特表 2024-527977 免疫エフェクター機能を有する操作されたＶＬＲＢ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】免疫エフェクター機能を有する操作されたＶＬＲＢ抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240719BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P37/02

A61P43/00 107

A61P43/00 105

A61P37/04

A61P31/00

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504987

(86)(22)【出願日】2022-07-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-21

(86)【国際出願番号】 US2022074225

(87)【国際公開番号】W WO2023010060

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/203,616

(32)【優先日】2021-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524033766

【氏名又は名称】ノヴァブ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キャノン， ロビック エドワード

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB31

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG08

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045EA29

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

キメラ可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）－免疫グロブリン抗体を作製および使用するための組成物が提供される。この抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖融合タンパク質から形成された２つの重鎖および軽鎖から構成される。典型的には、重鎖融合タンパク質は、第１の可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインおよびＣＨ１免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）、ならびに必要に応じて、免疫グロブリンヒンジドメイン（ヒンジ）、ＣＨ２免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２）、ＣＨＳ免疫グロブリンドメイン（ＣＨＳ）およびＣＨ４免疫グロブリンドメイン（ＣＨ４）のうちの１つまたは複数を含む。重鎖融合タンパク質は、第２の（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメイン、免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）もまた含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つまたは複数の可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＨ１免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）またはＣＬ免疫グロブリンドメイン（ＣＬ）とを含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢが、融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、またはそれらの組合せにある、重鎖融合タンパク質。

【請求項2】

免疫グロブリンヒンジドメイン（ヒンジ）をさらに含む、請求項１に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項3】

ＣＨ２免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２）をさらに含む、請求項１または２に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項4】

ＣＨ３免疫グロブリンドメイン（ＣＨ３）をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項5】

ＣＨ４免疫グロブリンドメイン（ＣＨ４）をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の重鎖融合物。

【請求項6】

第２の（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項7】

免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）をさらに含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＨが、前記融合タンパク質のＮ末端にあり、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインとＶＨドメインとが、前記融合タンパク質の異なる末端に融合されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項8】

必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）のうちの１つまたは複数をさらに含む重鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記融合タンパク質の異なる末端にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項9】

表１のドメイン構造を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項10】

ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと表１の構造とを含む重鎖融合タンパク質。

【請求項11】

前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインの一方または両方が、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によって発現される抗原に結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項12】

前記ＶＨ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲのうちの１つまたは複数が、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項13】

前記免疫グロビンドメインの各々が、哺乳動物、必要に応じてヒトの、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれらに対して７０％の配列同一性を有するそのバリアントから独立して選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項14】

前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／もしくはＩｇＧ４である、ならびに／または前記ＩｇＡが、ＩｇＡ１および／もしくはＩｇＡ２である、請求項１３に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項15】

Ｎ末端および／またはＣ末端のＶＬＲＢドメインと共に、構造ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３またはＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項16】

前記ＣＬドメインが、配列番号２３もしくは２４、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項17】

前記ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３が、配列番号２５、２６、６２、６３もしくは６４のＣＨ１、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３の配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項18】

配列番号２５、２６、６２、６３、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項19】

シグナル配列ありもしくはなしの配列番号５３、５５もしくは５６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、配列番号５３、５６または５６と比較して突然変異されていない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の重鎖融合タンパク質。

【請求項20】

シグナル配列ありまたはなしの配列番号５３、５５または６５のうちの１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合タンパク質。

【請求項21】

１つまたは２つの可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＬまたはＣＨ１ドメインとを含む軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、同じまたは異なり、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、ＣＬもしくはＣＨ１ドメインのＮ末端、前記ＣＬもしくはＣＨ１ドメインのＣ末端、またはそれらの組合せにある、軽鎖融合タンパク質。

【請求項22】

必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲをさらに含む軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記融合タンパク質の異なる末端にある、請求項２１に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項23】

表２のドメイン構造を含む、請求項２２に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項24】

１つまたは複数のＶＬＲＢ抗原結合ドメインと表２のドメイン構造とを含む軽鎖融合タンパク質。

【請求項25】

前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項26】

前記免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲが、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項27】

前記免疫グロビンドメインの各々が、哺乳動物、必要に応じてヒトの、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれに対して７０％の配列同一性を有するそのバリアントから独立して選択される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項28】

前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／もしくはＩｇＧ４である、ならびに／または前記ＩｇＡが、ＩｇＡ１および／もしくはＩｇＡ２である、請求項２７に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項29】

１つもしくは２つの前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインまたは１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインと、必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端の免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲとからなる軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記ＣＬまたはＣＨドメインのＮ末端およびＣ末端に融合されている、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項30】

前記ＣＬドメインが、配列番号２３もしくは２４、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントである、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項31】

前記ＣＨ１が、配列番号２５、２６、６２、６３、６４、６５もしくは６６のＣＨ１の配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項32】

配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項２１から３１のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項33】

シグナル配列ありもしくはなしの配列番号５４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、配列番号５４と比較して突然変異されていない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の軽鎖融合タンパク質。

【請求項34】

シグナル配列ありまたはなしの配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合タンパク質。

【請求項35】

それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の重鎖および／または請求項２１から３３のいずれか一項に記載の重鎖。

【請求項36】

請求項１から３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項37】

発現制御配列をさらに含む、請求項３６に記載の核酸。

【請求項38】

請求項３６または３７に記載の核酸を含む細胞。

【請求項39】

請求項１から２０のいずれか一項に記載の２つの重鎖融合タンパク質および請求項２１から３４のいずれか一項に記載の２つの軽鎖融合タンパク質を含むキメラ抗体。

【請求項40】

前記２つの重鎖融合タンパク質が同じである、請求項３９に記載の抗体。

【請求項41】

前記２つの重鎖融合タンパク質が異なる、請求項３９に記載の抗体。

【請求項42】

前記２つの軽鎖融合タンパク質が同じである、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項43】

前記２つの軽鎖融合タンパク質が異なる、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項44】

単一特異性である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項45】

二特異性である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項46】

多特異性である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項47】

表３、表４、または図２、３Ａ～３Ｄ、４、５もしくは６のうちのいずれかに記載の構造を含む、請求項３９から４７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項48】

それ自体、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号５３を含むキメラ抗体。

【請求項49】

少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体を形成する配列番号５５を含む、キメラ抗体。

【請求項50】

少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号６５を含む、キメラ抗体。

【請求項51】

少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号６６を含む、キメラ抗体。

【請求項52】

表１から独立して選択される２つの重鎖および表２から独立して選択される２つの軽鎖を含むキメラ抗体であって、少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗体。

【請求項53】

表３、表４、または図２、３Ａ～３Ｄ、４、５もしくは６のうちのいずれかに記載の構造を含むキメラ抗体であって、少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗体。

【請求項54】

ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に融合されたＶＬＲＢ抗原結合ドメインのダイマーを含むキメラ抗体。

【請求項55】

配列番号５１または５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のダイマーを含む、請求項５４に記載の抗体。

【請求項56】

がんまたは腫瘍抗原に結合することができる、請求項３９から５５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項57】

免疫細胞に結合することができる、請求項３９から５６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項58】

がんまたは腫瘍抗原および免疫細胞の両方に結合することができる、請求項３９から５７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項59】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージである、請求項５７または５８に記載の抗体。

【請求項60】

抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性を有する、請求項３９から５９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項61】

Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、標的細胞のＴ細胞による殺滅、またはそれらの組合せを誘導することができる、請求項３９から６２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項62】

それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴを含む、請求項３９から６１のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項63】

請求項３９から６２のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項64】

それを必要とする対象において治療結果または診断結果を誘導するための有効量の、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

非経口または経腸投与に適切な製剤における、請求項６３または６４に記載の組成物。

【請求項66】

それを必要とする対象を処置する方法であって、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項67】

それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項68】

がんについて対象を処置する方法であって、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項69】

前記抗体が、前記がんの細胞に結合する、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

感染症について対象を処置する方法であって、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項71】

前記抗体が、感染細胞に結合する、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記抗体が、１つまたは複数の免疫細胞型に結合する、請求項６６から７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性から選択される免疫応答を含む、請求項６６から７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記抗体が、Ｔ細胞に対して特異的な抗ＣＤ３抗原結合ドメイン／抗体を含む、または抗ＣＤ８抗原結合ドメインもしくはＣＤ８リガンドＴＬ抗原を含み、細胞傷害性Ｔ細胞に対して特異的である、上述の請求項のいずれか。

【請求項75】

前記ＶＬＲＢドメインのうちの１つまたは複数が、抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ８抗原結合ドメインを含むＳｃＦｖドメインまたはＣＤ８リガンドと必要に応じて組み合わされたＭＭ３ ＶＬＲＢ抗原結合ドメインであり、必要に応じて、前記リガンドが胸腺白血病抗原である、上述の請求項のいずれかの融合タンパク質および／または抗体。

【請求項76】

配列番号２２または配列番号３４の抗ＣＤ３結合ドメインを含む、上述の請求項のいずれか。

【請求項77】

図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、４、５または６のうちのいずれか１つの構造を有する、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項78】

ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に融合されたＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む融合タンパク質。

【請求項79】

配列番号５１または５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が本明細書によって参考として本明細書に具体的に援用される、２０２１年７月２７日出願の米国仮特許出願第６３／２０３，６１６号に基づく優先権を主張する。

【0002】

配列表に対する言及
２０２２年７月２７日に作成され、６８，１９３バイトのサイズを有する、名称「ＮＯＶＡＢ＿１０１＿ＰＣＴ．ｘｍｌ」のｘｍｌファイルとして提出された配列表は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８３４（ｃ）（１）に従って、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

発明の分野
開示される発明は、一般に、免疫エフェクター機能を有するように操作された可変リンパ球受容体の分野にある。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
Ｉｇ抗体とは異なり、ＶＬＲＢ抗体は、腫瘍およびウイルス感染細胞を殺滅するためまたは病原体を中和するために必要な生物学的エフェクター機能、例えば、補体活性化、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を動員／活性化する固有の能力を有さず、Ｉｇリサイクリングおよび延長された血中半減期を担うＦｃＲｎが含まれる細胞性Ｆｃ受容体と相互作用しない。ＶＬＲＢ抗体を「武器化する」ための最初の試みは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列との融合物としてそれらを発現させることを含んだ。しかし、それにもかかわらず、ＦｃＲｎ結合によって得られるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列の改善された生物学的活性、即ち、補体活性化、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび延長された血中半減期を有する改善された組成物が、いまだに望まれている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

改善されたＶＬＲＢベースの組成物およびその使用の方法を提供することが、本発明の目的である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の要旨
キメラ可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）－免疫グロブリン抗体を作製および使用するための組成物が提供される。抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖融合タンパク質から形成された２つの重鎖および軽鎖から構成される。したがって、重鎖および軽鎖融合タンパク質もまた提供される。

【0007】

典型的には、重鎖融合タンパク質は、第１の可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＨ１免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）またはＣＬ免疫グロブリンドメイン（ＣＬ）とを含む。好ましくは、重鎖タンパク質は、免疫グロブリンヒンジドメイン（ヒンジ）、ＣＨ２免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２）、ＣＨ３免疫グロブリンドメイン（ＣＨ３）およびＣＨ４免疫グロブリンドメイン（ＣＨ４）のうちの１つまたは複数を含む。重鎖融合タンパク質は、第２の（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメイン、免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）もまた含み得る。例示的な重鎖融合タンパク質のドメイン構造は、表１に提供される。
典型的には、軽鎖融合タンパク質は、可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＬ免疫グロブリンドメイン（ＣＬ）またはＣＨ１免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）とを含む。例示的なドメイン構造は、表２に提供される。

【0008】

一部の実施形態では、ＶＬＲＢ抗原結合ドメインのうちの１つもしくは複数および／またはＶＬ、ＶＨ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ（即ち、ナノボディ）、ＬもしくはＲのうちの１つもしくは複数は、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞型によってその上に発現される抗原に結合する。免疫グロビン（immunoglobin）ドメインは、典型的には、哺乳動物、必要に応じてヒトの、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントから独立して選択される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／もしくはＩｇＧ４であり得る、ならびに／またはＩｇＡは、ＩｇＡ１および／もしくはＩｇＡ２である。一部の実施形態では、免疫グロビンドメインの全てが、同じ抗体アイソタイプ由来である。融合タンパク質のいずれもが、それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴをさらに含み得る。

【0009】

例えば、その組換え発現のための、融合タンパク質をコードする核酸およびそれを含むベクターもまた、核酸を保有する細胞と同様に提供される。

【0010】

２つの重鎖融合タンパク質および２つの軽鎖融合タンパク質から形成されたキメラ抗体が提供される。一部の実施形態では、２つの重鎖は、同じである。他の実施形態では、２つの重鎖は、異なる。一部の実施形態では、２つの軽鎖は、同じである。他の実施形態では、２つの軽鎖は、異なる。ヘテロテトラマーの所望のアセンブリは、例えば、ノブイントゥホールおよび／またはクロスマブ（ｃｒｏｓｓｍａｂ）戦略（即ち、突然変異）を重鎖および／または軽鎖中に取り込むことによって、容易にされ得る。キメラ抗体は、単一特異性、二特異性または多特異性であり得る。例示的な構造は、表３および４、ならびに図２、３Ａ～３Ｄ、４、５および６に提供される。

【0011】

一部の実施形態では、キメラ抗体を形成する重鎖融合タンパク質のうちの１つもしくは複数は、ＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含まず、その代わり、免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）を含み得る。同様に、一部の実施形態では、キメラ抗体を形成する軽鎖融合タンパク質のうちの１つまたは複数は、ＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含まず、その代わり、免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）を含み得る。しかし、アセンブルされると、キメラ抗体は、典型的には、少なくとも１つの、好ましくは２つまたはそれよりも多くの同じまたは異なるＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む。

【0012】

一部の実施形態では、キメラ抗体は、がんまたは腫瘍抗原に結合することができる。さらにまたはあるいは、一部の実施形態では、キメラ抗体は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージに結合することができる。一部の実施形態では、キメラ抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性を有する。キメラ抗体は、それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴを有し得る。

【0013】

抗体を含む医薬組成物もまた提供される。典型的には、組成物は、それを必要とする対象において治療結果または診断結果を誘導するための有効量のキメラ抗体を有する。製剤は、典型的には、例えば、非経口または経腸投与による対象への投与に適切である。

【0014】

それを必要とする対象を処置する方法であって、キメラ抗体組成物を対象に投与するステップを含む、方法もまた提供される。例えば、有効量のキメラ抗体を対象に投与して、対象において免疫応答を増加させるステップを含む方法は、それを必要とする対象において免疫応答を増加させる（例えば、誘導する、活性化する、増強するなど）。がんについて対象を処置する方法は、有効量のキメラ抗体を対象に投与して、がんの１つまたは複数の症状を処置するステップを含み得る。一部のかかる実施形態では、キメラ抗体は、がんの細胞、および必要に応じて免疫細胞に結合するが、必要に応じて、好ましくは、がん細胞に対する免疫応答を増加させる。例えば、一部の実施形態では、組成物は、がん細胞に対する免疫細胞を動員および／または活性化する。感染症について対象を処置する方法は、有効量のキメラ抗体を対象に投与して、感染症の１つまたは複数の症状を処置するステップを含み得る。一部のかかる実施形態では、キメラ抗体は、感染細胞、および必要に応じて免疫細胞に結合するが、必要に応じて、好ましくは、感染細胞に対する免疫応答を増加させる。好ましい実施形態では、免疫応答には、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性、細胞傷害性細胞を動員および／または活性化することが含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A-D】図１Ａは、ＶＬＲＢ抗原結合ドメインの編成の実例である。図１Ｂは、ＶＬＲＢ ＲＢＣ３６－Ｈ３三糖抗原複合体の３次元構造表示である。図１Ｃは、ＩｇＧ構造の実例である。図１Ｄは、ＶＬＲＢとＦｃ配列とがヒンジドメインで融合された二価ＶＬＲＢ－ＩｇＧ Ｆｃの実例である。

【0016】

【図2】図２は、操作されたＶＬＲＢ：ＣＬ－ＶＬＲＢ：ＣＨ１四価ＩｇＧキメラの実例である。

【0017】

【図3A-B】図３Ａは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ重（「Ｈ」）鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＣ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された四価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｂは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ Ｈ鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＮ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された三価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｃおよび３Ｄは、Ｈ／Ｌ鎖対のうちの一方上のＣＬおよびＣＨ１の逆転（「クロスマブ」）ならびに正確なＨ鎖対形成を確実にするための「ノブインホール」を用いた、ＩｇＧ軽鎖のうちの一方のＣ末端（３Ｃ）またはＮ末端（３Ｄ）に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するＶＬＲＢ ＩｇＧを構築するための２つの方法を示す。図３Ｃは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインによるＣＬドメインの置換によって改変されたＩｇＧ Ｌ鎖のうちの一方のＣ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された四価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例であり、相補的なＨ鎖（「ホール」Ｈ鎖）は、ＣＬドメインによるＣＨ１ドメインの置換によって改変されている。ノブインホール法は、正確なＨ鎖対形成を確実にする。図３Ｄは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインによるＣＬドメインの置換によって改変されたＩｇＧ Ｌ鎖のうちの一方のＮ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された三価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例であり、相補的なＨ鎖（「ホール」Ｈ鎖）は、ＣＬドメインによるＣＨ１ドメインの置換によって改変されている。ノブインホール法は、正確なＨ鎖対形成を確実にする。

【図3C-D】図３Ａは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ重（「Ｈ」）鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＣ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された四価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｂは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ Ｈ鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＮ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された三価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｃおよび３Ｄは、Ｈ／Ｌ鎖対のうちの一方上のＣＬおよびＣＨ１の逆転（「クロスマブ」）ならびに正確なＨ鎖対形成を確実にするための「ノブインホール」を用いた、ＩｇＧ軽鎖のうちの一方のＣ末端（３Ｃ）またはＮ末端（３Ｄ）に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するＶＬＲＢ ＩｇＧを構築するための２つの方法を示す。図３Ｃは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインによるＣＬドメインの置換によって改変されたＩｇＧ Ｌ鎖のうちの一方のＣ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された四価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例であり、相補的なＨ鎖（「ホール」Ｈ鎖）は、ＣＬドメインによるＣＨ１ドメインの置換によって改変されている。ノブインホール法は、正確なＨ鎖対形成を確実にする。図３Ｄは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインによるＣＬドメインの置換によって改変されたＩｇＧ Ｌ鎖のうちの一方のＮ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された三価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例であり、相補的なＨ鎖（「ホール」Ｈ鎖）は、ＣＬドメインによるＣＨ１ドメインの置換によって改変されている。ノブインホール法は、正確なＨ鎖対形成を確実にする。

【0018】

【図4】図４は、各ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合されたＶＬＲＢを有する抗ＣＤ３モノクローナル抗体から構成される操作された二価二特異性ＶＬＲＢ－ＩｇＧキメラの実例である。

【0019】

【図5】図５は、ＣＬ－ＶＬＲＢ－抗ＣＤ３二特異性キメラ抗体の実例である。

【0020】

【図6】図６は、２つのＶＬＲＢ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３融合タンパク質および２つのＶＬＲＢ－ＣＬ－ＳｃＦｖ融合タンパク質から形成されたＶＬＲＢ：Ｃｌ－ＶＬＲＢ：ＣＨ四価－ＣＬ：ＳｃＦｖ二価ＩｇＧ構造の実例である。

【0021】

【図7】図７は、それらから形成された二価ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの図式的表示と対になった、ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質のドメイン構造の実例である。

【0022】

【図8】図８は、それらから形成された四価ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１の図式的表示と対になった、ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１の重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）融合タンパク質のドメイン構造の実例である。

【0023】

【図9】図９は、それらから形成された二特異性四価ＶＬＲＢ_４－一価ｓｃＦｖ_１ヒトＩｇＧ１の図式的表示と対になった、単一特異性ＶＬＲＢおよび二特異性ＶＬＲＢ－ｓｃＦｖアームの重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖融合タンパク質のドメイン構造の実例である。この例示的な図では、ＭＭ３ ＶＬＲＢ４－抗ＣＤ３ヒトＩｇＧ１二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（「ＢｉＴｅ」）を形成するために、ＶＬＲＢはＭＭ３であり、ｓｃＦｖは抗ＣＤ３である；「ノブ」および「ホール」突然変異が示される；両方の重（「Ｈ」）鎖が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異を有する。

【0024】

【図10A-B】図１０Ａおよび１０Ｂは各々、１０Ａ）Ｄａｕｄｉ細胞、ＣＤ３８^ｈｉならびに１０Ｂ）ＫＭＳ－１１ ＣＤ３８^－、ＢＪＡＢ ＣＤ３８^ｌｏ、Ｒａｊｉ ＣＤ３８^ｉｎｔおよびＤａｕｄｉ ＣＤ３８^ｈｉへの、ＶＬＲＢ融合タンパク質および対照Ａｂ結合についての例示的なフローサイトメトリーデータを示す一連のプロットである。Ｄ－ＭＭ３およびＴ－ＭＭ３は、それぞれＭＭ３ ＶＬＲＢ_２およびＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質に相当する。

【0025】

【図11】図１１は、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｉＴｅの細胞株結合についての例示的なフローサイトメトリーデータを示す一連のプロットである。

【0026】

【図12】図１２は、抗ヒトＣＤ３抗体比較対象と共に、ＪｕｒｋａｔおよびヒトＰＢＭＣへのＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｉＴｅ結合についての例示的なフローサイトメトリーデータを示す一連のプロットである。Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３細胞は、ＰｒｏｍｅｇａのＴ細胞活性化キットカタログ番号１６２１のものである。

【0027】

【図13】図１３は、細胞株へのＯ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（Ｄ－Ｏ１３）の結合についてのフローサイトメトリーデータを示す一連のプロットおよび対応する棒グラフである。

【0028】

【図14A-C】図１４Ａ～１４Ｃは、ＶＬＲＢ融合タンパク質による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を示す。図１４Ａは、２０％ヒト血清、ならびに０．５μｇのＮ８ならびにＭＭ３（Ｄ－ＭＭ３）ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ ＦｃおよびＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１（Ｔ－ＭＭ３）融合タンパク質、ならびに０．２５μｇダラツムマブを用いたＤａｕｄｉ細胞溶解のＣＤＣアッセイの結果を示すフローサイトメトリープロットである。死細胞は、ＰＩ染色で検出される。図１４Ｂは、ＮＦＡＴ誘導されたルシフェラーゼ発現（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７０１５）によって測定した、Ｊｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８エフェクター細胞によるＤａｕｄｉ細胞活性化のＡＤＣＣアッセイの結果を示すプロットである。Ｔ－ＭＭ３は、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１融合タンパク質に相当し、Ｄａｒａはダラツムマブである。図１４Ｃは、培養培地中へのＬＤＨの放出によって測定した、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａエフェクター細胞によって媒介されるＤａｕｄｉ細胞溶解のＡＤＣＣアッセイの結果を示すプロットである。エフェクター細胞の標的細胞に対する比は、５：１であった。このアッセイは、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が実施した。抗ヒトＣＤ２０ Ａｂリツキシマブは、陽性対照（青色の線およびデータポイント）であり、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃは、試験試料（緑色の線およびデータポイント）であった。

【0029】

【図15A】図１５Ａは、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１融合タンパク質によるＣＤＣ活性化を示す一連のフローサイトメトリープロットである。図１５Ｂは、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１融合タンパク質によるＡＤＣＣ活性化を示す折れ線グラフである。

【図15B】図１５Ａは、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１融合タンパク質によるＣＤＣ活性化を示す一連のフローサイトメトリープロットである。図１５Ｂは、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１融合タンパク質によるＡＤＣＣ活性化を示す折れ線グラフである。

【0030】

【図16】図１６は、Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３ ＮＦＡＴ Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号１６２１）の活性化を示す折れ線グラフである。標的細胞株および活性化剤は、示される通りである。

【0031】

【図17A-B】図１７Ａ～１７Ｄは、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｉＴｅ（図中ではＭＭ３／抗ＣＤ３）によるヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞の活性化を示す折れ線グラフである。標的細胞は、示される通りである。

【図17C-D】図１７Ａ～１７Ｄは、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｉＴｅ（図中ではＭＭ３／抗ＣＤ３）によるヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞の活性化を示す折れ線グラフである。標的細胞は、示される通りである。

【0032】

【図18】図１８は、ヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞細胞傷害性の活性化を示す棒グラフである。％細胞傷害性＝１００×（試料－ＰＢＭＣ自発－Ｄａｕｄｉ自発）／（Ｄａｕｄｉ最大－Ｄａｕｄｉ自発）であって、式中、試料＝ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅ＋ＰＢＭＣ＋Ｄａｕｄｉ細胞、ＰＢＭＣ自発＝ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅ＋ＰＢＭＣ、Ｄａｕｄｉ自発＝ＰＢＭＣ＋ＤａｕｄｉおよびＤａｕｄｉ最大＝溶解されたＤａｕｄｉである。

【発明を実施するための形態】

【0033】

発明の詳細な説明
Ｉ． 定義
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、他の抗原には有意に結合しないままでの、そのコグネート抗原への抗体の結合を指す。好ましくは、抗体は、その第２の分子と、約１０^５ｍｏｌ^－１よりも大きい（例えば、１０^６ｍｏｌ^－１、１０^７ｍｏｌ^－１、１０^８ｍｏｌ^－１、１０^９ｍｏｌ^－１、１０^１０ｍｏｌ^－１、１０^１１ｍｏｌ^－１および１０^１２ｍｏｌ^－１またはそれよりも大きい）親和性定数（Ｋａ）で、抗原に「特異的に結合する」。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」または「新生物」は、新生物性細胞を含有する組織の異常な塊を指す。新生物および腫瘍は、良性、前悪性または悪性であり得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、用語「がん」または「悪性新生物」は、制御されない成長、隣接する組織への浸潤、およびしばしば身体の他の場所への転移を示す細胞を指す。

【0036】

本明細書で使用される場合、用語「抗新生物性」は、がんの成長、浸潤および／または転移を阻害または予防することができる組成物、例えば、薬物または生物製剤を指す。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」は、投与または処置の標的である任意の個体を指すために、相互交換可能に使用される。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは獣医患者であり得る。

【0038】

本明細書で使用される場合、用語「治療（的に）有効（な）」は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を軽快させるのに十分な量であることを意味する。かかる軽快は、低減または変更だけを要求し、排除は必ずしも要求しない。がんを処置するための組成物の治療有効量は、好ましくは、腫瘍退縮を引き起こすのに、または放射線もしくは化学療法に対して腫瘍を感作させるのに十分な量である。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生物学的にも他の点でも望ましくないことのない材料を指す、即ち、材料は、いずれの望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、それが含有される医薬組成物の他の構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなしに、対象に投与され得る。担体は、必然的に、当業者に周知のように、活性成分のいずれの分解をも最小化するため、および対象におけるいずれの有害な副作用をも最小化するために、選択される。

