特表 2024-527867 ＶＥＧＦＲ融合タンパク質医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦＲ融合タンパク質医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240719BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240719BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240719BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240719BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240719BHJP

   C07K 14/71 20060101ALN20240719BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240719BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 Y

A61K47/26

A61K47/10

A61K47/36

A61K47/38

A61K47/22

A61K47/02

A61K47/18

A61P27/02

A61K9/08

C07K19/00 ZNA

C07K14/71

C07K16/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503892

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-01-22

(86)【国際出願番号】 US2022076009

(87)【国際公開番号】W WO2023219653

(87)【国際公開日】2023-11-16

(31)【優先権主張番号】17/663,260

(32)【優先日】2022-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517297038

【氏名又は名称】オールジェネシス バイオセラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002871

【氏名又は名称】弁理士法人坂本国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】グエン タン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ペイ－ズゥ

(72)【発明者】

【氏名】チャン ヤン－シャン

(72)【発明者】

【氏名】チェルクリ マドゥ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076CC10

4C076DD09F

4C076DD23

4C076DD51

4C076DD60Z

4C076DD67

4C076EE23F

4C076EE31

4C076EE32

4C076EE37

4C076FF16

4C076FF36

4C076FF61

4C076FF63

4C085AA33

4C085BB11

4C085BB31

4C085BB42

4C085CC21

4C085CC22

4C085EE05

4C085EE07

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、血管新生を阻害する生物製剤に関する。特に、本発明は、インテグリン活性化経路及び１つの他の血管新生因子活性化経路を阻害する融合タンパク質、並びにそのような融合タンパク質の製剤組成物、並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤であって、
前記製剤は約５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、前記製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤。

【請求項2】

前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

前記界面活性剤が約０．０３％ｗ／ｖの濃度である、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項4】

前記融合タンパク質が約１ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは前記融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項5】

前記ポリオールが約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、好ましくは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項6】

前記緩衝剤が、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくは前記ヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項7】

前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、及び
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメントを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項8】

前記融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、請求項７に記載の医薬製剤。

【請求項9】

ｐＨが約５．５～約７．０であり、好ましくはｐＨが約６．０である、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項10】

－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項11】

－７０℃、－２０℃、２～８℃及び／又は２５℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項12】

約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項13】

少なくとも１つのアミノ酸を約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項14】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項１２に記載の医薬製剤。

【請求項15】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬製剤。

【請求項16】

対象の眼疾患を治療する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬製剤を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項17】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記製剤が約０．５～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０を含む、医薬製剤であって、
前記製剤は約６．０のｐＨである、医薬製剤。

【請求項21】

前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、請求項２０に記載の医薬製剤。

【請求項22】

前記融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、請求項２１に記載の医薬製剤。

【請求項23】

－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項24】

－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項25】

約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項26】

少なくとも１つのアミノ酸を約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項27】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項２５に記載の医薬製剤。

【請求項28】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬製剤。

【請求項29】

請求項２０～２８のいずれか一項に記載の医薬製剤を前記対象に投与することを含む、対象の眼疾患を治療する方法。

【請求項30】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記製剤が約０．５～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ａ）約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ４００～１２０００等からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤を対象に投与することを含む、対象の眼疾患を治療する方法であって、
ｐＨが約５．５～７．５であり、場合により、前記製剤が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、方法。

【請求項34】

前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記界面活性剤が約０．０３％の濃度である、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記融合タンパク質が約２０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは前記融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ポリオールが約１５０ｍＭ～約２３０ｍＭ、好ましくは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記緩衝液が、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくは前記ヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、及び
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ｐＨが約６．０～約６．５であり、好ましくは前記ｐＨが約６．０である、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記製剤が、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記製剤が、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素変性、網膜色素線条症、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性及び非滲出性加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）を含む、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記製剤が約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項４９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年５月１３日に出願された米国非仮特許出願第１７／６６３，２６０号の優先権を主張する国際出願であり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された配列表の参照
電子配列表（０６５７８１＿ＷＯ１．ｘｍｌ；サイズ：６６，２００バイト；作成日２０２２年８月２５日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、血管新生因子活性化経路を阻害する融合タンパク質医薬組成物に関する。特に、本発明は、血管新生因子活性化経路を阻害する融合タンパク質、これらの融合タンパク質の組成物、並びにそれらを製造及び使用するための方法に関する。

【背景技術】

【0004】

血管形成は、既存の血管系から新しい血管を成長させるプロセスである。これは、胚発生並びに組織及び創傷修復を含むいくつかの生理学的過程において重要な役割を果たす（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７；２３５：４４２－７）。血管新生の生理学的工程は十分に特徴付けられており、細胞外マトリックスのタンパク質分解、内皮細胞の増殖、接着、遊走及び管状チャネルへの集合、壁細胞、周皮細胞の動員及び分化、並びに細胞外マトリックスの産生を含む（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７３：２９８－３０７）。病理学的血管形成は、腫瘍形成、眼障害（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜／脈絡膜血管新生、滲出型加齢黄斑変性、及び血管新生緑内障）、関節炎、乾癬、線維性疾患、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、及び動脈硬化症で起こり得る（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ Ｐ Ｊ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９９５；６（３）：２３０－４７，Ｐｅｒｒｏｔｔａ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１９；１１２：７２－７８）。

【0005】

病理学的血管新生は、より不均一で無秩序であり、蛇行した血管組織化、様々なサイズの低酸素ボイド、不均一で不完全な血管壁及びライニング、並びに無効な灌流を示すことが多い（Ｊａｉｎ Ｒ Ｋ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；９（６）：６８５－９３）。疾患における新しい血管形成のこれらの明確な特徴は、血管形成の治療標的化を課題としている。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）、又はＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）のオフラベル使用等の抗ＶＥＧＦ療法は一般に視覚機能を安定化又は改善することができるが、網膜下瘢痕化（線維症）は、抗ＶＥＧＦ治療後２年以内に治療された全ての眼の約半分に発症する可能性があり、転帰不良の１つの原因として特定されている（Ｄａｎｉｅｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４；１２１（３）：６５６－６６）。網膜下線維症における重要なプレイヤーの多くは、線維化過程（細胞増殖、遊走及びＥＣＭリモデリング）に関与する成長因子及びマトリックス細胞タンパク質である可能性が高い（Ｐａｔｓｅｎｋｅｒ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００９ Ｎｏｖ；５０（５）：１５０１－１５１１，Ｘｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１４ Ｎｏｖ；１８４２（１１）：２１０６－２１１９）。その複雑さにもかかわらず、血管新生プロセスに関する我々の知識の増加に伴い、抗血管新生薬物開発は依然として非常に興味深い領域である。

【0006】

現在、血管新生プロセスにおける多くの重要な役割が特定されており、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーが支配的な役割を有する。ヒトＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、及び胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の６つのメンバーからなる。更に、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ及びＰＩＧＦの複数のアイソフォームが、選択的ＲＮＡスプライシングによって生成される（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２００２；２（２）：１６５－７５）。ＶＥＧＦ－Ａは血管形成に関与する主要因子であり、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２の両方に結合する。ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達を妨害することによって血管新生を阻害する戦略は、特定の癌並びに網膜血管新生及び虚血性疾患の治療のための成功した治療法を確立した。（Ｍａｊｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９７；２８３（１）：４０２－１０；Ｗｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４；１０：１４５－７；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１２；１５（２）：１７１－８５；Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１９９５；９２：１０４５７－６１）。

【0007】

血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子又は線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子／スキャッター因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン２０（ＩＬ－２０）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）、Ｃ－Ｃモチーフリガンド（ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２１）及びＣ－Ｘ－Ｃモチーフリガンド（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５）等の走化性物質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、並びに分化抗原群（ＣＤ）等の免疫細胞表面タンパク質を含む他の成長因子、サイトカイン、ケモカイン。これらの因子は過剰発現され、血管新生関連疾患において重要な役割を果たすことが報告されている（Ｅｌｓｈａｂｒａｗｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１５；１８：４３３－４４８；Ｓｏｍａｎａｔｈ Ｐ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００９；５３（２）：５３－６４，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ Ｂ Ｐ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００１ Ｄｅｃ ７；８９（１２）：１１０４－１０）。下流経路活性化を減少させるためにこれらの因子を標的化することにより、血管新生関連疾患を減少させることができる。

【0008】

細胞表面受容体のファミリーであるインテグリンはまた、内皮細胞表面に過剰発現されることが見出されており、血管新生中に新たに形成される血管の成長及び生存を促進すると考えられている。インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質と相互作用するヘテロ二量体細胞表面受容体であり、多くの生物学的プロセスにとって重要である。様々な細胞型におけるインテグリンの発現は腫瘍進行に関与しており、増殖因子受容体とクロストークし、いくつかの増殖因子と直接相互作用するそれらの能力はそれらを魅力的な治療標的にした。（Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｄ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９１：１１１－５７；Ａｖｒａａｍｉｄｅｓ，Ｃ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００８；８：６０４－６１７，Ｓｏｍａｎａｔｈ Ｐ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００９；５３（２）：５３－６４）特に、インテグリンαｖβ３は、腫瘍細胞及び血管新生内皮細胞の両方で上方制御され、腫瘍細胞遊走、血管新生／血管新生、及び調節不全の細胞シグナル伝達にとって重要である。したがって、インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、それらの抗血管新生及び抗腫瘍特性について集中的に研究されている（Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ Ｊ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０：９－２２）。

【0009】

ディスインテグリンは、バイパーファミリーの蛇毒に見られるタンパク質であり、主にβ１及びβ３関連インテグリンの機能を阻害する。それらは最初にインテグリンαＩＩｂβ３の阻害剤として同定され、その後、他のインテグリンに高親和性で結合し、インテグリンとＲＧＤ含有タンパク質との相互作用を遮断することが示された。それらは、約４～７個のジスルフィド結合を有する４７～８４個のアミノ酸を含有し、同じＲＧＤモチーフを有する（ＭｃＬａｎｅ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９９８；２１９：１０９－１１９；Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９４；３１：２８９－３００；Ｃａｌｖｅｔｅ Ｊ Ｊ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００５；１１：８２９－８３５；Ｂｌｏｂｅｌ Ｃ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；４：７６０－７６５）。ディスインテグリンファミリーの保存されたＲＧＤ配列は、インテグリンの認識において最も重要な役割を果たす。ディスインテグリンは、２４個中８個のインテグリンと相互作用し、インテグリン媒介性の細胞増殖、接着、遊走及び血管新生を阻害することが見出された（ＭｃＬａｎｅ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８；１３：６６１７－６６３７；Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００７；１３：２８６０－２８７１）。動物研究は、ディスインテグリンが血管新生内皮及び転移性腫瘍を標的とすることを示し、癌治療におけるそれらの潜在的な使用を示した。ＲＧＤ含有タンパク質のインテグリンへの特異的結合は、ＲＧＤモチーフを取り囲む立体配座及び局所配列の両方の機能である。多くの研究は、ＲＧＤ含有タンパク質のＲＧＤモチーフに隣接する残基がインテグリンに対するそれらの結合特異性及び親和性に影響を及ぼすことを示している（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：１０５８－１０６５；Ｒａｈｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９８；３３５：２４７－２５７）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７；２３５：４４２－７

【非特許文献2】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７３：２９８－３０７

【非特許文献3】Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ Ｐ Ｊ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９９５；６（３）：２３０－４７

【非特許文献4】Ｐｅｒｒｏｔｔａ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１９；１１２：７２－７８

【非特許文献5】Ｊａｉｎ Ｒ Ｋ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；９（６）：６８５－９３

【非特許文献6】Ｄａｎｉｅｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４；１２１（３）：６５６－６６

【非特許文献7】Ｐａｔｓｅｎｋｅｒ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００９ Ｎｏｖ；５０（５）：１５０１－１５１１

【非特許文献8】Ｘｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１４ Ｎｏｖ；１８４２（１１）：２１０６－２１１９

【非特許文献9】Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２００２；２（２）：１６５－７５

【非特許文献10】Ｍａｊｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９７；２８３（１）：４０２－１０

【非特許文献11】Ｗｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４；１０：１４５－７

【非特許文献12】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１２；１５（２）：１７１－８５

【非特許文献13】Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１９９５；９２：１０４５７－６１

【非特許文献14】Ｅｌｓｈａｂｒａｗｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１５；１８：４３３－４４８

【非特許文献15】Ｓｏｍａｎａｔｈ Ｐ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００９；５３（２）：５３－６４

【非特許文献16】Ｅｌｉｃｅｉｒｉ Ｂ Ｐ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００１ Ｄｅｃ ７；８９（１２）：１１０４－１０

【非特許文献17】Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｄ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９１：１１１－５７

【非特許文献18】Ａｖｒａａｍｉｄｅｓ，Ｃ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００８；８：６０４－６１７

【非特許文献19】Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ Ｊ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０：９－２２

【非特許文献20】ＭｃＬａｎｅ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９９８；２１９：１０９－１１９

