特表 2024-528010 気管支肺異形成症（ＢＰＤ）及びＢＰＤ関連肺高血圧症の治療のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】気管支肺異形成症（ＢＰＤ）及びＢＰＤ関連肺高血圧症の治療のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/716 20060101AFI20240719BHJP

   A61K 31/7034 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/7008 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/7052 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

A61K31/716

A61K31/7034

A61P11/00

A61P9/12

A61K31/7008

A61K31/7052

A61K31/7048

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505131

(86)(22)【出願日】2022-07-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 US2022038426

(87)【国際公開番号】W WO2023009567

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/227,819

(32)【優先日】2021-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/873,453

(32)【優先日】2022-07-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518333214

【氏名又は名称】アユヴィス リサーチ インク．

【氏名又は名称原語表記】ＡＹＵＶＩＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】アチャリャ スチスミタ

(72)【発明者】

【氏名】ダス プラニャ

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA02

4C086EA08

4C086EA11

4C086EA22

4C086EA23

4C086NA14

4C086ZA42

4C086ZA59

(57)【要約】

本発明は、式（Ｉ）及びそのバリアントの化合物を、新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するのに十分な量で含む、新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するための組成物及び方法を含む。
【化１】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するための組成物であって、
式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物を含み、

【化1】

（式中、ｎ＝０～５であり；Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＣＨ_２であり；Ｙ＝フェニル、少なくとも１つのメチルで置換されているフェニル基、少なくとも１つのニトロで置換されているフェニル基、少なくとも１つの窒素で置換されているフェニル基、少なくとも１つのホウ素で置換されているフェニル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、４～６員のシクロアルキル、４～６員のヘテロシクロアルキルであり；Ｚ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又は非存在であり；Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_１＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_２＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ＮＨ_２、ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_３、Ｒ_４＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、３～６員のシクロアルキルである）
前記化合物の量が、前記新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するように選択される、前記組成物。

【請求項2】

式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物が、静脈内投与用に製剤化されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤又は塩を含む医薬組成物へと製剤化されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

肺内投与、肺胞内投与、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、局所投与、又は経口投与に適合した医薬組成物へと製剤化されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

エアロゾル、ネブライザー又はインヘラーへと製剤化されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

１又は２以上のリポソーム、ポリマー、塩又は緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗コリン剤、血管拡張剤、利尿剤、降圧剤、アセタゾラミド、抗生物質、抗ウイルス剤、免疫抑制薬、及びサーファクタントからなる群から選択される追加の治療剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

炎症を競合的に阻害し、肺組織損傷を保護するか又は肺組織傷害を抑えるようにマクロファージを調節する量で提供される、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

対象が小児若しくは成人のヒトであるか、又は幼体若しくは成体の動物である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

噴霧デバイス又は加圧送達デバイスである送達デバイス用に製剤化されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

化合物が、Ｚ＝非存在である式Ｉの化合物である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

式Ｉの化合物が

【化2】

である、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

化合物が、

【化3】

の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するための方法であって、
それを必要とする対象に、治療有効量かつ相乗作用量の、肺抽出物から単離された肺サーファクタント又はその合成等価物、及び
式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物を含み、

【化4】

（式中、ｎ＝０～５であり；Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＣＨ_２であり；Ｙ＝フェニル、少なくとも１つのメチルで置換されているフェニル基、少なくとも１つのニトロで置換されているフェニル基、少なくとも１つの窒素で置換されているフェニル基、少なくとも１つのホウ素で置換されているフェニル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、４～６員のシクロアルキル、４～６員のヘテロシクロアルキルであり；Ｚ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又は非存在であり；Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_１＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_２＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ＮＨ_２、ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_３、Ｒ_４＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、３～６員のシクロアルキルである）
を投与することを含み、
前記化合物の量が、前記新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するように選択される、前記方法。

【請求項15】

化合物が、式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

組成物が、１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤又は塩を含む医薬組成物へと製剤化されている、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

組成物が、肺内投与、肺胞内投与、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、局所投与、又は経口投与に適合した医薬組成物へと製剤化されている、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

組成物が、エアロゾル、ネブライザー又はインヘラーへと製剤化されている、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

組成物が吸入剤形を形成する、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

１又は２以上のリポソーム、ポリマー、塩又は緩衝剤を添加することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗コリン剤、血管拡張剤、利尿剤、降圧剤、アセタゾラミド、抗生物質、抗ウイルス剤、免疫抑制薬、及びサーファクタントからなる群から選択される１又は２以上の追加の治療剤を添加することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項22】

組成物が、炎症を競合的に阻害し、肺組織損傷を保護するか又は肺組織傷害を抑えるようにマクロファージを調節する量で提供される、請求項１４に記載の方法。

【請求項23】

対象が小児若しくは成人のヒトであるか、又は幼体若しくは成体の動物である、請求項１４に記載の方法。

【請求項24】

組成物が、噴霧デバイス又は加圧送達デバイスである送達デバイス用に製剤化されている、請求項１４に記載の方法。

【請求項25】

化合物が、Ｚ＝非存在である式Ｉの化合物である、請求項１４に記載の方法。

【請求項26】

式Ｉの化合物が

【化5】

である、請求項１４に記載の方法。

【請求項27】

化合物が、

【化6】

の少なくとも１つから選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項28】

処置の前に、肺炎症、窮迫又は不全のための処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０２１年７月３０日に出願された米国仮出願第６３／２２７，８１９号明細書の優先権を主張するものである。

【0002】

本発明は、概して、肺高血圧症のための治療の分野、より詳細には新生児肺傷害（neonatal lung injury）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ：bronchopulmonary dysplasia）及びＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ：BPD-associated pulmonary hypertension）を予防又は治療するための予防的治療処置のための組成物及び方法に関する。

【0003】

連邦政府の資金による研究の申告
なし。

【0004】

コンパクトディスクで出願された資料の参照による組み込み
なし。

【背景技術】

【0005】

本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景技術は、呼吸窮迫（respiratory distress）と関係して記載される。

【0006】

気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は、妊娠２８週未満かつ出生体重１０００グラム未満で生まれた乳児において生じる新生児の状態である。ＢＰＤについての最も強力なリスク因子は、未熟性及び低出生体重である（Bhandari, V. (2016). Bronchopulmonary Dysplasia）。早産に伴い、赤子は未熟な肺を有する。罹患した乳児は肺の成長により時間と共に改善し得るが、小児期から成人期までにわたり、神経発達障害、喘息及び肺の気腫性の変化による重大な罹患率に苦しむこととなる。多くの薬物によってＢＰＤを予防／減弱することが試みられたが（Bhandari, V. (2014). "Drug therapy trials for the prevention of bronchopulmonary dysplasia: current and future targets." Front Pediatr 2: 76、Sahni, M. and V. Bhandari (2020). "Recent advances in understanding and management of bronchopulmonary dysplasia." F1000Res 9）、利用可能な特異的かつ有効な治療はなく、したがって、この疾患は、依然として高い死亡率及び罹患率に関連している（Lui, K., S. K. Lee, S. Kusuda, M. Adams, M. Vento, B. Reichman, B. A. Darlow, L. Lehtonen, N. Modi, M. Norman, S. Hakansson, D. Bassler, F. Rusconi, A. Lodha, J. Yang, P. S. Shah and I. International Network for Evaluation of Outcomes of neonates (2019). "Trends in Outcomes for Neonates Born Very Preterm and Very Low Birth Weight in 11 High-Income Countries." J Pediatr 215: 32-40 e14）。新生児ケアが改善したにもかかわらず、より低い在胎期間の乳児の生存の増加に伴い、この状態によるＢＰＤの症例数は減少していない（Horbar, J. D., E. M. Edwards, L. T. Greenberg, K. A. Morrow, R. F. Soll, M. E. Buus-Frank and J. S. Buzas (2017). "Variation in Performance of Neonatal Intensive Care Units in the United States." JAMA Pediatr 171(3): e164396）。外因性サーファクタント（surfactant）は未熟な新生児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の標準ケア治療であるが、現在までのところＢＰＤのための有効な予防又は治療はない（Bhandari, V. (2014). "Drug therapy trials for the prevention of bronchopulmonary dysplasia: current and future targets." Front Pediatr 2: 76）。抗炎症療法としてのステロイドの使用は、ＢＰＤにおける炎症を最小化するのに部分的に有用であるが、（出生前後に、非経口又は吸入経路を介して）薬物を投与された赤子において、ＢＰＤの発生率は減少しないか、又は死亡のリスク及び不良な神経発達の転帰が全体的な利益を上回っている。吸入ブデソニドが「既存のＢＰＤ」を治療するのに使用される無作為化臨床試験（ＲＣＴ）は存在しない（Andrews, E. a. S., A (2020). "Is inhaled budesonide a useful adjunct for the prevention or management of bronchopulmonary dysplasia?" Arch Dis Child 105: 508-511）。最も大規模な吸入ブデソニドのＲＣＴ（Bassler, D., H. L. Halliday, R. Plavka, M. Hallman, E. S. Shinwell, P. H. Jarreau, V. Carnielli, J. van den Anker, M. Schwab and C. F. Poets (2010). "The Neonatal European Study of Inhaled Steroids (NEUROSIS): an eu-funded international randomised controlled trial in preterm infants." Neonatology 97(1): 52-55）では、ＢＰＤの発生率は有意に低下したが（Bassler, D. (2017). "Inhaled budesonide for the prevention of bronchopulmonary dysplasia." J Matern Fetal Neonatal Med 30(19): 2372-2374）、神経発達の転帰において差はなく（Bassler, D., E. S. Shinwell, M. Hallman, P. H. Jarreau, R. Plavka, V. Carnielli, C. Meisner, C. Engel, A. Koch, K. Kreutzer, J. N. van den Anker, M. Schwab, H. L. Halliday, C. F. Poets and G. Neonatal European Study of Inhaled Steroids Trial (2018). "Long-Term Effects of Inhaled Budesonide for Bronchopulmonary Dysplasia." N Engl J Med 378(2): 148-157）、治療群において死亡率が有意に増加した（Filippone, M., D. Nardo, L. Bonadies, S. Salvadori and E. Baraldi (2019). "Update on Postnatal Corticosteroids to Prevent or Treat Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Perinatol 36(S 02): S58-S62）。

【0007】

ＢＰＤは、正常な肺胞形成及び微小血管の発達に影響を及ぼし、異常なガス交換及び肺機能の一因となる解剖学的変化をもたらす、肺傷害の多因子性の臨床症候群である（Thebaud, B., K. N. Goss, M. Laughon, J. A. Whitsett, S. H. Abman, R. H. Steinhorn, J. L. Aschner, P. G. Davis, S. A. McGrath-Morrow, R. F. Soll and A. H. Jobe (2019). "Bronchopulmonary dysplasia." Nat Rev Dis Primers 5(1): 78）。この不均衡は、ＢＰＤ表現型の一因となる全体的な肺炎症に関連する細胞死の増加及び細胞増殖の低減をもたらす。肺胞は拡張し、肺胞上皮が単純化し、内皮が破壊され、遠位気腔の成長が妨げられる（Stenmark, K. R. and S. H. Abman (2005). "Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia." Annu Rev Physiol 67: 623-661）。ＢＰＤへの進行は不確実かつ予測不能なプロセスであり、ＲＣＴにおけるこの疾患の進行のリスクを低減するために利用可能な決定的な薬品は、現在までのところ存在しない（Jensen, E. A., R. S. Roberts and B. Schmidt (2020). "Drugs to Prevent Bronchopulmonary Dysplasia: Effect of Baseline Risk on the Number Needed to Treat." J Pediatr 222: 244-247）。吸入ブデソニド及び／若しくはブデソニドとサーファクタントとの組合せ若しくは母乳の使用、又は筋肉内ビタミンＡ及び予防的ヒドロコルチゾンの使用の試験は、ＢＰＤの割合を適度に減少させたが、疾患を治癒させなかった（Tolia, V. N., K. Murthy, P. S. McKinley, M. M. Bennett and R. H. Clark (2014). "The effect of the national shortage of vitamin A on death or chronic lung disease in extremely low-birth-weight infants." JAMA Pediatr 168(11): 1039-1044、Jensen, E. A., R. S. Roberts and B. Schmidt (2020). "Drugs to Prevent Bronchopulmonary Dysplasia: Effect of Baseline Risk on the Number Needed to Treat." J Pediatr 222: 244-247）。新たな前臨床メタ分析により、動物モデルにおける間葉系間質細胞療法の利益が実証されたが、初期臨床試験の結果は依然として保留中である（Strueby, L. and B. Thebaud (2018). "Novel therapeutics for bronchopulmonary dysplasia." Curr Opin Pediatr 30(3): 378-383）。

【0008】

ＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）は、壊滅的な短期及び長期の結果を伴う、慢性の炎症性の合併性状態である（Sahni, M., B. Yeboah, P. Das, D. Shah, D. Ponnalagu, H. Singh, L. D. Nelin and V. Bhandari (2020). "Novel biomarkers of bronchopulmonary dysplasia and bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary hypertension." J Perinatol 40(11): 1634-1643）。ＢＰＤを有する乳児は、調節不全の肺血管密度及び肺血管抵抗の増加を伴う肺血管系の異常な成長の素因を有し、これはＢＰＤ－ＰＨの一因となる。ＢＰＤ－ＰＨの発病機序はあまり理解されておらず、したがって適切な治療についてのデータは現在あまり存在しない。動物試験及び少数の臨床試験により、一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達経路を標的とした薬品（ＮＯ吸入、経口シルデナフィルクエン酸塩）がＢＰＤ－ＰＨのための有効な治療であり得ることが示唆されるが、これらはこの症状について具体的に承認されていない（Meau-Petit, V., G. Thouvenin, N. Guillemot-Lambert, V. Champion, I. Tillous-Borde, F. Flamein, L. de Saint Blanquat, S. Essouri, J. Guilbert, N. Nathan, I. Guellec, S. Kout, R. Epaud and M. Levy (2013). "[Bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary arterial hypertension of very preterm infants]." Arch Pediatr 20(1): 44-53）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Bhandari, V. (2016). Bronchopulmonary Dysplasia

【非特許文献2】Bhandari, V. (2014). "Drug therapy trials for the prevention of bronchopulmonary dysplasia: current and future targets." Front Pediatr 2: 76

【非特許文献3】Sahni, M. and V. Bhandari (2020). "Recent advances in understanding and management of bronchopulmonary dysplasia." F1000Res 9

【非特許文献4】Lui, K., S. K. Lee, S. Kusuda, M. Adams, M. Vento, B. Reichman, B. A. Darlow, L. Lehtonen, N. Modi, M. Norman, S. Hakansson, D. Bassler, F. Rusconi, A. Lodha, J. Yang, P. S. Shah and I. International Network for Evaluation of Outcomes of neonates (2019). "Trends in Outcomes for Neonates Born Very Preterm and Very Low Birth Weight in 11 High-Income Countries." J Pediatr 215: 32-40 e14

【非特許文献5】Horbar, J. D., E. M. Edwards, L. T. Greenberg, K. A. Morrow, R. F. Soll, M. E. Buus-Frank and J. S. Buzas (2017). "Variation in Performance of Neonatal Intensive Care Units in the United States." JAMA Pediatr 171(3): e164396

【非特許文献6】Andrews, E. a. S., A (2020). "Is inhaled budesonide a useful adjunct for the prevention or management of bronchopulmonary dysplasia?" Arch Dis Child 105: 508-511

【非特許文献7】Bassler, D., H. L. Halliday, R. Plavka, M. Hallman, E. S. Shinwell, P. H. Jarreau, V. Carnielli, J. van den Anker, M. Schwab and C. F. Poets (2010). "The Neonatal European Study of Inhaled Steroids (NEUROSIS): an eu-funded international randomised controlled trial in preterm infants." Neonatology 97(1): 52-55

【非特許文献8】Bassler, D. (2017). "Inhaled budesonide for the prevention of bronchopulmonary dysplasia." J Matern Fetal Neonatal Med 30(19): 2372-2374

【非特許文献9】Bassler, D., E. S. Shinwell, M. Hallman, P. H. Jarreau, R. Plavka, V. Carnielli, C. Meisner, C. Engel, A. Koch, K. Kreutzer, J. N. van den Anker, M. Schwab, H. L. Halliday, C. F. Poets and G. Neonatal European Study of Inhaled Steroids Trial (2018). "Long-Term Effects of Inhaled Budesonide for Bronchopulmonary Dysplasia." N Engl J Med 378(2): 148-157

【非特許文献10】Filippone, M., D. Nardo, L. Bonadies, S. Salvadori and E. Baraldi (2019). "Update on Postnatal Corticosteroids to Prevent or Treat Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Perinatol 36(S 02): S58-S62

【非特許文献11】Thebaud, B., K. N. Goss, M. Laughon, J. A. Whitsett, S. H. Abman, R. H. Steinhorn, J. L. Aschner, P. G. Davis, S. A. McGrath-Morrow, R. F. Soll and A. H. Jobe (2019). "Bronchopulmonary dysplasia." Nat Rev Dis Primers 5(1): 78

【非特許文献12】Stenmark, K. R. and S. H. Abman (2005). "Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia." Annu Rev Physiol 67: 623-661

【非特許文献13】Jensen, E. A., R. S. Roberts and B. Schmidt (2020). "Drugs to Prevent Bronchopulmonary Dysplasia: Effect of Baseline Risk on the Number Needed to Treat." J Pediatr 222: 244-247

【非特許文献14】Tolia, V. N., K. Murthy, P. S. McKinley, M. M. Bennett and R. H. Clark (2014). "The effect of the national shortage of vitamin A on death or chronic lung disease in extremely low-birth-weight infants." JAMA Pediatr 168(11): 1039-1044

【非特許文献15】Strueby, L. and B. Thebaud (2018). "Novel therapeutics for bronchopulmonary dysplasia." Curr Opin Pediatr 30(3): 378-383