【0040】

本明細書で使用される場合、用語「処置」は、疾患、病的状態または障害を治癒、軽快、安定化または予防することを意図した、患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的処置、即ち、疾患、病的状態または障害の改善に向けて特に指向された処置を含み、原因処置、即ち、関連疾患、病的状態または障害の原因の除去に向けて指向された処置もまた含む。さらに、この用語は、対症的処置、即ち、疾患、病的状態または障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計された処置；予防的処置、即ち、関連疾患、病的状態または障害の発症を最小化するまたは部分的もしくは完全に阻害するために指向された処置；および支持処置、即ち、関連疾患、病的状態または障害の改善に向けて指向された別の特定の治療を補完するために使用される処置を含む。

【0041】

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、改変（例えば、リン酸化またはグリコシル化）にかかわらず、任意の長さのアミノ酸の鎖を指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「バリアント」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸配列変更を含有する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列変更」は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る。

【0044】

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間で形成されるペプチド結合または他の連結を介した２つまたはそれよりも多くのポリペプチドの接続によって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成要素ポリペプチドの化学的カップリングによって形成され得る、または単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現され得る。単鎖融合タンパク質は、単一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子を単一の核酸配列へとインフレームで接続するための分子生物学における従来の技法を使用し、次いで、融合タンパク質が産生される条件下で適切な宿主細胞において核酸を発現させることによって、調製され得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントがその中に挿入され得る、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドである。本明細書に記載されるベクターは、発現ベクターであり得る。

【0046】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターである。

【0047】

本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。

【0048】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が、目的のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物中に取り込まれることを意味する。

【0049】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「断片」は、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを指す。一般に、断片は、５アミノ酸長またはそれよりも長い。

【0050】

本明細書で使用される場合、「価数」は、１分子当たりの利用可能な結合部位の数を指す。

【0051】

本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「非保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が有意に変更される置換である。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターがその中に導入され得る原核生物および真核生物細胞を指す。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、当該分野で公知のように、配列を比較することによって決定される、２つまたはそれよりも多くのポリペプチド配列間の関連性である。当該分野では、「同一性」は、かかる配列のストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度もまた意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., Eds., M Stockton Press, New York, 1991；ならびにCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない公知の方法によって、容易に計算することができる。

【0055】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最も大きいマッチを生じるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムで成文化される。２つの配列間のパーセント同一性は、Needelman and Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)アルゴリズム（例えば、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）を取り込む分析ソフトウェア（即ち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を使用することによって決定され得る。デフォルトパラメーターが、本開示のポリペプチドについて同一性を決定するために使用される。

【0056】

例として、ポリペプチド配列は、参照配列と同一、即ち、１００％同一であり得る、または参照配列と比較してある特定の整数までのアミノ酸変更を含み得、その結果、％同一性は１００％未満である。かかる変更は、以下から選択される：少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換が含まれる置換、または挿入であって、当該変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置において、あるいは参照配列中のアミノ酸間に個々に、または参照配列内に１つもしくは複数の連続する群のいずれかで散在して、これらの末端位置間の任意の場所において生じ得る。所与の％同一性のためのアミノ酸変更の数は、参照ポリペプチド中のアミノ酸の総数にそれぞれのパーセント同一性の数的パーセント（１００で除算した）を乗算し、次いで、参照ポリペプチド中のアミノ酸の当該総数からその積を減算することによって、決定される。

【0057】

本明細書で使用される場合、「必要に応じた」または「必要に応じて」は、引き続いて記載される事象、状況または材料が、生じても生じなくてもよいまたは存在してもしなくてもよいこと、ならびにその記載が、事象、状況または材料が生じるまたは存在する場合およびそれが生じないまたは存在しない場合を含むことを意味する。

【0058】

範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして、本明細書で表され得る。かかる範囲が表される場合、文脈が他を具体的に示さない限り、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までの範囲もまた、具体的に企図され、開示されたとみなされる。同様に、先行する「約」の使用によって値が近似値として表される場合、文脈が他を具体的に示さない限り、特定の値が、開示されたとみなされるべき別の具体的に企図される実施形態を構成することが理解される。文脈が他を具体的に示さない限り、範囲の各々の終点が、他の終点に関連して、および他の終点から独立しての両方で重要であることがさらに理解される。文脈が他を具体的に示さない限り、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値および値の下位範囲の全てもまた、具体的に企図され、開示されたとみなされるべきことを、理解すべきである。最後に、全ての範囲は、第１の終点を含んで第１の終点から、第２の終点を含んで第２の終点までの、範囲としてのおよび個々の数の収集としての両方の、列挙された範囲を指すことを理解すべきである。後者の場合、個々の数のいずれもが、その範囲が言及する量、値または特色の１つの形態として選択され得ることを理解すべきである。この方法で、範囲は、第１の終点を含んで第１の終点から、第２の終点を含んで第２の終点までの、数または値のセットを記載し、ここから、そのセットの単一のメンバー（即ち、単一の数）が、その範囲が言及する量、値または特色の１つの形態として選択され得る。上記は、特定の場合に、これらの実施形態の一部または全てが明示的に開示されているかどうかにかかわらずに適用される。

【0059】

本明細書で開示される全ての化合物は、本明細書で具体的に開示されることが意図され、本明細書で具体的に開示されたとみなすべきである。さらに、本開示内で同定され得る全てのサブグループは、本明細書で具体的に開示されることが意図され、本明細書で具体的に開示されたとみなすべきである。結果として、任意の化合物、または化合物のサブグループは、使用のために具体的に含まれ得もしくは使用から具体的に排除され得、または化合物のリスト中に具体的に含まれ得もしくはリストから具体的に排除され得ることが、具体的に企図される。

【0060】

開示される組成物ならびに本明細書で開示される方法内で使用される組成物自体を調製するために使用される構成成分が開示される。これらおよび他の材料は、本明細書で開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各種々の個々のおよび集合的な組合せおよび並べ替えの具体的な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、各々が、具体的に企図され本明細書に記載されることが理解される。例えば、特定のポリペプチドが開示および議論され、いくつかのポリペプチドに対してなされ得るいくつかの改変が議論される場合、逆が具体的に示されない限り、可能なポリペプチドおよび改変の各々および全ての組合せおよび並べ替えが、具体的に企図される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスが開示され、組合せ分子の例Ａ－Ｄが開示される場合、各々が個々に列挙されていない場合であっても、各々は、個々におよび集合的に企図され、組合せＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－ＥおよびＣ－Ｆが開示されたとみなされることを意味している。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せもまた開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－ＦおよびＣ－Ｅのサブグループが、開示されたとみなされる。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法におけるステップが含まれるがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実施され得る種々のさらなるステップが存在する場合、これらのさらなるステップの各々は、開示される方法の任意の具体的な実施形態または実施形態の組合せと共に実施され得ることが理解される。

【0061】

ＩＩ． ＶＬＲＢ－Ｉｇキメラ
各々が免疫グロブリン定常ドメイン（複数可）に連結された、少なくとも１つの、好ましくは２つまたはそれよりも多くのＶＬＲＢ抗原結合ドメイン、および必要に応じて１つまたは複数の他の標的部分結合ドメインから構成される２つの重鎖および２つの軽鎖から典型的には構成されるキメラ分子が提供される。キメラＶＬＲＢ－Ｉｇ、ＶＬＲＢ－Ｉｇ、キメラ抗体、または単に抗体として本明細書で言及されるが、これらの構造は、抗体の天然のＹ字型構造を模倣し、抗原結合ドメインの価数を増加させ、特異的な結合を受け得る標的の数を増加させ、免疫エフェクター応答（複数可）を増加させ、またはそれらの組合せを行うように、設計される。設計、製造、および使用の方法の原理は、以下でより詳細に議論される。

【0062】

Ａ． 設計戦略
唯一の現生無顎脊椎動物であるヤツメウナギおよびヌタウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ）では、可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）が、外来抗原の認識において主要な役割を果たしている。有顎脊椎動物における免疫グロブリンの可変、多様および連結（ｖａｒｉａｂｌｅ，ｄｉｖｅｒｓｅ，ａｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子セグメント（ＶＤＪ）とは対照的に、無顎脊椎動物は、多様なロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モジュールの、不完全なｖｌｒ遺伝子への体細胞ＤＮＡ再編成によって、受容体多様性の問題を解決している。得られた成熟ｖｌｒ遺伝子は、Ｎ末端ＬＲＲキャッピング領域（ＬＲＲＮＴ）、第１のＬＲＲ（ＬＲＲ１）、最大で７つの２４残基可変ＬＲＲ（ＬＲＲＶ）、末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）または末端（ｅｎｄ）ＬＲＲＶ（ＬＲＲＶｅ）、連結ペプチド（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＰ）、Ｃ末端ＬＲＲキャッピング領域（ＬＲＲＣＴ）、ならびにタンパク質をグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーおよび疎水性テイルに連結して、ＶＲＬＢの細胞表面形態を生じるスレオニン／プロリンリッチストーク領域をコードする（Han, et al., Science, 321(5897):1834-7 (2008)）。ＶＬＲＡおよびＶＬＲＣは、固有の１回膜貫通タンパク質であり、分泌されない。分泌型のＶＬＲＢは、ＧＰＩ連結を欠如し、ダイマー構造のペンタマー、即ち、１分子当たり１０個のＶＬＲＢ結合ドメインを形成する（Herrin, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(6):2040-5. Epub 2008/02/02. doi: 10.1073/pnas.0711619105. PubMed PMID: 18238899; PMCID: PMC2542867.）。

【0063】

可変リンパ球受容体（ＶＬＲＢ）の抗原結合ドメインは、可変数の高度に多様なタンデムに連結されたロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインから構成される。これらは、典型的には２７～３９アミノ酸長、最も典型的には、３２または３９アミノ酸長のアミノ末端ＬＲＲドメイン（ＬＲＲＮＴ）、第１の１８アミノ酸残基のＬＲＲ（ＬＲＲ１）、その後ろの、可変数（なしから８までであるが、３よりも大きいことはめったにない）の、各々典型的には２４または２３アミノ酸残基のＬＲＲドメイン（ＬＲＲＶ１、ＬＲＲＶ２など）、および典型的には１３アミノ酸残基の短い連結ペプチド（ＣＰ）を介して、ＬＲＲ１およびＬＲＲＶドメインとは異なり、高度に可変性の長さ、４８～６３アミノ酸残基のカルボキシ末端ＬＲＲドメイン（ＬＲＲＣＴ）に連結された、これもまた２４アミノ酸長の末端ＬＲＲＶ（ＬＲＲＶｅ）で、図１Ａに示されるように整列される（Herrin and Cooper, J Immunol. 185(3):1367-74 (2010). Epub 2010/07/28. doi: 10.4049/jimmunol.0903128. PubMed PMID: 20660361）。ＶＬＲが、手のひら（ｐａｌｍ）の一方の末端に「親指（ｔｈｕｍｂ）様」キャップを形成するＬＲＲＣＴドメイン中の可変的に存在するループと共に、三日月型の「手のひら様」タンパク質構造を形成するように、ＬＲＲＣＴを除く全てのＶＬＲ ＬＲＲドメインが、カノニカルベータ鎖－ターン－アルファヘリックスＬＲＲドメイン３次元構造を採用する（図１Ｂ）。ＶＬＲ：抗原複合体のＸ線結晶構造は、各ＬＲＲドメインのβ鎖によって形成される連続したβシート表面である、ＶＬＲの凹表面への限局化された抗原結合を有する（Han, et al., Science, 321(5897):1834-7 (2008). Epub 2008/09/27. doi: 10.1126/science.1162484、Collins, et al., Structure, 25(11):1667-78 e4 (2017). Epub 2017/10/11. doi: 10.1016/j.str.2017.09.003、Gunn, et al., J Mol Biol., 430(9):1350-67 (2018). Epub 2018/03/30. doi: 10.1016/j.jmb.2018.03.016.、Kirchdoerfer, et al., Structure, 20:479-486 (2012). [PubMed: 22405006]、Collins, et al., Acta Cryst., 682 - 687 (2017)、Luo, et al., J Biol Chem. 288(32):23597-606 (2013). Epub 2013/06/21. doi: 10.1074/jbc.M113.480467、Velikovsky, Nature Struct. Mol. Biol. 16, 725-730 (2009)）。各ＬＲＲドメイン内の同定されたアミノ酸位置は、ＶＬＲ凹表面上で溶媒に曝露され、結合した抗原との接触を形成する潜在力を有する（図１Ｂ）。

【0064】

しかし、Ｉｇ抗体とは異なり、ＶＬＲＢ抗体は、腫瘍およびウイルス感染細胞を殺滅するためまたは病原体を中和するために必要な生物学的エフェクター機能、例えば、補体活性化、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を動員／活性化する固有の能力を有さず、Ｉｇリサイクリングおよび延長された血中半減期を担うＦｃＲｎが含まれる細胞性Ｆｃ受容体と相互作用しない。

【0065】

天然に存在する抗体分子の基本構造は、非共有結合的相互作用および鎖間ジスルフィド結合によって一緒に保持される、２つの同一な重鎖および２つの同一な軽鎖からなるＹ字型テトラマー性四次構造である。例えば、図１Ｃを参照されたい。

【0066】

哺乳動物種では、５つの型の重鎖：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューが存在し、これが、免疫グロブリンのクラス（アイソタイプ）：それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを決定する。重鎖Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）の後ろには、重鎖ガンマ、アルファおよびデルタでは、３つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と番号付けされる）を含有する定常領域が続くが、重鎖ミューおよびイプシロンの定常領域は、４つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４と番号付けされる）から構成される。ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＤのＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、異なるクラス間で長さが異なり、ＩｇＡおよびＩｇＧの場合には、異なるサブタイプ間で長さが異なる柔軟性のあるヒンジによって分離される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４は、１５、１２、６２（または７７）および１２アミノ酸のヒンジをそれぞれ有し、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２は、２０および７アミノ酸のヒンジをそれぞれ有する。

【0067】

２つの型の軽鎖：ラムダおよびカッパが存在し、これらは、重鎖アイソタイプのいずれかと会合することができるが、所与の抗体分子では、両方とも同じ型のものである。両方の軽鎖は、機能的に同一なようである。それらのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）の後には、ＣＬと呼ばれる単一のドメインからなる定常領域が続く。

【0068】

重鎖および軽鎖は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間でのタンパク質／タンパク質相互作用によって対形成し、２つの重鎖は、それらのＣＨ３ドメイン間でのタンパク質／タンパク質相互作用によって会合する。免疫グロブリン分子の構造は、一般に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間およびヒンジ間での鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。

【0069】

治療的抗体の臨床的有効性は、免疫グロブリン分子の異なる部分にそれぞれ関連する、それらの抗原結合機能およびそれらのエフェクター機能の両方に依存する。抗原結合領域は、Ｙ字型構造のアームに対応し、これらのアームは各々、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと対形成した完全な軽鎖からなり、Ｆａｂ断片（抗原結合断片の代わり）と呼ばれる。Ｆａｂ断片は、鎖間ジスルフィド結合のアミノ末端側でヒンジ領域において抗体分子を切断して２つの同一な抗原結合アームを放出するパパイン消化によって、ネイティブ免疫グロブリン分子から最初に生成された。他のプロテアーゼ、例えば、ペプシンもまた、鎖間ジスルフィド結合のカルボキシ末端側でではあるが、ヒンジ領域において抗体分子を切断して、２つの同一なＦａｂ断片からなり、ジスルフィド結合を介して連結されたままである断片を放出する；Ｆ（ａｂ’）２断片中のジスルフィド結合の還元は、Ｆａｂ’断片を生成する。

【0070】

ＶＨドメインおよびＶＬドメインに対応する抗原結合領域の一部は、Ｆｖ断片（可変断片の代わり）と呼ばれる；これは、抗原結合部位（パラトープとも呼ばれる）を形成するＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。抗体をそのゴールに特に指向させることに加えて、その標的抗原への結合の際に、抗原結合領域は、標的化された抗原および抗体によって認識される当該抗原上のエピトープの両方に依存して、陽性または陰性であり得る種々の生物学的シグナルを誘導し得る。がん治療の分野での使用のために、細胞分裂停止または腫瘍細胞の死を生じる成長阻害性またはアポトーシス促進性シグナルを送達する抗体が一般に好まれる（Verma et al., J Immunol, 186, 3265-76; 2011）。

【0071】

抗体のエフェクター機能は、エフェクター分子、例えば、補体タンパク質への、または免疫細胞、例えば、マクロファージもしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上のＦｃ受容体へのその結合から生じる。これは、標的化された抗原のファゴサイトーシスまたは溶解をもたらす異なる効果、例えば、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる。エフェクター分子または細胞へのその結合を担う抗体のエフェクター領域は、Ｙ字型構造のステムに対応し、重鎖の対形成したＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（または抗体のクラスに依存して、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン）を含有し、Ｆｃ（結晶化可能断片の代わり）領域と呼ばれる。

【0072】

Ｆｃ領域によって媒介されるＡＤＣＣ、ＡＤＰおよびＣＤＣは、ｍＡｂの治療活性において主要な役割を果たす。ＡＤＣＣ機構が中心であると思われるが、それは、Ｆｃガンマ受容体について遺伝的に欠損したヌードマウスにおいて、２つの主要な臨床的に首尾よいｍＡｂである抗ＨＥＲ２および抗ＣＤ２０の、ヒト腫瘍異種移植片に対する治療作用が、ほぼ完全に無効にされたことが実証されているからである（Clynes et al., Nat Med, 6, 443-6, 2000）。ＡＤＰ機構もまた、ヒト腫瘍のいくつかのマウスモデルにおいて中心的に重要であることが示されており（Uchida et al., J. Exp. Med. 199: 1659-69, 2004）、ＣＤＣもまた、抗ＣＤ２０のｉｎ ｖｉｖｏでの治療活性において基本的な役割を果たすことが実証されている（Di Gaetano et al., J Immunol, 171, 1581-7, 2003）。

【0073】

これらの能力をＶＬＲＢ抗体に付与するための戦略が提供される。戦略は、典型的には、その抗原結合性断片、および必要に応じて１つまたは複数の他の細胞標的化または結合部分を、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインまたはそれらの組合せを有する分子に融合または連結して、ＶＬＲＢ－Ｉｇキメラを形成することを含む。好ましい実施形態では、キメラは、他のＩｇ定常ドメイン、例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ領域、またはそれらの組合せもまた含み、必要に応じて、Ｉｇの１つまたは複数の可変領域をさらに含み得る。好ましい実施形態では、分子は、抗体と類似したダイマー性Ｙ字型構造を取る。

【0074】

キメラＶＬＲＢ－Ｉｇ、キメラを構築するために使用され得る融合タンパク質、ならびに本明細書で使用され得る例示的なＶＬＲＢおよびＩｇ配列の構造は、以下でより詳細に議論される。

【0075】

Ｂ． ＶＬＲＢ－Ｉｇキメラ融合タンパク質
開示されるＶＬＲＢ－Ｉｇキメラは、ＶＬＲＢ抗体およびＩｇ抗体の要素を組み合わせる融合タンパク質を使用してアセンブルされ得る。

【0076】

重鎖融合タンパク質設計には、Ｎ末端からＣ末端に、表１に概略された構築物が含まれるがこれらに限定されない：

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0077】

軽鎖融合タンパク質設計には、Ｎ末端からＣ末端に、表２に概略された構築物が含まれるがこれらに限定されない：

【表2】

【0078】

開示される融合タンパク質では、「ＶＬＲＢ」は、抗原に結合することができるＶＬＲＢ抗体のセグメント、断片またはバリアントを含むドメインを指す。したがって、典型的には、ＶＬＲＢドメインは、ＶＬＲＢの抗原結合ドメイン（例えば、図１Ａならびに本明細書および当該分野の他の場所での記載を参照されたい）、または親ＶＬＲＢ抗原結合ドメインに対して例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するその抗原結合性バリアントを少なくとも含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のＶＬＲＢドメインは、ＶＬＲＢ抗体全体、または親ＶＬＲＢ抗体に対して例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するその抗原結合性バリアントである。

【0079】

開示される融合タンパク質では、「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」および「ＣＨ４」は、哺乳動物ＩｇのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびにそれらのバリアントを指す。一部の実施形態では、ドメイン（複数可）および／またはそのバリアントは、哺乳動物Ｉｇの定常領域の１つまたは複数の免疫学的機能を維持する。好ましい保持される機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＰおよび／またはＣＤＣが含まれるがこれらに限定されない。Ｉｇは、その全てのサブクラスを含む、それぞれ任意のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり得る。

【0080】

開示される融合タンパク質では、「ヒンジ」は、Ｉｇヒンジ領域もしくはドメイン、または別の柔軟性のあるリンカー、例えば、以下で議論されるものを指す。ヒンジの配列／長さは、Ｉｇの異なるクラスおよびサブクラス間で異なる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４は、１５、１２、６２（または７７）および１２アミノ酸のヒンジをそれぞれ有し、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２は、２０および７アミノ酸のヒンジをそれぞれ有する。定常ドメインの各々は、適切な型の入手可能なＩｇ定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ヒンジなど）の全てから、独立して選択され得る。したがって、定常ドメインのアイソタイプ混合が企図される。しかし、好ましい実施形態では、全ての定常ドメインが、同じアイソタイプ由来である。

【0081】

開示される融合タンパク質では、「ＶＨ」および「ＶＬ」は、親ＶＨまたはＶＬドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも高い配列同一性を典型的には有する、抗体またはその抗原結合性断片のそれぞれ重鎖および軽鎖の可変領域を指す。集合的にＦｖ断片（可変断片の代わり）と呼ばれ、これらのドメインは、Ｉｇの抗原結合部位を各々が形成する３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。好ましくは、融合タンパク質の「ＶＨ」および／または「ＶＬ」ドメインは、その親ＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲ配列の３つ全て、またはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するそのバリアント配列（複数可）を含有する。

【0082】

開示される融合タンパク質では、「ＳｃＦｖ」は、柔軟性のあるペプチドリンカーによって一緒に接続された、先行する段落で定義された重鎖の可変領域（「ＶＨ」）および軽鎖の可変領域（「ＶＬ」）を含む融合タンパク質、またはその抗体結合性断片を指す。ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向であり得るが、ｓｃＦｖに適切な様式でアセンブルされて、抗原結合のための所望の構造を形成する（即ち、単一のポリペプチド鎖のＶ_ＨおよびＶ_Ｌが互いに会合してＦｖを形成するように）。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、親抗体に由来し得る、または化学的にもしくは組換え的に合成され得る。「ＳｃＦｖ」は、本明細書で使用される場合、一価単鎖可変断片（即ち、モノ－ｓｃＦｖ）だけでなく、多価単鎖可変断片、例えば、ジ－ｓｃＦｖ、トリ－ｓｃＦｖなどもまた指し、各々、単独でおよび組み合わせて具体的に開示される。ジ－ｓｃＦｖおよびトリ－ｓｃＦｖは、単一特異性、二特異性、三特異性などであり得、各々、単独でおよび組み合わせて具体的に開示される。

【0083】

開示される融合タンパク質では、「ＶＨＨ」は、ナノボディを指す。ナノボディは、アルパカ重鎖ＩｇＧ抗体（ＨＣＡｂ）に由来する、小さい組換え的に産生された抗原結合性ＶＨＨ断片である。

【0084】

開示される融合タンパク質では、「Ｒ」および「Ｌ」は、非抗体標的化部分またはドメイン、例えば、受容体（「Ｒ」）またはリガンド（「Ｌ」）を指す。したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体の抗原結合ドメインの代わりに、ポリペプチド受容体またはポリペプチドリガンドを含む。抗原結合ドメインと同様、Ｒ／Ｌドメインは、キメラ抗体を、例えば、免疫細胞上、例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞上、腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造上で特異的に発現される、または正常組織と比較して腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造上で過剰発現される細胞表面リガンドまたは受容体に標的化および／または連結することができる。

【0085】

開示される融合タンパク質では、「－」は、キメラ融合タンパク質のドメイン間の連結を指し、必要に応じたリンカードメインもまた示し得る。典型的には、ドメインは、隣接するドメイン間で直接的に、または介在する柔軟性のあるリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合（複数可）によって連結されるが、連結の一部または全てについては化学的連結もまた企図される。

【0086】

開示される融合タンパク質では、「／」は、表３に関して以下でより詳細にこれも議論されるように、選択肢を示す。例えば、ＳｃＦｖ／ＶＨＨ／Ｒ／Ｌは、ドメインが、本明細書で定義される「ＳｃＦｖ」ドメインまたは「Ｒ」ドメインまたは「Ｌ」ドメインであり得ることを示す。

【0087】

上記ドメインの各々、およびそれらの例は、以下でより詳細に議論される。

【0088】

Ｃ． キメラＶＬＲＢ－Ｉｇ構造
開示される融合タンパク質は、典型的には、部分的または完全抗体の全体構造と似たダイマーまたはテトラマーをアセンブルするために使用される。開示されるキメラ抗体は、１つまたは複数のＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含有し、したがって、多くは、１つまたは複数の抗体可変ドメイン、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒ、Ｌなどを含む。

【0089】

一部の実施形態では、キメラ抗体は、軽鎖の非存在下で、１つの、好ましくは２つの重鎖を含む。かかる抗体は、典型的には、モノマーとしての、またはヘテロダイマーとしてもしくはより好ましくはホモダイマーとして好ましい、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３／ＣＨ４構造を含む。かかる構造は、本明細書でＩｇＧ Ｆｃとも呼ばれる（例えば、図１Ｄを参照されたい）。好ましくは、キメラ抗体は、少なくとも１つの、好ましくは２つの重鎖と、１つの、好ましくは２つの軽鎖とを含むが、より高次の構造もまた形成し得る。

【0090】

好ましい実施形態では、キメラ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される伝統的な抗体構造を形成する。天然に存在する抗体と同様、２つの重鎖間および重鎖および軽鎖の対間で形成されるジスルフィド結合は、鎖をテトラメーター（tetrameter）へと連結することができる。

【0091】

典型的には、重鎖および軽鎖（複数可）のＮ末端は、１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＬＲＢ抗原結合ドメイン、抗体可変ドメイン、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒ、Ｌなど）を示す。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖（複数可）のＣ末端は、あるいはまたはさらに、抗原結合ドメイン（例えば、ＶＬＲＢ抗原結合ドメイン、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒ、Ｌなど）を示す。

【0092】

種々のホモダイマー性およびヘテロダイマー性構築が想定される。例えば、一部の実施形態では、得られたテトラマーは、一緒になってＹ字様形状を形成する、２つの同一な半分を有する。フォークの各末端は、同一な抗原結合部位を含有する。

【0093】

他の実施形態では、半分は、同一ではない。したがって、同一なおよび非同一な重鎖および軽鎖の種々の組合せが提供される。ＶＬＲＢ抗原結合ドメインは、可変ドメインおよび／またはＳｃＦｖおよび／またはＶＨＨおよび／またはＲおよび／またはＬと組み合わされ得る。さらに、２つまたはそれよりも多くのクラスの抗原結合ドメインまたは他の標的化部分（例えば、ＶＬＲＢ、抗体可変ドメイン、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒおよび／またはＬ）が存在する場合、各ドメインは、同じまたは異なり得る。この方法で、キメラ抗体は、同じ抗原に対して多価および／または異なる抗原もしくは他の標的に対して多価であり得る。したがって、キメラ抗体は、調節可能な価数を有して、単一特異性、二特異性または多特異性であり得る。