【非特許文献21】Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９４；３１：２８９－３００

【非特許文献22】Ｃａｌｖｅｔｅ Ｊ Ｊ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００５；１１：８２９－８３５

【非特許文献23】Ｂｌｏｂｅｌ Ｃ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２；４：７６０－７６５

【非特許文献24】ＭｃＬａｎｅ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８；１３：６６１７－６６３７

【非特許文献25】Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００７；１３：２８６０－２８７１

【非特許文献26】Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：１０５８－１０６５

【非特許文献27】Ｒａｈｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９８；３３５：２４７－２５７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

血管新生は、様々な成長因子及びシグナル伝達受容体を含む複雑な生物学的プロセスであり、シグナル伝達カスケード中の単一分子を標的化することは、癌等の疾患における制御されていない血管新生の有効な臨床治療を提供しない可能性がある。したがって、血管新生及び疾患の進行を効果的に阻害するために、いくつかの重要な血管新生因子に協調的に結合することができる革新的な治療薬を開発する必要性が高まっている。
融合タンパク質の医薬製剤及びそのような製剤を使用する方法が本明細書で提供される。

【課題を解決するための手段】

【0012】

１つの一般的な態様では、本開示は、
ａ）約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤とを含む、医薬製剤であって、
製剤は約５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤に関する。

【0013】

本開示の実施形態によれば、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である。

【0014】

本出願の実施形態によれば、界面活性剤は約０．０３％の濃度である。

【0015】

本開示の実施形態によれば、融合タンパク質は、約１ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である。

【0016】

本出願の実施形態によれば、ポリオールは、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、好ましくは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである。

【0017】

本開示の実施形態によれば、緩衝剤は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である。

【0018】

本開示の実施形態によれば、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、及び
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む。

【0019】

本出願の実施形態によれば、融合タンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８を含む。

【0020】

本出願の実施形態によれば、ｐＨは約５．５～約７．０であり、好ましくはｐＨは約６．０である。

【0021】

本出願の実施形態によれば、製剤は、－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である。

【0022】

本出願の実施形態によれば、製剤は、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも９ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する。

【0023】

本出願の実施形態によれば、製剤は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む。

【0024】

本出願の実施形態によれば、製剤は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の少なくとも１つのアミノ酸を更に含む。

【0025】

本出願の実施形態によれば、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される。

【0026】

本開示の実施形態によれば、アミノ酸は、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される。

【0027】

本出願の実施形態によれば、医薬製剤は、眼疾患を治療する方法において使用することができる。

【0028】

本開示の実施形態によれば、眼疾患は、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される。

【0029】

本開示の実施形態によれば、製剤は、約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される。

【0030】

本出願の実施形態によれば、製剤は、眼当たり約４ｍｇの用量で投与される。

【0031】

本開示の別の一般的な態様は、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０を含む、医薬製剤であって、
製剤は約６．０のｐＨである、医薬製剤に関する。

【0032】

本明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0033】

例示的な実施形態の上記及び他の目的、態様、特徴、及び利点は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによってより明らかになり、よりよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】アカゲザルにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける、０．６、１．０及び１．９ｍｇ／眼での融合タンパク質１の単回硝子体内注射後の血管漏出領域のベースラインからの平均変化率のグラフである。データは平均±ＳＥＭとして提示した。全ての用量を０日目に単回硝子体内用量として投与した。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（０．５ｍｇ）をシステム適合性及び陽性対照として使用した。分析した全てのスポットはグレードＩＩＩ／ＩＶであった。％血管漏出＝（ベースライン漏出領域－治療漏出領域）÷（ベースライン漏出領域）×１００％；マン・ホイットニーのＵ検定により、処置群とビヒクル群とを比較するために統計分析を行い＊、ｐ＜０．０５。^ａ１．９ｍｇ群では、重度の眼炎症を有する一匹のサルからのデータが除去され、これは統計学的有意性に影響を与えた（ｐ＝０．０５７）。ｎ＝４眼／群。

【図2】アカゲザルにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける、０．６、１．０及び１．９ｍｇ／眼での融合タンパク質１の単回硝子体内注射後の光干渉断層法による平均網膜厚評価のグラフである。データは平均±ＳＥＭとして提示した。全ての用量を０日目に単回硝子体内用量として投与した。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（０．５ｍｇ）をシステム適合性及び陽性対照として使用した。分析した全てのスポットはグレードＩＩＩ／ＩＶであった。網膜の厚さ％＝（ベースライン網膜の厚さ－治療網膜の厚さ）÷（ベースライン網膜の厚さ－研究前の網膜の厚さ）×１００％；マン・ホイットニーのＵ検定により、処置群とビヒクル群とを比較するために統計分析を行い、＊、ｐ＜０．０５である。^ａ１．９ｍｇ群では、重度の眼炎症を有する一匹のサルからのデータが除去され、これは統計学的有意性に影響を与えた（ｐ＝０．０５７）。ｎ＝４眼／群。

【図3】示されるように処置されたアカゲザルにおけるレーザー誘導性脈絡膜血管新生モデルのグレードＩＩＩ／ＩＶ病変のマッソン・トリクローム染色のグラフである。データは平均±ＳＥＭとして提示した。脱核を２９日目に行った。選択されたグレード４の病変スポットを、マッソンのトリクローム染色によって分析した。スチューデントのｔ検定分析を行って、処置群をビヒクル群と比較した（＊、ｐ＜０．０５）。ｎ＝４眼／群。

【図4】示される処置後のベロマイシン誘導Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺線維症モデルにおける肺ヒドロキシプロリンレベルのグラフである（各処置群についてｎ＝８動物及び偽対照群についてｎ＝４）。＄ｐ＜０．０５、処置対偽対照、対応なしスチューデントのｔ検定；＊ｐ＜０．０５、処置対ビヒクル、一方向ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔ検定。融合タンパク質１群では、３日目の原因不明の早期死亡のために１つの動物データが利用できなかった。

【図5A】リン酸緩衝液ｐＨ７．０中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図5B】リン酸緩衝液ｐＨ６．５中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図5C】ヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図5D】ヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図5E】クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図5F】クエン酸塩緩衝液ｐＨ５．５中の融合タンパク質１の拡散係数のプロットである。拡散係数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。

【図6】４０及び８０ｍｇ／Ｌの融合タンパク質１の両方について２つの波長で分析された濁度測定値のグラフである。図６Ａは波長６６０ｎｍを示し、図６Ｂは波長３２０ｎｍを示す。ＮａＰｉ＝リン酸ナトリウム、Ｃｉｔ＝クエン酸及びＨｉｓ＝ヒスチジン。

【図7AB】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色ゲルを用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。図７Ａ及び図７Ｂは、クエン酸塩緩衝液中、４℃又は４０℃で開始（レーン２及び３）、４日間（レーン４及び５）、７日間（レーン６及び７）及び１４日間（レーン８及び９）インキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。

【図7CD】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色ゲルを用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。図７Ｃ及び図７Ｄは、４℃又は４０℃のヒスチジン緩衝液中で開始（レーン２及び３）、４日間（レーン４及び５）、７日間（レーン６及び７）及び１４日間（レーン８及び９）インキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。

【図7E】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色ゲルを用いた非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。図７Ｅは、ヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液中、４℃又は４０℃で２８日目にインキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。ＮａＰｉ＝リン酸ナトリウム、Ｃｉｔ＝クエン酸及びＨｉｓ＝ヒスチジン。各試料ウェルについて、３μｇのタンパク質を負荷した。

【図8AB】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色した還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。図８Ａ及び図８Ｂは、クエン酸塩緩衝液中、４℃又は４０℃で開始（レーン２及び３）、４日間（レーン４及び５）、７日間（レーン６及び７）及び１４日間（レーン８及び９）インキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。

【図8CD】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色した還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。図８Ｃ及び図８Ｄは、ヒスチジン緩衝液中、４℃又は４０℃で開始（レーン２及び３）、４日間（レーン４及び５）、７日間（レーン６及び７）及び１４日間（レーン８及び９）インキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。

【図8E】融合タンパク質１のクーマシーブルー染色した還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。図８Ｅは、ヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液中、４℃又は４０℃で２８日目にインキュベートした４０又は８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を含む。ＮａＰｉ＝リン酸ナトリウム、Ｃｉｔ＝クエン酸及びＨｉｓ＝ヒスチジン。各試料ウェルについて、３μｇのタンパク質を負荷した。

【図9】２５ｍＭヒスチジン緩衝液、１９０ｍＭトレハロース、０．０３％ＰＳ２０中に製剤化され、示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって決定された１ｍｇ／ｍＬでの融合タンパク質１のｐＨ６．０での熱安定性のグラフである。

【図10】ヒトＶＥＧＦ－Ａ_１６５によって誘導される網膜血管透過性を阻害する、オランダのベルトウサギにおける示された濃度での融合タンパク質１の単回用量投与のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0035】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0036】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「結合ドメイン」への言及は、複数の結合ドメイン及び当業者に公知のその等価物を含む。

【0037】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然タンパク質のアミノ酸配列、又は１つ若しくは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、及び／若しくは置換等の１つ若しくは複数の突然変異を有するアミノ酸配列を有するペプチドの長鎖を指すために互換的に使用され得る。

【0038】

「融合タンパク質」は、互いに共有結合した２つ以上の部分を有するタンパク質を指し、各部分は異なるタンパク質に由来する。

【0039】

本発明は、インテグリン（アミノ酸配列の説明については、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９４３，７２８号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１５／４６３２２を参照されたい）、抗インテグリンαｖβｘ抗体（アミノ酸配列の説明については、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第６，１６０，０９９及び同第８，３５０、０１０号を参照されたい）、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンアイソフォームαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン（アミノ酸配列の説明については、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第２０１５／０２１８２５１号を参照されたい）及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチド、血管新生因子及びＦｃドメインを標的とする他のタンパク質結合ペプチドを含む融合タンパク質を含む医薬製剤であって、ｘは１、３、５、６又は８である、医薬製剤を提供する。

【0040】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖及び２本の軽鎖で構成される免疫グロブリン分子を指すことを意図している。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨ、並びに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシ末端にある。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む。抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆａｂ’フラグメントは、１つの軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域をより多く含む１つの重鎖とを含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してダイアボディを形成することができる。可変フラグメント（Ｆｖ）領域は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、重鎖及び軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成しているＦｖ分子である。一本鎖抗体は、国際公開第８８／０１６４９号パンフレット及び米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号で詳細に論じられる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２本の完全長Ｌ鎖及び２本の完全長Ｈ鎖を有する免疫グロブリン分子、並びに抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆｖ領域、ｓｃＦｖ等のそのフラグメントを含む。

【0041】

「Ｆｃドメイン」という用語は、単量体又は多量体形態であるかどうかにかかわらず、抗体の非抗原結合部分の配列を含む分子又は配列を指す。Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤに由来し得る。完全長Ｆｃは、以下のＩｇ重鎖領域：ＣＨ１とＣＨ２との間、ＣＨ２とＣＨ３との間の可撓性ヒンジ領域からなり、２つの鎖は、典型的には、可撓性ヒンジ領域内のジスルフィド結合によって連結されている。

【0042】

本発明は、ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントを含むインテグリン結合ペプチド、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン及びＦｃドメインを含む他のタンパク質結合ペプチドを含む融合タンパク質であって、ＲＧＤモチーフ上又はＲＧＤモチーフに隣接する少なくとも１つの変異を含む融合タンパク質を提供する。本発明の実施形態によれば、ディスインテグリン及びそのインテグリン結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ディスインテグリン」は、インテグリンの強力な可溶性リガンドであるシステインに富むタンパク質又はポリペプチドのクラスを指す。ＲＧＤモチーフは、ほとんどの単量体ディスインテグリンで保存されているトリペプチド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）であり、インテグリン結合ループに位置する。本明細書中に記載されるディスインテグリンは、蛇毒から単離されるか、又は野生型形態に由来し、ＲＧＤモチーフ上に、又はＲＧＤモチーフに隣接して、様々なインテグリンアイソフォームに選択的に結合するか、又は様々なインテグリンアイソフォームを標的とする少なくとも１つの変異を有する。本明細書で使用される「ＲＧＤモチーフに隣接する」という用語は、所与のペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列中のＲＧＤモチーフから１５～２０アミノ酸以内の任意のアミノ酸残基で生じる任意の突然変異を意味する。

【0044】

ディスインテグリンの他のアミノ酸配列バリアントも企図される。例えば、タンパク質をコードするアミノ酸配列を改変することによって、ディスインテグリンの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することができる。ディスインテグリン変異体は、タンパク質をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって修飾を導入することによって調製することができる。そのような改変には、ディスインテグリンの核酸又はアミノ酸配列からの欠失、その中への挿入及び／又はその中の置換等の突然変異が含まれる。最終構築物が、インテグリンスーパーファミリーメンバーへの結合及び／又はインテグリン活性化経路の阻害等の所望の特徴を有するならば、ディスインテグリンの最終アミノ酸構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換の任意の組合せを行うことができる。