【非特許文献16】Sahni, M., B. Yeboah, P. Das, D. Shah, D. Ponnalagu, H. Singh, L. D. Nelin and V. Bhandari (2020). "Novel biomarkers of bronchopulmonary dysplasia and bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary hypertension." J Perinatol 40(11): 1634-1643

【非特許文献17】Meau-Petit, V., G. Thouvenin, N. Guillemot-Lambert, V. Champion, I. Tillous-Borde, F. Flamein, L. de Saint Blanquat, S. Essouri, J. Guilbert, N. Nathan, I. Guellec, S. Kout, R. Epaud and M. Levy (2013). "[Bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary arterial hypertension of very preterm infants]." Arch Pediatr 20(1): 44-53

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

これらの取り組みにも関わらず、新生児の肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）及びＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）を予防するか又は治療するための新規の組成物及び方法についての必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

一実施形態では、本発明は、新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するための組成物であって、式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物を含み、

【化1】

（式中、ｎ＝０～５であり；Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＣＨ_２であり；Ｙ＝フェニル、少なくとも１つのメチルで置換されているフェニル基、少なくとも１つのニトロで置換されているフェニル基、少なくとも１つの窒素で置換されているフェニル基、少なくとも１つのホウ素で置換されているフェニル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、４～６員のシクロアルキル、４～６員のヘテロシクロアルキルであり；Ｚ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又は非存在であり；Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_１＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_２＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ＮＨ_２、ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_３、Ｒ_４＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、３～６員のシクロアルキルである）化合物の量が、新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するように選択される、組成物を含む。一態様では、式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物は、静脈内投与用に製剤化されている。別の態様では、組成物は、１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤又は塩を含む医薬組成物へと製剤化されている。別の態様では、組成物は、肺内投与、肺胞内投与、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、局所投与、又は経口投与に適合した医薬組成物へと製剤化されている。別の態様では、組成物は、エアロゾル、ネブライザー（nebulizer）又はインヘラー（inhaler）へと製剤化される。別の態様では、組成物は、１又は２以上のリポソーム、ポリマー、塩又は緩衝剤をさらに含む。別の態様では、組成物は、コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗コリン剤、血管拡張剤、利尿剤、降圧剤、アセタゾラミド、抗生物質、抗ウイルス剤、免疫抑制薬、及びサーファクタントからなる群から選択される追加の治療剤をさらに含む。別の態様では、組成物は、炎症を競合的に阻害し、肺組織損傷を保護するか又は肺組織傷害を抑えるようにマクロファージを調節する量で提供される。別の態様では、対象は小児若しくは成人のヒトであるか、又は幼体若しくは成体の動物である。別の態様では、組成物は、噴霧デバイス又は加圧送達デバイスである送達デバイス用に製剤化されている。別の態様では、化合物は、Ｚ＝非存在である式Ｉの化合物である。別の態様では、式Ｉの化合物は、

【化2】

である。
別の態様では、化合物は、

【化3】

の少なくとも１つから選択される。

【0012】

新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量かつ相乗作用量（therapeutically effective and synergistic amount）の、肺抽出物から単離された肺サーファクタント又はその合成等価物（synthetic equivalent）、及び式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物を投与することを含み、

【化4】

（式中、ｎ＝０～５であり；Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＣＨ_２であり；Ｙ＝フェニル、少なくとも１つのメチルで置換されているフェニル基、少なくとも１つのニトロで置換されているフェニル基、少なくとも１つの窒素で置換されているフェニル基、少なくとも１つのホウ素で置換されているフェニル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、４～６員のシクロアルキル、４～６員のヘテロシクロアルキルであり；Ｚ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又は非存在であり；Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_１＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_２＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ＮＨ_２、ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_３、Ｒ_４＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、３～６員のシクロアルキルである）化合物の量が、新生児肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）又はＢＰＤ関連肺高血圧症（ＢＰＤ－ＰＨ）の少なくとも１つを予防するように選択される、方法。一態様では、式（Ｉ）又はその立体異性体、鏡像異性体、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩の化合物。別の態様では、組成物は、１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤又は塩を含む医薬組成物へと製剤化されている。別の態様では、組成物は、肺内投与、肺胞内投与、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、局所投与、又は経口投与に適合した医薬組成物へと製剤化されている。別の態様では、組成物は、エアロゾル、ネブライザー又はインヘラーへと製剤化されている。別の態様では、組成物は吸入剤形（inhalation dosage form）を形成する。別の態様では、方法は、１又は２以上のリポソーム、ポリマー、塩又は緩衝剤を添加することをさらに含む。別の態様では、方法は、コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗コリン剤、血管拡張剤、利尿剤、降圧剤、アセタゾラミド、抗生物質、抗ウイルス剤、免疫抑制薬、及びサーファクタントからなる群から選択される１又は２以上の追加の治療剤を添加することをさらに含む。別の態様では、組成物は、炎症を競合的に阻害し、肺組織損傷を保護するか又は肺組織傷害を抑えるようにマクロファージを調節する量で提供される。別の態様では、対象は小児若しくは成人のヒトであるか、又は幼体若しくは成体の動物である。別の態様では、組成物は、噴霧デバイス又は加圧送達デバイスである送達デバイス用に製剤化されている。別の態様では、化合物は、Ｚ＝非存在である式Ｉの化合物である。別の態様では、式Ｉの化合物は、

【化5】

から選択される。

【0013】

別の態様では、化合物は、

【化6】

の少なくとも１つから選択される。

【0014】

別の態様では、方法は、治療の前に、肺炎症、窮迫又は不全（insufficiency）のための治療を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本発明の特色及び利益をより完全に理解するために、本発明の詳細な説明のために、付随する図面とともにここで参照を行う。

【図1】ＩＰ投与された０．５、２．０、５．０及び１０ｍｇ／ｋｇの異なる用量でのＡＶＲ－４８の用量反応試験の図である。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｎ＝群あたり５～７匹のマウス。１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）を、最も有効な用量として選択した。ＩＰ：腹腔内、Ｈｙｐ：高酸素、ＢＰＤ：気管支肺異形成症。

【図2】ＡＶＲ－４８が肺の形態を改善することを示す図である。（図２Ａ）ＡＶＲ－４８処置後に組織学的変化を示す、代表的なH&E染色肺パラフィン切片。（図２Ｂ）コード長（chord length）（平均の気腔内自由距離を測定する）はＢＰＤ群において増加し、ＡＶＲ－４８処置後に正常化する。（図２Ｃ）肺胞中隔厚は低減し、（図２Ｄ）肺胞分岐数（radial alveolar count）（肺胞の数を測定する）も、ＡＶＲ－４８処置の後に改善する。^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝３～８、ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症。スケールバー１００μｍ。

【図3】ＡＶＲ－４８が炎症及び血管漏出を低減することを示す図である。（図３Ａ）ＢＰＤ群におけるＢＡＬ液中の総炎症細胞は、ＡＶＲ－４８処置後、有意に低減する。（図３Ｂ）ＢＰＤ群におけるＢＡＬ液中の総タンパク質は、ＡＶＲ－４８処置後、有意に低減する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝３～８、ＲＡ：室内気、ＢＡＬ：気管支肺胞洗浄、ＢＰＤ：気管支肺異形成症。

【図4】ＡＶＲ－４８が細胞増殖を改善することを示す図である。（図４Ａ）ＢＰＤ群におけるＡＶＲ－４８処置は細胞増殖を増加し（Ki67染色により示される）、右のパネルはKi67の定量化を示す。（図４Ｂ）ＳＰ－Ｃ（II型ＡＥＣについてのマーカー）のＰＣＮＡとの共局在化。白色の矢印は、増殖しているそれぞれの細胞を指す。一番右のパネルは、より高い倍率の、ＳＰ－Ｃ（cytoplasmic green）及びＰＣＮＡ（nuclear red）陽性の増殖中のII型ＡＥＣを示す。（図４Ｃ）ＲＡＧＥ（Ｉ型ＡＥＣについてのマーカー）のＰＣＮＡとの共局在化。一番右のパネルは、より高い倍率の、ＲＡＧＥ（cytoplasmic green）及びＰＣＮＡ（nuclear red）陽性のＩ型ＡＥＣ増殖を示す。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スケールバー１００μｍ。ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＳＰ：サーファクタントタンパク質、ＡＥＣ：肺胞上皮細胞、ＰＣＮＡ：増殖細胞核抗原、ＲＡＧＥ：終末糖化産物受容体。

【図5】ＡＶＲ－４８が細胞死を低減することを示す図である。TUNEL染色（白色の矢印はTUNEL陽性細胞を指す）（図５Ａ）並びに総カスパーゼ３及び切断型カスパーゼ３のウェスタンブロッティング（図５Ｂ）は、ＡＶＲ－４８での処置後の細胞死及びアポトーシスの低減を示す。右のパネルは、TUNEL陽性細胞の定量化（上部）並びに総カスパーゼ３及び切断型カスパーゼ３の濃度測定での定量化を示す。Ｎ＝３～４ ^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スケールバー１００μｍ。ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、Ｃｌ Ｃａｓ：切断型カスパーゼ。

【図6】ＡＶＲ－４８が血管発生を促進することを示す図である。（図６Ａ）血管発生を示す、代表的な免疫蛍光肺切片。血管についてのマーカーであるｖＷＦは、ＢＰＤにおいて著しく妨げられているが、ＡＶＲ－４８での処置後、有意な改善がみられる。（図６Ｂ）ＢＰＤ群において、ＡＶＲ－４８での処置後にＡｎｇ２が回復することを示す、代表的なウェスタンブロッティング。上部の右のパネルは血管数の定量化を示し、下部右のパネルはＡｎｇ２についての濃度測定での定量化を示す。スケールバー１００μｍ、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｖＷＦ：フォン・ヴィレブランド因子、Ａｎｇ２：アンジオポエチン２、ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＨＰＦ：高倍率視野、Ｎ＝３～５。

【図7】ＡＶＲ－４８が炎症を抑制することを示す図である。（図７Ａ～７Ｂ）ＢＰＤ群と比較した、ＡＶＲ－４８での処置後の肺中の炎症誘発性サイトカイン（ＴＧＦβ、ＮＦｋＢ、ＴＮＦα、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－４）の低減及びＩＬ－１０の増加を示す、代表的なウェスタンブロット。ＲＡ＋ＡＶＲ－４８処置群においてみられる炎症の増加は、自然防御適応機構によるものであり得る。ビンキュリンはローディング対照である。右のパネルは、タンパク質の濃度測定での定量化を示す。Ｎ＝５。（図７Ｃ）未処置のＢＰＤ対照と比較した、処置されたＢＰＤ群の血清中のいくつかの選択されたサイトカイン発現を示すＥＬＩＳＡ。ＲＡ＋ＡＶＲ－４８群は、このアッセイには含まれなかった。炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの大半が処置後に低減を示すが、ＭＩＰ－２、ＩＬ－２１及びＩＬ－１７には変化がなかった。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝４～５、ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＴＧＦβ：トランスフォーミング増殖因子ベータ、ＭＣＰ－１：単球走化性タンパク質１、ＭＩＰ－２：マクロファージ炎症性タンパク質２、ＮｆｋＢ：核因子カッパＢ、ＴＮＦα：腫瘍壊死因子アルファ、ＩＦＮγ：インターフェロンガンマ、ＩＬ：インターロイキン。

【図8】ＡＶＲ－４８がＢＰＤ－ＰＨを防ぐことを示す図である。（図８Ａ）ＢＰＤ群において、ＲＶ／ＬＶ比及びＦｕｌｔｏｎ指数（ＲＶ／ＬＶ＋ＩＶＳ）は、ＡＶＲ－４８処置後に改善する。（図８Ｂ）ＢＰＤ群と比較した、ＢＰＤ＋ＡＶＲ－４８処置群におけるＶｅｇｆ発現の増加を示す、代表的なウェスタンブロット。（図８Ｃ）ＢＰＤにおいて増加するｅＮＯＳ、ＢｍｐＲII及びＶｅｇｆＤは、ＡＶＲ－４８での処置後に顕著に低減する。ビンキュリンはローディング対照である。同じ試料を図８Ａ～８Ｂ及び図８Ｂ～８Ｃに使用したため、両方の画像について、ローディング対照として同じビンキュリンが示されている。Ｎ＝４～５。ＢＰＤ－ＰＨ：気管支肺異形成症関連肺高血圧症、ＲＶ：右心室、ＬＶ：左心室、ＩＶＳ：心室中隔、ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症；Ｖｅｇｆ：血管内皮細胞増殖因子；ｅＮＯＳ：内皮型一酸化窒素合成酵素；ＢｍｐＲII：骨形成タンパク質受容体２。

【図9】化合物８（ＡＶＲ－４８）の、公知のＴＬＲ４アンタゴニストであるTAK 242との比較を示す図である。ＡＶＲ－４８（１０ｍｇ／ｋｇ）での処置は、ＢＰＤマウス肺からの炎症性マクロファージ及び好中球からなる総ＢＡＬ細胞の増加を有意に低減したが、TAK 242処置は影響を及ぼさなかった。

【図10】ＴＬＲ４の対応する濃度測定での定量化（上部右のパネル）を伴う、肺ホモジネートの代表的なウェスタンブロッティングを示す図である。ビンキュリンはローディング対照であり、同じ試料が使用されたため、図７Ａ及び８Ｂに示されるのと同じものである。

【図11】ＢＰＤを有する動物において、ＡＶＲ－４８が２つの重要な自然免疫細胞集団を正常化することを示す図である。肺中、ＢＰＤ群において、ＲＡ群に対する好中球及び樹状細胞の有意な増加がみられたが、マクロファージは低減した。ＡＶＲ－４８処置ＲＡ動物は、ＲＡ動物と比較して、わずかであるが統計学的に有意に、肺中のマクロファージが低減し、樹状細胞が増加した。ＡＶＲ－４８で処置されたＢＰＤ動物は、未処置のＢＰＤ動物と比較して好中球が低減し、マクロファージが増加し、これらの細胞集団はＲＡ対照群と類似のレベルであった。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＴＬＲ：ｔｏｌｌ様受容体、Ｎ＝５～８。

【図12】ＡＶＲ－４８が外因性サーファクタントと適合性であることを示す図である。ＣＳ単独又はＡＶＲ－４８単独又はＣＳ＋ＡＶＲ－４８の組合せで処置したＢＰＤ群の間では、ＢＡＬ液中、（図１２Ａ）総炎症性細胞並びに（図１２Ｂ）総タンパク質における差はなかった。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＣＳ：この試験において使用したサーファクタント、Curosurf（登録商標）、ＢＡＬ：気管支肺胞洗浄、Ｎ＝３～６。

【図13】仔マウスにおける薬物のバイオアベイラビリティーを示す図である。（図１３Ａ）血漿中の平均ＡＶＲ－４８濃度。（図１３Ｂ）ＩＮ又はＩＰ投与後の、肺中の平均ＡＶＲ－４８濃度。ＩＰ：腹腔内、ＩＮ：鼻腔内、Ｎ＝６。

【図14】仔ラットにおける薬物のバイオアベイラビリティーを示す図である。（図１４Ａ）血漿中の平均ＡＶＲ－４８濃度。（図１４Ｂ）ＩＶ及びＳＣ投与の後のＢＡＬ中の平均ＡＶＲ－４８濃度。ＩＶ：静脈内、ＳＣ：皮下、ＢＡＬｆ：気管支肺胞洗浄液、Ｎ＝６。

【図15】新生児肺中の提案されたＡＶＲ－４８の作用機序を示す図である。ＡＶＲ－４８は、ＴＬＲ４と結合した後にＴＲＩＦ経路を駆動して、副経路を介してＭ２マクロファージを活性化してＩＬ－１０を産生し、それが次にＴＬＲ４を負に調節してＭｙＤ８８経路を下方調節し、ＢＰＤの間に古典的経路の活性化を介して産生されるＭ１マクロファージを抑制することにより、無数の炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの合成を低減する。この組合せの効果は、ＢＰＤ心肺表現型の全体的な改善を伴う好ましい転帰に向けてＭ２マクロファージとＭ１マクロファージとの間の均衡を維持することにより、組織傷害を低減し、組織修復及び治癒を増加する。

【図16】早産の子ヒツジＢＰＤモデルの呼吸重症度スコア（respiratory Severity Score）を示す図である。ＧＡ１２８日に出産された早産の子ヒツジ（ｎ＝２～４）に、ステロイドを出生前に、及びサーファクタント（Curosurf、１用量）を出産直後に投与した。子ヒツジは、侵襲的人工呼吸器（ＩＭＶ）を７日間、続けて非侵襲的呼吸器を３日間つけた。生理食塩水又はＡＶＲ－４８（０．１、０．３、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ）を、出産６時間後のＩＶ投薬（２／日、７日間）のために生理食塩水中で製剤化した。ＡＶＲ－４８（１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ）での処置後、プラセボ処置対照ＰＴ子ヒツジに対して呼吸重症度スコア（ＲＳＳ）が有意に改善した（Ｎ＝７、１匹は現在の試験から、６匹は以前の試験からのものである）。ＲＳＳは、式：ＲＳＳ＝平均気道圧（ＭＡＰ）×吸入酸素分画（ＦｉＯ_２）を使用して計算した。ＡＶＲ－４８（３．０ｍｇ．ｋｇ、ｎ＝４）は最も低いＲＳＳ（２．４）を示した。

