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特表2024-527947抗ＣＤ１５４抗体及びその用途

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】抗ＣＤ１５４抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

C07K 16/28 20060101AFI20240719BHJP

A61K 47/68 20170101ALI20240719BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20240719BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20240719BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20240719BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20240719BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20240719BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20240719BHJP

A61P 17/06 20060101ALI20240719BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61K47/68

A61P37/02

A61P37/06

A61P19/02

A61P1/04

A61P25/00

A61P13/12

A61P17/06

A61P7/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504862

(86)(22)【出願日】2022-08-01

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 KR2022011334

(87)【国際公開番号】W WO2023008982

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】10-2021-0100482

(32)【優先日】2021-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0095658

(32)【優先日】2022-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519001383

【氏名又は名称】ソウルナショナルユニバーシティアールアンドディービーファウンデーション

(71)【出願人】

【識別番号】518357128

【氏名又は名称】イファユニバーシティ－インダストリーコラボレーションファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ－ＩＮＤＵＳＴＲＹＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】５２，Ｅｗｈａｙｅｏｄａｅ－ｇｉｌＳｅｏｄａｅｍｕｎ－ｇｕＳｅｏｕｌ０３７６０，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100118256

【弁理士】

【氏名又は名称】小野寺隆

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口正夫

(72)【発明者】

【氏名】チュンジュンホ

(72)【発明者】

【氏名】チェキュンホ

(72)【発明者】

【氏名】キムサンイル

(72)【発明者】

【氏名】イヨンジェ

(72)【発明者】

【氏名】キムスジョン

(72)【発明者】

【氏名】パクソリョン

(72)【発明者】

【氏名】ファンシウォン

(72)【発明者】

【氏名】カンドンミン

(72)【発明者】

【氏名】キムスリ

【テーマコード（参考）】

4C076

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC09

4C076CC14

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体に関し、具体的には、配列番号１～３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲと、配列番号４～６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲとを含む抗体；並びに、前記抗体および薬物を含むＴ細胞媒介性自己免疫疾患または臓器移植拒絶反応の予防または治療用薬学組成物に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＨＣＤＲ１）と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とを含む重鎖と、
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＬＣＤＲ１）と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む軽鎖とを含む、抗体。

【請求項2】

配列番号７のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体は、ヒトＣＤ１５４（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１５４）に結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体に薬物が接合されている、抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。

【請求項5】

前記薬物は、前記抗体にリンカーまたは二次抗体で接合される、請求項４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項6】

さらにハプテン（ｈａｐｔｅｎ）を含む、請求項４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項7】

前記ハプテンは、コンチニン（ｃｏｎｔｉｎｉｎｅ）である、請求項６に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項8】

前記薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ、ＰＢＤ）二量体、α－アマニチン（α－ａｍａｎｉｔｉｎ）およびデュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）を含む群から選択される、請求項４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項9】

請求項４～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを含む、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項10】

前記Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅｓ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ループス腎炎（ｌｕｐｕｓｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ、ｐＳＳ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ｆｏｃａｌａｎｄｓｅｇｍｅｎｔａｌｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、および免疫性血小板減少症（ｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を含む群から選択される、請求項９に記載の薬学組成物。

【請求項11】

請求項４～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを含む、臓器移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の予防または治療用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体に関し、具体的には、活性化されたＴ細胞の表面に発現するＣＤ１５４を認識する抗体；並びに、前記抗体および薬物を含むＴ細胞媒介性自己免疫疾患または臓器移植拒絶反応の予防または治療用薬学組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞の活性化は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶反応などで現れる必須の現象であり、Ｔ細胞受容体連結（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）以外に共刺激シグナル（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌ）を必要とする。新たに活性化された（ｒｅｃｅｎｔｌｙａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞のＣＤ１５４は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ、ＡＰＣ）のＣＤ４０に結合し、ＣＤ８０とＣＤ８６の発現を促進するとともに、サイトカインの産生を促進する。ＣＤ８０とＣＤ８６に結合して、ＡＰＣのＣＤ８０／ＣＤ８６とＴ細胞のＣＤ２８との結合を抑制するＣＴＬＡ－４Ｉｇ（ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｏｒｅｎｃｉａ）とベラタセプト（ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ、Ｎｕｌｏｊｉｘ）は、効果的にＴ細胞の活性化を抑制することにより、自己免疫疾患の進行を抑制する（ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗＩｍｍｕｎｏｌ、２００１、１：２２０）。

