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▶ リネージ セル セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】網膜色素上皮細胞の増殖
(51)【国際特許分類】
C12N 5/079 20100101AFI20240719BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240719BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240719BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20240719BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20240719BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C12N5/079
C12N5/071
A61P27/02
A61L27/38 300
A61K35/30
A61K35/545
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505024
(86)(22)【出願日】2022-07-27
(85)【翻訳文提出日】2024-03-05
(86)【国際出願番号】 US2022038594
(87)【国際公開番号】W WO2023009676
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】63/226,741
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519336241
【氏名又は名称】リネージ セル セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ハユーン ネーマン ダナ
(72)【発明者】
【氏名】ワイザー オフェル
(72)【発明者】
【氏名】ティコツキ ラビド
(72)【発明者】
【氏名】アロン リラック
【テーマコード（参考）】
4B065
4C081
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB19
4B065BB34
4B065BC11
4B065BC14
4B065BC41
4B065BD50
4B065CA44
4C081AB21
4C081BA12
4C081CD34
4C081EA02
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB56
4C087BB65
4C087CA04
4C087DA32
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
懸濁性細胞支持マトリックスを使用してＲＰＥ細胞を増殖させるための方法及び組成物が本明細書にて提示される。ＲＰＥ細胞を含有する医薬組成物、及びＲＰＥ細胞を使用して眼の障害又は疾患を処置する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を増殖させるための方法であって、ａ）多能性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の集団を提供する工程と；
ｂ）第１の懸濁性細胞支持マトリックスを含む培地に前記ＲＰＥ細胞の集団を接種する工程と；
ｃ）動的懸濁状態にて前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス上で前記ＲＰＥ細胞の集団を増殖させて、増殖したＲＰＥ細胞の集団を提供する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ａ）より前に静的条件下にて固体表面上で増殖したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記固体表面が培養プレートを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ａ）より前に動的条件下にて固体表面上で増殖したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記固体表面が、第２の懸濁性細胞支持マトリックスを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記固体表面がコーティングされている、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ａ）より前に、１継代の間、静的条件下にて前記固体表面上で増殖したものである、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記固体表面上での増殖のための前記ＲＰＥ細胞の集団が、中間細胞バンクから得られたものである、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記懸濁性細胞支持マトリックスがマイクロキャリアを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＲＰＥ細胞の集団が中間細胞バンクから提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の懸濁性細胞支持マトリックスがコーティングされていない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＲＰＥ細胞の集団の多能性幹細胞からの分化が、ｉ．多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の多能性を維持する条件下にて固体表面上で増殖させて、増殖した多能性幹細胞を提供する工程と；
ｉｉ．前記増殖した多能性幹細胞を、分化誘導剤及び任意で成長因子を含む培地中で一定期間分化させて、前記ＲＰＥ細胞の集団を提供する工程と
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記固体表面が培養プレートである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記固体表面が第２の懸濁性細胞支持マトリックスを含み、前記多能性幹細胞が動的培養で増殖する、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
工程ｉｉが、前記増殖した多能性幹細胞を、動的培養にて第３の懸濁性細胞支持マトリックス上で分化させることを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程ｉからの前記増殖した多能性幹細胞が、工程ｉｉにおいて前記第２の懸濁性細胞支持マトリックスに付着したままである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記第２の懸濁性細胞支持マトリックスが第２のマイクロキャリアを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第３の懸濁性細胞支持マトリックスが第３のマイクロキャリアを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスのうちの少なくとも２つが同じである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスが異なる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
工程ｉｉが、前記増殖した多能性幹細胞を、静的培養にて培養プレート上で分化させることを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記多能性幹細胞が、前記第２の懸濁性細胞支持マトリックス及び／又は前記第３の懸濁性細胞支持マトリックスに接着した単層へと増殖する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項23】
多能性を維持するための前記条件がフィーダー細胞を含まない、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
多能性を維持するための前記条件がフィーダー細胞集団を含む、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記分化誘導試薬がニコチンアミドである、請求項１２～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記成長因子が、ＴＧＦβファミリーのメンバーである、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスが、ポリスチレン、表面が修飾されたポリスチレン、化学的に修飾されたポリスチレン、架橋デキストラン、セルロース、アクリルアミド、コラーゲン、アルギナート、ゼラチン、ガラス、ＤＥＡＥ－デキストラン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記第１のマイクロキャリア、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスが、球形、楕円形、棒状、円盤状、多孔質、非多孔質、滑らか、平坦、又はこれらの組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスが、ラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、それらの誘導体、又はこれらの組み合わせでコーティングされている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記固体表面が、コーティングされていないか、又はラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、それらの誘導体、若しくはこれらの組み合わせでコーティングされている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ｃ）において、Ｐ０の間は２～４、Ｐ１の間は２～３、及びＰ２の間は１～２の集団倍加レベルを有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ｃ）において、Ｐ０の間に、Ｐ１の間に、及びＰ２の間に、２％～２０％のヒト血清／ＤＭＥＭの存在下で播種された、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ｃ）において、Ｐ０の間に、Ｐ１の間に、及びＰ２の間に、動的培養で固体基材上に播種された、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ｃ）において、Ｐ０の間に、Ｐ１の間に、及びＰ２の間に、５０，０００個の細胞／ｃｍ２～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で、動的培養で固体基材上に播種された、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、工程ｃ）において、Ｐ０の間に、Ｐ１の間に、及びＰ２の間に、２．５ｃｍ２／ｍｌ～１０ｃｍ２／ｍｌの表面積を有する固体基材上に動的培養で播種された、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
工程ｃ）の間の増殖のための前記条件が、溶存酸素％を３０％超に維持することを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
工程ｃ）における増殖のための前記条件が、系全体の増殖チャンバー容積の５０％から始まる初期増殖培地体積を含み、系全体の増殖チャンバー容積の１６．６％の増殖培地体積が２～４日毎に添加される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記ＲＰＥ細胞が、成熟ＲＰＥ細胞の特徴を示す、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記成熟ＲＰＥ細胞が、フローサイトメトリーによって測定された場合に、９５％超で細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及びプレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）に対して二重陽性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項40】
前記成熟ＲＰＥ細胞が、正味の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞１００Ω・ｃｍ２並びにＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの極性分泌を有する極性化単層を解凍後に生成する、請求項４０に記載の方法。
【請求項41】
前記成熟ＲＰＥ細胞が凍結保存されており、解凍すれば直ちに対象に投与できる、請求項４１に記載の方法。
【請求項42】
前記成熟ＲＰＥ細胞が、高精度フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）によって確認された場合に０．０１％未満の多能性幹細胞を含み、かつフローサイトメトリーによって測定された場合にＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４について陰性である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＲＰＥ細胞が、分化後かつ製剤化までの前記ＲＰＥ細胞の増殖中の全ての継代で、及び細胞懸濁液として注射されたときに、多角形単層を生成する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記動的細胞増殖懸濁が、使い捨てバイオリアクタ内で行われる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、ニコチンアミドの存在下で増殖する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
眼の障害又は疾患を処置する方法であって、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＲＰＥ細胞を含む医薬組成物を、眼の障害又は疾患を処置することを必要とする患者の網膜組織中に移植することを含む、方法。
【請求項47】
前記眼の障害又は疾患が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）を含む遺伝性黄斑変性、又は網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記ＲＰＥ細胞の集団が、ａ）成熟ＲＰＥ細胞が、フローサイトメトリーによって測定された場合に、９５％超で細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及びプレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）に対して二重陽性であることを決定することと；
ｂ）前記成熟ＲＰＥ細胞が、正味の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞１００Ω・ｃｍ２並びにＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの極性分泌を有する極性化単層を解凍後に生成することを決定することと；
ｃ）前記成熟ＲＰＥ細胞が、高精度フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）によって確認された場合に、０．０１％未満の多能性幹細胞を含み、かつフローサイトメトリーによって測定された場合に、ＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４について陰性であることと
を含む製品リリース決定に基づいて、患者において直ちに使用できる、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記ＲＰＥ細胞が、分化後かつ製剤化までの前記ＲＰＥ細胞の増殖中の全ての継代で、及び細胞懸濁液として注射されたときに、多角形単層を生成する、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
移植用の成熟ＲＰＥ細胞の濃度が５０マイクロリットル当たり１００，０００個の細胞である、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
移植用の成熟ＲＰＥ細胞が、前記患者の網膜下腔内に注射される、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記医薬組成物が、解凍されて、注射前の細胞調製なしで対象に注射されるように、製剤化されている、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法によって生成された前記細胞を含む、医薬組成物。
【請求項54】
解凍されて、注射前の細胞調製なしで対象に注射されるように、製剤化されている、請求項５３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年７月２８日に出願された米国仮出願第６３／２２６，７４１号の優先権の恩典を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年７月２８日に出願された米国仮出願第６３／２２６，７４１号の優先権の恩典を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
背景
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、視細胞外節（ＰＯＳ）と脈絡膜脈管構造の間にあるブルッフ膜上に位置する神経上皮由来の色素細胞の単層である。ＲＰＥ単層は、視細胞の機能及び健全性にとって極めて重要である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能不全、損傷及び喪失は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）を含む遺伝性黄斑変性及び網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプなどの特定の眼疾患及び障害の顕著な特徴である。このような疾患に罹患した者の網膜へのＲＰＥ（及び視細胞）の移植は、ＲＰＥが変性した網膜疾患における細胞補充療法として使用され得る。
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、視細胞外節（ＰＯＳ）と脈絡膜脈管構造の間にあるブルッフ膜上に位置する神経上皮由来の色素細胞の単層である。ＲＰＥ単層は、視細胞の機能及び健全性にとって極めて重要である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能不全、損傷及び喪失は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）を含む遺伝性黄斑変性及び網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプなどの特定の眼疾患及び障害の顕著な特徴である。このような疾患に罹患した者の網膜へのＲＰＥ（及び視細胞）の移植は、ＲＰＥが変性した網膜疾患における細胞補充療法として使用され得る。
【0003】
ヒト胎児及び成人ＲＰＥは、同種移植のためのドナー源として使用されてきた。しかしながら、十分な組織供給を得る上での実際的な問題及び中絶された胎児由来の組織の使用に関する倫理的懸念は、これらのドナー源の広範な使用を制限する。成人及び胎児ＲＰＥ移植片の供給における制限を考慮して、代替的なドナー源の可能性が研究されてきた。
【0004】
ヒト多能性幹細胞は、移植のためのＲＰＥ細胞の供給源として著しい利点をもたらす。ヒト多能性幹細胞の多能性発生能は、ヒト多能性幹細胞が真の機能的なＲＰＥ細胞に分化することを可能にし、ヒト多能性幹細胞の無限の自己再生能を考慮すると、ヒト多能性幹細胞はＲＰＥ細胞の無限のドナー源として役立ち得る。実際、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）がインビトロでＲＰＥ細胞に分化し、網膜変性を減弱させ、網膜下移植後の視覚機能を維持し得ることが実証されている。したがって、ｈＥＳＣは、細胞療法のためのＲＰＥ細胞を生産するための無制限の供給源であり得る。
【0005】
しかしながら、ＲＰＥ細胞を用いた処置を必要とする患者の数は、世界中で２億人を超えると予測されている。必要とされる産業的同種異系ロットサイズは何十億個ものＲＰＥ細胞に増加されなければならないので、これらの膨大な数は製造上の課題を提起する。ＲＰＥ細胞などの足場依存性細胞型のための製造プラットフォームは、伝統的に二次元培養法を使用する。これらのプラットフォームは、労働集約的であり、極めて大きなフットプリントを有し、過剰なリソースを消費するので、産業製造には最適でない。制御されていない開放系であるため、汚染及びロット間の変動のリスクも高い。
【0006】
本開示は、再生医療及びＲＰＥ細胞療法の分野におけるこれら及び他の欠点に対処する。
【発明の概要】
【0007】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を増殖させるための方法、ＲＰＥ細胞の医薬組成物及び前記方法を使用して作製された医薬組成物を用いて眼の障害を処置するための方法が本明細書に記載されている。複数の態様において、疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。複数の態様において、疾患は、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）を含む遺伝性黄斑変性、又は網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプである。
【0008】
一局面において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を増殖させるための方法であって、多能性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の集団を提供することと；マイクロキャリアなどの第１の懸濁性細胞支持マトリックスを含む培地に前記ＲＰＥ細胞の集団を接種することと；動的懸濁状態にて前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス上で前記ＲＰＥ細胞の集団を増殖させて、増殖したＲＰＥ細胞の集団を提供することとを含む方法が本明細書において提供される。
【0009】
一局面において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を増殖させるための方法によって作成されたＲＰＥ細胞を含有する医薬組成物であって、前記方法は、多能性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の集団を提供することと；第１の懸濁性細胞支持マトリックスを含む培地に前記ＲＰＥ細胞の集団を接種することと；動的懸濁状態にて前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス上で前記ＲＰＥ細胞の集団を増殖させて、増殖したＲＰＥ細胞の集団を提供することとを含む、医薬組成物が本明細書において提供される。
