▶ コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】新規のキメラ抗原受容体及びそれを発現する免疫細胞
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240719BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240719BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240719BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240719BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240719BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240719BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240719BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240719BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/30
C07K14/705
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/85 Z
C12N5/0783
C12N5/10
A61P35/00
A61K35/17
A61K35/15
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504017
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-01-22
(86)【国際出願番号】 KR2022010729
(87)【国際公開番号】W WO2023003404
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】10-2021-0096085
(32)【優先日】2021-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505448855
【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，テドン
(72)【発明者】
【氏名】イ，スヨン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087CA04
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインを細胞内信号伝達ドメインとして含む新規のキメラ抗原受容体とこれを発現する免疫細胞に関する。本発明のキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の場合、正常細胞が存在する環境では細胞毒性がないか少なく、免疫細胞の細胞死滅が誘発されるので、正常細胞に対する安定性を確保できるのに対し、標的細胞が存在する環境では、既存の単独キメラ抗原受容体を活用した技術に比べてより強力な細胞毒性を示す効果がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合部位を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）と、
死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含む細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、を含む、
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）。
【請求項2】
前記死滅領域を含む受容体は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲＩ、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＤＡＲ、及びＤＲ６で構成される群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記抗原結合部位は、癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
前記抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的に結合する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
前記抗原結合部位は、抗体の単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）及びスペーサードメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）からなる群より選択される少なくとも一つをさ
らに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記ヒンジドメイン又はスペーサードメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン、及びＦｃからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記膜貫通型ドメインは、Ｔ－細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）、又はゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を第１キメラ抗原受容体として表面に発現し、癌細胞で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む第２キメラ抗原受容体を表面に発現する、免疫細胞。
【請求項12】
前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄ
ｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、マクロファージ、及び樹枝状細胞からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項13】
前記免疫細胞は表面に、前記第１キメラ抗原受容体及び前記第２キメラ抗原受容体とは異なる抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む少なくとも一つのキメラ抗原受容体をさらに発現する、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項14】
前記第２キメラ抗原受容体の抗原結合部位は、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ３、ＩＬ－１３Ｒα２、ＤＬＫ１、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＧＰＣ３、ＣＥＡＣＡＭ６、及びＣＤ５で構成される群より選択されるいずれか一つに特異的に結合する、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項15】
請求項１１に記載の免疫細胞を含む、癌治療用薬学的組成物。
【請求項16】
前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膵膓癌、大膓癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髄腫、急性骨髓性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉腫、繊維性腫瘍、及び脳癌からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１５に記載の癌治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメインを細
胞内信号伝達ドメインとして含む新規のキメラ抗原受容体とそれを発現する免疫細胞に関する。
胞内信号伝達ドメインとして含む新規のキメラ抗原受容体とそれを発現する免疫細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
癌を治療するための方法は、たゆまぬ発展と変化過程を経てきて、外科的手術、化学療法、放射線療法などの方法が現在まで利用し続けているが、このような既存の癌治療方法は、癌が転移されていない初期状態にのみ効果がある場合が大部分であり、既に転移が進行された状態では、例えば、外科的手術をしても後日再発可能性が高いという問題がある。そのため、最近癌を治療するために免疫反応を用いる方法に対する研究が続けられている。
【0003】
その中でも、免疫細胞を用いてそれを強化させるか遺伝工学的に変形して再度患者に注入する細胞治療方法に対する関心が高まっており、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）、及びＴ細胞受容体（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）技術などが研究されている。特に、Ｔ細胞やナ
チュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）に抗原特異性を伝達するように設計された人工受
容体であるキメラ抗原受容体の場合、前記受容体が癌細胞特異的抗原と結合することで、前記免疫細胞を活性化し、特異的免疫性を提供できる細胞外ドメインと、膜貫通型ドメイン、そして細胞内信号伝達ドメインからなっている。そして、このようなキメラ抗原受容体が発現されるＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と命名され（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５（１２）：９２８－９４０（２００５）；Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２（４）：２６９－２８１（２０１２））、ナチュラルキラー細胞の場合、ＣＡＲ－ＮＫ細胞と命名された。
チュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）に抗原特異性を伝達するように設計された人工受
容体であるキメラ抗原受容体の場合、前記受容体が癌細胞特異的抗原と結合することで、前記免疫細胞を活性化し、特異的免疫性を提供できる細胞外ドメインと、膜貫通型ドメイン、そして細胞内信号伝達ドメインからなっている。そして、このようなキメラ抗原受容体が発現されるＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と命名され（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５（１２）：９２８－９４０（２００５）；Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２（４）：２６９－２８１（２０１２））、ナチュラルキラー細胞の場合、ＣＡＲ－ＮＫ細胞と命名された。
【0004】
前記キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインは、主にＴ細胞受容体の信号伝達サブユニットであるＣＤ３ｚｅｔａの細胞内信号伝達ドメインを基本としている（１世代ＣＡＲ）。そして、ここに免疫細胞の成長及び分化を促進する共同－刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを追加する形態に進化されて来た。例えば、現在市販のＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、それぞれＣＤ２８と４－１ＢＢ共刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを使用しており（２世代ＣＡＲ）、その後、ＣＤ２８と４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメインを同時に含むＣＡＲ（３世代ＣＡＲ）などが試みられている（Ｓｔｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、１４（７）：４９９－５０９（２０１５））。
【0005】
しかし、ＣＡＲ－Ｔのような治療剤は、癌細胞に対して効果的であるが、一部場合に健康な組織に部分的に非特異的な攻撃による副作用を起こして来た。それを克服するために、癌細胞抗原認識能力を高めて正常細胞を攻撃する副作用を最小化しようとする研究が続けられているが、ＣＡＲ－Ｔが一度注入されると、毒性を有するＴ細胞が癌細胞が除去された後にもその機能が持続して、正常細胞に対しても細胞毒性をもたらすことができるなど、非特異的攻撃による副作用は相変らず問題となっている。また、癌の再発は、癌に存在する抗原の特異性不在、抗原の多様性及び異質性により行われるので、これに対する抗癌効能を向上させるためには、「ｌｏｇｉｃ－ｇａｔｅｄ ＣＡＲ高度化」技術、すなわ
ち、抗原を多重標的化するＣＡＲをデザインして癌に対する効能性を向上させ、正常細胞に対する安全性を確保する技術の開発も必要な実情である。
ち、抗原を多重標的化するＣＡＲをデザインして癌に対する効能性を向上させ、正常細胞に対する安全性を確保する技術の開発も必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、免疫細胞で発現された時に、正常細胞に対しては細胞毒性を示すことなく、癌細胞に対しては細胞毒性活性を増幅させ得るようにする新規のキメラ抗原受容体の提供を目的とする。
【0007】
また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクターの提供を目的とする。
【0008】
また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を表面に発現させることで、癌に対する治療効果はより優れながら正常細胞に対しては安全性があるので、癌治療剤として有用に用いることができる免疫細胞の提供を目的とする。
【0009】
また、本発明は、前記免疫細胞を用いて癌を治療するための薬学的組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明の一側面は、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含む細胞
内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含む、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）を提供する。
内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含む、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）を提供する。
【0011】
本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含むポリヌクレオチド、そして、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0012】
本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を第１キメラ抗原受容体；として表面に発現し、癌細胞で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む第２キメラ抗原受容体；を表面に発現する、免疫細胞を提供する。
【0013】
本発明の他の側面は、前記免疫細胞を含む、癌治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【0014】
本発明のキメラ抗原受容体は、正常細胞及び癌細胞ですべて発現される抗原を原因にして信号を伝達することができ、この際、単独で信号伝達時には前記受容体が発現された免疫細胞が細胞毒性を示さないかより少なく示すようにできる。また、抗原に長期間結合するようになる場合、免疫細胞の細胞死滅を誘導できるため、癌細胞ではなく正常細胞に対しては細胞毒性を示さないので、安定性を担保できるという利点がある。
【0015】
一方、前記キメラ抗原受容体が癌細胞で発現された抗原と結合する場合は、癌細胞特異的抗原を認識して結合できる他のキメラ抗原受容体とともに作用して信号伝達が発生するにつれて、癌細胞特異的な一つのキメラ抗原受容体が作用する時よりも増幅した細胞毒性を示すようにでき、シナジー効果を発揮する特徴があるため、癌を治療するための用途として非常に有用に用いることができるという効果がある。
【0016】
ただし、本発明の効果は、前記で言及した効果に制限されず、言及されていないさらに他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明のキメラ抗原受容体のうち、ＥＧＦＲを標的抗原とすることの構造を示す模式図及びこれを発現させるために前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドを挿入するためのベクターの構造を示す図である。
【図2】抗－コチニンキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２））に本発明のキメラ抗原受容体を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１を対象にして、Ｍｙｃ及びｚｓＧｒｅｅｎの発現程度を確認した結果を示す図である。前記図２で「Ｍ２－ＥＧＦＲ－Ｐ７５ＮＴＲ」は二重キメラ抗原受容体が発現されるナチュラルキラー細胞であり、＃１、＃２、＃３及び＃５は、Ｍ２－ＥＧＦＲ－Ｐ７５ＮＴＲの二重キメラ抗原受容体が発現されるナチュラルキラー細胞を単一細胞に分離した図である。