【0003】

ＣＤ２８の他にも多数のＴ細胞共刺激シグナルが判明しているが、疾患の治療において最も重要なシグナル伝達経路は、Ｔ細胞のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）とＣＤ４０との相互作用によるシグナルである。ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ１５４の発現レベルは、自己免疫関節炎患者の疾患の重症度（ｄｉｓｅａｓｅｓｅｖｅｒｉｔｙ）、臨床的な結果（ｃｌｉｎｉｃａｌｏｕｔｃｏｍｅ）、疾患の治癒度（ｄｉｓｅａｓｅｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、ＴＮＦ阻害剤の治療効果などと非常に密接に関連している（Ｃｅｌｌｓ、２０１９、８：９２７）。ＣＤ１５４に結合する抗体は、ＣＤ４０との相互作用の阻害以外にも、ＣＤ１５４を発現する活性化Ｔ細胞を補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）により除去することにより、ＭＨＣミスマッチ皮膚移植モデル（ＭＨＣ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｓｋｉｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ）における移植拒絶反応を抑制した（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、２００３、３：１２７５）。その後、ＣＤ１５４に結合する抗体の臨床開発が活発に進められ、ＢＧ９５８８、ＩＤＥＣ－１３１、ＡＢＩ７９３などが開発されたが、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）の発症により開発が中断された。その原因は、活性化された血小板から分泌されるｓｏｌｕｂｌｅＣＤ１５４と抗体が免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅｃｏｍｐｌｅｘ）を形成した後、血小板のＦｃγＲＩＩａと結合して血小板を活性化させるためであることが判明した（ＪＩｍｍｕｎｏｌ、２０１０、１８５：１５７７）。その後、ＦｃのないＣＤ１５４ブロックカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）であるＶＩＢ４９２０は、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）を対象として臨床開発が進められている（ＮＣＴ０４１２９１６４）。また、抗ＣＤ４０Ｌ抗体として、ダピロリズマブペゴル（Ｄａｒｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂｐｅｇｏｌ）（ＮＣＴ０４２９４６６７）、ＳＡＲ４４１３３４（ＩＮＸ－０２１；ＮＣＴ０４５７２８４１、ＮＣＴ０５０３９８４０、ＮＣＴ０４８７９６２８）もまた、Ｆｃ受容体に対する結合力を阻害して血栓塞栓症の発症を抑制するために様々なフォーマットで臨床開発が進められている。

【0004】

ＣＤ１５４のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）であるＣＤ４０の阻害剤も開発されているが、ＣＤ４０阻害剤の臨床的効果はＣＤ１５４阻害剤と比較して劣っていることが示された。その理由の一つは、ＣＤ１５４のリガンドはＣＤ４０の以外にもＣＤ１１ｂなどが存在するためである（ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０２０、２０：２２１６）。

【0005】

そこで、ＣＤ１５４を特異的に標的化してＣＤ１５４とＣＤ４０との間の相互作用を阻害しながらも、同時にＣＤ１５４＋Ｔ細胞の特異的な死滅を誘導できる抗体の開発が必要なのが現状である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ＣＤ１５４を特異的に標的化し、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞と特異的に結合できる抗体を提供することを目的とする。

【0007】

本発明は、抗ＣＤ１５４抗体を含むＴ細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【0008】

本発明は、抗ＣＤ１５４抗体を含む臓器移植拒絶反応の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

１．配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＨＣＤＲ１）と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とを含む重鎖と、
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＬＣＤＲ１）と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む軽鎖とを含む、抗体。

【0010】

２．前記項目１において、配列番号７のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）を含む、抗体。

【0011】

３．前記項目１において、前記抗体はヒトＣＤ１５４（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１５４）に結合する、抗体。

【0012】

４．前記項目１～３のいずれかの抗体に薬物が接合されている、抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。

【0013】

５．前記項目４において、前記薬物は、前記抗体にリンカーまたは二次抗体で接合される、抗体－薬物コンジュゲート。

【0014】

６．前記項目４において、さらにハプテン（ｈａｐｔｅｎ）を含む、抗体－薬物コンジュゲート。

【0015】

７．前記項目６において、前記ハプテンは、コンチニン（ｃｏｎｔｉｎｉｎｅ）である、抗体－薬物コンジュゲート。

【0016】

８．前記項目４において、前記薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ、ＰＢＤ）二量体、α－アマニチン（α－ａｍａｎｉｔｉｎ）およびデュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）を含む群から選択される、抗体－薬物コンジュゲート。