【0010】
一局面において、眼の障害又は疾患を処置する方法であって、前記方法は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を増殖させるための方法によって作製されたＲＰＥ細胞を含有する医薬組成物を、眼の障害又は疾患を処置することを必要とする患者の網膜組織中に移植することを含み、前記方法は、多能性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の集団を提供することと；第１の懸濁性細胞支持マトリックスを含む培地に前記ＲＰＥ細胞の集団を接種することと；動的懸濁状態にて前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス上で前記ＲＰＥ細胞の集団を増殖させて、増殖したＲＰＥ細胞の集団を提供することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本明細書に記載されている技術は、例示のみを目的とする以下の図面を参照することによってより完全に理解されるであろう。
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【図20A】図２０Ａ及び２０Ｂは、スピナーフラスコ内でのＲＰＥ細胞増殖に沿って２つの栄養供給レジメンを比較するデータである。Ｐ１スピナーフラスコ（１／２培地交換によって栄養供給される）及びＴ１７５フラスコを採集し、Ｐ２のために対照Ｔフラスコ又はスピナーフラスコ内のいずれかに播種した。Ｐ１スピナーフラスコに由来する２つのスピナーフラスコを使用して、２つの栄養供給レジメン、フェドバッチ及び１／２培地交換を試験した。フェドバッチを受けるスピナーフラスコは、より高い収率を有した（図２０Ａ）。対照Ｐ１スピナーフラスコ（ＥＸＰ ２７Ｅ ＭＣ）及び２つのＰ２スピナーフラスコ（ＥＸＰ２７Ｆ ＭＣ １Ａ／２Ａ）は、フローサイトメトリー試験で同様の解凍後純度（％ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７）値を示した（図２０Ｂ）。
【0033】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
詳細な説明
この説明を読んだ後、様々な代替の態様及び代替の適用において本発明を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な態様の全てについてここでは説明しない。ここに提示される態様は、一例としてのみ提示され限定でないことが理解されよう。したがって、様々な代替の態様のこの詳細な説明は、以下に記載されている本発明の範囲又は幅を限定すると解釈されるべきではない。
この説明を読んだ後、様々な代替の態様及び代替の適用において本発明を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な態様の全てについてここでは説明しない。ここに提示される態様は、一例としてのみ提示され限定でないことが理解されよう。したがって、様々な代替の態様のこの詳細な説明は、以下に記載されている本発明の範囲又は幅を限定すると解釈されるべきではない。
【0036】
本発明を開示及び説明する前に、以下に記載される局面は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法又はその使用に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の局面を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【0037】
本発明の詳細な説明は、読者の便宜のためだけに様々なセクションに分けられており、任意のセクションに見られる開示は、別のセクションの開示と組み合わされてもよい。タイトル又はサブタイトルが、読者の便宜のために本明細書で使用され得、本発明の範囲に影響を及ぼすことを意図しない。
【0038】
急速に拡大する患者集団のニーズを満たすために、必要とされているのは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の大規模な生産である。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、インビトロで機能的ＲＰＥ細胞に一貫して分化することができることが実証されている。臨床試験における加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者におけるこのようなＲＰＥ細胞の使用は、有望な機能的回復を示す。懸濁性細胞支持マトリックス又はマイクロキャリア（ＭＣ）を使用するＲＰＥ増殖のためのプラットフォームが本明細書に開示される。接着性細胞がその上で増殖することができる表面を提供しながら溶液中に懸濁されるなどのＭＣの特性によって、ＭＣは、閉鎖された及び制御された環境で接着性細胞培養物を増殖させるのに理想的なものとなる。大規模生産のためにＭＣを使用することの別の利点は、従来の静的培養プロセスよりも大幅に増加された表面積対体積比である。したがって、必要とされる占有面積を低減させながら、細胞密度を増加させることができる。
【0039】
大規模な閉鎖された及び制御された環境においてｈＥＳＣ由来のＲＰＥを増殖させるために、懸濁性細胞支持マトリックス（例えば、限定されないが、ＳＯＬＯＨＩＬＬ（登録商標）によるＳｔａｒ－Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ）上で増殖するＲＰＥ細胞の潜在能力を使用する方法が本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載されている閉鎖された系では、分化したＲＰＥ細胞は、最適なＲＰＥ収率及び品質についてスクリーニングされる懸濁性細胞支持マトリックスを含有する単一のバイオリアクタ内に接種され得る。細胞の酸素消費は、ｐＨ、代謝産物及び温度と同様に、自動的に監視及び制御され得る。栄養供給レジメンは、必要に応じて新鮮な培地及びグルコースが添加されるフェドバッチモードで行われ得る。懸濁性細胞支持マトリックス及び培地添加、細胞サンプリング、採集及びろ過を含む全ての操作は、凍結媒体中の細胞懸濁物の最終生成物がクライオバイアル中に自動的に分注されるまで、使い捨てバッグのチューブ溶着を使用して、制御された及び閉鎖された環境で行われ得る。数千本のバイアル、１時間の凍結セッションあたり最大約２３００本のバイアルの制御された大規模凍結が達成され得る。
【0040】
定義
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、傷害、疾患、病理又は症状の治療又は改善におけるなんらかの成功の兆候を指し、あらゆる客観的又は主観的パラメータ、例えば症候の軽減、緩和、減弱、又は傷害、病理、若しくは症状を患者にとってより許容可能にすること、衰退又は衰弱の速度の低下、衰退の最終点での衰弱の重度の低下、患者の身体的又は精神的健康の改善などを含む。症候の処置又は改善は、身体検査、神経精神医学的検査、及び／又は精神医学的評価の結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づくことができる。「処置すること」という用語、及びその活用形は、傷害、病理、症状又は疾病の予防を含み得る。複数の態様において、処置することは予防することである。複数の態様において、処置することは予防することを含まない。本明細書で使用される（かつ当技術分野でよく理解されているように）「処置すること」又は「処置」はまた、臨床結果を含む、対象の症状において有益な又は所望の結果を得るための任意のアプローチを広く含む。有益な又は所望の臨床結果には、限定されないが、１つ又は複数の症候又は症状の緩和又は改善、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の伝染又は伝播の防止、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和、疾患の再発の減少及び部分的又は完全であるかどうか、検出可能又は検出不可能かどうかを問わず、寛解が含まれ得る。言い換えれば、本明細書で使用される「処置」は、疾患の治癒、改善又は予防を含む。処置は、疾患の発生を予防し、疾患の伝播を防ぎ、疾患の症候を緩和し、疾患の根本原因を完全に若しくは部分的に取り除き、疾患の期間を短縮し、又はこれらの組み合わせを行い得る。
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、傷害、疾患、病理又は症状の治療又は改善におけるなんらかの成功の兆候を指し、あらゆる客観的又は主観的パラメータ、例えば症候の軽減、緩和、減弱、又は傷害、病理、若しくは症状を患者にとってより許容可能にすること、衰退又は衰弱の速度の低下、衰退の最終点での衰弱の重度の低下、患者の身体的又は精神的健康の改善などを含む。症候の処置又は改善は、身体検査、神経精神医学的検査、及び／又は精神医学的評価の結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づくことができる。「処置すること」という用語、及びその活用形は、傷害、病理、症状又は疾病の予防を含み得る。複数の態様において、処置することは予防することである。複数の態様において、処置することは予防することを含まない。本明細書で使用される（かつ当技術分野でよく理解されているように）「処置すること」又は「処置」はまた、臨床結果を含む、対象の症状において有益な又は所望の結果を得るための任意のアプローチを広く含む。有益な又は所望の臨床結果には、限定されないが、１つ又は複数の症候又は症状の緩和又は改善、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の伝染又は伝播の防止、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和、疾患の再発の減少及び部分的又は完全であるかどうか、検出可能又は検出不可能かどうかを問わず、寛解が含まれ得る。言い換えれば、本明細書で使用される「処置」は、疾患の治癒、改善又は予防を含む。処置は、疾患の発生を予防し、疾患の伝播を防ぎ、疾患の症候を緩和し、疾患の根本原因を完全に若しくは部分的に取り除き、疾患の期間を短縮し、又はこれらの組み合わせを行い得る。
【0041】
本明細書で使用される「処置すること」及び「処置」は、予防的処置を含む。処置方法には、治療有効量の活性剤を対象に投与することが含まれる。投与工程は、単回投与からなり得、又は一連の投与を含み得る。処置期間の長さは、症状の重症度、患者の年齢、活性剤の濃度、処置において使用される組成物の活性、又はこれらの組み合わせなどの様々な因子に依存する。また、処置又は予防のために使用される作用物質の有効量は、特定の処置又は予防計画の過程で増加又は減少し得ることが理解されるであろう。投与量の変化が生じ得、当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって明らかになり得る。いくつかの例において、長期投与が必要とされ得る。例えば、組成物は、患者を処置するのに十分な量と期間で、対象に投与される。複数の態様において、処置すること又は処置は、予防的処置ではない。
【0042】
「予防する」という用語は、患者における疾患症候の発生の減少を指す。上記のように、予防は完全（検出可能な症候なし）であってもよく、又は、処置なしで生じ得るものよりも少ない症候が観察されるように部分的であってもよい。
【0043】
「患者」又は「～を必要とする対象」とは、本明細書で提供されるような医薬組成物の投与によって処置することができる疾患又は症状に罹患しているか、又は罹患しやすい生物を指す。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、乳牛、シカ及び他の非哺乳動物が挙げられる。いくつかの態様において、患者はヒトである。
【0044】
「有効量」は、組成物の不存在と比較して、組成物が述べられた目的を達成する（例えば、組成物がそのために投与される効果を達成するか、疾患を処置するか、酵素活性を低下させるか、酵素活性を増加させるか、シグナル伝達経路を軽減させるか、又は疾患若しくは症状の１つ若しくは複数の症候を軽減させる）のに十分な量である。「有効量」の例は、疾患の１つ又は複数の症候の処置、予防又は軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも呼ばれ得る。１つ又は複数の症候の「軽減」（及びこの句の文法上の等価物）とは、１つ若しくは複数の症候の重症度若しくは頻度の減少、又は１つ若しくは複数の症候の除去を意味する。薬物（例えば、本明細書中に記載される細胞）の「予防有効量」は、対象に投与された場合に、意図された予防効果、例えば、損傷、疾患、病理若しくは症状の発症（又は再発）を予防若しくは遅延させるか、又は損傷、疾患、病理若しくは症状、若しくはそれらの症候の発症（又は再発）の可能性を低下させる薬物の量である。完全な予防効果は、必ずしも１用量の投与によって生じるとは限らず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、予防有効量は１又は複数回の投与で投与され得る。本明細書で使用される「活性低下量」は、アンタゴニストが存在しない場合と比較して酵素の活性を低下させるのに必要なアンタゴニストの量を指す。本明細書で使用する「機能破壊量」とは、アンタゴニストが存在しない場合と比較して、酵素又はタンパク質の機能を破壊するのに必要なアンタゴニストの量を指す。正確な量は処置の目的によって異なり、既知の技術を用いて当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ参照）。
【0045】
本明細書に記載の任意の組成物について、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に決定され得る。目標濃度は、本明細書に記載された又は当技術分野で公知の方法を使用して測定された、本明細書に記載の方法を達成し得る１つ又は複数の活性組成物の濃度（例えば、細胞濃度又は細胞数）である。
【0046】
当技術分野で周知のように、ヒトで使用するための治療有効量は、動物モデルからも決定され得る。例えば、動物で有効であることが判明している濃度を達成するようにヒトへの投与量を処方し得る。ヒトにおける投与量は、上記のように、組成物の有効性を監視し、投与量を上方又は下方に調整することによって調整され得る。上記の方法及び他の方法に基づいてヒトにおいて最大の有効性を達成するように用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0047】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、上記のように、障害を改善するのに十分な治療薬の量を指す。例えば、所与のパラメータについて、治療的有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又は少なくとも１００％の増加又は減少を示す。治療効果は、「～倍」の増加又は減少としても表され得る。例えば、治療有効量は、対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれを超える効果を有し得る。
【0048】
投与量は、患者及び採用される組成物の要件に応じて変化してもよい。本開示の文脈において、患者に投与される用量は、長期間にわたって患者に有益な治療反応をもたらすのに十分であるべきである。また、用量の大きさは、あらゆる有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、医師の技量の範囲内である。一般に、処置は、組成物の最適用量未満の、より少ない用量で開始される。この投与量は、その後、状況に応じて最適な効果が達せられるまで、少しずつ増やされる。投与量及び間隔は、処置されている特定の臨床的適応症に有効な投与された組成物のレベルを提供するために個別に調整され得る。これにより、個体の病状の重症度に見合った治療計画が提供される。
【0049】
「共投与する」は、本明細書中に記載される組成物が、１つ又は複数の追加の治療の投与と同時に、投与の直前に、又は投与の直後に投与されることを意味する。本明細書で提供される組成物は、患者に対して、単独で投与され得、又は共投与され得る。共投与は、組成物を個別に、又は組み合わせて（複数の組成物）同時投与又は逐次投与することを含むことを意味する。したがって、調製物はまた、所望であれば、（例えば、代謝分解を減少させるために）他の活性物質と組み合わされ得る。
【0050】
「対照」又は「対照実験」は、その単純な通常の意味に従って使用され、実験の手順、試薬、又は可変要素の省略を除いて、実験の対象又は試薬が同様の実験におけるように扱われる実験を指す。いくつかの例において、対照は、実験効果を評価する際の比較の基準として使用される。いくつかの態様において、対照は、本明細書（態様及び実施例を含む）に記載の組成物の非存在下でのタンパク質の活性の測定である。
【0051】
「薬学的に許容され得る賦形剤」及び「薬学的に許容され得る担体」は、対象への活性作用物質の投与及び対象による吸収を補助し、患者に有意な有害毒性作用を引き起こさずに本開示の組成物に含められ得る物質を指す。薬学的に許容され得る賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、通常の生理食塩水、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味料、香料、塩溶液（リンゲル液など）、アルコール、油、ゼラチン；ラクトース、アミロース又はデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン及び色素などが挙げられる。そのような調製物は、滅菌され得、所望であれば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、及び／又は本開示の組成物と有害に反応しない芳香族物質などの補助剤と混合され得る。当業者であれば、他の薬学的賦形剤が本開示において有用であることを認識するであろう。
【0052】
本明細書で使用される「細胞」は、そのゲノムＤＮＡを保存又は複製するのに十分な代謝機能又は他の機能を実行する細胞を指す。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の色素による染色、子孫を生産する能力、又は配偶子の場合、第２の配偶子と組み合わせて生存可能な子孫を生産する能力を含む、当技術分野で周知の方法によって同定され得る。細胞は、原核細胞及び真核細胞を含み得る。原核細胞には、細菌が含まれるが、これに限定されない。真核細胞としては、酵母細胞並びに植物及び動物由来の細胞、例えば哺乳動物、昆虫（例えばスポドプテラ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ））及びヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、天然に非接着性であるか、又は例えばトリプシン処理によって表面に接着しないように処理されている場合に有用であり得る。
【0053】
本明細書中で使用される場合、「幹細胞」とは、特定の特殊化された機能を有する他の細胞型（例えば、完全に分化した細胞）に分化するように誘導されるまで、培養状態で長期間にわたって未分化状態（例えば、多能性または複能性幹細胞）に留まることができる細胞を指す。複数の態様において、「幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、成体幹細胞、間葉系幹細胞及び造血幹細胞が含まれる。複数の態様において、ＲＰＥ細胞は、多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣ）から生成される。
【0054】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」は、体細胞の遺伝子操作によって、例えば、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４などの転写因子による線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のレトロウイルス形質導入によって、体細胞から生成され得る細胞である［Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００７，１（１）：３９－４９；Ａｏｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ Ｆｅｂ１４．（印刷前の電子出版）；ＩＨ Ｐａｒｋ，Ｚｈａｏ Ｒ，Ｗｅｓｔ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００８；４５１：１４１－１４６；Ｋ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ２００７；１３１：８６１－８７２］。他の胚様幹細胞は、レシピエント細胞が有糸分裂で停止している場合、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、又は接合体への核移植によって作製され得る。さらに、ｉＰＳＣは、非組み込み法を使用して、例えば、小分子又はＲＮＡを使用することによって作製され得る。
【0055】
「胚性幹細胞」という用語は、３つの胚性胚葉全て（すなわち、内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の細胞に分化することができる、又は未分化状態のままであることができる胚性細胞を指す。「胚性幹細胞」という語句は、妊娠後に形成された胚組織（例えば、胚盤胞）から胚の着床前に得られる細胞（すなわち、着床前胚盤胞）、着床後／原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号参照）、及び妊娠中の任意の時点、好ましくは妊娠の１０週前に胎児の生殖組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含む。複数の態様において、胚性幹細胞は、周知の細胞培養方法を用いて得られる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離され得る。
【0056】
ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトのインビボ着床前胚又はインビトロ受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞のヒト胚を胚盤胞期まで増殖させ得る。例えば、ヒトＥＳ細胞を単離するために、透明帯を胚盤胞から除去し、栄養外胚葉細胞を溶解させて穏やかなピペッティングによって無傷のＩＣＭから除去する手順によって内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離する。その後、ＩＣＭを、そのアウトグロースを可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに播種する。９～１５日後、ＩＣＭ由来のアウトグロースを機械的解離又は酵素的分解のいずれかによって塊に解離させ、次いで、細胞を新鮮な組織培養培地に再播種する。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個々に選択し、機械的に塊に解離させ、再播種する。次いで、得られたＥＳ細胞を４～７日毎に日常的に分割する。ヒトＥＳ細胞の調製方法のさらなる詳細については、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０００，Ｍａｙ：１８（５）：５５９；Ｔｈｏｍｓｏｎら、［米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４，１９９５］；Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ４：７０６，１９８９］；及びＧａｒｄｎｅｒら、［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８］。