【図3a】抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（α－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２（７９－１４））に本発明のキメラ抗原受容体を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２を対象にして、Ｍｙｃ及びｚｓＧｒｅｅｎの発現程度を確認した結果を示す図である。
【図3b】抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（α－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２（７９－１４））に本発明のキメラ抗原受容体を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２を対象にして、Ｍｙｃ及びｚｓＧｒｅｅｎの発現程度を確認した結果を示す図である。
【図4】前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲを発現する乳癌細胞ＡＵ５６５と共培養した後、細胞毒性を確認して比べたものであって、Ａは全細胞の細胞毒性を、Ｂは単一細胞の細胞毒性を比べたグラフである。
【図5a】前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲを発現する乳癌細胞ＡＵ５６５と共培養した後、共培養した時間による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）発生割合を測定して比べたグラフである。
【図5b】前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲを発現する乳癌細胞ＡＵ５６５と共培養した後、共培養した時間による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）発生割合を測定して比べたグラフである。
【図6】前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を発現する乳癌細胞ＡＵ５６５をＨＥＲ２－Ｃｏｔ接合体とともに共培養した後、細胞毒性を確認して比べたものであって、Ａは全細胞の細胞毒性を、Ｂは単一細胞の細胞毒性を比べたグラフである。
【図7】Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２及びα－Ｅｐｈａ２－ＣＡＲ ＮＫ９２（７９－１４）細胞を用いてＥＧＦＲとＥｐｈＡ２をすべて発現する乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と共培養した後、細胞毒性を確認して比べた図である。
【図8】Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２及びα－Ｅｐｈａ２－ＣＡＲ ＮＫ９２（７９－１４）細胞を用いてＥＧＦＲとＥｐｈＡ２をすべて発現する乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と共培養した後、１７時間硬化後の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）発生割合を測定して比べたグラフである。
【図9a】本発明のキメラ抗原受容体のうち、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）の構造を示す模式図及びこれを発現させるために前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドを挿入するためのベクターの構造を示す図である。
【図9b】本発明のキメラ抗原受容体のうち、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）の構造を示す模式図及びそれを発現させるために前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドを挿入するためのベクターの構造を示す図である。
【図10】抗－コチニンキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２））に本発明のキメラ抗原受容体のうち、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を対象にして、Ｍｙｃの発現程度を確認した結果を示す図である。
【図11】前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を発現する乳癌細胞ＡＵ５６５をＨＥＲ２－Ｃｏｔ接合体とともに共培養した後、細胞毒性を確認して比べた図である。
【図12a】前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲを発現する乳癌細胞ＡＵ５６５と共培養した後、共培養した時間による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）発生割合を測定して比べたグラフである。
【図12b】前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）を発現させて作ったＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１及びα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２（Ｍ２）細胞を用いてＥＧＦＲを発現する乳癌細胞ＡＵ５６５と共培養した後、共培養した時間による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）発生割合を測定して比べたグラフである。
【図13】本発明のキメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２が作用する原理を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明を詳しく説明する。
【0019】
１．新規のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明の一側面は、正常細胞に対しては安全性を示し、癌細胞に対しては他のキメラ抗原受容体とともに細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を増幅させる特徴がある、新規のキメラ抗原受容体を提供する。
本発明の一側面は、正常細胞に対しては安全性を示し、癌細胞に対しては他のキメラ抗原受容体とともに細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を増幅させる特徴がある、新規のキメラ抗原受容体を提供する。
【0020】
本発明において、用語「キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）」は、標的抗原及び前記抗原を発現する細胞を認識して結合した時に、これに対して免疫反応を誘導できるように設計された合成複合体である。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、及び細胞内信号
伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよい。キメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面に発現され、細胞外ドメインに含まれた抗原結合部位を介して、特定の抗原、例えば、癌細胞の表面に特異的に発現される抗原を認識して結合されることで、免疫細胞内で信号伝達を起こして免疫細胞の活性を変化させ得るため、特定の抗原のみを標的にして免疫反応を誘発させることができる。
伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよい。キメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面に発現され、細胞外ドメインに含まれた抗原結合部位を介して、特定の抗原、例えば、癌細胞の表面に特異的に発現される抗原を認識して結合されることで、免疫細胞内で信号伝達を起こして免疫細胞の活性を変化させ得るため、特定の抗原のみを標的にして免疫反応を誘発させることができる。
【0021】
本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含む細胞内信号伝達ドメイ
ン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含む。
ン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含む。
【0022】
前記死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体は、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ）誘導活性に関与するアミノ酸配列を細胞内ドメインとして有する受容体分子を意
味する。前記死滅領域を含む受容体としては、Ｆａｓ、ＴＮＦＲＩ、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＥＤＡＲなどがあるが、特にこれに限定されない。特に、このうち、前記ｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、神経細胞の分化に関するニューロトロフィン受容体の一種であって、低－親和性神経成長因子受容体（ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＬＮＧＦＲ）の一種として知られている。前記ｐ７５ＮＴＲは、細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内ドメインで構成されており、本発明においては、前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインが用いられる。前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインは、ｇｌｏｂａｌ－ｌｉｋｅドメインであってよく、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよいが、これに制限されるものではない。前述したアミノ酸配列は、これを含むタンパク質の構造、機能、活性などに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、又はこれらの組み合わせによって異なる配列を有する変異体を含んでよい。また、前記アミノ酸配列は、当業界に知られた通常の変形が起きたアミノ酸を含むものであってよく、前記アミノ酸変形は、例えば、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などであってよい。本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインは、前述したアミノ酸配列を含むだけではなく、これと実質的に同一のアミノ酸配列を有するものであるかその変異体を含む。前記実質的に同一のアミノ酸配列を有することの意味は、前述したアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってよいが、これに制限されるものではない。
ｓｉｓ）誘導活性に関与するアミノ酸配列を細胞内ドメインとして有する受容体分子を意
味する。前記死滅領域を含む受容体としては、Ｆａｓ、ＴＮＦＲＩ、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＥＤＡＲなどがあるが、特にこれに限定されない。特に、このうち、前記ｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、神経細胞の分化に関するニューロトロフィン受容体の一種であって、低－親和性神経成長因子受容体（ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＬＮＧＦＲ）の一種として知られている。前記ｐ７５ＮＴＲは、細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内ドメインで構成されており、本発明においては、前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインが用いられる。前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインは、ｇｌｏｂａｌ－ｌｉｋｅドメインであってよく、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよいが、これに制限されるものではない。前述したアミノ酸配列は、これを含むタンパク質の構造、機能、活性などに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、又はこれらの組み合わせによって異なる配列を有する変異体を含んでよい。また、前記アミノ酸配列は、当業界に知られた通常の変形が起きたアミノ酸を含むものであってよく、前記アミノ酸変形は、例えば、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などであってよい。本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインは、前述したアミノ酸配列を含むだけではなく、これと実質的に同一のアミノ酸配列を有するものであるかその変異体を含む。前記実質的に同一のアミノ酸配列を有することの意味は、前述したアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0023】
本発明の前記キメラ抗原受容体が免疫細胞の表面に発現された時に、標的抗原が前記受容体に結合するようになって前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインにより単独で信号伝達が発生する場合、前記免疫細胞の細胞毒性の低減及び／又は前記免疫細胞の細胞死滅の促進が誘導される可能性がある。前記細胞毒性の低減は、免疫細胞が細胞毒性を示さないものであるか、抗原が存在しない状態の免疫細胞が示す細胞毒性よりも少ない細胞毒性を示すものであるか、又は抗原により免疫細胞が活性化された場合に比べてより少ない細胞毒性を示すものであってよい。前記免疫細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）促進は、抗原が存在しない状態の免疫細胞に比べて細胞死滅がより誘導されるものであってよい。前記単独で信号伝達が発生することは、他のキメラ抗原受容体による信号伝達が発生しないものであってよく、より具体的には、癌細胞に対する免疫細胞の細胞毒性を促進する信号を発生するキメラ抗原受容体による信号伝達は発生せず、本発明の前記キメラ抗原受容体による信号伝達のみが発生するものであってよい。
【0024】
前記細胞外ドメインは、目的とする標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含み、その種類に制限されない。前記細胞外ドメインは、生物学的分子、例えば、細胞表面受容体、腫瘍タンパク質、脂質、多糖類、又はその他細胞表面標的分子などを特異的に認識し、これに結合できる構造を有するものであれば制限なく適用でき、例えば、前記のような特徴を有するタンパク質、ポリペプチド、又はその変異体であってよい。前記「特異的に結合する」ことは、背景結合よりも大きな結合親和性で他の分子に対して結合することを意味してよく、例えば、前記細胞外ドメインは、標的抗原に対して約１０－５Ｍ以上の親和性又はＫａ（１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数）で標的抗原に結合するものであってよい。前記親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）が１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ又は前記範囲以下のものであってよい。
【0025】
前記抗原結合部位は、癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原に特異的に結合されるものであってよい。具体的には、前記癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原は、
癌細胞特異的抗原ではないものであってよく、すなわち、癌を予防、治療、改善、診断するために用いられる癌特異的マーカーなどではないものであってよい。したがって、本発明の前記キメラ抗原受容体は、癌細胞及び正常細胞をすべて認識して結合することができ、これにより前記キメラ抗原受容体が発現された免疫細胞で信号伝達を発生させることができる。前記抗原結合部位は、例えば、ＥＧＦＲに特異的に結合するものであってよいが、これに制限されるものではない。
癌細胞特異的抗原ではないものであってよく、すなわち、癌を予防、治療、改善、診断するために用いられる癌特異的マーカーなどではないものであってよい。したがって、本発明の前記キメラ抗原受容体は、癌細胞及び正常細胞をすべて認識して結合することができ、これにより前記キメラ抗原受容体が発現された免疫細胞で信号伝達を発生させることができる。前記抗原結合部位は、例えば、ＥＧＦＲに特異的に結合するものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0026】
