位に相当する位置に１つまたはそれ以上の突然変異（例えば、置換、挿入、または欠失）を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項5】
多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～４のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項6】
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項7】
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項8】
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項9】
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項10】
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１～９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項11】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項12】
多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、
請求項１～１１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のライブラリーを生産する方法であって、複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することを含む方法。
【請求項14】
Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖の多様化された１つもしくはそれ以上、またはそれぞれを含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのフィブロネクチンモジュールのライブラリーを作製する方法であって、ａ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；
ｂ．多様化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ領域、Ｆベータ鎖領域、ＦＧループ領域、またはＧベータ鎖領域において少なくとも１つの残基を突然変異させることによって、参照ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入すること
とを含み、ここで：
多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、
方法。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載の方法によって生産されたライブラリー。
【請求項16】
標的分子に結合するか、または特異的に結合する多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含むポリペプチドを得る方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載のライブラリーを標的分子と接触させることと、標的分子に結合するか、または特異的に結合するポリペプチドを単離することとを含む方法。
【請求項17】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項18】
下記：ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
【請求項19】
Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項20】
下記：ＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号７４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
【請求項21】
Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項22】
請求項１７～２１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項23】
請求項２２に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項24】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチドのライブラリーをコードする複数の核酸分子。
【請求項25】
請求項２４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２０３，３４３号の優先権を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２０３，３４３号の優先権を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【0002】
本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン分子ならびに当該分子を作製する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
モノクローナル抗体は、標的分子に対する高い親和性および特異性が望ましい場合に、最も広く使用される種類の治療用タンパク質である。しかしながら、一般にタンパク質スキャフォールドと称される所望の標的分子を結合するよう操作することができる比較的明確な三次元構造を有する非抗体タンパク質は、それらの小さなサイズ、ジスルフィド結合の欠如、高い安定性、および原核生物宿主において発現される能力に起因して、伝統的な抗体を上回る利点を有する場合がある。これらのスキャフォールドは通常、特異的または無作為な配列変異に適している１つまたはそれ以上の領域を含有し、そのような配列無作為化は多くの場合、所望の産物が選択されるタンパク質のライブラリーを生産するために実行される。新規精製方法が容易に適用される；スキャフォールドは、薬物／毒素に容易にコンジュゲートされ、効率的に組織に浸透し、多特異的結合剤へとフォーマットされる（非特許文献１；非特許文献２）。
【0004】
そのようなタンパク質スキャフォールドの１つは、７つのベータ鎖によって結合された６つのループを有する特徴的な三次構造を有する、多数のタンパク質において同定されているフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。３つのループ、特にＦＧ、ＢＣ、およびＤＥループは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造的に類似している。これらのループは、重要な生物物理学的特性を保持しながら、多くの異なる標的に対する特異的結合剤を首尾よく選択するＦＮ３ドメインスキャフォールドのライブラリーを生成するよう無作為化されてきた（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】ＢｉｎｚおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６、４５９～４６９頁、２００５
【非特許文献2】Ｓｋｅｒｒａ、Ｊ Ｍａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、１３、１６７～１８７頁、２０００
【非特許文献3】Ｇｅｔｍａｎｏｖら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、１３、５４９～５５６頁、２００６
【非特許文献4】Ｈａｃｋｅｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１、１２３８～１２５２頁、２００８
【非特許文献5】Ｋａｒａｔａｎら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、１１、８３５～８４４頁、２００４
【非特許文献6】Ｋｏｉｄｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２８４、１１４１～１１５１頁、１９９８
【非特許文献7】Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ、１０４、６６３２～６６３７頁、２００７
【非特許文献8】Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ、１８、４３５～４４４頁、２００５
【非特許文献9】Ｘｕら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、９３３～９４２頁、２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
標的分子に結合することによって、オリゴヌクレオチドベースの治療薬のような治療薬の送達を容易にすることができるか、または直接的な治療効果を有するターゲティング部分として使用することができる代替結合ドメインが必要とされる。本開示は、そのような改善されたタンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一部の実施形態では、複数のフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメイン（ポリペプチド）を含むライブラリーが提供され、ライブラリーは、多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖を含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有し、ここで、ポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含み；ここで、複数のポリペプチドは、多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖のうちの１つもしくはそれ以上、またはそのそれぞれにおいて配列番号２４と比較した場合に少なくとも１つの突然変異アミノ酸残基を含む。
【0008】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリーを生産する方法が提供される。
【0009】
一部の実施形態では、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを作製する方法が提供され、ここで、ライブラリーは、Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖のうちの多様化された１つもしくはそれ以上、またはそのそれぞれを含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を含み、当該方法は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、または９０％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するヒトＦＮ３ドメインライブラリーを形成するように下記ドメイン：Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖残基のいずれか１つの少なくとも１つの残基を突然変異させることによって、参照ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入することとを含む。
【0010】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生産されたライブラリーが提供される。
【0011】
一部の実施形態では、標的分子に特異的に結合する多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するヒトフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含むタンパク質スキャフォールドを得る方法が提供され、当該方法は、ライブラリーを標的分子と接触させるか、またはパニングすることと、既定の親和性を有する標的分子に特異的に結合するタンパク質スキャフォールドを単離することとを含む。
【0012】
一部の実施形態では、標的分子に結合するか、または特異的に結合する多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含むポリペプチドを得る方法が提供され、当該方法は、本明細書に開示されるライブラリーを標的分子と接触させるか、またはパニングする（スクリーニングする）ことと、標的分子に結合するか、または特異的に結合するポリペプチドを単離することとを含む。
【発明を実施するための形態】
【0013】
「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）という用語は本明細書で使用される場合、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体および原核生物酵素を含むタンパク質において高頻度で出現するドメインを指す（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０～８９９４頁、１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０～１９１８頁、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９～１５６６５頁、１９９０）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、および例えば米国特許第８，２７８，４１９号に記載されるような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号およびタンパク質名、例えば、テネイシンの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）で言及される。
【0014】