【0057】
市販の幹細胞もまた、本開示の局面及び態様において使用され得ることが理解される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録（ｗｗｗ．ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ）又は他のｈＥＳＣ登録から購入され得る。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、ＨＡＤ－Ｃ１０２、ＥＳＩ、ＢＧＯ１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１Ｏ、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＣＨＢ－４、ＣＨＢ－５、ＣＨＢ－６、ＣＨＢ－８、ＣＨＢ－９、ＣＨＢ－１０、ＣＨＢ－１１、ＣＨＢ－１２、ＨＵＥＳ１、ＨＵＥＳ２、ＨＵＥＳ３、ＨＵＥＳ４、ＨＵＥＳ５、ＨＵＥＳ６、ＨＵＥＳ７、ＨＵＥＳ８、ＨＵＥＳ９、ＨＵＥＳ１０、ＨＵＥＳ１１、ＨＵＥＳ１２、ＨＵＥＳ１３、ＨＵＥＳ１４、ＨＵＥＳ１５、ＨＵＥＳ１６、ＨＵＥＳ１７、ＨＵＥＳ１８、ＨＵＥＳ１９、ＨＵＥＳ２０、ＨＵＥＳ２１、ＨＵＥＳ２２、ＨＵＥＳ２３、ＨＵＥＳ２４、ＨＵＥＳ２５、ＨＵＥＳ２６、ＨＵＥＳ２７、ＨＵＥＳ２８、ＣｙＴ４９、ＲＵＥＳ３、ＷＡＯ１、ＵＣＳＦ４、ＮＹＵＥＳ１、ＮＹＵＥＳ２、ＮＹＵＥＳ３、ＮＹＵＥＳ４、ＮＹＵＥＳＳ、ＮＹＵＥＳ６、ＮＹＵＥＳ７、ＵＣＬＡ１、ＵＣＬＡ２、ＵＣＬＡ３、ＷＡ０７７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＨＵＥＳ６２、ＨＵＥＳ６３、ＨＵＥＳ６４、ＣＴ Ｉ、ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、ＭＡ１３５、Ｅｎｅａｖｏｕｒ－２、ＷＩＢＲ１、ＷＩＢＲ２、ＷＩＢＲ３、ＷＩＢＲ４、ＷＩＢＲＳ、ＷＩＢＲ６、ＨＵＥＳ４５、Ｓｈｅｆ３、Ｓｈｅｆ６、ＢＩＮｈｅｍ１９、ＢＪＮｈｅｍ２０、ＳＡＧＯ１、ＳＡＯＯ１である。
【0058】
いくつかの態様によれば、胚性幹細胞株は、ＨＡＤ－Ｃ１０２又はＥＳＩである。
【0059】
さらに、ＥＳ細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４－７］、ラット［ｌａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８－９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０－８；Ｇｒａｖｅｓ＆Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３，３０ ３６：４２４－３３］、いくつかの家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５－６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ１９９４，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３－８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９－６７］及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４－８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４－９］を含む他の種から取得され得る。
【0060】
拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、原腸形成前の段階で、受精後少なくとも９日の胚盤胞から取得され得る。胚盤胞を培養する前に、［例えば、Ｔｙｒｏｄｅの酸性溶液によって（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）］、透明帯を消化して内部細胞塊を露出させる。次いで、標準的な胚性幹細胞培養法を使用して、インビトロで、受精後少なくとも９日（好ましくは最長１４日）間（すなわち、原腸形成事象の前に）、胚盤胞を全胚として培養する。
【0061】
ＥＳ細胞を調製するための別の方法は、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｉｓｓｕｅ２，１１３－１１７，７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００８に記載されている。この方法は、体外受精プロセス中に胚から単一細胞を除去することを含む。このプロセスで胚は破壊されない。
【0062】
ＥＧ（胚性生殖）細胞は、当業者に公知の実験技術を使用して、妊娠約８～１１週の胎児（ヒト胎児の場合）から得られた始原生殖細胞から調製され得る。生殖隆起は解離され、小さな部分に切断され、その後、機械的解離によって細胞に分解される。次いで、ＥＧ細胞を、適切な培地を含む組織培養フラスコ内で増殖させる。細胞は、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで（典型的には７～３０日又は１～４継代後）、培地を毎日交換しながら培養される。ヒトＥＧ細胞を調製する方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３７２６，１９９８］及び参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，０９０，６２２号を参照されたい。
【0063】
ＥＳ細胞を調製するためのさらに別の方法は、単為生殖によるものである。このプロセスでも胚は破壊されない。
【0064】
ＥＳＣ又は他の多能性幹細胞は、分化工程の前にフィーダーなしで増殖させ得る。例えば、フィーダー細胞を含まない系をＥＳ細胞の培養に使用することができる。このような系は、フィーダー細胞層の代替物として、血清代替物、サイトカイン、及び成長因子（ＩＬ６及び可溶性ＩＬ６受容体キメラを含む）が補充されたマトリックスを利用する。幹細胞は、培養培地、例えばＬｏｎｚａ Ｌ７系、ｍＴｅＳＲ、ＳｔｅｍＰｒｏ、ＸＦＫＳＲ、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標））の存在下で、細胞外マトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチン）などの固体表面上で増殖させることができる。フィーダー細胞と幹細胞の同時増殖を必要とし、混合細胞集団をもたらし得るフィーダーベースの培養とは異なり、フィーダーフリー系で増殖させた幹細胞は表面から容易に分離される。幹細胞の増殖に用いられる培養培地は、ＭＥＦ馴化培地、ｂＦＧＦなどの、分化を効果的に阻害し、幹細胞の増殖を促進する因子を含有する。フィーダーフリー培養培地ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）は、本明細書中に記載及び例示される方法及びプロトコルでは使用されない。
【0065】
いくつかの態様においては、増殖後、多能性幹細胞、例えばＥＳＣは、（球状体又は胚様体の中間生成なしに）接着性表面上で指向性分化に供される。例えば、全ての方法、細胞、試薬、組成物、及びその中に開示される全ての他の情報について、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１７／０７２７６３号を参照されたい。
【0066】
したがって、本開示の一局面によれば、接着性表面上で指向性分化に供される細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が未分化多能性幹細胞（ＰＳＣ）、例えばＥＳＣであり、多能性のマーカーを発現する。例えば、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％がＯｃｔ４＋ＴＲＡ－１－６０＋である。非分化ＰＳＣは、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦβ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－５、ＯＣＴ４、ＴＲＡ－１－６０、及び／又はＴＲＡ－１－８１などの他の多能性マーカーを発現し得る。
【0067】
１つの例示的な分化プロトコルでは、動的懸濁状態で懸濁性細胞支持マトリックス、例えばマイクロキャリア（ＭＣ）を使用して、接着性表面上で非分化多能性幹細胞をＲＰＥ細胞系統の方向に分化させる。例えば、ＳｏｌｏＨｉｌｌ（登録商標）のＳｔａｒ－Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓを使用し得る。トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＧＦ１、ＴＧＦ２及びＴＧＦ３サブタイプの他、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びアクチビンＡＢ）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、いくつかの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７、並びに成長分化因子（ＧＤＦ）を含む相同リガンド）などの分化誘導剤が使用され得る。
【0068】
いくつかの態様によれば、ニコチンアミド（ＮＩＣ）などの分化誘導剤は、約１～１００ｍＭ、５～５０ｍＭ、５～２０ｍＭ、及び例えば１０ｍＭの濃度で使用され得る。濃度は、終点を含む記載された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0069】
「ナイアシンアミド」又はＮＡとしても知られているＮＩＣは、ベータ細胞機能を保存及び改善すると考えられているビタミンＢ３（ナイアシン）のアミド誘導体形態である。ＮＩＣは、成長及び食物のエネルギーへの変換に不可欠であり、関節炎の処置及び糖尿病の処置と予防に使用されている。ＮＡは、化学式Ｃ６Ｈ６Ｎ２０及び以下の構造を有する。
【0070】
【0071】
いくつかの態様によれば、ニコチンアミドは、ニコチンアミド誘導体又はニコチンアミド模倣物である。本明細書で使用される「ニコチンアミド（ＮＡ）の誘導体」という用語は、天然ＮＡの化学的に修飾された誘導体である化合物を意味する。一態様において、化学修飾は、アミド部分の窒素又は酸素原子を介した、基本的なＮＡ構造のピリジン環の（環の炭素又は窒素メンバーを介した）置換であり得る。置換されている場合、１つ又は複数の水素原子が置換基で置換されていてもよく、且つ／又は置換基がＮ原子に結合して４価の正に帯電した窒素を形成していてもよい。したがって、本発明のニコチンアミドは、置換又は非置換のニコチンアミドを含む。別の態様において、化学修飾は、例えばＮＡのチオベンズアミド類似体を形成するための、単一の基の欠失又は置換であり得、これら全ては有機化学に精通した者によって理解されるとおりである。本発明の文脈における誘導体には、ＮＡのヌクレオシド誘導体（例えばニコチンアミドアデニン）も含まれる。ＮＡの様々な誘導体が記載されており、いくつかはまた、ＰＤＥ４酵素の阻害活性に関連して（国際公開第０３／０６８２３３号；国際公開第０２／０６０８７５号；ＧＢ２３２７６７５Ａ）、又はＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤として（国際公開第０１／５５１１４号）記載されている。例えば、４－アリール－ニコチンアミド誘導体を調製する方法（国際公開第０５／０１４５４９号）。他の例示的なニコチンアミド誘導体は、国際公開第０１／５５１１４号及びＥＰ２１２８２４４に開示されている。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0072】
ニコチンアミド模倣物には、ニコチンアミドの修飾形態、及び多能性細胞からのＲＰＥ細胞の分化及び成熟におけるニコチンアミドの効果を再現するニコチンアミドの化学的類似体が含まれる。例示的なニコチンアミド模倣物には、安息香酸、３－アミノ安息香酸、及び６－アミノニコチンアミドが含まれる。ニコチンアミド模倣物として作用し得る別のクラスの化合物は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＲ）の阻害剤である。例示的なＰＡＲＰ阻害剤には、３－アミノベンズアミド、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ－０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ－８８８）、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７及びＢＭＮ－６７３が含まれる。
【0073】
さらなる企図される分化誘導剤としては、例えばノギン、Ｗｎｔのアンタゴニスト（Ｄｋｋ１又はＩＷＲ１ｅ）、ノーダルアンタゴニスト（Ｌｅｆｔｙ－Ａ）、レチノイン酸、タウリン、ＧＳＫ３ｂ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）及びノッチ阻害剤（ＤＡＦＴ）が挙げられる。
【0074】
「網膜の色素層」としても知られる「網膜色素上皮」又は「ＲＰＥ」という用語は、網膜の外側の細胞の色素層を指す。ＲＰＥ層は、ブルッフ膜（脈絡膜内縁）と視細胞との間に位置する。ＲＰＥは、網膜に栄養素を供給するための中間体であり、網膜の発達、光の吸収、成長因子の分泌、及び眼の免疫応答の媒介を含む多くの機能を補助する。ＲＰＥの機能不全は、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、西ナイルウイルス、及び黄斑変性を含む症状において視力喪失又は失明をもたらし得る。
【0075】
本明細書で使用される場合、「成熟ＲＰＥ細胞のマーカー」という語句は、非ＲＰＥ細胞又は未成熟ＲＰＥ細胞と比較して成熟ＲＰＥ細胞で上昇している（例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍）抗原（例えば、タンパク質）を指す。
【0076】
本明細書で使用される場合、「ＲＰＥ前駆細胞のマーカー」という語句は、非ＲＰＥ細胞と比較したとき、ＲＰＥ前駆細胞において上昇している（例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍）抗原（例えば、タンパク質）を指す。
【0077】
いくつかの態様によれば、ＲＰＥ細胞は、網膜の色素上皮細胞層を形成する天然ＲＰＥ細胞の形態と同様の形態を有する。例えば、細胞は着色されていてもよく、特徴的な多角形の形状を有していてもよい。
【0078】
さらに他の態様によれば、ＲＰＥ細胞は、黄斑変性などの疾患を処置することが可能である。
【0079】
さらなる態様によれば、ＲＰＥ細胞は、本明細書中上記で列挙される要件の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は全てを満たす。
【0080】
「疾患」又は「症状」という用語は、本明細書で提供される組成物又は方法で処置することができる患者又は対象の状態又は健康状態を指す。加齢黄斑変性すなわちＡＭＤは、網膜中心部の進行性慢性疾患であり、世界中で視力喪失の主な原因である。ほとんどの視力喪失は、２つのプロセス：新生血管（「湿性」ＡＭＤ及び地図状萎縮（ＧＡ、「乾性」）のうちの１つに起因して疾患の後期段階で起こる。ＧＡでは、網膜色素上皮、脈絡毛細血管板及び視細胞の進行性萎縮が起こる。ＡＭＤの乾性型はより一般的であるが（全症例の８５～９０％）、「湿性」型に進行することがあり、未処置のまま放置すると、急速かつ重度の視力喪失をもたらす。ＡＭＤの推定有病率は、米国及び他の先進国では２，０００人に１人である。この有病率は、一般人口における高齢者の割合と共に増加すると予想される。疾患の危険因子としては、環境因子と遺伝因子の両方が挙げられる。この疾患の病因には、機能的に相互に関連する４つの組織、すなわち網膜色素上皮（ＲＰＥ）、ブルッフ膜、脈絡毛細血管及び視細胞の異常が関与している。しかしながら、ＲＰＥ細胞機能の障害は、臨床的に関連するＡＭＤ変化をもたらす分子経路における初期の重要な事象である。現在、乾性ＡＭＤに対する承認された処置は存在しない。予防的手段としては、ビタミン／ミネラルのサプリメントが挙げられる。これらは、湿性ＡＭＤを発症するリスクを低下させるが、地図状萎縮（ＧＡ）の進行の発症には影響しない。
【0081】
本明細書で提供される方法に従って処置の効果を測定し得る疾患の非限定的なリストには、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、遺伝性又は後天性黄斑変性、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、全脈絡膜萎縮、パターンジストロフィ及びＲＰＥの他のジストロフィー、シュタルガルト病、光線性、レーザー性、炎症性、感染性、放射線性、新生血管性又は外傷性傷害の任意の１つによって生じる損傷によるＲＰＥ及び網膜損傷、網膜異形成、網膜萎縮、網膜症、黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、蜂巣状網膜ジストロフィー（Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）、ドインハニカム型ジストロフィー、ソルスビー型ジストロフィー、パターン／蝶型ジストロフィー、ベスト病、ノースキャロライナ型ジストロフィー、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、網膜色素線条症、毒性黄斑症、病的近視、網膜色素変性症並びに黄斑変性が含まれる。複数の態様において、疾患は、乾性ＡＭＤである。複数の態様において、疾患は、ＧＡである。
【0082】
萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）又は進行性乾性ＡＭＤとしても知られる「地図状萎縮」又は「ＧＡ」又は「萎縮性網膜」は、経時的に視覚機能の喪失をもたらし得る網膜（視細胞、網膜色素上皮、脈絡毛細血管板（ｃｈｏｒｉｏｃａｐｐｉｌｌａｒｉｓ））の進行性及び不可逆性の喪失をもたらし得る加齢黄斑変性の進行した形態である。
【0083】
複数の態様において、ＲＰＥ欠損は、高齢、喫煙、不健康な体重、抗酸化物質の低摂取、又は心血管障害のうちの１つ又は複数に起因し得る。他の態様において、ＲＰＥ欠損は先天性異常に起因し得る。文脈が許す限り互換的に使用され得る「網膜色素上皮細胞」、「ＲＰＥ細胞」、「ＲＰＥ」は、例えば、機能的に、エピジェネティックに、又は発現プロファイルによって、網膜の色素上皮細胞層を形成する天然ＲＰＥ細胞と似ている細胞型の細胞（例えば、眼内への移植、投与又は送達の際に、それらは天然ＲＰＥ細胞の機能活性と同様の機能活性を示す）を指す。
【0084】
本明細書で使用される場合、「ＯｐＲｅｇｅｎ」という用語は、系列限定ヒトＲＰＥ細胞株を指す。ＲＰＥ細胞は、アクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－ｂ）ファミリー及びニコチンアミドを補充してＲＰＥ集団を濃縮した分化培地下で誘導される。ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）は、眼用平衡塩類溶液（ＢＳＳ Ｐｌｕｓ）中に、又はＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）５内のすぐに投与できる（ｒｅａｄｙ ｔｏ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ：ＲＴＡ）解凍注入（ｔｈａｗ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔ：ＴＡＩ）製剤として製剤化された単一細胞懸濁液である。
【0085】
本明細書で使用される場合、「中間細胞バンク」又は「ＩＣＢ」という用語は、生産の中間段階で、一定分量で凍結されている細胞のストックを指す。複数の態様において、本明細書で言及される中間細胞バンクは、ＰＳＣのＲＰＥ細胞への分化後であるが、ＲＰＥ細胞の増殖前に凍結されたＲＰＥ細胞を含む。ＩＣＢは解凍され、ＲＰＥ細胞の増殖、例えば懸濁性細胞支持マトリックス上での増殖のために培養物に接種するために使用され得る。解凍及び接種は、細胞の凍結の数日、数週間、数ヶ月、又は数年後であり得る。
【0086】
本明細書で使用される場合、「懸濁性細胞支持マトリックス」という用語は、接着性細胞が動的又は静的細胞培養で増殖することを可能にし、穏やかな混合で懸濁状態に留まることができる懸濁性支持マトリックスを指す。懸濁性細胞支持マトリックスの例は、マイクロキャリアである。
【0087】
本明細書で使用される場合、「マイクロキャリア」又は「ＭＣ」という用語は、接着性細胞が動的又は静的細胞培養で増殖することを可能にし、穏やかな混合で懸濁状態に留まることができる懸濁性支持マトリックスを指す。マイクロキャリアは、限定されないが、ポリスチレン、表面が修飾されたポリスチレン、化学的に修飾されたポリスチレン、架橋デキストラン、セルロース、アクリルアミド、コラーゲン、アルギナート、ゼラチン、ガラス、ＤＥＡＥ－デキストラン、又はこれらの組み合わせなどから構成され得る。マイクロキャリアは、ラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない生物学的支持マトリックスでコーティングされ得る。ＨｙＱＳｐｈｅｒｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｈｉｌｌｅｘ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）及びＬｏｗ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ブランドを含むがこれらに限定されない多くの異なる種類のマイクロキャリアが市販されている。マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘブランド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの架橋デキストランから作製され得る。マイクロキャリアは、球形で滑らかであり得、ＣＹＴＯＰＯＲＥブランド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの微孔性表面を有し得、且つ／又はＤＥ－５３（Ｗｈａｔｍａｎ）などの棒状キャリアであり得る。マイクロキャリアには、ビーズ（例えば、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓからのＧＥＭ粒子）からの細胞分離に役立ち得る磁性粒子を含浸させることができる。μＨｅｘ製品（Ｎｕｎｃ）などのチップベースのマイクロキャリアは、従来のマイクロキャリアの高い表面対体積比を維持しながら、細胞増殖のための平坦な表面を提供する。マイクロキャリアの特性は、増殖速度及び細胞の複能性又は多能性に有意に影響を及ぼし得る。
【0088】