【図17】早産の子ヒツジＢＰＤモデルにおける呼吸器系機構を示す図である。抵抗（Ｒｘ）及びリアクタンス（Ｘｒ）は、生後１０日目（生後最終日；生後２４０時間）の早産の子ヒツジについて、気道開口部に圧力刺激を加え、その結果生じる流量を測定することにより非協力的な対象の呼吸器系機構の測定を可能とする強制オシレーション法（ＦＯＴ）により測定される。３．０ｍｇ／Ｋｇ（Ｎ＝４）でのＡＶＲ－４８は、プラセボに対してより低い抵抗をもたらす（Ｒ７ｈｚ ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ、呼吸器系）。３ｍｇ／ＫｇでのＡＶＲ－４８はまた、より低い小気道抵抗（Ｒ７－２０ｈｚ－ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ）及びより低いリアクタンス（Ｘ７ｈｚ－ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ）をもたらした。

【図18】早産の子ヒツジＢＰＤモデルにおける病理組織学を示す図である。顕微鏡写真は、同じ倍率での肺の終末呼吸単位（ＴＲＵ：terminal respiratory units）を示す。７日の人工呼吸（ＭＶ）は、媒体処置したＰＴ子ヒツジ（図１８Ｄ）では肺胞の単純化（気腔の膨張、二次隔壁（secondary septa）減少及び間葉肥厚）をもたらしたが、これはＡＶＲ－４８子ヒツジ肺では有意に改善した（図１８Ｃ）。肺胞分岐数は、呼吸細気管支の中心から終末呼吸単位の周囲までの、終末呼吸単位にわたる組織の交点の数である。ヒツジは、ヒトのように終末呼吸単位を有し（ヒト肺は約１５０，０００の終末呼吸単位を有する）、この単位にわたり酸素と二酸化炭素の拡散が測定される（動脈血ガス）ため、これらの単位は生理学者によれば「肺胞」である。予備的な結果により、３．０ｍｇ／ＫｇでのＡＶＲ－４８が肺胞形成を促進することが示唆される（図１８Ｅ）。Ｎ＝３。

【図19】ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中の総タンパク質濃度を低減することを示す図である。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。

【図20】ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中のＶＥＧＦ濃度を低用量で増加し、高用量（３．０ｍｇ／ｋｇ）は効果を有しないことを示す図である。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。

【図21】ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中のＩＣＡＭ－１濃度を増加することを示す図である。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。ＡＶＲ－４８で処置された子ヒツジにおいて、肺組織病理学及び肺胞分岐数から観察して、総タンパク質の低減はより少ない肺漏出及び浮腫を示し、ＢＡＬ液中のＶＥＧＦ及びＩＣＡＭ－１の増加は肺の肺胞化（alveolation）の増加と相関した（図１８Ｅ）。

【図22】ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、血漿中のＩＬ－６濃度を有意に低減することを示す図である。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。Ｎ＝３～４。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図23】子ヒツジ血漿中のＩＬ－１０に対するＡＶＲ－４８処置の効果を示す図である。ＩＬ－１０は媒体処置された子ヒツジ血漿において時間依存的に低減したが、ＡＶＲ－４８での処置（２／日で７日間、最初の用量を６＋時間で開始）は、異なる時点で、媒体処置された子ヒツジと比較して、過剰炎症を阻害するのに必要とされる早期の時点（１～４日）で血漿中のＩＬ－１０濃度を有意に低減した。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。Ｎ＝３～４。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。二元配置ＡＮＯＶＡ。

【図24】４８～７２時間のＡＶＲ－４８（化合物８）での処置が、より多くの常在／抗炎症性マクロファージ（Ｌｙ６ｃ ｈｉ／ｌｏｗ）を産生したことを示す図（図２４Ａ、２４Ｂ）である。ＦＡＣＳ分析により決定した場合、ビオチンコンジュゲートＡＶＲ－４８（ＢＴ－ＡＶＲ－４８）はマウス脾臓単球（ＬＹ６ｃ＋、ＣＤ１９－、ＣＤ３－）と用量依存的に結合する（図２４Ｃ）。

【図25】ＦＡＣＳ分析により決定した場合、ビオチンコンジュゲートＡＶＲ－４８（ＢＴ－ＡＶＲ－４８）での処置が、マウス脾臓由来単球（ＬＹ６ｃ＋、ＣＤ１９－、ＣＤ３－）中のｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びＣＤ１６３スカベンジャー受容体タンパク質の両方と用量依存的に結合することを示す図である。

【図26】ＡＶＲ－４８がＴＨＰ－１ヒト単球細胞中のＴＬＲ４に結合し（図２６Ａ）、ＩＬ－１０産生を増加する（図２６Ｂ）ことを示す図である。ＥＬＩＳＡにより決定した場合、ＡＶＲ－４８は、２４時間前処理したときにＬＰＳ誘発性ＴＮＦ－α産生を低減する（図２６Ｃ）。

【図27】ＡＶＲ－４８処置後のマクロファージ集団の変化の図である。簡潔には、ｈＰＢＭＣを９６ウェルプレートに播種し、ＡＶＲ ４８で７２時間処置した。細胞を洗浄し、ＣＤ３２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ２０６抗ヒト抗体について染色し、ＦＡＣＳにより分析した。分析中、死細胞をｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（７ＡＡＤ）により除外した。親細胞の中間マクロファージの％を、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ２０６表面マーカーの両方についてマクロファージ染色陽性として決定する。ＡＶＲ－４８での処置後の、親マクロファージ集団（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）の中間マクロファージ（Ｍｉｎｔ）のパーセンテージを表す棒グラフ。ｎ＝２の技術的反復、及び実験を３回繰り返す。ＡＶＲ－４８は、単球上のｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びＣＤ１６３受容体の両方に結合する。ｈＰＢＭＣでは、７２時間のＡＶＲ－４８処置は、中間体マクロファージのパーセンテージを増加し、Ｍ１マクロファージを低減した。

【図28】ＡＶＲ－４８単独で処置したヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣ）が、０．１～１０μＭでＩＬ－１０の増加（約２．５倍）を示したことを示す図である。ＬＰＳ処置は、ＩＬ－１０（約５倍）、ＩＬ－１β（約３０倍）を有意に増加した（図２８Ａ及び図２８Ｂ）。ＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８は、１０μＭで、ＩＬ－１０及びＩＬ－１βの両方を有意に低減した。

【図29】ＣＢＭＣ中のＡＶＲ－４８の免疫刺激作用及びＩＬ－１２ｐ４０サイトカインの増加を示す図である。ＩＬ－１２ｐ４０は、感染に対する自然免疫応答についてのマーカーであり、ＣＢＭＣ中で下方調節される。ＡＶＲ－４８（１０μＭ）単独又はＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８処置はいずれもＬＰＳのみよりも高いＩＬ－１２ｐ４０応答をもたらし、これは活性な免疫系の促進を示す。しかし、市販のＴＬＲ４アンタゴニストTAK242は、試験されたときにＩＬ－１２ｐ４０レベルのＬＰＳ誘発性の増加の低減を示し、これはＡＶＲ－４８がＴＬＲ４アンタゴニストではなくＴＬＲ４調節因子であり、ＡＶＲ－４８処置が正準のＴＬＲ４アンタゴニストのように免疫抑制的でないことを明白に実証した。

【図30】ＡＶＲ－４８単独で処置した全臍帯血（ＷＣＢ）が、１０μＭでＩＬ－１０の増加（約１．５倍）を示したことを示す図である。ＬＰＳ処置は、ＩＬ－１０を適度に増加した（約２．５倍）。ＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８は、１０μＭでＩＬ－１０を有意に増加した（図３０Ａ）。ＴＮＦ－αはＷＣＢ中で既に上方調節され、ここでＡＶＲ－４８での処置は、ＴＮＦ－αレベルを単独で又はＬＰＳとの組合せで有意に低減した（図３０Ｂ）。ＩＬ－１β及びＩＦＮ－γは、ＡＶＲ－４８の単独又はＬＰＳとの組合せのいずれでも検出されなかった。Ｎ＝３、ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図31】ＥＬＩＳＡにより決定した場合、ＡＶＲ－４８が、ＬＰＳと併用処置したときにヒト肺Ｉ型肺胞上皮細胞（ＡＴ１）においてＴＮＦ－α及び一酸化窒素（ＮＯ）産生の両方を低減したことを示す図である。上皮細胞中、有意なレベルのＩＬ－１０又はＩＬ－βは、単球／マクロファージ細胞において観察されたようには検出されなかった。

【図32】ＢＴ－ＡＶＲ－４８の合成の図である。

【図33】ＩＶ及び経口投薬によるｐＫ及び製剤の結果を示す図である。静脈内投与による単回投与後の、生理食塩水溶液として血漿中３．０ｍｇ／ｋｇ／用量（有効用量、ｎ＝３の早産の子ヒツジ）で投与されたＡＶＲ－４８の最大薬物濃度（Ｃ_ｍａｘ）は、薬物濃度の直線的な減少を示し、半減期は０．５６＋１．５時間であり、Ｃ_ｍａｘ＝１２．２±５．６μＭであった。

【図34】早産の子ヒツジへの７日間の反復的なＩＶ投薬後に薬物の蓄積がみられないことを示し、良好なクリアランスを示す図である。

【図35】ＡＶＲ－４８（化合物８）の経口製剤を調製し、成体ラット（ｎ＝３）に１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与したことを示す図である。血漿は、前に報告したＩＶプロファイルと一致する薬物濃度の直線的な減少を示し、Ｔ_ｍａｘは０．７±０．３時間、半減期（Ｔ_１／２）は０．６±０．４時間、及びＣ_ｍａｘは３．６４±０．６６μＭであった。

【図36】ＡＶＲ－８４（化合物１７）の経口製剤を調製し、成体ラット（ｎ＝３）に１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与したことを示す図である。血漿は薬物濃度の直線的な減少を示し、Ｔ_ｍａｘは０．５±０．０時間、半減期（Ｔ_１／２）は１．６６±１．０時間、及びＣ_ｍａｘは４．５６±０．７７μＭであった。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の多様な実施形態の作製及び使用が以下に詳細に論じられるが、本発明は、広範な特定の文脈において実現されることが可能な、多数の適用可能な発明概念を提供することを理解すべきである。本明細書において論じられる特定の実施形態は、本発明を作製し使用するための特定の方法を単に例示するものであって、本発明の範囲を定めるものではない。

【0017】

本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関する領域における当業者により一般的に理解されるような意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「前記」のような用語は、単一の実体のみを指すことを意図せず、特定の実施例が例示のために使用され得る一般的な部類を含む。本明細書の用語学は、本発明の特定の実施形態を説明するのに使用されるが、これらの語法は、特許請求の範囲において概説されるものを除き、本発明の範囲を定めるものではない。

【0018】

本発明は、肺、例えばウシ及びブタの肺から（例えば仔又は幼獣から）単離したサーファクタントを、式Ｉ

【化7】

（式中、ｎ＝０～５であり；Ｘ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＣＨ_２であり；Ｙ＝フェニル、少なくとも１つのメチルで置換されているフェニル基、少なくとも１つのニトロで置換されているフェニル基、少なくとも１つの窒素で置換されているフェニル基、少なくとも１つのホウ素で置換されているフェニル基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、４～６員のシクロアルキル、又は４～６員のヘテロシクロアルキルであり；Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_１＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ_２、ＳＯ_２Ｒ_２であり；Ｒ_２＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ＮＨ_２、ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_３、Ｒ_４＝エチル、メチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、ｎ－ブチル、３～６員のシクロアルキルであり；Ｚ＝ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又は非存在である）の生物活性分子と組み合わせる。一態様では、化合物の量は、免疫応答を阻害又は活性化するように変動又は選択される。一態様では、化合物は式

【化8】

を有する。

【0019】

本発明の化合物は、肺系への薬物送達のための、低密度かつ大きなサイズの粒子の送達において特に用途が見い出される。本明細書において開示されているもののような化合物の制御放出及び送達のために、生分解性粒子が開発された。Langer, R.,Science, 249:1527-1533(1990)。

【0020】

呼吸道（respiratory tract）は、中咽頭及び喉頭を含む上気道、並びに気管に続いて気管支及び細気管支への分岐を含む下気道を包含する。上気道及び下気道は、誘導気道と呼ばれる。終末細気管支は呼吸細気管支へと分かれ、次に最終的な呼吸領域である肺胞又は肺深部（deep lung）に至る。本発明は、例えば、関連する部分が参照により本明細書に組み込まれるGonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313, 1990のように、呼吸道の任意の部分への送達のために製剤化することができる。１つの非限定的な例では、肺深部及び肺胞は、本発明の全身薬物送達のための吸入治療用エアロゾルの主要な標的である。

【0021】

吸入エアロゾルは、喘息及び嚢胞性線維症を含む局所的な肺障害の治療のために使用されており、本発明の化合物の全身送達についての潜在性を有する。肺薬物送達戦略は、中咽頭腔における吸入薬物の過剰な損失（多くの場合８０％を超える）、沈着部位に対する制御不良、呼吸パターンの多様性に起因して治療結果に再現性がないこと、多くの場合薬物の吸収が過剰に急速であり局所的な毒性効果をもたらす可能性があること、及び肺マクロファージによる食作用を含む、巨大分子の送達についての多くの困難を示す。

【0022】

吸入療法の効率及び乾燥粉末エアロゾル表面性状の設計を改善するために、治療用エアロゾルインヘラーの設計に相当な注意が費やされてきた。本発明者らは、粒子凝集、粒子凝集に起因する吸入療法の効率を相当に弱める現象を回避するための必要性が、効率的かつ一貫性のある肺深部送達のために求められることを認識している。

【0023】

肺送達の製剤についての一例では、本発明の活性化合物を含有する粒子は、治療剤の制御放出を提供するために局所及び全身吸入療法を用いて使用され得る。活性化合物を含有する粒子は、治療用エアロゾルからの遅延放出を可能とし、投与薬物の気道又は腺房中の滞留を延長し、血流中の薬物出現の割合を弱める。使用の低減及び投薬量の一貫性の増加により、患者の服薬遵守が増加する。

【0024】

ヒト肺は、加水分解的に切断可能な堆積したエアロゾルを、数分から数時間の範囲の期間にわたり、除去するか又は急速に分解することができる。上気道では、線毛上皮は、粒子が気道から口へと押し流される「粘膜毛様体エスカレーター（mucociliary escalator）」に寄与する。肺深部では、肺胞マクロファージは、粒子を沈着直後に貪食することができることが周知である。本明細書において提供される活性化合物を含有する粒子は、治療薬の短期及び長期放出の両方について、局所又は全身送達のいずれについても、凝集を最低限としながら、有効な乾燥粉末吸入療法を可能とする。粒径の一貫性の増加により、薬物が有効に送達されるまでの肺の天然機構による粒子のクリアランスが低減すると予測される。

【0025】

薬物放出プロファイルが延長されたナノ粒子製剤を有するＰＬＧＡカプセル化ナノ懸濁物。ナノ粒子製剤は、シングル又はダブルエマルション技術を通して実施することができる。例えば、シングルエマルション技術については、１０ｍｇの化合物０ｒを、１００ｍｇのＰＬＧＡを含有する３ｍｌのクロロホルムに溶解して、油相を形成した。次にこの溶液を２０ｍｌの５％のＰＶＡ溶液（水相）に滴下添加し、５０Ｗで５分乳化して、化合物を積載したナノ粒子を形成した。最終エマルションを終夜撹拌して、溶媒を蒸発させた。ナノ粒子を洗浄し、超遠心分離により収集し、使用前に凍結乾燥した。

【0026】

ダブルエマルション技術の例では、３０ｍｇのポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）を、４℃の１ｍＬのクロロホルムに溶解した。同時に、２ｍＬの２％ｗ／ｖポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）／蒸留脱イオン水溶液を形成した。ＰＶＡの水への可溶化の際、１ｍＬのエタノール又はメタノールを非溶媒としてＰＶＡ溶液に添加した。次に活性化合物を１ｍＭの濃度でＰＶＡ／エタノール溶液に添加し、撹拌した。活性薬剤の原液、例えば１０ｍｇ／ｍｌを、例えば０．５ＭのＮａＯＨを使用したアルカリ条件下でのクルクミンの水への溶解により形成する。活性薬剤を、１５０マイクロリットルの水性容量あたり０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＬＧＡ／クロロホルム溶液に添加する。一次エマルションの形成を、活性薬剤－ＰＬＧＡ／クロロホルム溶液を２０秒ボルテックスし、続けてBranson SonifierモデルW-350（Branson社、Danbury、CN）で、５５Ｗで１分チップソニケーション（tip sonication）することにより行う。次に一次エマルションをＢＳ３／ＰＶＡ／エタノール溶液に添加して、二次エマルションの形成を開始する。二次エマルションの完了は、２０秒のボルテックス、及び５５Ｗで２分のチップソニケーションを通して行う。次に、安定した活性化ナノ粒子を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブへとアリコートし、５分、１８，０００ｇで遠心分離にかける。クロロホルム及び残留したＰＶＡ上清を吸引し、粒子を、例えば１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中でのチップソニケーションにより再懸濁した。再懸濁に続けて、ナノ粒子を－８０℃に１時間置き、終夜凍結乾燥した。凍結乾燥は、２５０μＴの真空下、ATR FD3.0システム（ATR Inc社、St. Louis、MO）で実施することができる。凍結乾燥後、ナノ粒子を４℃で保管する。使用の際、ナノ粒子をエッペンドルフチューブ中に秤量し、１ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁する。

【0027】

一部の実施形態では、本開示の化合物は、非経口製剤中に組み込まれる。用語「非経口で」は、本明細書において使用される場合、様々な点滴技術を用いた皮下、静脈内、筋肉内及び動脈内注射を含む。動脈内及び静脈内注射は、本明細書で使用される場合、カテーテルを通した投与を含む。ある特定の症状については、エンドトキシン血症又は敗血症の治療のための静脈内注射のような、治療されている組織又は器官への急速なアクセスを可能とする投与の方法が好ましい。