【0045】

タンパク質又はポリペプチドの生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大部分の維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。

【0046】

突然変異誘発のための好ましい位置である融合タンパク質の特定の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｂ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９；２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」として知られている。例えば、アミノ酸と標的結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼすために、残基又は標的残基の群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の荷電残基）、中性アミノ酸（最も好ましくはグリシン、アラニン又はロイシン）又は逆荷電アミノ酸（正電荷から負電荷又はその逆）で置き換えられる。次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置は、置換部位又は置換部位に更なる又は他のバリアントを導入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め定められているが、変異の性質自体は予め定められている必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するために、ランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で行うことができ、発現された融合ポリペプチドバリアントを所望の活性についてスクリーニングする。例えば、その安定性を改善するために、融合タンパク質又はタンパク質成分にシステイン結合（複数可）を付加することができる。

【0047】

したがって、本明細書中には、本明細書中に開示される任意の融合タンパク質の成分であり得るディスインテグリン変異体が提供される。いくつかの実施形態では、ディスインテグリンは、ロドストミン（配列番号１）、トリフラビン（配列番号３）、エキスタチン（配列番号４）、トリムクリン（配列番号５）、エレガンチン（配列番号６）及びトリグラミン（配列番号７）からなる群から選択されるディスインテグリンのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ディスインテグリンは、ロドストミン（配列番号１）、トリフラビン（配列番号３）、エキスタチン（配列番号４）、トリムクリン（配列番号５）、エレガンチン（配列番号６）又はトリグラミン（配列番号７）のＲＧＤモチーフ上又はそれに隣接する少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ディスインテグリンは、ディスインテグリン変異体（配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号２中のＸａａは、ディスインテグリンの野生型とは異なるアミノ酸配列バリアントを産生するために挿入、置換又は欠失のいずれかによって修飾され得る様々な位置を示す。いくつかの例によれば、野生型ロドストミン（配列番号１）のＲＧＤモチーフ中のグリシン（Ｇｌｙ）に対応する配列番号２の位置５０のＸａａを、グリシン以外の天然に存在するアミノ酸で置換して、ロドストミン変異体を作製することができる。他の例では、配列番号２中の１つ又は複数のＸａａはまた、野生型ロドストミン（配列番号１）の対応する位置に最初に見出されたもの以外の天然に存在するアミノ酸で置換されて、様々なロドストミン変異体を生成し得る。更に、ディスインテグリン変異体は、配列番号２中の任意のＸａａに単一の変異のみを含むことに限定されず、配列番号２中のＸａａのいくつかの位置又はディスインテグリンの他のコンセンサス配列中の対応する位置に生じる複数の変異（例えば、配列番号３～７）も本発明の範囲に包含され得ることに留意されたい。

【0048】

ロドストミン変異体は、米国特許第７，９４３，７２８号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１５／４６３２２号に記載され、それらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１５／４６３２２には、配列番号２４～配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異ＲＧＤループと、配列番号２９～配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異リンカー、及び配列番号４２～配列番号４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異Ｃ末端の少なくとも一方とからなるディスインテグリンバリアントが記載されている。より好ましくは、ディスインテグリンバリアントは、本明細書中に記載の変異ＲＧＤループ、変異リンカー及び変異Ｃ末端を含む。

【0049】

例えば、リンカー領域又はＣ末端におけるＲＧＤモチーフに加えて１つ又はそれを超える修飾を有するロドストミン又はディスインテグリンの変異体は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１又はαＩＩｂβ３に選択的に結合する能力を示した。例えば、ＳＲＡＧＫ（配列番号５０）がＫＫＫＲＴ（配列番号５１）、ＫＫＡＲＴ（配列番号５２）、ＭＫＫＧＴ（配列番号５３）ＩＥＥＧＴ（配列番号５４）、ＬＫＥＧＴ（配列番号５５）、ＡＫＫＲＴ（配列番号５６）、ＫＡＫＲＴ（配列番号５７）、ＫＫＡＲＴ（配列番号５８）、ＫＫＫＡＴ（配列番号５９）、ＫＫＫＲＡ（配列番号６０）、ＫＡＫＲＡ（配列番号６１）又はＳＫＡＧＴ（配列番号６２）アミノ酸によって置き換えられたリンカー領域（３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ）における変異を有するロドストミンバリアントは、インテグリンに対して以下の順序で最も高い効果を有した：αＩＩｂβ３（約２倍）＞α５β１（約５倍）＞αｖβ３（約１４倍）。

【0050】

ＲＹＨが、ＲＹＨ（配列番号６３）、ＲＮＧＬ（配列番号６４）、ＲＧＬＹＧ（配列番号６５）、ＲＧＬＹ（配列番号６６）、ＲＤＬＹＧ（配列番号６７）、ＲＤＬＹ（配列番号６８）、ＲＮＧＬＹＧ（配列番号６９）又はＲＮＰＷＮＧ（配列番号７０）アミノ酸によって置き換えられた、Ｃ末端領域（６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ）における変異を有するロドストミンバリアントは、インテグリンに対して、以下の順序で最も高い効果を有した：αＩＩｂβ３（約１３倍）＞αｖβ５（約８倍）＝αｖβ６（約８倍）＞αｖβ３（約４倍）＞α５β１（約２倍）。表１は、配列番号２４～４９の配列及び配列番号１におけるそれらの対応する位置を示す。

【0051】

【表1】

【0052】

ディスインテグリンのバリアントは、主に上記のアミノ酸配列を参照して論じられているが、アルボラブリン、アップルギン、バシリシン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、セレベリン、セラスチン、クロトロキシン、デュリシン、フラボリジン、フラボスタチン、ハリシン、ハリスタチン、ジャララシン、ジャラスタチン、キストリン、ラチェシン、ルトシン、モロシン、サルモシン、サキサチリン、テルゲミニン、トリメスタチン、トリムターゼ、ウスリスタチン、ビリジアン、及びＲＧＤモチーフ上又はそれに隣接する少なくとも１つの変異を有するそれらの変異体等の蛇毒をコードするポリペプチド配列又はヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれ得る。

【0053】

理論に拘束されるものではないが、本明細書では、インテグリンは、インテグリンスーパーファミリーメンバーに結合して多価インテグリン受容体との相互作用を遮断することによってインテグリン活性化経路を阻害することが企図される。いくつかの局面において、ディスインテグリンは、インテグリンアイソフォームαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α５β１及び／又はαＩＩｂβ３を含むがこれらに限定されないインテグリンスーパーファミリーメンバーに結合する。

【0054】

本発明によれば、融合タンパク質の他のタンパク質結合ペプチドは、腫瘍抗原、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、ヘッジホッグファミリーメンバー、受容体チロシンキナーゼ、プロテオグリカン関連分子、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーメンバー、Ｗｎｔ関連分子及び血管新生標的からなる群から選択される標的に結合する受容体タンパク質であり得る。

【0055】

本発明のいくつかの実施形態によれば、他のタンパク質結合ペプチドは、限定するものではないが、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、エフリン（Ｅｐｈ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ニューロピリン（ＮＲＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）及びそれらの受容体を含む血管新生標的に特異的に結合し得る。したがって、本発明の実施形態によれば、他のタンパク質結合ペプチドは、血管新生標的に結合し、血管新生標的に拮抗する受容体タンパク質の細胞外部分を含み得る。他の実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、血管新生因子受容体の細胞外部分に結合し得る。

【0056】

いくつかの実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＶＥＧＦリガンドに結合する抗ＶＥＧＦ抗体（そのアミノ酸配列の説明については国際公開第２０１５／２００９０５号パンフレットを参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）又はＶＥＧＦ受容体に結合する抗ＶＥＧＦＲ１若しくは抗ＶＥＧＦＲ２抗体（そのアミノ酸配列の説明については、米国特許第５，８７４，５４２号明細書を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であり得る。他の実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドはまた、ＰＤＧＦリガンドに結合する抗ＰＤＧＦ抗体（そのアミノ酸配列の説明については、米国特許第５，０９４，９４１号明細書を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）又はＰＤＧＦ受容体に結合する抗ＰＤＧＦＲβ抗体（そのアミノ酸配列の説明については、米国特許第９，２６５，８２７号明細書を参照されたく、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）であり得る。

【0057】

特定の実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３のいずれか１つと同じＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、本明細書中に記載されるＶＥＧＦＲのいずれかのＶＥＧＦＲの少なくとも１つの細胞外部分を含む。例えば、他のタンパク質結合ペプチドは、ＶＥＧＦＲ１の少なくとも１つの細胞外部分又はＶＥＧＦＲ２の１つの細胞外部分を含む。別の例では、他のタンパク質結合ペプチドは、Ｉｇ様ドメイン２（Ｄ２）等のＶＥＧＦＲ１の１つの細胞外部分と、Ｉｇ様ドメイン３（Ｄ３）等のＶＥＧＦＲ２の１つの細胞外部分とを含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ１の１つの細胞外部分と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ２の１つの細胞外部分とを含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の細胞外部分の融合物を含む。

【0058】

他の実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）：ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβのいずれか１つと同じＰＤＧＦに結合する。いくつかの実施形態では、他のタンパク質結合ペプチドは、本明細書に記載のＰＤＧＦＲのいずれかのＰＤＧＦＲの少なくとも１つの細胞外部分を含む。例えば、他のタンパク質結合ペプチドは、ＰＤＧＦＲαの少なくとも１つの細胞外部分又はＰＤＧＦＲβの１つの細胞外部分を含む。別の例では、他のタンパク質結合ペプチドは、Ｉｇ様ドメイン１～３等のＰＤＧＦＲβの１つの細胞外部分を含む。いくつかの態様では、他のタンパク質結合ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲの細胞外部分を含む。

【0059】

他の実施形態によれば、本発明はまた、ＲＧＤモチーフ上又はＲＧＤモチーフに隣接する少なくとも１つの突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒト又はヒト化定常サブ領域、並びにＶＥＧＦＲ１のＩｇ様Ｄ２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇ様Ｄ３を有する他のタンパク質結合ペプチドを含むインテグリン結合ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の更なる実施形態では、インテグリン結合ペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0060】

参照ポリペプチド又は核酸配列に関する「パーセント（％）配列同一性」という用語は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド又は核酸配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である候補配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列又は核酸配列の同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８７）に記載されているもの、及びＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）Ｓｏｆｔｗａｒｅを含むものを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のために、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性は、以下のように計算される：画分Ｘ／Ｙの１００倍、Ｘは、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムによる同一のマッチとしてのアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡとＢの％アミノ酸配列同一性は、ＢとＡの％アミノ酸配列同一性に等しくないことが理解されよう。

【0061】

本発明は、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質を提供し、各融合タンパク質は、本明細書に開示される任意の融合タンパク質を含む。一実施形態では、二量体融合タンパク質は、２つの同一の融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は、２つの異なる融合タンパク質を含み得る。本明細書に開示される融合タンパク質は、２つ以上の同一の融合タンパク質の多量体を形成し得るか、又はヒト抗体若しくはヒト化抗体の定常部分領域を含む多量体化ドメインを介して異種融合タンパク質を形成し得る。いくつかの実施形態では、ヒト抗体又はヒト化抗体の定常部分領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域及びＩｇＥ Ｆｃ領域からなる群から選択される。更なる実施形態では、ヒト抗体又はヒト化抗体の定常部分領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域及びＩｇＧ４ Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの態様において、部分領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンをコードするアミノ酸配列は、当技術分野で周知である。

【0062】

融合タンパク質の成分は、互いに直接連結されてもよく、又はリンカーを介して連結されてもよい。一般に、「リンカー」という用語は、１つ又は複数の構成要素ドメインの間に挿入され得る１つ又は複数の分子、例えば核酸、アミノ酸又は非ペプチド部分を意味する。例えば、操作を容易にするために、構成要素間に所望の関心部位を提供するためにリンカーを使用することができる。リンカーはまた、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を増強し、立体障害を減少させて、その成分がその最適な三次構造をとる及び／又はその標的分子と適切に相互作用し得るように提供され得る。リンカー配列は、受容体成分に天然に接続した１つ又は複数のアミノ酸を含み得るか、又は融合タンパク質の発現を増強して、目的の特異的に所望の部位を提供し、成分ドメインが最適な三次構造を形成することを可能にし、及び／又は成分とその標的分子との相互作用を増強するために使用される付加配列であり得る。