「代替表面」という用語は本明細書で使用する場合、１つまたはそれ以上のベータ鎖、および１つまたはそれ以上のループを含むＦＮ３ドメインの側面上の表面を指す。一部の実施形態では、代替表面は、Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖におけるアミノ酸によって形成されるＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ表面である。一部の実施形態では、代替表面は、多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖を含む。
【0015】
「生体サンプル」という用語は、血液、組織、骨髄、痰などを指す。
【0016】
「診断試薬」という用語は、物質が単一物質として、または診断キット中の他の物質と組み合わせて分配されていようとされていないとに関わらず、生体サンプルを分析するために使用される任意の物質を指す。
【0017】
「置換すること」もしくは「置換された」または「突然変異させること」または「突然変異された」という用語は本明細書で使用される場合、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列中の１つもしくはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドを変更、欠失、または挿入して、当該配列のバリアントを生成することを指す。
【0018】
「無作為化すること」もしくは「無作為化された」または「多様化された」もしくは「多様化すること」という用語は本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列中で少なくとも１つの置換、挿入または欠失を行うことを指す。
【0019】
「バリアント」という用語は本明細書で使用される場合、１つまたはそれ以上の改変、例えば、置換、挿入もしくは欠失によって参照ポリペプチドもしくは参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【0020】
「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語は本明細書中で使用される場合、約１×１０－６Ｍもしくはそれ未満、例えば約１×１０－７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－９Ｍ以下もしくはそれ未満、約１×１０－１０Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－１１Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－１２Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０－１３Ｍもしくはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で所定の抗原に結合する本明細書に記載されるＦＮ３ドメインの能力を指す。通常、ＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用した表面プラズモン共鳴によって測定される場合、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡまたはカゼイン）に関するＫＤよりも少なくとも１０倍小さいＫＤを有する所定の抗原（即ち、ヒトＰＳＭＡ）に結合する。しかしながら、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインは、他の関連抗原に対して、例えば、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル、ｃｙｎｏ）またはパン・トログロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（チンパンジー）のような他の種（相同体）由来の同じ所定の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。
【0021】
「標的分子」という用語は本明細書で使用される場合、ＦＮ３ドメインによって認識される抗原またはエピトープを有するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質などを指す。標的分子は、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。
【0022】
「エピトープ」という用語は本明細書で使用される場合、ＦＮ３ドメインが特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または多糖側鎖のような部分の化学的に活性な（極性、無極性または疎水性のような）表面集団からなり、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する可能性がある。エピトープは、コンフォメーション空間単位を形成する連続的および／または不連続的なアミノ酸で構成される。不連続的なエピトープに関して、抗原の直鎖状配列の異なる部分由来のアミノ酸は、タンパク質分子のフォールディングを介して三次元空間で極めて近接するようになる。
【0023】
「ライブラリー」という用語は、バリアントの一群を指す。ライブラリーは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのバリアントで構成される。
【0024】
「安定性」という用語は本明細書で使用される場合、分子の、その正常な機能的活性の少なくとも１つを保持するように生理学的条件下でフォールディングされた状態、例えば所定の抗原への結合を維持する能力を指す。
【0025】
「Ｔｅｎｃｏｎ」は本明細書で使用される場合、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記載される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
【0026】
「テネイシンＣ」という用語は本明細書で使用される場合、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿００２１５１に示される配列を有するヒトテネイシンＣを指す。テネイシンＣは１５個のタンデムＦＮ３ドメインを有する。
【0027】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」は本明細書で使用される場合、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴わない自発的なまたは誘発された表現型変化を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、および組織培養のいずれかでのがん性、前がん性または形質転換細胞を指す。形質転換は、形質転換性ウイルスによる感染および新たなゲノム核酸の組み入れ、または外因性核酸の取り込みから起こる場合があるが、形質転換はまた、自発的にまたは発癌性物質への曝露後に起こる可能性があり、それにより内因性遺伝子を突然変異させる。形質転換／がんは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏでのヌードマウスのような適切な動物宿主における形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣形成、増殖、悪性腫瘍、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、腫瘍成長または抑制などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版．１９９４））。
【0028】
「成長を阻害する」（例えば、腫瘍細胞のような細胞に言及する）は、当業者に周知の適切な対照条件において成長させた同じ細胞の成長と比較した場合に、治療薬または治療薬もしくは薬物の組合せと接触された場合のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞成長の測定可能な減少を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の成長の阻害は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％であってもよい。細胞成長の阻害は、さまざまなメカニズムによって、例えばアポトーシス、壊死によって、または細胞増殖の阻害、もしくは細胞の溶解によって起こる可能性がある。
【0029】
「ベクター」という用語は、生物系内で複製されることが可能な、またはそのような系間で移動することができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは通常、生物系におけるこれらのポリヌクレオチドの複製もしくは維持を促進するよう機能する複製起点、ポリアデニル化シグナルまたは選択マーカーのようなエレメントを含有する。そのような生物系の例として、細胞、ウイルス、動物、植物、およびベクターを複製することが可能な生物学的成分を利用して再構成された生物系が挙げられる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはこれらのハイブリッドであってもよい。
【0030】
「発現ベクター」という用語は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系においてまたは再構成された生物学的系において利用されるベクターを意味する。
【0031】
「ポリヌクレオチド」という用語は、糖－リン酸骨格または他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチドの鎖を含む分子を意味する。二本鎖および一本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡは、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
【0032】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のアミノ酸の小さなポリペプチドは、「ペプチド」と称される。
【0033】
「と組み合わせて」という用語は本明細書で使用される場合、２つまたはそれ以上の治療薬を混合物中で一緒に対象に、投与し、単一薬剤として同時に、または任意の順序で単一薬剤として順次、投与することができることを意味する。
【0034】
「異種」という用語は、記載されるポリペプチドが、異なる細胞型または異なる種に由来しており、天然では存在しないことを意味する。
【0035】
本実施形態は、標的分子に特異的に結合するＦＮ３ドメインを提供し、したがって、治療用途および診断用途において広く使用することができる。ＦＮ３ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のベータ鎖および１つまたはそれ以上のループを含むドメインを有し、それらは無作為化されてタンパク質スキャフォールドを生成し、高親和性を有する標的分子を特異的に結合するタンパク質スキャフォールドを選択することができる。公開されたＦＮ３ベースのドメインライブラリーは、抗体可変鎖におけるＣＤＲに構造的に類似した領域である上部または下部のループを多様化し、曲線状の結合表面を提供することによって生成された。対照的に、高親和性結合分子は、参照配列に基づいて本明細書に提供されるように代替表面を無作為化することによって生成される凹面相互作用表面を示す、本明細書に提供されるＦＮ３ドメインライブラリーから選択することができる。これは、例えば、高親和性結合タンパク質スキャフォールドが選択されるエピトープおよび標的の数を増加させるために行うことができる。一部の実施形態では、タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドまたはその相補核酸、ベクター、宿主細胞、ならびにそれらを作製する方法および使用する方法が提供される。本実施形態はまた、本明細書で提供されるようなＦＮ３ドメインのライブラリー作製する方法、および前述で作製されたライブラリーを提供する。
【0036】
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン（またはモジュール）は、フィブロネクチンにおいて最初に同定され、現在では細胞表面受容体、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、筋肉タンパク質を含むさまざまな動物タンパク質ファミリー中に存在することが知られているプロトタイプ繰り返しドメインである。構造的に、ＦＮ３ドメインは、ジスルフィド結合の欠如を除いて、免疫グロブリン様ドメインのトポロジーと非常に類似したトポロジーを有する。当該技術分野において公知であるように、天然に存在するＦＮ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと称される、６つのループによって連結されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと称される７つのベータ鎖を有するベータサンドイッチ構造を有する（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９、８９９０～８９９２頁、１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。３つのループ、ＢＣ、ＤＥ、ＦＧループは、ＦＮ３ドメインの上部に存在し、３つの、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、ドメインの下部に存在する。ＦＮ３ドメインのコンフォメーションが高度に保存されるのに対して、アミノ酸レベルでの異なるドメイン間の類似性は非常に低い。ＦＮ３ドメインは、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。例示的な天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ある特定のタンパク質中に存在する選択されたＦＮ３ドメインのアライメントに基づいて設計され、天然に存在しないＦＮ３ドメインを生成するように各位置にて最も保存された（高頻度の）アミノ酸を取り込んでいるコンセンサスＦＮ３ドメインである。例えば、天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいて、またはヒトフィブロネクチン由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいて設計される。これらの天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインの典型的なトポロジーを保持し、野生型ＦＮ３ドメインと比較した場合、安定性の改善のような改善された特性を示すことができる。例示的な天然に存在しないＦＮ３ドメインは、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号および米国特許出願公開第２０１０／０２５５０５６号に記載されるＴｅｎｃｏｎおよびＦｉｂｃｏｎドメインである。しかしながら、結合性分子の改善は依然として必要とされる。