前記抗原結合部位は、抗体又はその抗原結合断片であってよく、より具体的には、前記抗原結合部位は、抗体の単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であってよい。具体的には、前記抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体の単鎖可変断片であってよく、より具体的には、配列番号３のアミノ酸配列を含むものであってよい。
ｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であってよい。具体的には、前記抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体の単鎖可変断片であってよく、より具体的には、配列番号３のアミノ酸配列を含むものであってよい。
【0027】
前記抗体は、免疫学的に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と特異的結合して反応性を有する免疫グロブリン分子を意味する。前記抗体は、単クローン抗体、多クローン抗体、全長の鎖構造を有する抗体（全長抗体、ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）
、少なくとも抗原結合機能を有する機能的な断片（抗原結合断片）及び再組み合わせ抗体をすべて含んでよく、具体的には、本発明の抗体は、単クローン抗体又はその抗原結合断片であってよい。前記単クローン抗体は、実質的に同一の抗体集団から得た単一分子組成の抗体分子を指称し、このような単クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。前記全長抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されてよい。前記抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）ポリペプチドを含み、前記重鎖及び軽鎖は、可変領域及び不変領域を含んでよい。
、少なくとも抗原結合機能を有する機能的な断片（抗原結合断片）及び再組み合わせ抗体をすべて含んでよく、具体的には、本発明の抗体は、単クローン抗体又はその抗原結合断片であってよい。前記単クローン抗体は、実質的に同一の抗体集団から得た単一分子組成の抗体分子を指称し、このような単クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。前記全長抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されてよい。前記抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）ポリペプチドを含み、前記重鎖及び軽鎖は、可変領域及び不変領域を含んでよい。
【0028】
前記不変領域は、免疫系の多様な種類の細胞（Ｔ－細胞など）、補体系の成分を含む宿主組織などに、前記抗体が結合できるように媒介する部位である。前記不変領域は、同一の種から由来する同一の種類の抗体であれば、抗原の種類と無関係に同一の機能をし、これを成すアミノ酸配列も抗体ごとに同一であるか高い類似度を有する。前記不変領域は、重鎖の不変領域（ＣＨと略称できる）と軽鎖の不変領域（ＣＬと略称できる）に分けられる。前記重鎖の不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及び／又はイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及び／又はアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは亞型（ｓｕｂｔｙｐｅ）であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
【0029】
前記可変領域は、抗原に対して特異性を有する抗体部位であって、重鎖の可変領域（ＶＨと略称できる）と軽鎖の可変領域（ＶＬと略称できる）とに分けられる。前記可変領域には、３つのＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉ
ｏｎｓ又は相補性決定領域）と４つのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）が含
まれてよい。前記ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であってよく、前記ＣＤＲのアミノ酸配列に応じて抗原に対する特異性が決定されてよい。前記ＣＤＲは、その手順に応じてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と指称されてよく、重鎖及び軽鎖のどのポリペプチドドのＣＤＲであるか否かに応じて、重鎖の可変領域の場合ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３で、軽鎖の可変領域の場合ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３と指称されてよい。ＦＲも同様に、重鎖の可変領域の場合ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４で、軽鎖の可変領域の場合ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４と指称されてよい。
ｏｎｓ又は相補性決定領域）と４つのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）が含
まれてよい。前記ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であってよく、前記ＣＤＲのアミノ酸配列に応じて抗原に対する特異性が決定されてよい。前記ＣＤＲは、その手順に応じてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と指称されてよく、重鎖及び軽鎖のどのポリペプチドドのＣＤＲであるか否かに応じて、重鎖の可変領域の場合ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３で、軽鎖の可変領域の場合ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３と指称されてよい。ＦＲも同様に、重鎖の可変領域の場合ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４で、軽鎖の可変領域の場合ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４と指称されてよい。
【0030】
前記抗原結合断片は、抗体の抗原結合機能を保有する、抗体の任意の断片を意味する。前記抗原結合断片は、「断片」、「抗体断片」などの用語と互換して指称されてよく、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどであってよいが、これに制限されるものではない。
【0031】
前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の第一不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であって、１つの抗原結合部位を有する。前記Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ
ｒｅｇｉｏｎ）を有する点で前記Ｆａｂと異なる。前記Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’の
ヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。前記Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域のみを有する最小の抗体片を意味する。二重鎖可変断片（ｔｗｏ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は非共有結合であって、
重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が連結されており、単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されるか又はＣ－末端で直ちに連結されているので、二重鎖可変断片のようにダイマーのような構造を成してよい。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、全抗体をパパインで制限切断するとＦａｂが得られ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、又は遺伝子再組み合わせ技術により製作することができるが、これに制限されるものではない。
ｒｅｇｉｏｎ）を有する点で前記Ｆａｂと異なる。前記Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’の
ヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。前記Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域のみを有する最小の抗体片を意味する。二重鎖可変断片（ｔｗｏ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は非共有結合であって、
重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が連結されており、単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されるか又はＣ－末端で直ちに連結されているので、二重鎖可変断片のようにダイマーのような構造を成してよい。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、全抗体をパパインで制限切断するとＦａｂが得られ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、又は遺伝子再組み合わせ技術により製作することができるが、これに制限されるものではない。
【0032】
前記リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、約１０～２５つのアミノ酸長さを有するものであってよい。例えば、前記リンカーには、グリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）のような新水性アミノ酸が含まれてよい。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含んでよく、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0033】
前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）及びスペーサー
ドメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）からなる群より選択される少なくとも一つをさ
らに含んでよい。前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、ヒンジドメイン及び／又はスペーサードメインを介して膜貫通型ドメインと連結されてよい。
ドメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）からなる群より選択される少なくとも一つをさ
らに含んでよい。前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、ヒンジドメイン及び／又はスペーサードメインを介して膜貫通型ドメインと連結されてよい。
【0034】
前記ヒンジドメインは、適切な細胞／細胞接触、適切な抗原／抗原結合部位の結合及び適切なキメラ抗原受容体の活性化ができるように、前記キメラ抗原受容体が発現される免疫細胞の表面から前記抗原結合部位が物理的に離隔できるようにする部分であって、細胞外ドメインの位置決めに重要な役割を担当することができる。前記キメラ抗原受容体は、前記細胞外ドメインと膜貫通型ドメインとの間に一つ以上のヒンジドメインを含んでよい。ヒンジドメインは、天然、合成、半－合成、又は再組み合わせ供給源から由来してよい。ヒンジドメインは、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域又は変化された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。前記変化されたヒンジ領域は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％のアミノ酸置換又は欠失）を有する天然発生ヒンジ領域、（ｂ）最大３０％アミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％のアミノ酸置換又は欠失）を有する少なくとも１０つのアミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４又は１５つのアミノ酸）長さの天然発生ヒンジ領域の一部、又は（ｃ）コアヒンジ領域（これは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５、又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５つのアミノ酸長さであってよい）を含む天然発生ヒンジ領域の一部を指称する。特定の実施形態において、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域で一つ以上のシステイン残基は、一つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、一つ以
上のセリン残基）に置換されてよい。変化された免疫グロブリンヒンジ領域は、代案的に又は追加的にさらに他のアミノ酸残基、例えば、システインに置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有してよい。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの類型１膜タンパク質の細胞外ドメインから由来するヒンジ領域であってよいが、前記抗原結合部位と膜貫通型ドメイン、そして細胞内信号伝達ドメインを細胞膜の間に連結可能なものであれば、いずれも制限なく用いることができる。また、これは、これら分子からの野生型ヒンジ領域であってよいか、変化されてよい。
上のセリン残基）に置換されてよい。変化された免疫グロブリンヒンジ領域は、代案的に又は追加的にさらに他のアミノ酸残基、例えば、システインに置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有してよい。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの類型１膜タンパク質の細胞外ドメインから由来するヒンジ領域であってよいが、前記抗原結合部位と膜貫通型ドメイン、そして細胞内信号伝達ドメインを細胞膜の間に連結可能なものであれば、いずれも制限なく用いることができる。また、これは、これら分子からの野生型ヒンジ領域であってよいか、変化されてよい。
【0035】
前記スペーサードメインは、連結ドメインと指称されてよく、例えば、ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／又はＣＤ８由来のヒンジドメインを含むものであってよく、前記ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／又はＣＤ８由来のヒンジドメインの全体又は一部を含むものであってよい。
【0036】
前記ヒンジドメイン及び／又はスペーサードメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン及びＦｃからなる群より選択される少なくとも一つであってよく、具体的には、Ｍｙｃエピトープ及びＣＤ８ヒンジドメインを含むものであってよい。より具体的には、前記Ｍｙｃエピトープは、配列番号５のアミノ酸配列を含むものであってよく、前記ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むものであってよい。
【0037】
前記膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）は、細胞外ドメ
イン及び細胞内信号伝達ドメインを互いに連結して融合させ、免疫細胞の原形質膜にキメラ抗原受容体を固定させる役割をする一部領域を意味する。前記膜貫通型ドメインは、天然、合成、半－合成、又は再組み合わせ供給源から由来するものであってよい。前記膜貫通型ドメインは、Ｔ－細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）、又はゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群より選択されるいずれか一つであってよいが、これに制限されるものではない。
イン及び細胞内信号伝達ドメインを互いに連結して融合させ、免疫細胞の原形質膜にキメラ抗原受容体を固定させる役割をする一部領域を意味する。前記膜貫通型ドメインは、天然、合成、半－合成、又は再組み合わせ供給源から由来するものであってよい。前記膜貫通型ドメインは、Ｔ－細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）、又はゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群より選択されるいずれか一つであってよいが、これに制限されるものではない。