【0017】

９．前記項目４～８のいずれかの抗体－薬物コンジュゲートを含む、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。

【0018】

１０．前記項目９において、前記Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅｓ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ループス腎炎（ｌｕｐｕｓｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ、ｐＳＳ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ｆｏｃａｌａｎｄｓｅｇｍｅｎｔａｌｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、および免疫性血小板減少症（ｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を含む群から選択される、薬学組成物。

【0019】

１１．前記項目４～８のいずれかの抗体－薬物コンジュゲートを含む、臓器移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の予防または治療用薬学組成物。

【発明の効果】

【0020】

本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する新規な抗体を提供することができる。これは、好ましくは、抗ＣＤ１５４抗体に薬物を接合した抗体－薬物コンジュゲートとして活用することができ、前記抗体－薬物コンジュゲートは、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患などの予防または治療用薬学組成物として活用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、抗ＣＤ１５４抗体がＣＤ１５４＋Ｌ細胞に結合することをフローサイトメトリーにより確認したものである。

【図2】図２は、ＬＡＬＡ突然変異を含む抗ＣＤ１５４抗体がＣＤ１５４＋Ｌ細胞に結合することをフローサイトメトリーにより確認したものである。

【図3】図３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性培地で培養した後、時間によるＣＤ４＋ＣＤ１５４＋Ｔ細胞の割合を確認したデータ及びＣＤ４＋ＣＤ１５４＋Ｔ細胞と抗ＣＤ１５４抗体が結合することをフローサイトメトリーにより確認したものである。

【図4】図４は、抗ＣＤ１５４抗体がＣＤ１５４に結合し、ＣＤ１５４の機能を阻害することを確認したものである。

【図5】図５は、抗ＣＤ１５４抗体の血中半減期を確認したものである。

【図6】図６は、抗ＣＤ１５４抗体の細胞内への内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び局在（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認したものである。

【図7】図７は、抗ＣＤ１５４抗体－薬物コンジュゲートがＣＤ１５４＋Ｌ細胞を死滅できることを確認したものである。

【図8】図８は、ＬＡＬＡ突然変異を含む抗ＣＤ１５４抗体薬物コンジュゲートがＣＤ１５４＋Ｌ細胞を死滅できることを確認したものである。

【図9】図９は、抗ＣＤ１５４抗体－薬物コンジュゲートがＣＤ１５４＋Ｔ細胞を死滅できることを確認したものである。

【図10】図１０は、抗ＣＤ１５４抗体アミノ酸配列を示すものである。

【図11】図１１は、１３個のニワトリ由来の残基がヒト由来の残基で置換された部分ヒト化抗体のｓｃＦｖ部位のアミノ酸配列を示すものである。

【図12】図１２は、抗ＣＤ１５４抗体のＬＣＤＲアミノ酸配列およびＨＣＤＲアミノ酸配列を示すものである。

【図13】図１３は、２５個のニワトリ由来の残基がヒト由来のアミノ酸配列に変更された部分ヒト化抗体のｓｃＦｖ部位のアミノ酸配列を示すものである。

【図14】図１４は、３１個のニワトリ由来の残基がヒト由来のアミノ酸配列に変更された部分ヒト化抗体のｓｃＦｖ部位のアミノ酸配列を示すものである。

【図15】図１５は、ＬＡＬＡ突然変異を含む抗ＣＤ１５４抗体（ＩｇＧ１）にＭＭＡＥを結合させた抗体－薬物コンジュゲートの模式図を示すものである。

【図16】図１６は、ＨＩＣ－ＨＰＬＣにより、抗ＣＤ１５４抗体とＦｃＢＰリンカーとの間の接合有無を確認したデータである。

【図17】図１７は、ＨＩＣ－ＨＰＬＣにより、抗ＣＤ１５４抗体とＭＭＡＥ薬物との間の接合有無を確認したデータである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明を詳細に説明する。特に定義がない限り、本明細書における全ての用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する技術者が理解する当該用語の一般的な意味と同じであり、仮に本明細書に使われる用語の意味と衝突する場合には、本明細書に使われる定義に従う。