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン（またはモジュール）は、フィブロネクチンにおいて最初に同定され、現在では細胞表面受容体、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、筋肉タンパク質を含むさまざまな動物タンパク質ファミリー中に存在することが知られているプロトタイプ繰り返しドメインである。構造的に、ＦＮ３ドメインは、ジスルフィド結合の欠如を除いて、免疫グロブリン様ドメインのトポロジーと非常に類似したトポロジーを有する。当該技術分野において公知であるように、天然に存在するＦＮ３ドメインは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと称される、６つのループによって連結されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと称される７つのベータ鎖を有するベータサンドイッチ構造を有する（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９、８９９０～８９９２頁、１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。３つのループ、ＢＣ、ＤＥ、ＦＧループは、ＦＮ３ドメインの上部に存在し、３つの、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、ドメインの下部に存在する。ＦＮ３ドメインのコンフォメーションが高度に保存されるのに対して、アミノ酸レベルでの異なるドメイン間の類似性は非常に低い。ＦＮ３ドメインは、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。例示的な天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ある特定のタンパク質中に存在する選択されたＦＮ３ドメインのアライメントに基づいて設計され、天然に存在しないＦＮ３ドメインを生成するように各位置にて最も保存された（高頻度の）アミノ酸を取り込んでいるコンセンサスＦＮ３ドメインである。例えば、天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいて、またはヒトフィブロネクチン由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいて設計される。これらの天然に存在しないＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインの典型的なトポロジーを保持し、野生型ＦＮ３ドメインと比較した場合、安定性の改善のような改善された特性を示すことができる。例示的な天然に存在しないＦＮ３ドメインは、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号および米国特許出願公開第２０１０／０２５５０５６号に記載されるＴｅｎｃｏｎおよびＦｉｂｃｏｎドメインである。しかしながら、結合性分子の改善は依然として必要とされる。
【0037】
各ループおよび各ベータ鎖を規定するアミノ酸残基は、本明細書に記載されるＦＮ３スキャフォールドについて表１に示されている。各ドメイン／領域について以下に示される残基は、２つの配列をアラインすることによって別の配列について決定することができ、一方は配列番号４４の参照配列であり、他方はクエリー配列である。例えばＢｌａｓｔｐ（ＮＢＣＩ社から入手可能）を使用してアラインして、デフォルト設定を使用して２つの配列をアラインすることができる。
【0038】
【表1】
【0039】
ライブラリーまたは別の配列を作成するためのＦＮ３ドメインにおける可変性は、下記領域：Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖のうちの１つまたはそれ以上で行うことができ、それらは、「Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面」と称される。
【0040】
この代替表面は、特定位置におけるコンセンサス配列および突然変異残基に基づいて多様化されて、細胞表面タンパク質または受容体または他の標的分子のような標的部分を結合するために使用することができるポリペプチドのライブラリーを生成することができる。一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４４：
【化1】
【0041】
のコンセンサス配列に基づく複数のタンパク質を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0042】
一部の実施形態では、配列番号４４の先頭のメチオニンは除去することができる。したがって、一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号７４：
ＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号７４）
のコンセンサス配列に基づく複数のタンパク質を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
ＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号７４）
のコンセンサス配列に基づく複数のタンパク質を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0043】
ＦＮ３ドメインにおける本明細書に記載することができる代替表面は、各ＦＮ３ドメインにおける非連続的な一続きのアミノ酸によってコードされる。例えば、Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ表面は、配列番号４４のアミノ酸残基２９～３７、３８～４３、４４～５０、６５～７４、７５～８０、および８１～９０によって形成され、例えば表２に示される通りである。一部の実施形態では、Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ表面は、配列番号４４のアミノ酸残基２９～３７、３８～４３、４４～５０、６５～７４、７５～８０、および８１～９０を含む。
【0044】
一部の実施形態では、ポリペプチドが本明細書に提供され、ポリペプチドは配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号４４におけるＸはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、配列番号４４のＸはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0045】
一部の実施形態では、ポリペプチドが本明細書に提供され、ポリペプチドは配列番号７４のアミノ酸配列を含み、ここで配列番号７４におけるＸはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、配列番号７４のＸはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0046】
代替表面の無作為化に基づくタンパク質スキャフォールド
一部の実施形態では、代替表面を含むＦＮ３ドメインを含む単離タンパク質スキャフォールドが提供され、ここで、代替表面は、代替表面を形成するＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面の領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、代替表面を含むＦＮ３ドメインを含む単離タンパク質スキャフォールドが提供され、ここで、代替表面は、代替表面を形成するＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面の領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
【0047】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるタンパク質または複数のタンパク質を含む。
【0048】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0049】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＩＶＥＹＲＥＫＤＧＳＧＥＷＫＥＶＴＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＦＲＶＲＡＶＮＧＡＧＥＧＰＰＳＱＳＶＴＶＴＴ（配列番号２４）
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＩＶＥＹＲＥＫＤＧＳＧＥＷＫＥＶＴＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＦＲＶＲＡＶＮＧＡＧＥＧＰＰＳＱＳＶＴＶＴＴ（配列番号２４）
【0050】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２４の３２、３４、３６、３８、３９、４０、４１、４６、４８、６８、７０、７２、７８、７９、８１、８５、および／または８７位に１つまたはそれ以上の置換を有するアミノ酸配列を含む。これらの位置は、新たなＦＮ３ポリペプチドまたはポリペプチドのライブラリーを作成するよう突然変異させることができる、以下の表２に示されるようなドメインに相当する。
【0051】
一部の実施形態では、タンパク質スキャフォールドまたはライブラリーは、Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖によって形成されるＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を含む。一部の実施形態では、タンパク質スキャフォールドまたはライブラリーは、Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、およびＧベータ鎖を含むＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を含む。一部の実施形態では、タンパク質スキャフォールドまたはライブラリーは、多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、および／またはベータ鎖を含むＣ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を含む。
【0052】
一部の実施形態では、Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を形成するＣベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖は、表２におよび配列番号４５～４８に示されるようなある特定のアミノ酸配列を含む。
【0053】
【表2】
【0054】
ここで、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0055】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、２、または３つの残基にて置換を有するアミノ酸配列ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）を有するＣベータ鎖を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0056】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、２、３、または４つの残基にて置換を有するＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有するＣＤループを含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0057】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、または２つの残基にて置換を有するアミノ酸配列ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）を有するＤベータ鎖を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0058】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、２、または３つの残基にて置換を有するアミノ酸配列ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）を有するＦベータ鎖を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0059】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、または２つの残基にて置換を有するアミノ酸配列ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）を有するＦＧループを含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0060】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１、２、または３つの残基にて置換を有するアミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有するＦベータ鎖を含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0061】