【0038】
前記膜貫通型ドメインは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して前記細胞外ドメインに付着されてよい。例えば、リンカーは、２～１０つのアミノ酸長さの短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーであってよく、例えば、グリシン（Ｇ）－セリン（Ｓ）二重体（ｄｏｕｂｌｅｔ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0039】
本発明の具体的な実施例においては、細胞外ドメインとしてＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ＣＤ２８を膜貫通型ドメインとして含み、前記単鎖可変断片及びＣＤ２８をＭｙｃ及びヒンジドメインで連結した形態のキメラ抗原受容体を設計した。そして、前記膜貫通型ドメインに前記死滅領域を含む受容体の一つであるｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを細胞内信号伝達ドメインで連結して本発明のキメラ抗原受容体を製造した。
【0040】
前述したように、本発明のキメラ抗原受容体は、ｐ７５ＮＴＲなどのように死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインにより単独で信号伝達が発生する場合、免疫細胞の細胞毒性の低減及び／又は前記免疫細胞の細胞死滅の促進が誘導される可能性がある。したがって、正常細胞が存在する時に、前記キメラ抗原受容体の抗原結合部位が正常細胞から発現された抗原を認識して結合する場合、信号伝達により免疫細胞の細胞毒性の低減及び／又は細胞死滅の促進が誘導される可能性があり、正常細胞に対する細胞毒性を有さないので、安定性を示すキメラ抗原受容体として有用に用いることができる。
【0041】
本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び
発現ベクターを提供する。
発現ベクターを提供する。
【0042】
前記ポリヌクレオチドは、前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含む。
【0043】
本発明において、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含むものであって、基本構成単位であるヌクレオシドは、自然のヌクレオシドのみでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。
【0044】
前記キメラ抗原受容体を暗号化することは、前記ポリヌクレオチドが転写、翻訳などの通常的なタンパク質発現過程を経て、本発明のキメラ抗原受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質が合成できる遺伝情報が暗号化されていることを意味する。この際、前記キメラ抗原受容体と完全に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質のみでなく、前述したように前記タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質や、前記タンパク質と同一及び／又は類似の活性を有するタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドまで本発明の範囲に含まれてよい。
【0045】
具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインを含むものであってよく、例えば、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを暗号化する塩基配列を含むものであってよく、より具体的には、配列番号２の塩基配列を含むものであってよい。
【0046】
また、本発明のポリヌクレオチドは、死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインを含むものであってよく、例えば、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを暗号化する塩基配列のみでなく、これと連結された前記膜貫通型ドメイン及び／又は前記細胞外ドメインを暗号化する塩基配列を含むものであってよい。
【0047】
前記ｐ７５ＮＴＲなどのような死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインを含む細胞内信号伝達ドメインや、膜貫通型ドメイン、細胞外ドメインなど前記キメラ抗原受容体に対する説明は、これに対して前述したものと同一である。
【0048】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１３の塩基配列を含むものであってよい。本発明の具体的な一実施形態においては、細胞外ドメインとしてＥＧＦＲに対して特異的に結合する抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ＣＤ２８を膜貫通型ドメインとして含み、前記単鎖可変断片及びＣＤ２８をＭｙｃ及びヒンジドメインで連結し、前記膜貫通型ドメインに前記死滅領域を含む受容体の一つであるｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを細胞内信号伝達ドメインで連結した形態のキメラ抗原受容体を設計し、これを発現させるために前記配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチドを製造した。
【0049】
本発明のポリヌクレオチドは、前記羅列された塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含んでよい。前記実質的に同一の塩基配列とは、例えば、転写及び翻訳された時に同一のアミノ酸が合成できる場合を含み、前記羅列された塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の相同性を有する塩基配列であってよいが、これに制限されるものではない。
【0050】
前記キメラ抗原受容体を暗号化するポリヌクレオチドは、これを導入させて発現させようとする生物の種類と前記生物の転写、翻訳など発現システムにより最適化された塩基配列を含んでよい。これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）から起因したものであって、これにより発現されるタンパク質を暗号化できる多様な組み合わせのヌクレオシ
ド配列が存在することができ、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。前記コドンの最適化によるポリヌクレオチドの変形は、本発明のキメラ抗原受容体を発現させて適用させようとする生物の種類に応じて決定されてよく、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物、霊長類のコドン選択に最適化して変形されたポリヌクレオチドであってよく、より具体的には、人間から発現させて作用するのに適するように最適化して変形されたものであってよい。
ド配列が存在することができ、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。前記コドンの最適化によるポリヌクレオチドの変形は、本発明のキメラ抗原受容体を発現させて適用させようとする生物の種類に応じて決定されてよく、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物、霊長類のコドン選択に最適化して変形されたポリヌクレオチドであってよく、より具体的には、人間から発現させて作用するのに適するように最適化して変形されたものであってよい。
【0051】
本発明の発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。
【0052】
前記ポリヌクレオチドは、本発明の前記キメラ抗原受容体を暗号化する塩基配列を含むので、これを含む前記発現ベクターは、前記キメラ抗原受容体を発現させて製造するために用いられてよく、前記キメラ抗原受容体が発現できるように前記ポリヌクレオチドを特定の細胞又は生物に移動させる役割をするか前記ポリヌクレオチドを保管、保存するために用いられてよい。
【0053】
前記発現ベクターは、原核細胞又は眞核細胞を宿主にして構築され得る。
【0054】
例えば、前記発現ベクターが原核細胞を宿主にする場合は、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開示のためのリボソーム結合部位及び転写／翻訳終決配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ ｃｏｌｉトリプトファン
生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ、Ｊ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そしてファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅｎ、Ｄ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられてよい。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルスチューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９９６）２５０：７３４－７４１）又はバチルス菌で発現可能ないかなるプロモーターでも調節部位として用いられてよい。前記発現ベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）、又はウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作されてよい。
生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ、Ｊ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そしてファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅｎ、Ｄ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられてよい。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルスチューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９９６）２５０：７３４－７４１）又はバチルス菌で発現可能ないかなるプロモーターでも調節部位として用いられてよい。前記発現ベクターは、当業界で時々使用されるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）、又はウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作されてよい。
【0055】
前記発現ベクターが眞核細胞を宿主にする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター、及びロウスサコマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、転写終決配列としてポリアデニル化配列を一般的に有してよい。前記発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを有するものであってよい。
【0056】
また、前記発現ベクターは、これから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合され得る。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇ
ｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明の発現ベクターにより発現されるタンパク質が人間化抗体又はその抗原結合断片であるので、その特性を考慮すると、精製のための追加的な配列なしも発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムなどを介して容易に精製することもできる。
ｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明の発現ベクターにより発現されるタンパク質が人間化抗体又はその抗原結合断片であるので、その特性を考慮すると、精製のための追加的な配列なしも発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムなどを介して容易に精製することもできる。
【0057】
前記発現ベクターは、選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含んでよい。
【0058】
２．二重キメラ抗原受容体（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ）を発現する免疫細胞
本発明の他の側面は、正常細胞に対しては細胞毒性を示すことなく、癌細胞に対してはより増進した細胞毒性を示す特徴がある免疫細胞を提供する。
本発明の他の側面は、正常細胞に対しては細胞毒性を示すことなく、癌細胞に対してはより増進した細胞毒性を示す特徴がある免疫細胞を提供する。
【0059】
前記免疫細胞は、前述した本発明の前記キメラ抗原受容体を第１キメラ抗原受容体；として表面に発現し、癌細胞で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む第２キメラ抗原受容体；を表面に発現する。
【0060】
前記第１キメラ抗原受容体は、前記「１．新規のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」でキメラ抗原受容体について説明したものと同一である。具体的には、前記第１キメラ抗原受容体は、正常細胞及び癌細胞ですべて発現される抗原に対して特異的に結合できる抗原結合部位を含んでよく、前記第１キメラ抗原受容体が結合する抗原は、前記第２キメラ抗原受容体が結合する抗原と互いに異なるものであってよい。
ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」でキメラ抗原受容体について説明したものと同一である。具体的には、前記第１キメラ抗原受容体は、正常細胞及び癌細胞ですべて発現される抗原に対して特異的に結合できる抗原結合部位を含んでよく、前記第１キメラ抗原受容体が結合する抗原は、前記第２キメラ抗原受容体が結合する抗原と互いに異なるものであってよい。
【0061】
前記第２キメラ抗原受容体は、次のように説明され得る。
【0062】
前記第２キメラ抗原受容体は、通常当業界で癌を標的にして免疫細胞を活性化させて免疫反応を誘導することができるので、癌治療剤として用いられる第２キメラ抗原受容体であれば、その種類に無関係に用いることができる。
【0063】
具体的には、前記第２キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、癌細胞で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む。具体的には、前記抗原は、癌細胞特異的抗原であってよく、これは癌を予防、治療、改善、診断するために用いられる癌特異的マーカーであってよい。すなわち、前記癌細胞特異的抗原は、正常細胞に比べて統計的に留意して癌細胞でより高い頻度で発現される抗原であってよく、したがって、前記第２キメラ抗原受容体は、正常細胞より癌細胞を特異的に認識して結合することができる。
【0064】
前記第２キメラ抗原受容体の抗原結合部位は、前記癌細胞特異的抗原に特異的に結合できるものであれば制限なく適用することができ、例えば、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ３、ＩＬ－１３Ｒα２、ＤＬＫ１、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＧＰＣ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ５などに特異的に結合するものであってよい。
【0065】
前記第２キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、前記抗原結合部位が特異的に結合する抗原の種類に関する説明以外は、「１．新規のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａ
ｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチ
ド及び発現ベクター」で第１キメラ抗原受容体の細胞外ドメインについて説明したものと同一であり、例えば、前記第２キメラ抗原受容体の抗原結合部位は、抗体の単鎖可変断片であってよい。
ｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチ
ド及び発現ベクター」で第１キメラ抗原受容体の細胞外ドメインについて説明したものと同一であり、例えば、前記第２キメラ抗原受容体の抗原結合部位は、抗体の単鎖可変断片であってよい。
【0066】
前記第２キメラ抗原受容体の膜貫通型ドメインに関する説明も「１．新規のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」で第１キメラ抗原受容体の膜貫通型ドメインについて説明したものと同一である。