【0028】

本開示の化合物は、標的細胞のＴＬＲの適切な阻害又は活性化をもたらす投薬量で投与され、一般に、これらの投薬量は、好ましくは０．２５～５０ｍｇ／患者、又は１．０～１００ｍｇ／患者、又は５．０～２００ｍｇ／患者、又は１００～５００ｍｇ／患者、より好ましくは０．２５～５０ｍｇ／患者、及び最も好ましくは１．０～１００ｍｇ／患者である。投薬量は、好ましくは１日１回を２８日、より好ましくは１日２回を１４日、又は最も好ましくは１日３回を７日間である。

【0029】

活性成分を含有する医薬組成物は、意図された投与の方法に適切な任意の形態であり得る。本発明を使用して有用な剤形を作製するための技術及び組成物は、以下の参考文献の１又は２以上に記載されている。Anderson, Philip O.；Knoben, James E.；Troutman, William G, eds., Handbook of Clinical Drug Data, Tenth Edition, McGraw-Hill, 2002； Pratt and Taylor, eds., Principles of Drug Action, Third Edition, Churchill Livingston, New York, 1990； Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Ninth Edition, McGraw Hill, 2007； Goodman and Gilman, eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition, McGraw Hill, 2001；Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins., 2000及びその改定版；Martindale, The Extra Pharmacopoeia, Thirty-Second Edition(The Pharmaceutical Press, London, 1999)；これらはすべて参照により組み込まれ、同様に、関連する部分が参照により本明細書に組み込まれる。

【0030】

本発明は、本明細書において記載されている特定の用量の活性薬剤の送達のためのエアロゾルを作製及び生成するための組成物及び方法を含む。一実施形態では、化合物は、エアロゾル生成デバイスを用いてエアロゾル化される製剤である。本発明の典型的な実施形態は、製剤のエアロゾルの形成を容易とする所定の物理的及び化学的特性を有する液体組成物を含む。そのような製剤は典型的に３又は４つの基本的なパラメーター、例えば（ｉ）活性成分、（ii）活性成分のための液体担体、（iii）材料を調整するためのエアロゾル特性、及び任意の（iv）少なくとも１つの賦形剤を含む。これらの成分の組合せは、肺送達用の吸入可能なエアロゾルを生成することにより、使用者への送達についての特性が増強された治療組成物を提供する。

【0031】

本発明の化合物の水性懸濁物は、水性懸濁物の作製に適切な賦形剤を有する混合物中に活性材料を含有する。そのような賦形剤には、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガム、及び分散剤又は湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。水性懸濁物は、１又は２以上の保存剤、例えばｎ－プロピルｐ－ヒドロキシベンゾエートのエチルも含有する。

【0032】

本発明の医薬組成物は、滅菌注射調製物、例えば滅菌された水性又は油性の注射用懸濁物の形態であることができる。この懸濁物は、上述された適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術により製剤化されてもよい。滅菌注射製剤はまた、非毒性、非経口の許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液又は懸濁物、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよく、又は凍結乾燥粉末として調製されてもよい。利用され得る許容可能な媒体及び溶媒には、水、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発油は、溶媒及び懸濁媒体として従来利用され得る。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無菌性固定油（bland fixed oil）を利用してもよい。加えて、脂肪酸、例えばオレイン酸を、注射剤の分離において同様に使用してもよい。

【0033】

一部の実施形態では、製剤は、ＰＬＡ又はＰＬＧＡナノ粒子を含み、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、及び／又はエデト酸二ナトリウムとさらに混合されてもよい。

【0034】

非経口投与に適切な組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び組成を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張の滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。組成物は、単位用量又は複数用量の密封された容器、例えばアンプル及びバイアルに存在してもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即時の注入溶液及び懸濁剤は、前に記載した類の滅菌粉末から調製されてもよい。

【0035】

しかし、任意の特定の患者のための特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、治療される個体の年齢、体重、健康全般及び性別、投与時間及び経路、排出速度、以前投与されていた他の薬物、並びに治療されている特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することが理解される。

【0036】

一部の実施形態では、本開示の組成物は、約８０％～約９９．５％、好ましくは約９０又は９５％～約９８．５％の適合性の非水性の薬学的に許容される局所用媒体も含有する。いくつかの媒体は、この開示のために本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６２１，０７５号明細書に記載されている。これらの媒体は水を有しないことが好ましいが、本発明の組成物は、所望のゲルの形成に対する著しい有害作用を有さずに、最大約５％の水を含有することができる。これらの非水性媒体成分は医薬品分野においても周知であり、これらには、短鎖アルコール及びケトン及び皮膚軟化剤、例えば炭化水素油及びワックス、ラノリン及びラノリン誘導体、シリコーン油、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドエステル、脂肪アルコール、脂肪酸のアルキル及びアルケニルエステル、ジカルボン酸のアルキル及びアルケニルジエステル、多価アルコール並びにこれらのエーテル及びエステル誘導体、ワックスエステル及びミツロウ誘導体が挙げられる（しかしこれらに限定されない）。好ましい媒体には、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びこれらの成分の混合物が組み込まれる。特に好ましい媒体には、エタノール、ｎ－プロパノール及びブタノール、特にエタノールが挙げられる。本発明においてまた有用である非水性媒体を提供するために、これらの好ましい溶媒を、他の成分、例えばセバシン酸ジイソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸メチル、シリコーン、グリセリン及びこれらの成分の混合物と組み合わせてもよい。これらの追加の成分のうち、セバシン酸ジイソプロピルは特に有用である。実際、好ましい媒体は、エタノールとセバシン酸ジイソプロピルの混合物を約４：１～約１：４の重量比で含む。好ましい媒体は、約１５％～約３５％のセバシン酸ジイソプロピル、及び約６５％～約８５％のエタノールを含有する。

【0037】

本発明の組成物は、局所用医薬組成物の製剤化において従来使用される適合性の補助成分を、これらの技術的に確立された使用レベルでさらに含有してもよい。これらの補助成分には、薬学的に活性な材料（例えば補充性の抗菌性又は抗炎症成分、例えばステロイド）又は製剤自体を増強するために使用される成分（例えば賦形剤、染料、香料、皮膚浸透増強剤、安定剤、保存剤及び抗酸化剤）をさらに挙げることができるが、これらに限定されない。そのような薬剤の例には、薬学的に許容される酸性カルボキシポリマー、例えばB. F. Goodrich Chemicals社、Cleveland、Ohioから市販のCarbopol化合物が挙げられる。

【0038】

一実施形態では、本発明の化合物は、一般的なトリガースプレー容器に包装されるクリーム、ローション又はゲルへと製剤化され、容器から噴出した後、普通のクリームのように所望の領域にしっかりと付着する。これは国際公開第９８／５１２７３号パンフレットに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一態様では、本開示は、本明細書において記載されている化合物を単独で又は組み合わせて含む、局所用途のための非エアロゾル噴霧組成物へと組み込まれ得る医薬品を提供する。化合物は、クリーム、ローション又はゲルの０．１重量％～２０重量％の範囲の量で、又は一部の実施形態では１～１５重量％、又は一部の実施形態では２～１０重量％で存在する。本発明の化合物は、中性の親水性の母材のクリーム、ローション又はゲル中に組み込むことができる。第１の実施形態では、局所用途のためのクリーム又はローション母材は、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを特徴とする。第２の実施形態では、ゲルは、架橋されたアクリル酸の高分子量ポリマーを特徴とする。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、医薬品局所製剤及び化粧品において主に油中水型及び水中油型エマルションのための乳化剤として広く使用される非イオン性サーファクタントである。これは、本発明において、非エアロゾルのトリガー噴霧可能なクリーム又はローションの基剤として特徴付けられる。ゲルを形成するために利用される架橋アクリル酸ポリマー（カルボマー）は、本発明の別の目的である。

【0039】

非エアロゾルスプレーのための特に適切な基剤は、したがって、１～２５％のポリオキシエチレンアルキルエーテル、３～４０％の保湿剤、及び０．１～１％の保存剤（複数可）を含有し、１００％までの残部が精製水である、クリーム又はローションである。適切には、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル（Atlas G-3713）、ポリオキシル（poloxyl）２セチルエーテル（セテス－２）、ポリオキシル１０セチルエーテル（セテス－１０）、ポリオキシル２０セチルエーテル（セテス－２０）、ポリオキシル４ラウリルセチルエーテル（ラウレス－４）、ポリオキシル２３ラウリルセチルエーテル（ラウレス－２３）ポリオキシル２オレイルエーテル（オレス－２）、ポリオキシル１０オレイルエーテル（オレス－１０）、ポリオキシル２０オレイルエーテル（オレス－２０）、ポリオキシル２ステアリルエーテル（ステアレス－２）、ポリオキシル１０ステアリルエーテル（ステアレス－１０）、ポリオキシル２０ステアリルエーテル（ステアレス－２０）及びポリオキシル１００ステアリルエーテル（ステアレス－１００）からなる群から選択される１つ又は任意の組合せであり得る。適切な保湿剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール及びグリセリンからなる群から選択される１つ又は任意の組合せであり得る。適切な保存剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びその塩並びにフェニルエチルアルコールからなる群から選択される１つ又は任意の組合せであり得る。

【0040】

非エアロゾルスプレーのための別の適切な基剤は、０．１～２．０％のカルボマー、０．１～１％のアルカリ性溶液、３～４０％の保湿剤及び０．１～１％の保存剤（複数可）を含有し、１００％までの残部が精製水である、ゲルである。適切には、カルボマーは、カルボマー９３４、カルボマー９４０及びカルボマー９４１からなる群から選択される１つ又は任意の組合せであり得る。ゲルのための適切な保湿剤、保存剤及び精製水は、クリーム剤又はローションの場合と同じである。他の噴霧可能な製剤は、明白に参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２００５／００２５５０４８号明細書に記載されている。

【0041】

本発明は、代替的に活性化されたマクロファージを産生し、ＬＰＳ誘発性炎症を阻害して、臓器を保護し、組織傷害を抑えることができる二作用性小分子を初めて提供する。１つのそのような化合物は化合物８（ＡＶＲ－４８）であり、これはその標的に異なって結合するように設計及び同定された。エリトラン（Kim, H. M., B. S. Park, J.-I. Kim, S. E. Kim, J. Lee, S. C. Oh, P. Enkhbayar, N. Matsushima, H. Lee, O. J. Yoo and J.-O. Lee (2007). "Crystal Structure of the TLR4-MD-2 Complex with Bound Endotoxin Antagonist Eritoran." Cell 130(5): 906-917）のような他のアンタゴニストのようにＴＬＲ４－ＭＤ２複合体に結合する代わりに、これはＴＬＲ４の活性部位に直接結合し、よって下流成分を阻害する。加えて、ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株、末梢血単核細胞を使用したインビトロのモデル系中で同様にＴＬＲ４に結合し、ＢＰＤを有する新生児仔マウスにおいて炎症性サイトカインを低減する、新規のシリーズの化合物、例えば化合物１、３、８及び３２が、ＳＡＲ試験により設計及び同定された。本発明は、化合物８が、マウス脾臓単球及びマクロファージ中の表面受容体タンパク質ＴＬＲ４及びスカベンジャー受容体ＣＤ１６３に結合し、受容体への結合を介して、これらをより食作用性の常在／抗炎症性マクロファージへと極性化するという発明を初めて提供した。

【0042】

キチン及びキトサンは、理想的な薬物送達のための優秀な特性を有する（Janes, K. A., M. P. Fresneau, A. Marazuela, A. Fabra and M. a. J. Alonso (2001). "Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin." Journal of Controlled Release 73(2-3): 255-267、Williams, J., R. Lansdown, R. Sweitzer, M. Romanowski, R. LaBell, R. Ramaswami and E. Unger (2003). "Nanoparticle drug delivery system for intravenous delivery of topoisomerase inhibitors." Journal of Controlled Release 91(1-2): 167-172、Li, N., C. Zhuang, M. Wang, X. Sun, S. Nie and W. Pan (2009). "Liposome coated with low molecular weight chitosan and its potential use in ocular drug delivery." International Journal of Pharmaceutics 379(1): 131-138）。ＬＭＷキトサンは、全身毒性を有しない天然分子である。これらは、ポリマーナノ粒子として送達される能力を有する、薬物様標的のための優秀な候補である。Ｎ－ヘキサアセチルキトヘキサオースのＴＬＲ４活性部位への結合のインシリコモデルが、本発明者らの以前の刊行物において示された（Panda, S. K., S. Kumar, N. C. Tupperwar, T. Vaidya, A. George, S. Rath, V. Bal and B. Ravindran (2012). "Chitohexaose activates macrophages by alternate pathway through TLR4 and blocks endotoxemia." PLoS Pathog 8(5): e1002717）。予備的な結果及び分子のドッキングに基づき、本発明者らは上に示すいくつかの化合物を設計及び合成し、インビトロでのアッセイにおいてスクリーニングした。最適な物理化学的性質に基づき、本発明者らは、化合物１、３、８及び３２を、発達上適切な高酸素に曝露したＢＰＤマウスモデルにおいて試験するために選択した。マウスＢＰＤモデルの結果に基づき、化合物８（ＡＶＲ－４８）をリード化合物としてさらに選択し、ＢＰＤの大型動物モデルである早産の子ヒツジモデルにおいてさらに評価した。

【実施例1】

【0043】

キチン由来ＡＶＲ－４８（化合物８）は、新生児マウスにおいて実験的な気管支肺異形成症（ＢＰＤ）及びＢＰＤ関連肺高血圧症を予防する

【0044】

ＡＶＲ－４８の安全性プロファイル。ＡＶＲ－４８（化合物８）の安全性を評価するために、２用量の静脈内（ＩＶ）のゆっくりとしたボーラス注射又は皮下（ＳＣ）注射又は鼻腔内（ＩＮ）滴下を、仔マウス又は仔ラット（出生後３～５日又はＰ３～Ｐ５）に６時間未満の間隔で投与した。総１日用量は、最大１００ｍｇ／ｋｇ／日のＩＶ、及び最大１５０ｍｇ／ｋｇ／日のＳＣを連続３日であった。すべての用量は忍容性良好であり、いかなる有害な臨床徴候及び／又は体重の変化も観察されなかった（データは示さず）。白血球数、リンパ球数（雌のみ）及び総ビリルビンレベル（ＳＣ群のみ）のわずかな低減が処置動物において記録され、これらは頻度又は重症度が軽度かつ用量依存性ではなかったため、有害でないと考えられた（データは示さず）。ＡＶＲ－４８（化合物８）を５０ｍｇ／ｋｇ／用量での１日２回のＩＶで投与された仔において、媒体のみをＩＶ投与された動物と比較して、注射部位の皮膚／皮下出血の高い発生率は、頬、下顎又は頸部の皮下混合細胞浸潤と高頻度に相関した。不確かではあるが、ＩＶ投与された仔におけるこれらの症状の高い発生率は、これらが薬物に関連した血管刺激であり得ることを示す。血液学的又は臨床的な化学的パラメーターは、いずれも変化がなかった。変色、腫脹の徴候並びに局所的刺激の巨視的及び微視的徴候はすべての処置群において投与部位で発生し、投与媒体（滅菌水中１０％のＤＭＳＯ、２０％のテトラグリコール、及び２０％のＰＥＧ４００の製剤）に起因した。剖検では、仔マウス及び仔ラットの内臓臓器にＡＶＲ－４８に関連した全身性の肉眼的所見のエビデンスはなく（データは示さず）、ＡＶＲ－４８に起因する有害な所見もなかった。この試験においてモニタリングされたパラメーターに基づき、最大耐用量（ＭＴＤ）及び無毒性量（ＮＯＡＥＬ，no-observed-adverse-effect level）は、ＩＶにより１００ｍｇ／ｋｇ／日、及びＳＣ投薬経路により１５０ｍｇ／ｋｇ／日と考えられた。

【0045】

ＡＶＲ－４８（化合物８）の薬物動態学（ＰＫ）プロファイル。溶液、懸濁物又はナノ粒子カプセル化として製剤化された薬物の、血漿、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び肺組織中のバイオアベイラビリティーを確認するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、仔マウス及び仔ラットの両方におけるＩＶ、ＩＰ及びＩＮ投薬によるＡＶＲ－４８のＰＫ試験を、社内で開発及び設計した。

【0046】

有効性についての用量範囲を決定するために、第１の試験を、仔マウスの血漿中でＩＰ及びＩＮ経路により行った。０．０８３３時間（ｈｒ）のＴ_ｍａｘが１０ｍｇ／ｋｇ又は０．２２ｍｇ／ｋｇ ＩＰ用量についていずれも見出され、１０ｍｇ／ｋｇ用量については０．３６時間のＴ_１／２での血液からの急速なクリアランスを伴った。定量下限（ＬＬＯＱ）を超えるＡＶＲ－４８レベルを有する試料の数では、０．２２ｍｇ／ｋｇ用量におけるＴ_１／２は決定できなかった。ＩＮ投薬については、０．２２ｍｇ／ｋｇの用量であってさえも１時間のＴ_ｍａｘが見出され、急速なクリアランスが２時間まで観察された。肺組織中のＡＶＲ－４８のアベイラビリティーはＩＰ及びＩＮ経路の両方による血漿中のものと類似しており、０．０８３３時間のＴ_ｍａｘが１０ｍｇ／ｋｇ用量について記録された。低レベルのＡＶＲ－４８では、１０ｍｇ／ｋｇ用量においてＴ_１／２を決定できなかった。また、肺組織中の極めて低レベルのＡＶＲ－４８では、０．２２ｍｇ／ｋｇ用量についていかなるＰＫパラメーターも計算できなかった。まとめると、これらのデータにより、仔マウスにおいてＩＰ注射に続けてＡＶＲ－４８が循環中から急速に除去されること（Shah, D., P. Das, S. Acharya, B. Agarwal, D. J. Christensen, S. M. Robertson and V. Bhandari (2021). "Small Immunomodulatory Molecules as Potential Therapeutics in Experimental Murine Models of Acute Lung Injury (ALI)/Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)." Int J Mol Sci 22(5)）、及び仔マウスにおいてＩＰ注射により観察されたＢＰＤの予防の有効性がＡＶＲ－４８の全身曝露に起因し得ることが示唆される。それにも関わらず、これらのデータにより、ＩＮ並びにＩＰ経路によるＡＶＲ－４８の送達の実現可能性が実証される。