【0094】

ヘテロダイマー化技術が、所望の構成成分および所望の場所のアセンブリを駆動するために取り込まれ得る。例えば、一部の実施形態では、重鎖および必要に応じて軽鎖（複数可）は、「ノブイントゥホール」技術を特色とし、それにより、相補的な突然変異が、重鎖のドメイン（例えば、ＣＨ３鎖ドメイン）および／または軽鎖／重鎖対のドメイン（例えば、ＣＬおよびＣＨ１ドメイン）のうちの１つまたは複数においてなされる（例えば、Merchant, et al. "An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol. 1998;16:677-81. doi: 10.1038/nbt0798-677を参照されたい）。これらの非共有結合的相互作用は、ヒンジ領域中のジスルフィド架橋と共に、同じまたは異なる軽鎖を有する抗体のヘテロダイマー形成に向けて、アセンブリを駆動する（Spiess, et al., "Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies." Nat Biotechnol. 2013;31:753-8. doi: 10.1038/nbt.2621.）。その各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Shatz, "Knobs-into-holes antibody production in mammalian cell lines reveals that asymmetric afucosylation is sufficient for full antibody-dependent cellular cytotoxicity," MAbs. 2013 Nov 1; 5(6): 872-881. doi: 10.4161/mabs.26307；Rouet, et al., "Stability engineering of the human antibody repertoire", FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):269-77. doi: 10.1016/j.febslet.2013.11.029. Epub 2013 Nov 28；およびRouet and Christ, "Bispecific antibodies with native chain structure." Nat Biotechnol 32, 136-137 (2014). doi.org/10.1038/nbt.2812もまた参照されたい。

【0095】

一部の実施形態では、抗体は、「クロスマブ」である。重鎖のヘテロダイマー化を容易にするノブイントゥホール技術に基づくと、軽鎖とそれらのコグネート重鎖との正確な会合は、二特異性（または多特異性）抗体の一方の半分の抗原結合性断片（Ｆａｂ）内での重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの交換によって達成される。この「クロスオーバー」は、抗原結合ドメインを保持するが、２つのアームを、軽鎖誤対形成がもはや生じることができないように異なるものにする。例えば、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Schaefer, et al., "Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies", PNAS, 108(27):11187 - 11192 (2011), pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1019002108、特にＣＨ１－ＣＬクロスマブを参照されたい。

【0096】

例えば、一部の実施形態では、抗体は、表１の２つの重鎖および表２の２つの軽鎖から形成され、抗体は、少なくとも１つのＶＲＬＢドメインを含む。以下の表３は、標的化部分ドメインのための８つの場所と共に、非限定的な例示的な抗体属構造を提供する。

【0097】

【表3】

【0098】

より具体的には、構造３ａ、３ｂおよび３ｃは、ＣＬドメインのＮ末端およびＣ末端、ＣＨ１ドメインのＮ末端、ならびにＣＨ３またはＣＨ４ドメインのＣ末端を、ローマ数字ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉおよびｖｉｉｉによって示される結合／標的化部分のための融合点として示す。結合／標的化部分（即ち、各ローマ数字）は、上で議論した、ＶＬＲＢ、ＶＨ、ＶＬ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＲまたはＬであり得る。これらのドメインの各々は、上記標的化部分ドメインのいずれかによって占有されないまたは占有されることができるが、全ての可能な組合せで、少なくとも１つのＶＬＲＢが存在することを条件とする。

【0099】

表３の構造によって包含される全ての亜属および各かかる具体的な構造は、具体的に開示される。２つまたはそれよりも多くの同じドメインが存在する場合、それは、同じまたは異なる抗原または結合パートナーを標的化し得る。実例として、ローマ数字ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉおよびｖｉｉｉの全てがＶＬＲＢによって占有される構造において、各ＶＬＲＢは、任意の所望の場所において、たった１つのＶＬＲＢが８回存在する、もしくは８つもの多くのＶＬＲＢが各々１回存在する、またはそれらの任意の下位組合せであるなど、同じまたは他とは異なり得る。アラビア数字は、異なるＶＬＲＢを示すために使用され得る。例えば、８つの異なるＶＬＲＢが存在する場合、これらは、ＶＬＲＢ１、ＶＬＲＢ２、ＶＬＲＢ３、ＶＬＲＢ４、ＶＬＲＢ５、ＶＬＲＢ６、ＶＬＲＢ７またはＶＬＲＢ８として示され得る。同様に、同じＶＬＲＢが８回使用される場合、８つ全てのＶＬＲＢが、ＶＬＲＢ１として示され得る。

【0100】

各々が同じまたは異なる標的に対して指向される、ＶＬＲＢ、ＶＨ、ＶＬ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒおよび／またはＬとのより高次の組合せもまた、同じ方法で扱われ、異なる結合標的を示すためのアラビア数字をこれもまた使用して、任意の所望の位置において同じまたは異なるＶＨ、ＶＬ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒおよび／またはＬを有する属構造に由来する亜属および種構造において同様に標識され得るが、少なくとも１つのＶＬＲＢが存在することを条件とする。位置は、占有されないままの場合もある。典型的には、ＶＬが存在する場合、それは、ＣＬのＮ末端に融合され、ＣＨ１のＮ末端に融合した対形成されたＶＨに隣接する。

【0101】

別のアノテーションされた位置では、「ＣＨ３／ＣＨ３－ＣＨ４」は、ＣＨ３またはＣＨ３－ＣＨ４のいずれかが、言及された位置において独立して選択され得ることを意味する。

【0102】

ＶＬＲＢ、ＶＬ、ＶＨ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、Ｒ、Ｌ、ＣＨＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４が含まれるがこれらに限定されない他の用語は、融合タンパク質に関して上で議論したように定義される。

【0103】

構造３ｂおよび３ｃは、軽鎖および重鎖対の特異的な所望のダイマー化を駆動するための例示的な「クロスマブ」設計を提供する。

【0104】

表４は、示されるように図中にも示される、表３の属の非限定的な例示的な種を提供する。

【0105】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0106】

Ｄ． 例示的なドメイン
１． ＶＬＲＢ配列
ＶＬＲＢドメインは、ＶＬＲＢ抗体の抗原結合性構成成分を少なくとも含む。例示的なＶＬＲＢ構築および配列は、例えば、各々の全体が参照により具体的に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１６５５８４号、同第２０１２／０１８９６４０号、同第２０１７／００８１３８５号および同第２０１７／０００８９４７号に提供される。

【0107】

ＶＬＲＢの構造は、上で議論され、そこ、ここ、および本明細書の他の場所でのかかる情報は、開示される設計戦略において使用され得る。ＶＬＲＢドメインは、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）（本明細書で内部ＬＲＲと呼ばれる）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および連結ペプチドを含み得、連結ペプチドは、アルファヘリックスを構成する。ポリペプチドの長さは、約１３０もしくは１３７ほどの少ないアミノ酸または約２２５もしくは２８５ほどの多いアミノ酸を有し得る。

【0108】

必要に応じて、連結ペプチドが、ＬＲＲＣＴのＮ末端側に位置する、より具体的には、内部ＬＲＲとＬＲＲＣＴとの間に位置する。連結ペプチドは、内部ＬＲＲおよびＬＲＲＣＴに連結され得る。したがって、一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、ＬＲＲＮＴ、１つまたは複数の内部ＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴを、その順序で含む。一部の実施形態では、ＬＲＲＮＴとＬＲＲＣＴとの間の内部ＬＲＲ領域は、１、２、３、４、５、６、７、８または９つのロイシンリッチリピートを含み、ＬＲＲ１は、ＬＲＲＮＴに隣接して、またはＬＲＲＮＴの近くに位置する。本明細書で使用される場合、ＬＲＲ１、２、３、４、５、６、７、８または９は、ＬＲＲＮＴからＬＬＲＣＴへと連続的に並ぶとみなされる。したがって、開示されるドメインは、ＬＲＲＮＴ、１、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８または１～９つのＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴを、その順序で含み得る。

【0109】

ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）は、タンパク質－タンパク質相互作用に典型的には関与する短い配列モチーフであり、ＬＲＲは、複数のロイシン残基を含む。ＬＲＲは、例えば、２位、５位、７位、１２位、１６位、２１位および２４位において、ロイシンまたは他の脂肪族残基を含有する。しかし、ロイシンまたは他の脂肪族残基は、２位、５位、７位、１２位、１６位、２１位および２４位の残基に加えて、またはその代わりに、他の位置に存在し得ることが理解され、本明細書で企図される。例えば、ロイシンは、２位ではなく３位に存在し得る。構造的に、モチーフは、ベータ－シート構造を形成することも理解される。したがって、例えば、開示されるＶＬＲＢドメインは、ＬＲＲＮＴ、５つのＬＲＲ、ＬＲＲＣＴおよび連結ペプチドを含み得、７つのベータ－シート構造、および連結ペプチドのアルファヘリックスを含み得る。

【0110】

各ＬＲＲの長さおよび配列は、ドメイン中の他のＬＲＲから、ならびにＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴから変動し得ることが理解される。例えば、一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、ＬＲＲＮＴ、１～９つのＬＲＲ、連結ペプチドおよびＬＲＲＣＴを含み、第１の内部ＬＲＲはＬＲＲ１であり、ＬＲＲ１は、約２０アミノ酸未満、例えば、約１８アミノ酸を含む。必要に応じて、ドメインは、ＬＲＲ２～９をさらに含み、ＬＲＲ２～９は、各々約２５アミノ酸未満である。一部の実施形態では、ＬＲＲ２～９は、各々約２４アミノ酸を含む。ＬＲＲ１～９は、長さおよび特定のアミノ酸配列の両方が、所与のドメインにおいて互いに同じまたは異なり得る。

【0111】

ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴで示される末端ＬＲＲは、典型的には、各内部ＬＲＲよりも長い。ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴは、不変の領域（類似の可変リンパ球受容体と比較して、ポリペプチドの残部に関連してほとんどバリエーションを有さない領域）を含む。可変領域は、受容体に特異性を提供するが、不変の領域および受容体にわたる全般的な構造的類似性は、防御免疫機能を維持することを助ける。ドメインは、ＬＲＲＮＴを含み得、ＬＲＲＮＴは、約４０アミノ酸未満を含む。したがって、ＬＲＲＮＴは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の存在下または非存在下で、アミノ酸配列ＣＰＳＱＣＳＣ（配列番号１）、ＣＰＳＲＣＳＣ（配列番号２）、ＣＰＡＱＣＳＣ（配列番号３）、ＣＰＳＱＣＬＣ（配列番号４）、ＣＰＳＱＣＰＣ（配列番号５）、ＮＧＡＴＣＫＫ（配列番号６）、またはＮＥＡＬＣＫＫ（配列番号７）を必要に応じて含む。ドメインは、ＬＲＲＣＴを含み得、ＬＲＲＣＴは、約６０アミノ酸未満、必要に応じて、４０～６０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ＬＲＲＣＴは、配列ＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮ－（Ｐ／Ｌ）－Ｘ－（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）－ＧＧＶＤＮＶＫ（配列番号８）またはＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮ－（Ｐ／Ｌ）－ＸＸ－（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）－ＧＧＶＤＮＶＫ（配列番号９）を含み、式中、（Ｐ／Ｌ）は、その位置におけるＰまたはＬのいずれかを意味し、Ｘは、任意のアミノ酸を意味し、（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）は、その位置におけるＳ、Ｙ、ＮまたはＨのいずれかを意味する。特に、ＬＲＲＣＴが、保存的アミノ酸置換の存在下または非存在下で、アミノ酸配列ＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰ（配列番号１０）、ＳＧＫＰＶＲＳＩＩＣＰ（配列番号１１）、ＳＳＫＡＶＬＤＶＴＥＥＥＡＡＥＤＣＶ（配列番号１２）、またはＱＳＫＡＶＬＥＩＴＥＫＤＡＡＳＤＣＶ（配列番号１３）を含む、ポリペプチドが、具体的に開示される。

【0112】

全てのペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質と同様、ＬＲＲＣＴおよびＬＲＲＮＴのアミノ酸配列中に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の性質または機能を変更しない置換が存在し得ることが理解される。かかる置換には、保存的アミノ酸置換が含まれる。

【0113】

開示される組成物は、連結ペプチドもまた含み得る。典型的には、かかるペプチドは、１５アミノ酸長未満の短いペプチドであり、アルファヘリックスを形成し得る。したがって、例えば、１０、１１、１２、１３、１４および１５アミノ酸長の、アルファヘリックスを形成する連結ペプチドが、具体的に開示される。連結ペプチドは、ポリペプチドの構造的構成成分を連結するように機能することが理解される。ポリペプチドの連結ペプチドは、ＬＲＲＣＴに連結され得ることがさらに理解される。

【0114】

ポリペプチドは、ストーク領域を含み得る。ストーク領域は、典型的には、スレオニン－プロリンリッチ領域を含み、必要に応じて、ＧＰＩアンカーおよび疎水性テイルと共に、ポリペプチドの膜結合形態で存在する。

【0115】

内因性ＶＬＲＢ抗体は、典型的には、ポリペプチドを膜表面上に維持するグリコシル－ホスファチジル－イノシトール（ＧＰＩ）アンカー、および疎水性テイルを含む。

【0116】

開示される融合タンパク質は、典型的には好ましくは可溶性であるので、融合タンパク質およびキメラ抗体構築物のＶＬＲＢドメインは、ストーク、ＧＰＩアンカーおよび疎水性テイルドメインのうちの１つ、２つまたは３つ全てを欠如し得る。一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、ＧＰＩアンカーおよび疎水性テイルを欠如し、ストークドメイン（例えば、７アミノ酸）の一部または全てを含む。かかる部分的ストークドメインは、発現構築物におけるＶＬＲＢドメイン置換を容易にするための制限酵素部位として機能し得る。

【0117】

ＶＬＲＢドメインは、所望の機能を有する。本明細書に記載されるＶＬＲＢドメインのポリペプチドは、抗体が抗原または薬剤に選択的に結合するのと同等に、抗原または薬剤に選択的に結合する。ポリペプチドは、必要に応じて、可変リンパ球受容体（天然に存在するまたは天然に存在しない）またはその断片もしくはバリアントである。用語「可変リンパ球受容体」は、本明細書で広い意味で使用され、用語「抗体」と同様、種々の特異性を有する種々のバージョンを含む。ポリペプチドは、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、または類似の方法によって、それらの所望の活性について試験され得、その後、それらの治療活性、診断活性または他の精製活性が、公知の試験方法に従って試験され得る。

【0118】

ポリペプチドは、細胞外薬剤（例えば、病原体）または抗原に結合することができる。薬剤または抗原には、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質およびタンパク質が含まれ得るがこれらに限定されない。薬剤または抗原は、病原性生物が含まれるがそれらに限定されない種々の供給源に起源し得る。薬剤または抗原への結合は、選択的であることが理解される。「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、他の抗原または薬剤の部分的または完全な排除に至るまで、１つの薬剤または抗原に結合することを意味する。「結合する」は、アッセイ方法の背景の少なくとも約１．５倍の検出可能な結合を意味する。選択的または特異的結合について、かかる検出可能な結合は、所与の抗原または薬剤について検出され得るが、対照抗原または薬剤については検出されない。したがって、例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物抗原または薬剤に選択的に結合するＶＬＲＢポリペプチドが開示される。

【0119】

開示される融合タンパク質およびＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体のＶＬＲＢ抗原結合ドメインとしての使用のために使用または改変され得るポリペプチドの例には、ストーク、ＧＰＩアンカーおよび疎水性テイルドメインありの、または好ましくはなしの、その配列表およびその中で開示される全ての配列が含まれる、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１６５５８４号の配列識別子１～４３、４５～５２、５４、５６、６０～６５、６８～７２、７５、７７～７８、８１～１１９、１２２～１２５、１２９～１３２、１３４～１４４および１４６～１５５の抗原結合ドメインまたは完全配列、ならびにその各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５７７９４１～ＡＹ５７８０５９およびＣＫ９８８４１４～ＣＫ９８８６５２が含まれる。米国特許出願公開第２０１１／０１６５５８４号の配列識別子１～２０のアミノ酸配列を含む配列は、全長ＶＬＲの例を示す。米国特許出願公開第２０１１／０１６５５８４号の配列識別子４３のアミノ酸配列を含む配列は、シグナルペプチドありの全長ＶＬＲの例である。これらの公開された出願の各々はまた、その配列表を含むその全体が参照により組み込まれる。

【0120】

他の特定のＶＬＲ抗原結合ドメインは、以下に由来し得る：
その配列表およびその中で開示される全ての配列が含まれる、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１８９６４０号の配列識別子２０は、血液型決定基Ｈに特異的に結合する抗原特異的ポリペプチドを提供する；
その配列表およびその中で開示される全ての配列が含まれる、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１８９６４０号の配列識別子５、２２、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１は、抗原特異的ポリペプチドを提供し、結合ポリペプチドは、病原体、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞表面ポリペプチド、例えば、ＢｃｌＡに特異的に結合する；

【0121】

一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、ＶＬＲＢ ＭＭ３の抗原結合ドメインを含むまたはそれからなる。

【0122】

例示的なＭＭ３抗原結合ドメインには、以下が含まれる：
ＡＣＰＳＱＣＳＣＰＧＴＤＶＮＣＨＥＲＲＬＡＳＶＰＡＥＩＰＴＴＴＫＩＬＲＬＹＩＮＱＩＴＫＬＥＰＧＶＦＤ ＲＬＴＱＬＴＱＬＧＬＷＤＮＱＬＱＡＬＰＥＧＶＦＤＲＬＶＮＬＱＫＬＹＬＮＱＮＱＬＬＡＬＰＶＧＶＦＤＫＬＴＱＬＴＹＬＤＬＮＮＮＱＬＫＳＩＰＲＧＡＦＤＮＬＫＳＬＴＨＩＷＬＹＧＮＰＷＤＣＥＣＳＤＩＬＹＬＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＶＫＣＳＧＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰＧ（配列番号１４）（これは、その配列表およびその中で開示される全ての配列が含まれる、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子５６のポリペプチド配列である）、もしくは
ＡＣＰＳＱＣＳＣＰＧＴＤＶＮＣＨＥＲＲＬＡＳＶＰＡＥＩＰＴＴＴＫＩＬＲＬＹＩＮＱＩＴＫＬＥＰＧＶＦＤＲＬＴＱＬＴＱＬＧＬＷＤＮＱＬＱＡＬＰＥＧＶＦＤＲＬＶＮＬＱＫＬＹＬＮＱＮＱＬＬＡＬＰＶＧＶＦＤＫＬＴＱＬＴＹＬＤＬＮＮＮＱＬＫＳＩＰＲＧＡＦＤＮＬＫＳＬＴＨＩＷＬＹＧＮＰＷＤＣＥＣＳＤＩＬＹＬＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＶＫＣＳＧＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰＧＹＶＡＴＴＴ（配列番号１５：これは、ＭＭ３抗原結合ドメインとストークの一部とを含む）；
またはそのヒト化抗原結合ドメイン、例えば、
ＣＰＡＡＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＴＥＩＰＴＮＬＰＥＴＩＴＥＩＲＬＥＱＮＴＩＫＶＩＰＰＧＡＦＳＰ ＹＫＫＬＲＩＬＲＬＹＩＮＱＩＳＥＬＡＰＤＡＦＱＧＬＲＳＬＮＱＬＶＬＷＤＮＫＩＴＥＬＰＫＳＬＦＥＧＬＦＳＬＱＬＬＹＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＤＡＦＱＤＬＨＮＬＮＹＬＤＬＮＮＮＫＬＱＴＩＡＫＧＴＦＳＰＬＲＡＩＱＨＩＷＬＹＧＮＰＦＩＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＡＲＣＴＳＰＲＲＬＡＮ（配列番号１６）（これは、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子６４のポリペプチド配列である）
ＣＰＡＡＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＴＥＩＰＴＮＬＰＥＴＩＴＥＩＲＬＥＱＮＴＩＫＶＩＰＰＧＡＦＳＰ ＹＫＫＬＲＩＬＲＬＹＩＮＱＩＳＥＬＡＰＤＡＦＱＧＬＲＳＬＮＱＬＶＬＷＤＮＫＩＴＥＬＰＫＳＬＦＥＧＬＦＳＬＱＬＬＹＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＤＡＦＱＤＬＨＮＬＮＹＬＤＬＮＮＮＫＬＱＴＩＡＫＧＴＦＳＰＬＲＡＩＱＨＩＷＬＹＧＮＰＦＩＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＨＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＡＲＣＴＳＰＲＲＬＡＮ（配列番号１７）（これは、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子７４のポリペプチド配列である）；
ＣＰＡＡＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＴＥＩＰＴＮＬＰＥＴＩＴＥＩＲＬＥＱＮＴＩＫＶＩＰＰＧＡＦＳＰ ＹＫＫＬＲＩＬＲＬＹＩＮＱＩＳＥＬＡＰＤＡＦＱＧＬＲＳＬＮＱＬＶＬＷＤＮＫＩＴＥＬＰＫＳＬＦＥＧＬＦＳＬＱＬＬＹＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＤＡＦＱＤＬＨＮＬＮＹＬＤＬＮＮＮＫＬＱＴＩＡＫＧＴＦＳＰＬＲＡＩＱＨＩＷＬＹＧＮＰＦＩＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＨＴＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＲＣＴＳＰＲＲＬＡＮ（配列番号１８）（これは、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子７５のポリペプチド配列である）；
ＣＰＡＡＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＴＥＩＰＴＮＬＰＥＴＩＴＥＩＲＬＥＱＮＴＩＫＶＩＰＰＧＡＦＳＰ ＹＫＫＬＲＩＬＲＬＹＩＮＱＩＳＥＬＡＰＤＡＦＱＧＬＲＳＬＮＱＬＶＬＷＤＮＫＩＴＥＬＰＫＳＬＦＥＧＬＦＳＬＱＬＬＹＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＤＡＦＱＤＬＨＮＬＮＹＬＤＬＮＮＮＫＬＱＴＩＡＫＧＴＦＳＰＬＲＡＩＱＨＩＷＬＹＧＮＰＦＩＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＨＴＮＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＡＲＣＴＳＰＲＲＬＡＮ（配列番号１９）（これは、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子７６のポリペプチド配列である）；
ＣＰＡＡＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＴＥＩＰＴＮＬＰＥＴＩＴＥＩＲＬＥＱＮＴＩＫＶＩＰＰＧＡＦＳＰ ＹＫＫＬＲＩＬＲＬＹＩＮＱＩＳＥＬＡＰＤＡＦＱＧＬＲＳＬＮＱＬＶＬＷＤＮＫＩＴＥＬＰＫＳＬＦＥＧＬＦＳＬＱＬＬＹＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＤＡＦＱＤＬＨＮＬＮＹＬＤＬＮＮＮＫＬＱＴＩＡＫＧＴＦＳＰＬＲＡＩＱＨＩＷＬＹＧＮＰＦＩＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＨＴＮＰＨＡＳＩＶＮＰＨＰＹＧＧＶＤＮＲＣＴＳＰＲＲＬＡＮ（配列番号２０）（これは、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号の配列識別子７７のポリペプチド配列である）；
あるいは、それに対して例えば８０、８５、９０、９５、９７、９８％のパーセント同一性または類似性を有するそのバリアント。

【0123】

本明細書で教示されるおよびさもなくば当該分野で公知の構造および機能に基づいて、これらの配列は、ポリペプチドの属の例であることが理解される。開示される融合タンパク質およびＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体のＶＬＲＢドメイン（複数可）として使用され得る全長ＶＬＲおよびその断片が開示されることが理解される。

【0124】

ＶＬＲＢ抗体および抗原結合ドメインの他の例は、その各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許出願公開第２０２０／０３０８２４７号、同第２０１９／０２５６５７４号、同第２０１９／０２０２８９７号、同第２０１９／０２０２８８７号、同第２０１７／００８１３８５号、同第２０１７／０００８９４７号、同第２０１６／０３７６３４８号、同第２０１２／０１８９６４０号、同第２０１２／０１０７９２９号および同第２０１１／０１６５５８４号に開示されている。ＶＬＲＢドメインのいずれかは、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２０２８８７号などで議論されるように、ヒト化され得る。したがって、一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、ヒト化ＶＬＲＢ抗原結合ドメインである。

【0125】

選択された抗原特異性を有する抗原特異的タンパク質を作製する方法もまた、当該分野で公知であり、開示される融合タンパク質およびキメラ抗体のＶＬＲ抗原結合ドメインを調製するために使用され得る。これらの方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１８９６４０号に記載され、ヤツメウナギまたはヌタウナギに、１つまたは複数の標的抗原（例えば、標的炭水化物、標的タンパク質、標的病原体、標的糖タンパク質、標的脂質、標的糖脂質、標的腫瘍抗原、標的リガンド、標的受容体、標的細胞、または例えば、２つの炭水化物、１つの炭水化物および１つのタンパク質を含むそれらの任意の組合せなど）を投与するステップ；ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質コードＲＮＡを単離するステップ；単離されたＲＮＡから抗原特異的タンパク質コードｃＤＮＡを増幅するステップ；ｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングするステップ；発現ベクターで形質転換された細菌において発現ベクターを発現させるステップ；ｃＤＮＡクローンを単離するステップ；培養細胞にｃＤＮＡクローンをトランスフェクトするステップ；標的抗原に結合する能力について培養物上清をスクリーニングするステップ、および標的抗原に結合する抗原特異的タンパク質を、上清から単離するステップを含み得る。

【0126】

他の実施形態では、作製する方法は、総ＲＮＡの調製、オリグ（olig）－ｄＴプライマーを用いたｃＤＮＡの調製、次いで、クローニングを容易にするようにベクター配列と相補的な領域もまた含有するＶＬＲＢ遺伝子特異的プライマーを用いたｃＤＮＡの増幅を含み得る。

【0127】

トランスフェクトーマと呼ばれるトランスフェクション／スクリーニングプロセスが使用され得るが、これは、数百のトランスフェクタントがスクリーニングされる低スループットであり、数百万（酵母）または数億（ファージ）がスクリーニングされる酵母ディスプレイおよびファージ／ファージミドディスプレイによって大部分が取って代わられている。ＶＬＲＢファージディスプレイについては、例えば、Hassan, et al., "Generation of lamprey monoclonal antibodies ("Lambribodies") using a phage display system," Biomolecules, 9, 868 (2019); doi:10.3390/biom9120868を参照されたい；酵母ディスプレイについては、Tasumi, et al., "High-affinity lamprey VLRA and VLRB monoclonal antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 12891-12896 (2009)を参照されたい。その各々の全体はこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