【0063】

好ましくは、リンカーは、融合タンパク質内の各機能性成分の構造を妨害することなく、融合タンパク質成分の柔軟性を高める。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、２～１００アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーである。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｇｌｙ（Ｇ）ｎ及びＧｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカー等の少なくとも２つのアミノ酸残基を有する直鎖状ペプチドが挙げられる。本明細書に記載のＧＳリンカーには、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＳＧ）ｎ、（Ｇ_２Ｓ）ｎ，Ｇ_２Ｓ_２Ｇ、（Ｇ_２ＳＧ）ｎ、（Ｇ_３Ｓ）ｎ、（Ｇ_４Ｓ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎＧｎ及びＧＳＧ_４ＳＧ_４ＳＧが含まれるが、これらに限定されず、ｎは１つ又は複数である。（Ｇ）ｎリンカーの一例としては、Ｇ_９リンカーが挙げられる。適切な線状ペプチドには、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、並びにアラニル及び／又はセリニル及び／又はプロリニル及び／又はグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが含まれる。リンカー部分は、本明細書に開示される融合タンパク質の成分のいずれかを連結するために使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーが、受容体タンパク質の細胞外部分と免疫グロブリンの定常サブ領域との間で使用される。他の実施形態では、リンカーが、ディスインテグリン又はそのバリアントと免疫グロブリンの定常サブ領域との間で使用される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、受容体タンパク質の細胞外部分とディスインテグリン又はそのバリアントとの間のリンカー、及びディスインテグリン又はそのバリアントと免疫グロブリンの定常サブ領域との間のリンカーを含む。本発明で実施されるように、融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーを含み得るが、４つ以下のリンカーを含み得る。

【0064】

本明細書に記載の融合タンパク質は、宿主細胞から融合タンパク質を分泌するように機能するシグナルペプチドを含んでも含まなくてもよい。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、目的のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はシグナルペプチドを含まない。

【0065】

更に、本発明に記載される融合タンパク質は、タンパク質結合ペプチドの修飾形態を含み得る。例えば、融合タンパク質成分は、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、及び任意のタンパク質結合ペプチドへのリン酸化を含む翻訳後修飾を有し得る。

【0066】

実施形態は、融合タンパク質に含まれる２つのタンパク質結合ペプチドを参照して一般に記載されているが、本発明はまた、血管新生の過程を阻害する観点から任意の更なる効果又は相乗効果を提供するために３つ以上のタンパク質結合ペプチドを組み込んだ融合タンパク質を企図する。例えば、他の血管新生標的に結合するか、又は既存の２つのタンパク質結合ペプチドに連結される血管新生因子アンタゴニストとして作用する追加のタンパク質結合ペプチドが存在し得る。

【0067】

本明細書に開示される医薬製剤の融合タンパク質は、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はＤＥＡＥ等のカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を用いたゲル濾過；疎水性親和性樹脂、マトリックス上に固定化された適切な結合パートナーを使用したリガンド親和性、遠心分離、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣｏｒｅ、ウエスタンブロットアッセイ、アミノ酸及び核酸配列決定、並びに生物学的活性等の一般的に公知の方法を使用して精製及び同定することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞で発現され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、緩衝液交換、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び透析を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の標準的な精製技術の組合せを使用して宿主細胞から精製される。したがって、回収された融合タンパク質は実質的に純粋である。更なる実施形態では、回収された融合タンパク質は、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度の少なくともいずれかである。

【0068】

本明細書に開示される融合タンパク質又は融合タンパク質成分は、標的結合パートナーに対する親和性、競合結合、阻害活性、細胞増殖の阻害、腫瘍増殖の阻害、及び血管新生の阻害を含むがこれらに限定されない生物学的活性について特徴付け又は評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質又は融合タンパク質成分は、インビトロ及びインビボで生物学的活性について評価することができる。結合親和性を評価するための多くの方法が当技術分野で公知であり、滴定法によって結合パートナーに対する融合タンパク質又は融合タンパク質成分の結合親和性を同定するために使用することができる。結合速度論は、解離定数（Ｋ_Ｄ）又は最大半量有効濃度（ＥＣ_５０）値として表される定常状態平衡結合定数として表すことができる。

【0069】

一定の実施形態では、融合タンパク質が、活性の阻害（例えば、血管新生因子活性及び／又はインテグリン活性の阻害）について１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又は０．００１ｎＭ以下のＥＣ_５０を有する。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、融合タンパク質は、結合パートナー（血管新生因子及び／又はインテグリン）に対するＫ_Ｄが約１．０ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ又は５ｐＭ未満であり、これらの数字の間の任意の値を含む。

【0070】

特定の実施形態では、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、約４．０～９．０である。特定の実施形態では、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、９．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、又はそれらの間の任意の値である。好ましくは、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は８．１７である。

【0071】

本発明はまた、ディスインテグリン、抗インテグリンαｖβｘ抗体、抗インテグリンα５β１抗体、インテグリンαｖβｘ又はα５β１を標的とするフィブロネクチン及びそれらのインテグリン結合フラグメントからなる群から選択されるインテグリン結合ペプチド、血管新生因子を標的とする他のタンパク質結合ペプチド及びＦｃドメインを含む融合タンパク質を含む医薬組成物を提供し、ここで、ｘは１、３、５、６又は８である。本発明の組成物は、治療有効量の融合タンパク質を含む。

【0072】

「治療有効量」という用語は、所望の生物学的又は臨床的効果を誘発するのに必要な治療活性化合物の量を意味する。本発明の実施形態によれば、「治療有効量」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量である。治療有効量は、１回以上の投与で投与することができる。疾患状態に関して、治療有効量は、疾患の改善、安定化、又は発症の遅延に十分な量である。本発明の具体的な実施形態によれば、治療有効量は、血管新生、血管透過性、浮腫、炎症、網膜症、線維症又は癌を特徴とする疾患等の異常な血管新生を特徴とする障害を治療又は予防するために必要な融合タンパク質の量である。

【0073】

「効力」という用語は、投与された臨床用量で意図されたように機能する融合タンパク質の能力を意味する。

【0074】

本明細書における「医薬製剤」という用語は、例えば治療／医薬用途のためにＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト又はコンベルセプト）を対象に投与するために使用される、薬学的に許容される担体を含む製剤を指す。

【0075】

本明細書における「純度」という用語は、融合タンパク質の汚染がないことを指す。本明細書で言及される夾雑物には、不純物としての化合物製造プロセス及び／又は製造されたタンパク質化合物の分解から生じる、意図された融合タンパク質分子以外のタンパク質種が含まれる。

【0076】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む医薬組成物は、約０．５～約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０～約８０ｍｇ／ｍＬ、例えば約４０、５０、６０、７０又は８０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約４０±約４ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で緩衝液に製剤化された融合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、約４０ｍｇ／ｍＬを超えるタンパク質濃度で緩衝液中に製剤化される。

【0077】

特定の実施形態では、緩衝剤は、約５．５～７．０、より好ましくは約６．０～６．５、更により好ましくは約６．０のｐＨを有する緩衝剤である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約６．５～８、より好ましくは約７～７．５、更により好ましくは約７．２のｐＨを有するリン酸緩衝剤である。リン酸緩衝液は、約５ｍＭ～２０ｍＭのリン酸ナトリウム、例えば５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ又は２０ｍＭのリン酸ナトリウム、より好ましくは約１０ｍＭのリン酸ナトリウム；約２０～６０ｍＭ塩化ナトリウム、より好ましくは約４０ｍＭ塩化ナトリウム；約１～１０％重量／体積（ｗ／ｖ）スクロース、より好ましくは約５％ｗ／ｖスクロース；及び約０．０１から０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは約０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。

【0078】

特定の実施形態では、医薬製剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールを、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％ｗ／ｖ等の約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度で含む。

【0079】

好ましい実施形態では、ポリオールは、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、例えば約２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、又は２５０ｍＭの濃度のトレハロースである。他の好ましい実施形態では、ポリオールは、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、又は２００ｍＭ等の約１００～２００ｍＭの濃度のトレハロースである。他の好ましい実施形態では、ポリオールは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである。

【0080】

特定の実施形態では、医薬製剤は緩衝剤を含む。特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、又は５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、例えば約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は４０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、緩衝剤は、約２０ｍＭ～３０ｍＭ、例えば約２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ又は３０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、緩衝剤は約２５ｍＭの濃度である。

【0081】

特定の実施形態では、医薬製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む。

【0082】

好ましい実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、例えば約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は４０ｍＭの濃度のヒスチジンである。他の好ましい実施形態では、ヒスチジンは、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、例えば約２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、又は３０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、ヒスチジンは約２５ｍＭの濃度である。

【0083】

特定の実施形態では、医薬製剤は界面活性剤を含む。好ましい実施形態では、界面活性剤は、約０．０１％、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、又は４．０％等、約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度である。他の好ましい実施形態では、界面活性剤は、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．０％ｗ／ｖ等の約０．０１％～約１．０％ｗ／ｖの濃度である。他の好ましい実施形態では、界面活性剤は約０．０３％ｗ／ｖの濃度である。

【0084】

好ましい実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である。好ましい実施形態では、ポリソルベート２０は、約０．０３％ｗ／ｖの濃度である。

【0085】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、－７０℃、－６０℃、－５０℃、－４０℃、－３０℃、－２０℃、－１０℃、０℃又は５℃等、－７０℃～５℃で少なくとも２年間、安定な医薬製剤中にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、－７０℃、－２０℃、及び／又は５℃で少なくとも６ヶ月間、例えば６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、又はそれ以上安定である医薬製剤中にある。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、－７０℃、－２０℃、及び／又は５℃で少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、又は１０年間以上安定な医薬製剤中にある。他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２年間安定な医薬製剤中にある。

【0086】

いくつかの実施形態では、製剤は、－７０℃～２５℃、例えば－７０℃、－６０℃、－５０℃、－４０℃、－３０℃、－２０℃、－１０℃、０℃、又は５℃若しくは２５℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－７０℃、－２０℃、及び／又は５℃で、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、又は１０年以上等、少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する。

【0087】

いくつかの実施形態では、製剤は塩を更に含む。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム又は塩化カリウムから選択される。

【0088】

特定の実施形態では、製剤は、少なくとも１つのアミノ酸を更に含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、プロリン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート、及びイソロイシンからなる群から選択される。

【0089】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース、及び０．０３％ポリソルベート２０の濃度で融合タンパク質を含み、製剤は約６．０のｐＨにある。

【0090】

本発明はまた、製剤の各成分を単一の組成物に組み合わせる工程を含む、本明細書に記載の任意の製剤を製造する方法を提供する。そのような方法は、得られた製剤をバイアル又は注射装置に添加する工程を含み得る。この方法は、滅菌濾過工程を更に含んでもよい。そのような方法の生成物である任意の組成物も本発明の一部を形成する。例えば、本明細書の実施形態はまた、例えば本明細書で論じられるように、ヒスチジン系緩衝液を界面活性剤（ポリソルベート２０等）、融合タンパク質、トレハロース、及び場合により１つ又は複数の追加の成分と組み合わせることによって製剤を調製する方法を含む。

【0091】

本発明はまた、個体又は被験体におけるインテグリン関連疾患を治療又は予防するための本発明による組成物の使用に関する。「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾患の１つ又は複数の局面又は症状を治療又は予防する方法は、融合タンパク質を含む有効量の組成物を個体に投与することを含む。

【0092】

本明細書に記載の方法は、炎症性疾患、眼疾患、自己免疫疾患、又は癌を含むがこれらに限定されない様々な疾患の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、治療される疾患には、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節症、癌、組織／器官線維症、網膜色素変性症、ブドウ膜炎（前部ブドウ膜炎又は後部ブドウ膜炎等）、及び血管新生又は虚血を特徴とする眼疾患（角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）等）が含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

本明細書に記載の組成物は、静脈内、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、髄腔内、経皮、経胸膜、局所、粘膜、胃腸、関節内、嚢内、脳室内、頭蓋内、尿道内、肝臓内及び腫瘍内を含むがこれらに限定されない任意の経路を介して個体に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与される（例えば、静脈内注射によって）。いくつかの実施形態では、組成物は、局所的に（例えば、その動脈内又は眼内関連注射によって）投与される。

【0094】

いくつかの実施形態では、組成物は、眼又は眼組織に直接投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば点眼剤で眼に局所投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼又は眼に関連する組織への注射によって投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、上脈絡膜注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、又は後傍強膜送達によって投与することができる。これらの方法は当技術分野で公知である。組成物は、例えば、硝子体、房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、網膜脈絡膜組織、黄斑、又は個体の眼内又は眼の近傍の他の領域に投与され得る。

【0095】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、又は１０ｍｇ等、眼当たり約０．０３～１０ｍｇの用量で眼に投与される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、又は６ｍｇ等の眼当たり約３．０～６．０ｍｇの用量で眼に送達される。他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、眼当たり約４ｍｇの用量で眼に送達される。

【0096】

組成物の最適な有効量は、経験的に決定することができ、疾患の種類及び重症度、投与経路、疾患の進行及び健康状態、個体の質量及び身体面積に依存する。そのような決定は、当業者の技術の範囲内である。融合タンパク質を含む組成物は、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、又は１年に１回投与することもできる。

【0097】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで好ましい方法及び材料を説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を記載するために参照により本明細書に組み込まれる。