【0023】

本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＨＣＤＲ１）と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とを含む重鎖と、
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎ１；ＬＣＤＲ１）と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３とを含む軽鎖とを含む抗体に関するものである。

【0024】

本発明の抗体は、前記配列番号１～３のＨＣＤＲアミノ酸配列および配列番号４～６のＬＣＤＲアミノ酸配列を有するものであれば、残りのアミノ酸配列を限定しない。例えば、配列番号７のアミノ酸配列および配列番号８を含む単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）を含む抗体であってもよい。但し、これに限定されるものではない。

【0025】

前記単鎖可変断片を含む抗体の場合は、重鎖可変部の配列と軽鎖可変部の配列がリンカー等で連結されていてもよい。前記リンカー配列は、当業者によって制限なく選択され、例えば配列番号１５のアミノ酸配列であってもよい。但し、これに限定されるものではない。

【0026】

抗原の特定のエピトープを認識して抗原－抗体複合体を形成する抗体の主要部位は、重鎖および軽鎖の可変領域、特に相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）がこの複合体の形成に寄与するので、前述した本発明の抗体の可変領域、特にＣＤＲを含むそのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを本発明の範囲に含む。前記ヒト化抗体は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗体であってもよく、配列番号１１のアミノ酸配列および配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体であってもよく、配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号１４のアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。但し、これらに限定されるものではない。

【0027】

また、本発明のモノクローナル抗体の可変領域、特にＣＤＲが同一である以上、ＩｇＧ_１～ＩｇＧ_４のＩｇＧサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）なども本発明の範囲に含まれ、ＩｇＧサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）アミノ酸配列中の一部の配列に突然変異が存在する場合も含まれ得る。例えば、ヒトＩｇＧ１配列においてＬＡＬＡ突然変異（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）が存在する場合、Ｆｃ部位に対する抗Ｆｃ抗体の結合を抑制でき、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）のような副作用を最小限に抑えることができる。また、本発明は、前述のような結合特性を有する限り、２つの全長の軽鎖および２つの全長の重鎖を有する完全な形態のみならず、抗体分子の機能的断片を含む。「抗体分子の機能的断片」とは、少なくとも抗原結合機能を保持している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどがある。但し、これらに限定されるものではない。

【0028】

また、本発明の抗体は、二重（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、三重（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）又はそれ以上の抗原に結合できる多重抗体であっても、抗原結合部位の１つ以上が前記配列番号１～３のＨＣＤＲ配列および配列番号４～６のＬＣＤＲ配列を有するものであれば、関係なく本発明の範囲に含まれる。例えば、二重抗体としてＣＤ１５４とハプテンにそれぞれ特異的に結合するＦｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）配列を有するものであってもよく、その場合、ハプテンと薬物等をコンジュゲートして抗体－薬物コンジュゲートを作成することもできる。但し、これらに限定されるものではない。

【0029】

本発明の抗体は、ＣＤ１５４（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１５４）に結合することができる。ＣＤ１５４は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわち免疫応答を活発に行うことができるＣＤ４＋Ｔ細胞で主に発現され、休止（ｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ）状態のＴ細胞では発現されない細胞表面タンパク質に該当する。但し、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外にも活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ）、単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）または活性化された血小板表面でも発現され得る。したがって、本発明の抗体は、活性化されたＴ細胞と休止状態のＴ細胞とを区別し、活性化されたＴ細胞の表面タンパク質に選択的に結合できる抗体に該当する。本発明の抗体は、ヒト、アカゲザル（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ、Ｒｈｅｓｕｓｍａｃａｑｕｅ）、３ストライプ夜猿（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ、Ｔｈｒｅｅ－ｓｔｒｉｐｅｄｎｉｇｈｔｍｏｎｋｅｙ）、夜猿（Ｄｏｕｒｏｕｃｏｕｌｉ）及びスーティーマンガベイ（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓａｔｙｓ、Ｓｏｏｔｙｍａｎｇａｂｅｙ）を含む群のＣＤ１５４に結合できる。但し、これらに限定されるものではない。

【0030】

また、本発明は、前記抗体に薬物が接合された抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関するものである。

【0031】

本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、薬物を、抗体が特異的に結合できる細胞に送達するものであり、ＣＤ１５４に特異的に結合できる本発明の抗体と薬物とをコンジュゲートすることにより、ＣＤ１５４を発現する細胞に選択的に薬物を送達することができる。