【0128】

別の例示的なＶＬＲＢ抗原結合ドメインは、
ＡＣＰＳＱＣＳＣＳＧＴＴＶＮＣＫＳＫＳＬＡＳＶＰＡＧＩＰＴＴＴＲＶＬＹＬＮＤＮＱＩＴＫＬＥＰＧＶＦＤＲＬＶＮＬＱＴＬＷＬＮＮＮＱＬＴＳＬＰＡＧＬＦＤＳＬＴＱＬＴＩＬＡＬＤＳＮＱＬＱＡＬＰＶＧＶＦＧＲＬＶＤＬＱＱＬＹＬＧＳＮＱＬＳＡＬＰＳＡＶＦＤＲＬＶＨＬＫＥＬＬＭＣＣＮＫＬＴＥＬＰＲＧＩＥＲＬＴＨＬＴＨＬＡＬＤＱＮＱＬＫＳＩＰＨＧＡＦＤＲＬＳＳＬＴＨＡＹＬＦＧＮＰＷＤＣＥＣＲＤＩＭＹＬＲＮＷＶＡＤＨＴＳＩＶＭＲＷＤＧＫＡＶＮＤＰＤＳＡＫＣＡＧＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰＧＹＶＡＴＴＴ（配列番号２１、Ｏ１３ ＶＬＲＢ抗原結合ドメイン）である。

【0129】

２． 抗体可変および受容体／リガンドドメイン
それ由来のＶＨ、ＶＬ、ＳｃＦｖおよびＶＨＨ抗原結合ドメインが、開示される融合タンパク質およびＶＬＲＢ抗体において利用され得る、例示的な抗体が提供される。かかる抗体には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ダラツムマブ（ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標））ならびにReichert, Mabs,3(1): 76-99 (2011)で議論されているもの、例えば、ＡＩＮ－４５７、バピネオズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ダロツズマブ、エプラツズマブ、ファーレツズマブ、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（ＷＸ－Ｇ２５０）、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、オビヌツズマブ、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ＲＥＧＮ８８、レスリズマブ、ソラネズマブ、Ｔ１ｈ、テプリズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブおよびザノリムマブ、ならびに以下が含まれるがこれらに限定されない他の場所：非ホジキンリンパ腫を処置するために承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）；Ｇｅｎｍａｂによって現在開発中の抗ＣＤ２０であるＨｕＭａｘ－ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号に記載された抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ－１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）およびＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、表題「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、乳房がんを処置するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（例えば、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって現在開発中であるペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ－２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇｅ）；米国特許第４，７５３，８９４号に記載された抗Ｈｅｒ２抗体；種々のがんについて臨床試験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ ＷＯ ９６／４０２１０）；Ａｂｇｅｎｉｘ－Ｉｍｍｕｎｅｘ－Ａｍｇｅｎによって現在開発中のＡＢＸ－ＥＧＦ（米国特許第６，２３５，８８３号）；Ｇｅｎｍａｂによって現在開発中のＨｕＭａｘ－ＥＧＦｒ（米国特許出願第１０／１７２，３１７号）；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００およびＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号；Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60；Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20；Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83）；１ＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＰＣＴ ＷＯ ９５／２００４５；Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46；Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53；Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35；Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80）；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３（ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎａｄａ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号；Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81）；ｍＡｂ－８０６（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44）；ＫＳＢ－１０２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲＩ－１（ＩＶＡＸ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ ＷＯ ０１６２９３１Ａ２）；ならびにＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ ＷＯ ０１／８８１３８）；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の処置のために現在承認されているヒト化ｍＡｂであるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）；Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ－ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標））、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体であるイブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ－３ Ｆｃ融合物であるアレファセプト（Ａｍｃｖｉｖｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるＨｕｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された完全ヒトＴＮＦ抗体であるゴリムマブ（ＣＮＴＯ－１４８）、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎによって開発されたｐ７５ ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物であるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、Ｒｏｃｈｅによって以前に開発されたｐ５５ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物であるレネルセプト、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＣＤ１４７抗体であるＡＢＸ－ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＩＬ８抗体であるＡＢＸ－ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＭＵＣ１８抗体であるＡＢＸ－ＭＡＩ、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１であるペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｒ１５４９，９０Ｙ－ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１抗体であるＴｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＨｕＢＣ－１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のチオプラチン（Ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）（ＡＳ１４０７）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗アルファ－４－ベータ－１（ＶＬＡ－４）およびアルファ－４－ベータ－７抗体であるＡｎｔｅｇｒｅｎｅ（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗ＶＬＡ－１インテグリン抗体であるＶＬＡ－１ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体であるＬＴＢＲ ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗ＴＧＦ－ベータ２抗体であるＣＡＴ－１５２、Ａｂｂｏｔｔによって開発中の抗ＩＬ－１２ ｐ４０抗体であるＡＢＴ ８７４（Ｊ６９５）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅによって開発中の抗ＴＧＦベータ１抗体であるＣＡＴ－１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗エオタキシン－１（Eotaxinl）抗体であるＣＡＴ－２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．によって開発中のＬｙｎｔｐｈｏＳｔａｔ－Ｂ（登録商標）抗Ｂｌｙｓ抗体、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発中の抗ＴＲＡＩＬ－Ｒ１抗体であるＴＲＡＩＬ－Ｒ１ｍＡｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＶＥＧＦ抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ－ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗組織因子抗体である抗組織因子（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＩｇＥ抗体であるＸｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ（Omalizurnab））、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＸｏｍａによって開発中の抗ＣＤ１１ａ抗体であるＲａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ（Efalizurnab））、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中のＭＬＮ－０２抗体（以前にはＬＤＰ－０２）、Ｇｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘ ＣＤ４、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中の抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ－ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘによって開発中のＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発中の抗ヘパラナーゼＩ抗体であるＨｕＭａｘ－Ｃａｎｃｅｒ、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中のＨｕＭａｘ－Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂによって開発中のＨｕＭａｘ－ＴＡＣ、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ－１３１、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ－１５１（クレノリキシマブ）、ＩＤＦＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ－１１４、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ２３であるＩＤＥＣ－１５２、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗イディオタイプ抗体であるＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＫＤＲ抗体であるＩＭＣ－１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ｆｌｋ－１抗体であるＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＶＥカドヘリン抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体であるＣＥＡ－Ｃｉｄｅ（登録商標）（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗ＣＤ２２抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＡＦＰ－Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＴＬＡ４抗体であるＭＤＸ－０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＤ３０抗体であるＭＤＸ－０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ－０７０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ－０１８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発中の抗Ｈｅｒ２抗体であるＯｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ－Ｉ）、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘｅ－ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ－ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗ＴＮＦα抗体であるＣＮＴＯ １４８、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗サイトカイン抗体であるＣＮＴＯ １２７５、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）（ＣＤ５４）抗体であるＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ－３）抗体であるＭＯＲ２０１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓに

よって開発中の抗ＣＤ３抗体であるＮｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビジリズマブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発中の抗ガンマインターフェロン抗体であるＨｕＺＡＦＯ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発中の抗α５β１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発中の抗ＩＬ－１２、Ｘｏｍａによって開発中の抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体であるＩＮＧ－１、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＮｏｖａｒｔｉｓによって開発中のＸｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）ヒト化抗ＩｇＥ抗体、ならびにＸｏｍａによって開発中の抗ベータ２インテグリン抗体であるＭＬＮ０１。別の実施形態では、治療薬には以下が含まれる：ＫＲＮ３３０（Ｋｉｒｉｎ）；ｈｕＡ ３３抗体（Ａ３３、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ＣＮＴＯ ９５（アルファＶインテグリン、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＭＥＤＩ－５２２（アルファＶ１３３インテグリン、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ボロシキシマブ（αＶβ１インテグリン、Ｂｉｏｇｅｎ／ＰＤＬ）；ヒトｍＡｂ ２１６（Ｂ細胞グリコシル化（glycosolated）エピトープ、ＮＣＩ）；ＢｉＴＥ ＭＴ１０３（二特異性ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；４Ｇ７×Ｈ２２（二特異性Ｂ細胞×ＦｃガンマＲ１、Ｍｅｃｌａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ ＫＧａ）；ｒＭ２８（二特異性ＣＤ２８×ＭＡＰＧ、米国特許第ＥＰ１４４４２６８）；ＭＤＸ４４７（ＥＭＤ ８２６３３）（二特異性ＣＤ６４×ＥＧＦＲ、Ｍｅｄａｒｅｘ）；カツマキソマブ（ｒｅｍｏｖａｈ）（二特異性ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、Ｔｒｉｏｎ／Ｆｒｅｓ）；エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（二特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ）（ＣＡ－１２５、ＶｉＲｅｘｘ）；Ｒｅｎｃａｒｅｘ（登録商標）（ＷＸ Ｇ２５０）（炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｗｉｌｅｘ）；ＣＮＴＯ ８８８（ＣＣＬ２、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＴＲＣ１０５（ＣＤ１０５（エンドグリン）、Ｔｒａｃｏｎ）；ＢＭＳ－６６３５１３（ＣＤ１３７アゴニスト、Ｂｒｙｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＭＤＸ－１３４２（ＣＤ１９、Ｍｅｄａｒｅｘ）；シプリズマブ（ＭＥＤＩ－５０７）（ＣＤ２、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；オファツムマブ（Ｈｕｍａｘ－ＣＤ２０）（ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）（ＣＤ２０、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＴＨＩＯＭＡＢ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ベルツズマブ（ｈＡ２０）（ＣＤ２０、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；エプラツズマブ（ＣＤ２２、Ａｍｇｅｎ）；ルミリキシマブ（ＩＤＥＣ １５２）（ＣＤ２３、Ｂｉｏｇｅｎ）；ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３、Ｏｒｔｈｏ）；ＨｕＭ２９１（ＣＤ３ ｆｃ受容体、ＰＤＬ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）；ＨｅＦｉ－１（ＣＤ３０、ＮＣＩ）；ＭＤＸ－０６０（ＣＤ３０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ＭＤＸ－１４０１（ＣＤ３０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ＳＧＮ－３０（ＣＤ３０、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；ＳＧＮ－３３（リンツズマブ）（ＣＤ３３、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；ザノリムマブ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）（ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂ）；ＨＣＤ １２２（ＣＤ４０、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＧＮ－４０（ＣＤ４０、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；Ｃａｍｐａｔｈｌｈ（アレムツズマブ）（ＣＤ５２、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；ＭＤＸ－１４１１（ＣＤ７０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ｈＬＬ１（ＥＰＢ－Ｉ）（ＣＤ７４．３８、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ガリキシマブ（ＩＤＥＣ－１４４）（ＣＤ８０、Ｂｉｏｇｅｎ）；ＭＴ２９３（ＴＲＣ０９３／Ｄ９３）（切断型コラーゲン、Ｔｒａｃｏｎ）；ＨｕＬｕｃ６３（ＣＳ１、ＰＤＬ Ｐｈａｒｍａ）；イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）（ＣＴＬＡ４、Ｂｒｙｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；トレメリムマブ（チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＰ－６７５，２）（ＣＴＬＡ４、Ｐｆｉｚｅｒ）；１－ＩＧＳ－ＥＴＲ１（マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ））（ＤＲ４ＴＲＡＩＬ－Ｒ１アゴニスト、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）；ＡＭＧ－６５５（ＤＲ５、Ａｍｇｅｎ）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ）（ＤＲ５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＣＳ－１００８（ＤＲ５、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）；ＨＧＳ－ＥＴＲ２（レクサツムマブ）（ＤＲ５ＴＲＡＩＬ－Ｒ２アゴニスト、ＨＧＳ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（ＥＧＦＲ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＭＣ－１１Ｆ８（ＥＧＦＲ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ニモツズマブ（ＥＧＦＲ、ＹＭ Ｂｉｏ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔａｂｉｘ）（ＥＧＦＲ、Ａｍｇｅｎ）；ザルツムマブ（ＨｕＭａｘＥＧＦｒ）（ＥＧＦＲ、Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＸ－１１０（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＡＶＡＮＴ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＭＴ２０１）（Ｅｐｃａｍ、Ｍｅｒｃｋ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ、１７－１Ａ）（Ｅｐｃａｍ Ｇｌａｘｏ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＭＯＲＡｂ－００３（葉酸受容体ａ、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｃｈ）；ＫＷ－２８７１（ガングリオシドＧＤ３、Ｋｙｏｗａ）；ＭＯＲＡｂ－００９（ＧＰ－９、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｃｈ）；ＣＤＸ－１３０７（ＭＤＸ－１３０７）（ｈＣＧｂ、Ｃｅｌｌｄｅｘ）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（ＨＥＲ２、Ｃｅｌｌｄｅｘ）；ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４）（ＨＥＲ２（ＤＩ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲベータ鎖、ＰＤＬ Ｐｈａｒｍａ）；ＡＭＧ－４７９（ＩＧＦ－１Ｒ、Ａｍｇｅｎ）；抗ＩＧＦ－１Ｒ Ｒ１５０７（ＩＧＦ１－Ｒ、Ｒｏｃｈｅ）；ＣＰ ７５１８７１（ＩＧＦ１－Ｒ、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＩＭＣ－Ａ１２（ＩＧＦ１－Ｒ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；Ｂ１１１１０２２（Ｂｉｏｇｅｎ）；Ｍｉｋ－ベータ－１（ＩＬ－２Ｒｂ（ＣＤ１２２）、Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ）；ＣＮＴＯ ３２８（ＩＬ６、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；抗ＫＩＲ（１－７Ｆ９）（キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、Ｎｏｖｏ）；Ｈｕ３Ｓ１９３（ルイス（ｙ）、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ｈＣＢＥ－１１（ＬＴβＲ、Ｂｉｏｇｅｎ）；ＨｕＨＭＦＧ１（ＭＵＣ１、Ａｎｔｉｓｏｍａ／ＮＣＩ）；ＲＡＶ １２（Ｎ結合型炭水化物エピトープ、Ｒａｖｅｎ）；ＣＡＬ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨ－ｒＰ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＣＴ－０１１（ＰＤ１、ＣｔｉｒｅＴｅｃｈ）；ＭＤＸ－１１０６（ｏｎｏ－４５３８）（ＰＤＬ Ｎｉｌｅｃｌａｒｏｘ／Ｏｎｏ）；ＭＡｂ ＣＴ－０１１（ＰＤ１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）；ＩＭＣ－３Ｇ３（ＰＤＧＦＲａ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；バビツキシマブ（ホスファチジルセリン、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）；ｈｕＪ５９１（ＰＳＭＡ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）；ｍｕＪ５９１（ＰＳＭＡ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）；ＧＣ１００８（ＴＧＦｂ（汎）阻害剤（ＩｇＧ４）、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（ＴＮＦα、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；Ａ２７．１５（トランスフェリン受容体、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＮＳＥＲＮ ＷＯ ２００５／１１１０８２）；Ｅ２．３（トランスフェリン受容体、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）（ＶＥＧＦ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＨｕＭＶ８３３（ＶＥＧＦ、Ｔｓｕｋｕｂａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ－ＷＯ／２０００／０３４３３７、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１（ＶＥＧＦＲ１、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ならびにＩＭＣ－１１２１（ＶＥＧＦＲ２、Ｉｍｃｌｏｎｅ）。

【0130】

他の抗体には、抗原結合ドメインの一方または両方が本明細書に議論されるようにＶＬＲＢ－Ｉｇ中に取り込まれている、二特異性Ｔ細胞エンゲージャーが含まれる。適切な二特異性抗体および他の抗体の例は、Tian, et al., "Bispecific T cell engagers: an emerging therapy for management of hematologic malignancies", Journal of Hematology & Oncology volume 14, Article number: 75 (2021)中で議論されているが、表５のものに限定されない。

【表5-1】

【表5-2】

【0131】

例示的な非ＶＬＲＢ抗原結合ドメインは、低親和性ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＫＤ＝１００ｎＭ）であり、以下の実験において使用される：
ＤＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＴＴＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＳ （配列番号２２）（その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれるＷＯ ２００７／０７３４９９Ａ２もまた参照されたい）および抗ＣＤ３高親和性ＶＨ－Ｌ－ＶＬ ｓｃＦｖ

【化1】

（その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれるＷＯ ２０１７／０９１６５６もまた参照されたい）であり、式中、ＣＤＲは太字で同定され、リンカーは小文字で示される。

【0132】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、免疫細胞、腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造上で特異的に発現される、または正常組織と比較して腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造上で過剰発現される細胞表面受容体またはリガンドに結合するＲ／Ｌドメインを含む。腫瘍はまた、多数のリガンドを、腫瘍の成長および発達に影響を与える腫瘍微小環境中に分泌する。したがって、Ｒ／Ｌは、細胞、例えば、免疫細胞の表面上で典型的には発現されるリガンド、例えば、組織適合性抗原ファミリーのメンバー、または増殖因子、サイトカインおよびケモカインが含まれるがこれらに限定されない、腫瘍の表面上で発現されるリガンドに結合する受容体（複数可）であり得る。他の実施形態では、Ｒ／Ｌは、免疫細胞または腫瘍の表面上に発現される受容体に結合するリガンドである。

【0133】

したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、ケモカインまたはケモカイン受容体に特異的に結合するドメインを含有する。ケモカインは、それらのコグネートＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合して、細胞性応答、通常は指向性の遊走または走化性を惹起する、可溶性の小さい分子量（８～１４ｋＤａ）のタンパク質である。腫瘍細胞は、ケモカインを分泌し、それに応答し、これが、増加した内皮細胞動員および血管形成、免疫学的監視の転覆、ならびに腫瘍白血球プロファイルを操って、ケモカイン放出が腫瘍の成長および離れた部位への転移を可能にするようにそれを歪めることによって達成される成長を容易にする。したがって、ケモカインは、腫瘍進行にとって極めて重要である。

【0134】

ケモカインの保存された２つのＮ末端システイン残基の位置決めに基づいて、これらは、４つの群、即ち、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＣケモカインへと分類される。ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣ配列に先行するモチーフ「ｇｌｕ－ｌｅｕ－ａｒｇ（ＥＬＲモチーフ）」の存在または非存在に基づいて、ＥＬＲ＋およびＥＬＲ－ケモカインへとさらに分類され得る。ＣＸＣケモカインは、好中球、リンパ球、内皮および上皮細胞上のそれらのコグネートケモカイン受容体に結合し、それを活性化する。ＣＣケモカインは、樹状細胞、リンパ球、マクロファージ、好酸球、ナチュラルキラー細胞のいくつかのサブセットに対して作用するが、マウス好中球以外の好中球はＣＣケモカイン受容体を欠如するので、好中球を刺激することはない。およそ５０種のケモカインおよびわずか２０種のケモカイン受容体が存在し、したがって、リガンド／受容体相互作用のこの系には、かなりの冗長性が存在する。

【0135】

腫瘍および間質細胞から産生されたケモカインは、腫瘍および間質細胞上に存在するケモカイン受容体に結合する。腫瘍細胞の自己分泌ループおよび腫瘍と間質細胞との間のパラ分泌刺激ループは、腫瘍の進行を容易にする。特に、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２およびＣＣＲ７は、腫瘍形成および転移において主要な役割を果たす。ＣＸＣＲ２は、血管形成において極めて重要な役割を果たし、ＣＣＲ２は、腫瘍微小環境中へのマクロファージの動員において役割を果たす。リンパ節は、ＣＣＲ７に対するリガンドであるＣＣＬ２１を有するので、ＣＣＲ７は、センチネルリンパ節中への腫瘍細胞の転移に関与する。ＣＸＣＲ４は、広範な種々の腫瘍の転移性の伝播に主に関与する。

【0136】

３． 定常ドメイン
ある特定の実施形態では、ＣＨＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物配列である。これらは、キメラ抗体が投与される対象にとって内因性の配列であり得る。好ましい実施形態では、配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨＬ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４アイソタイプ由来であり、および／またはＣＨ４配列は、ＩｇＥもしくはＩｇＭアイソタイプ由来である。ＣＨＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４配列のうちのいずれかは、天然に存在する配列、またはそれと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれよりも高い配列同一性を有するそのバリアントであり得る。好ましいバリアントは、定常ドメインのうちの１つもしくは複数、または全体としてのキメラ抗体の活性または性能を改善する、またはあるいは、活性、例えば、１つもしくは複数のＦｃＲへの結合または補体の活性化を排除する、直交性突然変異である。

【0137】

ＣＬアミノ酸配列は、ラムダ軽鎖定常ドメイン配列であり得る。特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列、例えば、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＧ０４のラムダ軽鎖配列である。
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ （配列番号２３）は、Ｐ０ＣＧ０４・ＩＧＬＣ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリンラムダ定常１のポリペプチド配列である。したがって、一部の実施形態では、ＣＬドメインは、配列番号２３、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。

【0138】

ＣＬアミノ酸配列は、カッパ軽鎖定常ドメイン配列であり得る。好ましい実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトカッパ軽鎖定常ドメイン配列である、例えば、カッパ軽鎖配列は、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４である。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ （配列番号２４）は、Ｐ０１８３４・ＩＧＫＣ＿ＨＵＭＡＮ免疫グロブリンカッパ定常のポリペプチド配列である。したがって、一部の実施形態では、ＣＬドメインは、配列番号２４、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。

【0139】

一部の実施形態では、重鎖ドメイン配列のうちの１つまたは複数は、その各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号またはＰ０ＤＯＸ５またはＰ０１８５７のヒトＩｇＧ１配列に由来し、その配列は以下に提供される：

【化2】

は、Ｐ０ＤＯＸ５・ＩＧＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリンガンマ－１重鎖のポリペプチド配列であり、これは、以下のドメイン／領域アノテーションもまた提供する：

【表6】

【化3】

は、Ｐ０１８５７・ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１のポリペプチド配列であり、これは、以下のドメイン／領域アノテーションもまた提供する：

【表7】

【0140】

配列番号２５、Ｐ０ＤＯＸ５・ＩＧＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリンガンマ－１重鎖および配列番号２６、Ｐ０１８５７・ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１は、配列番号２５の抗原認識に関与する可変（Ｖ）ドメインを欠如する配列番号２６に関連する。配列番号２５のこの可変ドメインは、典型的には、開示される構築物では利用されない（例えば、存在しないまたは置換されている）。その一部が以下でより詳細に議論される例示的な突然変異部位は、配列番号２５および２６中で太字で示される。

【0141】

したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６、もしくは配列番号２５の対応する配列のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域（複数可）のうちの１つもしくは複数、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントを含む。

【0142】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、好ましくは配列番号２５の可変ドメイン（例えば、アミノ酸１２０～４４４）もしくは対応する配列なしの配列番号２６、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、バリアントは、太字残基のうちの１つまたは複数において突然変異を含み、必要に応じて、突然変異のうちの１つまたは複数は、以下でより詳細に議論される。

【0143】

例示的な実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＧ１アイソタイプ由来である。具体的な例では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７（配列番号２６）、アミノ酸１～９８：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号５７）、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。

【0144】

例示的な実施形態では、ヒンジ配列は、ＩｇＧ１アイソタイプ由来である。具体的な例では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７（配列番号２６）、アミノ酸９９～１１０、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５８）、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。

【0145】

ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は別々に、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列中に直交性の改変、例えば、操作されたジスルフィド架橋、荷電対突然変異、またはそれらの組合せを導入する改変をそれぞれ含む。例えば、その各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５３，５６２号、同第９，５２７，９２７号、同第８，５９２，５６２号、同第９，２４８，１８２号および同第９，３５８，２８６号を参照されたい。

【0146】

例示的なＣＨ２配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７（配列番号２６）、アミノ酸１１１～２２３：

【化4】

のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、バリアントは、太字残基のうちの１つまたは複数において突然変異を含み、必要に応じて、突然変異のうちの１つまたは複数は、以下でより詳細に議論される。開示される抗体のために有用なオルソロガスなＣＨ２アミノ酸配列は、その各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０１１３４２およびＷＯ２０１７／１０６４６２中に、より詳細に記載されている。

【0147】

ＣＨ２配列は、Ｎ末端可変ドメイン－定常ドメイン（例えば、ＣＨ１）をＣＨ２ドメインに連結するＮ末端ヒンジ領域ペプチドを含み得るか、またはさもなくばそれを介して連結され得る。さらに、ヒンジ領域は、典型的には、Ｎ末端可変ドメイン－定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間の柔軟性、ならびに重鎖間（例えば、第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖との間）にジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフの両方を提供する。

【0148】

一部の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１アイソタイプ由来である。一部の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＡアイソタイプ由来である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７（配列番号２６）、アミノ酸２２４～３３０：

【化5】

、またはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、バリアントは、太字残基のうちの１つまたは複数において突然変異を含み、必要に応じて、突然変異のうちの１つまたは複数は、以下でより詳細に議論される。

【0149】

一部の実施形態では、ＣＨ３配列は、内因性ＣＨ３配列のセグメント、または操作もしくは改変された配列である。

【0150】

１つまたは複数の重鎖突然変異（例えば、挿入、欠失および／または置換）が、開示される構築物において利用される配列または断片中に取り込まれ得る。例示的な突然変異には、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＤＯＸ５（配列番号２５）に言及して以下に提供されるもの、Ｐ０１８５７（配列番号２６）および丸括弧中の例示的なドメイン（配列番号６２～６４）中の対応する残基、ならびに同様に、他のＩｇＧ参照配列中で同定されるもの、または他のＩｇＧ参照配列中の対応する残基に適用されるものが含まれる。例えば、特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ３４３（２２４）およびＱ３４４（２２５）を欠如する内因性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｃ末端アミノ酸Ｐ４４７（３２８）、Ｇ４４８（３２９）およびＫ４４９（３３０）を欠如する内因性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ３４３（２２４）およびＱ３４４（２２５）ならびにＣ末端アミノ酸Ｐ４４７（３２８）、Ｇ４４８（３２９）およびＫ４４９（３３０）の両方を欠如する内因性ＣＨ３配列を有する。

【0151】

ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、１つまたは複数の置換を有する天然に存在する配列である。特定の実施形態では、突然変異は、特定のＣＨ３配列の特異的対形成をガイドするため、免疫原性を低減させるため、またはそれらの組合せのために内因性ＣＨ３配列中に導入される１つまたは複数の直交性突然変異である。一部の実施形態では、ＣＨ３配列は、ノブ－ホール直交性突然変異；直交性突然変異を含有するＣＨ３ドメインと共に操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５６（２３７）ＣもしくはＹ３５１（２３２）Ｃ突然変異のいずれかのイソアロタイプ（ｉｓｏａｌｌｏｔｙｐｅ）突然変異、またはそれらの組合せを含む。一部の好ましい実施形態では、イソアロタイプ突然変異と組み合わされるノブ－ホール直交性突然変異は、以下の突然変異的変化である：Ｄ３５８（２３９）Ｅ、Ｌ３６０（２４１）Ｍ、Ｔ３６８（２４９）Ｓ、Ｌ３７０（２５１）ＡおよびＹ４０９（２９０）Ｖ。１つのアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプの特定のアミノ酸で置き換えることによってキメラ抗体の免疫原性を低減させるように操作されたＣＨ３配列は、それが教示する全てについてこれにより参照により本明細書に組み込まれるStickler et al. (Genes Immun. 2011 April; 12(3): 213-221)により詳細に記載されるように、本明細書でイソアロタイプ突然変異と呼ばれる。特定の実施形態では、Ｇ１ｍ１アロタイプの特定のアミノ酸が、置き換えられる。好ましい実施形態では、イソアロタイプ突然変異Ｄ３５８（２３９）ＥおよびＬ３６０（２４１）Ｍが、ＣＨ３配列中でなされる。一部の特定の例では、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列は、以下の突然変異的変化を有し得る：Ｐ３４５（２２６）Ｖ；Ｙ３５１（２３２）Ｃ；およびトリペプチド挿入４４７（３２８）Ｐ、４４８（３２９）Ｇ、４４９（３３０）Ｋ。他の実施形態では、以下の突然変異的変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列：Ｔ３６８（２４９）Ｋ；およびトリペプチド挿入４４７（３２８）Ｋ、４４８（３２９）Ｓ、４４９（３３０）Ｃ。他の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３は、以下の突然変異的変化を有する配列を有する：Ｙ３４９（２３０）Ｃおよびトリペプチド挿入、４４７（３２８）Ｐ、４４８（３２９）Ｇ、４４９（３３０）Ｋ、またはその他の点では内因性のＣＨ３配列中に取り込まれた４４９（３３０）Ｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列。