【0098】

実施形態
本出願は、以下の番号が付けられた実施形態を含むが、これらに限定されない。

【0099】

実施形態１は、ａ）約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤とを含む、医薬製剤であって、
製剤は約５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤である。

【0100】

実施形態２は、界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である、実施形態１に記載の医薬製剤である。

【0101】

実施形態３は、ポリソルベートがポリソルベート２０である、実施形態２に記載の医薬製剤である。

【0102】

実施形態４は、界面活性剤が約０．０３％ｗ／ｖの濃度である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0103】

実施形態５は、融合タンパク質が約１ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0104】

実施形態６は、融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態５に記載の医薬製剤である。

【0105】

実施形態７は、ポリオールが約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、好ましくは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0106】

実施形態８は、トレハロースが約１９０ｍＭの濃度である、実施形態７に記載の医薬製剤である。

【0107】

実施形態９は、緩衝剤が、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0108】

実施形態１０は、ヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である、実施形態９に記載の医薬製剤である。

【0109】

実施形態１１は、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、及び
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0110】

実施形態１２は、融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0111】

実施形態１３は、ｐＨが約５．５～約７．０、好ましくはｐＨが約６．０である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0112】

実施形態１４は、ｐＨが約６．０である、実施形態１３に記載の医薬製剤である。

【0113】

実施形態１５は、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0114】

実施形態１６は、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0115】

実施形態１７は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0116】

実施形態１８は、塩が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される実施形態１７に記載の医薬製剤である。

【0117】

実施形態１９は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0118】

実施形態２０は、アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、実施形態１９に記載の医薬製剤である。

【0119】

実施形態２１は、眼疾患を治療する方法に使用される、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0120】

実施形態２２は、眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、実施形態２１に記載の医薬製剤である。

【0121】

実施形態２３は、製剤が、約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤は、約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0122】

実施形態２４は、製剤が眼当たり約４ｍｇの用量で投与される、実施形態２３に記載の医薬製剤である。

【0123】

実施形態２５は、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０を含む、医薬製剤であって、
製剤は約６．０のｐＨである、医薬製剤である。

【0124】

実施形態２６は、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、実施形態２５に記載の医薬製剤である。

【0125】

実施形態２７は、融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、実施形態２６に記載の医薬製剤である。

【0126】

実施形態２８は、－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0127】

実施形態２９は、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0128】

実施形態３０は、約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態２５～２９のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0129】

実施形態３１は、塩が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される実施形態３０に記載の医薬製剤である。

【0130】

実施形態３２は、少なくとも１つのアミノ酸を約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0131】

実施形態３３は、アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、実施形態３２に記載の医薬製剤である。

【0132】

実施形態３４は、眼疾患を治療する方法に使用される、実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0133】

実施形態３５は、眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、実施形態３４に記載の医薬製剤である。

【0134】

実施形態３６は、製剤が、約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤は、約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【0135】

実施形態３７は、製剤が眼当たり約４ｍｇの用量で投与される、実施形態３６に記載の医薬製剤である。

【0136】

実施形態３８は、対象の眼疾患を治療する方法であって、
ａ）約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）約１％～約１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ４００～１２０００等からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）約０．０１～約４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤を対象に投与することを含み、
ｐＨが約５．５～７．５であり、場合により、製剤が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、方法である。

【0137】

実施形態３９は、界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である、実施形態３８の方法である。

【0138】

実施形態４０は、界面活性剤がポリソルベート２０である実施形態３９の方法である。

【0139】

実施形態４１は、界面活性剤が約０．０３％ｗ／ｖの濃度である、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法である。

【0140】

実施形態４２は、融合タンパク質が約１ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法である。

【0141】

実施形態４３は、融合タンパク質が約４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態４２に記載の方法である。

【0142】

実施形態４４は、ポリオールが約１５０ｍＭ～約２３０ｍＭ、好ましくは約１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、実施形態３８～４３のいずれか１つに記載の方法である。

【0143】

実施形態４５は、トレハロースが約１９０ｍＭの濃度である、実施形態４４に記載の方法である。

【0144】

実施形態４６は、緩衝剤が約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である、実施形態３８～４５のいずれか１つに記載の方法である。

【0145】

実施形態４７は、ヒスチジンが約２５ｍＭの濃度である実施形態４６に記載の方法である。

【0146】

実施形態４８は、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、及び
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、実施形態３８～４７のいずれか１つに記載の方法である。

【0147】

実施形態４９は、融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法である。

【0148】

実施形態５０は、ｐＨが約６．０～約６．５、好ましくはｐＨが約６．０である、実施形態３８～４９のいずれか１つに記載の方法である。

【0149】

実施形態５１は、ｐＨが約６．０である実施形態５０の方法である。

【0150】

実施形態５２は、製剤が－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、実施形態３８～５１のいずれか１つに記載の方法である。

【0151】

実施形態５３は、製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の方法である。

【0152】

実施形態５４は、製剤が約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で塩を更に含む、実施形態３８～５３のいずれか１つに記載の方法である。

【0153】

実施形態５５は、塩が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される実施形態５４に記載の方法である。

【0154】

実施形態５６は、製剤が約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の方法である。

【0155】

実施形態５７は、アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、実施形態５６に記載の方法である。

【0156】

実施形態５８は、眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、網膜色素線条症、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性及び非滲出性加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、実施形態３８～５７のいずれか１つに記載の方法である。

【0157】

実施形態５９は、製剤が約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態３８～５８のいずれか１つに記載の方法である。

【0158】

実施形態６０は、製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態５９に記載の方法である。

【0159】

実施形態６１は、対象の眼疾患を治療する方法であって、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０
を含む、医薬製剤を対象に投与することを含み、
製剤は約６．０のｐＨである、方法である。

【0160】

実施形態６２は、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で、
ａ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、
ｂ）ヒト免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、
ｃ）インテグリン結合タンパク質又はそのフラグメント
を含む、実施形態６１に記載の方法である。

【0161】

実施形態６３は、融合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、実施形態６２に記載の方法である。

【0162】

実施形態６４は、製剤が－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の方法である。

【0163】

実施形態６５は、製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃、好ましくは２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、実施形態６１～６４のいずれか１つに記載の方法である。

【0164】

実施形態６６は、製剤が約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の方法である。

【0165】

実施形態６７は、塩が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される実施形態６６に記載の方法である。

【0166】

実施形態６８は、製剤が約１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の方法である。

【0167】

実施形態６９は、アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、実施形態６８に記載の方法である。

【0168】

実施形態７０は、眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載の方法である。

【0169】

実施形態７１は、製剤が約０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは約３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態６１～７０のいずれか１つに記載の方法である。

【0170】

実施形態７２は、製剤が約４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態７１の方法である。

【実施例】

【0171】

以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定するために提供されるものではない。当業者は、以下の手順が当業者に公知の方法を使用して修正され得ることを認識するであろう。

【0172】

実施例１ アカゲザルにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける融合タンパク質１の評価
融合タンパク質１（複数の標的を有するＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質）を、眼の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のサルモデルにおいて評価した。

【0173】

ＣＮＶモデルでは、アカゲザル（ｎ＝４眼／群）に光凝固を用いて網膜上にレーザー熱傷を行い、２１日間（－２１～０日目）脈絡膜血管新生を発症させた。０日目に、ビヒクル、０．５ｍｇ／眼のＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（０．５ｍｇ／眼）又は融合タンパク質１（０．６ｍｇ、１．０ｍｇ、１．９ｍｇ／眼）を、単回硝子体内（ＩＶＴ）注射によってサルの眼に注射した。有効性エンドポイントを、全ての群において、投与前のベースライン（－２日目）並びに注射後１４日目及び２８日目に評価した。

【0174】

０．５ｍｇのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で処置した眼では、平均漏出領域スコアは、ベースラインと比較して、１４及び２８日目にそれぞれ９１％及び９２％減少した（図１）。平均網膜厚もまた、ベースラインと比較して、それぞれ１１７％及び１２０％減少した（図２）。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）は、ビヒクル対照で処置した眼と比較して統計学的に有意な改善を示した。

【0175】

融合タンパク質１の３つの用量群は全て、ベースライン値及び研究前の値と比較して、レーザー誘発網膜厚及び漏出面積の回復を示した。平均漏出面積スコアは、１４日目及び２８日目にそれぞれ８７％～８９及び７９％～９０％減少した（図１）。平均網膜厚もまた、それぞれ９８％～１２１％及び１０４％～１２９％減少した（図２）。融合タンパク質１は、０．６ｍｇ及び１．０ｍｇの用量について、１４日目及び２８日目にビヒクルコントロールで処置した眼と比較して、統計学的に有意な改善を示した。全ての用量が同様の有効性を示したため、融合タンパク質１の用量依存的な効果は観察されなかった。

【0176】

コラーゲン（線維症の前駆体）に対するマッソン染色を使用した眼の組織学的検査は、融合タンパク質１についてはコラーゲンの厚さの用量依存的減少（眼線維症）を示したが、ビヒクル又はＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）処置群については示さなかった（図３）。

【0177】

結論として、０．６、１．０、及び１．９ｍｇ／眼の融合タンパク質１の単回ＩＶＴ注射は、アカゲザルのレーザー誘発ＣＮＶモデルにおいて血管漏出、網膜の厚さ、及び線維症を効果的に阻害した。ヒト（４ｍＬ）とサル（２ｍＬ）との間の硝子体体積比に基づいて、これらの用量は、１．２ｍｇ、２ｍｇ、及び４ｍｇ／眼のヒト等価用量に等しい。これは、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び血管新生加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）等の網膜疾患の治療における提案された用量の融合タンパク質１を支持する。更に、データは、融合タンパク質１が、従来の抗ＶＥＧＦ単独療法と比較して、患者に利益をもたらす相加効果を有することを示唆している。

【0178】

実施例２ ブレオマイシン誘発Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺線維症モデルにおける融合タンパク質１の評価
３９ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）投与した融合タンパク質１を、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおける抗線維化活性の可能性について評価した。マウスに、１日目にＰＥＮＮＣＥＮＴＵＲＹ（商標）肺内エアロゾル化装置を用いて１．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシンをチャレンジした。
マウスには、１日目から２１日目まで毎日、融合タンパク質１、ニンテダニブエタンスルホン酸塩（ニンテダニブ）又はビヒクル（製剤緩衝液）を静脈内投与し、２２日目に屠殺した。回収した肺組織から、氷上で２０分間、５０％トリクロロ酢酸を用いて総タンパク質を沈殿させた。試料を遠心分離し、ペレットを１ｍＬの１２Ｎ ＨＣｌと混合し、試料が炭化し乾燥するまで１１０℃で１４～１８時間焼成した。断続的なボルテックスを適用しながら室温で７２時間インキュベートすることによって、試料を２ｍＬの脱イオン水に再懸濁した。０．５ｍｇ／ｍＬから出発して、トランス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン標準物（供給源：Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）の段階希釈液を調製した。２００μＬのボルテックスした試料（又は標準）を、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／１０％イソプロパノール（供給源：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ，ＵＳＡ）中の５００μＬの１．４％クロラミンＴに添加し、室温で２０分間インキュベートした。次に、５００μＬのエールリッヒ溶液（７０％イソプロパノール／３０％過塩素酸中１．０Ｍのｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド）（供給源：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ，ＵＳＡ）を添加し、混合し、６５℃で１５分間インキュベートした。試料が室温に達した後、各試料及び標準の光学密度を５５０ｎｍで測定し、ヒドロキシプロリン標準曲線から肺ヒドロキシプロリンの濃度（μｇ／肺）を計算した。プロリンはコラーゲンの主要成分であり、線維症形成を評価するために使用されるマーカーの１つである。

【0179】

肺ヒドロキシプロリンは、ビヒクル対照群（図４）で有意に増加し（ｐ＜０．０５）、肺線維症の誘導の成功を示唆した。融合タンパク質１の複数回投与は、ビヒクル対照と比較してヒドロキシプロリンレベルを著しく阻害し（ｐ＜０．０５）、融合タンパク質１注射後のこれらのマーカーに対する相加効果を示した（図４）。ニンテダニブの連続経口曝露は、ヒドロキシプロリンのレベルの低下に対して穏やかな効果を有した（図４）。

【0180】

したがって、３９ｍｇ／ｋｇで２１日間１日１回静脈内投与された融合タンパク質１は、マウスにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症の主要な肺線維症マーカーである肺ヒドロキシプロリンの有意な減少に関連していた。

【0181】

実施例３ 硝子体内注射用の融合タンパク質１のプレフォーミュレーション
融合タンパク質１のプレフォーミュレーション研究を行って、融合タンパク質１の適切な液体製剤を開発した。この研究の目的は以下の通りであった。
１．様々な濃度の融合タンパク質１（４０ｍｇ／ｍＬ及び８０ｍｇ／ｍＬ）と選択された緩衝液との適合性及びコロイド安定性を評価するため。
２．短期貯蔵後の加速条件下（４０℃、２５℃、２～８℃）での品質特性の変化を評価するため。
３．賦形剤の選択：張度、ＮａＣｌ、ポリオール（すなわち、トレハロース、スクロース、マンニトール、及びソルビトール）並びにメチオニン及びアルギニン等の他の安定剤。
４．選択された緩衝液及び潜在的安定剤を用いた実験計画（ＤｏＥ）計画を通して適合性を評価する。
５．凍結保護剤の効果を評価する。