【0032】

本発明で前記抗体と薬物との接合は、直接結合であってもよく、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）または抗体に結合した二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙ）による間接結合であってもよい。但し、これらに限定されるものではなく、抗体と薬物を共同で標的細胞に送達できるものであれば良い。

【0033】

本発明で前記「二次抗体」とは、抗原に結合する他の抗体（一次抗体）のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を意味するものであり、標的抗原に直接結合する一次抗体とは結合の対象に差異がある。本発明で「リンカー」とは、薬物と抗体の連結に用いられるものであり、例えば、リンカー配列を前記抗体のＦｃ配列に結合し、リンカー配列と薬物を連結して抗体－リンカー－薬物（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｎｋｅｒ－ｄｒｕｇ）の形で製造して使用してもよく、前述のように、前記抗体を二重抗体で構成し、ハプテン－リンカー－薬物をハプテンに特異的なＦｖ部位に結合させて使用してもよい。前記リンカー又は前記二次抗体は、いずれも本発明の前記抗体と薬物を結合させる用途に使用するものであり、抗体と薬物を結合させる用途であれば、二次抗体配列またはリンカーの種類とは無関係に当業者の使い方によって使用可能である。

【0034】

本発明における前記薬物の種類は制限されず、目的に応じて当業者によって選択され得る。例えば、ＣＤ１５４を表面に発現する活性化Ｔ細胞を死滅させるために、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ、ＰＢＤ）二量体、α－アマニチン（α－ａｍａｎｉｔｉｎ）およびデュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）を含む群から薬物を選択して抗体とコンジュゲートすることができる。前述のように、コンジュゲートの方法は制限なく選択することができ、目的によって前記薬物の種類を変えることができる。

【0035】

本発明における前記抗体－薬物コンジュゲートは、さらにハプテンを含むことができる。本発明でハプテンは、リンカーを介して薬物と結合し、本発明の抗体におけるハプテンに特異的な結合部位を有するＦｖ部位と結合させて安定な抗体－薬物コンジュゲートを形成する用途に使用され、この目的に合致するハプテンであれば、制限なく本発明の範囲に含まれる。すなわち、前記ハプテンの例としては、コチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）が挙げられる。但し、これに限定されるものではなく、免疫原性がないが抗原性を有する分子として、ハプテンに特異的な抗体を形成できるものであれば良い。

【0036】

本発明の前記抗体－薬物コンジュゲートを使用する場合、抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅ；以下「ＡＤＣ」という。）方式の作用機序によってＴ細胞媒介性自己免疫疾患を予防または治療するか、または、臓器移植拒絶反応を抑制することができる。前記「ＡＤＣ」とは、抗体に薬物を結合させて注入する方法であり、抗体に特異的に結合する抗原を発現する細胞において抗体の内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することによって細胞内に薬物を送達し、細胞特異的に薬物を送達する原理の治療方法に該当する。前述のように、抗ＣＤ１５４抗体部位によって活性化されたＴ細胞に結合した後に細胞内に内部化され、共に結合した薬物によってＴ細胞の死滅を誘導することにより、前記疾患の予防または治療効果を示すことができる。

【0037】

また、本発明は、前記抗体－薬物コンジュゲートを含むＴ細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療用薬学組成物に関するものである。

【0038】

本発明で前記「Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患」とは、Ｔ細胞の過剰な増殖または過剰な活性化などにより、Ｔ細胞による免疫応答が定常状態よりも高いレベルに誘導されて発症する自己免疫疾患を意味する。前記Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は、例えば、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅｓ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ループス腎炎（ｌｕｐｕｓｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ、ｐＳＳ）、原発性巣状分節性糸球体硬化症（ｆｏｃａｌａｎｄｓｅｇｍｅｎｔａｌｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、および免疫性血小板減少症（ｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を含む群から選択される疾患であってもよい。但し、これらに限定されるものではない。

【0039】

また、本発明は、前記抗体－薬物コンジュゲートを含む臓器移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の予防または治療用薬学組成物に関するものである。

【0040】

本発明の前記抗体－薬物コンジュゲートは、臓器移植過程または臓器移植後の拒絶反応に関与する活性化されたＴ細胞の免疫応答を抑制することにより、臓器移植拒絶反応を抑制することができる。