【0152】

一部の実施形態では、Ｆｃ領域（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４）ドメイン（複数可））は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を増加させるように改変されている。例えば、一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管構造上で特異的に発現される、または正常組織と比較して腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管構造上で過剰発現される特異的Ｆｃ受容体への結合を増強する１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換を含有し得る。

【0153】

非ホジキンリンパ腫またはワルデンシュトレームマクログロブリン血症についてリツキシマブ（ＣＤ２０に対するキメラマウス／ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療転帰は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対する別個の固有の親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子バリアントの、個体の発現と相関した。特に、低親和性活性化性Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の高親和性対立遺伝子を有する患者は、より高い応答率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、改善された無進行生存を示した。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、低親和性阻害性Ｆｃ受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）への結合を低減させ、低親和性活性化性Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）への結合の野生型レベルを保持するまたは結合を増強する１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換を含有し得る。好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａへの結合を増強するアミノ酸挿入、欠失または置換を含有する。ＣＤ１６Ａへの結合を増加させ、ＣＤ３２Ｂへの結合を低減させる、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン中の多数の置換は、当該分野で公知であり、Stavenhagen, et al., Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)に記載されている。ＣＤ３２Ｂへの低減された結合および／またはＣＤ１６Ａへの増加した結合を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的なバリアントは、Ｆ２４５（１３０）Ｌ、Ｒ２９４（１７５）Ｐ、Ｙ３０２（１８３）Ｌ、Ｖ３０７（１８８）ＩまたはＰ３９８（２７９）Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中に任意の組合せで存在し得る。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインバリアントは、Ｆ２４５（１３０）Ｌ、Ｒ２９４（１７５）ＰおよびＹ３０２（１８３）Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインバリアントは、Ｆ２４５Ｌ、Ｒ２９４Ｐ、Ｙ３０２Ｌ、Ｖ３０７（１８８）ＩおよびＰ３９８（２７９）Ｌ置換を含有する。

【0154】

別の実施形態は、それらの半減期を増加させるＦｃＲへの結合を低減させる、ＩｇＧ_２－４ハイブリッドおよびＩｇＧ_２－４突然変異体を含む。代表的なＩＧ_２－４ハイブリッドおよびＩｇＧ４突然変異体は、Angal, S. et al. (1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (Igg4) Antibody," Molec. Immunol. 30(1):105-108；Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452；および米国特許第６，９８２，３２３号に記載されている。一部の実施形態では、ＩｇＧ_１および／またはＩｇＧ_２ドメインは、欠失されており、例えば、Angal, s. et al.は、セリン２４１（１２２）がプロリンで置き換えられたＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２を記載している。

【0155】

キメラ抗体における置換、付加または欠失は、抗体のＦｃ領域中にあり得、それにより、１つまたは複数のＦｃγＲへの抗体の結合親和性を改変するように機能し得る。１つまたは複数のＦｃγＲへの改変された結合を有する抗体を改変するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０４／０２９２０７、ＷＯ ０４／０２９０９２、ＷＯ ０４／０２８５６４、ＷＯ ９９／５８５７２、ＷＯ ９９／５１６４２、ＷＯ ９８／２３２８９、ＷＯ ８９／０７１４２、ＷＯ ８８／０７０８９、ならびに米国特許第５，８４３，５９７号および同第５，６４２，８２１号を参照されたい。１つの特定の実施形態では、Ｆｃ領域の改変は、変更された抗体媒介性エフェクター機能、他のＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ活性化受容体）への変更された結合、変更された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、変更されたＣ１ｑ結合活性、変更された補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、食作用活性、またはそれらの任意の組合せを有する抗体を生じる。

【0156】

一部の実施形態では、分子が、変更されたＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合活性を示すように、例えば、活性化受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩＡに対する減少した活性、または阻害性受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対する増加した活性を示すように、そのＦｃ領域が改変された、抗体を包含する。好ましくは、かかる抗体は、（野生型Ｆｃ受容体と比較して）減少した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を示す。

【0157】

Ｆｃ媒介性エフェクター機能に影響を与える改変は、当該分野で周知である（米国特許第６，１９４，５５１号およびＷＯ ００／４２０７２；Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890；Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR," J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604を参照されたい）。ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡへの低減された結合を有するが、ＦｃγＲＩＩＢへの無変化のまたは増強された結合を有する、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的なバリアントは、Ｓ２４１（１２２）Ａ、Ｈ２７０（１５１）Ａ、Ｓ２６９（１５０）Ｇ、Ｅ２７１（１５２）Ａ、Ｅ２９５（１７６）Ａ、Ｅ２９５（１７６）Ｄ、Ｙ２９８（１７９）Ｆ、Ｒ３０３（１８４）Ａ、Ｖ３０５（１８６）Ａ、Ａ３２９（２１０）Ｇ、Ｋ３２４（２０５）Ａ、Ｅ３３５（２１６）Ａ、Ｋ３３６（２１７）Ａ、Ｋ３４０（２２１）Ａ、Ａ３４１（２２２）Ａ、Ｄ３７８（２５９）Ａを含む。

【0158】

その各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許出願公開第２０２１／０１７９７３４号、同第２０１１０１５０８６７号、同第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号もまた参照されたい。

【0159】

さらなる突然変異には、表８のものが含まれるがそれらに限定されない：

【表8】

【0160】

それらの全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Lo, et al., "Effector attenuating substitutions that maintain antibody stability and reduce toxicity in mice." J Biol Chem. (2017) 292:3900-8. doi: 10.1074/jbc.M116.767749、Oganesyan, et al., "Structural characterization of a human Fc fragment engineered for lack of effector functions." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (2008) 64:700-4. doi: 10.1107/S0907444908007877およびChu, et al., "Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies." Mol Immunol 45:3926-3933 (2008)もまた参照されたい。

【0161】

例示的な配列には、以下が含まれるがこれらに限定されない：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（（配列番号６１）ヒトＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃ配列）、ならびにそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するその断片およびバリアント；
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（（配列番号２４）ヒトＩｇカッパＣＬ配列）、ならびにそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するその断片およびバリアント；
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（（配列番号６２）ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列）、ならびにそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するその断片およびバリアント；

【化6】

ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ１１７Ａ／Ｌ１１８Ａ／Ｐ２１２Ｇ「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｓ２３７Ｃ／Ｔ２４９Ｗ「ノブ」突然変異を伴う））、ならびにそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するその断片およびバリアント；ならびに

【化7】

【化8】

ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ１１７Ａ／Ｌ１１８Ａ／Ｐ２１２Ｇ「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｙ２３２Ｃ／Ｔ２４９Ｓ／Ｌ２５１Ａ／Ｙ２９０Ｖ「ホール」突然変異を伴ってイタリック））、ならびにそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するその断片およびバリアント。

【0162】

４． リンカーおよびシグナル配列
ａ． シグナル配列
シグナルペプチド（シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、分泌経路に向けて運命づけられるほとんどの新たに合成されたタンパク質のＮ末端に（または時折、非古典的には、Ｃ末端もしくは内部に）存在する短いペプチド（通常は１６～３０アミノ酸長）である。これらのタンパク質には、ある特定のオルガネラ（小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）の内側に存在するもの、細胞から分泌されたもの、またはほとんどの細胞膜中に挿入されたもののいずれかが含まれる。シグナルペプチドの末端には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断され、したがって、切断部位と呼ばれるアミノ酸のストレッチが、典型的には存在する。

【0163】

全ての開示される融合タンパク質は、シグナル配列ありおよびなしで明示的に開示される。以下の実施例の構築物において使用される例示的な非限定的なシグナル配列は、ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２７）である。

【0164】

ｂ． リンカー
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、限定なしに、ペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、可変領域またはＶＬＲＢ抗原結合ドメインによるエピトープの結合を妨害しないことを条件として、任意のサイズであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のグリシンおよび／またはセリンアミノ酸残基を含む。リンカーは、ＶＬＲＢおよび／もしくはＳｃＦｖ抗原結合ドメインを、軽鎖および重鎖のＣＬおよび／もしくはＣ１および／もしくはＣＨ３および／もしくはＣＨ４ドメインに連結すること、ならびに／またはＳｃＦｖの重鎖（複数可）および軽鎖（複数可）を、それらの適切なコンフォメーション配向で一緒に結合させることが含まれ得る、その意図した目的に基づいて選択される。二価、三価および他の多価ｓｃＦｖは、典型的には、３つまたはそれよりも多くのリンカーを含む。リンカーは、長さおよび／またはアミノ酸組成が同じまたは異なり得る。したがって、リンカーの数、リンカー（複数可）の組成およびリンカー（複数可）の長さは、当該分野で公知のように、ｓｃＦｖの所望の価数に基づいて決定され得る。リンカー（複数可）は、二価、三価および他の多価ｓｃＦｖの形成を可能にし得るまたは形成を駆動し得る。例示的な柔軟性のあるリンカーには、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２８）、Ａｌａ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２９）、（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_２（配列番号３０）および（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_４（配列番号３１）、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_３（配列番号３２）、およびＧｌｙ_４－Ａｌａ－Ｇｌｙ_４（配列番号３３）が含まれるがこれらに限定されない。他のリンカーには、表９のものが含まれる（V. Mallajosyula et al., Sci. Immunol. 10.1126/sciimmunol.abg5669 (2021)。

【0165】

【表9】

【0166】

５． カーゴ
開示される融合タンパク質またはキメラ抗体のいずれもが、１つまたは複数のカーゴを含むようにさらに改変され得る。典型的には、カーゴは、活性薬剤である。送達される薬剤には、治療的、栄養的、診断的および予防的化合物が含まれる。タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、核酸分子および有機分子、ならびに診断剤が送達され得る。

【0167】

活性薬剤には、薬物およびイメージング剤が含まれる。治療剤は、抗生物質、抗ウイルス薬、抗寄生生物（蠕虫、原生動物）薬、抗がん薬（本明細書で「化学療法薬」と呼ばれ、細胞傷害薬物、例えば、ドキソルビシン、シクロスポリン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよびカルボプラチン、ＢＣＮＵ、５ＦＵ、メトトレキセート、アドリアマイシン、カンプトテシン、エポチロンＡ～Ｆ、ならびにタキソールが含まれる）、抗体およびその生物活性断片（ヒト化、単鎖およびキメラ抗体が含まれる）、抗原およびワクチン製剤、ペプチド薬物、抗炎症薬、栄養補助食品、例えば、ビタミン、ならびにオリゴヌクレオチド薬物（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、リボヌクレアーゼＰのための外部ガイド配列が含まれるＲＮＡ、および三重鎖形成剤、例えば、ｔｃＰＮＡが含まれる）が含まれる。一部の実施形態では、活性薬剤は、オリゴヌクレオチドをコードするベクター、プラスミドまたは他のポリヌクレオチド、例えば、上で議論したものである。

【0168】

送達される例示的な薬物には、抗血管形成剤、抗増殖剤および化学療法剤が含まれる。かかる組成物は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれ得る。抗体の標的化を治療的薬物（例えば、細胞傷害薬物のがん殺滅能）と組み合わせることによって、ＡＤＣは、健康な組織と罹患組織との間の高感度の区別を可能にする。

【0169】

ＤＮＡを損傷させるまたはＤＮＡ修復を阻害する抗新生物性薬物の非限定的な例には、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、プロカルバジン、テモゾロミドおよびバルルビシンが含まれる。一部の実施形態では、抗新生物性薬物は、神経膠芽腫に対して一般に使用されるＤＮＡ損傷性アルキル化剤であるテモゾロミドである。一部の実施形態では、抗新生物性薬物は、ＤＮＡ損傷の塩基除去修復中のステップを阻害するＰＡＲＰ阻害剤である。例えば、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ（Ｃ_２４Ｈ_２３ＦＮ_４Ｏ_３）であり得る。

【0170】

一部の実施形態では、抗新生物性薬物は、ＤＮＡ修復を転写レベルで抑制し、クロマチン構造を破壊する、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、抗新生物性薬物は、細胞におけるユビキチン代謝の破壊によってＤＮＡ修復を抑制するプロテアソーム阻害剤である。ユビキチンは、ＤＮＡ修復を調節するシグナル伝達分子である。一部の実施形態では、抗新生物性薬物は、ＤＮＡ損傷応答シグナル伝達経路を変更することによってＤＮＡ修復を抑制するキナーゼ阻害剤である。

【0171】

さらなる抗新生物性薬物には、アルキル化剤（例えば、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびイホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、フルダラビンおよびフロクスウリジン）、一部の有糸分裂阻害薬、ならびにビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシンおよびエピルビシン、ならびにアクチノマイシン、例えば、アクチノマイシンＤが含まれる）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシンおよびブレオマイシンが含まれる）、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン、例えば、イリノテカンおよびトポテカン、ならびにエピポドフィロトキシンの誘導体、例えば、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドが含まれる）ならびに細胞骨格標的化薬物、例えば、パクリタキセルが含まれるがこれらに限定されない。

【0172】

予防薬には、腫脹を緩和する化合物、放射線損傷を低減させる化合物および抗炎症薬が含まれ得る。

【0173】

診断的材料の代表的なクラスには、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子および放射性核種が含まれる。例示的な材料には、金属酸化物、例えば、酸化鉄、金属粒子、例えば、金粒子などが含まれるがこれらに限定されない。バイオマーカーもまた、診断適用のために表面にコンジュゲートされ得る。

【0174】

例えば、イメージングのために、放射性材料、例えば、テクネチウム９９（^９９ｍＴｃ）または磁性材料、例えば、Ｆｅ_２Ｏ_３が使用され得る。他の材料の例には、放射線不透過性であるガスまたはガス発生性化合物が含まれる。脳腫瘍のための最も一般的なイメージング剤には、酸化鉄およびガドリニウムが含まれる。診断剤は、放射性、磁性、またはｘ線もしくは超音波検出可能であり得る。他の検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、元素粒子（例えば、金粒子）または造影剤が含まれる。これらは、ポリマー内に封入され得、ポリマー内に分散され、またはポリマーにコンジュゲートされ得る。

【0175】

例えば、蛍光標識は、蛍光標識されたポリマーを得るために、ナノ担体のポリマーに化学的にコンジュゲートされ得る。他の実施形態では、標識は、造影剤である。造影剤は、医学的イメージングにおいて身体内の構造または流体のコントラストを増強するために使用される物質を指す。造影剤は、当該分野で公知であり、これには、Ｘ線減衰および磁気共鳴シグナル増強に基づいて機能する薬剤が含まれるがこれらに限定されない。適切な造影剤には、ヨウ素およびバリウムが含まれる。

【0176】

活性薬剤は、使用されている処置の型に基づいて選択され得る。がん、感染症および傷害を処置するための例示的な活性薬剤。

【0177】

キメラ抗体は、ペプチド結合によって、または当該分野で周知の型の化学的もしくはペプチドリンカー分子によって、ポリペプチドに化学的に連結され得る。薬物または他の小分子医薬品を抗体断片に結合させるための方法は、周知であり、二官能性化学的リンカー、例えば、（４－ヨードアセチル）－アミノ安息香酸Ｎ－スクシンイミジル；（４－ヨードアセチル）－アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル；４－スクシンイミジル－オキシカルボニル－Ａ逆（.A-inverted.）－（２－ピリジルジチオ）トルエン；スルホスクシンイミジル－６－［アルファ－メチル－Ａ逆－（ピリジルジチオール）－トルアミド（toluamido）］ヘキサノエート；Ｎ－スクシンイミジル－３－（－２－ピリジルジチオ）－プロプリオネート（proprionate）；スクシンイミジル－６－［３（－（－２－ピリジルジチオ）－プロプリオンアミド（proprionamido）］ヘキサノエート；スルホスクシンイミジル－６－［３（－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート；３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓ－（２－チオピリジル）－Ｌ－システインなどの使用を含み得る。さらなる二官能性連結分子は、例えば、米国特許第５，３４９，０６６号、同第５，６１８，５２８号、同第４，５６９，７８９号、同第４，９５２，３９４号および同第５，１３７，８７７号で議論されている。

【0178】

リンカーは、切断可能または切断不能であり得る。高度に安定なリンカーは、循環中に落ちるペイロードの量を低減させ得、したがって、安全性プロファイルを改善し、より多くのペイロードが標的細胞に到達することを確実にする。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンもしくはペプチド（切断可能）、またはチオエーテル（切断不能）が含まれる化学的モチーフに基づき得、標的細胞への活性薬剤の分布および送達を制御し得る。切断可能および切断不能型のリンカーは、前臨床試験および臨床試験において安全であることが証明されている（例えば、カテプシンによって切断可能な酵素感受性リンカーを含むブレンツキシマブベドチン；および安定な切断不能リンカーを含むトラスツズマブエムタンシンを参照されたい）。特定の実施形態では、リンカーは、エドマン分解によって切断可能なペプチドリンカーである（Bachor, et al., Molecular diversity, 17 (3): 605-11 (2013)）。

【0179】

Ｅ． 抗原標的
開示されるキメラ抗体は、１つの標的に対して単一特異性であり得る、または２つもしくはそれよりも多くの標的に対して二特異性もしくは多特異性であり得る。一部の実施形態では、キメラ抗体は、腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造に特異的な抗原、または正常組織と比較して腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管構造において上方調節される抗原に結合する。一部の実施形態では、キメラ抗体は、例えば、感染性疾患原因因子、がんなどに応答したＢおよび／またはＴ細胞活性化の調節に関与する、免疫組織に特異的な抗原に結合する。一部の実施形態では、キメラ抗体は、二特異性または多特異性であり、腫瘍標的および免疫細胞標的の両方に結合する。

【0180】

一部の実施形態は、Ｔ細胞の動員および／または活性化を容易にし得る。例えば、二特異性キメラ抗体は、Ｔ細胞受容体（抗ＣＤ３抗体またはｓｃＦｖ）と、また、Ｔ細胞を好ましくは動員および活性化してがん細胞を溶解させるＶＬＲＢ抗体によって認識されるがん細胞と、相互作用し得る。

【0181】

１． 免疫細胞標的
抗原は、免疫細胞または腫瘍細胞によって発現されるチェックポイントリガンドまたは受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（例えば、ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬＳ、ＬＡＧＳ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲおよびＢ－７ファミリーリガンドであり得る。

【0182】

抗原は、免疫細胞または腫瘍細胞によって発現される共刺激リガンドまたは受容体であり得、例えば、共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ａｎｄ ４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４，ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ４０およびＣＤ１９ａのうちの１つまたは複数を含む。

【0183】

他の免疫細胞抗原には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、ＴＬＲおよびＩＤＯが含まれるがこれらに限定されない。

【0184】

２． 腫瘍標的
腫瘍によって発現される抗原は、腫瘍に特異的であり得る、または非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上でより高いレベルで発現され得る。抗原性マーカー、例えば、がん細胞によって独自に発現されるか、または適切な対照と比較して、悪性状態を有する対象において顕著により高いレベルで存在する（例えば、統計的に有意に上昇される）かのいずれかの、腫瘍関連抗原として公知の血清学的に定義されたマーカーが、ある特定の実施形態における使用のために企図される。

【0185】

腫瘍関連抗原には、例えば、細胞オンコジーンにコードされる産物もしくは異常に発現されるプロトオンコジーンにコードされる産物（例えば、ｎｅｕ、ｒａｓ、ｔｒｋおよびｋｉｔ遺伝子によってコードされる産物）、または増殖因子受容体もしくは受容体様細胞表面分子（例えば、ｃ－ｅｒｂ Ｂ遺伝子によってコードされる表面受容体）の突然変異形態が含まれ得る。他の腫瘍関連抗原には、形質転換事象に直接関与し得る分子、または発癌性形質転換事象には直接関与しないかもしれないが、腫瘍細胞によって発現される分子（例えば、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、黒色腫（melonoma）関連抗原など）が含まれる（例えば、米国特許第６，６９９，４７５号；Jager, et al., Int. J. Cancer, 106:817-20 (2003)；Kennedy, et al., Int. Rev. Immunol., 22:141-72 (2003)；Scanlan, et al. Cancer Immun., 4:1 (2004)を参照されたい）。

【0186】

細胞性腫瘍関連抗原をコードする遺伝子には、細胞オンコジーンおよび異常に発現されるプロトオンコジーンが含まれる。一般に、細胞オンコジーンは、細胞の形質転換に直接関連する産物をコードし、これに起因して、これらの抗原は、免疫療法のための特に好ましい標的である。一例は、発癌性形質転換に関与する細胞表面分子をコードする腫瘍原性ｎｅｕ遺伝子である。他の例には、ｒａｓ、ｋｉｔおよびｔｒｋ遺伝子が含まれる。プロトオンコジーン（オンコジーンを形成するように突然変異される正常遺伝子）の産物は、異常に発現され得（例えば、過剰発現され得）、この異常な発現は、細胞形質転換に関連し得る。したがって、プロトオンコジーンによってコードされる産物が標的化され得る。一部のオンコジーンは、腫瘍細胞表面上で発現される増殖因子受容体分子または増殖因子受容体様分子をコードする。一例は、ｃ－ｅｒｂＢ遺伝子によってコードされる細胞表面受容体である。他の腫瘍関連抗原は、悪性形質転換に直接関与してもしなくてもよい。しかし、これらの抗原は、ある特定の腫瘍細胞によって発現され、したがって、有効な標的を提供し得る。一部の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５（卵巣癌に関連する）および黒色腫特異的抗原である。

【0187】

卵巣癌および他の癌腫では、例えば、腫瘍関連抗原は、容易に得られる生物学的流体、例えば、血清または粘膜分泌物の試料中で検出可能である。１つのかかるマーカーは、これもまた血流中に落ち、血清中で検出可能な癌腫関連抗原であるＣＡ１２５である（例えば、Bast, et al., N. Eng. J. Med., 309:883 (1983)；Lloyd, et al., Int. J. Canc., 71:842 (1997)）。血清および他の生物学的流体中のＣＡ１２５レベルは、卵巣癌および他の癌腫の診断および／または予後プロファイルを提供することを試みて、他のマーカー、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）および胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルと共に測定されている（例えば、Sarandakou, et al., Acta Oncol., 36:755 (1997)；Sarandakou, et al., Eur. J. Gynaecol. Oncol., 19:73 (1998)；Meier, et al., Anticancer Res., 17(4B):2945 (1997)；Kudoh, et al., Gynecol. Obstet. Invest., 47:52 (1999)）。上昇した血清ＣＡ１２５は、神経芽細胞腫に付随しても起き得るが（例えば、Hirokawa, et al., Surg. Today, 28:349 (1998)）、上昇したＣＥＡおよびＳＣＣは、とりわけ、結腸直腸がんに付随して起き得る（Gebauer, et al., Anticancer Res., 17(4B):2939 (1997)）。

【0188】

モノクローナル抗体Ｋ－１との反応性によって定義される腫瘍関連抗原メソテリンは、上皮卵巣、子宮頸および食道腫瘍が含まれる扁平上皮癌の大多数の上に、ならびに中皮腫上に存在する（Chang, et al., Cancer Res., 52:181 (1992)；Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992)；Chang, et al., Int. J. Cancer, 51:548 (1992)；Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136 (1996)；Chowdhury, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:669 (1998)）。ＭＡｂ Ｋ－１を使用すると、メソテリンは、細胞関連腫瘍マーカーとしてのみ検出可能であり、卵巣がん患者由来の血清中、またはＯＶＣＡＲ－３細胞によって馴化された培地中では、可溶性形態では見出されない（Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992)）。しかし、構造的に関連するヒトメソテリンポリペプチドには、腫瘍関連抗原ポリペプチド、例えば、悪性疾患を有する患者由来の生物学的流体中で天然に存在する可溶性抗原として検出可能な別個のメソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドもまた含まれる（ＷＯ ００／５０９００を参照されたい）。

【0189】

腫瘍抗原には、細胞表面分子が含まれ得る。公知の構造の、公知のまたは記載された機能を有する腫瘍抗原には、以下の細胞表面受容体が含まれる：ＨＥＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２）、ＨＥＲ２（Yoshino, et al., J. Immunol., 152:2393 (1994)；Disis, et al., Canc. Res., 54:16 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３およびＭ１７７３０）、ＨＥＲ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２９３３９およびＭ３４３０９）、ＨＥＲ４（Plowman, et al., Nature, 366:473 (1993)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７８６８およびＴ６４１０５）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２およびＫＯ３１９３）、血管内皮細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ３２９７７）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２２３７５、１６８０１４３、Ｕ４８８０１およびＸ６２５６８）、インスリン様増殖因子－Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００１７３、Ｘ５６７７４、Ｘ５６７７３、Ｘ０６０４３、欧州特許番号ＧＢ２２４１７０３）、インスリン様増殖因子－ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３５６２、Ｘ００９１０、Ｍ１７８６３およびＭ１７８６２）、トランスフェリン受容体（Trowbridge and Omary, Proc. Nat. Acad. USA, 78:3039 (1981)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０６０およびＭ１１５０７）、エストロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３８６５１、Ｘ０３６３５、Ｘ９９１０１、Ｕ４７６７８およびＭ１２６７４）、プロゲステロン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１７３０、Ｘ６９０６８およびＭ１５７１６）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨ－Ｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３４２６０およびＭ６５０８５）、レチノイン酸受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１２０６０、Ｍ６０９０９、Ｘ７７６６４、Ｘ５７２８０、Ｘ０７２８２およびＸ０６５３８）、ＭＵＣ－１（Barnes, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:7159 (1989)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５１３２およびＭ６４９２８）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００３１４９およびＵ８７４５９）、ＮＡ １７－Ａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／４００３９）、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０６６５４およびＵ０６４５２）、チロシナーゼ（Topalian, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:9461 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６７２９；Weber, et al., J. Clin. Invest, 102:1258 (1998)）、Ｇｐ－１００（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３、Adema, et al., J. Biol. Chem., 269:20126 (1994)）、ＭＡＧＥ（van den Bruggen, et al., Science, 254:1643 (1991)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９３１６３、ＡＦ０６４５８９、Ｕ６６０８３、Ｄ３２０７７、Ｄ３２０７６、Ｄ３２０７５、Ｕ１０６９４、Ｕ１０６９３、Ｕ１０６９１、Ｕ１０６９０、Ｕ１０６８９、Ｕ１０６８８、Ｕ１０６８７、Ｕ１０６８６、Ｕ１０６８５、Ｌ１８８７７、Ｕ１０３４０、Ｕ１０３３９、Ｌ１８９２０、Ｕ０３７３５およびＭ７７４８１）、ＢＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１９１８０；米国特許第５，６８３，８８６号および同第５，５７１，７１１号）、ＧＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５４７５、ＡＦ０５５４７４、ＡＦ０５５４７３、Ｕ１９１４７、Ｕ１９１４６、Ｕ１９１４５、Ｕ１９１４４、Ｕ１９１４３およびＵ１９１４２）、ＳＳＸ２遺伝子によってコードされるＨＯＭ－ＭＥＬ－４０抗原が特に含まれるＣＴＡクラスの受容体のいずれか（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６１７５、Ｕ９０８４２、Ｕ９０８４１およびＸ８６１７４）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、Gold and Freedman, J. Exp. Med., 121:439 (1985)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５９７１０、Ｍ５９２５５およびＭ２９５４０）、ならびにＰｙＬＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２２８９およびＪ０２０３８）；ｐ９７（メラノトランスフェリン（ｍｅｌａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ））（Brown, et al., J. Immunol., 127:539-46 (1981)；Rose, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1261-61 (1986)）。