【0182】

適切な緩衝液、ポリオール、界面活性剤、及び他の安定剤を同定するためにＤｏＥアプローチを使用して、原薬に対する製剤開発作業を開始した。製剤開発中に、４０ｍｇ／ｍＬ及び８０ｍｇ／ｍＬの２つの濃度の融合タンパク質１を試験した。製剤開発中に、熱ストレス並びに撹拌及び凍結／解凍ストレスを使用した。表２は、以下の研究で試験した成分及び関連する機能を要約する。

【0183】

【表2】

【0184】

様々な緩衝液及びｐＨにおける融合タンパク質１のコロイド安定性及び相溶性
溶解度及び拡散係数（Ｄ）は、タンパク質－タンパク質相互作用を評価するために一般的に使用され、タンパク質コロイド安定性を実証するためにも使用される。コロイド安定性は、分散後の分子の長期完全性及び溶液中の沈降／沈殿に対するその耐性を表すための重要なパラメータである。加えて、この方法は、分子に対する緩衝液の適合性を迅速に捕捉することができる。その結果、融合タンパク質１を、リン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、及びクエン酸塩緩衝液（Ｃｉｔ）の３つの一般的に使用されている点眼液緩衝液に供し、ｐＨを緩衝する可能性があった（表３）。融合タンパク質１の属性を、高速液体クロマトグラフィーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）（表４）、動的光散乱（ＤＬＳ）（表５）及び濁度（図６）によって分析した。

【0185】

【表3】

【0186】

リン酸緩衝液及びクエン酸塩緩衝液中の融合タンパク質１の拡散係数は、濃度の増加と負の相関を示し、タンパク質－タンパク質相互作用の増加の可能性を示した（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｅ、及び図５Ｆ）。対照的に、６．５及び６．０の両方のヒスチジン緩衝液中の融合タンパク質１の反発性タンパク質－タンパク質相互作用が、拡散係数と様々な濃度の融合タンパク質１との間に正の相関を伴って観察された（図５Ｃ及び図５Ｄ）。したがって、ヒスチジン緩衝液中の反発性分子間相互作用融合タンパク質１は、融合タンパク質１の好ましいコロイド安定性を示唆する。

【0187】

濃度が４０ｍｇ／ｍＬを超えて６０及び８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１に増加したため、ヒスチジン緩衝製剤であっても、全ての製剤について下降拡散係数が検出された。ヒスチジン緩衝製剤の場合、これは、濃度が４０ｍｇ／ｍＬを超えて上昇すると予備凝集が起こり得ることを示唆している。ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果に基づいて、８０ｍｇ／ｍＬで製剤化されたタンパク質は、ヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５を除いて、全ての緩衝液及びｐＨについて緩衝液中純度がより低く、高分子量凝集体がより大きいことを示した（表４）。４０ｍｇ／ｍＬの試料と比較して、全ての８０ｍｇ／ｍＬ製剤でサブビジブル粒子（１００～１，０００ｎｍ、ＤＬＳによる）の増加が検出された（表５）。４０ｍｇ／ｍＬ試料と８０ｍｇ／ｍＬ試料との間で濁度に有意差はなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。まとめると、ＤＬＳによる粒径分析は、タンパク質濃度が４０ｍｇ／ｍＬから８０ｍｇ／ｍＬに増加するにつれて、全ての緩衝液についてサブビジブル凝集体の増加を示し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるＨＭＷのわずかな増加がヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を除く全ての製剤について検出され、いずれの製剤についても濁度の有意な増加は観察されなかった。

【0188】

【表4】

【0189】

【表5】

【0190】

緩衝液選択及び融合タンパク質１属性の評価
ｐＨ６．０の２５ｍＭクエン酸塩又はヒスチジン緩衝液中に製剤化された４０及び８０ｍｇ／ｍＬの両方の融合タンパク質１の実現可能性及び加速安定性を試験した。２～８℃で保存したクエン酸塩及びヒスチジン緩衝液中の融合タンパク質１非凝集（二量体型）量は、４０及び８０ｍｇ／ｍＬ濃度の両方について保存時に明らかな変化を示さなかった（表６）。しかし、４０℃の加速条件では、８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１の主ピークは、２８日後にクエン酸塩緩衝液中で約７０％減少した（表７）。比較すると、融合タンパク質１の含有量は、ヒスチジン緩衝液に製剤化された場合、約５０％減少した。更に、８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１でのタンパク質濃度は、ヒスチジン緩衝液での減少なしと比較して、クエン酸塩緩衝液では２９％減少した。したがって、ヒスチジン緩衝液中の融合タンパク質１は、ｐＨ６．０でクエン酸塩緩衝液中よりも安定である。

【0191】

【表6】

【0192】

【表7】

【0193】

更に、クエン酸塩緩衝液中の融合タンパク質１は、４０℃でのインキュベーション後に、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図７Ａ～図７Ｅ）において約２５０ｋＤａの位置で主バンド強度のより大きな減少を示した。（図８Ａ～図８Ｅ）。融合タンパク質１のタンパク質分解プロファイルは、生成物分解フラグメント及び高分子量凝集体のバンドを経時的に増加させた。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析は、約７５ｋＤａでの主バンド強度の減少及び増加したフラグメントバンドを示した（図８Ａ～図８Ｅ）。全体として、タンパク質純度及び完全性の調査は、融合タンパク質１が、クエン酸塩緩衝液中よりもｐＨ６．０の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中でより良好な安定性を示したことを示した。

【0194】

凍結／解凍のための短期間の貯蔵による加速条件も評価して、融合タンパク質１試料の品質属性の変化を調べた。試料を４０℃で４日間インキュベートした。－７０℃及び室温（ＲＴ）の１回の凍結解凍サイクルは、融合タンパク質１がポリオール保護なしで安定であることを示した（表８）。

【0195】

【表8】

【0196】

賦形剤のスクリーニング
賦形剤の適合性を調べるために、製剤化された融合タンパク質１試料のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる主ピーク純度変化を評価するためのパイロット研究を行った。上記の研究に基づいて、更なる賦形剤スクリーニング試験のために２５ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０を選択した。含まれる３種類の添加剤は、ポリオール、塩及びアミノ酸であった。評価は１１の条件を有するように設計され、４０℃で４日間の加速条件によって試験された（表９）。

【0197】

【表9】

【0198】

各ポリオール（表１０、試験＃１～４）、トレハロースとＮａＣｌとの組合せ（試験＃６）、及びスクロースとメチオニンとの組合せ（試験＃１１）と配合した場合、主ピーク純度は９０％以上であった。

【0199】

【表10】

【0200】

残りのポリオールとＮａＣｌとの組合せは、ＮａＣｌを含まない試験と比較して、凝集物の％がわずかに増加した（表１０、試験＃６、７、８、９）。アルギニンとスクロースの組合せでは、加速条件で保存した後、純度は７３．８８％に低下し、１６％を超える凝集物が得られた（表１０、試験＃１０）。その結果、トレハロース、スクロース及びマンニトールを選択して、実験調査の設計に進めた。

【0201】

ＤｏＥによる組成物候補製剤の最適化
安定剤候補から生じる有意性を調査し、ＮａＣｌと個々のポリオールとの交差効果を明確にするために、表１１に示すように、計画されたＤｏＥを介して選択されたポリオール及び様々な濃度のＮａＣｌを試験した。加速試験条件及び分析を表１２に要約する。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果（表１３）によれば、２００ｍＭポリオール／糖（特にトレハロース及びスクロース）を含む２５ｍＭ Ｈｉｓ緩衝液ｐＨ６．０は、熱ストレスに対する融合タンパク質１の最良の保護を提供して、融合タンパク質１の高純度を維持した。

【0202】

【表11】

【0203】

【表12】

【0204】

８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１試料を４０℃で４日間及び７日間保存した後（表１２）、熱ストレスに対して２００ｍＭポリオールで安定化された融合タンパク質１を配合したｐＨ６．０の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中で、相対純度＞８０％を維持し、融合タンパク質１の最良の得られた純度を提供した（表１３の試験＃４及び６）。ポリオール及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含む試料（試験＃２及び＃５）は全て、ポリオールのみを含む試料（試験＃４及び６）よりも低い純度を示した。この効果は、２５ｍＭポリオール及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含む試料（試験＃１０及び１１）と比較して、２５ｍＭポリオールを含み、ＮａＣｌを含まない試料（試験＃７及び９）でも観察された。これらの組合せ間の差は、４℃及び２５℃では区別されなかった（データは示さず）。

【0205】

【表13】

【0206】

２００ｍＭポリオールを含むより高いヒスチジン緩衝液はタンパク質の品質属性を維持したが、重量オスモル濃度は２８０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの眼生理学範囲まで維持されなければならない。そこで、目標ＤｏＥ統計計算として、３００ｍＯｓｍ／ｋｇを設定した。融合タンパク質１を８０ｍｇ／ｍＬで製剤化するために選択された成分の組成物は、ｐＨ６．０の２５ｍＭヒスチジン緩衝液、１９０ｍＭトレハロース、スクロース、又はトレハロースとスクロースとの組合せであった。

【0207】

式の潜在的な賦形剤組成物の評価
組み合わせた製剤中の適切な成分の適合性を評価するために、更なる試験で、４つの候補製剤での使用について８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を試験した。この試験では、０．０３％ポリソルベート２０（ＰＳ２０）又はポリソルベート８０（ＰＳ８０）をトレハロース又はスクロースと共に添加して、１週間及び／又は１ヶ月間の加速条件、－２０℃と室温（ＲＴ）との間の様々な凍結解凍サイクル、並びに２４時間後及び４８時間後の撹拌で処理した後の融合タンパク質１の属性を評価した（表１４Ａ～１４Ｂ）。容器の短期間の適合性を並行して試験した。

【0208】

【表14A】

【0209】

【表14B】

【0210】

４つの候補製剤組成物は、熱ストレス試験の属性の変化について同様の観察を示した。８０ｍｇ／ｍＬ濃度の融合タンパク質１は、４０℃の温度に感受性であり、７日間までに９５％未満及び５％を超える凝集までの主ピークの減少を引き起こした。これは、４℃で少なくとも１ヶ月間保存しても観察されなかった（表１５及び１６）。更に、参照と比較したＶＥＧＦ及び／又はインテグリンαｖβ３結合の相対効力は標的範囲内（７０～１３０％）であり、ＶＥＧＦ結合にわずかな変化を示し、加速条件での貯蔵後にαｖβ３結合の明らかな変化は示さなかった。

【0211】

特に、サイズ排除クロマトグラフィー研究は、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース、及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６．０の製剤が、４℃及び４０℃の両方で他の製剤よりも良好な融合タンパク質１の安定性を可能にしたことを示した。

【0212】

【表15】

【0213】

【表16】

【0214】

候補製剤に製剤化された８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１を、－２０℃で約２３時間凍結し、２５℃で少なくとも１時間解凍して３サイクル及び６サイクル後の品質属性について試験した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる分析では、融合タンパク質１及びその凝集体のパーセント主ピークの明らかな変化は検出されなかった（表１７）。残りのタンパク質は９５％を超え、凝集体は５％未満であった。更に、参照と比較したＶＥＧＦ又はインテグリンαｖβ３に結合する融合タンパク質１の効力は、候補＃３及び＃４で７０％未満に減少した（表１７）。

【0215】

【表17】

【0216】

撹拌試験は、液体形態の融合タンパク質１を用いた潜在的な取り扱い及び輸送を模倣するためにタンパク質安定性を試験した。２５℃環境下でバイアルを２２０ｒｐｍで２４時間及び４８時間振盪することによって条件を加速する。そのような厳密な条件下でタンパク質試料を処理することは、定常条件及びベースラインで曝露された試料と比較して、タンパク質純度及び主要標的への結合に影響を与えた（表１８）。

【0217】

【表18】

【0218】

量、純度及び効力等の重要な品質属性に加えて、ストレス条件後のサブビジブル粒子の形成及び分布を調べた。動的光散乱（ＤＬＳ）分析によれば、観察されたサブビジブル粒子は、サイズ、多分散性％、及び異なるサイズの粒子の割合によって分類された。結果は、所望の濃度８０ｍｇ／ｍＬまでの濃縮融合タンパク質１を得るための進行が適切にモニターされず、したがって、約５ｎｍの半径を有する主要な融合タンパク質１分子が検出されただけでなく、凝集体は、より大きなサイズの粒子、すなわちベースライン（Ｄ０）で１０～１００ｎｍ又は１００～１０００ｎｍとして見ることができることを示した。どの候補製剤緩衝液がＤＬＳによって最もよく機能したかを結論付けることはできなかった。