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）、およびＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）の配列を含む複数のポリペプチドを含み、ここで、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0062】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0063】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0064】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0065】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0066】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号５の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0067】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号６の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0068】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号７の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0069】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号８の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0070】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号９の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0071】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１０の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0072】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１１の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0073】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１２の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0074】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１３の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0075】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１４の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0076】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１５の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0077】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１６の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0078】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１７の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0079】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１８の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0080】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１９の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0081】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２０の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0082】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２１の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0083】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２２の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0084】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２３の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0085】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２４の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0086】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２５の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0087】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２６の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0088】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２７の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0089】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２８の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0090】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号２９の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0091】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３０の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0092】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３１の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0093】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３２の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0094】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３３の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0095】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３４の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0096】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３５の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0097】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３６の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0098】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３７の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0099】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３８の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0100】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３９の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0101】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４０の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0102】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４１の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0103】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４２の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0104】
一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号４３の配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、もしくはそれと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む。
【0105】
一部の実施形態では、ポリペプチドが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
【0106】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるコンセンサスまたは参照配列に基づく得られたＦＮ３ドメインは、例えば、安定性の改善、免疫原性の低減、結合親和性、オンレート、オフレート、半減期、溶解度、または任意の他の適切な特性の増強を目的として、本明細書に提供されるもののような代替表面の外側またはその内部に存在する残基にてさらに改変することができる。この目標を達成する方法の１つにおいて、スキャフォールドタンパク質は、親配列および操作された配列の三次元モデルを使用して、親配列およびさまざまな概念操作された産物の分析のプロセスによって場合により製造することができる。三次元モデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補配列の可能性の高い三次元立体構造を図示および表示し、また考え得る免疫原性を測定することができるコンピュータプログラムが利用可能である（例えば、カリフォルニア州モンロビアのＸｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）。これらの表示の検査により、候補配列の機能における残基、例えば、スキャフォールドタンパク質の安定性または候補スキャフォールドタンパク質がその標的分子を結合する能力に影響を及ぼす残基の見込みある役割の分析が可能となる。このようにして、残基を親配列および参照配列から選択して、組み合わせることができ、その結果、スキャフォールド安定性の改善のような所望の特性が達成される。あるいは、または上記の手順に加えて、当該技術分野で公知であるように、他の適切な操作方法を使用することができる。
【0107】
ＦＮ３ドメインの望ましい物理的特性として、高い熱安定性ならびに熱的フォールディングおよびアンフォールディングの可逆性が挙げられる。非常に類似した熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、アルファヘリックス傾向を高めるための突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変更、指向性進化、およびコンセンサス配列の構成を含むいくつかの方法が、タンパク質および酵素の見かけの熱安定性を高めるのに適用されてきた（ＬｅｈｍａｎｎおよびＷｙｓｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２、３７１～３７５頁、２００１）。高い熱安定性は、発現されるタンパク質の収量を高め、溶解度または活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小限に抑える可能性がある。
【0108】
ＦＮ３ドメインの任意の特性を改善するよう置換することができる残基は、置換を行うことと、スキャフォールドの所望の特性についてアッセイすることとによって決定することができる。
【0109】
安定性の損失の観点から、即ち、タンパク質を「変性すること」または「変性」は、タンパク質の機能的特性を付与する三次元コンフォメーションの一部または全てが、活性および／または溶解度の付随する損失とともに損失されたプロセスを意味する。変性中に破壊される力として、分子内結合、例えば、静電力、疎水性力、ファンデルワールス力、水素結合、およびジスルフィドが挙げられる。タンパク質変性は、機械力（例えば、圧縮力またはせん断力）、熱的ストレス、浸透圧ストレス、ｐＨの変化、電場もしくは磁場、電離放射線、紫外線照射および脱水のようなタンパク質またはタンパク質を含む溶液に引加された力によって、ならびに化学的変性剤によって引き起こされる。