【0190】

さらなる腫瘍関連抗原には、胸腺白血病抗原（ＴＬ）、前立腺表面抗原（ＰＳＡ）（米国特許第６，６７７，１５７号；同第６，６７３，５４５号）；β－ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ－ＨＣＧ）（McManus, et al., Cancer Res., 36:3476-81 (1976)；Yoshimura, et al., Cancer, 73:2745-52 (1994)；Yamaguchi, et al., Br. J. Cancer, 60:382-84 (1989): Alfthan, et al., Cancer Res., 52:4628-33 (1992)）；グリコシルトランスフェラーゼβ－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ）（Hoon, et al., Int. J. Cancer, 43:857-62 (1989)；Ando, et al., Int. J. Cancer, 40:12-17 (1987)；Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:45-54 (1987)；Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:55-60 (1987)）；ＮＵＣ１８（Lehmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-95 (1989)；Lehmann, et al., Cancer Res., 47:841-45 (1987)）；黒色腫抗原ｇｐ７５（Vijayasardahi, et al., J. Exp. Med., 171:1375-80 (1990)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１４５５）；ヒトサイトケラチン８；高分子量黒色腫抗原（Natali, et al., Cancer, 59:55-63 (1987)；ケラチン１９（Datta, et al., J. Clin. Oncol., 12:475-82 (1994)）が含まれる。

【0191】

目的の腫瘍抗原には、当該分野で、悪性状態を有する対象中の、免疫原性の「がん／精巣」（ＣＴ）抗原とみなされる抗原が含まれる（Scanlan, et al., Cancer Immun., 4:1 (2004)）。ＣＴ抗原には、以下が含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数のメンバーを含有し、免疫応答を誘導することが可能な、少なくとも１９の異なるファミリーの抗原が含まれる：ＭＡＧＥＡ（ＣＴ１）；ＢＡＧＥ（ＣＴ２）；ＭＡＧＥＢ（ＣＴ３）；ＧＡＧＥ（ＣＴ４）；ＳＳＸ（ＣＴ５）；ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＴ６）；ＭＡＧＥＣ（ＣＴ７）；ＳＹＣＰ１（Ｃ８）；ＳＰＡＮＸＢ１（ＣＴ１１．２）；ＮＡ８８（ＣＴ１８）；ＣＴＡＧＥ（ＣＴ２１）；ＳＰＡ１７（ＣＴ２２）；ＯＹ－ＴＥＳ－１（ＣＴ２３）；ＣＡＧＥ（ＣＴ２６）；ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５（ＣＴ２８）；ＨＣＡ６６１（ＣＴ３０）；ＮＹ－ＳＡＲ－３５（ＣＴ３８）；ＦＡＴＥ（ＣＴ４３）；およびＴＰＴＥ（ＣＴ４４）。

【0192】

腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原が含まれる、標的化され得るさらなる腫瘍抗原には、以下が含まれるがこれらに限定されない：アルファ－アクチニン－４、Ｂｃｒ－Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ－８、ベータ－カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－１、２および３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ（Triosephosphate isomeras）、Ｂａｇｅ－１、Ｇａｇｅ ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、Ｌａｇｅ－１、Ｍａｇｅ－Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ－Ｃ２、ＮＡ－８８、ＮＹ－Ｅｓｏ－１／Ｌａｇｅ－２、ＳＰ１７、ＳＳＸ－２、ならびにＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、メランＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ－Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３（ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＣＤ１９（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ＥｐＣＡＭ（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）、ＣＤ２０（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ならびにＣＤ４５（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）。他の腫瘍関連抗原および腫瘍特異的抗原は、当業者に公知であり、開示される融合タンパク質による標的化のために適切である。

【0193】

抗原は、腫瘍新生血管構造に特異的であり得る、または正常脈管構造と比較した場合に、腫瘍新生血管構造においてより高いレベルで発現され得る。正常脈管構造と比較して腫瘍関連新生血管構造によって過剰発現される例示的な抗原には、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、Ｔｉｅ２、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、エンドグリンおよびα_５β_３インテグリン／ビトロネクチンが含まれるがこれらに限定されない。正常脈管構造と比較して腫瘍関連新生血管構造によって過剰発現される他の抗原は、当業者に公知であり、開示される融合タンパク質による標的化のために適切である。

【0194】

別の実施形態では、キメラ抗体は、ケモカインまたはケモカイン受容体に特異的に結合する。ケモカインは、それらのコグネートＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合して、細胞性応答、通常は指向性の遊走または走化性を惹起する、可溶性の小さい分子量（８～１４ｋＤａ）のタンパク質である。腫瘍細胞は、ケモカインを分泌し、それに応答し、これが、増加した内皮細胞動員および血管形成、免疫学的監視の転覆、ならびに腫瘍白血球プロファイルを操って、ケモカイン放出が腫瘍の成長および離れた部位への転移を可能にするようにそれを歪めることによって達成される成長を容易にする。したがって、ケモカインは、腫瘍進行にとって極めて重要である。

【0195】

ケモカインの保存された２つのＮ末端システイン残基の位置決めに基づいて、これらは、４つの群、即ち、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＣケモカインへと分類される。ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣ配列に先行するモチーフ「ｇｌｕ－ｌｅｕ－ａｒｇ（ＥＬＲモチーフ）」の存在または非存在に基づいて、ＥＬＲ＋およびＥＬＲ－ケモカインへとさらに分類され得る。ＣＸＣケモカインは、好中球、リンパ球、内皮および上皮細胞上のそれらのコグネートケモカイン受容体に結合し、それを活性化する。ＣＣケモカインは、樹状細胞、リンパ球、マクロファージ、好酸球、ナチュラルキラー細胞のいくつかのサブセットに対して作用するが、マウス好中球以外の好中球はＣＣケモカイン受容体を欠如するので、好中球を刺激することはない。およそ５０種のケモカインおよびわずか２０種のケモカイン受容体が存在し、したがって、リガンド／受容体相互作用のこの系には、かなりの冗長性が存在する。

【0196】

腫瘍および間質細胞から産生されたケモカインは、腫瘍および間質細胞上に存在するケモカイン受容体に結合する。腫瘍細胞の自己分泌ループおよび腫瘍と間質細胞との間のパラ分泌刺激ループは、腫瘍の進行を容易にする。特に、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２およびＣＣＲ７は、腫瘍形成および転移において主要な役割を果たす。ＣＸＣＲ２は、血管形成において極めて重要な役割を果たし、ＣＣＲ２は、腫瘍微小環境中へのマクロファージの動員において役割を果たす。リンパ節は、ＣＣＲ７に対するリガンドであるＣＣＬ２１を有するので、ＣＣＲ７は、センチネルリンパ節中への腫瘍細胞の転移に関与する。ＣＸＣＲ４は、広範な種々の腫瘍の転移性の伝播に主に関与する。

【0197】

ＩＩＩ． 核酸
Ａ． 融合タンパク質をコードする単離された核酸分子
融合タンパク質をコードする単離された核酸およびそのバリアントが含まれる核酸が、開示される。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、哺乳動物ゲノムにおいて核酸の一方または両方の側に通常は隣接する核酸が含まれる、哺乳動物ゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された、核酸を指す。

【0198】

単離された核酸は、例えば、天然に存在するゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直接隣接して通常は見出される核酸配列のうちの１つが除去されているまたは存在しないことを条件とした、ＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離された核酸には、限定なしに、他の配列とは独立した別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処置によって産生されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自律複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれる組換えＤＮＡが含まれる。さらに、単離された核酸には、操作された核酸、例えば、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子が含まれ得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス内の数百～数百万の他の核酸中に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。

【0199】

核酸は、センスもしくはアンチセンス配向であり得る、または開示される融合タンパク質をコードする参照配列に対して相補的であり得る。

【0200】

核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または核酸アナログであり得る。核酸アナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変され得る。かかる改変は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。塩基部分における改変には、デオキシチミジンの代わりのデオキシウリジン、およびデオキシシチジンの代わりの５－メチル－２’－デオキシシチジンまたは５－ブロモ－２’－デオキシシチジンが含まれ得る。糖部分の改変は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成する、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変が含まれ得る。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸（ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）骨格がシュードペプチド骨格によって置き換えられており、４種の塩基が保持されているペプチド核酸を産生するために、改変され得る。例えば、Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195；およびHyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置き換えることができる。

【0201】

Ｂ． 融合タンパク質を発現するベクターおよび宿主細胞
核酸、例えば、上記のものは、細胞における発現のためにベクター中に挿入され得る。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが、挿入されたセグメントの複製をもたらすように挿入され得る、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドである。ベクターは、発現ベクターであり得る。「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。

【0202】

ベクター中の核酸は、１つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、目的のコード配列の発現を発現制御配列が効果的に制御するように、遺伝子構築物中に取り込まれることを意味する。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結領域が含まれる。プロモーターは、典型的には、転写が開始するポイントの上流１００ヌクレオチド以内（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位の近傍）の、ＤＮＡ分子の領域から構成される発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くために、プロモーターの下流１ヌクレオチドと約５０ヌクレオチドとの間に、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を位置決めすることが必要である。エンハンサーは、時間、場所およびレベルに関して発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から種々の距離に位置する場合に機能することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流にも位置し得る。ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡへと転写することができ、このｍＲＮＡが次いで、コード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合、コード配列は、細胞において「作動可能に連結された」および発現制御配列の「制御下」にある。

【0203】

適切な発現ベクターには、限定なしに、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの会社から市販されている。

【0204】

発現ベクターは、タグ配列を含み得る。タグ配列は、典型的には、コードされるポリペプチドとの融合物として発現される。かかるタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のいずれの場所でも挿入され得る。有用なタグの例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質およびプロテインＡが含まれるがこれらに限定されない。

【0205】

発現される核酸を含有するベクターは、宿主細胞中に移入され得る。用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターが導入され得る原核生物および真核生物細胞を含む意図である。本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、いくつかの技法のうちの１つによる細胞中への核酸分子（例えば、ベクター）の導入を包含する。特定の技法に限定されないが、いくつかのこれらの技法は、当該分野で十分に確立されている。原核生物細胞は、例えば、電気穿孔または塩化カルシウム媒介性形質転換によって、核酸で形質転換され得る。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔またはマイクロインジェクションが含まれる技法によって、哺乳動物細胞中にトランスフェクトされ得る。宿主細胞（例えば、原核生物細胞または真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞）が、例えば、本明細書に記載される融合タンパク質を産生するために使用され得る。

【0206】

ＩＶ． 製造の方法
Ａ． 融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を産生するための方法
融合タンパク質をコードする単離された核酸分子は、限定なしに、一般的な分子的クローニングおよび化学的核酸合成技法が含まれる、標準的な技法によって産生され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法が、バリアント共刺激ポリペプチドをコードする単離された核酸を得るために使用され得る。ＰＣＲは、標的核酸が酵素的に増幅される技法である。典型的には、目的の領域の末端またはそれを超えたところからの配列情報が、増幅される鋳型の対向する鎖と配列が同一なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用され得る。ＰＣＲは、総ゲノムＤＮＡまたは総細胞性ＲＮＡ由来の配列が含まれる、ＤＮＡならびにＲＮＡ由来の特定の配列を増幅するために使用され得る。プライマーは、典型的には、１４～４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド～数百ヌクレオチド長の範囲であり得る。一般的なＰＣＲ技法は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. by Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。ＲＮＡを鋳型の供給源として使用する場合、逆転写酵素が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成するために使用され得る。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製または核酸配列ベースの増幅もまた、単離された核酸を得るために使用され得る。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878；およびWeiss (1991) Science 254:1292-1293を参照されたい。

【0207】

単離された核酸は、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成され得る（例えば、３’から５’の方向での自動化されたＤＮＡ合成のためにホスホラミダイト技術を使用して）。例えば、所望の配列を含有する、長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド）の１つまたは複数の対が合成され得、各対は、オリゴヌクレオチド対がアニールした場合に二重鎖が形成されるような、相補的な短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチドを伸長させて、オリゴヌクレオチド対１つ当たり単一の二本鎖核酸分子を生じるために使用され得、これは次いで、ベクター中にライゲーションされ得る。単離された核酸は、変異誘発によっても得ることができる。融合タンパク質コード核酸は、ＰＣＲを介したオリゴヌクレオチド特異的変異誘発および／または部位特異的変異誘発が含まれる標準的な技法を使用して突然変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology. Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, edited by Ausubel et al, 1992を参照されたい。改変され得るアミノ酸位置の例には、本明細書に記載されるものが含まれる。

【0208】

Ｂ． 融合タンパク質を作製するための方法
融合タンパク質は、例えば、化学的合成によって、または宿主細胞における組換え産生によって、得ることができる。融合タンパク質を組換え的に産生するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸は、細菌または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母または哺乳動物細胞）を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。一般に、核酸構築物は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書で発現制御配列とも呼ばれる）は、典型的には、遺伝子産物をコードしないが、その代わり、それが作動可能に連結された核酸配列の発現に影響を与える。

【0209】

ポリペプチドを発現および産生するために有用な原核生物および真核生物系は、当該分野で周知であり、これには、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、例えば、ＢＬ－２１、および培養哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞が含まれる。

【0210】

真核生物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が、融合タンパク質を発現させるために利用され得る。ウイルスベースの発現系は、当該分野で周知であり、これには、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルスまたはワクシニアベースのウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。

【0211】

バリアント共刺激ポリペプチドを安定に発現する哺乳動物細胞株は、適切な制御エレメントおよび選択可能なマーカーを有する発現ベクターを使用して産生され得る。例えば、真核生物発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐ９１０２３（Ｂ）（Wong et al. (1985) Science 228:810-815を参照されたい）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ－１細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるバリアント共刺激ポリペプチドの発現に適切である。電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン、または他の適切なトランスフェクション法による発現ベクターの導入後、安定な細胞株は、（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性によって）選択され得る。トランスフェクトされた細胞は、目的のポリペプチドが発現されるように培養され得、ポリペプチドは、例えば、細胞培養物上清からまたは溶解された細胞から回収され得る。あるいは、融合タンパク質は、（ａ）増幅された配列を、哺乳動物発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にライゲーションすること、ならびに（ｂ）コムギ胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することによって産生され得る。

【0212】

融合タンパク質は、例えば、クロマトグラフィー法、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを使用して、単離され得る。例えば、細胞培養物上清または細胞質抽出物中の共刺激ポリペプチドは、プロテインＧカラムを使用して単離され得る。一部の実施形態では、バリアント共刺激ポリペプチドは、ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕捉されるのを可能にするアミノ酸配列を含有するように「操作され」得る。例えば、タグ、例えば、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジンまたはＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）が、ポリペプチド精製を助けるために使用され得る。かかるタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のいずれの場所でも挿入され得る。有用であり得る他の融合物は、ポリペプチドの検出を助ける酵素、例えば、アルカリホスファターゼを含む。免疫親和性クロマトグラフィーもまた、共刺激ポリペプチドを精製するために使用され得る。

【0213】

バリアントポリペプチドを産生するためにランダム突然変異を導入するための方法は、当該分野で公知である。ランダムペプチドディスプレイライブラリーが、所望の融合タンパク質バリアントについてスクリーニングするために使用され得る。かかるランダムペプチドディスプレイライブラリーを創出およびスクリーニングための技法は、当該分野で公知であり（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，４０３，４８４号およびＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号）、ランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは、市販されている。

【0214】

Ｃ． ＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体を製造する方法
開示されるキメラ抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して調製され得る。例えば、組換えキメラ抗体は、開示される融合タンパク質をコードする１つまたは複数のベクターの所望の組合せ（複数可）を、宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生され得る。抗体の生成および産生の組換え手段の例示的な記載には、Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997)；Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000)；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993)；Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, most recent edition)；米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）、米国特許第６，３３１，４１５号および同第４，８１６，５６７号（共にＣａｂｉｌｌｙら）、英国特許ＧＢ ２，１８８，６３８（Ｗｉｎｔｅｒら）および英国特許ＧＢ ２，２０９，７５７、Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991)、ならびにBorreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992)が含まれる。組換え抗体の生成、設計および発現に関するさらなる情報は、Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993)中に見出すことができる。

【0215】

抗体は、カスタム設計の組換え産生を専門にする供給業者によっても作製され得る。

【0216】

Ｖ． 製剤
ＶＬＲＢ－Ｉｇを含む医薬組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン泳動もしくは電気穿孔を使用してのいずれか）または経粘膜（経鼻、腟、直腸または舌下）経路の投与による投与のためのものであり得る。組成物は、生体分解性インサートを使用しても投与され得、適切なリンパ系組織（例えば、脾臓、リンパ節、または粘膜関連リンパ系組織）に直接的に、または臓器もしくは腫瘍に直接的に送達され得る。組成物は、投与の各経路に適切な投薬形態で製剤化され得る。一部の実施形態では、組成物は、経腸投与のために製剤化される。

【0217】

用語「有効量」または「治療有効量」は、処置されている障害の１つもしくは複数の症状を処置、阻害もしくは緩和するのに、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を他の方法で提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、種々の因子、例えば、対象依存的変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患、およびもたらされている処置に従って変動する。

【0218】

一部の実施形態では、ＶＬＲＢ－Ｉｇは、腫瘍モデル化およびバイオアベイラビリティからの外挿に基づいて、０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。最も好ましい範囲は、５～２０ｍｇ／ｋｇのＶＬＲＢ－Ｉｇである。一般に、静脈内注射または注入のために、投薬量は、代替的な経路によって投与される場合よりも低くてもよい。

【0219】

Ａ． 非経口投与のための製剤
好ましい実施形態では、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものが含まれる開示される組成物は、非経口注射または注入によって、水性溶液中で投与される。製剤は、懸濁物またはエマルジョンの形態でもあり得る。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物が提供され、必要に応じて、この医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む。かかる組成物は、滅菌水、緩衝食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度；ならびに必要に応じて、添加剤、例えば、洗剤および可溶化薬剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油およびコーン油、ゼラチン、ならびに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。製剤は、凍結乾燥され得、使用の直前に再溶解／再懸濁され得る。製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過によって、滅菌剤を組成物中に取り込むことによって、組成物に照射することによって、または組成物を加熱することによって、滅菌され得る。

【0220】

Ｂ． 経腸投与のための製剤
ＶＬＲＢ－Ｉｇは、経口送達のためにも製剤化され得る。経口固体投薬形態は、当業者に公知である。固体投薬形態には、錠剤、カプセル、丸剤、トローチもしくはロゼンジ、サシェ、ペレット、粉末もしくは顆粒、またはポリマー性化合物、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの粒状調製物中への、もしくはリポソーム中への材料の取り込みが含まれる。かかる組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響し得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. (2005, Lippincott, Williams & Wilins, Baltimore, Md. 21201) pages 889-964を参照されたい。組成物は、液体形態で調製され得る、または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥された）形態であり得る。リポソームまたはポリマー封入が、組成物を製剤化するために使用され得る。Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10, 1979もまた参照されたい。一般に、製剤は、活性薬剤と、胃環境においてＶＬＲＢ－Ｉｇを保護し、腸における生物学的に活性な材料の放出を保護する不活性成分とを含む。

【0221】

薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁物およびシロップが含まれる、経口投与のための液体投薬形態は、不活性希釈剤；アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤；ならびに甘味剤、香味剤および芳香剤が含まれる他の構成成分を含有し得る。

【0222】

Ｃ． 制御送達ポリマー性マトリックス
１つまたは複数のＶＬＲＢ－Ｉｇを含有する組成物は、制御放出製剤で投与され得る。制御放出ポリマー性デバイスは、ポリマー性デバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の移植、または注射（マイクロ粒子）の後の全身的な長期放出のために作製され得る。マトリックスは、ペプチドが、固体ポリマー性マトリックスまたはマイクロカプセル内に分散され、コアが、ポリマー性シェルとは異なる材料のものであり、ペプチドが、性質が液体または固体であり得るコア中に分散または懸濁される、マイクロ粒子、例えば、ミクロスフェアの形態であり得る。本明細書で具体的に定義されない限り、マイクロ粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは、相互交換可能に使用される。あるいは、ポリマーは、数ナノメートル～４センチメートルの範囲の薄い平板もしくはフィルム、製粉もしくは他の標準的な技法によって産生された粉末、またはさらには、ゲル、例えば、ヒドロゲルとして、成型され得る。マトリックスはまた、免疫応答をモジュレートするため、免疫不全患者（例えば、カテーテルが挿入された高齢者、または早産児）において感染症を予防するため、または褥瘡、褥瘡性潰瘍（decubitis ulcer）などの治癒を容易にするために使用されるマトリックスの場合には、治癒を助けるために、医学的デバイス中にまたはその上に取り込まれ得る。非生分解性または生分解性のいずれかのマトリックスがＶＬＲＢ－Ｉｇの送達のために使用され得るが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは、天然または合成ポリマーであり得るが、分解および放出プロファイルのより良い特徴付けに起因して、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。一部の場合には、線形放出が最も有用であり得るが、他の場合には、パルス放出または「バルク放出」が、より有効な結果を提供し得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には、最大で約９０重量％の水を吸収する）の形態であり得、必要に応じて、多価イオンまたはポリマーと架橋結合され得る。

【0223】

マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出および当業者に公知の他の方法によって形成され得る。生体分解性ミクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)；Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)；およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)によって記載されるように、薬物送達のためのミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを使用して調製され得る。

【0224】

制御放出経口製剤が望ましい場合がある。ＶＬＲＢ－Ｉｇは、拡散または浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えば、フィルムまたはゴム中に取り込まれ得る。緩徐に崩壊するマトリックスもまた、製剤中に取り込まれ得る。別の形態の制御放出は、浸透圧効果に起因して単一の小さい開口部を介して水が進入して薬物を押し出すことを可能にする半透過性膜中に薬物が封入されたものである。経口製剤のために、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸（jejunem）または回腸）または大腸であり得る。好ましくは、放出は、活性薬剤（もしくは誘導体）の保護によって、または腸中などの、胃環境を過ぎた場所での活性薬剤の放出によってのいずれかで、胃環境の有害な影響を回避する。完全な胃抵抗性を確実にするために、腸溶コーティング（即ち、少なくともｐＨの５．０に対して不透過性）が不可欠である。これらのコーティングは、Ｂａｎｎｅｒ Ｐｈａｒｍａｃａｐｓから入手可能なものなど、混合フィルムとして、またはカプセルとして、使用され得る。

【0225】

デバイスは、移植または注射の領域を処置するために局所放出のために製剤化され得、典型的には、全身の処置のための投薬量よりもずっと少ない投薬量を送達することができる。デバイスは、全身送達のためにも製剤化され得る。これらは、皮下で移植または注射され得る。

【0226】

ＶＩ． 使用の方法
Ａ． 治療方法および診断方法
典型的には、ＶＬＲＢ－Ｉｇは、上で議論したように、例えば、標的細胞上の抗原、受容体、リガンドまたは他の部分に結合する１つまたは複数のドメイン（例えば、ＶＬＲＢ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ、Ｒおよび／またはＬドメイン）を含有することによって、１つまたは複数の標的細胞に結合するように設計される。これは、ＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増加、誘導もしくは増強するように、より多くのより多くの標的細胞へのカーゴの送達を増加させるように、２つの異なる標的細胞間の近接もしくは連絡を増加もしくは増強するように、エフェクター細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を動員して、標的細胞、例えば、腫瘍細胞との複合体を形成するように、ならびに／または１つもしくは複数の異なる型の標的の凝集を誘導するように機能し得る。２つまたはそれよりも多くの細胞が（例えば、２つの異なる標的細胞間の近接または連絡を増加または増強するため、エフェクター細胞を標的細胞に動員するため、１つまたは複数の異なる型の標的の凝集を誘導するためなどに）標的化される実施形態について、典型的には、２つまたはそれよりも多くの異なる標的細胞上の２つまたはそれよりも多くの異なる抗原、受容体、リガンドまたは他の部分を標的化する１つまたは複数のドメイン（例えば、ＶＬＲＢ、ＳｃＦｖ、ＶＨ／ＶＬ、Ｒおよび／またはＬドメイン）を含む二特異性または多特異性抗体が、利用される。

【0227】

１つまたは複数の異なる細胞型が標的化され得る実施形態、例えば、１つまたは複数の標的細胞へのカーゴの増加した送達、ならびに誘導または増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣについて、キメラ抗体は、単一特異性、二特異性または多特異性であり得る。したがって、開示される方法は、典型的には、１つまたは複数の標的細胞型に結合するＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。かかる方法は、好ましくは、診断結果を達成する（例えば、対象における標的細胞の場所または量を検出する）または治療結果（例えば、疾患または障害の１つまたは複数の症状の低減または予防）を達成するのに有効である。

【0228】

例えば、本明細書で提供されるＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体は、例えば、がんまたは感染症を処置するために、免疫応答刺激性治療薬として、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで有用であり得る。

【0229】

一部の実施形態では、ＶＬＲＢ－Ｉｇは、ＶＬＲＢ－Ｉｇによって誘導される抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を容易にするように設計される。

【0230】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とも呼ばれるが、ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞が、その膜表面抗原に特異的抗体が結合した標的細胞を能動的に溶解させる、細胞媒介性免疫防御の機構である。これは、体液性免疫応答の一部としての抗体が、感染症またはがんを制限するおよび封じ込めるために利用され得る機構の１つである。

【0231】

ＡＤＣＣは、これもまた標的を溶解するが、いずれの他の細胞も要求しない免疫補体系とは無関係である。ＡＤＣＣは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体と典型的には相互作用するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であることが古典的に公知のエフェクター細胞を要求する。しかし、マクロファージ、好中球および好酸球もまた、ＡＤＣＣを媒介することができ、例えば、好酸球は、ＩｇＥ抗体を介して、蠕虫として公知のある特定の寄生虫を殺滅する。