【0219】

更に、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ストレス条件で処理した後の融合タンパク質１の完全性の変化を区別することができなかった。これらの試験された候補製剤の浸透圧（表１９）は、より低い浸透圧を示した候補＃４を除いて、他の製剤が同様の範囲であることを示した。

【0220】

【表19】

【0221】

結論
結果に基づいて、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６．０を含有する２５ｍＭ Ｈｉｓ緩衝液を含む製剤１の組成物を、１２ヶ月の安定性試験のためのパイロット製剤で試験するように指定した。

【0222】

実施例４ 硝子体内注射用の融合タンパク質１の製剤化
安定性研究を行って、融合タンパク質１の最終製剤を開発した。

【0223】

原薬バルク濃度試験
製造プロセスを通して融合タンパク質１の最終バルク原薬を支持するのに適した濃度を選択するために、４０及び８０ｍｇ／ｍＬの両方の融合タンパク質１を主要な製剤成分（２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース、及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６．０）に製剤化した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＤＬＳ、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析による任意の変化の重要な品質属性を評価するために、両方の濃度の融合タンパク質１を含む製剤を短期加速条件下で試験した。

【0224】

タンパク質量は、４０ｍｇ／ｍＬ試料及び８０ｍｇ／ｍＬ試料の間で、４０℃で７日間の短期間貯蔵の間に様々に示された（表２０）。８０ｍｇ／ｍＬでわずかにより多量の凝集体が観察された。４０℃で保存した試料の結果は、融合タンパク質１が、４日目及び７日目までに８０ｍｇ／ｍＬと比較して、４０ｍｇ／ｍＬでより低い高分子量凝集体を形成したことを示した。ＮａＣｌを含む４０ｍｇ／ｍＬの試験＃２タンパク質試料は、＞５％の凝集物が検出されたことを示した。凍結／解凍サイクル試験は、４０及び８０ｍｇ／ｍＬ試料の両方について、凝集物の％又は純度の明らかな変化を示さなかった（データは示さず）。

【0225】

【表20】

【0226】

ＤＬＳを使用してサブビジブル粒子及び分布を分析し、全てのタンパク質試料はベースラインで１０ｎｍ～１００ｎｍ及び／又は１００～１０００ｎｍのサイズ範囲の粒子を含み、ストレス試験後の変化を区別することができなかった。

【0227】

パイロット製剤安定性試験
上記の研究に基づき、融合タンパク質１がＳＥＣ－ＨＰＬＣに基づいて最も一貫した純度を維持した場合、融合タンパク質１の選択された製剤組成物は以下の通りであった：ｐＨ６．０で４０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０。容器系との適合性を検証及び評価し、並びに初期安定性を収集するために、４０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１をこの式で調製し、ホウケイ酸Ｉ型ガラスバイアル（ゴム栓付き及びフリップキャップ密封）に充填し、－２５℃～－１５℃、２～８℃、及び２５℃／６０％相対湿度（ＲＨ）の３つの条件下でインキュベートした（表２１）。

【0228】

【表21】

【0229】

研究の結果は、４０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１が、－２０℃で少なくとも１２ヶ月間保存した場合に安定であることを示した（表２２）。４℃の保存条件で６ヶ月後、純度のわずかな低下及び凝集物の増加があった（表２３）。２５℃での加速貯蔵に関して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣは６ヶ月間にわたって凝集物％の増加を検出したが、主ピークは９５％以上のままであり、分子特異的効力及び完全性（すなわち、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）のデータ）は最小限の変化で維持された（表２４）。

【0230】

【表22】

【0231】

【表23】

【0232】

【表24】

【0233】

ＤＬＳ分析によれば、試験品を－２０℃及び４℃で少なくとも１２ヶ月間保存した場合、１２ヶ月の時点で１回の凍結／解凍サイクルを経験し、微量（２％）でより大きなサイズの粒子（半径２２０８ｎｍ）を形成した４℃で保存した１つの試料を除いて、サブビジブル粒子は検出されなかった。より大きなサイズの粒子（半径２１９５及び２２６４ｎｍ）が、２５℃で保存した３ヶ月及び６ヶ月の試料において検出された。

【0234】

４℃で保存した試料の予備を分析して、１２ヶ月で観察されたサブビジブル粒子の存在を確認した。この試料も１２ヶ月間保存し、凍結／解凍サイクルを行った。試験した予備試料中にサブビジブル粒子が観察された。したがって、融合タンパク質１は、４℃で１２ヶ月間貯蔵した後の凍結／解凍ストレスに感受性である。その結果、凍結／解凍サイクルなしで、融合タンパク質１を４℃で少なくとも１２ヶ月間保存することができる。しかし、融合タンパク質１を６ヶ月より長く保存する場合、－２０℃での保存が推奨される。

【0235】

製剤の粘度測定は、粘度計を使用して得た。対象製剤（選択された成分を含む２５ｍＭヒスチジン緩衝液中の４０ｍｇ／ｍＬ融合タンパク質１）は、５．４０２ｃＰ（センチポアズ）の低粘度を有していた（表２５）。選択された製剤は、図９の代表的な示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによって示されるように、タンパク質に対して好ましい熱特性を有する。デコンボリューションされたサーモグラムは、６１．４７℃、６６．５１℃、８１．５５℃～８４．２１℃のＴｍ値を有する４つの熱転移ピークを有する。

【0236】

【表25】

【0237】

結論
この研究の結果に照らして、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６．０中４０ｍｇ／ｍＬで製剤化された融合タンパク質１は、選択された容器閉鎖系と適合性であり、－２０℃及び２℃～８℃で保存した場合、少なくとも１２ヶ月間安定なままであった。

【0238】

実施例５ 融合タンパク質１の長期安定性研究。
様々な温度で、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６．０中４０ｍｇ／ｍＬで製剤化された融合タンパク質１の長期安定性を調べるために研究を行った。融合タンパク質１は、－７０℃で保存した後、２年間にわたって安定性を示した（表２６）。９、１８及び２４ヶ月目（Ｔ９、Ｔ１８及びＴ２４）並びに９、１２及び２４ヶ月目（Ｔ９、Ｔ１２及びＴ２４）に、αｖβ３及びα５β１結合におけるＥＣ５０の変動が観察された。この変動を調査し、これが期限切れの試験試薬に起因する可能性があることを示した。

【0239】

【表26】

【0240】

－２０℃で３６ヶ月間保存した後、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６中４０ｍｇ／ｍＬで製剤化された融合タンパク質１の安定性を調べる研究が進行中である。－２０℃で９ヶ月保存した後の安定性結果の要約を表２７に示す。

【0241】

【表27】

【0242】

更に、５℃で３６ヶ月間保存した後、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６中４０ｍｇ／ｍＬで製剤化された融合タンパク質１の安定性を調べる研究が進行中である。直立又は逆さのいずれかで５℃で９ヶ月保存した後の安定性結果の要約をそれぞれ表２８及び表２９に示す。

【0243】

【表28】

【0244】

【表29】

【0245】

更に、２５℃で６ヶ月間保存した後、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６中４０ｍｇ／ｍＬで製剤化された融合タンパク質１の安定性を試験した研究を行った。２５℃で６ヶ月保存した後の安定性結果の要約を表３０に示す。

【0246】

【表30】

【0247】

実施例６ ＶＥＧＦ－Ａ_１６５による刺激後の融合タンパク質１の製剤で処置したウサギにおける血管漏出スコア
インビボ研究を行って、上記の目的の製剤９に製剤化された様々な用量の融合タンパク質１（２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース及び０．０３％ＰＳ２０、ｐＨ６中４０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質１）の有効性を試験した。ヒトＶＥＧＦ誘発網膜血管漏出を、オランダベルトウサギにおいて、標準化蛍光血管造影（ＦＡ）スコアリング画像に基づく定義された漏出スコアによって調べた。漏出スコアを０～４に分類した（０、主要血管が非常に真っ直ぐであり、小血管がいくらか蛇行している；１、主要血管の蛇行性の増加及び／又は血管拡張；２、主要血管間の漏出；３、主要血管と小血管との間の漏出、小血管はまだ見える；４、主要血管と小血管との間の漏出、小血管は見えない）。

【0248】

各ウサギは５０μＬの両側単回硝子体内注射を受け、各群は合計３匹のウサギ及び６つの眼を有していた。０日目に、５０μＬのビヒクルコントロール、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（１．２５ｍｇ／眼）、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（０．６２５ｍｇ／眼）及び漸増濃度の融合タンパク質１（すなわち、眼当たり０．０３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、及び１ｍｇ）をウサギに投与した。次いで、ウサギを２日目に１０００ｎｇのヒトＶＥＧＦ－Ａ_１６５で刺激し、ＦＡを使用して５日目に漏出スコアを評価した。

【0249】

０．０３ｍｇという低い融合タンパク質１で処置したウサギは、血管漏出スコアの減少を示した（図１０）。その結果、０．０３ｍｇという低用量の融合タンパク質１は、血管漏出を効果的に減少させる。

【0250】

融合タンパク質１の用量は、ＶＥＧＦ誘導性網膜漏出を阻害するその能力において、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＥｙｌｅａ（登録商標）と同等であった。これらのデータは、融合タンパク質１がＤＭＥ、ｎＡＭＤ及びＲＶＯ等の血管新生網膜疾患の治療に適していることを裏付けている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6】

【図7AB】

【図7CD】

【図7E】

【図8AB】

【図8CD】

【図8E】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-01-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）０．５ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質であって、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む融合タンパク質と、
ｂ）１％～１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）０．０１～４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤であって、
前記製剤は５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、前記製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、
医薬製剤。

【請求項2】

前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

前記界面活性剤が０．０３％ｗ／ｖの濃度である、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項4】

前記融合タンパク質が１ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項5】

前記ポリオールが２５ｍＭ～２５０ｍＭの濃度のトレハロースである、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項6】

前記緩衝剤が、１０ｍＭ～４０ｍＭの濃度のヒスチジンである、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項7】

ｐＨが５．５～７．０である、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項8】

－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項9】

－７０℃、－２０℃、２～８℃及び／又は２５℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項10】

１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項11】

少なくとも１つのアミノ酸を１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、請求項１又は請求項２に記載の医薬製剤。

【請求項12】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項１０に記載の医薬製剤。

【請求項13】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬製剤。

【請求項14】

請求項１に記載の医薬製剤を含む、対象の眼疾患を治療するための医薬製剤。

【請求項15】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、請求項１４に記載の医薬製剤。

【請求項16】

前記製剤が０．５～１０ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項１４又は請求項１５に記載の医薬製剤。

【請求項17】

前記製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項１６に記載の医薬製剤。

【請求項18】

ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質であって、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０
を含む、医薬製剤であって、
前記製剤は６．０のｐＨである、医薬製剤。

【請求項19】

－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項１８に記載の医薬製剤。

【請求項20】

－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項１８に記載の医薬製剤。

【請求項21】

１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項１８に記載の医薬製剤。

【請求項22】

少なくとも１つのアミノ酸を１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、請求項１８に記載の医薬製剤。

【請求項23】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項２１に記載の医薬製剤。

【請求項24】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬製剤。

【請求項25】

請求項１８に記載の医薬製剤を含む、対象の眼疾患を治療するための医薬製剤。

【請求項26】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素線条症、網膜色素変性、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性（ウェット）及び非滲出性（ドライ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）から選択される、請求項２５に記載の医薬製剤。

【請求項27】

前記製剤が０．５～１０ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項２５又は請求項２６に記載の医薬製剤。

【請求項28】

前記製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項２７に記載の医薬製剤。

【請求項29】

ａ）０．５ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質であって、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む融合タンパク質と、
ｂ）１％～１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ４００～１２０００等からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）０．０１～４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、対象の眼疾患を治療するための医薬製剤であって、
ｐＨが５．５～７．５であり、場合により、前記製剤が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤。

【請求項30】

前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択される、請求項２９に記載の医薬製剤。

【請求項31】

前記界面活性剤が０．０３％の濃度である、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項32】

前記融合タンパク質が２０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項33】

前記ポリオールが１５０ｍＭ～２３０ｍＭの濃度のトレハロースである、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項34】

前記緩衝液が、２０ｍＭ～４０ｍＭの濃度のヒスチジンである、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項35】

前記ｐＨが６．０～６．５である、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項36】

前記製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は５℃で少なくとも２４ヶ月間安定である、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項37】

前記製剤が、－７０℃、－２０℃及び／又は２～８℃で少なくとも６ヶ月後にタンパク質純度及び効力を保持する、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項38】

前記製剤が、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項39】

前記製剤が、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項40】

前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、又は塩化カリウムから選択される、請求項３８に記載の医薬製剤。

【請求項41】

前記アミノ酸が、アルギニン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、システイン、リジン、グリシン、アスパルタート、トリプトファン、グルタマート及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項３９に記載の医薬製剤。