【0110】
タンパク質の安定性およびタンパク質の不安定性の測定は、タンパク質の完全性の同じか、または異なる側面とみなすことができる。タンパク質は、熱によって、紫外線または電離放射線、液体溶液中の場合には周囲モル浸透圧濃度およびｐＨの変化、小さな孔径の濾過によって課せられる機械的せん断力、紫外線照射、ガンマ線照射によるような電離放射線、化学的もしくは熱脱水、またはタンパク質構造崩壊を引き起こす可能性がある任意の他の作用もしくは力によって引き起こされる変性に対して感受性が高いか、または「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を使用して決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を使用して、分子の１／２がアンフォールディングされるようになる摂氏温度（℃）の温度である熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することによって決定することができる。通常、ＴＭが高いほど、分子はより安定である。熱に加えて、化学的環境もまた、タンパク質の、特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。
【0111】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＴＭの増加によって測定された操作前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれ以上増加された安定性を示す。
【0112】
同様に、化学的変性はさまざまな方法によって測定することができる。化学的変性剤として、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ベータ－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、および水素化ホウ素ナトリウムのような水素化物）、非イオン性およびイオン性界面活性剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、および標的変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子を結合する能力のような機能的特性の損失に、または凝集への傾向、以前は溶媒が到達しにくい残基の露出、もしくはジスルフィド結合の崩壊もしくは形成のような物理化学的特性に依存する可能性がある。
【0113】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、グアニジン塩酸塩を化学的変性剤として使用することによって測定された操作前の同じスキャフォールドと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれ以上増加された安定性を示す。安定性の増加は、周知の方法を使用してグアニジン塩酸塩の濃度の増加に伴う処置時のトリプトファン蛍光の減少の関数として測定することができる。
【0114】
本明細書に記載されるＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、もしくは多量体として、例えば、標的分子結合の結合価およびしたがってアビディティを高める手段として、または２つもしくはそれ以上の異なる標的分子を同時に結合する二重もしくは多重特異的スキャフォールドを生成するために生成される。二量体および多量体は、単一特異的、二重または多重特異的タンパク質スキャフォールドを連結することによって、例えば、アミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシンおよびセリン、またはアラニンおよびプロリンを含有するリンカーを含むことによって生成される。ポリペプチドを新規の連結融合ポリペプチドに結合するための天然に存在するペプチドリンカーならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知されている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４、５２６０～５２６８頁、１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５～７３１頁、９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、１０９～１１６頁、１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
【0115】
ＦＮ３ドメインは、二重特異的分子として使用され、ここで、ドメインにおける第１の代替表面は、第１の標的分子に対して特異性を有し、同じドメインにおける第２の代替表面は、第２の標的分子に対して特異性を有する。
【0116】
ＦＮ３ドメインは、例えば共有結合的相互作用を介して他のサブユニットを取り込む可能性がある。抗体定常領域の全てまたは一部をＦＮ３ドメインに結合させて、抗体様特性、特にＦｅ領域に関連する特性、例えば補体活性、半減期などを付与する可能性がある。例えば、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｅ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどのＦｅエフェクター機能は、これらの活性に関与するＦｅにおける残基を改変することによって提供および／または制御することができる（概説に関して；Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６８５～６９１頁、２００９を参照）。
【0117】
所望の特性のために毒素コンジュゲート、アルブミンまたはアルブミン結合剤、ＰＥＧ５０００もしくはＰＥＧ２０，０００のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類または多糖類）のようなさらなる部分を、ＦＮ３ドメインに組み入れられるか、またはそれらとコンジュゲートされる。これらの部分は、タンパク質コード配列との直接的な融合体であってもよく、標準的なクローニングおよび発現技法によって生成される。あるいは、周知の化学的カップリング方法を使用して、本明細書に記載されるＦＮ３ドメインを組換え的に生産するための部分を結合させてもよい。一部の実施形態では、ＦＮ３は、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ＰＭＯなどのような核酸分子とコンジュゲートされる。
【0118】
さらなる部分を組み入れたＦＮ３ドメインは、いくつかの周知のアッセイによって機能性について比較される。例えば、Ｆｃドメインおよび／またはＦｃドメインバリアントの組み入れに起因した変更されたＦＮ３ドメイン特性は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、ＦｃｙＲＩＩＩもしくはＦｃＲｎ受容体のような可溶性形態の受容体を使用して、または例えばＡＤＣＣもしくはＣＤＣを測定する周知の細胞ベースのアッセイを使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるタンパク質スキャフォールドの薬物動態特性を評価して、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイされる。
【0119】
ＦＮ３ドメインタンパク質の生成および生産
一部の実施形態では、代替表面を含むＦＮ３ドメインのライブラリーを作製する方法が提供され、ここで代替表面は、本明細書に提供されるような参照ＦＮ３ドメインと比較した場合に、代替表面が少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、上記方法は、参照ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチドを供給することと；代替表面を無作為化することによって、参照ＦＮ３ドメインのポリヌクレオチド配列のライブラリーを生成することと；ライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳することまたはライブラリーを宿主において発現させることとを含む。
一部の実施形態では、代替表面を含むＦＮ３ドメインのライブラリーを作製する方法が提供され、ここで代替表面は、本明細書に提供されるような参照ＦＮ３ドメインと比較した場合に、代替表面が少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、上記方法は、参照ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチドを供給することと；代替表面を無作為化することによって、参照ＦＮ３ドメインのポリヌクレオチド配列のライブラリーを生成することと；ライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳することまたはライブラリーを宿主において発現させることとを含む。
【0120】
一部の実施形態では、Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖によって形成される多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ポリペプチドのライブラリーを作製する方法が提供され、当該方法は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも、または約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖における少なくとも１つの残基を突然変異させることによって、コンセンサスＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入して、多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成することとを含む。
【0121】
一部の実施形態では、多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖を含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ポリペプチドのライブラリーを作製する方法が提供され、当該方法は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも、または約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖における少なくとも１つの残基を突然変異させることによってコンセンサスＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入して、多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成することとを含む。
【0122】
本明細書中に記載されるライブラリーを作製する方法において、配列番号４４のＣベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖のいずれか１つにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の残基を突然変異または改変することができる。一部の実施形態では、突然変異は、置換、挿入または欠失である。
【0123】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生産されたライブラリーが提供される。スキャフォールドタンパク質、ＦＮ３ドメイン（ポリペプチドまたはモジュール）の生成は、例えば、核酸レベルで達成される。１つまたはそれ以上の特定残基にて置換コドンを有するＦＮ３ドメインのライブラリーは、例えば、標準的なＰＣＲクローニング法、または米国特許第６，５２１，４２７号および米国特許第６，６７０，１２７号に記載される方法に従う化学的遺伝子合成を使用して合成することができる。コドンは、周知の方法、例えば、設計された多様性に合致する縮重オリゴヌクレオチドを使用して、またはＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７～３８２頁、１９８７）を使用して無作為化することができる。
【0124】
ライブラリーは、アミノ酸の無作為または規定セットを使用して、選択されたコドンにて無作為化することができる。例えば、無作為置換を有するライブラリーにおけるバリアントは、２０個の天然に存在するアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを使用して生成することができる。他の多様化スキームにおいて、ＤＶＫコドンを使用して、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードすることができる。あるいは、ＮＮＳコドンを使用して、２０個のアミノ酸残基全てを生じることができ、同時に終止コドンの頻度を低減させる。コドンの指定は、周知のＩＵＢコードに従う。一部の実施形態では、多様化は、突然変異された残基にて選択肢としてメチオニンおよび／またはシステインを含まずに行われる。
【0125】
任意の他のタンパク質としてのＦＮ３ドメインは、さまざまな物理的および／または化学的不安定さを起こしやすく、下流のプロセシングに悪影響をもたらす。例えば、物理的および化学的不安定さは、凝集、分解、産物収量の低減、効力の損失、免疫原性の可能性の増加、分子の不均一性、および活性の損失につながる場合がある。したがって、考え得る不安定さ誘導残基および認識配列の存在は、ライブラリーの設計中に最小限に抑えられる。例えば、表面に露出されたメチオニンおよびトリプトファンは、保管条件で酸化され、場合によってはタンパク質スキャフォールドの効力の損失を引き起こす。アスパラギンの存在は、周知のＮ－グリコシル化認識部位（ＮＸＳ／Ｔ）に寄与することに加え、グリシンが続く場合には脱アミド化され、場合によっては不均一性が生じる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ、９９、５２８３～５２８８頁、２００２）。したがって、これらのアミノ酸の一部または全ては、選択した位置を無作為化するために使用される混合物から省略されるか、または省略されない。さらに、システインおよびプロリンは、ジスルフィド架橋の形成およびベータシートの崩壊を最小限に抑えるよう省略される。