【0232】

したがって、一部の実施形態では、開示されるキメラ抗体は、ＡＤＣＣ活性、または対照と比較して改善されたＡＤＣＣ活性を示し得る。ＡＤＣＣ活性は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）反応を惹起する抗体の能力を指す。ＡＤＣＣは、ＦｃＲを発現する抗原非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞の表面に結合した抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解（即ち、「殺滅」）を引き起こす、細胞媒介性反応である。ＡＤＣＣにおける一次メディエーター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＦｃγＲＩＩＡは活性化受容体であり、ＦｃγＲＩＩＩＢは阻害性受容体である。単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。

【0233】

ＣＤＣは、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のエフェクター機能である。それらが標的細胞（例えば、細菌またはウイルス感染細胞）上の表面抗原に結合している場合、古典的補体経路が、タンパク質Ｃ１ｑをこれらの抗体に結合させることによって誘発され、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成および標的細胞溶解を生じる。補体系は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭ抗体によって効率的に活性化され、ＩｇＧ２抗体によって弱く活性化され、ＩｇＧ４抗体によっては活性化されない。ＡＤＣＣおよびＣＤＣは、治療的抗体がそれによって抗腫瘍効果を達成し得る２つの作用機構である。

【0234】

したがって、さらにまたはあるいは、開示されるキメラ抗体は、ＣＤＣ活性を示し得る、または対照と比較して改善されたＣＤＣ活性を示し得る。ＣＤＣ活性は、標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、補体系の１つまたは複数の成分の反応を指す。

【0235】

ＡＤＣＰは、抗体コーティングされた外来粒子、例えば、微生物または腫瘍細胞の排除の強力な機構である。マクロファージ上で発現されるＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩのエンゲージメントは、ＩｇＧオプソニン化粒子の貪食をもたらすシグナル伝達カスケードを誘発する。例えば、Tay, et al., Front Immunol., 10: 332, doi: 10.3389/fimmu.2019.00332 (2019)を参照されたい。

【0236】

したがって、さらにまたはあるいは、開示されるキメラ抗体は、ＡＤＣＰ活性を示し得る、または対照と比較して改善されたＡＤＣＰ活性を示し得る。ＡＤＣＰ活性は、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）反応を惹起する抗体の能力を指す。

【0237】

さらにまたはあるいは、開示される二特異性または多特異性キメラ抗体は、２つまたはそれよりも多くの標的細胞型を近接近させるために使用され得る。対になる標的細胞の例には、免疫細胞およびがん細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍細胞標的、２つの異なる免疫細胞などが含まれるがこれらに限定されない。この方法で、抗体は、２つの細胞間のシグナル伝達を容易にし得る。細胞間の相互作用および／またはシグナル伝達の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：
Ｔ細胞標的と相互作用する抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的によって誘導される増加した免疫応答活性化；
腫瘍または感染細胞標的に対するＮＫ細胞またはマクロファージ標的によって誘導される増加した免疫応答エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ；ならびに
抗ＣＤ８：腫瘍特異的ＶＬＲＢによる腫瘍へのＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の動員。

【0238】

さらにまたはあるいは、開示されるキメラ抗体は、コンジュゲートされたカーゴを、上で紹介したように、標的細胞に送達することができる。送達は、例えば、細胞傷害剤または診断剤を腫瘍細胞に、免疫応答誘導剤、例えば、炎症促進性（proinflammtory）サイトカインを免疫細胞に、などであり得る。

【0239】

Ｂ． 処置のための標的細胞および疾患
したがって、ＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体によって提示される抗原結合ドメイン、リガンドまたは受容体は、意図した使用に基づいて選択され得、所望の細胞型（単数または複数）を標的化するように設計され得る。一部の実施形態では、標的細胞型のうちの１つまたは複数は、がん細胞である。細胞が標的化され得るがんには、癌腫、神経膠腫、肉腫、血液およびリンパ系（白血病、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、孤立性形質細胞腫、多発性骨髄腫が含まれる）、泌尿生殖器系のがん（前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がんが含まれる）、神経系のがん（髄膜腫（mengiomas）、神経膠腫、神経膠芽腫、上衣腫が含まれる）、頭頸部のがん（口腔、鼻腔、鼻咽頭腔、中咽頭腔（ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）、喉頭および副鼻腔の扁平上皮癌が含まれる）、肺がん（小細胞および非小細胞肺がんが含まれる）、婦人科がん（子宮頸がん、子宮内膜がん、腟がん、外陰部がん卵巣および卵管がんが含まれる）、胃腸がん（胃、小腸、結腸直腸、肝臓、肝胆道および膵がんが含まれる）、皮膚がん（黒色腫、扁平上皮癌および基底細胞癌が含まれる）、乳房がん（乳管および小葉がんが含まれる）、ならびに小児がん（神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、髄芽細胞腫が含まれる）が含まれるがこれらに限定されない。

【0240】

一部の実施形態では、標的細胞型のうちの１つまたは複数は、免疫細胞である。免疫細胞には、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｂ細胞およびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。

【0241】

一部の好ましい実施形態では、キメラ抗体は、腫瘍細胞型および免疫細胞型に対して二特異性または多特異性である。

【0242】

一部の実施形態では、キメラ抗体は、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。ＢｉＴＥは、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Tian, et al. "Bispecific T cell engagers: an emerging therapy for management of hematologic malignancies." J Hematol Oncol 14, 75 (2021), pages 1-18, doi.org/10.1186/s13045-021-01084-4で概説されている。ＢｉＴＥは、典型的には、免疫細胞標的、例えば、ＣＤ３と腫瘍抗原とを同時に標的化する。ＢｉＴＥは、腫瘍抗原を有するがん（例えば、腫瘍）に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。一部の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、腫瘍抗原を標的化し、別の結合／標的化ドメイン（例えば、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ、Ｒおよび／またはＬドメイン）は、免疫細胞を標的化する。他の実施形態では、ＶＬＲＢドメインは、免疫細胞を標的化し、別の結合／標的化ドメイン（例えば、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ、Ｒおよび／またはＬドメイン）は、腫瘍抗原を標的化する。例示的なＢｉＴＥ構築物は、本明細書で議論され、以下の実施例で実験的に実証される。

【0243】

Ｃ． 組合せ治療
開示されるキメラ抗体組成物は、既存の抗原、例えば、がんを有する対象における腫瘍抗原に対する対象の免疫応答を開始または増強するために使用され得る予防的ワクチンまたは治療的ワクチンと併せて投与され得る。組合せは、同じまたは別々の混合物で投与され得る。

【0244】

予防的免疫応答、治療的免疫応答または脱感作された免疫応答の所望の転帰は、当該分野で周知の原理に従って、疾患によって変動し得る。同様に、がん、アレルゲンまたは感染性因子に対する免疫応答は、疾患を完全に処置し得る、症状を緩和し得る、または疾患に対する治療介入全体における１つの様相であり得る。例えば、がんに対する免疫応答の刺激は、処置に影響を与えるために、外科的、化学療法的、放射線学的、ホルモン的および他の免疫性アプローチとカップリングされ得る。腫瘍を根絶するために第１の治療剤に加えて投与される処置は、アジュバント療法と呼ばれ得る。アジュバント処置は、がんが再発する可能性を減少させるために、一次処置、例えば、手術または放射線を補強するために与えられる。このさらなる処置は、より強力なおよび／または延長された応答によって明らかなような、一次応答の増幅を生じ得る。

【0245】

アジュバント療法には、５つの主要な型が存在する（これらの一部は、一次／単独療法としても使用され得ることに留意されたい）：１．）がん細胞の増殖を予防することまたは細胞の自己破壊を引き起こすことのいずれかによってがん細胞を殺滅する薬物を使用する化学療法、２．）ホルモン産生を低減させ、がんの成長を予防するためのホルモン療法、３．）がん細胞を殺滅するために高出力線を使用する放射線療法、４．）任意の残存がん細胞を攻撃および根絶するように身体特有の免疫系に影響することを試みる免疫療法。免疫療法は、身体特有の防御を刺激する（がんワクチン）か、それを補完する（抗体または免疫細胞の受動的投与））かのいずれかであり得、がん細胞内に存在する特定の分子を標的化する標的化治療は、正常な健康な細胞単独を残す。例えば、乳房がんの多くの症例は、ＨＥＲ２と呼ばれるタンパク質を過剰量産生する腫瘍によって引き起こされる。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、ＨＥＲ２陽性腫瘍を標的化するアジュバント療法として使用される。

【0246】

典型的には、アジュバント処置は、複数の機構を誘導し、腫瘍を根絶する可能性を増加させるために、一次処置と併せて共投与されるまたは与えられる。免疫療法、および特にワクチンは、優れた特異性と既存の免疫寛容を回避する能力とを有する持続性の抗腫瘍効果を誘導するという独自の利点を提供する。

【0247】

一部の実施形態では、開示されるキメラ抗体は、第１の治療剤、例えば、がん治療剤の投与後に二次治療剤として投与される。他の実施形態では、開示されるキメラ抗体は、一次治療剤であり、二次治療剤の前に投与される。二次治療剤投与のタイミングは、０日目から一次処置後１４日目までの範囲であり得、単一のまたは複数の処置を含み得る。ある特定の実施形態では、ＶＬＲＢ－Ｉｇ抗体は、一次処置の投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日後に、または二次薬剤の前に投与される。

【0248】

一部の実施形態では、第２の薬剤は、上で議論したカーゴのうちの１つである。例えば、一部の実施形態では、代表的な治療剤には、化学療法剤およびアポトーシス促進剤、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。代表的なアポトーシス促進剤には、フルダラビンタウロスポリン（fludarabinetaurosporine）、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）およびそれらの組合せ、ならびに／または免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４およびＢ７－Ｈ１アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤ－１、抗Ｂ７－Ｈ１および抗ＣＴＬＡ４抗体などが含まれるがこれらに限定されない。

【0249】

Ｄ． さらなる方法
さらなる治療方法、診断方法および研究ベースの方法もまた提供される。例えば、キメラ抗体は、選択された薬剤を検出するために、選択された薬剤の活性を遮断するために、薬剤を精製するために、イメージングツールとして、および治療剤として、使用され得る。

【0250】

試料中の薬剤を検出する方法であって、試料を、組成物が試料中の薬剤に結合することができる条件下でキメラ抗体と接触させるステップ、および試料中の薬剤に結合した組成物を検出するステップを含む方法が、本明細書で提供される。結合した組成物は、試料中の薬剤を示す。検出方法は、当該分野で周知である。例えば、キメラ抗体は、検出可能なタグで標識され得る。検出方法は、試料中の薬剤の存在または非存在を示すために使用され得る。しかし、検出方法は、定量化方法とさらに組み合わされ得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ方法には、対照試料、または標準と比較した量を確立するために使用され得る既知の薬剤量の試料との比較に基づいて薬剤の定量化を可能にする、比色分析アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡが含まれる。これらの方法には、放射された放射線に基づく定量化を可能にする放射測定アッセイ、および蛍光アッセイ、または上記可視化および定量化の任意の手段もまた含まれ得る。

【0251】

試料は、任意の生物学的試料が含まれる、試験される任意の試料であり得る。試料には、流体試料（例えば、水、血液、尿など）、組織試料、培養物試料、細胞性試料などが含まれ得る。

【0252】

キメラ抗体は、遮断抗体と匹敵して、それが結合する任意の薬剤の活性を遮断するためにも使用され得る。したがって、薬剤の活性を遮断する方法であって、薬剤を、組成物が薬剤に結合する条件下でキメラ抗体と接触させるステップを含む方法もまた、開示される。薬剤への組成物の結合は、薬剤の活性を遮断する。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。したがって、例えば、試料の夾雑を低減させるために、毒素に結合するキメラ抗体が、試料に添加され得、毒素活性を遮断し得る。

【0253】

キメラ抗体は、アゴニスト性抗体と匹敵して、それが結合する薬剤の活性を促進するためにも使用され得る。したがって、薬剤の活性を促進する方法であって、薬剤を、組成物が薬剤に結合する条件下で組成物と接触させるステップを含む方法もまた、開示される。薬剤への組成物の結合は、薬剤の活性を促進する。

【0254】

本明細書で開示されるキメラ抗体は、未知の機能を有する遺伝子の機能を決定するために使用され得る。したがって、開示されるキメラ抗体をタンパク質ノックダウンアッセイにおいて使用する方法が、本明細書で開示される。例えば、開示される組成物は、未知の機能の遺伝子を含む細胞の細胞質において発現され得る。ＲＮＡ転写物が細胞の細胞質において翻訳されている場合、開示される組成物は、問題の遺伝子のタンパク質産物に結合し得る。タンパク質発現の喪失が細胞に対して有する影響をモニタリングすることによって、タンパク質の機能が決定され得る。したがって、未知の機能の遺伝子産物に対して特異的なキメラ抗体が、具体的に開示される。遺伝子の機能を決定する方法であって、遺伝子のタンパク質産物に対して特異的なキメラ抗体を、その遺伝子を発現する細胞の細胞質中に導入するステップ、および未知の機能を有する遺伝子のタンパク質産物の喪失に起因する影響をモニタリングするステップを含む方法もまた、提供される。

【0255】

キメラ抗体は、イメージング方法においても使用され得る。例えば、イメージング方法は、有効量の開示される組成物を対象に投与するステップ、および対象における結合した組成物の局在化を検出するステップを含み得る。イメージング方法の例は、上記される。

【0256】

精製の方法が提供される。薬剤を試料から精製する方法であって、試料を、組成物が薬剤に結合し、組成物／薬剤複合体を形成する条件下でキメラ抗体と接触させるステップ；および薬剤を組成物／薬剤複合体から単離するステップを含み得る方法が、本明細書で開示される。例えば、組成物を、カラムに結合させることができ、試料を、試料中の薬剤が、結合した組成物に結合するのを可能にする条件下で、カラムを通過させることができる。薬剤は、引き続いて、所望の溶離剤中でカラムから溶出させることができる。精製方法は、研究方法として、および商業的方法として、有用である。例えば、かかる方法は、薬理学的化合物から夾雑物を除去する際に有用である。

【0257】

ＶＩＩ． 例示的な実施形態
非限定的な例示的な実施形態は、図２～６に示される。図２は、操作されたＶＬＲＢ：ＣＬ－ＶＬＲＢ：ＣＨ１四価単一特異性ＩｇＧキメラの実例である。四価単一特異性ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１、カッパ構造は、ヒトＩｇＧ１ ＶＨＣＨ遺伝子およびヒトＶＬＣカッパ遺伝子のＶＬおよびＶＨ配列を、ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列で置き換えることによって、高収量ＣＨＯ細胞株において組換え発現によって産生されている。

【0258】

図３Ａは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ Ｈ鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＣ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された四価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｂは、正確なＨ鎖対形成を確実にするためにノブインホール法を使用した、ＩｇＧ Ｈ鎖のうちの一方（「ノブ」Ｈ鎖）のＮ末端に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する操作された三価ＶＬＲＢ ＩｇＧの実例である。図３Ｃおよび３Ｄは、Ｈ／Ｌ鎖対のうちの一方上のＣＬおよびＣＨ１の逆転（「クロスマブ」）ならびに正確なＨ鎖対形成を確実にするための「ノブインホール」を用いた、ＩｇＧ軽鎖のうちの一方のＣ末端（３Ｃ）またはＮ末端（３Ｄ）に結合された一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するＶＬＲＢ ＩｇＧを構築するための２つの方法を示す。

【0259】

図４は、各ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合されたＶＬＲＢを有する抗ＣＤ３モノクローナル抗体から構成される操作された二価二特異性ＶＬＲＢ－ＩｇＧキメラの実例である。

【0260】

図５は、２×抗ＣＤ３ ｍＡｂ ＶＬおよびＶＨ、ならびにＣＬドメインのＣ末端に融合された２×ＶＬＲＢを有する二価抗ＣＤ３、二価ＶＬＲＢ抗体の実例であり、重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをさらに含む。

【0261】

図６は、ＶＬＲＢ－ｓｃＦＶキメラの実例であり、ＶＬＲＢドメインは、４×単一特異性、２×二特異性、１×単一特異性および１×三特異性、または１×四特異性であり得、ｓｃＦｖは、同じ（即ち、二価単一特異性）または異なり（即ち、一価二特異性）得る。

【0262】

代替的な例示的な実施形態では、上記図の抗ＣＤ３または抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメインは、抗ＣＤ８抗体（もしくはｓｃＦｖ）またはＣＤ８リガンドドメインで置換される。例示的なＣＤ８リガンドは、胸腺白血病抗原である。これらの抗体は、その全てがＣＤ８およびＣＤ３を発現する細胞傷害性Ｔ細胞を動員するが、これもまたＣＤ３を発現するがＣＤ８は発現しない調節性または他の阻害性Ｔ細胞は動員しないように設計され、好ましくは、ＣＤ４ Ｔ細胞の動員を回避する。例えば、その各々の全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Clement, et al., J Immunol., 187(2): 654-663. doi:10.4049/jimmunol.1003941 (2011)、Tsujimura, et al., International Immunology, Vol. 15, No. 11, pp. 1319-1326 doi: 10.1093/intimm/dxg131 (2003)およびＷＯ ２０１４／１６４５５３を参照されたい。

【0263】

これらの実施形態では、ＭＭ３ ＶＬＲＢは、形質細胞腫腫瘍細胞に結合し、Ｔ細胞を（ＣＤ３またはＣＤ８への結合を介して）動員および活性化して、腫瘍細胞を溶解し得る。

【0264】

例示的な非限定的な融合タンパク質には、以下の実施例で利用したものが含まれる：
（１）ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質
（ａ）二価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ Ｆｃ配列（イタリック）

【化9】

【化10】

^＊Ｃ末端リシンはCai, et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404 - 412 doi: 10.1002/bit.22933に従って除去した。

【0265】

他のＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質は、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質について以下に示されるように、ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列を新たなＶＬＲＢの配列で置き換え、上記構築物の全ての他の配列を維持することによって産生した。

【0266】

（ｂ）二価Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
シグナル配列（破線の下線）
Ｏ１３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ Ｆｃ配列（イタリック）

【化11】

^＊Ｃ末端リシンはCai, et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404 - 412 doi: 10.1002/bit.22933に従って除去した。

【0267】

（２）四価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１
（ａ）ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック）

【化12】

【0268】

（ｂ）ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇカッパＬ鎖構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇカッパＣ_Ｌ配列（イタリック）

【化13】

【0269】

（３）ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅ
正確なＨ鎖対形成を容易にするために「ノブインホール」技術を利用し、ＦｃＲ１、ＩＩおよびＩＩＩ結合をサイレンシングするためにＬＡＬＡ ＰＧ突然変異を利用するが、ＩｇＧ１抗体の望ましい血液Ｔ_１／２を付与するためにＦｃＲｎ結合は保持する。
全ての構築物は、多価ＭＭ３ ＶＬＲＢ提示を取り込むことによって腫瘍結合を増加／増強させるように、ならびに一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ提示を取り込むことによって腫瘍エンゲージメントの非存在下でのＴ細胞活性化、即ち、非特異的Ｔ細胞活性化および殺滅をもたらすＣＤ３の架橋結合を回避するように、設計される。

【0270】

（ａ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ ＦｃＲ１、ＩＩ、ＩＩＩサイレンシング変化を有する、Ｃ末端ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構築物を有する、ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ「ノブ」
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ３４４Ａ／Ｌ３４５Ａ／Ｐ４３９Ｇ（他の場所では「Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ」とも呼ばれる）「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｓ４６４Ｃ／Ｔ４７６Ｗ（他の場所では「Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ」とも呼ばれる）「ノブ」突然変異を伴ってイタリック）
ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列（二重下線）

【化14】

【0271】

（ｂ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ ＦｃＲ１、ＩＩ、ＩＩＩサイレンシング変化を有するＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ「ホール」構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ３４４Ａ／Ｌ３４５Ａ／Ｐ４３９Ｇ（他の場所では「Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ」とも呼ばれる）「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｙ４５９Ｃ／Ｔ４７６Ｓ／Ｌ４７８Ａ／Ｙ５１７Ｖ（他の場所では「Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ」とも呼ばれる）「ホール」突然変異を伴ってイタリック）

【化15】

【0272】

（４）ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：高親和性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅ
（ａ）Ｃ末端に高親和性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するＭＭ３ ＶＬＲＢノブＨ鎖
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示される「ノブ」突然変異を伴ってイタリック）
高親和性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列（二重下線）

【化16】

【0273】

（ｂ）Ｎ末端に結合された高親和性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するノブＨ鎖
シグナル配列（破線の下線）
高親和性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列（二重下線）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示される「ノブ」突然変異を伴ってイタリック）

【化17】

【化18】

【0274】

一部の実施形態では、配列番号５３は、それ自体、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖（例えば、配列番号５４）とテトラマー性抗体を形成する。

【0275】

一部の実施形態では、配列番号５５は、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖（例えば、配列番号５６）、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖（例えば、配列番号５４）とテトラマー性抗体を形成する。

【0276】

一部の実施形態では、配列番号６５は、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖（例えば、配列番号５６）、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖（例えば、配列番号５４）とテトラマー性抗体を形成する。

【0277】

一部の実施形態では、配列番号６６は、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖（例えば、配列番号５６）、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖（例えば、配列番号５４）とテトラマー性抗体を形成する。

【0278】

開示される発明は、以下の番号付きの段落によってさらに理解され得る：
段落１． １つまたは複数の可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＨ１免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）またはＣＬ免疫グロブリンドメイン（ＣＬ）とを含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢが、融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、またはそれらの組合せにある、重鎖融合タンパク質。
段落２． 免疫グロブリンヒンジドメイン（ヒンジ）をさらに含む、段落１に記載の重鎖融合タンパク質。
段落３． ＣＨ２免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２）をさらに含む、段落１または２に記載の重鎖融合タンパク質。
段落４． ＣＨ３免疫グロブリンドメイン（ＣＨ３）をさらに含む、段落１から３のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落５． ＣＨ４免疫グロブリンドメイン（ＣＨ４）をさらに含む、段落１から４のいずれか一つに記載の重鎖融合物。
段落６． 第２の（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインをさらに含む、段落１から５のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落７． 免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）をさらに含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＨが、前記融合タンパク質のＮ末端にあり、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインとＶＨドメインとが、前記融合タンパク質の異なる末端に融合されている、段落１から６のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落８． 必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）のうちの１つまたは複数をさらに含む重鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記融合タンパク質の異なる末端にある、段落１から７のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落９． 表１のドメイン構造を含む、段落１から９のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１０． ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと表１の構造とを含む重鎖融合タンパク質。
段落１１． 前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインの一方または両方が、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によって発現される抗原に結合する、段落１から１０のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１２． 前記ＶＨ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲのうちの１つまたは複数が、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、段落８から１１のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１３． 前記免疫グロビンドメインの各々が、哺乳動物、必要に応じてヒトの、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれらに対して７０％の配列同一性を有するそのバリアントから独立して選択される、段落１から１２のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１４． 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／もしくはＩｇＧ４である、ならびに／または前記ＩｇＡが、ＩｇＡ１および／もしくはＩｇＡ２である、段落１３に記載の重鎖融合タンパク質。
段落１５． Ｎ末端および／またはＣ末端のＶＬＲＢドメインと共に、構造ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３またはＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、段落１から１４のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１６． 前記ＣＬドメインが、配列番号２３もしくは２４、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントである、段落１から１５のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１７． 前記ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３が、配列番号２５、２６、６２、６３もしくは６４のＣＨ１、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３の配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、段落１から１６のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１８． 配列番号２５、２６、６２、６３、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、段落１から１７のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落１９． シグナル配列ありもしくはなしの配列番号５３、５５もしくは５６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、配列番号５３、５６または５６と比較して突然変異されていない、段落１から１８のいずれか一つに記載の重鎖融合タンパク質。
段落２０． シグナル配列ありまたはなしの配列番号５３、５５または６５のうちの１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合タンパク質。
段落２１． １つまたは２つの可変リンパ球受容体Ｂ（ＶＬＲＢ）抗原結合ドメインとＣＬまたはＣＨ１ドメインとを含む軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、同じまたは異なり、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、ＣＬもしくはＣＨ１ドメインのＮ末端、前記ＣＬもしくはＣＨ１ドメインのＣ末端、またはそれらの組合せにある、軽鎖融合タンパク質。
段落２２． 必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲをさらに含む軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記融合タンパク質の異なる末端にある、段落２１に記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２３． 表２のドメイン構造を含む、段落２２に記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２４． １つまたは複数のＶＬＲＢ抗原結合ドメインと表２のドメイン構造とを含む軽鎖融合タンパク質。
段落２５． 前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、段落２１から２４のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２６． 前記免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲが、がんもしくは腫瘍抗原または免疫細胞によってその上に発現される抗原に結合する、段落２２から２５のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２７． 前記免疫グロビンドメインの各々が、哺乳動物、必要に応じてヒトの、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれに対して７０％の配列同一性を有するそのバリアントから独立して選択される、段落１から２６のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２８． 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／もしくはＩｇＧ４である、ならびに／または前記ＩｇＡが、ＩｇＡ１および／もしくはＩｇＡ２である、段落２７に記載の軽鎖融合タンパク質。
段落２９． １つもしくは２つの前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインまたは１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインと、必要に応じて、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端の免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）、ＳｃＦｖ、ＶＨＨ、ＬまたはＲとからなる軽鎖融合タンパク質であって、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインと一価もしくは多価単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ＶＨＨ、ポリペプチドリガンド（Ｌ）またはポリペプチド受容体（Ｒ）とが、前記ＣＬまたはＣＨドメインのＮ末端およびＣ末端に融合されている、段落２１から２８のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落３０． 前記ＣＬドメインが、配列番号２３もしくは２４、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントである、段落２１から２９のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落３１． 前記ＣＨ１が、配列番号２５、２６、６２、６３、６４、６５もしくは６６のＣＨ１の配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、段落２１から２９のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落３２． 配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、段落２１から３１のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落３３． シグナル配列ありもしくはなしの配列番号５４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖融合タンパク質であって、必要に応じて、前記ＶＬＲＢ抗原結合ドメインが、配列番号５４と比較して突然変異されていない、段落１から１８のいずれか一つに記載の軽鎖融合タンパク質。
段落３４． シグナル配列ありまたはなしの配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合タンパク質。
段落３５． それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴをさらに含む、段落１から２０のいずれか一つに記載の重鎖および／または段落２１から３３のいずれか一つに記載の重鎖。
段落３６． 段落１から３４のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
段落３７． 発現制御配列をさらに含む、段落３６に記載の核酸。
段落３８． 段落３６または３７に記載の核酸を含む細胞。
段落３９． 段落１から２０のいずれか一つに記載の２つの重鎖融合タンパク質および段落２１から３４のいずれか一つに記載の２つの軽鎖融合タンパク質を含むキメラ抗体。
段落４０． 前記２つの重鎖融合タンパク質が同じである、段落３９に記載の抗体。
段落４１． 前記２つの重鎖融合タンパク質が異なる、段落３９に記載の抗体。
段落４２． 前記２つの軽鎖融合タンパク質が同じである、段落３９から４１のいずれか一つに記載の抗体。
段落４３． 前記２つの軽鎖融合タンパク質が異なる、段落３９から４２のいずれか一つに記載の抗体。
段落４４． 単一特異性である、段落３９から４３のいずれか一つに記載の抗体。
段落４５． 二特異性である、段落３９から４３のいずれか一つに記載の抗体。
段落４６． 多特異性である、段落３９から４３のいずれか一つに記載の抗体。
段落４７． 表３、表４、または図２、３Ａ～３Ｄ、４、５もしくは６のうちのいずれかに記載の構造を含む、段落３９から４７のいずれか一つに記載の抗体。
段落４８． それ自体、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号５３を含むキメラ抗体。
段落４９． 少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体を形成する配列番号５５を含む、キメラ抗体。
段落５０． 少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号６５を含む、キメラ抗体。
段落５１． 少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含むキメラ抗体であって、必要に応じて、ＭＭ３ ＶＬＲＢホールＨ鎖、必要に応じて配列番号５６、および／または１つもしくは複数のＭＭ３ ＶＬＲＢ Ｌ鎖、必要に応じて配列番号５４とテトラマー性抗体構造を形成する配列番号６６を含む、キメラ抗体。
段落５２． 表１から独立して選択される２つの重鎖および表２から独立して選択される２つの軽鎖を含むキメラ抗体であって、少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗体。
段落５３． 表３、表４、または図２、３Ａ～３Ｄ、４、５もしくは６のうちのいずれかに記載の構造を含むキメラ抗体であって、少なくとも１つのＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗体。
段落５４． ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に融合されたＶＬＲＢ抗原結合ドメインのダイマーを含むキメラ抗体。
段落５５． 配列番号５１または５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のダイマーを含む、段落５４に記載の抗体。
段落５６． がんまたは腫瘍抗原に結合することができる、段落３９から５５のいずれか一つに記載の抗体。
段落５７． 免疫細胞に結合することができる、段落３９から５６のいずれか一つに記載の抗体。
段落５８． がんまたは腫瘍抗原および免疫細胞の両方に結合することができる、段落３９から５７のいずれか一つに記載の抗体。
段落５９． 前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージである、段落５７または５８に記載の抗体。
段落６０． 抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性を有する、段落３９から５９のいずれか一つに記載の抗体。
段落６１． Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、標的細胞のＴ細胞による殺滅、またはそれらの組合せを誘導することができる、段落３９から６２のいずれか一つに記載の抗体。
段落６２． それにコンジュゲートされた活性薬剤カーゴを含む、段落３９から６１のいずれか一つに記載の抗体。
段落６３． 段落３９から６２のいずれか一つに記載の抗体を含む組成物。
段落６４． それを必要とする対象において治療結果または診断結果を誘導するための有効量の、段落６３に記載の組成物。
段落６５． 非経口または経腸投与に適切な製剤における、段落６３または６４に記載の組成物。
段落６６． それを必要とする対象を処置する方法であって、段落６３から６５のいずれか一つに記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
段落６７． それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、段落６３から６５のいずれか一つに記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
段落６８． がんについて対象を処置する方法であって、段落６３から６５のいずれか一つに記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
段落６９． 前記抗体が、前記がんの細胞に結合する、段落６８に記載の方法。
段落７０． 感染症について対象を処置する方法であって、段落６３から６５のいずれか一つに記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
段落７１． 前記抗体が、感染細胞に結合する、段落７０に記載の方法。
段落７２． 前記抗体が、１つまたは複数の免疫細胞型に結合する、段落６６から７１のいずれか一つに記載の方法。
段落７３． 抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性から選択される免疫応答を含む、段落６６から７２のいずれか一つに記載の方法。
段落７４． 前記抗体が、Ｔ細胞に対して特異的な抗ＣＤ３抗原結合ドメイン／抗体を含む、または抗ＣＤ８抗原結合ドメインもしくはＣＤ８リガンドＴＬ抗原を含み、細胞傷害性Ｔ細胞に対して特異的である、上述の段落のいずれか。
段落７５． 前記ＶＬＲＢドメインのうちの１つまたは複数が、抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ８抗原結合ドメインを含むＳｃＦｖドメインまたはＣＤ８リガンドと必要に応じて組み合わされたＭＭ３ ＶＬＲＢ抗原結合ドメインであり、必要に応じて、前記リガンドが胸腺白血病抗原である、上述の段落のいずれかの融合タンパク質および／または抗体。
段落７６． 配列番号２２または配列番号３４の抗ＣＤ３結合ドメインを含む、上述の段落のいずれか。
段落７７． 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、４、５または６のうちのいずれか１つの構造を有する、段落６８から７０のいずれか一つに記載の抗体。
段落７８． ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３に融合されたＶＬＲＢ抗原結合ドメインを含む融合タンパク質。
段落７９． 配列番号５１または５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、段落７８に記載の融合タンパク質。