【0047】

第２のＰＫ試験を仔ラットにおいて行い、ここでＡＶＲ－４８をＳＣ又はＩＶのいずれかで１００及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日で連続３日投与し、上の２群についてそれぞれ薬物の最大血漿濃度を３０及び６０分（ｍｉｎ）記録した（Ｔ_ｍａｘ）。ＩＶ投与された動物については、血漿中のＡＶＲ－４８の最大濃度は双指数関数的に減少し、Ｔ_１／２は推定不可能であった。ＳＣ用量動物のみについては、ＡＵＣ_{（０－ｔ）}は５０～７５ｍｇ／ｋｇ用量の間で用量比例的に増加した。ＡＶＲ－４８への曝露は３日間の１日２回の投与後実質的に変化せず、薬物の蓄積はみられなかった。絶対バイオアベイラビリティーを、ＡＵＣ_{（０－ｔ）}を使用して、１日目に（２０１０／５４６０）^＊１００＝３６％、及び３日目に（２６１０／４２００）^＊１００＝６２％と推定した。

【0048】

ＢＡＬＦ中、１日目のＡＶＲ－４８（化合物８）の最大濃度は０．８９１～１．０７μｇ／ｍＬの範囲であり（Ｃ_ｍａｘ）、投与後２～１５分の間に出現した。両方の投与経路について、３日目のＢＡＬＦ ＡＶＲ－４８の最大濃度は０．７８０～１．６７μｇ／ｍＬの範囲であり（Ｃ_ｍａｘ）、投与後１５～６０分の間で生じた（Ｔ_ｍａｘ）。Ｔ_１／２が推定不可能である場合にのみ、持続したレベルのＡＶＲ－４８が観察された。ＩＶ投与された動物のみについては、ＰＫ１日目には最大濃度はその後減少したが、ＰＫ３日目にはＡＶＲ－４８のレベルはその後持続した。Ｔ_１／２は同様に推定不可能であった。ＳＣ投与された動物のみについては、ＡＵＣ_{（０－ｔ）}は１００～１５０ｍｇ／ｋｇ／日の間で用量比例的に増加したが、３日目は例外であり、ＡＵＣ_{（０－ｔ）}は用量にあまり比例せずに減少した。要約すると、両方の経路について３日間の１日２回の投与後に、ＡＶＲ－４８への曝露は１００ｍｇ／ｋｇ／日については増加したが、１５０ｍｇ／ｋｇ／日群についてはそうではなかった。ＩＶ投与された動物についてのＡＵＣ_{（０－ｔ）}を使用した蓄積比は２．０４であり、ＳＣ投与された動物については、これらは１００及び１５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量でそれぞれ１．９０及び０．８８０であった。

【0049】

薬物放出及び用量反応試験。動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、ポリＤ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）でカプセル化されたナノ粒子形態のＡＶＲ－４８のサイズを決定し、これは３６９±４５ｎｍであり、ゼータ電位は－１９．３６ｍＶであることが判明した。３７℃のＰＢＳ_７．４中、ＰＬＧＡでカプセル化されたＡＶＲ－４８ナノ懸濁物から、薬物が最初の１２時間で約６０％放出され、その後１５日にわたり７０～１００％放出された。本発明者らは、いくつかの濃度のＡＶＲ－４８ナノ懸濁物を使用して最大用量反応試験を行い、０．１１ｍｇ／ｋｇが安全かつ有効な用量であると決定した。初期の報告では（Shah, D., P. Das, S. Acharya, B. Agarwal, D. J. Christensen, S. M. Robertson and V. Bhandari (2021). "Small Immunomodulatory Molecules as Potential Therapeutics in Experimental Murine Models of Acute Lung Injury (ALI)/Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)." Int J Mol Sci 22(5)）、本発明者らは、成人呼吸窮迫症候群／急性肺傷害（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）マウスモデルにおいてＡＶＲ－４８（化合物８）の有効用量が１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶであることを実証した。本試験では、仔マウスの血漿中のＣ_ｍａｘ値により、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＶＲ－４８の単回ＩＶ又はＩＰ注射が５．７８±０．９１μＭのＣ_ｍａｘをもたらし、所望の抗炎症治療応答をもたらすのに十分であり得るという手がかりが得られた。したがって、１０ｍｇ／ｋｇをＢＰＤマウスモデル試験において試験されるＡＶＲ－４８についての最適用量として選択して、続いて、用量反応試験を行って最小有効用量を決定した。

【0050】

同時に、ＡＶＲ－４８ナノ懸濁物製剤ＩＮ（０．１１ｍｇ／ｋｇ）も、溶液の形態でのＩＰ及びＩＶ（１０ｍｇ／ｋｇ）（顔面静脈を通して）と同様に試験し、すべての投与経路が類似した転帰を生じることを確認した。ＩＮで送達される場合にＡＶＲ－４８が肺に到達したことを証明するために、試験化合物をフルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせ、次に組織学的に評価して、肺区域で緑色蛍光染色が明らかであった場合にこれが肺に到達したと確認した。上記のようなＰＫ試験から、溶液製剤としてＩＮ又はＩＰ経路のいずれかを介して送達される場合、血漿及び肺中の薬物のバイオアベイラビリティーは類似していた。この試験の目標は、商業的に実用可能でありかつ適用可能なＢＰＤのための治療候補としてＡＶＲ－４８を開発することであるため、薬物を早産の赤子に全身送達するにはＩＮ経路よりもＩＶの方がより容易であろうという理由から、ＩＰ経路を新生児仔マウスにおける薬物送達の好ましい様式として選択した。すべての投与経路についてエンドポイントが類似していたため、すべての投与経路の結果及び転帰を累積的に示した。０．５、２．０、５．０及び１０ｍｇ／ｋｇ用量を使用したＩＰ投薬を介する用量反応試験により、５．０ｍｇ／ｋｇが最小有効用量であり、一方で１０ｍｇ／ｋｇがＢＰＤ表現型の予防（８０％未満）における最適な用量であることが実証された（図１）。ＰＬＧＡナノ懸濁物（０．１１ｍｇ／ｋｇ）も、ＩＮ送達される場合、類似した有効性をもたらした。図１は、ＩＰ投与された０．５、２．０、５．０及び１０ｍｇ／ｋｇの異なる用量でのＡＶＲ－４８の用量反応試験の図である。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｎ＝群あたり５～７匹のマウス。１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）を、最も有効な用量として選択した。ＩＰ：腹腔内、Ｈｙｐ：高酸素、ＢＰＤ：気管支肺異形成症。

【0051】

ＡＶＲ－４８は肺の形態を回復し、肺胞細胞の生理を改善した。ＡＶＲ－４８の安全性プロファイルの評価及び使用される理想の用量の確認の後、次に本発明者らは、前に記載されたように（Bhandari, V., R. Choo-Wing, C. G. Lee, K. Yusuf, J. H. Nedrelow, N. Ambalavanan, H. Malkus, R. J. Homer and J. A. Elias (2008). "Developmental regulation of NO-mediated VEGF-induced effects in the lung." Am J Respir Cell Mol Biol 39(4): 420-430、Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014、Das, P., S. Acharya, D. Shah, B. Agarwal, V. Prahaladan and V. Bhandari (2020). "Chitin Analog AVR-25 Prevents Experimental Bronchopulmonary Dysplasia." J Pediatr Intensive Care 9(3): 225-232、Das, P., T. Curstedt, B. Agarwal, V. M. Prahaladan, J. Ramirez, S. Bhandari, M. A. Syed, F. Salomone, C. Casiraghi, N. Pelizzi and V. Bhandari (2020). "Small Molecule Inhibitor Adjuvant Surfactant Therapy Attenuates Ventilator- and Hyperoxia-Induced Lung Injury in Preterm Rabbits." Front Physiol 11: 266）、実験的ＢＰＤマウスモデルにおける肺への治療効果を評価するために試験を行った。ＢＰＤは、大きな気嚢、肥厚した隔膜及び薄い肺胞上皮を有する、拡張した単純化した肺胞を特徴とし（図２Ａ）、肺胞細胞増殖の全体的な低減、血管新生の低減／調節不全、及び細胞死の増加を伴う。これらの特性はすべて、Ｐ２日目及びＰ４日目のＩＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）での２用量のＡＶＲ－４８の注射後に回復した。コード長（図２Ｂ）及び中隔厚（図２Ｃ）から明らかであるように、肺胞嚢は、処置群において、ＲＡ対照と同等に正常な形状及びサイズを取り戻した。疾患状態において低減する肺胞分岐数（ＲＡＣ）も、ＡＶＲ－４８処置後に改善した（図２Ｄ）。ＢＡＬＦ中に存在する総炎症性細胞（図３Ａ）及び総タンパク質含有量（図３Ｂ）は、両方ともＢＰＤにおいて増加するが、ＡＶＲ－４８での処置後に低減した。細胞増殖が復活した（Ki67免疫染色から明らかである、図４Ａ）。Ｉ型及びII型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）は、文書に記載されているように肺胞形成のプロセスに最も関連するため、細胞の特異性を評価するために本発明者らはこれらに注目した。本発明者らは、好ましいマーカーとして、Ｉ型ＡＥＣについては終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を（Bassler, D., E. S. Shinwell, M. Hallman, P. H. Jarreau, R. Plavka, V. Carnielli, C. Meisner, C. Engel, A. Koch, K. Kreutzer, J. N. van den Anker, M. Schwab, H. L. Halliday, C. F. Poets and G. Neonatal European Study of Inhaled Steroids Trial (2018). "Long-Term Effects of Inhaled Budesonide for Bronchopulmonary Dysplasia." N Engl J Med 378(2): 148-157、Bhandari, V. (2002). "Developmental differences in the role of interleukins in hyperoxic lung injury in animal models." Front Biosci 7: d1624-1633）、及びII型ＡＥＣについてはサーファクタントタンパク質（ＳＰ）－Ｃを（Bhandari, V. (2014). "Drug therapy trials for the prevention of bronchopulmonary dysplasia: current and future targets." Front Pediatr 2: 76、Bhandari, V. (2016). Bronchopulmonary Dysplasia）利用した。Ki67及びＳＰ－Ｃが同じ種において上昇したことに起因して、細胞は増殖するときにＧ１／Ｓ相に長時間とどまるため、十分に確立された細胞増殖のマーカーである増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）発現を増殖細胞の好ましいマーカーとして使用した。サーファクタントタンパク質（ＳＰ）－Ｃ及びＰＣＮＡと共局在する細胞の数は、ＲＡ、ＲＡ＋ＡＶＲ－４８及びＢＰＤ＋ＡＶＲ－４８群と比較して、ＢＰＤ群ではより少なかった（図４Ｂ）。ＲＡ及びＲＡ＋ＡＶＲ－４８群において、ＰＣＮＡ並びにＲＡＧＥに二重陽性であった細胞はほぼなかった（図４Ｃ）。他方、ＲＡＧＥ＋ｖｅ細胞の数は、ＲＡ、ＲＡ＋ＡＶＲ－４８及びＢＰＤ＋ＡＶＲ－４８群と比較してＢＰＤ群において低減したが、これらはＢＰＤ又はＢＰＤ＋ＡＶＲ－４８群においてＰＣＮＡと共局在しなかった（図４Ｃ）。加えて、ＡＶＲ－４８での処置の後、ＢＰＤ群と比較して、（TUNEL染色（図５Ａ）及び切断型カスパーゼ３の免疫ブロット法、図５Ｂに示されるように）細胞死の減少がみられた。

【0052】

血管は、ＢＰＤにおいて通常崩壊しているが、改善を示した（ｖＷＦ免疫染色、図６Ａから明らかである）。アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、ＢＰＤにおいて増加しているが（Bhandari, V., R. Choo-Wing, C. G. Lee, K. Yusuf, J. H. Nedrelow, N. Ambalavanan, H. Malkus, R. J. Homer and J. A. Elias (2008). "Developmental regulation of NO-mediated VEGF-induced effects in the lung." Am J Respir Cell Mol Biol 39(4): 420-430、Bhandari, V., R. Choo-Wing, C. G. Lee, Z. Zhu, J. H. Nedrelow, G. L. Chupp, X. Zhang, M. A. Matthay, L. B. Ware, R. J. Homer, P. J. Lee, A. Geick, A. R. de Fougerolles and J. A. Elias (2006). "Hyperoxia causes angiopoietin 2-mediated acute lung injury and necrotic cell death." Nat Med 12(11): 1286-1293）、ＡＶＲ－４８での処置後に有意に低減し（図６Ｂ）、よって、ＡＶＲ－４８処置が血管漏出を安定化し血管新生の成長を促進することが可能であり得ることが示唆される。

【0053】

ＡＶＲ－４８は、サーファクタントを伴ってもいかなる有害作用も有しなかった。外因性サーファクタントは、早産新生児の初期におけるＲＤＳを予防及び管理するために新生児集中治療室（ＮＩＣＵ）の標準ケアとして使用されるため、本発明者らは、ＡＶＲ－４８のサーファクタントとの併用の影響（もしあれば）を試験することを望んだ。マウスには（サーファクタントが欠乏している早産ヒト乳児とは異なり）サーファクタントが十分にあるが、本発明者らは、Curosurf（登録商標）（ＣＳ、Chiesi Parma社、Italyからの市販のサーファクタント）をＩＮ送達してヒト赤子における気管内（ＩＴ）点滴を模倣し、続けてＡＶＲ－４８をＩＰ注射して、アジュバント治療として投与される場合にＡＶＲ－４８がＣＳと良好な適合性を有するかどうかを実証した。未処置のＢＰＤ群単独と比較して、ＡＶＲ－４８単独又はＣＳ単独又はＣＳとＡＶＲ－４８との組合せで処置されたＢＰＤ群の間で、ＢＡＬＦ中の総細胞及び総タンパク質含有量に変化はなかった。

【0054】

ＡＶＲ－４８は肺のＴＬＲ４発現を増加する。インシリコでの分子モデリング及びインビトロでの試験から、ＡＶＲ－４８がｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４への結合親和性を有し、したがって、ＥＬＩＳＡにより決定する場合、処置の４８時間後にＴＨＰ－１ヒト単球細胞中のＴＬＲ４の発現レベルを７６．０ｎＭのＥＣ_５０で低減することが判明した（データは示さず）。クリニカルシナリオでは、新生児は免疫が弱まっているために感染しやすく、なんらかの外部からの後天性感染と闘うために彼らの自然免疫系に依存し、ＴＬＲ４は新生児免疫系の必須の成分である。ＡＶＲ－４８処置を行った肺中のＴＬＲ４発現を決定するために、ウェスタンブロットを全肺ホモジネートに対して行った。驚くべきことに、処置後、肺中のＴＬＲ４の発現が増加した。ＡＶＲ－４８は、細胞株中でＴＬＲ４発現を低減するが、このインビボのＢＰＤマウスモデルにおいてＴＬＲ４を増加した。

【0055】

ＡＶＲ－４８処置はＢＰＤ仔肺中のＢＡＬ細胞の数を低減したが、市販のＴＬＲ４アンタゴニストであるTAK 242は低減しなかった。活性の差を示す（図９）。

【0056】

図１０は、ＴＬＲ４の対応する濃度測定での定量化（上部右のパネル）を伴う、肺ホモジネートの代表的なウェスタンブロッティングを示す。ビンキュリンはローディング対照であり、同じ試料が使用されたため、図７Ａ及び８Ｂに示されるのと同じものである。

【0057】

ＢＰＤを有する動物において、ＡＶＲ－４８は２つの重要な自然免疫細胞集団を正常化する。ＡＶＲ－４８のＴＬＲ４への親和性、及びＡＶＲ－４８処置されたＢＰＤ動物におけるＴＬＲ４発現の増加に基づき、本発明者らは肺間質への免疫細胞の動員に対する影響があるかどうかを決定した。フローサイトメトリーを行って、ＲＡ及びＢＰＤ群中のＡＶＲ－４８で処置された動物及び未処置の動物からの新生児仔マウスの肺中、重要な免疫細胞集団の絶対数を決定した。細胞集団は以下のように同定された：マクロファージ（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ－Ｆ４／８０^＋）、樹状細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１０３^＋ＭＨＣII^ｈｉｇｈ）、好中球（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋）、Ｂ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ１９^＋）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋）、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）及びＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋）。これらの細胞集団を、自然及び獲得免疫細胞集団の両方を同定するために選択した。第１に、免疫細胞の肺への動員に対するＡＶＲ－４８単独の影響を決定するために、ＲＡ動物をＡＶＲ－４８処置されたＲＡ動物と比較した。ＡＶＲ－４８で処置されたＲＡ動物は、わずかであるが統計学的に有意に、肺中のマクロファージが低減し、樹状細胞が増加した。すべての他の細胞集団は類似していた（図１１）。したがって、ＡＶＲ－４８それ自体は、肺中の免疫細胞組成に対して最小限の影響しか有しなかった。