【0126】
多様化されるべき位置にて偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリーは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を使用して合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な汎用構成要素として機能するあらかじめ作製された二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するために必要な全ての考え得る配列の組合せを表す。
【0127】
ある特定の位置にて選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知されており、例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋら、Ｊ Ｍａｌ Ｂｉｏｌ ２９６、５７～８６頁、１９９９；Ｇａｒｒａｒｄ ＆ Ｒｅｎｎｅｒ、Ｇｅｎｅ １２８、１０３～１０９頁、１９９３）である。ある特定のコドンセットを有するヌクレオチドのそのようなセットは、市販のヌクレオチドまたはヌクレオシド試薬および装置を使用して合成することができる。
【0128】
標準的なクローニングおよび発現技法を使用して、ライブラリーをベクターにクローニングするか、もしくはライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでライブラリーを発現するか、もしくは翻訳する。例えば、シスディスプレイを使用して、スキャフォールドタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片にライゲーションして、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳後に形成されるタンパク質－ＤＮＡ複合体のプールを生成することができ、ここで、タンパク質はそれぞれ、それをコードするＤＮＡと安定に結合されている（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１、２８０６～２８１０頁、２００４）。他の方法、例えば、リボソームディスプレイ（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、４９３７～４９４２頁、１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、１２２９７～１２３０２頁、１９９７）、または他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）を使用することができる。タンパク質スキャフォールドのライブラリーは、例えば任意の適切なバクテリオファージの表面に表示された融合タンパク質として発現される。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドを表示する方法は周知されている（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号；国際出願公開２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。
【0129】
スクリーニング
標的分子への特異的結合について、操作されたタンパク質ＦＮ３ドメインまたはＦＮ３ドメインバリアントのライブラリーをスクリーニングすることは、例えば、実施例およびＯｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ １０１、２８０６～２８１０頁、２００４に記載されているようにシスディスプレイを使用してライブラリーを生産することと、当該技術分野において公知の任意の方法によって標的分子への特異的結合についてライブラリーをアッセイすることとによって達成することができる。使用することができる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに競合的および非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨークを参照）。ＦＮ３ドメインは、広範囲の親和性（ＫＤ）を有するヒトまたは他の哺乳動物タンパク質を結合することができる。通常、ＦＮ３ドメインは、当業者によって実施されるように表面プラズモン共鳴またはＫｉｎｅｘａ法によって決定される場合に約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２Ｍ、１０－１３Ｍ、１０－１４Ｍ、もしくは１０－１５Ｍに等しいか、またはそれ未満のＫＤを有する標的タンパク質に結合することができる。抗原に対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．著、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：ニューヨーク、ＮＹ（１９９２）；および本明細書に記載される方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン－抗原相互作用の測定された親和性は、種々の条件（例えば、浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変化する可能性がある。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は好ましくは、タンパク質スキャフォールドおよび抗原の標準化溶液、ならびに本明細書に記載される緩衝液のような標準化緩衝液を用いて行われる。他のスクリーニング方法もまた、米国特許第７，８４２，４７６号および米国特許第８，６７９，７８１号に記載されており、それらはそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れる。
標的分子への特異的結合について、操作されたタンパク質ＦＮ３ドメインまたはＦＮ３ドメインバリアントのライブラリーをスクリーニングすることは、例えば、実施例およびＯｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ １０１、２８０６～２８１０頁、２００４に記載されているようにシスディスプレイを使用してライブラリーを生産することと、当該技術分野において公知の任意の方法によって標的分子への特異的結合についてライブラリーをアッセイすることとによって達成することができる。使用することができる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに競合的および非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨークを参照）。ＦＮ３ドメインは、広範囲の親和性（ＫＤ）を有するヒトまたは他の哺乳動物タンパク質を結合することができる。通常、ＦＮ３ドメインは、当業者によって実施されるように表面プラズモン共鳴またはＫｉｎｅｘａ法によって決定される場合に約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２Ｍ、１０－１３Ｍ、１０－１４Ｍ、もしくは１０－１５Ｍに等しいか、またはそれ未満のＫＤを有する標的タンパク質に結合することができる。抗原に対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．著、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：ニューヨーク、ＮＹ（１９９２）；および本明細書に記載される方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン－抗原相互作用の測定された親和性は、種々の条件（例えば、浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変化する可能性がある。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は好ましくは、タンパク質スキャフォールドおよび抗原の標準化溶液、ならびに本明細書に記載される緩衝液のような標準化緩衝液を用いて行われる。他のスクリーニング方法もまた、米国特許第７，８４２，４７６号および米国特許第８，６７９，７８１号に記載されており、それらはそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れる。
【0130】
核酸分子およびベクター
本開示は、単離ポリヌクレオチドとして、または発現ベクターの一部として、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳に使用される直鎖状ＤＮＡ配列、原核生物、真核生物または繊維状ファージ発現、その組成物または指向性突然変異原の分泌および／またはディスプレイに適合するベクターを含む直鎖状ＤＮＡ配列の一部として、ＦＮ３をコードする核酸を提供する。ある特定の例示的なポリヌクレオチドは本明細書に開示されるが、所与の発現系における遺伝コードまたはコドン選択の縮重を考慮して、本明細書に開示されるタンパク質スキャフォールドおよびタンパク質スキャフォールドのライブラリーをコードする他のポリヌクレオチドもまた、範囲内である。
本開示は、単離ポリヌクレオチドとして、または発現ベクターの一部として、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳に使用される直鎖状ＤＮＡ配列、原核生物、真核生物または繊維状ファージ発現、その組成物または指向性突然変異原の分泌および／またはディスプレイに適合するベクターを含む直鎖状ＤＮＡ配列の一部として、ＦＮ３をコードする核酸を提供する。ある特定の例示的なポリヌクレオチドは本明細書に開示されるが、所与の発現系における遺伝コードまたはコドン選択の縮重を考慮して、本明細書に開示されるタンパク質スキャフォールドおよびタンパク質スキャフォールドのライブラリーをコードする他のポリヌクレオチドもまた、範囲内である。
【0131】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成によって生産され、完全な一本鎖または二本鎖分子へと構築される。あるいは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲ、続く日常的なクローニングのような他の技法によって生産される。所与の公知の配列のポリヌクレオチドを生産または獲得する技法は、当該技術分野において周知されている。
【0132】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するシス配列のような少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。また、ポリヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の精製もしくは検出を容易にするためのヒスチジンタグもしくはＨＡタグのようなマーカーまたはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡのような融合タンパク質パートナー、ＦｅまたはｐＩＸもしくはｐＩＩＩのようなバクテリオファージコートタンパク質をコードするさらなるアミノ酸をコードするさらなる配列を含んでもよい。例示的なポリヌクレオチドは、Ｔａｃプロモーターに関する配列、ＦＮ３ドメインライブラリーおよびｒｅｐＡをコードする配列、シスエレメント、および細菌の複製起点（ｏｒｉ）を含む。別の例示的なポリヌクレオチドは、ｐｅｌＢまたはｏｍｐＡシグナル配列、ｐＩＩＩまたはｐＩＸバクテリオファージコートタンパク質、ＦＮ３ドメイン、およびｐｏｌｙＡ部位を含む。
【0133】
別の実施形態は、本明細書に開示される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用のベクター、トランスポゾンベースのベクターまたは任意の手段による所与の生物もしくは遺伝的背景へのポリヌクレオチドの導入に適した任意の他のベクターであってもよい。そのようなベクターは、そのようなベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御することができるか、調節することができるか、引き起こすことができるか、または可能にすることができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターであってもよい。そのようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、および所与の発現系におけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでもよい。そのような発現系は、当該技術分野において周知の細胞ベース系、または無細胞系であってもよい。
【0134】
宿主細胞選択または宿主細胞操作
本明細書に開示されるＦＮ３ドメインは、当該技術分野において周知であるように、場合により細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって生産される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９４～２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ，（１９９７～２００１年）を参照のこと。
本明細書に開示されるＦＮ３ドメインは、当該技術分野において周知であるように、場合により細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって生産される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９４～２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ，（１９９７～２００１年）を参照のこと。
【0135】