複数の態様において、マイクロキャリア（ＭＣ）濃度は約１０ｃｍ２／ｍＬであり得る。複数の態様において、ＭＣ濃度は１０ｃｍ２／ｍＬである。いくつかの態様において、ＭＣ濃度は、約１ｃｍ２／ｍＬ～約３０ｃｍ２／ｍＬ、又は約１ｃｍ２／ｍＬ～約２０ｃｍ２／ｍＬ、又は約１ｃｍ２／ｍＬ～約１０ｃｍ２／ｍＬ、又は約１ｃｍ２／ｍＬ～約５ｃｍ２／ｍＬである。いくつかの態様において、ＭＣ濃度は、約１ｃｍ２／ｍＬ、又は約２ｃｍ２／ｍＬ、又は約３ｃｍ２／ｍＬ、又は約４ｃｍ２／ｍＬ、又は約５ｃｍ２／ｍＬ、又は約６ｃｍ２／ｍＬ、又は約７ｃｍ２／ｍＬ、又は約８ｃｍ２／ｍＬ、又は約９ｃｍ２／ｍＬ、又は約１０ｃｍ２／ｍＬ、又は約１１ｃｍ２／ｍＬ、又は約１２ｃｍ２／ｍＬ、又は約１３ｃｍ２／ｍＬ、又は約１４ｃｍ２／ｍＬ、又は約１５ｃｍ２／ｍＬ、又は約１６ｃｍ２／ｍＬ、又は約１７ｃｍ２／ｍＬ、又は約１８ｃｍ２／ｍＬ、又は約１９ｃｍ２／ｍＬ、又は約２０ｃｍ２／ｍＬであるか、又はそれを超える。複数の態様において、ＭＣ濃度は５～１０ｃｍ２／ｍＬの範囲である。
【0089】
複数の態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはコーティングされていない。複数の態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは処理されていない。複数の態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、細胞接着を促進するために処理又はコーティングされている。表面化学修飾は、細胞接着を改善することができ、正電荷若しくは負電荷を印加する方法又はラミニン若しくはビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする方法を含むがこれらに限定されない。
【0090】
本明細書で使用される場合、「バイオリアクタ」という用語は、生物学的に活性な環境を支持することができる任意の系を指す。バイオリアクタは、開放系又は閉鎖系、嫌気性又は好気性であり得る。バイオリアクタは、連続流又は静止流であり得る。バイオリアクタは、連続的に又はバッチによって栄養供給され得る。バイオリアクタは、例えば溶存酸素（ＤＯ）のレベル、ｐＨ、並びにＮ２、Ｏ２、ＣＯ２、及び空気を含む気体の流れについて監視し得る。バイオリアクタは、例えばバイオリアクタ内の任意の種類の羽根車若しくは撹拌器による、又は動的培養条件を提供するための揺動プラットフォームによる、細胞懸濁液を混合又は撹拌するための手段を含み得る。バイオリアクタは使い捨てであり得る。
【0091】
本明細書で使用される場合、「集団倍加レベル」という用語は、所与の集団中の細胞がインビトロ培養中に倍加した回数の総数である。集団倍加の数学的表現は、ｌｏｇ２（採集された生細胞／播種された生細胞）である。例えば、１００万個の生細胞が播種され、８００万個の生細胞が採集された場合、ｌｏｇ２（８／１）＝３である。すなわち、平均細胞集団倍加は３であった。
【0092】
ＲＰＥ細胞増殖の方法
本明細書における態様は、一般的には、マイクロキャリアなどの懸濁性細胞支持マトリックスの使用を含む、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の増殖のための方法に関する。
本明細書における態様は、一般的には、マイクロキャリアなどの懸濁性細胞支持マトリックスの使用を含む、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の増殖のための方法に関する。
【0093】
いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化される。いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞はヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化される。
【0094】
特定の態様によれば、分化は以下のように行われる。（ａ）高度に制御された培養系におけるフィーダーフリーｈＥＳＣ（ＦＦ ｈＥＳＣ）の増殖；（ｂ）ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）及び分化誘導剤（例えばニコチンアミド）を含む培地中での工程ａ）から得られた細胞のＦＦ単層指向性分化；（ｃ）ゼラチンコーティングされた容器上でのＲＰＥ増殖；（ｄ）懸濁性細胞支持マトリックス上で培養された第２継代のＲＰＥ。工程（ａ）は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）の非存在下で行われ得る。多能性幹細胞からのＲＰＥ細胞の生産の非限定的な例は、国際公開第２０２１／２４２７８８号、国際公開２０１７／０２１９７３号、国際公開２０１７／０２１９７２号、国際公開２０１７／０１７６８６号、国際公開２０１６／１０８２３９号、国際公開２０１６／１０８２３９号、国際公開２０１６／１０８２３９号、国際公開２００８／１２９５５４号、国際公開２００６／０７０３７０号、国際公開２０１９／０２８０８８号、国際公開２０２１／２４２７８８号、国際公開２０２０／２２３２２６号及び国際公開第２０１３／１１４３６０号に見出され得る。これらの参考文献の各々は、全ての組成物、試薬及び細胞、並びに全ての方法、製造方法及び組成物、試薬及び細胞を使用する方法、並びにそれらの中に開示されている全ての他の情報について、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0095】
いくつかの態様において、工程（ａ）における培地は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを完全に欠いている。他の態様において、培地中のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーのレベルは、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はさらに０．１ｎｇ／ｍＬ未満である。濃度は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0096】
上記プロトコルには、検証手順が後続し得る。検証手順は、以下の基準を含み得る。（ａ）ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７フローサイトメトリーによって測定される９５％を超える純度を有する高純度のＲＰＥ細胞；（ｂ）正味の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞１００Ω／ｃｍ２並びに極性をもったＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの分泌を有する解凍後の極性化した単層の生成；並びに／又は（ｃ）高精度Ｆｕｚｚｙ Ｃ－Ｍｅａｎ（ＦＣＭ）法によって確認された、フローサイトメトリーによって測定された場合にＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４を欠く残存幹細胞、例えばｈＥＳＣがない。
【0097】
次いで、上記のプロトコルを使用して得られた細胞懸濁液は、例えばこれを必要とする患者中に移植され得る。細胞は、広大な領域に再定着することができ、必要とされる損傷を受けた空間に位置して、接触阻害に達するまで、拘束されたＲＰＥ細胞増殖によって増殖する。細胞は、ＴＥＥＲ並びに極性をもったＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの分泌によって測定されるバッチ放出（ＢＲ）能力のためのバリア機能を有する成熟した極性化ＲＰＥ層を生成することができる。得られた細胞懸濁液は解凍して患者に注射する準備ができており、手術前に細胞調製の必要がない。
【0098】
上記プロトコルは、３Ｌのバイオリアクタあたり５×１０９個のＲＰＥ細胞を有する約２５００本のバイアルを与え得る。バイオリアクタの数及びバイオリアクタの容積は、比較的容易に増やすことができる。
【0099】
いくつかの態様によれば、免疫染色によって測定すると、細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、又は９５％が細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）を発現する。例えば、細胞の９５～１００％がＣＲＡＬＢＰを発現する。パーセンテージは、終点を含む列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。
【0100】
別の態様によれば、免疫染色によって測定すると、細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、又は９５％が細胞メラノサイト系列特異的抗原ＧＰ１００（ＰＭＥＬ１７）を発現する。例えば、細胞の９５～１００％がＰＭＥＬ１７を発現する。パーセンテージは、終点を含む列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。
【0101】
一局面において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を増殖させるための方法であって、ＲＰＥ細胞の集団を提供することと；第１の懸濁性細胞支持マトリックスを含有する培地に前記ＲＰＥ細胞の集団を接種することと；動的懸濁状態にて前記第１の懸濁性細胞支持マトリックス上で前記ＲＰＥ細胞の集団を増殖させて、増殖したＲＰＥ細胞の集団を提供することとを含む方法が本明細書において提供される。複数の態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、提供する工程の前に多能性幹細胞から分化したものである。
【0102】
一態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、静的条件下にて、固体表面上で増殖する。いくつかの態様において、固体表面は培養プレートである。いくつかの態様において、固体表面は培養フラスコである。いくつかの態様において、固体表面はマルチウェル培養皿である。
【0103】
一態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、第１の接種工程の前に、動的条件下にて、固体表面上で増殖したものである。いくつかの態様において、固体表面は、第２の懸濁性細胞支持マトリックスを含有する。
【0104】
いくつかの態様において、固体表面はコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面は、ラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、又はこれらの組み合わせによってコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はラミニンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はマトリゲルでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はコラーゲンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はポリリジンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はポリ－Ｌ－リジンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はポリ－Ｄ－リジンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はビトロネクチンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はフィブロネクチンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はテネイシンでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はデキストランでコーティングされている。いくつかの態様において、固体表面はペプチドでコーティングされている。
【0105】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、中間細胞バンクから提供される。いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、ＲＰＥ細胞を提供する前に、１継代の間、静的条件下にて固体表面上で増殖したものである。
【0106】
複数の態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックスはコーティングされていない。複数の態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはコーティングされている。
【0107】
複数の態様において、多能性幹細胞からのＲＰＥ細胞の集団の分化は、ｉ）多能性幹細胞を、多能性幹細胞の多能性を維持する条件下にて固体表面上で増殖させて、増殖した多能性幹細胞を提供することと；ｉｉ）増殖した多能性幹細胞を、分化誘導剤及び任意で成長因子を含む培地中で一定期間分化させて、ＲＰＥ細胞の集団を提供することを含む。
【0108】
いくつかの態様において、固体表面は培養プレートである。いくつかの態様において、固体表面は、第２の懸濁性細胞支持マトリックスを含む。いくつかの態様において、多能性幹細胞は動的培養において増殖する。
【0109】
複数の態様において、方法工程ｉｉ）は、増殖した多能性幹細胞を分化させることを含む。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、動的培養において第３の懸濁性細胞支持マトリックス上で増殖する。いくつかの態様において、工程ｉ）からの増殖した多能性幹細胞は、工程ｉｉ）において第２の懸濁性細胞支持マトリックスに付着したままである。いくつかの態様において、方法工程ｉｉ）は、静的培養において、培養プレート上の増殖した多能性幹細胞を分化させることを含む。
【0110】
複数の態様において、多能性幹細胞は、第２の懸濁性細胞支持マトリックス及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスに接着した単層へと増殖する。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、第２の懸濁性細胞支持マトリックスに接着した単層へと増殖する。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、第３の懸濁性細胞支持マトリックスに接着した単層へと増殖する。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、第２及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスに接着した単層へと増殖する。
【0111】
複数の態様において、多能性幹細胞の多能性を維持するための条件は、フィーダー細胞を含まない。いくつかの態様において、多能性を維持するための条件は、フィーダー細胞集団を含む。
【0112】
複数の態様において、分化誘導試薬は、ニコチンアミドである。
【0113】
複数の態様において、成長因子は、ＴＧＦβファミリーのメンバーである。いくつかの態様において、トランスフォーミング成長因子Ｂ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦ１、ＴＧＦ２及びＴＧＦ３サブタイプの他、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びアクチビンＡＢ）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、いくつかの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７、並びに成長分化因子（ＧＤＦ）を含む相同リガンド）である。具体的な態様によれば、トランスフォーミング成長因子－Ｂ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーはアクチビンＡである。
【0114】
複数の態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスは、ポリスチレン、表面が修飾されたポリスチレン、化学的に修飾されたポリスチレン、架橋デキストラン、セルロース、アクリルアミド、コラーゲン、アルギナート、ゼラチン、ガラス、ＤＥＡＥ－デキストラン、又はこれらの組み合わせから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはポリスチレンから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、表面が修飾されたポリスチレンから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、化学的に修飾されたポリスチレンから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、架橋デキストランから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、セルロースから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、アクリルアミドから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、コラーゲンから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはアルギナートから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはゼラチンから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはガラスから構成される。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ＤＥＡＥ－デキストランから構成される。
【0115】
複数の態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスはコーティングされていない。いくつかの態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスがコーティングされる。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、又はこれらの組み合わせによってコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはラミニンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはマトリゲルでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはコラーゲンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ポリリジンでコーティングされる。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、ビトロネクチンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは、フィブロネクチンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはテネイシンでコーティングされている。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはデキストランでコーティングされる。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはペプチドでコーティングされている。
【0116】
複数の態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス、及び／又は第３の懸濁性細胞支持マトリックスは、球形、楕円形、棒状、円盤状、多孔質、非多孔質、滑らか、平坦、又はこれらの組み合わせである。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは球形である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは楕円形である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは棒状である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは円盤状である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは多孔質である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは非多孔質である。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは滑らかである。いくつかの態様において、懸濁性細胞支持マトリックスは平坦である。
【0117】
複数の態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスは同じである。いくつかの態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスのうちの少なくとも２つは同じである。いくつかの態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックス、第２の懸濁性細胞支持マトリックス及び第３の懸濁性細胞支持マトリックスは異なる。
【0118】
複数の態様において、懸濁性細胞支持マトリックスはマイクロキャリアである。いくつかの態様において、第１の懸濁性細胞支持マトリックスは第１のマイクロキャリアである。いくつかの態様において、第２の懸濁性細胞支持マトリックスは、第２のマイクロキャリアである。いくつかの態様において、第３の懸濁性細胞支持マトリックスは、第３のマイクロキャリアである。
【0119】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、Ｐ０（分化後又はＩＣＢからの接種後の初期増殖期）の間は２～４、Ｐ１（Ｐ０後の第１の継代）の間は２～３、Ｐ２（第２の継代）の間は１～２の集団倍加レベルを有する。
【0120】
いくつかの態様において、本明細書に記載のＲＰＥ細胞の増殖は、所与の時間にわたって増殖した細胞の数の増加をもたらし得る。例えば、１年の間、ＩＣＢなしでは、２つの異なるバッチを同じ場所で増殖させれば、１組当たり４つのバッチを増殖させ得る。対照的に、ＩＣＢありでは、１年で、同じサイズの１組当たり１０バッチ、例えば、２バッチを同時に増殖させることなく３倍の量を増殖させ得る。いくつかの態様において、増殖の終了時におけるＲＰＥ細胞の数は、ＩＣＢを使用した場合、使用しない場合と比較して約２倍多い。いくつかの態様において、増殖の終了時におけるＲＰＥ細胞の数は、ＩＣＢを使用した場合、約３倍多い。いくつかの態様において、増殖の終了時におけるＲＰＥ細胞の数は、ＩＣＢを使用した場合、約４倍多い。いくつかの態様において、ＲＰＥ増殖のコストは、ＩＣＢを使用しない場合よりもＩＣＢを使用する場合の方がより低い。
【0121】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞の増殖のための条件は、溶存酸素％を３０％超に維持することを含む。
【0122】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞の増殖のための条件は、系全体の増殖チャンバー容積の約５０％から始まる最初の増殖培地体積を含む。複数の態様において、系全体の増殖チャンバー容積の約１０％～約２５％、例えば、約１６．６％の増殖培地体積が定期的に添加される。複数の態様において、増殖培地体積は、２～４日毎に添加される。