【0058】

刊行された文献及び前の試験と一致して（Sureshbabu, A., M. Syed, P. Das, C. Janer, G. Pryhuber, A. Rahman, S. Andersson, R. J. Homer and V. Bhandari (2016). "Inhibition of Regulatory-Associated Protein of Mechanistic Target of Rapamycin Prevents Hyperoxia-Induced Lung Injury by Enhancing Autophagy and Reducing Apoptosis in Neonatal Mice." Am J Respir Cell Mol Biol 55(5): 722-735、Syed, M., P. Das, A. Pawar, Z. H. Aghai, A. Kaskinen, Z. W. Zhuang, N. Ambalavanan, G. Pryhuber, S. Andersson and V. Bhandari (2017). "Hyperoxia causes miR-34a-mediated injury via angiopoietin-1 in neonatal lungs." Nat Commun 8(1): 1173、Gilfillan, M., P. Das, D. Shah, M. A. Alam and V. Bhandari (2020). "Inhibition of microRNA-451 is associated with increased expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor and mitgation of the cardio-pulmonary phenotype in a murine model of Bronchopulmonary Dysplasia." Respir Res 21(1): 92）、ＢＰＤ群において、ＲＡ群を上回る好中球（Sun, Y., C. Chen, X. Zhang, X. Weng, A. Sheng, Y. Zhu, S. Chen, X. Zheng and C. Lu (2019). "High Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio Is an Early Predictor of Bronchopulmonary Dysplasia." Front Pediatr 7: 464）及び樹状細胞（De Paepe, M. E., L. C. Hanley, Z. Lacourse, T. Pasquariello and Q. Mao (2011). "Pulmonary dendritic cells in lungs of preterm infants: neglected participants in bronchopulmonary dysplasia?" Pediatr Dev Pathol 14(1): 20-27）の有意な増加がみられた。次に、ＡＶＲ－４８で処置されたＢＰＤ動物と未処置のＢＰＤ動物とを比較した。興味深いことに、ＡＶＲ－４８で処置されたＢＰＤ動物は、未処置のＢＰＤ動物と比較して好中球が低減し、マクロファージが増加し、これらの細胞集団はＲＡ対照群と類似のレベルであった。したがって、ＢＰＤの状況において、ＡＶＲ－４８は２つの重要な自然免疫細胞集団を正常化した。

【0059】

ＡＶＲ－４８は、炎症誘発性サイトカインを低減し、抗炎症性サイトカインを増加することにより、肺中の炎症を抑制する。ＡＶＲ－４８処置を用いたこの好中球とマクロファージとの均衡の差、及びＢＰＤ重症度についての重要な測定基準の有意な改善（図２Ａ）に基づき、本発明者らは、ＡＶＲ－４８で処置された動物において炎症性サイトカイン産生が改善されるであろうと仮説を立てた。肺胞の炎症は、ＢＰＤの発病における特徴の１つである。本発明者ら（Bhandari, V. (2002). "Developmental differences in the role of interleukins in hyperoxic lung injury in animal models." Front Biosci 7: d1624-1633、Bhandari, V. and J. A. Elias (2006). "Cytokines in tolerance to hyperoxia-induced injury in the developing and adult lung." Free Radic Biol Med 41(1): 4-18）及びその他（Speer, C. P. (2006). "Pulmonary inflammation and bronchopulmonary dysplasia." J Perinatol 26 Suppl 1: S57-62; discussion S63-54）により報告されたように、いくつかのサイトカイン及びケモカインがＢＰＤにおいて上方調節される。胚ホモジネート中で、マスター炎症性転写因子である核因子カッパＢ（ＮｆｋＢ）、並びに一部の炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、インターロイキン（ＩＬ）－１３及びＩＬ－１βは、ＢＰＤ群においてＲＡ対照と比較して劇的に増加しているにもかかわらず、ＡＶＲ－４８での処置の際には顕著な低減がみられた（図７Ａ～Ｂ）。対照的に、ウェスタンブロッティングにより明らかなように、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０は処置の際に増加するが、これはＢＰＤ群において相当に低減する（図７Ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイにより、肺ライセート（データは示さず）及び血清からも類似の結果が得られた。炎症誘発性サイトカインの一部、例えば単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、インターフェロンガンマ誘発性タンパク質（ＩＰ）－１０、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、ＩＬ－１β及びＴＮＦαは、ＢＰＤ群においてＲＡ対照と比較して血清中有意に上方調節され、ＡＶＲ－４８での処置後、正常レベルへと低減した（図７Ｃ）。ＲＡ＋ＡＶＲ－４８群は、これらのアッセイを行う時に試料を入手不可能であったため、含めなかった。ＩＬ－１０は、ＢＰＤ群において薬物処置後に顕著に増加した（図７Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＢＰＤの状況においてＡＶＲ－４８が肺への免疫細胞の動員に影響を与えないことを示す。しかし、ＡＶＲ－４８は炎症性及び抗炎症性サイトカイン産生を有効に調節し、処置された動物を抗炎症環境の方へとシフトさせ、肺の形態計測を改善する可能性がある。

【0060】

ＡＶＲ－４８は、肺がＢＰＤ－ＰＨへと進行するのを防ぐ。ＢＰＤ－ＰＨは異常な血管のリモデリング及び肺血管系の希薄化を特徴とし、血管の成長停止をもたらし、これは最終的に肺血管抵抗性の増加及び右心不全をもたらす（Hansmann, G., H. Sallmon, C. C. Roehr, S. Kourembanas, E. D. Austin, M. Koestenberger and N. European Pediatric Pulmonary Vascular Disease (2021). "Pulmonary hypertension in bronchopulmonary dysplasia." Pediatr Res 89(3): 446-455）。本発明者らにより前に報告されたように、類似の効果は実験的ＢＰＤのマウスモデルにおいてもみられる（Sun, H., R. Choo-Wing, A. Sureshbabu, J. Fan, L. Leng, S. Yu, D. Jiang, P. Noble, R. J. Homer, R. Bucala and V. Bhandari (2013). "A critical regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in hyperoxia-induced injury in the developing murine lung." PLoS One 8(4): e60560、Sureshbabu, A., M. Syed, P. Das, C. Janer, G. Pryhuber, A. Rahman, S. Andersson, R. J. Homer and V. Bhandari (2016). "Inhibition of Regulatory-Associated Protein of Mechanistic Target of Rapamycin Prevents Hyperoxia-Induced Lung Injury by Enhancing Autophagy and Reducing Apoptosis in Neonatal Mice." Am J Respir Cell Mol Biol 55(5): 722-735、Syed, M., P. Das, A. Pawar, Z. H. Aghai, A. Kaskinen, Z. W. Zhuang, N. Ambalavanan, G. Pryhuber, S. Andersson and V. Bhandari (2017). "Hyperoxia causes miR-34a-mediated injury via angiopoietin-1 in neonatal lungs." Nat Commun 8(1): 1173、Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014）。心室中隔（ＩＶＳ）厚の増加を伴い、右心室（ＲＶ）が肥大する。ＲＶ／左心室（ＬＶ）及びＦｕｌｔｏｎ指数（ＲＶ／ＬＶ＋ＩＶＳ）は、ＲＡと比較してＢＰＤ群においてより高いが、ＢＰＤ群においてＡＶＲ－４８での処置後に有意に低減する（図８Ａ）。薬物で処置されたＲＡ群において比に変化はなく、これはＲＡ対照群と類似していた（図８Ａ）。総血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｇｆ）はＢＰＤ群においてより少なく、これはＡＶＲ－４８での処置後に相当に増加し（図８Ｂ）、他方、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）（Potter, C. F., N. T. Kuo, C. F. Farver, J. T. McMahon, C. H. Chang, F. H. Agani, M. A. Haxhiu and R. J. Martin (1999). "Effects of hyperoxia on nitric oxide synthase expression, nitric oxide activity, and lung injury in rat pups." Pediatr Res 45(1): 8-13）及び骨形成タンパク質受容体（ＢｍｐＲ）IIはＢＰＤにおいて上昇することが公知であるが（Alejandre-Alcazar, M. A., G. Kwapiszewska, I. Reiss, O. V. Amarie, L. M. Marsh, J. Sevilla-Perez, M. Wygrecka, B. Eul, S. Kobrich, M. Hesse, R. T. Schermuly, W. Seeger, O. Eickelberg and R. E. Morty (2007). "Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292(2): L537-549、Chen, X., M. Orriols, F. J. Walther, E. H. Laghmani, A. M. Hoogeboom, A. C. B. Hogen-Esch, P. S. Hiemstra, G. Folkerts, M. T. H. Goumans, P. Ten Dijke, N. W. Morrell and G. T. M. Wagenaar (2017). "Bone Morphogenetic Protein 9 Protects against Neonatal Hyperoxia-Induced Impairment of Alveolarization and Pulmonary Inflammation." Front Physiol 8: 486）、ＡＶＲ－４８で処置された群において有意に低減した（図８Ｃ）。本発明者らの知る限りＶｅｇｆ－ＤはＢＰＤのマウスモデルにおいてこれまで報告されておらず、本試験では、本発明者らは、ＢＰＤにおいてＶｅｇｆ－Ｄタンパク質の発現が増加し、処置後に低減することを実証している。上のデータはすべて、ＡＶＲ－４８がＢＰＤ心肺表現型を救うことができることを明白に示している。

【0061】

図１１は、ＢＰＤを有する動物において、ＡＶＲ－４８が２つの重要な自然免疫細胞集団を正常化することを示す。肺中、ＢＰＤ群において、ＲＡ群に対する好中球及び樹状細胞の有意な増加がみられたが、マクロファージは低減した。ＡＶＲ－４８で処置されたＲＡ動物は、ＲＡ動物と比較して、わずかであるが統計学的に有意に、肺中のマクロファージが低減し、樹状細胞が増加した。ＡＶＲ－４８で処置されたＢＰＤ動物は、未処置のＢＰＤ動物と比較して好中球が低減し、マクロファージが増加し、これらの細胞集団はＲＡ対照群と類似のレベルであった。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。ＲＡ：室内気、ＢＰＤ：気管支肺異形成症、ＴＬＲ：ｔｏｌｌ様受容体、Ｎ＝５～８。

【0062】

新生児の救命方法においていくらかの進歩があるにもかかわらず、ＢＰＤは、早産児において最も壊滅的な命を脅かす状態の１つであり続けている。出生前の合併症及び出生後の結果による炎症性障害の繰り返しは、肺表現型を悪化させる。ＢＰＤ－ＰＨは、さらに重度の罹患率及び死亡率の有意な一因となる。しかし早期に予防される場合、これらの早産乳児の小児期にこの状態を緩和して呼吸器の状態及び発達の遅延を改善することができる。本発明者らは近年、ＡＶＲ－４８が成体マウスにおいてＬＰＳ誘発性、高酸素誘発性及びＣＬＰ誘発性ＡＲＤＳにおける重度の肺炎症を低減し、ＡＶＲ－４８の別の近いアナログであるＡＶＲ－２５が、実験的ＢＰＤの新生児マウスモデルにおいて肺傷害を予防することができると報告した（Das, P., S. Acharya, D. Shah, B. Agarwal, V. Prahaladan and V. Bhandari (2020). "Chitin Analog AVR-25 Prevents Experimental Bronchopulmonary Dysplasia." J Pediatr Intensive Care 9(3): 225-232）。バルク製造を容易とし、物理化学特性を改善するために、本発明者らは化学系統を最適化し、ＡＶＲ－４８をＡＶＲ－２５よりも良好なリードであると特定した。この試験では、ＡＶＲ－４８が肺傷害及びＢＰＤ－ＰＨを緩和することにより実験的ＢＰＤを予防することが示された。ＢＰＤは新生児疾患であるため、本発明者らは、形成の間に化合物を最も純粋な形態で合成することによりこれを非毒性とするためにあらゆる取り組みを行い、１００ｍｇ／ｋｇの高用量が内臓臓器にいかなる毒性効果も有しなかったことに言及した。最も重要なことには、用量反応有効性及び毒物動態学試験から、５ｍｇ／ｋｇ／日の最小有効用量対１００ｍｇ／ｋｇ／日のＮＯＡＥＬに基づき、若齢マウスにおけるＡＶＲ－４８についての治療指数は２０倍であると決定され、これはリード薬物候補について非常に望ましいプロファイルである。

【0063】

サーファクタントは世界中でＮＩＣＵにおける標準ケアであるため、本発明者らは、インビボでのサーファクタントとのいかなる交差反応性も除外するために、仔マウスにおいてＣＳとともにアジュバントとして投与されたＡＶＲ－４８を試験した。薬物とＣＳとの間の相互作用に対する有害作用はなかった。コード長は正常であり、ＢＡＬＦ中の総細胞及びタンパク質含有量はＡＶＲ－４８単独又はＣＳ単独で処置された群のものと類似していた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。

【0064】

図１３Ａ及び１３Ｂは、仔マウスにおける薬物のバイオアベイラビリティーを示す。（図１３Ａ）血漿中の平均ＡＶＲ－４８濃度。（図１３Ｂ）ＩＮ又はＩＰ投与後の、肺中の平均ＡＶＲ－４８濃度。ＩＰ：腹腔内、ＩＮ：鼻腔内、Ｎ＝６。

【0065】

図１４Ａ及び１４Ｂは、仔ラットにおける薬物のバイオアベイラビリティーを示す図である。（図１４Ａ）血漿中の平均ＡＶＲ－４８濃度。（図１４Ｂ）ＩＶ及びＳＣ投与の後のＢＡＬ中の平均ＡＶＲ－４８濃度。ＩＶ：静脈内、ＳＣ：皮下、ＢＡＬｆ：気管支肺胞洗浄液、Ｎ＝６。

【0066】

炎症の増加、血管新生の低減／調節不全、細胞死の増加及び細胞増殖の低減は、ＢＰＤの発病に関連する重要な特性の一部である。ＡＶＲ－４８は、すべて炎症のメディエータであるＴＧＦβ、ＮＦｋＢ、ＴＮＦα、ＩＬ１β、ＭＣＰ－１、ＩＰ－１０、ＩＦＮγを阻害することにより炎症を抑制することができ、対照的に、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０は処置の際に上方調節された。ＡＶＲ－４８はＴＬＲ４への結合親和性を有するが、ＡＶＲ－４８処置後にＴＬＲ４発現が増加した。ＴＬＲ４は、新生児脳中（Liu, Y., P. Jiang, M. Du, K. Chen, A. Chen, Y. Wang, F. Cao, S. Deng and Y. Xu (2015). "Hyperoxia-induced immature brain injury through the TLR4 signaling pathway in newborn mice." Brain Res 1610: 51-60）及び肺中（Chen, Y., Q. Li, Y. Liu, L. Shu, N. Wang, Y. Wu, X. Sun and L. Wang (2015). "Attenuation of hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats by 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D3." Exp Lung Res 41(6): 344-352）、高酸素曝露の後に活性化し、これは炎症性サイトカイン放出をもたらす。潜在的に、ＡＶＲ－４８はＴＬＲ４に部分的に結合し得、これはＴＩＲドメイン含有アダプター誘導性インターフェロンβ（ＴＲＩＦ）経路を活性化し得、ＩＬ－１０の産生の増加、並びにＴＮＦα及びＩＬ１βのようなＭｙＤ８８依存性炎症性サイトカインの産生の低減をもたらす（Tam, J. S. Y., J. K. Coller, P. A. Hughes, C. A. Prestidge and J. M. Bowen (2021). "Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonists as potential therapeutics for intestinal inflammation." Indian J Gastroenterol）。ＩＬ－１０はＴＬＲ４の抑制因子として作用するため、このＩＬ－１０の増加はＴＬＲ４活性化についての負のフィードバックループとして働くであろう（Curtale, G., M. Mirolo, T. A. Renzi, M. Rossato, F. Bazzoni and M. Locati (2013). "Negative regulation of Toll-like receptor 4 signaling by IL-10-dependent microRNA-146b." Proc Natl Acad Sci U S A 110(28): 11499-11504）。例示として、決して本発明の限定としてではなく、本発明者らは、ＬＰＳ誘発性敗血症モデルにおいてキトヘキサオースを用いて示されたように（Panda, S. K., S. Kumar, N. C. Tupperwar, T. Vaidya, A. George, S. Rath, V. Bal and B. Ravindran (2012). "Chitohexaose activates macrophages by alternate pathway through TLR4 and blocks endotoxemia." PLoS Pathog 8(5): e1002717）、ＡＶＲ－４８とＴＬＲ４との結合が、副経路の活性化を介して炎症性マクロファージＭ１を上回って常在／抗炎症性マクロファージＭ２を増強する結果として、ＡＶＲ－４８がフィードバック調節因子として作用し得ると仮説を立てた。さらに、ＡＶＲ－４８がＴＲＩＦ経路を通して作用しＩＬ－１０の産生を開始するフィードバック調節因子として作用し得ると仮説が立てられた。次に、このＩＬ－１０産生はＴＬＲ４を抑制し、ＭｙＤ８８依存性の炎症誘発性サイトカインの産生を下方調節する（図１５）。

【0067】

ＰＨは多くの場合ＢＰＤに関連し、この状態は実験的ＢＰＤのマウスモデルにおいても観察された。ＢＰＤにおいて、ＢＰＤ－ＰＨについての古典的なマーカーとして考えられるＶｅｇｆ（Abman, S. H. (2010). "Impaired vascular endothelial growth factor signaling in the pathogenesis of neonatal pulmonary vascular disease." Adv Exp Med Biol 661: 323-335）は低減し、一方ｅＮＯＳは増加した。この試験では、本発明者らはリンパ管新生成長因子であるＶｅｇｆ－ＤがＢＰＤにおいて増加することを初めて報告する。ｅＮＯＳ及びＶｅｇｆ－Ｄの両方は、ＡＶＲ－４８での処置後に実質的に低減する。