【0041】

本発明の薬学組成物は、薬学の分野における通常の方法により、患者の体内投与に適した単位投与型の製剤、好ましくは、タンパク質医薬品の投与に有用な製剤の形態に製剤化して当分野で通常使用される投与方法を用いて、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔を含む非経口投与経路によって投与できるが、これらに限定されるものではない。

【0042】

この目的に適した製剤としては、注射用アンプルのような注射剤、注入剤、およびハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）のような噴霧剤などの非経口投与用製剤が好ましい。注射または注入用製剤の場合には、懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含むことができる。また、前記抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体に再調整して使用できる乾燥された形態に製剤化することもできる。

【0043】

本発明の薬学組成物の有効成分として、前記抗体は、ヒトを含む哺乳動物に対して１日当たりに０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重を１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、有効成分の実際の投与量は、予防または治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢および性別、薬剤の組み合わせ、反応の感受性および治療に対する耐性・反応などの様々な関連因子に照らして決定しなければならない。したがって、前記の投与量は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。

【0044】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明することとする。

【0045】

実施例１．抗ＣＤ１５４抗体（ａｎｔｉ－ｈＣＤ１５４）の確立
ヒトＣＤ１５４に対するモノクローナル抗体を作成するために、ヒトＣＤ１５４をニワトリに免疫注射した後に作成した抗体ライブラリーから、細胞膜の表面に発現されたヒトＣＤ１５４に結合する抗体を開発した。具体的なプロトコルは、従来の確立された方法に従って行われた。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を図１２に示し、可変領域の配列を図１０に示す。

【0046】

その後、抗ＣＤ１５４部位と抗コチニンｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）を結合させた融合抗体を作成するために、抗体の軽鎖と重鎖の末端部位が抗コチニンＳｃＦｖとリンカー（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_４で連結されたベクターを作製し、当該ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２５－ｋＤＡ線状ポリエチレンイミン（ｌｉｎｅａｒｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて公知の方法によりトランスフェクションし、プロテインＡアガロースビーズ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、クロマトグラフィーによって抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ抗体を分離した。

【0047】

またさらに、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅ）抗体中のＬＡＬＡ突然変異を含むＩｇＧを作成するために、ヒトＩｇＧ１においてＬｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を誘導し、遺伝子組換えにより抗ｈＣＤ１５４抗体の重鎖および軽鎖がそれぞれＬＡＬＡ突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むＩｇＧ１重鎖定常領域（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ）およびＩｇｋａｐｐａ重鎖定常領域（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ）に連結されたベクターを作製し、前述のようにして抗体を分離して抗ｈＣＤ１５４（１Ｈ８－７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）抗体を作成した（図１１）。

【0048】

実施例２．抗ＣＤ１５４抗体のｈＣＤ１５４結合能の確認（ｉｎｖｉｔｒｏ）
抗体のｈＣＤ１５４との結合力を測定するために、前記実施例１で製造した抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質を、ｈＣＤ１５４を発現するＬ細胞または未発現Ｌ細胞に処理し、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行った。具体的には、連続希釈した抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質をＬ細胞（ｈＣＤ１５４－）またはＬ細胞（ｈＣＤ１５４＋）に処理してインキュベートし、ＡＰＣ－コンジュゲート抗Ｃκ抗体を用いて、細胞に結合した抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質の量を測定した。各サンプルは１０，０００個の細胞を用いて分析した。その結果、ＣＤ１５４＋Ｌ細胞と１Ｈ８抗体が活性化されたヒトＴ細胞が結合することが確認された（図１）。

【0049】

また、ＬＡＬＡ突然変異を含む抗ｈＣＤ１５４（１Ｈ８＿７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）に対しても同様にして実験を行ったところ、前述の抗体と同様に、Ｌ細胞の表面に発現したヒトＣＤ１５４に結合できることを確認した（図２）。

【0050】

実施例３．ヒト活性ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ１５４の発現の確認および抗ＣＤ１５４抗体の結合能の確認
一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を３日間、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３抗体を３日間処理して活性化し、ヒトＩＬ－２下で２日間培養した。当該細胞株を、活性の直後、６時間、４８時間、９６時間、１２０時間、１５０時間後、それぞれＰＥ標識マウス抗ｈＣＤ１５４抗体およびＦＩＴＣ標識マウス抗ＣＤ４抗体を用いてｈＣＤ１５４の発現量を測定した。その結果、６時間後には全細胞株の約６０％がＣＤ４＋／ＣＤ１５４＋Ｔ細胞であることを確認した。その後の１５０時間までも平均約５０％内外のダブルポジティブ（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞が存在することを確認した（図３Ａ、３Ｂ）。タイムポイント毎に１０，０００個の細胞を用いて分析した。