【0123】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞は、成熟ＲＰＥ細胞に特徴的である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞は、フローサイトメトリーによって測定された場合に、９５％超で細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及びプレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）に対して二重陽性である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞は、解凍後に正味の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞１００Ω／ｃｍ２並びにＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの極性分泌を有する極性化単層を生成する。
【0124】
いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞は凍結保存されており、解凍すれば対象に直ちに投与できる。複数の態様において、ＲＰＥ細胞は、凍結保存培地中で凍結保存される。複数の態様において、凍結保存培地は、凍結保護剤、例えばグリセロール、スクロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又は他の適切な凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保護剤はグリセロールを含む。複数の態様において、凍結保護剤はスクロースを含む。複数の態様において、凍結保護剤はＤＭＳＯを含む。複数の態様において、凍結保護剤はデキストランを含む。
【0125】
複数の態様において、凍結保存培地は、約０．１％～約４０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約０．１％～約３０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約０．１％～約２０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約０．１％～約１０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約０．１％～約５％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約１％～約４０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約１％～約３０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約１％～約２０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約１％～約１０％の凍結保護剤を含む。複数の態様において、凍結保存培地は、約１％～約５％の凍結保護剤を含む。パーセンテージは、培地の体積あたりの凍結保護剤の重量として測定され得る。パーセンテージは、培地の体積あたりの凍結保護剤の体積として測定され得る。パーセンテージは、終点を含む列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。
【0126】
いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞は、高精度フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）によって確認された場合に、０．０１％未満の多能性幹細胞を含有し、フローサイトメトリーによって測定された場合に、ＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４について陰性である。
【0127】
いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞は、分化後製剤化までの増殖中の全ての継代で、及び細胞懸濁液としての注射後に、多角形単層を生成する。
【0128】
複数の態様において、本方法の１つ又は複数の工程は、使い捨てバイオリアクタ中で行われる。複数の態様において、ＲＰＥ細胞の増殖は、使い捨てバイオリアクタ中で行われる。複数の態様において、ＲＰＥ細胞の分化は、使い捨てバイオリアクタ中で行われる。
【0129】
処置の方法
本明細書の態様は、一般に、黄斑変性などの網膜症状を含む眼の疾患及び病気を処置するための方法、組成物及び装置に関する。
本明細書の態様は、一般に、黄斑変性などの網膜症状を含む眼の疾患及び病気を処置するための方法、組成物及び装置に関する。
【0130】
一局面において、眼の障害又は疾患を処置する方法であって、眼の障害又は疾患を処置することを必要とする患者の網膜組織中に、本明細書に記載の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の増殖の方法から生成されたＲＰＥ細胞を含有する医薬組成物を移植することを含む方法。
【0131】
複数の態様において、眼の障害又は疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）を含む遺伝性黄斑変性、又は網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプである。複数の態様において、眼の障害又は疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。複数の態様において、眼の障害又は疾患は、遺伝性黄斑変性である。複数の態様において、眼の障害又は疾患は、ベスト病（早発型の卵黄様黄斑ジストロフィー）である。複数の態様において、眼の障害又は疾患は、網膜色素変性症（ＲＰ）のサブタイプである。
【0132】
複数の態様において、ＲＰＥ細胞の集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、成熟ＲＰＥ細胞が９５％超で細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及びプレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）について二重陽性であると決定すること；前記成熟ＲＰＥ細胞が、＞１００Ω／ｃｍ２の正味の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）並びにＰＥＤＦ及びＶＥＧＦの極性分泌を有する極性化単層を解凍後に生成することを決定することを含み；並びに／又は成熟ＲＰＥ細胞は、高精度フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）によって確認された場合に、０．０１％未満の多能性幹細胞を含み、フローサイトメトリーによって測定された場合に、ＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４について陰性である製品リリース決定に基づいて、患者において直ちに使用できる。
【0133】
いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞は、分化後製剤化までの増殖中の全ての継代で、及び細胞懸濁液としての注射後に、多角形単層を生成する。
【0134】
複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０～２００マイクロリットル当たり１０，０００～５００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０～２００マイクロリットル当たり１５，０００～３００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０～２００マイクロリットル当たり２５，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０～２００マイクロリットル当たり５０，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり１０，０００～５００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり１５，０００～３００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり２５，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり５０，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり１０，０００～５００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり１５，０００～３００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり２５，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり５０，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり１０，０００～５００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり１５，０００～３００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり２５，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり５０，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり１０，０００～５００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり１５，０００～３００，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり２５，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。複数の態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり５０，０００～２５０，０００個の細胞の範囲である。濃度は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0135】
いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約１００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約１２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約１５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約１７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約２００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約２２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、５０マイクロリットル当たり約２５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約１００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約１２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約１５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約１７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約２００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約２２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約２５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約１００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約１２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１００マイクロリットル当たり約１５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約１７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約２００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約２２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、１５０マイクロリットル当たり約２５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約１００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約１２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約１５０，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約１７５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約２００，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約２２５，０００個の細胞である。いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞の濃度は、２００マイクロリットル当たり約２５０，０００個の細胞である。
【0136】
いくつかの態様において、医薬組成物は、解凍されて、注射前の細胞調製なしで対象に注射されるように、製剤化されている。
【0137】
一態様によれば、移植は、経扁平部硝子体切除術（ｐａｒｓ ｐｌａｎｅ ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ）手術の後、小さな網膜開口部を通じて網膜下腔内に又は直接注射によって細胞を送達することを介して行われる。
【0138】
特定の態様において、投与は、硝子体切除術後の、小さな網膜切開術によるカニューレを介した黄斑領域内の網膜下腔へのＲＴＡ治療用細胞組成物の送達を含み得る。細胞用量に応じて、総体積５０～１００μＬの細胞懸濁液を、ＧＡ拡大の潜在的リスクがある領域に埋め込むことができる。
【0139】
いくつかの態様においては、ＧＡが存在する場合ＧＡの領域及びより良好に保存された中心窩外網膜とＲＰＥ層との間の境界に沿って、黄斑領域内に作られた網膜下腔内に、硝子体切除術後の小さな網膜切開術を通じてＲＴＡ治療用細胞組成物が送達される単一の外科的手順が実施される。開瞼器の配置後、標準的な３ポート硝子体切除術を実施することができる。これは、２３Ｇ又は２５Ｇ注入カニューレ及び２つの２３Ｇ又は２５／２３Ｇポート（トロカール）の配置を含み得る。次いで、２３Ｇ又は２５Ｇの器具を用いてコア硝子体切除術を行い、その後、後部硝子体面を剥離させることができる。ＲＴＡ治療用細胞組成物は、後極内の所定の部位の網膜下腔内に、好ましくは、ＧＡが存在する場合ＧＡの境界の近くに依然として比較的保存されている領域内の網膜を貫通して注射され得る。
【0140】
医薬組成物
いくつかの局面において、本開示は、多能性細胞に由来する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む細胞治療剤である。そのような細胞治療剤としては、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）が挙げられるが、これに限定されることは意図されていない。
いくつかの局面において、本開示は、多能性細胞に由来する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む細胞治療剤である。そのような細胞治療剤としては、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）が挙げられるが、これに限定されることは意図されていない。
【0141】
一局面において、本明細書に記載のＲＰＥ細胞の増殖方法から生成されたＲＰＥ細胞を含有する医薬組成物が本明細書で提供される。
【0142】
複数の態様において、組成物は、患者に使用する前に凍結される。複数の態様において、組成物は、解凍されて、注射前の細胞調製なしで対象に注射されるように、製剤化されている。
【実施例】
【0143】
実施例１
本実施例の目的は、高度に制御された培養系においてフィーダーフリーｈＥＳＣ（ＦＦ ｈＥＳＣ）の増殖を用いて培養されたＲＰＥ細胞の膜形成を実証することである。次いで、ゼラチンでコーティングされた容器上でのＲＰＥ増殖のために、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）及び分化誘導剤（例えばニコチンアミド）を含む培地中での細胞のフィーダーフリー単層指向性分化を使用することができ、マイクロキャリア（ＭＣ）上で培養された第２継代のＲＰＥを移植のために使用することができる。ＦＦ ｈＥＳＣの増殖は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）の非存在下で行われ得る。
本実施例の目的は、高度に制御された培養系においてフィーダーフリーｈＥＳＣ（ＦＦ ｈＥＳＣ）の増殖を用いて培養されたＲＰＥ細胞の膜形成を実証することである。次いで、ゼラチンでコーティングされた容器上でのＲＰＥ増殖のために、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）及び分化誘導剤（例えばニコチンアミド）を含む培地中での細胞のフィーダーフリー単層指向性分化を使用することができ、マイクロキャリア（ＭＣ）上で培養された第２継代のＲＰＥを移植のために使用することができる。ＦＦ ｈＥＳＣの増殖は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えばアクチビンＡ）の非存在下で行われ得る。
【0144】
本明細書に記載の方法を使用して培養されたＲＰＥ細胞は、細胞懸濁液として注射した場合でさえ、多角形単層膜を生成することができる。ＲＰＥ細胞は、分化後かつ製剤化までの増殖中に全ての継代でそのような多角形単層膜を生成する。図１は、播種後４日目に始まり、組織化し、９日目（採集日）に高密度多角形形態に達する、ＲＰＥ増殖でのＰ１継代中のＲＰＥ細胞を示す。
【0145】
実施例２
本実施例の目的は、Ｃｏｒｎｉｎｇ使い捨て０．１Ｌスピナーフラスコ内でのＲＰＥ細胞の増殖のための小規模プロセスの開発を要約することである。
本実施例の目的は、Ｃｏｒｎｉｎｇ使い捨て０．１Ｌスピナーフラスコ内でのＲＰＥ細胞の増殖のための小規模プロセスの開発を要約することである。
【0146】
小規模容器でのこの開発は、制御された増殖条件でＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）を製造するために、バイオリアクタ内のＲＰＥ細胞の増殖をスケールアップする前の予備工程である。この方法では、分化したＲＰＥをプラスチックＭＣ上に播種し、１～２継代増殖させた。プラスチックの種類、ＭＣの濃度及びＭＣの面積当たりの播種細胞密度などのいくつかのパラメータを試験し、最適化した。
【0147】
ＲＰＥ細胞をスピナーフラスコ内のＭＣ上で増殖させた。対照Ｔフラスコと比較して、いくつかの条件を段階的に試験した。他のプロセス修正を各実行中に実施し、プロセス開発に沿って文書に記録した。試験したパラメータは以下を含んでいた：
ＭＣの種類のスクリーニング－ Ｐａｌｌ Ｓｏｌｌｏｈｉｌ（Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩ）Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｍａｘ（Ｈｉ，Ｌｏｗ，ＣｅｌｌＢｉｎｄ）；
播種密度－ 様々な細胞密度、６０，０００～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の範囲で細胞を播種した。
シード撹拌－ ３０分毎に５分間休止しながら４０ＲＰＭ、水平管中で１０ＲＰＭ、４０ＲＰＭで一定；
栄養供給レジメン－ 培地交換又はフェドバッチレジメンのいずれかによって細胞に栄養供給した。増殖培地を週に２～３回交換（半分の体積）又は添加（２８～５６％）した。
血清濃度低下－ ＴＣフラスコ（ＥＸＰ２９ Ａ～Ｃ）で行われた研究の追跡調査、２０％ ＨＳ／ＤＭＥＭの標準的な播種培地を２％ ＨＳ／Ｎｕｔマイナス／ＨＳＡ、又は０％ ＨＳ／Ｎｕｔマイナス／ＨＡＳによって置き換えた；
ニコチンアミド－ 増殖培地へのニコチンアミドの添加あり又はなし；及び
ＭＣ濃度－ ５～２０ｃｍ２／ｍＬ（３６０ｃｍ２／ｇｒ、０．５～２ｇｒ／スピナーフラスコ）の範囲のスピナーフラスコ内でいくつかのＭＣ濃度を試験した。
表１：研究デザイン
ＭＣの種類のスクリーニング－ Ｐａｌｌ Ｓｏｌｌｏｈｉｌ（Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩ）Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｍａｘ（Ｈｉ，Ｌｏｗ，ＣｅｌｌＢｉｎｄ）；
播種密度－ 様々な細胞密度、６０，０００～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の範囲で細胞を播種した。
シード撹拌－ ３０分毎に５分間休止しながら４０ＲＰＭ、水平管中で１０ＲＰＭ、４０ＲＰＭで一定；
栄養供給レジメン－ 培地交換又はフェドバッチレジメンのいずれかによって細胞に栄養供給した。増殖培地を週に２～３回交換（半分の体積）又は添加（２８～５６％）した。
血清濃度低下－ ＴＣフラスコ（ＥＸＰ２９ Ａ～Ｃ）で行われた研究の追跡調査、２０％ ＨＳ／ＤＭＥＭの標準的な播種培地を２％ ＨＳ／Ｎｕｔマイナス／ＨＳＡ、又は０％ ＨＳ／Ｎｕｔマイナス／ＨＡＳによって置き換えた；
ニコチンアミド－ 増殖培地へのニコチンアミドの添加あり又はなし；及び
ＭＣ濃度－ ５～２０ｃｍ２／ｍＬ（３６０ｃｍ２／ｇｒ、０．５～２ｇｒ／スピナーフラスコ）の範囲のスピナーフラスコ内でいくつかのＭＣ濃度を試験した。
表１：研究デザイン
【0148】
実験手順：
ＲＰＥ細胞を直接解凍するか、又は６ウェルプレートのウェル中（ＥＸＰ２７Ａ）若しくは０．１Ｌ Ｃｏｒｎｉｎｇスピナーフラスコ内（ＥＸＰ２７ Ｂ～Ｃ、Ｇ～Ｋ）の異なる種類のＭＣ（表２）上に播種する前にＴフラスコ内で増殖させた。
ＲＰＥ細胞を直接解凍するか、又は６ウェルプレートのウェル中（ＥＸＰ２７Ａ）若しくは０．１Ｌ Ｃｏｒｎｉｎｇスピナーフラスコ内（ＥＸＰ２７ Ｂ～Ｃ、Ｇ～Ｋ）の異なる種類のＭＣ（表２）上に播種する前にＴフラスコ内で増殖させた。
【0149】
フィーダーフリーｈＥＳＣに由来する分化したＲＰＥ細胞の非凍結源を、スピナーフラスコ内のＳｔａｒ ｐｌｕｓ ＭＣ（表２－１行目）上で増殖させた（ＥＸＰ２７Ｄ～Ｆ、Ｌ）。