発現用に選択される宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、またはＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ－１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫もしくは植物細胞、もしくはそれらの任意の誘導体、不死化もしくは形質転換細胞から選択される。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種または生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬｌ－Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳｌ ７４、ＨＭＳｌ ７４（ＤＥ３）、および天然のもしくは操作された大腸菌属種（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、またはシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）株のいずれかから選択される。
【0136】
ＦＮ３ドメインの使用
本明細書に記載され、また上述の方法のいずれかによって生成されたＦＮ３ドメイン（モジュール）ベースの分子の組成物は、細胞、組織、器官、液体、もしくは一般的に宿主におけるヒト疾患もしくは特定病状の症状を診断するか、モニタリングするか、調節するか、処置するか、軽減するか、それらの発生を防止するために役立つか、またはそれらを低減するために使用される。特定目的のために操作されたＦＮ３ドメインは、免疫介在性または免疫不全疾患、代謝性疾患、心血管障害または疾患；悪性疾患；神経障害または疾患；細菌、ウイルスもしくは寄生虫感染のような感染；または腫れ、疼痛、および組織壊死もしくは線維症を含む他の公知のもしくは特定の関連状態を処置するために使用される。
本明細書に記載され、また上述の方法のいずれかによって生成されたＦＮ３ドメイン（モジュール）ベースの分子の組成物は、細胞、組織、器官、液体、もしくは一般的に宿主におけるヒト疾患もしくは特定病状の症状を診断するか、モニタリングするか、調節するか、処置するか、軽減するか、それらの発生を防止するために役立つか、またはそれらを低減するために使用される。特定目的のために操作されたＦＮ３ドメインは、免疫介在性または免疫不全疾患、代謝性疾患、心血管障害または疾患；悪性疾患；神経障害または疾患；細菌、ウイルスもしくは寄生虫感染のような感染；または腫れ、疼痛、および組織壊死もしくは線維症を含む他の公知のもしくは特定の関連状態を処置するために使用される。
【0137】
そのような方法は、症状、効果もしくはメカニズムにおけるそのような調節、処置、軽減、防止、または低減を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に標的分子を特異的に結合する少なくとも１つのＦＮ３ドメインを含む有効量の組成物または医薬組成物を投与することを含むことができる。有効量は、公知の方法を使用して実施および決定されるように、本明細書に記載されるか、または関連技術において公知であるように、単回（例えば、ボーラス）、複数回または連続投与につき約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの量を含むことができるか、または単回、複数回、または連続投与につき０．０１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、またはその中の任意の有効範囲もしくは値を達成することができる。
【0138】
ＦＮ３ポリペプチドは、治療薬の送達を容易にするために別の治療薬に連結することができる。したがって、ＦＮ３ポリペプチドは、ＣＤ７１のような、ＦＮ３ポリペプチドが結合する標的を発現する細胞に治療薬を送達するために使用することができる。
【0139】
ＦＮ３ドメインベースのタンパク質を含む医薬組成物
改変されたか、または改変されていない単量体、二量体、または多量体であるか、単一、二重または多重特異的である標的分子を特異的に結合するＦＮ３ドメインは、捕捉、固定化、分割、または沈降のための当該技術分野において周知の分離手順を使用して単離し、商業的利用可能性に必要な程度にまで精製することができる。また、それらは、核酸分子または他の治療薬とコンジュゲートされる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子である。
改変されたか、または改変されていない単量体、二量体、または多量体であるか、単一、二重または多重特異的である標的分子を特異的に結合するＦＮ３ドメインは、捕捉、固定化、分割、または沈降のための当該技術分野において周知の分離手順を使用して単離し、商業的利用可能性に必要な程度にまで精製することができる。また、それらは、核酸分子または他の治療薬とコンジュゲートされる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子である。
【0140】
治療用途で、標的分子を特異的に結合するＦＮ３ドメインは、薬学的に許容される担体中に有効成分として有効量のＦＮ３ドメインを含有する医薬組成物として製造される。「担体」という用語は、活性化合物がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、水および落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような石油、動物性、植物性または合成起源の油を含む油のような液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水および０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌性であり、一般に粒子状物質は含んでいない。それらは、従来の周知の滅菌技法（例えば、濾過）によって滅菌される。組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤などのような生理学的条件に近づけるのに必要に応じて、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。そのような医薬製剤中の薬剤の濃度は、広範囲にわたって、即ち約０．５％未満から、通常は約１重量％にてまたは少なくとも約１重量％にて、１５または２０重量％程度まで変化することができ、選択された特定の投与様式に従って、主に所要の用量、液体容量、粘度などに基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む適切なビヒクルおよび製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．著、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ＰＡ ２００６、Ｐａｒｔ ５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ６９１～１０９２頁に例えば記載されている。特に９５８～９８９頁を参照のこと。
【0141】
標的分子を特異的に結合するＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与様式は、非経口投与、例えば皮内、筋内、腹膜内、静脈内または皮下、肺；経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）のような；錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子中で製剤を使用して；およびシリンジ、埋め込み型デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；または当該技術分野で周知されるような当業者によって認識されている他の手段に含有されて、宿主に薬剤を送達する任意の適切な経路であってもよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、髄腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心臓内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮送達によって達成される。
【0142】
実施形態の列挙
本明細書に記載される実施形態はまた、下記を含むが、これらに限定されない：
本明細書に記載される実施形態はまた、下記を含むが、これらに限定されない：
【0143】
実施形態を一般的な用語で説明してきたが、ある特定の実施形態は、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例においてさらに開示される。
【0144】
１．多様化Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖を含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有する複数のフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメイン（ポリペプチド）を含むライブラリーであって、ポリペプチドは、下記：
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列または配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含み、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるライブラリー。
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列または配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含み、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるライブラリー。
【0145】
２．Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１のライブラリー。
【0146】
３．ポリペプチドは、多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ、Ｄベータ鎖、Ｆベータ鎖、ＦＧループ、またはＧベータ鎖のうちの１つもしくはそれ以上、またはそのそれぞれにおいて配列番号２４と比較した場合に少なくとも１つの突然変異アミノ酸残基を含む、実施形態１または２のライブラリー。
【0147】
４．複数のポリペプチドは、配列番号２４の３２、３４、３６、３８、３９、４０、４１、４６、４８、６８、７０、７２、７８、７９、８１、８５、および／または８７位に相当する位置に１つまたはそれ以上の突然変異（例えば、置換、挿入、または欠失）を有する、実施形態１～３のいずれか１つのライブラリー。
【0148】
５．多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～４のいずれか１つのライブラリー。
【0149】
６．多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～５のいずれか１つのライブラリー。
【0150】
７．多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～６のいずれか１つのライブラリー。
【0151】
８．多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～７のいずれか１つのライブラリー。
【0152】
９．多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～８のいずれか１つのライブラリー。
【0153】
１０．多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１～９のいずれか１つのライブラリー。
【0154】
１１．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つのライブラリー。
【0155】
１２．多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、
実施形態１～１１のいずれか１つのライブラリー。
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、
実施形態１～１１のいずれか１つのライブラリー。
【0156】
１３．実施形態１～１２のいずれか１つのライブラリーを生産する方法であって、複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することを含む方法。
【0157】
１４．Ｃベータ鎖、ＣＤループ、Ｆベータ鎖、ＦＧループおよびＧベータ鎖の多様化された１つもしくはそれ以上、またはそれぞれを含む多様化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのフィブロネクチンモジュールのライブラリーを作製する方法であって、
ａ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；
ｂ．多様化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ領域、Ｆベータ鎖領域、ＦＧループ領域、またはＧベータ鎖領域において少なくとも１つの残基を突然変異させることによって、参照ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入すること
とを含み、ここで：
多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である
方法。
ａ．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する参照ＦＮ３ドメインポリペプチドを供給することと；
ｂ．多様化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するＦＮ３ドメインライブラリーを形成するようにＣベータ鎖、ＣＤループ領域、Ｆベータ鎖領域、ＦＧループ領域、またはＧベータ鎖領域において少なくとも１つの残基を突然変異させることによって、参照ＦＮ３ドメインポリペプチドに多様性を導入すること
とを含み、ここで：