【0067】
前記第２キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインは、免疫細胞の機能（例えば、第２キメラ抗原受容体と抗原が結合された標的細胞に対する細胞毒性因子の放出を含む活性化、サイトカイン生成、増殖及び細胞毒性活性、又は前記抗原結合で誘発されたその他細胞反応）を誘発するために、前記キメラ抗原受容体と抗原の結合により発生する信号を免疫細胞の内部に伝達する役割をする部分に該当する。前記細胞内信号伝達ドメインは、作動機能信号を伝達し、細胞が特殊な機能を行うように指示するタンパク質の一部であってよい。
【0068】
前記第２キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインは、既存にキメラ抗原受容体の発展過程で用いられた細胞内信号伝達ドメインが用いられてよい。具体的には、１世代ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）で用いられたＣＤ３ζのみを含んでよい。そして、２世代ＣＡＲで用いられたように、免疫細胞に対する反応性向上のために共刺激ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζを結合した形態が用いられてよい。また、３世代ＣＡＲで用いられたように、２つ以上の共刺激ドメインが用いられてよく、この際、生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性達成のために、共刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８、又はＯＸ４０などと結合させてよい。さらに、４世代ＣＡＲで用いたように、ＩＬ－１２又はＩＬ－１５のようなサイトカインを暗号化する追加遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲ基盤免疫タンパク質がさらに発現されるようにでき、５世代ＣＡＲで用いたように、免疫細胞強化のためにインターロイキンレセプター鎖、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含んでよい。
【0069】
より具体的には、前記細胞内信号伝達ドメインによる前記免疫細胞の活性化は、細胞内信号伝達ドメインの２つの異なる部類により媒介され得る。例えば、抗原－依存性一次活性化を開始する１次信号伝達ドメイン及び２次信号を提供するために抗原－独立的方式で作用する共刺激信号伝達ドメインにより免疫細胞活性化が媒介され得る。したがって、前記細胞内信号伝達ドメインは、１次信号伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよい。
ｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよい。
【0070】
前記１次信号伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とは、免疫細胞活性化を刺激又は抑制方式で調節する信号伝達ドメインを意味する。刺激方式で作用する１次信号伝達ドメインは、免疫受容体チロシン－基盤活性化モチーブ又はＩＴＡＭで公知されている信号伝達モチーブを含んでよい。１次信号伝達ドメインを含むＩＴＡＭは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄなどであってよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、前記１次信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（ｚｅｔａ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0071】
前記共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とは、共刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを意味する。前記共刺激信号伝
達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドで構成された群より選択される共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記共刺激分子はＤＡＰ１０であってよいが、これに制限されるものではない。
達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドで構成された群より選択される共刺激信号伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含んでよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記共刺激分子はＤＡＰ１０であってよいが、これに制限されるものではない。
【0072】
本発明の一実施形態によれば、前記第２キメラ抗原受容体は、細胞内信号伝達ドメインとしてＤＡＰ１０及びＣＤ３ζを用いることで、ナチュラルキラー細胞の高い活性で癌細胞に対する死滅効果を示すようにできる。
【0073】
前記第２キメラ抗原受容体は、２つ以上の細胞内信号伝達ドメインを含んでよく、２つ以上の細胞内信号伝達ドメインを含む場合は、細胞内信号伝達ドメインが互いに直列に連結されてよい。又は２～１０つのアミノ酸からなるポリペプチドリンカーを介して連結されてもよく、前記リンカー配列は、例えば、グリシン－セリン連続配列であってよい。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、又は（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含んでよく、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0074】
前記第２キメラ抗原受容体は、免疫細胞の免疫機能促進因子をさらに含んでよく、例えば、前記免疫細胞の免疫機能促進因子は、インターロイキン信号配列（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であってよい。前記インターロイキン信号配列は、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－１２、ＩＬ－８、ＩＬ－２などの発現を誘導することを特徴としてよいが、これに制限されるものではない。また、前記免疫細胞がＴ細胞の場合、前記免疫機能促進因子はＩＬ－７、ＣＣＬ１９などであってよいが、これに制限されるものではない。
【0075】
前記免疫細胞は、免疫を誘導して目的とする治療効果を誘発できる細胞であれば制限なく用いられてよく、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、ナチュ
ラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、マクロファージ及び樹枝状細胞
からなる群より選択されるいずれか一つであってよいが、これに制限されるものではない。したがって、本発明による第１キメラ抗原受容体及び第２キメラ抗原受容体を細胞表面に発現する免疫細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏ
ｐｈａｇｅ）などであってよい。
ラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、マクロファージ及び樹枝状細胞
からなる群より選択されるいずれか一つであってよいが、これに制限されるものではない。したがって、本発明による第１キメラ抗原受容体及び第２キメラ抗原受容体を細胞表面に発現する免疫細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏ
ｐｈａｇｅ）などであってよい。
【0076】
前記Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）、末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）で分離したＴ細胞などであってよいが、これに制限され
るものではない。
るものではない。
【0077】
前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ナチュラルキラー細胞にキメラ抗原受容体が導入された細胞を意味し、既存のＴ細胞を基盤としたＣＡＲ－Ｔ治療剤を用いた時の癌免疫治療が有する
持続的な毒性による問題、自己免疫疾患の危険、異種細胞移植に対する移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の問題、非標的毒性の問題などを反応開始（ｏｎ）／中止（ｏｆｆ）のスイッチを介して解決できるだけではなく、多様な癌細胞を標的できるようにして、汎用の治療剤として活用可能な利点がある。
持続的な毒性による問題、自己免疫疾患の危険、異種細胞移植に対する移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の問題、非標的毒性の問題などを反応開始（ｏｎ）／中止（ｏｆｆ）のスイッチを介して解決できるだけではなく、多様な癌細胞を標的できるようにして、汎用の治療剤として活用可能な利点がある。
【0078】
本発明の免疫細胞は、ｐ７５ＮＴＲなどのように死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ
）を含む受容体の細胞内ドメインを細胞内信号伝達ドメインとして含み、正常細胞／癌細胞の両方で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む第１キメラ抗原受容体と、癌細胞特異的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む第２キメラ抗原受容体を、免疫細胞表面に発現させることができる。この際、もし正常細胞のみ存在する場合は、前記二重キメラ抗原受容体のうち第１キメラ抗原受容体のみが正常細胞表面の抗原を認識して結合することができ、これにより前述したように前記免疫細胞の細胞毒性を低減させるか免疫細胞の細胞死滅を促進することができるので、正常細胞に対する免疫反応を誘発しない可能性がある。一方、癌細胞が存在する場合は、癌細胞の表面に第１キメラ抗原受容体が認識できる抗原と第２キメラ抗原受容体が認識できる抗原とがすべて存在することができるので、前記２つのキメラ抗原受容体ですべて信号伝達が発生するようになる。この際、前記第１キメラ抗原受容体と第２キメラ抗原受容体ですべて信号伝達が発生する場合、第２キメラ抗原受容体が単独で信号伝達を介して免疫細胞を活性化させることと比べて免疫細胞の細胞毒性がより向上することができる。したがって、本発明の免疫細胞は、正常細胞に対しては安定性を示し、癌細胞に対しては既存のキメラ抗原受容体が示す細胞毒性より増加した細胞毒性を示すことができるため、癌細胞を攻撃して治療する効能が向上した特徴がある。
）を含む受容体の細胞内ドメインを細胞内信号伝達ドメインとして含み、正常細胞／癌細胞の両方で発現される抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む第１キメラ抗原受容体と、癌細胞特異的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む第２キメラ抗原受容体を、免疫細胞表面に発現させることができる。この際、もし正常細胞のみ存在する場合は、前記二重キメラ抗原受容体のうち第１キメラ抗原受容体のみが正常細胞表面の抗原を認識して結合することができ、これにより前述したように前記免疫細胞の細胞毒性を低減させるか免疫細胞の細胞死滅を促進することができるので、正常細胞に対する免疫反応を誘発しない可能性がある。一方、癌細胞が存在する場合は、癌細胞の表面に第１キメラ抗原受容体が認識できる抗原と第２キメラ抗原受容体が認識できる抗原とがすべて存在することができるので、前記２つのキメラ抗原受容体ですべて信号伝達が発生するようになる。この際、前記第１キメラ抗原受容体と第２キメラ抗原受容体ですべて信号伝達が発生する場合、第２キメラ抗原受容体が単独で信号伝達を介して免疫細胞を活性化させることと比べて免疫細胞の細胞毒性がより向上することができる。したがって、本発明の免疫細胞は、正常細胞に対しては安定性を示し、癌細胞に対しては既存のキメラ抗原受容体が示す細胞毒性より増加した細胞毒性を示すことができるため、癌細胞を攻撃して治療する効能が向上した特徴がある。
【0079】
本発明の具体的な実施形態では、正常細胞及び癌細胞ですべて発現するＥＧＦＲに特異的に結合できる前記第１キメラ抗原受容体と、癌細胞で特異的に発現するＨＥＲ２やＥｐｈＡ２に特異的に結合できる前記第２キメラ抗原受容体がすべて発現されたナチュラルキラー細胞を用いて、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２が発現された乳癌細胞又はＥＧＦＲとＥｐｈＡ２をすべて発現する乳癌細胞に対する細胞毒性を確認した結果、前記第２キメラ抗原受容体のみが発現されたナチュラルキラー細胞で示される細胞毒性に比べて第１及び第２キメラ抗原受容体が二重に発現されたナチュラルキラー細胞では、細胞毒性がより高く示されることを確認することができた。したがって、本発明の前記免疫細胞は、癌を治療するための用途として非常に有用に用いられることを確認することができる。
【0080】
一方、本発明の前記免疫細胞は、その表面に前述した第１キメラ抗原受容体と第２キメラ抗原受容体以外にも、複数の追加的なキメラ抗原受容体、例えば、第３、第４、第５キメラ抗原受容体などをさらに発現するものであってよい。前記複数の追加的なキメラ抗原受容体は、前記第１キメラ抗原受容体や第２キメラ抗原受容体とは全く異なる種類の抗原に特異的に結合するものであってよく、前記複数のキメラ抗原受容体のそれぞれも互いに異なる種類の抗原に特異的に結合するものであってよい。前記のような複数の追加的なキメラ抗原受容体が前記免疫細胞の表面に発現される場合、本発明の前記免疫細胞は、複数の抗原を同時に標的化することができる。結局、本発明の前記免疫細胞は、ｐ７５ＮＴＲなどのように死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメインを細
胞内信号伝達ドメインとして含む前記第１キメラ抗原受容体とともに、第２、第３、第４キメラ抗原受容体などを同時に発現させることで、前記第２、第３、第４キメラ抗原受容体などに特異的な抗原が存在する標的細胞に対する前記第２、第３、第４キメラ抗原受容体などによる免疫細胞の細胞毒性をより向上させることができるので、本発明の前記免疫細胞が細胞毒性を示すことができる標的細胞の範囲をさらに確張することができる。
胞内信号伝達ドメインとして含む前記第１キメラ抗原受容体とともに、第２、第３、第４キメラ抗原受容体などを同時に発現させることで、前記第２、第３、第４キメラ抗原受容体などに特異的な抗原が存在する標的細胞に対する前記第２、第３、第４キメラ抗原受容体などによる免疫細胞の細胞毒性をより向上させることができるので、本発明の前記免疫細胞が細胞毒性を示すことができる標的細胞の範囲をさらに確張することができる。
【0081】
３．本発明の免疫細胞の癌に対する治療用途
本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を含む癌治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を含む癌治療用薬学的組成物を提供する。
【0082】
前記免疫細胞、これから発現されるキメラ抗原受容体などに関する説明は、「１．新規のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）及びこれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」及び「２．二重キメラ抗原受容体（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ）を発現する免疫細胞」でこれらについて説明したものと同一であるので、繰り返し説明を避けるために記載を省略する。
【0083】
本発明において、用語「癌」と「腫瘍」は同一の意味として用いられ、典型的に調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指称するか意味する。
【0084】
本発明の組成物として治療できる癌又は癌種は特に制限されず、固形癌及び血液癌をすべて含む。例えば、前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膵膓癌、大膓癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髄腫、急性骨髓性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉腫、繊維性腫瘍、及び脳癌からなる群より選択される少なくとも一つであってよいが、これに制限されるものではなく、前記第２キメラ抗原受容体から認識できる抗原を含む癌細胞であれば、本発明で制限なく適用され得る。
【0085】
本発明において、用語「治療」は、癌の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。
【0086】
前記薬学的組成物は、治療対象である個体の腫瘍細胞の数に比べて前記免疫細胞の数が１倍～１０倍、２倍～１０倍、又は５倍～８倍で含まれてよいが、これに制限されるものではない。
【0087】
前記組成物は、薬学的組成物以外にも、医薬外品組成物、健康食品用組成物などの形態であってよい。
【0088】