【0150】
ＮＣ－２００細胞計数器を使用して細胞を計数し、播種された細胞の数で割ることによって収率を計算した。
【0151】
細胞形態並びにラクタート及びグルコースのレベルを継代に沿って調べた。
【0152】
継代終了時に、各条件のＲＰＥ培養物を採集し、収率を対照フラスコと比較した。１又は複数回の連続継代で、収率及び形態を対照Ｔフラスコと比較した。
【0153】
いくつかの実験では、継代終了時の凍結細胞試料を回収、同一性及び効力について試験した。
【0154】
適切なＭＣの種類のスクリーニング
表２－ＥＸＰ２７研究において試験されたマイクロキャリア。
表２－ＥＸＰ２７研究において試験されたマイクロキャリア。
【0155】
最適な細胞密度
【0156】
ＲＰＥの増殖に対する播種細胞密度の効果は、研究ＥＸＰ２７Ｃ、ＥＸＰ２７Ｄ、ＥＸＰ２７Ｆ及びＥＸＰ２７Ｈで行われた。
表３：Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ ＭＣ上での、様々な密度でのＲＰＥ細胞播種の結果の要約
＊収率は、継代最終日に採集された細胞の数を継代０日の播種された細胞の数で割ることによって計算された。
結論：ＲＰＥ細胞は、試験した全ての播種密度で、組織培養フラスコ上と同様にＭＣ上で効率的に増殖する。
表３：Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ ＭＣ上での、様々な密度でのＲＰＥ細胞播種の結果の要約
結論：ＲＰＥ細胞は、試験した全ての播種密度で、組織培養フラスコ上と同様にＭＣ上で効率的に増殖する。
【0157】
フェドバッチ対１／２培地交換
ＭＣ上でのＲＰＥ増殖に対する様々な栄養供給レジメンの効果を研究ＥＸＰ２７Ｃ、ＥＸＰ２７Ｄ、ＥＸＰ２７Ｆ及びＥＸＰ２７Ｈで試験した。
表４－栄養供給プロセスを最適化するための、スピナーフラスコ内でのＲＰＥ細胞増殖に沿った２つの栄養供給レジメンの試験の結果の要約
表５－解凍後の回収純度及び効力（ＴＥＥＲ並びに分泌されたＰＥＤＦ及びＶＥＧＦ）を研究ＲＥＣ＃３、ＲＭ１１９で試験した。
ＭＣ上でのＲＰＥ増殖に対する様々な栄養供給レジメンの効果を研究ＥＸＰ２７Ｃ、ＥＸＰ２７Ｄ、ＥＸＰ２７Ｆ及びＥＸＰ２７Ｈで試験した。
表４－栄養供給プロセスを最適化するための、スピナーフラスコ内でのＲＰＥ細胞増殖に沿った２つの栄養供給レジメンの試験の結果の要約
表５－解凍後の回収純度及び効力（ＴＥＥＲ並びに分泌されたＰＥＤＦ及びＶＥＧＦ）を研究ＲＥＣ＃３、ＲＭ１１９で試験した。
【0158】
結論－結果は、２つの栄養供給方法について同様の値を示した。スケールアップがより簡単であるため、フェドバッチを選択した。
【0159】
ＭＣ濃度
【0160】
ＲＰＥ増殖に対する播種時の様々なＭＣ濃度の効果を、Ｐ２の間、ＥＸＰ２７Ｈ及びＥＸＰ２７Ｌの研究で試験した。
表６－ＭＣ濃度の試験Ｐ２ ＲＰＥ細胞を約５６，０００個の細胞／ｃｍ２（ＥＸＰ２７Ｈ）又は約８８，０００個の細胞／ｃｍ ２ （ＥＸＰ２７Ｌ）の細胞密度で播種した。
結論：
１．ＭＣ濃度は５～１０ｃｍ２／ｍＬの範囲で最適であった。最適であると決定されたＭＣ濃度は、７．２ｃｍ２／ｍＬ、すなわちスピナーフラスコ内の５０ｍＬ接種培地中１グラムのＭＣ（３６０ｃｍ２）であった。
２．継代終了時に最も高い細胞密度を可能にするので、最も効率的なＭＣ濃度は、１０ｃｍ２／ｍＬである。２０ｃｍ２／ｍＬで、２倍多くの細胞が播種されたとしても、最終的な収率は、半分のＭＣ濃度によって達成されるものに非常に近い。
接種培地中の低下した血清
表７：低下した試験
結論－継代終了時に細胞密度をより高くすることを可能にし、より高い収率及び容器当たりの総細胞をもたらすので、ＴＣフラスコ内で行われた他の研究と同様に、Ｎｕｔ／ＨＳＡ中の２％ＨＳ濃度は、標準的な２０％ＨＳ／ＤＭＥＭ播種培地を置き換えることができる。
表８：ＭＣ上での増殖の間のＮｉｃの存在
結論：Ｎｉｃの添加は、各継代の最終細胞収率の５０％の増加をもたらした。結果は有意であった（Ｐ＜０．０５）
０．１Ｌスピナーフラスコ内のｍｃ上でのＲＰＥ増殖の開発段階についての結論：
１．試験した６種類のＭＣから、Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ ＭＣがＲＰＥ増殖を最もよく支持することが明らかとなった。
２．ＲＰＥ細胞は、９０，０００個の細胞／ｃｍ２～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の範囲で良好に増殖した。この密度範囲は、ＴＣフラスコで見られた範囲と同一である。
３．ＲＰＥ増殖は、２つの栄養供給方法で同等であった。ＭＣを使用する場合のスケールアップがより簡単であり、費用対効果がより高いので、１／２培地交換よりフェドバッチを選択した。
４．継代終了時に最も高い細胞密度を可能にするので、最も効率的なＭＣ濃度は、１０ｃｍ２／ｍＬであることが明らかとなった。２０ｃｍ２／ｍＬで、２倍多くの細胞が播種されたとしても、最終的な収率は、半分のＭＣ濃度によって達成されるものに非常に近かった。
５．継代終了時により高い細胞密度を可能にするので、ＴＣフラスコ内で行われた以前の研究と同様に、ｎｕｔ／ＨＳＡ中の２％ＨＳ濃度は、標準的な２０％ＨＳ／ＤＭＥＭ播種培地を置き換えることができる。収率及び容器あたりの総細胞もより高かった。
６．Ｎｉｃの添加は、各継代の最終細胞収率の５０％の増加をもたらした。結果は有意であった（ｐ＜０．０５）
表６－ＭＣ濃度の試験Ｐ２ ＲＰＥ細胞を約５６，０００個の細胞／ｃｍ２（ＥＸＰ２７Ｈ）又は約８８，０００個の細胞／ｃｍ ２ （ＥＸＰ２７Ｌ）の細胞密度で播種した。
結論：
１．ＭＣ濃度は５～１０ｃｍ２／ｍＬの範囲で最適であった。最適であると決定されたＭＣ濃度は、７．２ｃｍ２／ｍＬ、すなわちスピナーフラスコ内の５０ｍＬ接種培地中１グラムのＭＣ（３６０ｃｍ２）であった。
２．継代終了時に最も高い細胞密度を可能にするので、最も効率的なＭＣ濃度は、１０ｃｍ２／ｍＬである。２０ｃｍ２／ｍＬで、２倍多くの細胞が播種されたとしても、最終的な収率は、半分のＭＣ濃度によって達成されるものに非常に近い。
接種培地中の低下した血清
表７：低下した試験
結論－継代終了時に細胞密度をより高くすることを可能にし、より高い収率及び容器当たりの総細胞をもたらすので、ＴＣフラスコ内で行われた他の研究と同様に、Ｎｕｔ／ＨＳＡ中の２％ＨＳ濃度は、標準的な２０％ＨＳ／ＤＭＥＭ播種培地を置き換えることができる。
表８：ＭＣ上での増殖の間のＮｉｃの存在
結論：Ｎｉｃの添加は、各継代の最終細胞収率の５０％の増加をもたらした。結果は有意であった（Ｐ＜０．０５）
０．１Ｌスピナーフラスコ内のｍｃ上でのＲＰＥ増殖の開発段階についての結論：
１．試験した６種類のＭＣから、Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ ＭＣがＲＰＥ増殖を最もよく支持することが明らかとなった。
２．ＲＰＥ細胞は、９０，０００個の細胞／ｃｍ２～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の範囲で良好に増殖した。この密度範囲は、ＴＣフラスコで見られた範囲と同一である。
３．ＲＰＥ増殖は、２つの栄養供給方法で同等であった。ＭＣを使用する場合のスケールアップがより簡単であり、費用対効果がより高いので、１／２培地交換よりフェドバッチを選択した。
４．継代終了時に最も高い細胞密度を可能にするので、最も効率的なＭＣ濃度は、１０ｃｍ２／ｍＬであることが明らかとなった。２０ｃｍ２／ｍＬで、２倍多くの細胞が播種されたとしても、最終的な収率は、半分のＭＣ濃度によって達成されるものに非常に近かった。
５．継代終了時により高い細胞密度を可能にするので、ＴＣフラスコ内で行われた以前の研究と同様に、ｎｕｔ／ＨＳＡ中の２％ＨＳ濃度は、標準的な２０％ＨＳ／ＤＭＥＭ播種培地を置き換えることができる。収率及び容器あたりの総細胞もより高かった。
６．Ｎｉｃの添加は、各継代の最終細胞収率の５０％の増加をもたらした。結果は有意であった（ｐ＜０．０５）
【0161】
実施例３
さらなる適切なＭＣの種類のスクリーニング
さらなる適切なＭＣの種類のスクリーニング
【0162】
ＲＰＥ－Ｐｒｏ－０５研究では、ＲＰＥ増殖を支持するための適合性について、追加のＭＣの種類をスクリーニングした。この研究で試験された市販のマイクロキャリアを表９に示す。
表９：ＲＰＥ増殖に対するＭＣ適合性のさらなる試験
表９：ＲＰＥ増殖に対するＭＣ適合性のさらなる試験
【0163】
実施例４
本実施例の目的は、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏＦｌｏ ３２０バイオプロセスシステムによって監視された、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの使い捨て３Ｌバイオリアクタ（ＳＵＢ）ＢｉｏＢｌｕ ３Ｃ中でのＲＰＥ細胞の増殖のためのスケールアップされたプロセスの開発を要約することである。
本実施例の目的は、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏＦｌｏ ３２０バイオプロセスシステムによって監視された、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの使い捨て３Ｌバイオリアクタ（ＳＵＢ）ＢｉｏＢｌｕ ３Ｃ中でのＲＰＥ細胞の増殖のためのスケールアップされたプロセスの開発を要約することである。
【0164】
スピナーフラスコ内のＳｔａｒ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（ＭＣ）上でのＲＰＥ増殖の開発は、バイオリアクタ中の制御された条件下にて、マイクロキャリア（ＭＣ）上でＲＰＥ細胞を増殖させるための予備研究においてさらに適用することができるプロセスパラメータについての基礎を提供した。これらのパラメータは、播種細胞密度、播種撹拌速度、ＭＣ濃度、及び栄養供給方式である。
【0165】
この系は、その独自のソフトウェアを利用して、通気方式（空気、Ｏ２、ＣＯ２、Ｎ２）ｐＨ、温度及び撹拌速度を含む、細胞培養において必要とされるプロセスパラメータの変化する継続的な制御を要求する細胞培養用途を監視及び制御する。
【0166】
培地含有バッグを接続するためにバイオウェルダーを利用することにより、ＳＵＢを「閉鎖系」として維持することが可能となった。大幅なスケールアップを支持することができる閉鎖系を維持することを目的として、以前は開放した４０ミクロンメッシュを使用して手動で行われていたＭＣ及び他の大きな粒子（マトリックス及び細胞凝集体）からＲＰＥ細胞を分離するための現行のろ過手順は置き換えられた。
【0167】
材料、装置及び細胞
【0168】
表１０：材料
【0169】
表１１ 装置
【0170】
略語及び定義
ＣＳ５－Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ５％
ＤＰ－製剤
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー単層分化
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン
ＩＣＢ－中間細胞バンク
ＭＣ－マイクロキャリア
Ｎｉｃ－ニコチンアミド
ＮＵＴＳ－Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（細胞培養培地）
ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）ＴＡＩ－ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）’Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｉｎｊｅｃｔ’
ＲＰＥ－網膜色素上皮細胞。
ＲＰＭ－分当たり回転数
ＳＦ－スピナーフラスコ
ＳＵＢ－使い捨てバイオリアクタ
ＣＳ５－Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ５％
ＤＰ－製剤
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー単層分化
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン
ＩＣＢ－中間細胞バンク
ＭＣ－マイクロキャリア
Ｎｉｃ－ニコチンアミド
ＮＵＴＳ－Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（細胞培養培地）
ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）ＴＡＩ－ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）’Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｉｎｊｅｃｔ’
ＲＰＥ－網膜色素上皮細胞。
ＲＰＭ－分当たり回転数
ＳＦ－スピナーフラスコ
ＳＵＢ－使い捨てバイオリアクタ
【0171】
実験デザイン
【0172】
Ｔ１７５フラスコ上で、Ｐ０（ＲＰＥ細胞分化の終了及び増殖の開始）から第１の継代、Ｐ１、９～１４日の終了まで、ＲＰＥ細胞を増殖させた。次いで、細胞を採集し、９０，０００～１２０，０００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で、３．６～７．２ｃｍ２／ｍＬのＭＣ濃度でＳＵＢに接種した。接種の３～４日後、培地（２０％ＨＳ／ＤＭＥＭ）を、ＨＳＡを含む又は含まない増殖培地Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ｍｉｎｕｓ（Ｎｕｔ（－））で置き換えた。培地添加の前にグルコース及びラクタートレベルを測定し、グルコースを２～３グラム／Ｌになるように（加えて、現在の消費に従って週末分を補うための追加のグルコース）補充した。
【0173】
ＭＣ上での増殖に対する対照として、接種後約１０分の細胞をＳＵＢからサンプリングし、並行して培養するスピナーフラスコに移した。他のプロセス修正が各実行中に試験及び実施され、表１２に記録されている。
表１２：実行順の研究デザインリスト
表１２：実行順の研究デザインリスト
【0174】
実験手順
【0175】
解凍された又は進行中の分化ＲＰＥ細胞源は、ヒト臍帯上又はフィーダーフリー条件で増殖させたｈＥＳＣに由来し、ＳＵＢ中のＭＣ上に播種する前にＴフラスコ内で増殖させた。ＮＣ－２００細胞計数器を使用して細胞を計数し、接種された細胞の数で割ることによって収率を計算した。細胞形態並びにラクタート及びグルコースレベルを継代に沿って調べた。継代の終わりに、各条件のＲＰＥ細胞培養物を採集し、収率を対照スピナーフラスコ（ＳＵＢ接種体積の１／３０（５０ｍｌ）で、ＳＵＢ接種の１０分後に採取されたＲＰＥ細胞と培養）と比較した。いくつかの実験では、継代終了時の凍結細胞試料を回収、同一性及び効力について試験した。
表１３－開発において使用された細胞
表１３－開発において使用された細胞
【0176】
結果
【0177】
主な発見が以下にまとめられている。形態は図２に示されている。示されたＭＣＳ研究の形態的評定は、ＭＣ表面上のＲＰＥ細胞の外層を示す。継代の終わり近くでの（図２に日数が示されている）、ＭＣに付着したＲＰＥ細胞の４×対物レンズでの代表的な位相画像。
【0178】
収率
表１４：細胞数及び接種時の関連パラメータ及び最終収率の推定
表１４：細胞数及び接種時の関連パラメータ及び最終収率の推定
【0179】
＊ＭＣＳ１及びＭＣＳ２では、培養物をスピナーフラスコ内に移した。最終的な示された収率は、採集されたスピナーフラスコから得られる。＊＊ＭＣＳ７及びＭＣＳ８では、継代に沿っていくつかの試料（それぞれ全体積の３％）を採取した。表１４に示されているＭＣ表面積（第３列－最終表面密度）は採集時の最終である；接種ＭＣ表面積は、ＭＣＳ７－１０，８００ｃｍ２、ＭＣＳ８－８，２０８ｃｍ２であった。
【0180】
グルコース及びラクタートの測定
表１５：継代に沿ったグルコース消費速度
表１６：継代に沿ったラクタート消費速度
表１５：継代に沿ったグルコース消費速度
表１６：継代に沿ったラクタート消費速度
【0181】
グルコース消費及びラクタート生産は、現在のレベルから前のレベル（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を差し引き、結果を前の測定以来の期間（日数）で割ることによって計算した。ＣＨＯ細胞などのバイオリアクタで培養されるほとんどの細胞株では、ラクタート生産レベルは継続的に増加するが、ＲＰＥ細胞培養では増加しない。グルコース消費の相対的減少は、培養が集密状態に達したことを示したのに対して、ラクタート生産の減少は、ＲＰＥ細胞によるラクタート消費を伴い得る、解糖から酸化的リン酸化へのシフトを示す。
表１７ ＴＥＥＲ測定値（ＱＣ－ＷＩＮ－１１による改変アッセイの結果）
表１７ ＴＥＥＲ測定値（ＱＣ－ＷＩＮ－１１による改変アッセイの結果）
【0182】
結論
【0183】
ＢｉｏＦｌｏ ３２０バイオプロセスシステムと組み合わされたＢｉｏＢｌｕ ３Ｃ ＳＵＢは、制御された及び監視された環境下でＭＣ上でのＲＰＥ細胞の増殖を維持及び支持する上での再現性及び堅牢性を実証した。３気体ミックスアルゴリズム（Ｏ２、ＣＯ２及び空気）は、ＲＰＥ増殖を３０％ＤＯ設定点に維持するのに有効である。プロセスに沿って撹拌を調整した；十分な細胞付着接種を達成するために、２２ＲＰＭで実行し、次いで、ＭＣの完全な懸濁のために撹拌をさらに２９ＲＰＭまで増加させ、最後に撹拌を４０ＲＰＭまで上昇させて培養物中のガス溶解の効率を増加させ、増殖している細胞による酸素消費速度の増加を促進した。４つの独立した実行（ＭＣＳ３、ＭＣＳ６、ＭＣＳ７及びＭＣＳ８）は、ろ過前のＢｉｏＢｌｕ ３Ｃ ＳＵＢ中での増殖終了時に良好な細胞収率を与えた。Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ５０μｍフィルタを使用したろ過は、２つの実行において成功したが、２つの他の実行では、細胞の有意な喪失が観察された。ろ過プロセスをさらに改善するための努力が継続中である。３つの実行のうちの２つにおいて、解凍されたバイアルは効力アッセイに合格し、ＭＣ上のＳＵＢ中で増殖させたＲＰＥ細胞がそれらの特性及び生物学的活性を保持したことを示した。最適な採集日は１４日目であることが明らかとなったので、将来の細胞採集は、運用上の柔軟性を可能にするために１３～１４日目に実行されるであろう。
【0184】
最終的なプロセスパラメータを表１８に要約する。
表１８：溶液体積、ＭＣ量及びプロセスパラメータの設定点
表１９．データの要約
表１８：溶液体積、ＭＣ量及びプロセスパラメータの設定点
表１９．データの要約
【0185】
実施例５
本実施例は、以前に確立されたプロセス開発に基づいて、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏｆｌｏ ３２０バイオプロセスシステムを使用する３Ｌ使い捨てバイオリアクタ中のＭＣ上での（一増殖継代のための）ＲＰＥ細胞の増殖のためのスケールアップされた生産プロセスの開発を要約する。
本実施例は、以前に確立されたプロセス開発に基づいて、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏｆｌｏ ３２０バイオプロセスシステムを使用する３Ｌ使い捨てバイオリアクタ中のＭＣ上での（一増殖継代のための）ＲＰＥ細胞の増殖のためのスケールアップされた生産プロセスの開発を要約する。
【0186】
ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）「Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｉｎｊｅｔｃｔ」（ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ）プロセス開発は、監視された及び制御された条件下での、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の接種、増殖及び採集を包含する大規模生産プロセスの実施を含む。このスケールアップされたプロセスの開発は、ＲＰＥ細胞の最終（Ｐ２）増殖期におけるＲＰＥ細胞の増殖に焦点を当てており、より早期の増殖期（Ｐ０及びＰ１）は、現在、フラスコ依存性のままであり、現在の実施から変化していない。
【0187】
フラスコ依存性プロセスから大規模な半自動化閉鎖系へのこの移行の基礎は、２つの基本的な変化に依存する。１つは、卓上バイオプロセスシステム、例えば、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏＦｌｏ ３２０に、細胞培養プロセスにおいて使い捨て容器を制御するための柔軟性を組み込んだことである。この系は、その独自のソフトウェアを利用して、細胞培養において必要とされるプロセスパラメータの変化する継続的な制御を要求する細胞培養用途を監視及び制御する。第２の変化は、ＲＰＥ細胞の接着のために必要とされる表面を提供するマイクロキャリア（ＭＣ）上でＲＰＥ細胞を増殖させる能力であり、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）の品質属性及び特徴に影響を与えることなくゼラチンでコーティングされた組織培養フラスコ表面を置き換える。この開発されたプロセスは、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセス中の無菌リスクを軽減するという全体的な意図にも寄与する。
【0188】
目的及び範囲
【0189】
ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏｆｌｏ ３２０バイオプロセスシステムを使用する３Ｌ使い捨てバイオリアクタ中のＭＣ上でのＲＰＥ細胞の増殖（一継代の増殖）のためのスケールアップされた生産プロセスの開発を要約する。ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩスケールアップ製造プロセスを紹介し、描写する。
【0190】
略語及び定義
ＢｉｏＦｌｏ ３２０－Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの自動監視及び制御バイオプロセスシステム。
ＢＬＯＤ－検出限界未満
不感帯－出力に変化が存在しない指定された範囲内の入力のスパン。
ＤＭＥＭ－ダルベッコ改変イーグル培地。
ＤＯ－溶存酸素（％）。
ＤＳ－原体。
ＥＣＭ－細胞外マトリックス。
フェドバッチ－培養中に１つ又は複数の栄養素がバイオリアクタに栄養供給（供給）され、生成物が実行の終了までバイオリアクタ内に留まる操作技術。
ＦＦ－フィーダーフリーｈＥＳＣ。
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー単層分化。
ＧＲＰ－群
ＨＳ－ヒト血清。
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン。
ＩＣＢ－中間細胞バンク。
接種－バイオリアクタ内への細胞の移入。
ＬＭ５２１－ラミニン５２１。
ＭＣ－マイクロキャリア。
ＮＵＴ（－）／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（細胞培養培地）。
ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）ＴＡＩ－ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）「Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｉｎｊｅｃｔ」（新しいＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）製剤）。