【請求項42】

前記眼疾患が、血管新生又は虚血性ブドウ膜炎、網膜血管炎、網膜色素変性、網膜色素線条症、角膜血管新生、虹彩血管新生、血管新生緑内障、緑内障における術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、視神経円板血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管網膜症、ＤＭＥを伴わない糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、ＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症（ＤＲ、非増殖性及び増殖性ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、滲出性及び非滲出性加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、ポリープ状脈絡膜血管新生（ＰＣＶ）、硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）及び／又は硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）を含む、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項43】

前記製剤が０．０３～１０ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項２９又は請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項44】

前記製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、請求項４３に記載の医薬製剤。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0012】

１つの一般的な態様では、本開示は、
ａ）０．５ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）１％～１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）０．０１～４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤であって、
製剤は５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤に関する。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0014】

本出願の実施形態によれば、界面活性剤は０．０３％の濃度である。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0015】

本開示の実施形態によれば、融合タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が４０ｍｇ／ｍＬの濃度である。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0016】

本出願の実施形態によれば、ポリオールは、２５ｍＭ～２５０ｍＭ、好ましくは１９０ｍＭの濃度のトレハロースである。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0017】

本開示の実施形態によれば、緩衝剤は、１０ｍＭ～４０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ～３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが２５ｍＭの濃度である。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0020】

本出願の実施形態によれば、ｐＨは５．５～７．０であり、好ましくはｐＨは６．０である。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0023】

本出願の実施形態によれば、製剤は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0024】

本出願の実施形態によれば、製剤は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の少なくとも１つのアミノ酸を更に含む。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0029】

本開示の実施形態によれば、製剤は、０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0030】

本出願の実施形態によれば、製剤は、眼当たり４ｍｇの用量で投与される。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0031】

本開示の別の一般的な態様は、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０
を含む、医薬製剤であって、
製剤は６．０のｐＨである、医薬製剤に関する。

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0049】

例えば、リンカー領域又はＣ末端におけるＲＧＤモチーフに加えて１つ又はそれを超える修飾を有するロドストミン又はディスインテグリンの変異体は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１又はαＩＩｂβ３に選択的に結合する能力を示した。例えば、ＳＲＡＧＫ（配列番号５０）がＫＫＫＲＴ（配列番号５１）、ＫＫＡＲＴ（配列番号５２）、ＭＫＫＧＴ（配列番号５３）ＩＥＥＧＴ（配列番号５４）、ＬＫＥＧＴ（配列番号５５）、ＡＫＫＲＴ（配列番号５６）、ＫＡＫＲＴ（配列番号５７）、ＫＫＡＲＴ（配列番号５８）、ＫＫＫＡＴ（配列番号５９）、ＫＫＫＲＡ（配列番号６０）、ＫＡＫＲＡ（配列番号６１）又はＳＫＡＧＴ（配列番号６２）アミノ酸によって置き換えられたリンカー領域（３９Ｘ４０Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３Ｘ）における変異を有するロドストミンバリアントは、インテグリンに対して以下の順序で最も高い効果を有した：αｖβ３（約１４倍）＞α５β１（約５倍）＞αＩＩｂβ３（約２倍）。

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0069】

一定の実施形態では、融合タンパク質が、活性の阻害（例えば、血管新生因子活性及び／又はインテグリン活性の阻害）について１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又は０．００１ｎＭ以下のＥＣ_５０を有する。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、融合タンパク質は、結合パートナー（血管新生因子及び／又はインテグリン）に対するＫ_Ｄが１．０ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ又は５ｐＭ未満であり、これらの数字の間の任意の値を含む。

【手続補正15】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0070】

特定の実施形態では、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、４．０～９．０である。特定の実施形態では、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、９．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、又はそれらの間の任意の値である。好ましくは、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は８．１７である。

【手続補正16】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0076】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む医薬組成物は、０．５～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは４０～８０ｍｇ／ｍＬ、例えば４０、５０、６０、７０又は８０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは４０±４ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で緩衝液に製剤化された融合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、４０ｍｇ／ｍＬを超えるタンパク質濃度で緩衝液中に製剤化される。

【手続補正17】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0077】

特定の実施形態では、緩衝剤は、５．５～７．０、より好ましくは６．０～６．５、更により好ましくは６．０のｐＨを有する緩衝剤である。特定の実施形態では、緩衝剤は、６．５～８、より好ましくは７～７．５、更により好ましくは７．２のｐＨを有するリン酸緩衝剤である。リン酸緩衝液は、５ｍＭ～２０ｍＭのリン酸ナトリウム、例えば５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ又は２０ｍＭのリン酸ナトリウム、より好ましくは１０ｍＭのリン酸ナトリウム；２０～６０ｍＭ塩化ナトリウム、より好ましくは４０ｍＭ塩化ナトリウム；１～１０％重量／体積（ｗ／ｖ）スクロース、より好ましくは５％ｗ／ｖスクロース；及び０．０１から０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。

【手続補正18】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0078】

特定の実施形態では、医薬製剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールを、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％ｗ／ｖ等の１％～１０％ｗ／ｖの濃度で含む。

【手続補正19】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0079】

好ましい実施形態では、ポリオールは、２５ｍＭ～２５０ｍＭ、例えば２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、又は２５０ｍＭの濃度のトレハロースである。他の好ましい実施形態では、ポリオールは、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、又は２００ｍＭ等の１００～２００ｍＭの濃度のトレハロースである。他の好ましい実施形態では、ポリオールは１９０ｍＭの濃度のトレハロースである。

【手続補正20】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0080】

特定の実施形態では、医薬製剤は緩衝剤を含む。特定の実施形態では、緩衝剤は、１０ｍＭ～５０ｍＭ、例えば１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、又は５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、緩衝剤は、１０ｍＭ～４０ｍＭ、例えば１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は４０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、緩衝剤は、２０ｍＭ～３０ｍＭ、例えば２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ又は３０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、緩衝剤は２５ｍＭの濃度である。

【手続補正21】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0082】

好ましい実施形態では、緩衝剤は、１０ｍＭ～４０ｍＭ、例えば１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は４０ｍＭの濃度のヒスチジンである。他の好ましい実施形態では、ヒスチジンは、２０ｍＭ～３０ｍＭ、例えば２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、又は３０ｍＭの濃度である。他の好ましい実施形態では、ヒスチジンは２５ｍＭの濃度である。

【手続補正22】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0083】

特定の実施形態では、医薬製剤は界面活性剤を含む。好ましい実施形態では、界面活性剤は、０．０１％、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、又は４．０％等、０．０１～４％ｗ／ｖの濃度である。他の好ましい実施形態では、界面活性剤は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．０％ｗ／ｖ等の０．０１％～１．０％ｗ／ｖの濃度である。他の好ましい実施形態では、界面活性剤は０．０３％ｗ／ｖの濃度である。

【手続補正23】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0084】

好ましい実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８からなる群から選択され、好ましくはポリソルベート２０である。好ましい実施形態では、ポリソルベート２０は、０．０３％ｗ／ｖの濃度である。

【手続補正24】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0089】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭヒスチジン、１９０ｍＭトレハロース、及び０．０３％ポリソルベート２０の濃度で融合タンパク質を含み、製剤は６．０のｐＨにある。

【手続補正25】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0095】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、又は１０ｍｇ等、眼当たり０．０３～１０ｍｇの用量で眼に投与される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、又は６ｍｇ等の眼当たり３．０～６．０ｍｇの用量で眼に送達される。他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、眼当たり４ｍｇの用量で眼に送達される。

【手続補正26】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0099】

実施形態１は、ａ）０．５ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）１％～１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００～１２０００からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）０．０１～４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤であって、
製剤は５．５～７．５のｐＨであり、任意選択で、製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、医薬製剤である。

【手続補正27】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0102】

実施形態４は、界面活性剤が０．０３％ｗ／ｖの濃度である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正28】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0103】

実施形態５は、融合タンパク質が１ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正29】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0104】

実施形態６は、融合タンパク質が４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態５に記載の医薬製剤である。

【手続補正30】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0105】

実施形態７は、ポリオールが２５ｍＭ～２５０ｍＭ、好ましくは１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正31】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0106】

実施形態８は、トレハロースが１９０ｍＭの濃度である、実施形態７に記載の医薬製剤である。

【手続補正32】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0107】

実施形態９は、緩衝剤が、１０ｍＭ～４０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ～３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが２５ｍＭの濃度である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正33】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0108】

実施形態１０は、ヒスチジンが２５ｍＭの濃度である、実施形態９に記載の医薬製剤である。

【手続補正34】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0111】

実施形態１３は、ｐＨが５．５～７．０、好ましくはｐＨが６．０である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正35】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0112】

実施形態１４は、ｐＨが６．０である、実施形態１３に記載の医薬製剤である。

【手続補正36】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0115】

実施形態１７は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正37】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0117】

実施形態１９は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正38】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0121】

実施形態２３は、製剤が、０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤は、４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正39】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0122】

実施形態２４は、製剤が眼当たり４ｍｇの用量で投与される、実施形態２３に記載の医薬製剤である。

【手続補正40】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0123】

実施形態２５は、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０
を含む、医薬製剤であって、
製剤は６．０のｐＨである、医薬製剤である。

【手続補正41】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0128】

実施形態３０は、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態２５～２９のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正42】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0130】

実施形態３２は、少なくとも１つのアミノ酸を１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で更に含む、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正43】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0134】

実施形態３６は、製剤が、０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤は、４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の医薬製剤である。

【手続補正44】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0135】

実施形態３７は、製剤が眼当たり４ｍｇの用量で投与される、実施形態３６に記載の医薬製剤である。

【手続補正45】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0136】

実施形態３８は、対象の眼疾患を治療する方法であって、
ａ）０．５ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質と、
ｂ）１％～１０％ｗ／ｖの濃度の、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ベンジルアルコール、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ４００～１２０００等からなる群から選択されるポリオール又はアルコールと、
ｃ）１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム二水和物からなる群から選択される緩衝剤と、
ｄ）０．０１～４％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤と、
を含む、医薬製剤を対象に投与することを含み、
ｐＨが５．５～７．５であり、場合により、製剤が、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース又はヒアルロン酸ナトリウムからなる群から選択される多糖を更に含む、方法である。

【手続補正46】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0139】

実施形態４１は、界面活性剤が０．０３％ｗ／ｖの濃度である、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正47】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0140】

実施形態４２は、融合タンパク質が１ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは融合タンパク質が４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正48】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0141】

実施形態４３は、融合タンパク質が４０ｍｇ／ｍＬの濃度である、実施形態４２に記載の方法である。

【手続補正49】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0142】

実施形態４４は、ポリオールが１５０ｍＭ～２３０ｍＭ、好ましくは１９０ｍＭの濃度のトレハロースである、実施形態３８～４３のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正50】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0143】

実施形態４５は、トレハロースが１９０ｍＭの濃度である、実施形態４４に記載の方法である。

【手続補正51】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0144】

実施形態４６は、緩衝剤が２０ｍＭ～４０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ～３０ｍＭの濃度のヒスチジンであり、より好ましくはヒスチジンが２５ｍＭの濃度である、実施形態３８～４５のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正52】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0145】

実施形態４７は、ヒスチジンが２５ｍＭの濃度である実施形態４６に記載の方法である。

【手続補正53】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0148】

実施形態５０は、ｐＨが６．０～６．５、好ましくはｐＨが６．０である、実施形態３８～４９のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正54】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0149】

実施形態５１は、ｐＨが６．０である実施形態５０の方法である。

【手続補正55】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0152】

実施形態５４は、製剤が１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で塩を更に含む、実施形態３８～５３のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正56】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0154】

実施形態５６は、製剤が１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正57】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0157】

実施形態５９は、製剤が０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態３８～５８のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正58】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0158】

実施形態６０は、製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態５９に記載の方法である。

【手続補正59】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0159】

実施形態６１は、対象の眼疾患を治療する方法であって、
ａ）４０ｍｇ／ｍＬの濃度の融合タンパク質、
ｂ）２５ｍＭのヒスチジン、
ｃ）１９０ｍＭのトレハロース、スクロース又はマンニトール、
ｄ）０．０３％ポリソルベート２０又はポリソルベート８０
を含む、医薬製剤を対象に投与することを含み、
製剤は６．０のｐＨである、方法である。

【手続補正60】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0165】

実施形態６６は、製剤が１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度の塩を更に含む、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正61】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0166】

実施形態６８は、製剤が１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で少なくとも１つのアミノ酸を更に含む、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正62】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0169】

実施形態７１は、製剤が０．０３～１０ｍｇ／眼、好ましくは３．０～６．０ｍｇ／眼の用量で投与され、より好ましくは製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態６１～７０のいずれか１つに記載の方法である。

【手続補正63】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0170】

実施形態７２は、製剤が４ｍｇ／眼の用量で投与される、実施形態７１の方法である。

【国際調査報告】