多様化Ｃベータ鎖は、ＴＧＹＸＶＸＹＸＥ（配列番号４５）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＣＤループは、ＸＸＸＸＧＥ（配列番号４６）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｄベータ鎖は、ＷＫＸＶＸＶＰ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｆベータ鎖は、ＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶ（配列番号４８）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化ＦＧループは、ＮＧＡＸＸＧ（配列番号４９）のアミノ酸配列を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であり；
多様化Ｇベータ鎖は、アミノ酸配列ＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号５０）を有し、Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である
方法。
【0158】
１５．実施形態１３または１４の方法によって生産されたライブラリー。
【0159】
１６．標的分子に結合するか、または特異的に結合する多様化Ｃ－ＣＤ－Ｄ－Ｆ－ＦＧ－Ｇ代替表面を有するフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦＮ３）ドメインを含むポリペプチドを得る方法であって、実施形態１～１２のいずれか１つのライブラリーを標的分子と接触させることと、標的分子に結合するか、または特異的に結合するポリペプチドを単離することとを含む方法。
【0160】
１７．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される配列と少なくとも、もしくは約、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【0161】
１８．下記：
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
ＭＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号４４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
【0162】
１９．Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態１８のポリペプチド。
【0163】
２０．下記：
ＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号７４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
ＬＳＰＰＳＮＬＲＶＴＤＶＴＳＴＳＶＴＬＳＷＫＰＰＡＰＩＴＧＹＸＶＸＹＸＥＸＸＸＸＧＥＷＫＸＶＸＶＰＧＳＥＴＳＹＴＶＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸＦＸＶＸＡＶＮＧＡＸＸＧＸＰＳＱＸＶＸＶＴＴ（配列番号７４）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｘはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸であるポリペプチド。
【0164】
２１．Ｘはそれぞれ独立して、メチオニンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である、実施形態２０のポリペプチド。
【0165】
２２．実施形態１７～２１のポリペプチドを含む医薬組成物。
【0166】
２３．実施形態２２のポリペプチドをコードする核酸分子。
【0167】
２４．実施形態１～１２のいずれか１つのポリペプチドのライブラリーをコードする複数の核酸分子。
【0168】
２５．実施形態２４の核酸分子を含む宿主細胞。
【実施例1】
【0169】
Ｆｎ３ドメインヒトコンセンサス配列（ＨｕｍＣｏｎ）の設計
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのＰｒｏｓｉｔｅ配列データベースアライメント（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＤＯＣ５０８５３）を、コンセンサス配列の生成のための出発点として使用した。このアライメントは、非ヒト由来の配列全てを除去するように編集され、生じたアライメントは、８０６個のヒト配列を含有していた。９４個の位置それぞれにある顕著な残基を使用して、候補コンセンサス配列を決定した。２つの位置（４７および８９）にて、２つの残基が同等に顕著であった。これらは、４７位にあるＮおよびＴならびに８９位にあるＳおよびＶであった。あらゆる他の位置では、単一残基が主要であった。４７位および８９位での両義性のため、４つのコンセンサス配列が生成された（表３）。
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのＰｒｏｓｉｔｅ配列データベースアライメント（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＤＯＣ５０８５３）を、コンセンサス配列の生成のための出発点として使用した。このアライメントは、非ヒト由来の配列全てを除去するように編集され、生じたアライメントは、８０６個のヒト配列を含有していた。９４個の位置それぞれにある顕著な残基を使用して、候補コンセンサス配列を決定した。２つの位置（４７および８９）にて、２つの残基が同等に顕著であった。これらは、４７位にあるＮおよびＴならびに８９位にあるＳおよびＶであった。あらゆる他の位置では、単一残基が主要であった。４７位および８９位での両義性のため、４つのコンセンサス配列が生成された（表３）。
【0170】
【表3】
【0171】
ループ設計：
ループ領域は、長さおよび配列の両方において非常に可変的である可能性がある。８０６個の配列がコンセンサスを形成するようにアラインされ、ほとんどの配列は９４個の位置それぞれに残基を含有する一方で、位置によっては、通常はループで発生する欠失のために、より少ない配列を含有していた。したがって、ループによっては短縮されて、より安定な配列を生じた。推定上のＢＣおよびＣＤループは、長さの可変性の領域として同定された。これらのループを短縮することができるという仮説を検証するために、配列番号２を骨格配列として使用して、これらの領域における一連の欠失を設計した。結果は、以下で表４に列挙される配列番号５～１３である。
ループ領域は、長さおよび配列の両方において非常に可変的である可能性がある。８０６個の配列がコンセンサスを形成するようにアラインされ、ほとんどの配列は９４個の位置それぞれに残基を含有する一方で、位置によっては、通常はループで発生する欠失のために、より少ない配列を含有していた。したがって、ループによっては短縮されて、より安定な配列を生じた。推定上のＢＣおよびＣＤループは、長さの可変性の領域として同定された。これらのループを短縮することができるという仮説を検証するために、配列番号２を骨格配列として使用して、これらの領域における一連の欠失を設計した。結果は、以下で表４に列挙される配列番号５～１３である。
【0172】
【表4】
【0173】
遺伝子合成、発現および特性化
表３および表４の１３個の配列に関する遺伝子を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いて設計し、Ｔ５プロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングした。培養物のｍｇ／Ｌとしての発現収量を振盪フラスコ中で評価し、融解温度を示差走査熱量測定によって評価した（表５）。ＳＤＳ ＰＡＧＥアッセイを確立し、ＭＷ標準物質を使用して単量体の均質性を確認した。いくつかのクローンは、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィによって実証することができる鎖スワッピングに起因すると仮定された二量体形成と一致する挙動を示した。
表３および表４の１３個の配列に関する遺伝子を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いて設計し、Ｔ５プロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングした。培養物のｍｇ／Ｌとしての発現収量を振盪フラスコ中で評価し、融解温度を示差走査熱量測定によって評価した（表５）。ＳＤＳ ＰＡＧＥアッセイを確立し、ＭＷ標準物質を使用して単量体の均質性を確認した。いくつかのクローンは、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィによって実証することができる鎖スワッピングに起因すると仮定された二量体形成と一致する挙動を示した。
【0174】
【表5】
【0175】
さらなる最適化（Ｎ末端、プロリン、ｐＩ）
配列番号２を、生物物理学的特性の改善のために操作するリード候補として選択した。一連の突然変異は、１）鎖スワッピングを最低限に抑えることを目標として、他のＦＮ３ドメイン構造に対するホモロジーモデリングに基づいてベータシート構造を有すると予想されるセグメントからプロリンを除去するように；または２）予測ｐＩ値を高め、製造および配合特性の簡素化を可能にするように設計された。これらのバリアントに関する配列を表６に列挙する。タンパク質それぞれを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して精製し、親クローン（配列番号２）と比較して、溶解度（可溶性タンパク質の発現／Ｌ（大腸菌））、安定性（示差走査熱量測定によるＴｍ）および単量体の均質性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）について評価した（表７）。
配列番号２を、生物物理学的特性の改善のために操作するリード候補として選択した。一連の突然変異は、１）鎖スワッピングを最低限に抑えることを目標として、他のＦＮ３ドメイン構造に対するホモロジーモデリングに基づいてベータシート構造を有すると予想されるセグメントからプロリンを除去するように；または２）予測ｐＩ値を高め、製造および配合特性の簡素化を可能にするように設計された。これらのバリアントに関する配列を表６に列挙する。タンパク質それぞれを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して精製し、親クローン（配列番号２）と比較して、溶解度（可溶性タンパク質の発現／Ｌ（大腸菌））、安定性（示差走査熱量測定によるＴｍ）および単量体の均質性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）について評価した（表７）。
【0176】
【表6】
【0177】
【表7】
【0178】
ライブラリー設計－アラニンスキャニング
ライブラリー設計戦略の実行可能性を検証するために、１９個の突然変異タンパク質を設計し、ここで、バリアントタンパク質はそれぞれ、設計された結合界面の一部であると意図された固有の位置にて１つのアラニン残基をコードした。アラニンスキャニング突然変異配列を表８に列挙する。タンパク質それぞれを大腸菌において発現させ、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して精製し、確実に生物物理学的特性が親クローン（配列番号２４）の生物物理学的特性と一致するように特徴付けた。タンパク質バリアントを、溶解度（可溶性タンパク質の発現／Ｌ）、安定性（示差走査熱量測定によるＴｍ）、および単量体の均質性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）について評価した（表９）。
ライブラリー設計戦略の実行可能性を検証するために、１９個の突然変異タンパク質を設計し、ここで、バリアントタンパク質はそれぞれ、設計された結合界面の一部であると意図された固有の位置にて１つのアラニン残基をコードした。アラニンスキャニング突然変異配列を表８に列挙する。タンパク質それぞれを大腸菌において発現させ、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して精製し、確実に生物物理学的特性が親クローン（配列番号２４）の生物物理学的特性と一致するように特徴付けた。タンパク質バリアントを、溶解度（可溶性タンパク質の発現／Ｌ）、安定性（示差走査熱量測定によるＴｍ）、および単量体の均質性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）について評価した（表９）。
【0179】
【表8】
【0180】
【表9】
【0181】
ＣＤ７１への特異的結合をスクリーニングすることによるライブラリーバリデーション
ＨｕｍＣｏｎバリアントのライブラリーは、標準的な分子生物学の方法を使用して構築され、ここで、アラニン突然変異実験によって確認された位置のうち１７個を、１８個の考え得るアミノ酸（メチオニンおよびシステインを除く全てのアミノ酸）に突然変異させた。このライブラリーをＣＩＳディスプレイベクターにクローニングし、本明細書に記載される方法を使用してＣＤ７１に対する結合についてパニングした。特異的結合剤をＥＬＩＳＡによって決定した。ＣＤ７１標的に首尾よく結合されたライブラリーの成員を表１０に列挙する。
ＨｕｍＣｏｎバリアントのライブラリーは、標準的な分子生物学の方法を使用して構築され、ここで、アラニン突然変異実験によって確認された位置のうち１７個を、１８個の考え得るアミノ酸（メチオニンおよびシステインを除く全てのアミノ酸）に突然変異させた。このライブラリーをＣＩＳディスプレイベクターにクローニングし、本明細書に記載される方法を使用してＣＤ７１に対する結合についてパニングした。特異的結合剤をＥＬＩＳＡによって決定した。ＣＤ７１標的に首尾よく結合されたライブラリーの成員を表１０に列挙する。
【0182】
【表10-1】
【表10-2】
【0183】
本明細書に提供される本実施例および実施形態は、本明細書に提供されるＦＮ３ドメインを生成し、目的の標的タンパク質に結合することができる分子を生産するためにライブラリーを使用することができることを実証している。これらの結果は予測することできず、したがって、分子のライブラリー、分子のライブラリーを含む組成物、および分子のライブラリーを使用する方法は、予測することができなかった様式で本明細書に提供される。本実施形態は、先述の説明および実施例において特に記載されたもの以外に実施することができることは明らかである。本実施形態の多数の変更および変動は、上記の教示に鑑みて可能であり、したがって、併記の特許請求の範囲内である。
【配列表】
【国際調査報告】