ＰＢＳ－リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＥ－網膜色素上皮細胞。
ＲＰＭ－分当たり回転数。
ＳＦ－スピナーフラスコ。
ＳＬＰＭ－分当たり標準リットル。
ＳＰ－設定点。
ＳＵＢ－使い捨てバイオリアクタ。
温度－温度。
ｗ／ｖ－重量対体積比。
表２０．材料及び消耗品。
表２１．装置
ＢｉｏＦｌｏ ３２０－Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの自動監視及び制御バイオプロセスシステム。
ＢＬＯＤ－検出限界未満
不感帯－出力に変化が存在しない指定された範囲内の入力のスパン。
ＤＭＥＭ－ダルベッコ改変イーグル培地。
ＤＯ－溶存酸素（％）。
ＤＳ－原体。
ＥＣＭ－細胞外マトリックス。
フェドバッチ－培養中に１つ又は複数の栄養素がバイオリアクタに栄養供給（供給）され、生成物が実行の終了までバイオリアクタ内に留まる操作技術。
ＦＦ－フィーダーフリーｈＥＳＣ。
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー単層分化。
ＧＲＰ－群
ＨＳ－ヒト血清。
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン。
ＩＣＢ－中間細胞バンク。
接種－バイオリアクタ内への細胞の移入。
ＬＭ５２１－ラミニン５２１。
ＭＣ－マイクロキャリア。
ＮＵＴ（－）／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（細胞培養培地）。
ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）ＴＡＩ－ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）「Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｉｎｊｅｃｔ」（新しいＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）製剤）。
ＰＢＳ－リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＥ－網膜色素上皮細胞。
ＲＰＭ－分当たり回転数。
ＳＦ－スピナーフラスコ。
ＳＬＰＭ－分当たり標準リットル。
ＳＰ－設定点。
ＳＵＢ－使い捨てバイオリアクタ。
温度－温度。
ｗ／ｖ－重量対体積比。
表２０．材料及び消耗品。
表２１．装置
【0191】
実験手順：
【0192】
Ｐ１の最後での、Ｔ１７５フラスコ上で増殖させた分化したＲＰＥ細胞の採集。組換えヒトゼラチンでコーティングされたＴ１７５フラスコ上で増殖させた、ＦＦＭＤプロセスでの分化したＲＰＥ細胞の採集（ＭＣＳ９を除いて、細胞はＩＣＢから解凍され、ＳＵＢ接種前にフラスコ上で増殖させた）。Ｐ２への１ＲＰＥ増殖継代のために（Ｐ１で接種されたＭＣＳ１１Ａを除く）、フラスコ内で進行中のＲＰＥ ＦＦＭＤ分化手順からの採集されたＲＰＥ細胞（ＩＣＢから生じたＭＣＳ９を除く）をＳＵＢに接種する。各実行の細胞の起源を以下の表２２に記載する。
表２２：開発研究における細胞起源
１ ＩＣＢからの解凍された細胞。
表２２：開発研究における細胞起源
【0193】
ＳＵＢ接種ＭＣ種類の選択、接種に必要な細胞数及び接種パラメータ（培地体積及び撹拌速度）を、Ｃｏｒｎｉｎｇスピナーフラスコを用いて開発した。ＭＣ上の採集されたＲＰＥ細胞のＳＵＢへの接種は、フラスコを採集することから得られたＲＰＥ細胞の最終収率に応じて、１００，０００～１２０，０００個の生細胞／ｃｍ２のＭＣに最適化された。ＭＣのＨＳでのコーティングを可能にして、細胞接着を改善し、ＳＵＢ中に均一なＭＣ懸濁液を達成するために、接種前に、３７℃で、ＳＵＢ中で接種培地（２０％ ＨＳ／ＤＭＥＭ）及びＭＣを少なくとも２０分間平衡化させる。ＤＯ、ｐＨ、ガス処理及び培地交換／添加などの他のパラメータは、ＭＣＳ１～ＭＣＳ８研究中に確立されたとおりである。
【0194】
撹拌速度
【0195】
スピナーフラスコとＳＵＢは、羽根車と容器のサイズ及び形状が大きく異なるため、十分な混合及び酸素移動を可能にしながら、スピナーフラスコからＳＵＢへの移行中に比較的一定の剪断力レベルを維持するための「一定の羽根車先端速度」原理を適用することによって撹拌速度を確立した。「一定の先端速度」は、以下の式Ｉに従って計算した。
先端速度＝π×ｄ×Ｎ
式中、ｄ＝羽根車の外径（ｍ）
Ｎ＝撹拌速度（ｒｐｍ）
表２３：ＳＵＢ接種条件
先端速度＝π×ｄ×Ｎ
式中、ｄ＝羽根車の外径（ｍ）
Ｎ＝撹拌速度（ｒｐｍ）
表２３：ＳＵＢ接種条件
【0196】
接種条件を４日間維持した後、培地を交換した。
表２４：研究あたりのＳＵＢ接種サイズ
表２４：研究あたりのＳＵＢ接種サイズ
【0197】
１プロトコルに記録されているように、様々な研究管理のために、総接種生細胞数の約３．３％をＳＵＢから採取した。
【0198】
３Ｌ ＳＵＢ中のＭＣ上でのＲＰＥ細胞の増殖
【0199】
接種後４日目に、接種培地を同体積（１．５Ｌ）のＮＵＴ（－）／ＨＳＡで置き換え、細胞付着を確認するためにＭＣへの細胞の付着を観察した。ＲＰＥ細胞の増殖は、フェドバッチ栄養供給方式並びに温度、ＤＯ、ｐＨ、撹拌及びガス処理の制御されたパラメータの下で行われた。栄養供給方式、温度及び撹拌速度は、Ｔフラスコ及びＳＦを使用して以前に確立されているが、環境パラメータ－ＤＯ、ｐＨ及びガス処理－は、ＳＦでの以前の経験に基づいてスケールアップすることができなかった。これらのパラメータ設定点は、以前のＭＣＳ１～８の実行及び一般的な慣行に基づいて開発及び確立された。
【0200】
前述のように、ＭＣ挙動の本発明者らの観察と同時に「一定の羽根車先端速度」原理を適用することによって撹拌速度のスケールアップを確立し、沈降を最小限に抑えながら又はなくしながらＭＣを培地中に懸濁させ続けることを目指した。ＮＵＴ（－）／ＨＳＡによる培地交換の直後に、撹拌速度をまず４日目に２２ｒｐｍから２９ｒｐｍに増加させる。この増加は、ＳＵＢ中での温度安定性及びＭＣ懸濁の両方を改善し、これは培養物の全体的によりよい均一性をもたらすが、剪断応力を比較的低く保つ。撹拌を７日目に４０ｒｐｍにさらに増加し、プロセスの継続期間中不変のままに保って、より大きな体積でのＭＣ懸濁を改善する。
表２５：増殖期ＳＰ
表２５：増殖期ＳＰ
【0201】
ｐＨ設定点は７．２５に設定され、不感帯は１．２５で、能動的な調節はない。ｐＨは、接種工程における約７．９の比較的高いｐＨ（主にＨＳの存在に寄与した）から、増殖終了時の約ｐＨ７．３まで、プロセスの間、時間と共に徐々に低下する。ＳＵＢの試料を測定するために外部アナログｐＨ計を使用することによってｐＨを確認し、実際のｐＨ値がＢｉｏＦｌｏ ３２０ ｐＨ値から±０．０５ ｐＨ単位を超えて外れた場合には、ｐＨの標準を実際の測定された値に改めた。ＲＰＥ細胞増殖中の栄養供給方式は、グルコース添加と共に、フェドバッチとして以前に確立された。別々の３つの日に、２～３日の間隔で、３Ｌの最終体積まで培養物に０．５ＬのＮＵＴ（－）／ＨＳＡを補充する。代謝産物試験装置を使用して測定した実際の毎日の培養物のグルコースレベルに基づいて、グルコースを２～２．５ｇｒ／Ｌまで（４５％ｗ／ｖのｄ－グルコース溶液を用いて）補充する。以下の表２６は、培地交換、フェドバッチ方式及び各実行の採集のスケジュールを詳述する。
表２６：培地交換、フェドバッチ方式及び採集スケジュール
Ｄ＝日
表２６：培地交換、フェドバッチ方式及び採集スケジュール
【0202】
最適な採集日を１４日目に設定されたので、動作の柔軟性のために１３～１４日の最小の増殖が決定された。
【0203】
ガス処理レジーム
【0204】
ＯｖｅｒｌａｙとＳｐａｒｇｅｒの両方を介したガス処理方式は、ＢｉｏＦｌｏシステムの自動３気体ミックスアルゴリズムによって能動的に制御される３つの気体（空気、酸素及び二酸化炭素）の混合物に基づいている。動作範囲は、ｈＥＳＣでの一般的な業界慣行に基づいて設定された。ＳＵＢは、２つの通気入口を有する。主たる入口は、酸素濃度（ＤＯ）を維持するために必要な３気体混合物がそれを介して供給されるピンホール焼結体である。第２の入口は、ヘッドスペース通気を維持するためのオーバーレイ入口である。両入口は、入ってくる気体をろ過するための予め設置された０．２μｍの５ｃｍディスクフィルタを有する。焼結体におけるような小さな孔径は、高い表面積を有する小さな気泡を生成し、したがって培地内への気体移動速度を改善する。しかしながら、そのような高レベルの小さな気泡は、液体ヘッドスペース境界での気体交換の減少をもたらし、最終的には排気フィルタを詰まらせる可能性さえある泡の形成をもたらし得る。気体流入は非常に少なく、これらの研究中に有意な発泡層の形成は観察されなかった。
表２７：３気体ミックスＳＰ
表２７：３気体ミックスＳＰ
【0205】
容器の圧力は培養物中の溶存気体に影響を及ぼし、したがってｐＨ及びＤＯに影響を及ぼす。全体的なガス圧の低下は、気体溶解度の低下を引き起こし、その結果、全体的な気体需要の増加をもたらし得る。ＳＵＢは陽圧下で動作するように設計されており、製造業者の推奨に従って、ＳＵＢ内のガス圧は０．４４ｂａｒｇ（６ｐｓｉｇ）を超えるべきではない。しかしながら、培養を維持するためには正のガス流が必要であるが、ＲＰＥ細胞の培養中には比較的低いガス流束が必要とされるので（表１８の２０行目及び２１行目、並びに表２７を参照）、これらの研究中に重大な圧力上昇は予想されず、観察もされなかった。さらに、ＳＵＢの予め設置されたベントフィルタは、最大５バールの最大圧力に耐えるように設計されている。
【0206】
接種、培地交換及びフェドバッチ培地添加
【0207】
フラスコ内でのＲＰＥの増殖とは対照的に、閉鎖系としてＳＵＢを維持するには、プロセス全体にわたる全ての培地添加及び交換が、培養物を外部環境にさらすことなく行われ、培養物を無菌状態に保つことが必要である。自動化されたバイオウェルダーを使用して、無菌かつ確実な方法で、ＳＵＢのポートに培地を含有するバッグを溶着する。使い捨てバッグには、ＳＵＢに溶着される前に、生物学的安全キャビネット内で必要な培地が予め充填される。
【0208】
採集
【0209】
Ｔ－フラスコ及びＳＦから採集されたＲＰＥ細胞のろ過を、４０μｍグリッドのメッシュを使用して確立した。手順のスケールを拡大し、いずれも０．１５ｍ２の表面積を有する５０μｍ又は６０μｍのフィルタサイズを使用して、必要とされる「閉鎖系」としてこの手順を確立した。これらのフィルタは、４０μｍグリッドのメッシュに孔径が最も近いため、ＤＳ懸濁液中に６０μｍより大きな粒子が存在しないことが確保される。
【0210】
ＲＰＥ細胞をＭＣから分離し、残存する大きな細胞凝集体及びＥＣＭから溶液を除去するために、閉鎖系を維持する５０μｍ（ＳＡＲＴＯＰＵＲＥ（登録商標））又は６０μｍ（ＶＡＮＧＵＡＲＤ（登録商標））の高容量フィルタを使用して、各ＳＵＢをフィルタにかけ、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔとの酵素的インキュベーション後に直ちにクエンチした。さらに、酵素的インキュベーションの最後、クエンチの直前にＳＵＢから試料を採取し、試料をクエンチし、スケールを拡大したろ過プロセスを評定するため及びＳＵＢの収率推定値を得るために、４０μｍメッシュのグリッドを使用してフィルタにかけた。
【0211】
懸濁液をフィルタにかける前に、約０．５Ｌのクエンチ溶液をフィルタに与え、次いで、蠕動式ポンプを介して、インキュベートされた懸濁液をフィルタに通す。細胞懸濁液を断続的にフィルタにかけて、フィルタの目詰まり及び潜在的な細胞損失を最小限に抑えるために、最大の可視的凝集体を含有する細胞懸濁液の画分が、ろ過の最終段階中にフィルタを通過するようにする。ろ過手順のこの部分は、ＭＣＳ９において得られた比較的低い細胞収率（表２８、ＭＣＳ９～１４の推定収率対最終収率を参照）に従って開発及び確立された。
【0212】
結果
【0213】
以下の結果は、ＭＣＳ９、ＭＣＳ１１Ａ、ＭＣＳ１１Ｂ、ＭＣＳ１３及びＭＣＳ１４のスケール拡大開発研究を表す。以下のアッセイから結果を得た：生存率（％）、回収率（％）、純度、ＨＥＳ残存、生物学的活性（効力）及び核学。
【0214】
ＱＣアッセイの合否判定基準
【0215】
生存率（％）≧７０％。回収率（％）：１００％±２５％生細胞／ｍｌ、２×１０６細胞／ｍｌの目標最終バッチ濃度に対して計算される。効力：正味のＴＥＥＲ（１４日目）：＞１００Ω・ｃｍ２；基底部ＶＥＧＦ／頂端部ＶＥＧＦ比（１４日目）：＞１．００；頂端部ＰＥＤＦ／基底部ＰＥＤＦ比（１４日目）：＞１．００純度：Ｐ２のＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）細胞は、９５．００％以上、ＣＲＡＬＢＰ及びＰＭＥＬ１７について二重陽性である。ＨＥＳ残存：細胞の０．０１０００％未満が、ＴＲＡ１－６０及びＯｃｔ－４について二重陽性である。核学：染色体に対する３つ未満の同一の欠失又は２つ未満の同一の付加。
【0216】
ＤＯ傾向
【0217】
図３に示されているように、培地が交換されるまで接種直後にＤＯ％の急激な低下が明らかである。このＤＯ％低下は、接種及び生存の成功を示す。ＭＣＳ９は、接種サイズが小さいため、接種中により高いＤＯ％値を示す。第２及び第３のフェドバッチでは、添加される培地の相対的な割合がより小さく、各フェドバッチでＳＵＢに入る空気が相対的により少ないため、減弱したＤＯ％スパイクをもたらす。
【0218】
最終ＤＳ収率
表２８：推定収率対実際の最終収率
表２８：推定収率対実際の最終収率
【0219】
酵素的インキュベーションの最後、クエンチの直前に各ＳＵＢから試料（６０ｍＬ）を採取し、試料をクエンチし、スケールを拡大したろ過プロセスを評定するため及びＳＵＢの収率推定値を得るために、４０μｍメッシュのグリッドを使用してフィルタにかけた。全ての研究の平均推定収率（表２８に提示）は約４．０９であり、ろ過後ＤＳにおいて測定された実際の最終収率に近く、平均最終収率は約２．８７であり、これは約３０％の平均フィルタ上損失を構成する。ＭＣＡ１１ Ａ、ＭＣＳ１１ Ｂ及びＭＣＳ１３は、ろ過後に約３．３５の最終平均ＤＳ収率を達成し、これはそれぞれの推定収率に類似する。ろ過前にフィルタを準備するための要件を確立する前に得られた研究ＭＣＳ９の最終収率は、その推定収率よりも約４４％低かった（４．７８対２．６８）。他の研究とは異なるフェドバッチ方式に供されたＭＣＳ１４は、予想より６０％低い最終収率を有した。
【0220】
生存率（％）及び回収率（％）の評定
【0221】
各研究の５つのバイアル（２×１０６細胞／ｍｌ）を解凍し、生存率（％）及び回収率（％）について評定した。結果を表２９に要約する
表２９：生存率（％）及び回収率（％）の結果
表２９：生存率（％）及び回収率（％）の結果
【0222】
解凍直後の全研究からの全バイアルの生存率（％）及び回収率（％）は、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ合否判定基準を満たした（表２９に提示）。生存率（％）は９０％以上に維持された。回収率（％）は７８％以上であり、平均は９０％であった。
【0223】
生物学的活性（効力）評定
【0224】
解凍された細胞を生物学的活性についてアッセイし、結果を表３０に要約する。
表３０：効力アッセイの結果
表３０：効力アッセイの結果
【0225】
全ての研究は、両効力法において生物学的活性アッセイの合否判定基準を満たしている。
【0226】
純度アッセイの結果
【0227】
解凍された細胞を純度についてアッセイし、結果を下の表３１に要約する。
表３１：純度（ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７）アッセイの結果
表３１：純度（ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７）アッセイの結果
【0228】
研究ＭＣＳ１１Ａ、ＭＣＳ１１Ｂ及びＭＣＳ１３から得られたＲＰＥ細胞は純度アッセイの合否判定基準を満たしたが、ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４からの細胞は満たさなかった。ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４の両方のフェドバッチ方式は他の研究とは異なっていたことに留意されたい。さらに、ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４はいずれも、最も低い最終収率を与え、これが最終細胞集団に影響を及ぼした可能性がある。
【0229】
％ｈＥＳＣ残存率アッセイの結果
【0230】
解凍された細胞をｈＥＳＣ残存率（％）についてアッセイし、結果を表３２に要約する。
表３２：ｈＥＳＣ残存率（％）（Ｏｃｔ－４／ＴＲＡ１－６０）アッセイの結果
表３２：ｈＥＳＣ残存率（％）（Ｏｃｔ－４／ＴＲＡ１－６０）アッセイの結果
【0231】
５つの研究全てから得られたＲＰＥ細胞は、ｈＥＳＣ残存％アッセイの合否判定基準を満たした（表３２）。
【0232】
核型分析
【0233】
Ｐ２の凍結バイアルを解凍し、２継代培養し、核型分析のために固定した。これらの研究の各々からの細胞の核型は正常であった；３つの同一の染色体欠失又は２つの同一の付加は認められなかった。１つの例外は、ｉｓｏｑ２０が見出されたＭＣＳ１１Ａであり、この結果は調査中である。
【0234】
考察
【0235】
ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産のスケールアップされたプロセスを確立するために、制御された及び監視された条件下にて、３ＬのＳＵＢ中で、１増殖継代の間、ＲＰＥ細胞をＭＣ上で培養した。より初期のスケールアップ研究ＭＣＳ１～８の間に徐々に改善された提案されたスケールアップしたプロセスパラメータの下で、５つの連続する開発研究ＭＣＳ９／１１Ａ／１１Ｂ／１３／１４を実行した。これらのパラメータは、堅牢で再現性のあるスケールアップされたプロセスをもたらすことが示されている。これらの研究におけるＤＯ傾向の調査は、ほぼ同一の挙動を明らかにする。最初の数日間継続する接種直後の急激な低下は、成功した接種及び生存率（％）を示す。次いで、ＤＯ％はＳＰ３０％で安定化し、その後、培地交換及びその後のフェドバッチ培地添加に対応する断続的なスパイクが続く。フェドバッチレジメンは、２～３日間隔で（表２６に示されているように、培地交換、フェドバッチ方式及び採集スケジュールで）栄養供給された場合により良好な最終細胞収率をもたらすことが示されており、４日間隔（ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４）は、その後、ろ過効率及びＲＰＥ成熟に関する最終集団組成に影響を及ぼすいくらかのストレスを培養物に誘発し得る。
【0236】
開発中、細胞損失を最小限に抑えるために、ＭＣ－細胞分離の前に、クエンチ溶液でフィルタを下準備することが改善であることが示された。さらに、（ＭＣＳ９で実行されたように）バルク体積全体を連続的に混合し、フィルタにかけるのではなく、ろ過の最終段階でのみ、大きな凝集体を含有する懸濁液画分を通過させることを含む改善されたろ過手順は、より高い細胞収率を得るために不可欠であることが証明された。ＭＣＳ１４で得られた有意により低い最終収率に関しては、異なる栄養供給レジメンに起因するものであり得、その実行中、第２のフェドバッチは、第１のファドバッチの３日後ではなく、４日後に補充された。これはＲＰＥ細胞によるより大きなＥＣＭの生産に寄与した可能性があり、最終的に、採集及びろ過中により成熟した細胞を捕捉した。
【0237】
提案されたフェドバッチレジメン（栄養供給の間が３日以下）及び改善されたろ過手順（すなわち、ＭＣＳ１１Ａ、ＭＣＳ１１Ｂ、及びＭＣＳ１３）の下で細胞が増殖し、得られることを考えると、開発されたスケールアップされたプロセスは、約３．３５の最終平均細胞収率（表２８を参照、３．３５の平均数はＭＣＳ１１Ａ＿１１Ｂ及び１３に関する）で、有効かつ再現性があることが示された。
【0238】
研究ＭＣＳ１１Ａ、ＭＣＳ１１Ｂ及びＭＣＳ１３の純度アッセイ結果（表３１に示されている）はアッセイの合否判定基準を満たしたが、ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４はこれらの合否判定基準を満たすことができなかった。理由は、ＭＣＳ９及びＭＣＳ１４のプロセスでの異なるパラメータによるものである。それらのそれぞれの実際のＦＡＣＳダイアグラムは、より成熟していない（より若い）ＲＰＥ細胞に典型的である、より低いＰＭＥＬ値を示す細胞のより幅広い集団を示す。より成熟していない細胞の、これらの通常より（すなわち、ＭＣＳ１３と比較して）相対的により幅広い集団は、最適化されていない採集手順が原因である可能性が最も高い。より成熟した細胞がより多くのＥＣＭを生産するにつれて、これによって、成熟ＲＰＥ細胞は、より成熟していないＲＰＥ細胞と比較して、ＴｒｙｐＬｅ Ｓｅｌｅｃｔとの酵素的インキュベーション中にＭＣから脱離しにくくなる。その結果、これらの成熟した細胞はろ過中にＥＣＭ凝集体内に捕捉され、このため、ろ過後に、ＤＳは、より成熟していないＲＰＥ細胞が比較的豊富になる。
【0239】
研究ＭＣＳ１１Ａ、ＭＣＳ１１Ｂ及びＭＣＳ１３は、純度アッセイの合否判定基準を満たし、最適化されたフェドバッチレジメン及びろ過手順がスケールアップされたＲＰＥ増殖の成功のために必要であることを示した。最終的なＲＰＥ集団における成熟の変動は、おそらくは接種の結果である固有の不均一なＭＣ細胞密度をもたらす可能性がある。３Ｄ撹拌される細胞増殖プラットフォームであるＭＣは、２Ｄ静的組織培養フラスコとは対照的に、接種中に細胞の不均一な分布をもたらしやすい（図４に示されているとおり）。最終集団の多様な成熟度は、ＲＰＥ細胞にとって有益である可能性が高い。
【0240】
ｈＥＳＣ残存率（％）アッセイの結果は、ＯｐＲｅｇｅｎ（登録商標）ＴＡＩ合否判定基準を満たした。全ての研究は、両アッセイの方法の下で生物学的活性（効力）アッセイの合否判定基準を満たしている。５つの研究のうち４つの核型分析結果は正常であった；研究の１つは異常な核型（Ｉｓｏｑ２０（３／５０））を示し、これを調査した。
【0241】
要約すると、バイオプロセスシステム全般及び特にスケールアップされた増殖プラットフォームは、必要とされるＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）の品質属性及び特徴を維持することによって、堅牢なＲＰＥ細胞増殖及び再現性のあるプロセスを維持及び支持することができる。
【0242】
結論
【0243】
ＢｉｏＦｌｏ ３２０バイオプロセスシステムと組み合わされたＢｉｏＢｌｕ ３Ｃ ＳＵＢは、現行のＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）プロセスにおいてＭＣ上でのＲＰＥ細胞の増殖を維持及び支持する上で堅牢性を実証した。制御された及び監視された条件下にて、３ＬのＳＵＢ中において、１０．８ｘ１０３ｃｍ２の表面積を有するＭＣ上でＲＰＥ細胞を培養することから、約４ｘ１０９のＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ細胞（最終ろ過後）を得ることができる。スケールアップされたろ過手順は、確立された細胞増殖プロセスのフェドバッチレジメン及び改善されたろ過手順が実施された場合に有効でありかつ再現性があることが示され、約３．３５の最終ＤＳ細胞収率をもたらした。
表３３：溶液体積、ＭＣ量及びプロセスパラメータの設定点
表３３：溶液体積、ＭＣ量及びプロセスパラメータの設定点
【0244】
実施例６
本実施例の目的は、ＧＭＰ ＦＦシードロットバンクのＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）Ｎｏｎ－ＧＭＰエンジニアリングランを要約することである。
本実施例の目的は、ＧＭＰ ＦＦシードロットバンクのＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）Ｎｏｎ－ＧＭＰエンジニアリングランを要約することである。