【0051】

前記の結果により、Ｔ細胞の活性化から６時間経過した一次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に実施例１の抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ抗体を処理し、ＡＰＣ－コンジュゲート抗Ｃκ抗体を用いて細胞に結合した抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質の量を測定することにより、Ｔ細胞と抗体の結合有無を確認した。その結果、１Ｈ８抗体が、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞に結合することを確認した（図３Ｃ）。

【0052】

実施例４．抗ＣＤ１５４抗体のＣＤ１５４－ＣＤ４０結合阻害能の確認
ヒトＣＤ１５４またはＣＤ１５４を発現するＬ細胞とＣＤ４０＋ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞を共培養する場合、ダウディ細胞がＣＤ８０及びＣＤ８６を発現することに着目し、抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質（２，５００ｎＭ）を組換えＨＡタグ（ＨＡ－ｔａｇｇｅｄ）ｈＣＤ１５４タンパク質（２５０ｎＭ）と混合し、ダウディ細胞に処理した。また、ダウディ細胞にＣＤ１５４＋Ｌ細胞または抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質（３０ｎＭ）を共に処理した。その後、ＣＤ８０とＣＤ８６の発現レベルをＰＥ標識マウス抗ＣＤ８０抗体およびＦＩＴＣ標識マウス抗ＣＤ８６抗体で測定した。

【0053】

その結果、組換えＨＡタグ（ＨＡ－ｔａｇｇｅｄ）ｈＣＤ１５４タンパク質を処理するか、またはＣＤ１５４＋Ｌ細胞をダウディ細胞に処理する場合、ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現量が増加するのに対して、抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ抗体を共に処理する場合には、その発現量の増加幅が大幅に減少することを確認した。このことから、抗ＣＤ１５４抗体は、効果的にＣＤ１５４及びＣＤ４０の結合を阻害できることを確認した（図４）。

【0054】

実施例４．抗ＣＤ１５４抗体の血中半減期の確認
ＮＳＧマウス（ｎ＝４）に対して、５００μｇの抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖを静脈注射した。その後、様々な時間間隔を置き、眼窩静脈から血液サンプルを収集し、血中における抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。具体的には、組換えｈＣＤ１５４タンパク質でコーティングされたマイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）を血液または標準溶液下でインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＣκ抗体をプローブとして使用し、ＴＭＢを基質として使用して測定した。全ての実験は３回繰り返して行い、データは平均と標準偏差で表している。

【0055】

その結果、抗体は注射後約２０時間が経過するまでも分解せずに維持できることを確認した。また、半減期は約６時間内外であることを確認した（図５）。

【0056】

実施例５．抗ＣＤ１５４－薬物コンジュゲートの製造（ａｎｔｉ－ｈＣＤ１５４（１Ｈ８－７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）－ＭＭＡＥ）
前記の実施例１で述べた抗ｈＣＤ１５４（１Ｈ８－７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）にＭＭＡＥを結合させ、抗体－薬物コンジュゲートを作製した（図１５）。

【0057】

具体的には、ＦｃＢＰ（Ｏｒｎ）－Ｎ_３リンカーを合成し、ｐＨ７．４１ＸＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファー中で抗体のＫ２４８位置にアジド（ａｚｉｄｅ）を導入するために、抗体（１．５３ｍｇ、１０．２ｎｍｏｌ）当たりに３．０当量（３０．６ｎｍｏｌ）の化合物ＦｃＢＰ（Ｏｒｎ）－Ｎ_３を反応液に入れ、反応を行った。反応は常温で６時間行い、反応のモニタリングおよび終了はＨＩＣ－ＨＰＬＣにより確認した。その結果、図１６に示すように、反応の後、抗ＣＤ１５４抗体とＦｃＢＰリンカーに反応が存在することを確認した。精製は透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ、ｐＨ７．４１ＸＰＢＳ）３回の精製を行い、ＣＤ１５４アジド（ａｚｉｄｅ）を確保した（収率＝９１％）。