【0068】

ＢｍｐＲIIの変異は遺伝性の肺動脈高血圧（ＰＡＨ）に関連し、成人ＰＡＨにおいてＢｍｐＲIIが低減したことを示す複数の報告が存在する。しかし、新生児過酸素症及びＢＰＤ－ＰＨにおけるＢｍｐＲIIの役割は、あまり注目を受けてこなかった。Alejandre-Alcazar et alは、Ｐ１０又はＰ１４に仔マウスにおいて高酸素曝露（８５％のＯ_２を１４又は２１日間）後にＢｍｐＲIIが有意に低減することを示し（Alejandre-Alcazar, M. A., G. Kwapiszewska, I. Reiss, O. V. Amarie, L. M. Marsh, J. Sevilla-Perez, M. Wygrecka, B. Eul, S. Kobrich, M. Hesse, R. T. Schermuly, W. Seeger, O. Eickelberg and R. E. Morty (2007). "Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292(2): L537-549）、Chen et alは、仔ラット（Ｐ１０）において１０日間の高酸素（１００％のＯ_２）曝露の後にＢｍｐＲIIが有意に増加することを示す（Chen, X., M. Orriols, F. J. Walther, E. H. Laghmani, A. M. Hoogeboom, A. C. B. Hogen-Esch, P. S. Hiemstra, G. Folkerts, M. T. H. Goumans, P. Ten Dijke, N. W. Morrell and G. T. M. Wagenaar (2017). "Bone Morphogenetic Protein 9 Protects against Neonatal Hyperoxia-Induced Impairment of Alveolarization and Pulmonary Inflammation." Front Physiol 8: 486）。興味深いことに、Ｙｅｅらは、成体マウスにおいて、これらのマウスが新生児段階において高酸素に曝露したときにＢｍｐＲIIが低減することを報告したが、彼らは新生児段階における高酸素曝露後のＢｍｐＲIIの発現に関するデータは有していない（Yee, M., R. J. White, H. A. Awad, W. A. Bates, S. A. McGrath-Morrow and M. A. O'Reilly (2011). "Neonatal hyperoxia causes pulmonary vascular disease and shortens life span in aging mice." Am J Pathol 178(6): 2601-2610）。興味深いことに、彼らの手中ではＢｍｐＲIIの抗体がそのタンパク質レベルを評価するようには機能しなかったため、３つのグループはすべて、ＢｍｐＲIIのｍＲＮＡ発現のみを報告している。対照的に、本発明者らは、高酸素曝露の後にＢｍｐＲIIのタンパク質発現が増加し、その後ＡＶＲ－４８での処置の後に下方調節されることを示した。ここで特筆すべきは、多くの場合ｍＲＮＡレベルはタンパク質レベルと相関しないということである。したがって、高酸素誘発性ＢＰＤ－ＰＨにおけるＢｍｐＲIIの役割は、新生児の状況においてより入念に評価する必要がある。

【0069】

この試験の結果に基づき、ＡＶＲ－４８（化合物８）は、現在までのところ予防又は治癒法のないＢＰＤ及びＢＰＤ－ＰＨのような希少疾患のための予防的治療として使用することができる。

【0070】

動物Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをThe Jackson Laboratory社（Bar Harbor社、ME、USA）から購入し、Drexel University、Philadelphia、PA、USAにて繁殖コロニー中に維持した。動物手順をNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行い、Drexel University Philadelphia, PAのInstitutional Animal Care and Use Committee（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた（プロトコル番号第２０７０６）。雌の妊娠したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット（Charles River Laboratories社, St-Constant、QC, Canada）から生まれた新生児仔ラットを、毒性及びＰＫ試験に使用して安全性を評価し、ＡＶＲ－４８の最大耐用量（ＭＴＤ）及びＰＫプロファイルを決定した。ラットを実験室の環境に慣らすため、動物の受け取りと処置の開始との間に最短６日の順応期間が許可された。すべてのラット試験は、ITR Laboratories社, CanadaのＩＡＣＵＣにより承認を受けた（プロトコル番号第７４６９１）。

【0071】

化学物質及び試薬化合物。ＡＶＲ－４８及びＰＬＧＡカプセル化ＡＶＲ－４８の合成及び構造の特徴付けを、AyuVis Research Inc.社の実験室において、彼らの社内の手順に従って行った（国際公開第２０２００１００９０号パンフレット）。ＡＶＲ－４８ナノ粒子懸濁物の合成、特徴付け及び薬物放出は、補遺の項において提供する。エンドトキシンを有しないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、Sigma-Aldrich Inc.社、St. Louis、MO、USAから購入した。

【0072】

有効性及び毒物動態学試験のためのＡＶＲ－４８の製剤。マウスの用量反応有効性試験のために、ＡＶＲ－４８を０．９％の滅菌した正常な生理食塩水中で再構成して、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度を無色透明な溶液として得て、Ｐ２及びＰ４にＩＰ（３０μｌ）注射した。ＰＬＧＡカプセル化ＡＶＲ－４８又はＧＦＰタグ付きアナログを脱イオン化滅菌水中に再懸濁して、０．０２５、０．０５及び０．１１ｍｇ／ｋｇ／滴の最終用量濃度を有するナノ懸濁物を作製した。市販のサーファクタントであるCurosurf（登録商標）（Cheisi Parma社、Italy）を、Ｐ２及びＰ４に、鼻孔あたり３μｌの容量でＩＮ送達した。仔ラットにおけるＡＶＲ－４８の毒物動態学試験のために、１０％のＤＭＳＯ、２０％のテトラグリコール、２０％のＰＥＧ４００及び５０％の滅菌水の製剤を、投与前に新しく作製した（Shah, D., P. Das, S. Acharya, B. Agarwal, D. J. Christensen, S. M. Robertson and V. Bhandari (2021). "Small Immunomodulatory Molecules as Potential Therapeutics in Experimental Murine Models of Acute Lung Injury (ALI)/Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)." Int J Mol Sci 22(5)）。

【実施例2】

【0073】

高酸素処置。高酸素実験のために、新生児仔をそれらの母親とともに、本発明者らにより前に説明されたように（Syed, M., P. Das, A. Pawar, Z. H. Aghai, A. Kaskinen, Z. W. Zhuang, N. Ambalavanan, G. Pryhuber, S. Andersson and V. Bhandari (2017). "Hyperoxia causes miR-34a-mediated injury via angiopoietin-1 in neonatal lungs." Nat Commun 8(1): 1173、Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014、Das, P., S. Acharya, D. Shah, B. Agarwal, V. Prahaladan and V. Bhandari (2020). "Chitin Analog AVR-25 Prevents Experimental Bronchopulmonary Dysplasia." J Pediatr Intensive Care 9(3): 225-232）（関連した部分が本明細書に組み込まれる）、気密のPlexiglas室（OxyCycler；Biospherix社, Redfield, NY, USA）中のケージ内で１００％の高酸素（Ｐ０）に４日連続で（Ｐ４まで）曝露し、Ｐ５にＲＡへと再び移してＰ１４まで回復させて、ヒトＢＰＤ状態を模倣した。さらなる実験分析のために、すべての仔をＰ１４に屠殺した。高酸素曝露されていない仔を、対応するＲＡ（酸素正常状態）対照として扱った。

【実施例3】

【0074】

早産の子ヒツジＢＰＤモデルにおいて、ＡＶＲ－４８処置は呼吸器の重症度を低減し、肺機能を改善する。

【0075】

次に本発明者らは、早産（ＰＴ）ヒト乳児を模倣したより高等な動物モデルにおいて肺、脳及び血漿への薬物曝露を試験し、ＩＶ投薬を介してＢＰＤを予防するための本明細書において教示される化合物の有効性を実証した。Dr. Albertine（University of Utah）により開発された独自のＰＴ子ヒツジモデルを、肺が子宮外の生活を支援するのに十分に成長する前の早産に関連した呼吸器不全を有する、ＰＴヒト乳児の臨床状況を模倣するために使用した。ＰＴ子ヒツジモデル及びＰＴヒト乳児は両方とも、ＰＴ誕生の状況を有し、サーファクタント不足を含む肺の構造及び機能の未熟性に関連する呼吸器不全のための酸素に富むガスを用いた長期の換気支援を有する、生物全体を生理学的に表すものである。酸素に富むガスを用いた換気支援は、数日、数週間、数カ月であり、脳、肝臓、遠位回腸及び腎臓傷害の併存症並びに不十分な栄養及び不良な出生後の成長と関連している。このＢＰＤのためのＰＴ子ヒツジモデルは、ＢＰＤの発生（Joss-Moore, L. A., D. B. Metcalfe, K. H. Albertine, R. A. McKnight and R. H. Lane (2010). "Epigenetics and fetal adaptation to perinatal events: diversity through fidelity." J Anim Sci 88(13 Suppl): E216-222（Joss-Moore, L. A., D. B. Metcalfe, K. H. Albertine, R. A. McKnight and R. H. Lane (2010). "Epigenetics and fetal adaptation to perinatal events: diversity through fidelity." J Anim Sci 88(13 Suppl): E216-222））、多臓器機能不全の発症（Albertine, K. H. (2012). "Brain injury in chronically ventilated preterm neonates: collateral damage related to ventilation strategy." Clin Perinatol 39(3): 727-740（Albertine, K. H. (2012). "Brain injury in chronically ventilated preterm neonates: collateral damage related to ventilation strategy." Clin Perinatol 39(3): 727-740）、Abdullah, O. M., T. Seidel, M. Dahl, A. D. Gomez, G. Yiep, J. Cortino, F. B. Sachse, K. H. Albertine and E. W. Hsu (2016). "Diffusion tensor imaging and histology of developing hearts." NMR Biomed 29(10): 1338-1349（Abdullah, O. M., T. Seidel, M. Dahl, A. D. Gomez, G. Yiep, J. Cortino, F. B. Sachse, K. H. Albertine and E. W. Hsu (2016). "Diffusion tensor imaging and histology of developing hearts." NMR Biomed 29(10): 1338-1349））及び長期の構造及び機能の障害（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833））の間の機構的な洞察を提供し続けている。

【0076】

用量範囲設定試験（dose range-finding study）を、２匹のＰＴ子ヒツジを、６～７日の人工呼吸、続けて３日非侵襲的な呼吸支援（ＮＩＳ）への移行、合計１０日でのこれらのＰＴ子ヒツジの管理の間に、媒体対照又は低、中及び高用量のＡＶＲ－４８（化合物８）のいずれかでの１日２回の静脈内点滴により処置する目的で行った。化合物８は、化合物８の効果の短期の持続性を評価するために、非侵襲的な呼吸支援の期間中は投与されなかった。化合物８についてのＰＫ及びＰＤパラメーターも決定した。

【0077】

詳細な方法は、関連する部分が参照により本明細書に組み込まれるReyburn et al及びNull et al（Reyburn, B., M. Li, D. B. Metcalfe, N. J. Kroll, J. Alvord, A. Wint, M. J. Dahl, J. Sun, L. Dong, Z. M. Wang, C. Callaway, R. A. McKnight, L. Moyer-Mileur, B. A. Yoder, D. M. Null, R. H. Lane and K. H. Albertine (2008). "Nasal ventilation alters mesenchymal cell turnover and improves alveolarization in preterm lambs." Am J Respir Crit Care Med 178(4): 407-418（Reyburn, B., M. Li, D. B. Metcalfe, N. J. Kroll, J. Alvord, A. Wint, M. J. Dahl, J. Sun, L. Dong, Z. M. Wang, C. Callaway, R. A. McKnight, L. Moyer-Mileur, B. A. Yoder, D. M. Null, R. H. Lane and K. H. Albertine (2008). "Nasal ventilation alters mesenchymal cell turnover and improves alveolarization in preterm lambs." Am J Respir Crit Care Med 178(4): 407-418）、Null, D. M., J. Alvord, W. Leavitt, A. Wint, M. J. Dahl, A. P. Presson, R. H. Lane, R. J. DiGeronimo, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2014). "High-frequency nasal ventilation for 21 d maintains gas exchange with lower respiratory pressures and promotes alveolarization in preterm lambs." Pediatr Res 75(4): 507-516（Null, D. M., J. Alvord, W. Leavitt, A. Wint, M. J. Dahl, A. P. Presson, R. H. Lane, R. J. DiGeronimo, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2014). "High-frequency nasal ventilation for 21 d maintains gas exchange with lower respiratory pressures and promotes alveolarization in preterm lambs." Pediatr Res 75(4): 507-516））により前に公開されている。すべてのプロトコルは動物研究についてのＡＰＳ／ＮＩＨガイドラインを遵守し、University of UtahのInstitution Animal Care and Use Committees（ＩＡＣＵＣ）により承認を受けた。機械的人工呼吸（ＭＶ）を受けているＰＴ子ヒツジを含むＰＴ新生児における肺傷害は、肺胞の単純化の古典的な像である。肺胞の単純化は、二次隔壁減少及び細胞間葉肥厚を有する、終末呼吸単位の膨張として明白である。この病理学は、高頻度鼻孔換気（ＨＦＮＶ，high-frequency nasal ventilation）のような非侵襲的支援が使用される時は発生しない（Reyburn, B., M. Li, D. B. Metcalfe, N. J. Kroll, J. Alvord, A. Wint, M. J. Dahl, J. Sun, L. Dong, Z. M. Wang, C. Callaway, R. A. McKnight, L. Moyer-Mileur, B. A. Yoder, D. M. Null, R. H. Lane and K. H. Albertine (2008). "Nasal ventilation alters mesenchymal cell turnover and improves alveolarization in preterm lambs." Am J Respir Crit Care Med 178(4): 407-418（Reyburn, B., M. Li, D. B. Metcalfe, N. J. Kroll, J. Alvord, A. Wint, M. J. Dahl, J. Sun, L. Dong, Z. M. Wang, C. Callaway, R. A. McKnight, L. Moyer-Mileur, B. A. Yoder, D. M. Null, R. H. Lane and K. H. Albertine (2008). "Nasal ventilation alters mesenchymal cell turnover and improves alveolarization in preterm lambs." Am J Respir Crit Care Med 178(4): 407-418）、Null, D. M., J. Alvord, W. Leavitt, A. Wint, M. J. Dahl, A. P. Presson, R. H. Lane, R. J. DiGeronimo, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2014). "High-frequency nasal ventilation for 21 d maintains gas exchange with lower respiratory pressures and promotes alveolarization in preterm lambs." Pediatr Res 75(4): 507-516（Null, D. M., J. Alvord, W. Leavitt, A. Wint, M. J. Dahl, A. P. Presson, R. H. Lane, R. J. DiGeronimo, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2014). "High-frequency nasal ventilation for 21 d maintains gas exchange with lower respiratory pressures and promotes alveolarization in preterm lambs." Pediatr Res 75(4): 507-516））。本発明者らは３日の人工呼吸を使用したが、これは３日が、病態生理学的に上方調節されるか（例えばエラスチン、炎症性サイトカイン）又は下方調節されるか（例えば血管内皮細胞増殖因子又はＶＥＧＦ及びその機能的受容体、界面活性アポタンパク質、インスリン様成長因子１）のいずれかでの肺胞形成に関与する遺伝子発現の変化を見出すのに必要とされる最短日数（７２時間）であるためである（Pierce, R. A., K. H. Albertine, B. C. Starcher, J. F. Bohnsack, D. P. Carlton and R. D. Bland (1997). "Chronic lung injury in preterm lambs: disordered pulmonary elastin deposition." Am J Physiol 272(3 Pt 1): L452-460（Pierce, R. A., K. H. Albertine, B. C. Starcher, J. F. Bohnsack, D. P. Carlton and R. D. Bland (1997). "Chronic lung injury in preterm lambs: disordered pulmonary elastin deposition." Am J Physiol 272(3 Pt 1): L452-460）、Albertine, K. H., G. P. Jones, B. C. Starcher, J. F. Bohnsack, P. L. Davis, S. C. Cho, D. P. Carlton and R. D. Bland (1999). "Chronic lung injury in preterm lambs. Disordered respiratory tract development." Am J Respir Crit Care Med 159(3): 945-958（Albertine, K. H., G. P. Jones, B. C. Starcher, J. F. Bohnsack, P. L. Davis, S. C. Cho, D. P. Carlton and R. D. Bland (1999). "Chronic lung injury in preterm lambs. Disordered respiratory tract development." Am J Respir Crit Care Med 159(3): 945-958）、Albertine, K. H., M. J. Dahl, L. W. Gonzales, Z. M. Wang, D. Metcalfe, D. M. Hyde, C. G. Plopper, B. C. Starcher, D. P. Carlton and R. D. Bland (2010). "Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 299(1): L59-72（Albertine, K. H., M. J. Dahl, L. W. Gonzales, Z. M. Wang, D. Metcalfe, D. M. Hyde, C. G. Plopper, B. C. Starcher, D. P. Carlton and R. D. Bland (2010). "Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 299(1): L59-72））。

【0078】

疾患の一時的な発病を特定するための、呼吸管理のための６ｄ～７ｄの人工呼吸に使用された改変されたＰＴ子ヒツジモデル。侵襲的人工呼吸器を使用した６ｄ～７ｄの呼吸管理期間は、現在のＮＩＣＵにおける臨床結果を模倣する。６ｄ～７ｄ支援されるＰＴ乳児は、抜管することがより困難であり（抜管することができない）、又は再挿管が控えられる（抜管失敗）。目的は、耐容量、ＰＫパラメーターを見出し、予備的な有効性を特定することであった。