【0245】
商業生産に向けたＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）製造プロセスは、フィーダーフリー及び単層分化（ＦＦＭＤ）プロセスの開発を含む。ＦＦＭＤプロセスは、最小の無菌リスクとし、高度に制御されるべきであり、堅牢であるべきであり、自発的分化工程への依存はより少なくすべきである。
【0246】
開発されたＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）の商業的プロセスは、細胞の４つの段階に依存している：第１段階－フィーダーフリー（ＦＦ）ヒト胚性幹細胞をラミニン５２１（ＬＮ５２１）上で３週間増殖させる；第２段階－ｈＥＳＣをＲＰＥ細胞に分化させる、現行のＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）Ｔｈａｗ ａｎｄ Ｉｎｊｅｃｔ（ＴＡＩ）プロセスに基づいて開発されたｈＥＳＣのＦＦＭＤ手順を６～７週間実施する；第３段階－２継代（Ｐ０、Ｐ１）のＲＰＥ増殖、現在はＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩに対して行われたようにゼラチンでコーティングされたフラスコ上でさらに４週間行われる；第４段階－半自動の制御された閉鎖系（ＢｉｏＢｌｕ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＳＵＢ）を監視するＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏＦｌｏ３２０コンソール）におけるマイクロキャリア（ＭＣ）上でのＲＰＥ細胞の大規模培養。
【0247】
略語及び定義
ＣｏＡ－分析証明書
ＣＳ５－ＣｒｙｏＳｔｏｒ５
ＤＭＥＭ－ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＯ－溶存酸素
フェドバッチ－培養中に１つ又は複数の栄養素がバイオリアクタに供給され、生成物が実行の終了までバイオリアクタ内に留まるバイオテクノロジープロセスにおける培養技術
ＦＦ－フィーダーフリー
ＦＦＢ－フィーダーフリーバンク
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー及び単層分化
ＧＲＰ－群
ｈＥＳＣ－ヒト胚性幹細胞
ＨＳ－ヒト血清
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン
ＩＰＣ－工程内管理
ＬＮ５２１－ラミニン５２１
ＭＣ－マイクロキャリア
ＭＣＢ－マスター細胞バンク
ＮＩＣ－ニコチンアミド
Ｎｕｔ（－）ｗ／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍマイナス
Ｎｕｔ＋ｗ／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍプラス
ＰＤＬ－集団倍加レベル
ＰＯＣ－概念実証
ＱＣ－品質管理
Ｒ＆Ｄ－研究開発
ＲＰＥ－網膜色素上皮
ＲＰＭ－分当たり回転数。
ＳＤ－標準偏差
ＴＡＩ－解凍及び注入
ＴＥＥＲ－経上皮電気抵抗
ＴＳ－ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ
Ｖ－バージョン
ｗ／－あり
ｗ／ｏ－なし
ＣｏＡ－分析証明書
ＣＳ５－ＣｒｙｏＳｔｏｒ５
ＤＭＥＭ－ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＯ－溶存酸素
フェドバッチ－培養中に１つ又は複数の栄養素がバイオリアクタに供給され、生成物が実行の終了までバイオリアクタ内に留まるバイオテクノロジープロセスにおける培養技術
ＦＦ－フィーダーフリー
ＦＦＢ－フィーダーフリーバンク
ＦＦＭＤ－フィーダーフリー及び単層分化
ＧＲＰ－群
ｈＥＳＣ－ヒト胚性幹細胞
ＨＳ－ヒト血清
ＨＳＡ－ヒト血清アルブミン
ＩＰＣ－工程内管理
ＬＮ５２１－ラミニン５２１
ＭＣ－マイクロキャリア
ＭＣＢ－マスター細胞バンク
ＮＩＣ－ニコチンアミド
Ｎｕｔ（－）ｗ／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍマイナス
Ｎｕｔ＋ｗ／ＨＳＡ－ＨＳＡを含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍプラス
ＰＤＬ－集団倍加レベル
ＰＯＣ－概念実証
ＱＣ－品質管理
Ｒ＆Ｄ－研究開発
ＲＰＥ－網膜色素上皮
ＲＰＭ－分当たり回転数。
ＳＤ－標準偏差
ＴＡＩ－解凍及び注入
ＴＥＥＲ－経上皮電気抵抗
ＴＳ－ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ
Ｖ－バージョン
ｗ／－あり
ｗ／ｏ－なし
【0248】
手順及び方法：
【0249】
細胞：ＣＣＮ ＧＭＰ施設で凍結保存。
【0250】
実験手順
【0251】
ｈＥＳＣの増殖及びｈＥＳＣの融解
【0252】
凍結細胞の１つのバイアルを解凍し、Ｎｕｔ＋ｗ／ＨＳＡ培地中、５μｇ／ｍｌのＬＮ５２１でコーティングされた皿の上に６，０００個の生細胞／ｃｍ２で播種した。ｈＥＳＣを培養した。細胞培養物が５０％を超える集密度に達したら、細胞を採集し、計数し、ｈＥＳＣ増殖Ｉのために３，５００個の生細胞／ｃｍ２で播種した。
【0253】
ｈＥＳＣ増殖Ｉ
【0254】
Ｎｕｔ＋ｗ／ＨＳＡ培地を含む、５μｇ／ｍｌのＬＮ５２１でコーティングされた皿の上で、さらに１継代ｈＥＳＣを継代した。細胞培養物が５０％を超える集密度に達したら、細胞を採集し、計数し、ｈＥＳＣ増殖ＩＩのために４，０００個の生細胞／ｃｍ２で播種した。さらに、採集されたｈＥＳＣからの試料を多能性マーカーについて評価した。
【0255】
ｈＥＳＣ増殖ＩＩ
【0256】
Ｎｕｔ＋ｗ／ＨＳＡ培地を含む、５μｇ／ｍｌのＬＮ５２１でコーティングされた皿の上にｈＥＳＣを播種した。培養の６日目から開始して、細胞培養物が８０％以上の集密度に達するまで、細胞形態及び集密度を評価した。さらに、多能性マーカーを試験するために、１つの等価なフラスコ（同じ条件下で培養）を採集した。
【0257】
ｈＥＳＣのＲＰＥへの分化
【0258】
ＮＩＣ Ｉ
【0259】
ｈＥＳＣ増殖ＩＩの終了時に、１０ｍＭ ＮＩＣが補充されたＮｕｔ＋ｗ／ＨＳＡからＮｕｔ－ｗ／ＨＳＡに培地を変更することによって、並びに細胞を５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び３７℃で２週間培養することによって、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）分化プロセスを開始した。
【0260】
ＮＩＣ＋アクチビンＡ
【0261】
５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び３７℃において、１０ｍＭ ＮＩＣ及び１４０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを補充されたＮｕｔ－ｗ／ＨＳＡと共に２週間、細胞を培養した。１４日の終わりに、因子分泌試験のために培地の試料を収集した。
【0262】
ＮＩＣ ＩＩ
【0263】
両眼顕微鏡下で軽度に色素沈着した領域が観察されるまで、５％Ｏ２、５％ＣＯ２中及び３７℃で、１０ｍＭ ＮＩＣを補充されたＮｕｔ－ｗ／ＨＳＡと共に、５日間細胞を培養した。次いで、正常酸素状態（２０％Ｏ２、５％ＣＯ２及び３７℃）でさらに１０日間細胞を培養した。１５日の終わり（分化の終わり）に、分化している細胞の形態を評価し、培地の試料を因子分泌試験のために収集し、ＴＳを用いて細胞を採集し、ＲＰＥ増殖段階のＰ０のために、６０，０００個の生細胞／ｃｍ２で、２０％ ＨＳ－ＤＭＥＭを含む、０．１％のｒｈ－ゼラチンでコーティングされた皿の上に播種した。さらに、細胞の試料をＲＰＥ純度／同一性について試験した。
【0264】
ＲＰＥ増殖
【0265】
Ｔ１７５フラスコ内のＲＰＥ（Ｐ０、Ｐ１）
【0266】
２０％ＨＳ－ＤＭＥＭ中で４日間、Ｐ０についてはＮｕｔ－ｗ／ＨＳＡ培地中で（１００％の集密度及びＲＰＥ多角形の典型的な形態に達するまで）さらに１１日間、５％ＣＯ２中及び３７℃で細胞を培養した（Ｐ０では、合計１５日間）。Ｐ０の終了時に、細胞を採集し、１２０，０００個の生細胞／ｃｍ２で、０．１％のｒｈ－ゼラチンでコーティングされた皿の上に播種した。さらに、ＲＰＥの純度／同一性及び残存ｈＥＳＣについて細胞を評価した。細胞をＰ１でさらに１３日間培養した後、採集し、Ｐ２のために播種した。
【0267】
ＳＵＢ中のＲＰＥ（Ｐ２）
【0268】
採集されたＰ１細胞を最適条件でＳＵＢに接種した。ＭＣを含む２０％ ＨＳ－ＤＭＥＭ播種培地をＳＵＢ中で少なくとも２０分間平衡化させた。その後、３７℃の接種条件で、１０，８００ｃｍ２のＭＣあたり１．２６×１０９個の生細胞（１１７，０００個の生細胞／ｃｍ２ＭＣ）；２２ｒｐｍ撹拌；３０％ ＤＯ；ｐＨ ７．２５で細胞を接種した。４日後、２０％ ＨＳ－ＤＭＥＭをＮｕｔ（－）ｗ／ＨＳＡ培地に交換したが、撹拌速度（３～７日目に２９ｒｐｍ及び７～１４日目に４０ｒｐｍ）を除いて、ＲＰＥ細胞の増殖条件は同じままである。Ｐ２増殖段階中の栄養供給方式は、グルコース添加と共にフェドバッチとして行われた。別々の３つの日（７、１０及び１２）に、０．５ＬのＮｕｔ（－）ｗ／ＨＳＡ培地を細胞培養物に３Ｌの最終体積まで補充する。代謝産物試験装置を使用して測定した実際の毎日の培養物のグルコースレベルに基づいて、グルコースを２．５ｇ／Ｌまで（４５％ｗ／ｖのｄ－グルコース溶液を用いて）補充する。１３日間の培養の終了時に、ＳＵＢを採集し、６０μｍフィルター（Ｖａｎｇｕａｒｄ）を用いて、ＲＰＥ細胞をフィルタにかけ、２×１０６細胞／バイアルで凍結保存した。
表３４：ＦＦＭＤ大規模ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセスのバッチリリース試験
表３４：ＦＦＭＤ大規模ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセスのバッチリリース試験
【0269】
結果
【0270】
工程内管理
【0271】
多能性。多能性マーカー（ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ－４／Ｎａｎｏｇ）の発現を各ｈＥＳＣ増殖段階の終わりに試験し、各アッセイにおける二重陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって測定し、以下の表３５に示した。
表３５：ｈＥＳＣ増殖段階に沿った多能性マーカーの発現
表３５：ｈＥＳＣ増殖段階に沿った多能性マーカーの発現
【0272】
多能性マーカーの発現は全てのｈＥＳＣ増殖段階にわたって高かった－ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０二重陽性細胞のパーセンテージは９７．９１％及び９５．３６％超であり、Ｏｃｔ－４／Ｎａｎｏｇ二重陽性細胞の％は９８．０９％及び９６．９６％であった。結果は、培養されたｈＥＳＣがＦＦＭＤ手順開始前にそれらの多能性を維持したことを示した。ｈＥＳＣ増殖工程ＩＩの終了時と比較したｈＥＳＣ増殖工程Ｉの終了時に観察されたマーカーの発現の軽度の低下は、分化プロセスのために必要とされる、ＦＦＭＤの開始前での細胞の意図されたより高い播種密度及び集密度に関連する。
【0273】
純度及び同一性
【0274】
ＦＦＭＤ及びＲＰＥ増殖段階の異なる段階に沿って、ＲＰＥマーカー（ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７）の発現を試験した。
表３６：ＲＰＥ分化及びＰ０に沿ったＲＰＥマーカーの発現。
表３６：ＲＰＥ分化及びＰ０に沿ったＲＰＥマーカーの発現。
【0275】
ＲＰＥ細胞の％は、ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７陽性細胞の％によって表される。分化段階の終わりに、ＲＰＥ細胞の％は４５．９６％であった。継代及びＰ０の終了時でのＲＰＥ細胞の濃縮後に、ＲＰＥ細胞の％は９７．９６％であり、この時点でバッチリリース合否判定基準（９５．００％超のＲＰＥ細胞）を満たした。
【0276】
残存ｈＥＳＣ
【0277】
残存ｈＥＳＣを決定するために、Ｐ０の終わりに、ｈＥＳＣ多能性マーカーＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４についてＲＰＥ細胞を染色した。ＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４の％は検出限界未満（０．０００４％未満）であった。
【0278】
プロセスに沿ったＰＥＤＦ分泌
【0279】
以前のＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ Ｖ１．１ランでは、培養培地に分泌されたＰＥＤＦレベルの規模の増加が、最終分化段階（アクチビンＡの終わり、分化の終わり）及び初期ＲＰＥ増殖段階（Ｐ０の終わり）で観察されたので、ＦＦＭＤプロセスにおいて及びこの非ＧＭＰエンジニアリングラン－ＦＦＭＤ大規模ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセスにおいてＰＥＤＦ濃度について試験するためにこれらのＩＰＣが選択された。ＰＥＤＦを評価するためのこれらの３つの点は、ＦＦＭＤ大規模ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセスのためのＩＰＣとして重要な、指標となる点であることが明らかとなった。ＮＩＣ＋アクチビンＡの終わり、分化の終わり（ＮＩＣ ＩＩの終わり）及びＰ０の終わりの３つの点で、培養培地中のＰＥＤＦ濃度を評価した。結果を表３７に示す。
表３７：プロセスに沿った培養培地へのＰＥＤＦの分泌
表３７：プロセスに沿った培養培地へのＰＥＤＦの分泌
【0280】
予想されたように、細胞集団がより純粋になり、ＲＰＥ集団が（プロセスの進行に沿って）より成熟するにつれてＰＥＤＦレベルが上昇した。ＮＩＣ及びアクチビンＡ工程の終わりと分化工程の終わりとの間で、ＰＥＤＦレベルが増加した（１０倍超高い）。分化の終わりとＰ０の終わりとの間で、ＰＥＤＦの上昇は中程度であった（２倍超高い）。
【0281】
プロセスに沿ったＰＤＬ
【0282】
ＲＰＥ分化中、分化プロセスのために播種された各ｈＥＳＣからいくつのＲＰＥ細胞が採集されたかを決定するために、収率の値を計算した。
表３８：分化及びＲＰＥ増殖中の細胞のＰＤＬ
表３８：分化及びＲＰＥ増殖中の細胞のＰＤＬ
【0283】
プロセスに沿った細胞倍加の数は、ＦＦＭＤプロトコルの以前のランと同様に約１６であった。
【0284】
バッチリリース
【0285】
生存率（％）及び総細胞数／バイアル
【0286】
２×１０６生細胞／ｍＬ／バイアルの濃度のＰ２の終わりでの凍結バイアル（ＭＣＳ１１Ｂ）を解凍し、回収率（％）及び生存率（％）について試験した。
表３９：解凍したバイアルの生存率（％）及び回収率（％）。
表３９：解凍したバイアルの生存率（％）及び回収率（％）。
【0287】
結果は、７５％を超える回収率（％）及び７０％を超える生存率（％）という合否判定基準を満たした。比較的低い回収率（％）の値は、いくつかの群を並行して凍結保存したことによる長いＤＰインキュベーション時間（２時間超）の結果であり得る。さらに、バイアルに入れる直前のＣＳ５における細胞の計数は、低濃度の生細胞（１．７５×１０６個の生細胞／ｍＬ）を示した。解凍結果後の細胞数をバイアルに入れる直前に計数された細胞の実際の数に対して正規化すると、約８９％の回収率となる。
【0288】
ＲＰＥ純度／同一性（ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７）をバッチリリースで評価した。Ｐ２の終わりでのＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ純度／同一性について９６．６５％二重陽性であった。
【0289】
極性化
【0290】
【0291】
【0292】
ｈＥＳＣの残存
【0293】
残存ｈＥＳＣの存在を決定するために、細胞を解凍し、ＴＲＡ－１－６０／Ｏｃｔ－４について染色した。ｈＥＳＣの％は検出限界（０．０００４％）未満であった。
【0294】
核型分析
【0295】
Ｐ２の凍結バイアルを解凍し、２継代培養し、核型分析のために固定した。細胞の核型は正常であった；試料中には、３つの同一の染色体欠失又は２つの同一の付加は認められなかった。
【0296】
考察
【0297】
商業的プロセスに向けたＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）製造のプロセス開発は、監視された及び制御された条件下にて大規模システムでＲＰＥ細胞を培養することに加えて、ＦＦ ｈＥＳＣのＦＦＭＤ手順を含む。この報告は、ＣＣＮ ＧＭＰ設備で製造された細胞の３Ｌ ＳＵＢ中でのＦＦＭＤ及びＲＰＥ増殖を含む生産プロセスを要約する。ＦＦＭＤプロセスの第１段階は、ＦＦ ｈＥＳＣの増殖を含む。ｈＥＳＣ増殖継代の各々での細胞多能性は高く、試験した全てのマーカーについて９５％を超えた。予想されたように、多能性マーカー発現の中程度の低下が、ｈＥＳＣ増殖Ｉ段階とｈＥＳＣ増殖ＩＩ段階との間で観察された。
【0298】
分化の終わりでの及びＰ０終わりでのＲＰＥ純度／同一性の評価は、細胞バンクから分化段階の終了時における４５．９６％のＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７発現ＲＰＥ細胞への細胞の分化の成功を実証した。分化した細胞の継代及び培養はＲＰＥ集団を濃縮し、Ｐ０の終わりで、ＣＲＡＬＢＰ／ＰＭＥＬ１７マーカーの共発現は９７．９６％であった。これらの結果は、以前のＦＦＭＤランにおいて見られたこれらの段階でのＲＰＥ純度の範囲内であった。さらに、培養培地中のＰＥＤＦ濃度は、ＲＰＥ増殖手順のＰ０までの分化が進行するにつれて、ＮＩＣ及びアクチビンＡ工程の終わりの２５６．１９ｎｇ／ｍｌ／日からＰ０の終わりの４，６８７．０２ｎｇ／ｍｌ／日まで上昇し、ＰＥＤＦ選択結果に従って選択された指標点について、ＲＰＥ集団の濃縮及び成熟を確認した。
【0299】
最終的に、プロセスの終わりに、ＢｉｏＢＬＵ ３Ｌ ＳＵＢを監視する半自動の制御された閉鎖系（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＢｉｏＦｌｏ ３２０コンソール）においてＭＣ上でＰ２継代の間、細胞を培養した。Ｐ２の終わりに、細胞を採集し、ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩとして凍結保存した。この開発されたＦＦＭＤ及び大規模非ＧＭＰエンジニアリングランにおいて生産されたＲＰＥ細胞は、実施された全てのバッチリリース試験において、全てのＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）が要求する合否判定基準を満たした。まとめると、これらの結果は、ＣＣＮ－ＦＦＨＥＳＣ－０１ ＭＣＢの ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）非ＧＭＰエンジニアリングランの開発されたプロセスを適格とする。
【0300】
結論
【0301】
非ＧＭＰエンジニアリングラン－ＦＦＭＤ大規模ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）生産プロセスはＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ ＩＰＣ及びリリース基準を満たす；ＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）ＴＡＩ中にｈＥＳＣの残存は存在せず、ＲＰＥ細胞の純度は損なわれなかった。さらに、細胞はそれらの生物学的活性を保持し、生存率（％）及び回収率（％）のＯＰＲＥＧＥＮ（登録商標）合否判定基準を満たした。
表４２
表４２
【0302】
実施例５
大規模な閉鎖された及び制御された環境でｈＥＳＣ由来のＲＰＥを増殖させるために、胎児由来ＲＰＥに対して確立されたように、Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌ）上でＲＰＥを増殖させるための方法を開発した。本発明者らの閉鎖系では、最適なＲＰＥ収率及び品質についてスクリーニングされたマイクロキャリアを含有する単一のバイオリアクタ内に、分化したＲＰＥ細胞を接種する。細胞の酸素消費は自動的に監視及び制御され、ＰＨ代謝産物及び温度も監視する。栄養供給レジメンは、必要に応じて新鮮な培地及びグルコースが添加されるフェドバッチモードで行われる。マイクロキャリア及び培地添加、細胞サンプリング採集及びろ過を含む全ての操作は、１時間の凍結セッションあたり最大２３００の数千のバイアルの制御された大規模凍結の後に、凍結媒体中の細胞懸濁液の最終生成物がクライオバイアル中に自動的に分注されるまで使い捨てバッグのチューブ溶着を使用することによって、制御された及び閉鎖された環境で行われる。
大規模な閉鎖された及び制御された環境でｈＥＳＣ由来のＲＰＥを増殖させるために、胎児由来ＲＰＥに対して確立されたように、Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（Ｓｏｌｏｈｉｌ）上でＲＰＥを増殖させるための方法を開発した。本発明者らの閉鎖系では、最適なＲＰＥ収率及び品質についてスクリーニングされたマイクロキャリアを含有する単一のバイオリアクタ内に、分化したＲＰＥ細胞を接種する。細胞の酸素消費は自動的に監視及び制御され、ＰＨ代謝産物及び温度も監視する。栄養供給レジメンは、必要に応じて新鮮な培地及びグルコースが添加されるフェドバッチモードで行われる。マイクロキャリア及び培地添加、細胞サンプリング採集及びろ過を含む全ての操作は、１時間の凍結セッションあたり最大２３００の数千のバイアルの制御された大規模凍結の後に、凍結媒体中の細胞懸濁液の最終生成物がクライオバイアル中に自動的に分注されるまで使い捨てバッグのチューブ溶着を使用することによって、制御された及び閉鎖された環境で行われる。
【0303】
本明細書の記述は多くの詳細な記載を含むが、これらは本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、単に現在好ましい態様のいくつかの例示を提供するものと解釈されるべきである。したがって、本開示の範囲は、当業者に明らかになり得る他の態様を完全に包含することが理解されよう。
【0304】
特許請求の範囲において、単数形の要素への言及は、明示的に述べられていない限り、「１つかつ１つのみ」を意味することは意図されず、むしろ「１つ又は複数」を意味することが意図される。当業者に公知の開示された態様の要素に対する全ての構造的、化学的及び機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、本特許請求の範囲に包含されることが意図される。さらに、本開示の要素、構成要素又は方法工程は、その要素、構成要素又は方法工程が特許請求の範囲に明示的に記載されているかどうかにかかわらず、公衆に提供されたことは意図されていない。本明細書の特許請求の範囲の要素は、その要素が「～のための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」という語句を使用して明示的に記載されていない限り、「ミーンズプラスファンクション（ｍｅａｎｓ ｐｌｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」要素として解釈されるべきではない。本明細書の特許請求の範囲の要素は、その要素が「～のための工程」という語句を使用して明示的に記載されていない限り、「ステッププラスファンクション」要素として解釈されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【国際調査報告】