【0058】

その後、化合物ＦｃＢＰ（Ｏｒｎ）－Ｎ_３によりアジド（ａｚｉｄｅ）の２分子が導入されたＣＤ１５４－Ｎ_３を用いて抗体薬物複合体を作製した。０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で１．７ｍＬの量（１０．２ｎｍｏｌ）を用いて反応を行い、抗体に結合しているアジド（ａｚｉｄｅ）との生物直交反応（ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のためにＤＢＣＯ－ＢＧ－ＭＭＡＥ薬物の結合を試みた。抗体に対して６．０当量（６１．２ｎｍｏｌ）の薬物を使用し、結合反応は常温で３時間、ｐＨ７．４１ＸＰＢＳバッファー中で行った。結合反応はＨＩＣ－ＨＰＬＣにより観察した（図１７）。精製は透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ、ｐＨ７．４１ＸＰＢＳ）３回の精製を行い、抗ＣＤ１５４－ＭＭＡＥＡＤＣを確保した。

【0059】

実施例６．抗ＣＤ１５４－薬物コンジュゲートの細胞内流入の確認
ｈＣＤ１５４＋Ｌ細胞およびｈＣＤ１５４－Ｌ細胞を抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質と共にインキュベートした。細胞の表面に結合した抗体を除去し、細胞を固定した後、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームを検出するために、ウサギ抗Ｒａｂ５抗体を共に処理してインキュベートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｒｅｄ）を処理した。細胞の核は、ＤＡＰＩを用いて染色した。

【0060】

その結果、抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームは、細胞内で共に位置することを確認した（図６）。

【0061】

実施例７．抗ＣＤ１５４－薬物コンジュゲートの細胞死滅能の確認
抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖにコチニン－デュオカルマイシンを処理して製造した抗体－薬物コンジュゲート（抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖ；コチニン－デュオカルマイシン）または実施例５の抗体－薬物コンジュゲート（抗ｈＣＤ１５４（１Ｈ８－７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）－ＭＭＡＥ）をそれぞれｈＣＤ１５４＋Ｌ細胞またはｈＣＤ１５４－Ｌ細胞に処理した。その後、細胞毒性アッセイ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙ）を行い、処理濃度による細胞死滅の程度を測定した。

【0062】

その結果、抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖにコチニン－デュオカルマイシンを結合させた抗体－薬物コンジュゲート、および抗ｈＣＤ１５４（１Ｈ８－７Ｂ）ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）にＭＭＡＥを結合させた抗体－薬物コンジュゲートは、いずれもＣＤ１５４が人工的に発現されたＣＤ１５４＋Ｌ細胞を死滅できることを確認した（図７、図８）。

【0063】

さらに、フローサイトメトリーを用いて、抗ｈＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ－ｈＣκ－ｓｃＦｖとコチニン－デュオカルマイシンとが結合した抗体薬物コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞の死滅能を確認した。前記抗体薬物コンジュゲートをＣＤ４＋Ｔ細胞に４８時間処理し、ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）を用いて生存細胞／死滅細胞の割合を測定した。その結果、薬物（ｄｒｕｇ）のみを処理した場合（１３．７％）と比較して、抗体－薬物コンジュゲートを処理した場合（３０．６％）には、Ｔ細胞の死滅率が増加することを確認した（図９Ａ）。ＦＶＳ（ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＳｔａｉｎ）染色により測定した場合もまた、薬物のみを処理した場合よりも（４８．７％）、抗体薬物コンジュゲートをＣＤ４＋Ｔ細胞に６０時間処理した実験群において（７４．９％）、より高い死滅能を示すことを確認した（図９Ｂ）。また、前記サンプル（６０時間処理）におけるＦＶＳの平均蛍光強度（ＭＦＩ）および細胞の生存／死滅の割合を別々に示したとき、デュオカルマイシンまたはｈＣＤ１５４と結合しないｓｃＦｖ－ｈＣｋ－ｓｃＦｖのみを単独処理した場合には死滅細胞の割合にほとんど差がないが、抗体－薬物コンジュゲートを処理した場合には死滅細胞の割合が大きく増加することを確認した。これにより、前記効果は抗体－薬物コンジュゲート自体による効果であり、抗体－薬物コンジュゲートがｈＣＤ１５４を発現する細胞を選択的に死滅できることを確認した。

【図1】