本発明の癌の治療用組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。前記「薬学的に許容可能な」という意味は、有効成分の活性を抑制することなく、適用（処方）対象が適応可能な以上の毒性を有しないというものであり、前記「担体」は、細胞又は組織内への化合物の付加を容易にする化合物として定義される。
【0089】
本発明の前記薬学的組成物は、単独で又はある便利な担体などとともに混合して投与されてよく、そのような投与剤形は、単回投与又は繰り返し投与剤形であってよい。前記薬学組成物は、固形製剤又は液状製剤であってよい。固形製剤は、散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤などがあるが、これに限定されるものではない。固形製剤には、担体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、活沢剤、充填剤などが含まれてよいが、これに制限されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、油剤などがあるが、これに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造してよい。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体と乳糖、澱粉、未結晶セルロースなど薬剤学的に許容可能な適当な担体を単純混合することで製造され得る。粒剤は、本発明の前記多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な担体及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式粒法又は圧縮力を用いた乾式粒法を用いて製造され得る。また、錠剤は、前記粒剤をマグネシウムステアリン酸などの薬学的に許容可能な適当な活沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造され得る。
【0090】
前記薬学的組成物は、治療すべき疾患及び個体の状態に応じて経口剤、注射剤（例えば
、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トレンスドマル剤、トピカル剤などに投与されてよいが、これに制限されるものではない。投与経路に応じて通常使用され、非毒性である薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形に製剤化され得る。
、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トレンスドマル剤、トピカル剤などに投与されてよいが、これに制限されるものではない。投与経路に応じて通常使用され、非毒性である薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形に製剤化され得る。
【0091】
前記薬学的組成物は、毎日約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｇ／ｋｇが投与されてよく、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇの１日投与容量で投与されてよい。しかし、前記投与量は、前記混合物の精製程度、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性などに応じて多様であってよい。必要に応じて、便利性のために、１日総投与量を一日複数分けて投与されてよい。
【0092】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
【0093】
ただし、下記実施例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例により限定されない。
【0094】
［実施例１］
死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメインを含むキメラ抗
原受容体の設計
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、及び細胞内信号伝達ドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）を含ん
でよく、前記細胞内信号伝達ドメインとして死滅領域を含む受容体の一つであるｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含むようにして
、本発明のキメラ抗原受容体を設計した。
死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含む受容体の細胞内ドメインを含むキメラ抗
原受容体の設計
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、膜貫通型ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、及び細胞内信号伝達ドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）を含ん
でよく、前記細胞内信号伝達ドメインとして死滅領域を含む受容体の一つであるｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含むようにして
、本発明のキメラ抗原受容体を設計した。
【0095】
前記細胞外ドメインは、抗原結合部位を含み、本発明のキメラ抗原受容体は、前記抗原の種類や抗原結合部位の種類と無関係に製造され得、本実施例では、ＥＧＦＲに特異的に結合できる抗体の単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を使用した。膜貫通型ドメインとしては、ＣＤ２８を使用して前記ＥＧＦＲに対するｓｃＦｖと前記ＣＤ２８をＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通型ドメインにｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインが連結されるように構成して、これを暗号化する配列番号１３の塩基配列を含む遺伝子コンストラクトをｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－ｚｓＧＲＥＥＮベクターに挿入した（図１）。
ｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を使用した。膜貫通型ドメインとしては、ＣＤ２８を使用して前記ＥＧＦＲに対するｓｃＦｖと前記ＣＤ２８をＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通型ドメインにｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインが連結されるように構成して、これを暗号化する配列番号１３の塩基配列を含む遺伝子コンストラクトをｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－ｚｓＧＲＥＥＮベクターに挿入した（図１）。
【0096】
［実施例２］
二重キメラ抗原受容体（ｄｕａｌ ＣＡＲ）を表面に発現する免疫細胞の製造
二重キメラ抗原受容体（ｄｕａｌ ＣＡＲ）を表面に発現する免疫細胞の製造
【0097】
［２－１］α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ及びｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むＣＡＲをともに発現する免疫細胞の製造
前記実施例１を介して設計した本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現できる免疫細胞を製造した。この際、抗－コチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）キメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）であるα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）に前記実施例１で設計したベクターを導入させ、これにより２種類のキメラ抗原受容体を発現できるナチュラルキラー細胞であるＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１を製造した。
前記実施例１を介して設計した本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現できる免疫細胞を製造した。この際、抗－コチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）キメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）であるα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）に前記実施例１で設計したベクターを導入させ、これにより２種類のキメラ抗原受容体を発現できるナチュラルキラー細胞であるＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１を製造した。
【0098】
前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞は、韓国登録特許第２，１２２，５４６号に記
載された方法により製造及び／又は修得できるナチュラルキラー細胞であって、コチニンに特異的に結合できるｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体を表面に発
現させる特徴がある。具体的には、前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を自動化高速
柔細胞分離器（ＦａｃｓＡｒｉａ ｆｕｓｉｏｎ）を介して単一細胞に分離し（Ｍ２）、
レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を用いて前記実施例１を介して設計した本発明キメラ抗原受容体を暗号化するベクターを前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に導入
した。これにより、前記ベクターが成功的に導入したナチュラルキラー細胞の場合、既存に発現する抗－コチニンキメラ抗原受容体のみではなく、本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を細胞表面に発現させることができる。
載された方法により製造及び／又は修得できるナチュラルキラー細胞であって、コチニンに特異的に結合できるｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体を表面に発
現させる特徴がある。具体的には、前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を自動化高速
柔細胞分離器（ＦａｃｓＡｒｉａ ｆｕｓｉｏｎ）を介して単一細胞に分離し（Ｍ２）、
レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を用いて前記実施例１を介して設計した本発明キメラ抗原受容体を暗号化するベクターを前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に導入
した。これにより、前記ベクターが成功的に導入したナチュラルキラー細胞の場合、既存に発現する抗－コチニンキメラ抗原受容体のみではなく、本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を細胞表面に発現させることができる。
【0099】
本発明のキメラ抗原受容体を暗号化するベクターを導入させた後、ナチュラルキラー細胞株から前記キメラ抗原受容体の発現可否を確認した。具体的には、前記キメラ抗原受容体に含まれたタグタンパク質Ｍｙｃを検出するために蛍光を発現するＭｙｃ抗体を用いて細胞株を染色し、細胞表面への発現を柔細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を介
して確認した。また、前記ＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲの発現は、前記挿入されたベクターから発現されるｚｓＧｒｅｅｎの蛍光を柔細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を介
して測定することで、キメラ抗原受容体の２種が成功的に発現されたことを確認することができた（図２）。
して確認した。また、前記ＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲの発現は、前記挿入されたベクターから発現されるｚｓＧｒｅｅｎの蛍光を柔細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を介
して測定することで、キメラ抗原受容体の２種が成功的に発現されたことを確認することができた（図２）。
【0100】
［２－２］α－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ及びｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むＣＡＲをともに発現する免疫細胞の製造
さらに、前記実施例１を介して設計した本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現できる他の免疫細胞を製造した。
さらに、前記実施例１を介して設計した本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現できる他の免疫細胞を製造した。
【0101】
先ず、抗－ＥｐｈＡ２単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を抗原結合部位として含む細胞外ドメインにしてナチュラルキラー細胞に導入するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）を設計した。具体的には、前記ｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８を膜貫通型ドメインにしてＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通型ドメインに細胞内信号伝達ドメインでＣＤ３－ｚｅｔａと共刺激分子でＣＤ２８ ＤＡＰ１０を追加して連結することで、いわゆる３世代ＣＡＲに分類されるキメ
ラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインを有するように、本発明のキメラ抗原受容体を設計した（図３ａ）。そして、これを暗号化する遺伝子コンストラクトの塩基配列をレンチウイルスベクターに挿入し、ウイルスパッケージングベクター（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａ
ｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ；ｐＭＤＬＧ／ＲＲＥ、ｐＲＳＶ／ＲＥＶ、ＶＳＶＧ）とともに
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。それからＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１を発現するレンチウイルスを得た後、これを超高速遠心分離機を用いて濃縮させた後、Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ方法（３６０ｇ、９０ｍｉｎ、ＲＴ）で感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）が３０になるようにナチュラルキラー細胞に感染さ
せた。前記のように感染されたナチュラルキラー細胞を３７℃、５％ ＣＯ２条件で５時
間培養した後、新鮮な培地に替え、３日後に確実に感染されたナチュラルキラー細胞の選別のために３ｕｇ／ｍｌ濃度のピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を処理して培養を進行し続けた。対照群で感染されていないナチュラルキラー細胞にもピューロマイシンを処理し、対照群でナチュラルキラー細胞がピューロマイシンによりすべて死滅されるまでピューロマイシンが処理された培地を用いて培養を続けた。対照群のナチュラルキラー細胞がすべて死滅した時点で感染されたナチュラルキラー細胞を選別して実験を行った。前記のように選別されたα－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を自動化高速柔細胞分離
器を介して単一細胞に分離後（７９－１４）、前記実施例［２－１］と同一の方法で前記実施例１で設計したベクターを導入させることで、既存に発現する抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体と本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のすべてを細胞表面に発現させ得るナチュラルキラー細胞であるＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２
を製造した。
ｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を抗原結合部位として含む細胞外ドメインにしてナチュラルキラー細胞に導入するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）を設計した。具体的には、前記ｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８を膜貫通型ドメインにしてＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通型ドメインに細胞内信号伝達ドメインでＣＤ３－ｚｅｔａと共刺激分子でＣＤ２８ ＤＡＰ１０を追加して連結することで、いわゆる３世代ＣＡＲに分類されるキメ
ラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインを有するように、本発明のキメラ抗原受容体を設計した（図３ａ）。そして、これを暗号化する遺伝子コンストラクトの塩基配列をレンチウイルスベクターに挿入し、ウイルスパッケージングベクター（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａ
ｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ；ｐＭＤＬＧ／ＲＲＥ、ｐＲＳＶ／ＲＥＶ、ＶＳＶＧ）とともに
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。それからＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１を発現するレンチウイルスを得た後、これを超高速遠心分離機を用いて濃縮させた後、Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ方法（３６０ｇ、９０ｍｉｎ、ＲＴ）で感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）が３０になるようにナチュラルキラー細胞に感染さ
せた。前記のように感染されたナチュラルキラー細胞を３７℃、５％ ＣＯ２条件で５時
間培養した後、新鮮な培地に替え、３日後に確実に感染されたナチュラルキラー細胞の選別のために３ｕｇ／ｍｌ濃度のピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を処理して培養を進行し続けた。対照群で感染されていないナチュラルキラー細胞にもピューロマイシンを処理し、対照群でナチュラルキラー細胞がピューロマイシンによりすべて死滅されるまでピューロマイシンが処理された培地を用いて培養を続けた。対照群のナチュラルキラー細胞がすべて死滅した時点で感染されたナチュラルキラー細胞を選別して実験を行った。前記のように選別されたα－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を自動化高速柔細胞分離
器を介して単一細胞に分離後（７９－１４）、前記実施例［２－１］と同一の方法で前記実施例１で設計したベクターを導入させることで、既存に発現する抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体と本発明のｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のすべてを細胞表面に発現させ得るナチュラルキラー細胞であるＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２
を製造した。
【0102】
前記のように製造されたＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２を対象にして、前記実施例
［２－１］と同一の方法で前記キメラ抗原受容体の発現可否を確認した結果、キメラ抗原受容体の２種が紙成功的に発現されたことを確認できた（図３ｂ）。
［２－１］と同一の方法で前記キメラ抗原受容体の発現可否を確認した結果、キメラ抗原受容体の２種が紙成功的に発現されたことを確認できた（図３ｂ）。
【0103】
［実施例３］
癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原のみ存在する場合、ナチュラルキラー細胞でｐ７５ＮＴＲ信号の機能確認
前記実施例［２－１］で製造したナチュラルキラー細胞は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを信号伝達ドメインとして含むキメラ抗原受容体（第１ＣＡＲ）とコチニンに対して特異的に結合できる抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体（第２ＣＡＲ）を表面に発現する特徴がある。この際、前記第１ＣＡＲは、正常細胞と癌細胞ですべて発現されるＥＧＦＲを認識して結合できる抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでいるので、ＥＧＦＲを表面に発現させた正常細胞又は癌細胞が存在する場合、これによりナチュラルキラー細胞内で信号伝達が行われ得る。
癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原のみ存在する場合、ナチュラルキラー細胞でｐ７５ＮＴＲ信号の機能確認
前記実施例［２－１］で製造したナチュラルキラー細胞は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを信号伝達ドメインとして含むキメラ抗原受容体（第１ＣＡＲ）とコチニンに対して特異的に結合できる抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体（第２ＣＡＲ）を表面に発現する特徴がある。この際、前記第１ＣＡＲは、正常細胞と癌細胞ですべて発現されるＥＧＦＲを認識して結合できる抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでいるので、ＥＧＦＲを表面に発現させた正常細胞又は癌細胞が存在する場合、これによりナチュラルキラー細胞内で信号伝達が行われ得る。
【0104】
そこで、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含む本発明のキメラ抗原受容体（第２ＣＡＲ）のみが単独で活性化される時に、ナチュラルキラー細胞の活性を確認するために、ＥＧＦＲを表面に発現する乳癌細胞であるＡＵ５６５を標的細胞にし、前記第２ＣＡＲの信号伝達は行われないようにコチニン接合体は入れない条件で、前記ＡＵ５６５細胞はカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）で染色して進行し、前記実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）又はａ－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）と１：３（標的細胞：ナチュラルキラー細胞）の割合で４時間共培養した。前記ナチュラルキラー細胞の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は４時間共培養後、上澄み液に分泌されたカルセインの量で確認した。その結果、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）の
場合ＥＧＦＲに結合できず、コチニン接合体がなくて信号伝達が発生しないので、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性も示されておらず、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体が発現された実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）でも同様にナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性が示されなかった（図
４）。
場合ＥＧＦＲに結合できず、コチニン接合体がなくて信号伝達が発生しないので、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性も示されておらず、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体が発現された実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）でも同様にナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性が示されなかった（図
４）。
【0105】
また、前記ナチュラルキラー細胞をＡＵ５６５細胞と培養した後、それぞれ６時間及び２４時間経過した時点でナチュラルキラー細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度を確認した。前記細胞死滅は、ＡＵ５６５細胞と前記実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）又はＭ２細胞をそれぞれ１：０．２（標的細胞：ナ
チュラルキラー細胞）の割合で６又は２４時間共培養した後、実施した。各細胞を共培養した後、細胞をａｎｎｅｘｉｎＶと７ＡＡＤで染色した後、柔細胞分析を介して細胞の死滅程度を確認した。この際、前記Ｍ２細胞は、ＣＤ５６－ＦＩＴＣの蛍光を発現する抗体で染色し、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞は、自体的に発現されるｚｓＧｒｅｅｎを用いて標的細胞であるＡＵ５６５と区分できるようにし、チュラルキラー細胞のみを区画して細胞の死滅程度を確認した。その結果、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）をＥＧＦＲが発現されたＡＵ５６５細胞に長期間露
出させる場合、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）と比べると、ナチュラルキラ
ー細胞の細胞死滅が増加すると確認された（図５）。
チュラルキラー細胞）の割合で６又は２４時間共培養した後、実施した。各細胞を共培養した後、細胞をａｎｎｅｘｉｎＶと７ＡＡＤで染色した後、柔細胞分析を介して細胞の死滅程度を確認した。この際、前記Ｍ２細胞は、ＣＤ５６－ＦＩＴＣの蛍光を発現する抗体で染色し、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞は、自体的に発現されるｚｓＧｒｅｅｎを用いて標的細胞であるＡＵ５６５と区分できるようにし、チュラルキラー細胞のみを区画して細胞の死滅程度を確認した。その結果、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）をＥＧＦＲが発現されたＡＵ５６５細胞に長期間露
出させる場合、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）と比べると、ナチュラルキラ
ー細胞の細胞死滅が増加すると確認された（図５）。
【0106】
前記のような結果を総合してみると、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体がナチュラルキラー細胞表面に発現されて前記キメラ抗原受容体のみ単独で信号伝達が活性化される場合、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性は示されず、むしろ抗原に長期間露出された時にナチュラルキラー細胞の細胞死滅が誘導され、ナチュラルキラー細胞が本来の機能ができなくなることを確認できた。前記ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを
含む本発明のキメラ抗原受容体は、癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原を認識して結合できるように設計されたので、もし正常細胞のみ存在する場合、前記ナチュラルキラー細胞は、正常細胞に対しては毒性を示さず、細胞死滅が誘導される。したがって、本発明の前記キメラ抗原受容体を表面に発現させたナチュラルキラー細胞は、正常細胞は攻撃しない特徴があることを確認できた。
含む本発明のキメラ抗原受容体は、癌細胞及び正常細胞ですべて発現される抗原を認識して結合できるように設計されたので、もし正常細胞のみ存在する場合、前記ナチュラルキラー細胞は、正常細胞に対しては毒性を示さず、細胞死滅が誘導される。したがって、本発明の前記キメラ抗原受容体を表面に発現させたナチュラルキラー細胞は、正常細胞は攻撃しない特徴があることを確認できた。
【0107】
［実施例４］
癌細胞特異的抗原が存在する場合、二重ＣＡＲが発現されたナチュラルキラー細胞の細胞毒性確認
前記実施例３でｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体による単独信号伝達発生時にナチュラルキラー細胞の細胞毒性が減少し、細胞死滅が増加することを確認したことに加え、癌細胞特異的抗原もともに存在してナチュラルキラー細胞の二重ＣＡＲによる信号伝達がすべて発生した時にナチュラルキラー細胞の活性がどのように変化するか否かを確認した。
癌細胞特異的抗原が存在する場合、二重ＣＡＲが発現されたナチュラルキラー細胞の細胞毒性確認
前記実施例３でｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体による単独信号伝達発生時にナチュラルキラー細胞の細胞毒性が減少し、細胞死滅が増加することを確認したことに加え、癌細胞特異的抗原もともに存在してナチュラルキラー細胞の二重ＣＡＲによる信号伝達がすべて発生した時にナチュラルキラー細胞の活性がどのように変化するか否かを確認した。
【0108】
具体的には、ＥＧＦＲとＨＥＲ２をすべて発現する乳癌細胞であるＡＵ５６５細胞を標的細胞として用いて、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）及び実施例［２－１］
のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）をそれぞれ共培養した。この際
、前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）及び実施例［２－１］のナチュラルキ
ラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）の表面に発現されたキメラ抗原受容体により認
識して結合できるように、ＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体をともに使用してＡＵ５６５細胞から発現されるＨＥＲ２を認識できるようにした（韓国登録特許第２，１２２，５４６号参考）。
のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）をそれぞれ共培養した。この際
、前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）及び実施例［２－１］のナチュラルキ
ラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）の表面に発現されたキメラ抗原受容体により認
識して結合できるように、ＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体をともに使用してＡＵ５６５細胞から発現されるＨＥＲ２を認識できるようにした（韓国登録特許第２，１２２，５４６号参考）。
【0109】
ＡＵ５６５細胞と共培養させた前記ナチュラルキラー細胞を対象にして、前記実施例３と同一の方法でナチュラルキラー細胞の細胞毒性を確認した。
【0110】
その結果、ＨＥＲ２－コチニン接合体が存在する条件で、抗－コチニンキメラ抗原受容体のみが発現されているα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）の細胞毒性に比べて
、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）の細胞毒性
が顕著に増加することを確認でき、単一細胞別に確認した結果でもすべてのＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞で前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）に比べて高い細胞毒性を示した（図６）。
、実施例［２－１］のナチュラルキラー細胞（Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２）の細胞毒性
が顕著に増加することを確認でき、単一細胞別に確認した結果でもすべてのＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞で前記α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（Ｍ２）に比べて高い細胞毒性を示した（図６）。
【0111】
抗－コチニンキメラ抗原受容体が発現されたナチュラルキラー細胞では、ＨＥＲ２－コチニン接合体を介して癌細胞表面のＨＥＲ２を認識することで、信号伝達により細胞毒性を有するようになり、癌細胞を攻撃できる活性が高くなる。しかし、前記実験結果をみると、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体が二重に発現され、癌細胞表面のＥＧＦＲにより信号伝達が発生されると、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性がより増加することが分かる。
【0112】
［実施例５］
二重ＣＡＲが発現されたナチュラルキラー細胞の細胞毒性の追加検証