【実施例】

【0279】

（実施例１）
キメラＶＬＲＢ－ＩｇＧ抗体の構築、およびその結合、およびそれによる免疫応答モジュレーション
材料および方法
細胞および試薬。
全てのヒト造血細胞株は、Ｍ．Ｃｏｏｐｅｒ（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）によって提供され、グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン、５０μＭ ２－メルカプトエタノールおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で培養した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で加湿雰囲気中で維持した。非特定化した抗凝固剤処置したヒト血液試料および血清は、Ｙｅｒｋｅｓ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供された。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）勾配培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８０１）での密度勾配遠心分離によって単離した。細胞表面抗原ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５およびＣＤ６９に対するマウスモノクローナルＡｂ；ＣＤ３８特異的治療的抗体Ｄａｒｚａｌｅｘ（ダラツムマブ（daratumummab））ならびにフルオロフォア標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂは、商業的に調達した。

【0280】

モノクローナルＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１およびＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１融合タンパク質。
モノクローナルＶＬＲＢ Ａｂ ＭＭ３（Yu, et al., "Identification of human plasma cells with a lamprey monoclonal antibody." JCI Insight. 2016;1(3). Epub 2016/05/07. doi: 10.1172/jci.insight.84738. PubMed PMID: 27152361; PMCID: PMC4854299.）、Ｎ８（Chan, et al., "A tyrosine sulfation-dependent HLA-I modification identifies memory B cells and plasma cells." Sci Adv. 2018;4(11):eaar7653. Epub 2018/11/13. doi: 10.1126/sciadv.aar7653. PubMed PMID: 30417091; PMCID: PMC6221509.）およびＯ１３（Collins, et al., "Structural Insights into VLR Fine Specificity for Blood Group Carbohydrates." Structure. 2017;25(11):1667-78 e4. Epub 2017/10/11. doi: 10.1016/j.str.2017.09.003. PubMed PMID: 28988747; PMCID: PMC5677568.）の単離および結合特性は、以前に記載されている。二価ＭＭ３、Ｎ８およびＯ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃならびに四価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１融合タンパク質（図７および８）、ならびにＭＭ３ ＶＬＲＢ：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）（図９）は、Ｃｕｒｉａ－ＬａｋｅＰｈａｒｍａが彼らのＴｕｎａＣＨＯ（商標）組換えタンパク質発現技術を用いて産生し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養培地から精製した。ＢｉＴｅ設計は、正確なＨ鎖対形成を容易にするための「ノブインホール」突然変異（Carter, et al., "Bispecific IgG by Design." J. Immunol. Meth. 248: 7 - 15, (2001)）ならびにＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩおよびＦｃＲＩＩＩ結合をサイレンシングするための「ＬＡＬＡ ＰＧ」突然変異（Lo, et al., "Effector-Attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice." J. Biol. Chem. 292: 3900 - 3908, (2017)）を取り込んでいる。

【0281】

ＢｉＴｅ構造は、腫瘍細胞結合を改善するために設計されたＭＭ３ ＶＬＲＢについては四価であり、ＭＭ３ ＶＬＲＢ腫瘍細胞エンゲージメントの非存在下でＣＤ３の架橋結合およびＴ細胞活性化を回避するために設計された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖについては一価である。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列は、ＷＯ ２００７／０７３４９９Ａ２の配列識別子６５からである。ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列は、米国特許第１０，１６７，３３０号Ｂ２の配列識別子５７からである。

【0282】

Ｏ１３ ＶＬＲＢ抗体は、ヒトＯ血液型２型Ｈ三糖抗原（Ｈ３）、フコースβ１，２ガラクトースβ１，４ Ｎ－アセチルグルコサミンを認識する。

【0283】

他に示さない限り、全ての構築物のための遺伝子は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａが合成し、コードされるタンパク質は、彼らの独占所有権のあるベクター／ＣＨＯ細胞組換えタンパク質発現技術を用いた一過的発現によって産生し、プロテインＡクロマトグラフィーによって培養培地から精製した。

【0284】

（１）ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質
（ａ）二価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ Ｆｃ配列（イタリック）

【化19】

^＊Ｃ末端リシンはCai, et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404 - 412 doi: 10.1002/bit.22933に従って除去した。

【0285】

他のＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質は、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質について以下に示されるように、ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列を、新たなＶＬＲＢの配列で置き換え、上記構築物の全ての他の配列を維持することによって産生した。

【0286】

（ｂ）二価Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
シグナル配列（破線の下線）
Ｏ１３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ Ｆｃ配列（イタリック）

【化20】

【化21】

^＊Ｃ末端リシンはCai, et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404 - 412 doi: 10.1002/bit.22933に従って除去した。

【0287】

（２）四価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１
（ａ）ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック）

【化22】

【0288】

（ｂ）ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇカッパＬ鎖構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇカッパＣ_Ｌ配列（イタリック）

【化23】

【0289】

（３）ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅ
正確なＨ鎖対形成を容易にするために「ノブインホール」技術を利用し、ＦｃＲ１、ＩＩおよびＩＩＩ結合をサイレンシングするためにＬＡＬＡ ＰＧ突然変異を利用するが、ＩｇＧ１抗体の望ましい血液Ｔ_１／２を付与するためにＦｃＲｎ結合は保持する。

【0290】

全ての構築物は、多価ＭＭ３ ＶＬＲＢ提示を取り込むことによって腫瘍結合を増加／増強させるように、ならびに一価抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ提示を取り込むことによって腫瘍エンゲージメントの非存在下でのＴ細胞活性化、即ち、非特異的Ｔ細胞活性化および殺滅をもたらすＣＤ３の架橋結合を回避するように、設計される。

【0291】

（ａ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ ＦｃＲ１、ＩＩ、ＩＩＩサイレンシング変化を有する、Ｃ末端ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構築物を有する、ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ「ノブ」
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ３４４Ａ／Ｌ３４５Ａ／Ｐ４３９Ｇ（他の場所では「Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ」とも呼ばれる）「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｓ４６４Ｃ／Ｔ４７６Ｗ（他の場所では「Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ」とも呼ばれる）「ノブ」突然変異を伴ってイタリック）
ＴＲ６６抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列（二重下線）

【化24】

【化25】

【0292】

（ｂ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ ＦｃＲ１、ＩＩ、ＩＩＩサイレンシング変化を有するＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ「ホール」構築物
シグナル配列（破線の下線）
ＭＭ３ ＶＬＲＢ配列（太字）
リンカー配列（小文字）
ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３配列（イタリック／太字／一重下線で示されるＬ３４４Ａ／Ｌ３４５Ａ／Ｐ４３９Ｇ（他の場所では「Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ」とも呼ばれる）「ＬＡＬＡ ＰＧ」ＦｃＲ１、ＲＩＩ、ＲＩＩＩサイレンシング；Ｙ４５９Ｃ／Ｔ４７６Ｓ／Ｌ４７８Ａ／Ｙ５１７Ｖ（他の場所では「Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ」とも呼ばれる）「ホール」突然変異を伴ってイタリック）

【化26】

【化27】

【0293】

組換え融合タンパク質の純度を、ＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラフィーによって評価し、分子量を、還元性および非還元性ＳＤＳゲル電気泳動によって決定した。組換え融合タンパク質についての収量、純度、分子量および吸光係数は、表１０に示される。

【0294】

【表10】

【0295】

結合アッセイ。
細胞へのＶＬＲＢ融合タンパク質および他のＡｂ試薬の結合を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ １０ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いるフローサイトメトリーによってアッセイした。二価ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃおよび四価ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１融合タンパク質およびダラツムマブを、Ｚｅｎｏｎ（商標）ヒトＩｇＧ標識キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｚ２５４０２）を使用して、フルオロフォアで直接標識した。細胞を、ブロッキング緩衝液（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号００６０－０１）と共に氷上で２０分間インキュベートし、スナップキャップ細胞ストレイナー（Ｖｅｎｄｏｒ、カタログ番号６０８１９－５２４）で裏ごしし、１ウェル当たり４００，０００細胞で９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、３００×ｇで４℃で５分間の遠心分離によって単離した。細胞を、示された濃度のフルオロフォア標識ＶＬＲＢ融合タンパク質を含有する１００μＬ ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中に再懸濁し、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で氷上で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリー分析前に冷ＰＢＳ－２％ＦＢＳで２回洗浄した。他のＡｂ試薬については、マイクロタイタープレートウェル中の細胞を、示された濃度の未標識のＡｂ試薬を含有するＰＢＳ－２％ＦＢＳ １００μＬによって、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で氷上で３０分間再懸濁し、その後、結合したＡｂ試薬を、フルオロフォア標識ヤギ抗マウスＡｂで検出した。死細胞は、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）の含有によって排除した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。

【0296】

補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。
ＶＬＲＢ融合タンパク質および他のＡｂによる補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の活性化を、死細胞を定量化するためのＰＩ染色を用いたフローサイトメトリーによって評価した。示された濃度のＶＬＲＢ融合タンパク質および他のＡｂを、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で示された数の標的細胞と共に氷上で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ－２％ＦＢＳで１回洗浄し、補体の供給源として０％、２０％または４０％のヒト血清を含有するＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁し、ＰＩによる染色およびフローサイトメトリー分析の前に、３７℃および５％ＣＯ_２で加湿雰囲気中で４時間インキュベートした。

【0297】

抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ。
ＶＬＲＢ融合タンパク質および他のＡｂによる抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を、細胞培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７０１５）を用いて検出することによって、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を用いて評価した。示された濃度のＶＬＲＢ融合タンパク質または他のＡｂを、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で示された数の標的細胞と共に氷上で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ－２％ＦＢＳで洗浄し、示された数の、ＮＦＡＴ誘導されるルシフェラーゼに連結されたヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８（高親和性）を安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞を含有する完全培地中に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ_２で加湿雰囲気中で６時間インキュベートした。発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）Ｏｍｅｇａマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。

【0298】

ＰＢＭＣの活性化アッセイ。
ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅタンパク質によるヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞の活性化を、ＰＢＭＣ Ｔ細胞ＣＤ２５およびＣＤ６９細胞表面発現のフローサイトメトリー測定によって、Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３ ＮＦＡＴ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｊ１６２１）を用いて評価した。Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３ ＮＦＡＴ細胞を用いるアッセイは、キットの使用説明書に従った。ヒトＰＢＭＣを用いるアッセイについて、示された濃度のＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅタンパク質を、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で示された数の標的細胞と共に氷上で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ－２％ＦＢＳで１回洗浄し、次いで、示された数のＰＢＭＣを含有する完全培地中に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ_２で加湿雰囲気中で一晩インキュベートし、その後、ＣＤ２５およびＣＤ６９の両方の細胞表面タンパク質を用いて測定されるような、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のＰＢＭＣ Ｔ細胞の活性化を可視化するための、抗ＣＤ２５および抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５および抗ＣＤ８、抗ＣＤ６９および抗ＣＤ４、ならびに抗ＣＤ６９および抗ＣＤ８のＡｂ組合せを用いて染色した。

【0299】

標的細胞の細胞傷害性Ｔ細胞による殺滅の活性化。
ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅによる標的細胞の細胞傷害性Ｔ細胞による殺滅の活性化を、細胞培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７０１５）を用いて検出することによって、Ｔ細胞およびＤａｕｄｉ標的細胞の供給源としてのヒトＰＢＭＣを用いて評価した。示された濃度のＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅタンパク質を、ＰＢＳ－２％ＦＢＳ中で示された数の標的細胞と共に氷上で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳ－２％ＦＢＳで洗浄し、次いで、示された数のヒトＰＢＭＣを含有する完全培地中に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ_２で加湿雰囲気中で４時間インキュベートした。発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）Ｏｍｅｇａマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。

【0300】

結果
ＶＬＲＢ Ｉｇ融合タンパク質の結合特性。
ＭＭ３、Ｎ８およびＯ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１ならびにＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）融合タンパク質の結合特性を、フローサイトメトリーによって評価した。結果は表１１に要約され、例となるフローサイトメトリーデータは、図１０～１３に示される。硫酸化チロシン改変されたＨＬＡクラス１抗原に対するＮ８ ＶＬＲＢの特異性（Chan, et al. "A tyrosine sulfation-dependent HLA-I modification identifies memory B cells and plasma cells." Sci Adv. 2018;4(11):eaar7653. Epub 2018/11/13. doi: 10.1126/sciadv.aar7653. PubMed PMID: 30417091; PMCID: PMC6221509.）、Ｏ血液型２型Ｈ三糖抗原に対するＯ１３ ＶＬＲＢの特異性（Collins, et al., "Structural Insights into VLR Fine Specificity for Blood Group Carbohydrates." Structure. 2017;25(11):1667-78 e4. Epub 2017/10/11. doi: 10.1016/j.str.2017.09.003. PubMed PMID: 28988747; PMCID: PMC5677568.）およびＣＤ３８のより高次の構造、例えば、テトラマーに対するＭＭ３ ＶＬＲＢの特異性（Yu, et al., "Identification of human plasma cells with a lamprey monoclonal antibody." JCI Insight. 2016;1(3). Epub 2016/05/07. doi: 10.1172/jci.insight.84738. PubMed PMID: 27152361; PMCID: PMC4854299.）は、記載されている。表１１および図１０～１３に示されるこれらのＶＬＲＢ融合タンパク質の細胞株結合特異性は、「親」ＶＬＲＢ抗体について報告されたデータと一致している。

【0301】

ＣＤ３８を発現することが公知の全ての細胞株は、ダラツムマブおよび抗ＣＤ３８ ＨＩＴ ｍＡｂによる結合について陽性である。高い量のＣＤ３８を発現する細胞株であるＤａｕｄｉおよびＲａｊｉは、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ ＦｃおよびＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１による結合についても陽性であるが、低レベルのＣＤ３８を発現するＢＪＡＢなどの細胞株は、ＭＭ３ ＶＬＲＢ結合について陰性である。四価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１の結合は、二価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの結合よりも優れている。結合の特異性は、全ての抗ＣＤ３８試薬によるＫＭＳ－１１ ＣＤ３８^－細胞への結合の非存在によって、Ｎ８試薬についてはＤａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＢＪＡＢ Ｎ８^－細胞への結合の非存在によって、ならびにＮ８^＋ＫＭＳ－１１細胞への、弱くはあるがＮ８ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの結合によって、支持される；最後に、ＭＭ３は、ＣＤ３８がより高次の構造、即ち、テトラマーを形成する場合に創出される「ネオトープ（ｎｅｏｔｏｐｅ）」を認識する可能性が高く、高いＣＤ３８発現が、ＭＭ３ ＶＬＲＢ検出可能なＣＤ３８テトラマーの形成を質量作用を介して駆動するために必要である可能性が高い。

【0302】

ＣＤＣおよびＡＤＣＣ免疫エフェクター機能の活性化。
図１４Ａ～１４Ｃは、ＶＬＲＢ融合タンパク質によるＣＤＣおよびＡＤＣＣ免疫エフェクター機能の活性化を測定するためのアッセイの結果を報告する。試験したタンパク質量（０．５μｇ）および補体量（２０％ヒト血清）では、二価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃも四価ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ヒトＩｇＧ１融合タンパク質も、検出可能なＣＤＣ活性化活性を実証しなかった（図１４Ａ）。四価ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１融合タンパク質（図１４Ｂ）は、陽性対照ダラツムマブＩｇＧ１抗体よりもかなり低い効力でではあるが、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６ａ）媒介性ＡＤＣＣエフェクター機能の活性化を実証したが、二価ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（図１４Ｃ）は実証しなかった。ＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ１ Ｆｃ構造と比較してＭＭ３ ＶＬＲＢ_４ ＩｇＧ１構造の増加した価数および結合力増強された見掛けの親和性は、陽性対照抗ＣＤ３８ ＩｇＧ１ ｍＡｂダラツムマブで達成されたものよりもかなり低いものの、ＣＤ１６ａの安定な結合および架橋結合のためのＩｇＧ１ Ｆｃ結合部位のより高い密度を生じるようである。

【0303】

ＭＭ３ ＶＬＲＢ融合タンパク質のエフェクター活性の非存在または低いエフェクター活性は、Ｏ１３ ＶＬＲＢ_２ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質の強力なＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性化特性によって示されるように、ＶＬＲＢ ＩｇＧ融合タンパク質の固有の特性ではない（図１５Ａ～１５Ｂ）。Ｏ１３ ＶＬＲＢ標的である血液型Ｏ ２型Ｈ三糖グリカン抗原は、以下のためにＯ１３ ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ１ Ｆｃ結合部位を「凝集させる」のに十分な密度で、ＫＭＳ－１２およびＫＭＳ－１８細胞の表面上に存在する：（ａ）細胞溶解のための抗体媒介性「古典的」補体経路を開始させるための補体Ｃ１ｑ成分の安定な結合、および（ｂ）標的細胞の溶解を活性化するための、ＣＤ１６ａ Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）の安定な結合および架橋結合；一方で、Ｄａｕｄｉ（および他の）細胞のＭＭ３ ＶＬＲＢ標的であるＣＤ３８テトラマーの細胞表面密度は、安定な結合または架橋結合のためにＭＭ３ ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ１ Ｆｃ Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩ結合部位を凝集させるには不適切である。ＢＪＡＢ細胞上に存在はするものの、Ｈ三糖は、ＫＭＳ－１２および１８細胞上よりもＢＪＡＢ細胞上でかなり存在量が低く（図１３）、その密度は、ＢＪＡＢ標的細胞によってＡＤＣＣを完全に活性化するには不十分であること（図１５Ｂ）に留意されたい。

【0304】

ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ Ｔ細胞活性化。
ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅによるＴ細胞の活性化を、Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３ ＮＦＡＴエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｊ１６２１）を用いて（図１６）、およびＰＢＭＣ Ｔ細胞のＣＤ２５およびＣＤ６９細胞表面発現のフローサイトメトリー測定によってヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞を用いて（図１７Ａ～１７Ｄ）、評価した。アッセイで利用した標的細胞は、図に示される通りである。ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅによる、Ｄａｕｄｉ標的細胞と共に、Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ／ＣＤ３ ＮＦＡＴ細胞細胞の活性化は、陽性対照ブリナツモマブ抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：抗ＣＤ３ ＢｉＴｅによる活性化と匹敵し、これは、ＣＤ１９発現が、Ｄａｕｄｉ細胞によるＭＭ３ ＣＤ３８テトラマー標的の発現に匹敵することを示している。ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅの分子量は、ブリナツモマブの分子量よりも４倍超大きく、等しい重量の２つのＢｉＴｅは、ブリナツモマブの４分の１未満のモル濃度量のＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅに対応することに留意されたい。種々の標的細胞株を用いたＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅの活性化効力は、これらの細胞株に対するテトラマー性ＭＭ３ ＶＬＲＢヒトＩｇＧ１融合タンパク質の結合強度に従い（表１１を参照されたい）、これは、ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅのＴ細胞活性化活性が、分子標的発現密度によって決定されることを示している。ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＭ３^ｈｉ標的／アクチベーターＤａｕｄｉ細胞が存在する場合にのみ、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅによって細胞表面ＣＤ２５を発現するように活性化され、存在する場合には、ＣＤ２５細胞表面発現によって測定される最小限の活性化は、ＭＭ３^ｌｏＲａｊｉ細胞が含まれる他の標的／アクチベーター細胞を用いて検出され、即ち、ＣＤ２５細胞表面発現を用いて測定される、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１によるＴ細胞活性化は、抗原特異的である（図１７Ａ～１７Ｄ）。ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＭ３^ｈｉ標的Ｄａｕｄｉ細胞およびＭＭ３^ｌｏ標的Ｒａｊｉ細胞が存在する場合には、ＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅによって細胞表面ＣＤ６９を発現するように活性化されるが、ＭＭ３^－ＢＪＡＢ標的細胞が存在する場合にはそうではない。ＣＤ６９細胞表面発現によって測定され、ＣＤ２５細胞表面発現によってより低い程度まで測定されるヒトＰＢＭＣ ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化は、ＫＭＳ－１１ ＭＭ３^－標的細胞の存在下でＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１ ＢｉＴｅを用いて見られ、これは、ＫＭＳ－１１細胞が、「正常」ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８ Ｔ細胞によって認識され得、それを活性化することができることを示している。ＣＤ６９の細胞表面発現は、ＣＤ２５の細胞表面発現よりも感度の高い、またはより特異性の低い、Ｔ細胞活性化の指標であるようである。

【0305】

Ｔ細胞による殺滅のＭＭ３ ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖヒトＩｇＧ１活性化。
Ｄａｕｄｉ標的細胞を溶解するヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞の活性化についての結果は、図１８に示される。示されるように、ＭＭ３ ＶＬＲＢ ＢｉＴｅは、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を用量依存的に「武装させ」て、Ｄａｕｄｉ細胞を殺滅する。

【0306】

【表11】

要約
１）ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ Ｆｃ、ＶＬＲＢ_４ ＩｇＧおよびＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＩｇＧ融合タンパク質は、従来の組換えタンパク質産生法を用いて許容される収量で産生され得、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて許容される純度まで精製され得る（表１０）。
２）ＶＬＲＢ ＩｇＧ融合タンパク質は、親ＶＬＲＢ抗体の結合特性を保持する（表１１および図１０Ａ～１３）。
３）ＶＬＲＢ_４ ＩｇＧ融合タンパク質は、ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と比較して、優れた結合を実証している（表１１および図１０Ａ～１０Ｃ）。
４）ＶＬＲＢ_４ ＩｇＧ融合タンパク質は、ＶＬＲＢ_２ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と比較して、免疫エフェクター機能、例えば、ＣＤＣおよびＡＤＣＣの優れた活性化を実証している（図１４Ａ～１４Ｃ）。
５）ＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＩｇＧ ＢｉＴｅは、ＶＬＲＢ抗体によって認識される分子標的とＣＤ３^＋Ｔ細胞との両方に結合する（図１１および１２）。
６）ＶＬＲＢ抗体によって認識される標的を発現する細胞への、およびＣＤ３^＋Ｔ細胞へのＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＩｇＧ ＢｉＴｅの結合は、ＶＬＲＢ抗体によって認識される細胞を溶解するようにＴ細胞を活性化する。
７）ＣＤ３^＋ Ｔ細胞単独へのＶＬＲＢ_４：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＩｇＧ ＢｉＴｅの結合は、ＶＬＲＢ抗体によって認識されない他の細胞を溶解するようにＴ細胞を活性化することはない、即ち、ＶＬＲＢ ＢｉＴｅによるＴ細胞活性化は、ＶＬＲＢ抗体によって認識される抗原に対して抗原特異的である。

【0307】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそれらがそのために引用されている材料は、参照によって具体的に組み込まれる。

【0308】

当業者は、慣用に過ぎない実験を使用して、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識する、または確認することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含される意図である。

【図1A-D】

【図2】

【図3A-B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A-B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A-C】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17A-B】

【図17C-D】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】