前記実施例３で確認されたｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみにより単独で信号伝達が発生される場合にナチュラルキラー細胞自らの細胞死滅が増加するという点と前記実施例４で確認された癌特異的抗原がともに存在して２種のＣＡＲすべてで信号伝達が発生された場合にナチュラルキラー細胞の細胞毒性が向上する点を、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞ではなく他の種類の細胞外ドメインを有するＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞（α－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞）
を用いてもう一度検証した。
二重ＣＡＲが発現されたナチュラルキラー細胞の細胞毒性の追加検証
前記実施例３で確認されたｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみにより単独で信号伝達が発生される場合にナチュラルキラー細胞自らの細胞死滅が増加するという点と前記実施例４で確認された癌特異的抗原がともに存在して２種のＣＡＲすべてで信号伝達が発生された場合にナチュラルキラー細胞の細胞毒性が向上する点を、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞ではなく他の種類の細胞外ドメインを有するＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞（α－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞）
を用いてもう一度検証した。
【0113】
具体的には、ＥＧＦＲとＥｐｈＡ２をすべて発現する乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を標的細胞として用いて、ｉ）ＮＫ９２細胞、ｉｉ）前記実施例１で設計した本発明のキメラ抗原受容体を暗号化するベクターを前記実施例［２－１］と同一の方法でＮＫ９２細胞に導入して製作したＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＮＫ９２細胞、ｉｉｉ）前記実
施例［２－２］で製作したα－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（７９－１４）、ｉｖ
）前記実施例［２－２］で製作したＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２（７９－１４－７
５）をそれぞれ共培養し、前記実施例３と同一の方法で各ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を確認した。その結果、ｉ）ＮＫ９２細胞と、ｉｉ）ＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＮＫ９
２細胞との細胞活性を比べてみると、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみによる単独信号伝達が発生する場合は細胞毒性が増加しなかったが、ｉｖ）Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２（７９－１４－７５）は、抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容
体のみが発現されるｉｉｉ）α－Ｅｐｈａ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（７９－１４）に比
べて遥かに向上した細胞毒性を示すと確認された（図７）。
施例［２－２］で製作したα－ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（７９－１４）、ｉｖ
）前記実施例［２－２］で製作したＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２（７９－１４－７
５）をそれぞれ共培養し、前記実施例３と同一の方法で各ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を確認した。その結果、ｉ）ＮＫ９２細胞と、ｉｉ）ＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＮＫ９
２細胞との細胞活性を比べてみると、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみによる単独信号伝達が発生する場合は細胞毒性が増加しなかったが、ｉｖ）Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞２（７９－１４－７５）は、抗－ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容
体のみが発現されるｉｉｉ）α－Ｅｐｈａ２－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（７９－１４）に比
べて遥かに向上した細胞毒性を示すと確認された（図７）。
【0114】
また、前記実施例３と同様に、前記自然細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と培養した後、１７時間経過した時点で細胞の死滅を確認した。その結果、ｉ）ＮＫ９２細胞の場合、標的細胞と共培養した後にも、共培養前と比べて細胞死滅が増加しなかったが、ｉｉ）ＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＮＫ９２細胞の場合は標的細胞と共培養後に細胞死滅が増加した
と確認された（図８）。
と確認された（図８）。
【0115】
前記のような結果は、α－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞１と同一の結果として、このような結果からコチニン以外の他の抗原に対しても、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを信号伝達ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体を用いたＤｕａｌ－ＣＡＲが同一の効能を示すことが分かる。
【0116】
［実施例６］
Ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）による細
胞死滅効果確認
Ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインには死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）が含まれて
おり、このドメインは、細胞死滅に関与すると知られている。本発明でも前記実施例３及び実施例５を介してｐ７５ＮＴＲのみの単独信号伝達により細胞死滅が増加することを確認し、このような現象が実際にｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインに存在する前記死滅領域による効果であるか否かを確認しようとした。
Ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）による細
胞死滅効果確認
Ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインには死滅領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）が含まれて
おり、このドメインは、細胞死滅に関与すると知られている。本発明でも前記実施例３及び実施例５を介してｐ７５ＮＴＲのみの単独信号伝達により細胞死滅が増加することを確認し、このような現象が実際にｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインに存在する前記死滅領域による効果であるか否かを確認しようとした。
【0117】
具体的には、前記死滅領域の機能を確認するために、前記実施例１で設計したキメラ抗原受容体でｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのうち死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体（ｐ７５ＮＴＲＤＤＤ）を設計し、これを暗号化する遺伝子コンストラクトをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）ベクターに挿入した（図９）。これとは別途に、前記実施例１
で設計したキメラ抗原受容体を暗号化する遺伝子コンストラクトもｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）ベクターに挿入し、これら２つのベクターのそれぞれから試験管内転写を
介してＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＣＡＲとＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＤＤＤ ＣＡＲのｍＲ
ＮＡを製作した。前記のように製作されたｍＲＮＡをα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞
（Ｍ２）に形質転換した後、１７時間経過後に導入されたキメラ抗原受容体の発現可否を前記実施例２と同一の方法でタグタンパク質Ｍｙｃを検出を介して確認した。その結果、ｐ７５ＮＴＲ及び死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体の２種がすべて成功的に発現されたと確認された（図１０）。
で設計したキメラ抗原受容体を暗号化する遺伝子コンストラクトもｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）ベクターに挿入し、これら２つのベクターのそれぞれから試験管内転写を
介してＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＣＡＲとＥＧＦＲ－ｐ７５ＮＴＲ ＤＤＤ ＣＡＲのｍＲ
ＮＡを製作した。前記のように製作されたｍＲＮＡをα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞
（Ｍ２）に形質転換した後、１７時間経過後に導入されたキメラ抗原受容体の発現可否を前記実施例２と同一の方法でタグタンパク質Ｍｙｃを検出を介して確認した。その結果、ｐ７５ＮＴＲ及び死滅領域が除去されたキメラ抗原受容体の２種がすべて成功的に発現されたと確認された（図１０）。
【0118】
前記のように各キメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を用いて
、前記実施例４と同一の方法で標的細胞であるＡＵ５６５細胞とそれぞれのＤｕａｌ－Ｃ
ＡＲ ＮＫ９２細胞１：１、１：０．５、１：０．２５（標的細胞：ナチュラルキラー細
胞）の割合で共培養することで、細胞毒性を確認した。その結果、死滅領域の除去可否と関係なく、Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞がα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に比べて高い細胞毒性を示し、ＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体を入れないので、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみ単独で活性化された場合は、死滅領域の除去可否と関係なく細胞毒性は増加しないと確認された（図１１）。これは前記実施例３～実施例５と同一の結果であることが分かる。
、前記実施例４と同一の方法で標的細胞であるＡＵ５６５細胞とそれぞれのＤｕａｌ－Ｃ
ＡＲ ＮＫ９２細胞１：１、１：０．５、１：０．２５（標的細胞：ナチュラルキラー細
胞）の割合で共培養することで、細胞毒性を確認した。その結果、死滅領域の除去可否と関係なく、Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞がα－Ｃｏｔ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に比べて高い細胞毒性を示し、ＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体を入れないので、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体のみ単独で活性化された場合は、死滅領域の除去可否と関係なく細胞毒性は増加しないと確認された（図１１）。これは前記実施例３～実施例５と同一の結果であることが分かる。
【0119】
一方、前記死滅領域は、細胞死滅に影響を及ぼすと知られているので、前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を標的細胞であるＡＵ５６５と共培養した後、２４時間が経過した
時点で前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度を確
認した。前記細胞死滅程度の確認は、前記実施例３と同一の方法でｐ７５ＮＴＲの細胞内信号のみ伝達されるようにＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体を入れない状態で、Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞と標的細胞を０．５：１の割合で共培養すること
で確認した。その結果、ＡＵ５６５と共培養しないそれぞれのＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９
２細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度はすべて類似しているのに対し、ＡＵ５６５と共培養した場合は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを有するキメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞がｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのないα－Ｃｏｔ
－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に比べて細胞死滅が増加したと確認され、死滅領域が除去された
キメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の場合は、細胞死滅程度が
減少したと確認された（図１２）。前記のような結果から、ｐ７５ＮＴＲのみにより単独で細胞内信号伝達が活性化されると細胞死滅が誘導され、このような細胞死滅誘導現象は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインに存在する死滅領域によるものであることが分かる。
時点で前記Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度を確
認した。前記細胞死滅程度の確認は、前記実施例３と同一の方法でｐ７５ＮＴＲの細胞内信号のみ伝達されるようにＨＥＲ２－コチニン（ＨＥＲ２－ｃｏｔ）接合体を入れない状態で、Ｄｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞と標的細胞を０．５：１の割合で共培養すること
で確認した。その結果、ＡＵ５６５と共培養しないそれぞれのＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９
２細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度はすべて類似しているのに対し、ＡＵ５６５と共培養した場合は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインを有するキメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞がｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインのないα－Ｃｏｔ
－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞に比べて細胞死滅が増加したと確認され、死滅領域が除去された
キメラ抗原受容体を発現するＤｕａｌ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の場合は、細胞死滅程度が
減少したと確認された（図１２）。前記のような結果から、ｐ７５ＮＴＲのみにより単独で細胞内信号伝達が活性化されると細胞死滅が誘導され、このような細胞死滅誘導現象は、ｐ７５ＮＴＲの細胞内ドメインに存在する死滅領域によるものであることが分かる。
【0120】
したがって、ｐ７５ＮＴＲなどのような死滅領域を含む受容体の細胞内ドメインを含む細胞内信号伝達ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体を用いる場合、正常細胞に対しては細胞毒性がないか少なく、ナチュラルキラー細胞の細胞死滅が誘発されるので、正常細胞に対する安定性が確保できながらも、癌細胞に対しては既存の単独キメラ抗原受容体を活用した技術に比べてより強力な細胞毒性を示すことができることを確認できた。そこで、前記キメラ抗原受容体及びナチュラルキラー細胞を優れた効果の癌治療剤として有用に使用できることを確認した。
【0121】
以上で本発明は、記載された実施形態に対してのみ詳しく説明されたが、本発明の技術思想の範囲内で多様な変形及び修正が可能であることは、当業者において明らかなものであり、このような変形及び修正が添付された特許請求の範囲に属することは当然である。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】