【0079】

このＢＰＤのためのＰＴ子ヒツジモデルは、ＢＰＤの発生（Joss-Moore, L. A., D. B. Metcalfe, K. H. Albertine, R. A. McKnight and R. H. Lane (2010). "Epigenetics and fetal adaptation to perinatal events: diversity through fidelity." J Anim Sci 88(13 Suppl): E216-222（Joss-Moore, L. A., D. B. Metcalfe, K. H. Albertine, R. A. McKnight and R. H. Lane (2010). "Epigenetics and fetal adaptation to perinatal events: diversity through fidelity." J Anim Sci 88(13 Suppl): E216-222））、多臓器機能不全の発症（Albertine, K. H. (2012). "Brain injury in chronically ventilated preterm neonates: collateral damage related to ventilation strategy." Clin Perinatol 39(3): 727-740（Albertine, K. H. (2012). "Brain injury in chronically ventilated preterm neonates: collateral damage related to ventilation strategy." Clin Perinatol 39(3): 727-740）、Abdullah, O. M., T. Seidel, M. Dahl, A. D. Gomez, G. Yiep, J. Cortino, F. B. Sachse, K. H. Albertine and E. W. Hsu (2016). "Diffusion tensor imaging and histology of developing hearts." NMR Biomed 29(10): 1338-1349（Abdullah, O. M., T. Seidel, M. Dahl, A. D. Gomez, G. Yiep, J. Cortino, F. B. Sachse, K. H. Albertine and E. W. Hsu (2016). "Diffusion tensor imaging and histology of developing hearts." NMR Biomed 29(10): 1338-1349））及び長期の構造及び機能の障害（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833））の間の機構的な洞察を提供し続けている。臨床において重度ＢＰＤ及び死亡を予測することができる呼吸重症度スコア（ＲＳＳ）（Jung, Y. H., J. Jang, H.-S. Kim, S. H. Shin, C. W. Choi, E.-K. Kim and B. I. Kim (2019). "Respiratory severity score as a predictive factor for severe bronchopulmonary dysplasia or death in extremely preterm infants." BMC Pediatrics 19(1): 121）は、最も高い有効な用量である３．０ｍｇ／ｋｇで劇的に改善する（図９Ａ）。ＰＴの赤子における出生後１４日での３．０以上のＲＳＳ、及び出生後２１日での３．６以上のＲＳＳは、重度ＢＰＤ又は死亡を予測するための信頼のおける値である。

【0080】

合計９匹の子ヒツジをこの試験のために使用した。１用量のCurosurfを、出生直後のＰＴ子ヒツジに気管内投与した。無作為化された用量の化合物ＡＶＲ－４８（８）（０、０．１、０．３、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ）を、出産６時間後にｎ＝２～４の子ヒツジにゆっくりとした静脈内注射により投与される初回量の後、１２時間毎に静脈内投与した。出産６時間後に開始される処置は、新生児科医が乳児に可能であれば人工呼吸なしに呼吸させようと試み、次に必要に応じて侵襲性の呼吸支援を開始するヒトの例を表すように選択される。出産時（「投与前」）、投与直後（ＩＡＤ）、初回量の１５、３０、４５及び６０分、並びに２、４、８、１２、２４、４８、７２及び９６時間後に、全血をＰＴ子ヒツジから採取した。血漿抽出及び化合物ＡＶＲ－４８（８）の生物分析を、我々が既に開発した適格な生物分析方法を使用して行った。ＰＫパラメーターを、Roberts et alにより前に記載されたように（Roberts, J. K., C. Stockmann, M. J. Dahl, K. H. Albertine, E. Egan, Z. Lin, C. A. Reilly, P. L. Ballard, R. A. Ballard and R. M. Ward (2016). "Pharmacokinetics of Budesonide Administered with Surfactant in Premature Lambs: Implications for Neonatal Clinical Trials." Curr Clin Pharmacol 11(1): 53-61）、非コンパートメント薬物動態学モデリング及び集団薬物動態モデリングの両方の後に計算した。サイトカイン（Visconti, K., P. Senthamaraikannan, M. W. Kemp, M. Saito, B. W. Kramer, J. P. Newnham, A. H. Jobe and S. G. Kallapur (2018). "Extremely preterm fetal sheep lung responses to antenatal steroids and inflammation." Am J Obstet Gynecol 218(3): 349.e341-349.e310）及びＶＥＧＦレベル（Albertine, K. H., M. J. Dahl, L. W. Gonzales, Z. M. Wang, D. Metcalfe, D. M. Hyde, C. G. Plopper, B. C. Starcher, D. P. Carlton and R. D. Bland (2010). "Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 299(1): L59-72（Albertine, K. H., M. J. Dahl, L. W. Gonzales, Z. M. Wang, D. Metcalfe, D. M. Hyde, C. G. Plopper, B. C. Starcher, D. P. Carlton and R. D. Bland (2010). "Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 299(1): L59-72））の分析のために、血液を出生後の最初の９０分について１５分毎に、続けて１２時間について３時間毎に、次に１．５日、２．５日、３．５日、６．５日及び９．５日空けて収集した。血液試料を、血液学及び肝臓酵素についても分析した。６～７日の人工呼吸の後、子ヒツジを人工呼吸から切り替え、３日の非侵襲的な支援へと切り替えて、長期の転帰を確かめた（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833））。最後に、ＰＴ子ヒツジを１０日後に安楽死させ、これらの心臓／肺及び脳を取り除いた。右前葉（これは独自の気管支、肺動脈及び静脈を有する）のエクスビボでのＢＡＬを、類似の分析のために行った。サイトカイン、ＢＡＬタンパク質、ＩＣＡＭ－１及びＶＥＧＦについては、気管吸引液をプロトコルに従って収集した。脾臓を収集して、ＦＡＣＳを使用して免疫細胞集団を分析した。

【0081】

呼吸ガス交換及び心血管生理学。

【0082】

強制オシレーション法（ＦＯＴ）は、気道開口部に圧力刺激を加え、その結果生じる流量を測定することにより、非協力的な対象の呼吸器系（ｒｓ）インピーダンス（Ｚｒｓ）の非侵襲的な測定を可能とする。本発明者らは、ＦＯＴが、出生から生後５カ月までの自然呼吸する正常期産（normal term）の子ヒツジにおける、呼吸器系機構についての信頼のおける非侵襲的な測定を提供することを示した（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833（Dahl, M. J., S. Bowen, T. Aoki, A. Rebentisch, E. Dawson, L. Pettet, H. Emerson, B. Yu, Z. Wang, H. Yang, C. Zhang, A. P. Presson, L. Joss-Moore, D. M. Null, B. A. Yoder and K. H. Albertine (2018). "Former-preterm lambs have persistent alveolar simplification at 2 and 5 months corrected postnatal age." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 315(5): L816-l833））。この試験において定義される方法及び正常な基準値は、早産の病態生理学的結果を決定するための正常な生理学的状況を提供する。

【0083】

本発明者らは、動脈カテーテル留置により心血管機能を測定して、酸素負荷、換気及び腎臓機能と同時に平均血圧及び収縮期／拡張期圧を測定した。

【0084】

気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）分析。仔をＰＮ１４に屠殺し、ＰＢＳを気管内に２５ｃｍ Ｈ_２Ｏの圧力で１５分滴下注入することにより、気管を小口径の針でカニューレ処置した。２容量の３００μＬの冷１×ＰＢＳを滴下注入し、穏やかに吸引し、プールした。試料を１０００Ｘ ｇで１０分、４℃で遠心分離にかけた。上清を収集し、Pierce（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Fisher Scientific Co社、Houston、TX）を使用して総タンパク質を定量化した。総細胞数を、TC20細胞計測装置（BioRad社、Hercules、CA）を使用して行った。早産子ヒツジから収集したＢＡＬ液中のタンパク質濃度を分析するために、類似の方法を続けた。

【0085】

組織学、免疫組織化学及び免疫蛍光。ＲＡ対照及びＢＰＤマウスの両方を麻酔し（キシラジン－ケタミンのカクテルの過剰投与を使用する）、肺及び心組織を灌流後に採取し、４％のホルムアルデヒドで終夜固定した。次に、前に記載されたような肺の形態計測又は免疫組織化学／免疫蛍光のために（Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014、Das, P., S. Acharya, D. Shah, B. Agarwal, V. Prahaladan and V. Bhandari (2020). "Chitin Analog AVR-25 Prevents Experimental Bronchopulmonary Dysplasia." J Pediatr Intensive Care 9(3): 225-232、Das, P., T. Curstedt, B. Agarwal, V. M. Prahaladan, J. Ramirez, S. Bhandari, M. A. Syed, F. Salomone, C. Casiraghi, N. Pelizzi and V. Bhandari (2020). "Small Molecule Inhibitor Adjuvant Surfactant Therapy Attenuates Ventilator- and Hyperoxia-Induced Lung Injury in Preterm Rabbits." Front Physiol 11: 266）、固定した組織を新鮮なＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールを使用して脱水し、透徹し、パラフィン中に包埋して薄片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色した。免疫蛍光染色を、肺パラフィン切片上で、以前記載されたプロトコル（Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014）に従ってKi67（Abcam社、１：１０）及びVon Wilebrand因子（ｖＷＦ－DAKO社、１：１００）について行い、TUNEL染色を製造元の使用説明書（Roche社）に従って行った。

【0086】

形態計測及び定量化。肺中のコード長、中隔厚及び肺胞分岐数、ＲＶ、ＬＶ及びＩＶＳ厚を試験するため、５μｍ厚の肺左葉及び心臓のパラフィン包埋切片をH&Eで染色した。各切片からの複数の無作為に選択された領域（少なくとも１０の領域）を、１００×の合計倍率を使用して写真撮影した。太い気道又は血管を有する肺からの切片を肺形態計測から除外し、ＰＨ誘発性ＲＶ肥大比（ＲＶ／ＬＶ及びＲＶ／ＬＶ＋ＩＶＳ）の定量測定を、前に記載した方法を使用して行った（Sun, H., R. Choo-Wing, A. Sureshbabu, J. Fan, L. Leng, S. Yu, D. Jiang, P. Noble, R. J. Homer, R. Bucala and V. Bhandari (2013). "A critical regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in hyperoxia-induced injury in the developing murine lung." PLoS One 8(4): e60560）。肺形態計測パラメーターを、ImageJ（ＮＩＨのフリーソフトウェア）又はCellSens software（バージョン７、Olympus社）のいずれかを使用して、記載されたように測定した（Bhandari, V., R. Choo-Wing, C. G. Lee, K. Yusuf, J. H. Nedrelow, N. Ambalavanan, H. Malkus, R. J. Homer and J. A. Elias (2008). "Developmental regulation of NO-mediated VEGF-induced effects in the lung." Am J Respir Cell Mol Biol 39(4): 420-430、Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014、Das, P., S. Acharya, D. Shah, B. Agarwal, V. Prahaladan and V. Bhandari (2020). "Chitin Analog AVR-25 Prevents Experimental Bronchopulmonary Dysplasia." J Pediatr Intensive Care 9(3): 225-232、Das, P., T. Curstedt, B. Agarwal, V. M. Prahaladan, J. Ramirez, S. Bhandari, M. A. Syed, F. Salomone, C. Casiraghi, N. Pelizzi and V. Bhandari (2020). "Small Molecule Inhibitor Adjuvant Surfactant Therapy Attenuates Ventilator- and Hyperoxia-Induced Lung Injury in Preterm Rabbits." Front Physiol 11: 266）。

【0087】

細胞増殖及び細胞死の定量化のために、全肺切片を３つの領域に分け、Ki67＋ｖｅ及びTUNEL＋ｖｅの細胞核の総数を手作業で数え、これを核の総数で正規化し、陽性細胞のパーセンテージを得た。ｖＷＦ定量化のために、１つの肺切片中、高倍率視野領域あたりの閉じた血管の総数を数えた。最低３領域を選択し、３～７匹の動物を染色及び計数に使用した。

【0088】

ウェスタンブロット分析。ＴＬＲ４（Cell Signaling Technology社、Danvers, MA；１：１０００）、Ａｎｇ２（１：５００；Sigma社、St. Louis, MO）、ＴＧＦβ、ＮＦｋＢ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、Ｖｅｇｆ、ｅＮｏｓ、Ｖｅｇｆ－Ｄ、ＢｍｐＲII、ビンキュリン（１：５００；SantaCruz社, Dallas, TX）についてのウェスタンブロット分析を、前に記載されたように（Leary, S., P. Das, D. Ponnalagu, H. Singh and V. Bhandari (2019). "Genetic Strain and Sex Differences in a Hyperoxia-Induced Mouse Model of Varying Severity of Bronchopulmonary Dysplasia." Am J Pathol 189(5): 999-1014）、３０μｇの肺タンパク質をローディングし、続けて上記の抗体で免疫ブロットし、Odyssey赤外線撮像システム（LI-COR Biosciences社, Lincoln, NE）で可視化することにより行った。ローディング対照のハウスキーピングタンパク質であるビンキュリンでの正規化の後、ImageJを使用して濃度測定での定量化を行った。

【0089】

マルチプレックスＥＬＩＳＡ。対照及びＡＶＲ－４８処置群からの肺ライセート及び血漿を、Meso Scale Discoveryマルチスポットアッセイシステム（MSD社, Rockville, MD）の４つの別々の炎症パネル上で行うマルチプレックスＥＬＩＳＡに使用して、２種のケモカイン（ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１）及び８種のサイトカイン、ＩＬ－２１、ＩＰ－１０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０及びＩＬ－６を、製造元の使用説明書に従って検出した。簡潔には、試料を、ＭＳＤキットに付属の希釈緩衝液を用いて２５μｌの総容量で１：１に希釈して、上記の標識抗体とともに２時間室温でインキュベートし、続けてＰＢＳＴで洗浄した。ＭＳＤ専用のルミノメーターを使用して吸光度を検出した。

【0090】

画像化。すべての画像を、ＤＰ７３カメラアタッチメントを備えたOlympus IX70で撮った。少なくとも５～７枚の画像（必要に応じて×１０又は×２０又は×４０の倍率）を定量化のために入手した。CellSensソフトウェアバージョン７を画像の撮影に使用し、最良の画像を入手するために、Adobe Photoshop 13（Adobe Inc.社, San Jose, CA）でさらに修正した。

【0091】

統計分析。すべての統計分析を、Graph Pad Prismバージョン７．０（GraphPad Software社, San Diego, CA）を使用して行った。データを、各群中ｎ＝５～７匹のマウスでの平均±ＳＥＭで表す。群を、必要に応じて対応のない両側ｔ検定及び一元配置分散分析又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。Ｐ≦０．０５は統計学的に有意であると考えられた。毒性及びＰＫ試験のために、汎用の分散分析／共分散分析（ＡＮＯＶＡ／ＡＮＣＯＶＡ）検定を、試験の数値データ（３又は４匹以上の動物／群）に対して以下のように行った。自動変換を使用して、Ｌｅｖｅｎｅの検定を使用した等分散性についてのデータを分析した。パラメトリック傾向及びノンパラメトリック傾向を、それぞれＷｉｌｌｉａｍｓ検定及びＳｈｉｒｌｅｙ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ検定を用いて分析した。ＡＮＯＶＡ／ＡＮＣＯＶＡを使用して同種データを分析し、Ｄｕｎｎｅｔｔの検定を使用して、対照と被験品目処置群との間の群間の差の有意性を分析した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して異種データを分析し、ノンパラメトリックなＤｕｎｎｅｔｔの検定を使用して、対照と被験品目処置群との間の群間の差の有意性を評価した。すべてのデータを±ＳＥＭとして報告する。この試験において報告されたすべての実験について、９５％信頼区間でのｐ＜０．０５の有意水準を統計学的に有意と考えた。

【0092】

図１６は、早産の子ヒツジＢＰＤモデルの呼吸重症度スコアを示す。ＧＡ１２８日に出産された早産の子ヒツジ（ｎ＝２～４）に、ステロイドを出生前に、及びサーファクタント（Curosurf、１用量）を出産直後に投与した。子ヒツジは、侵襲的人工呼吸器（ＩＭＶ）を７日間、続けて非侵襲的呼吸器を３日間つけた。生理食塩水又はＡＶＲ－４８（０．１、０．３、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ）を、出産６時間後のＩＶ投薬（２／日、７日間）のために生理食塩水中で製剤化した。ＡＶＲ－４８（１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ）での処置後、プラセボ処置対照ＰＴ子ヒツジに対して呼吸重症度スコア（ＲＳＳ）が有意に改善した（Ｎ＝７、１匹は現在の試験から、６匹は以前の試験からのものである）。ＲＳＳは、式：ＲＳＳ＝平均気道圧（ＭＡＰ）×吸入酸素分画（ＦｉＯ_２）を使用して計算した。ＡＶＲ－４８（３．０ｍｇ．ｋｇ、ｎ＝４）は最も低いＲＳＳ（２．４）を示した。

【0093】

図１７Ａ～１７Ｃは、早産の子ヒツジＢＰＤモデルにおける呼吸器系機構を示す。抵抗（Ｒｘ）及びリアクタンス（Ｘｒ）は、生後１０日目（生後最終日；生後２４０時間）の早産の子ヒツジについて、気道開口部に圧力刺激を加え、その結果生じる流量を測定することにより非協力的な対象の呼吸器系機構の測定を可能とする強制オシレーション法（ＦＯＴ）により測定される。３．０ｍｇ／Ｋｇ（Ｎ＝４）でのＡＶＲ－４８は、プラセボに対してより低い抵抗をもたらす（Ｒ７ｈｚ ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ、呼吸器系）。３ｍｇ／ＫｇでのＡＶＲ－４８も、より低い小気道抵抗（Ｒ７－２０ｈｚ－ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ）及びより低いリアクタンス（Ｘ７ｈｚ－ｃｍＨ_２Ｏ^＊ｓ／Ｌ）をもたらした。

【0094】

図１８Ａ～１８Ｅは、早産の子ヒツジＢＰＤモデルにおける病理組織学を示す。顕微鏡写真は、同じ倍率での肺の終末呼吸単位（ＴＲＵ）を示す。７日の人工呼吸（ＭＶ）は、媒体処置したＰＴ子ヒツジ（図１８Ｄ）では肺胞の単純化（気腔の膨張、二次隔壁減少及び間葉肥厚）をもたらしたが、これはＡＶＲ－４８子ヒツジ肺では有意に改善した（図１８Ｃ）。肺胞分岐数は、呼吸細気管支の中心から終末呼吸単位の周囲までの、終末呼吸単位にわたる組織の交点の数である。ヒツジは、ヒトのように終末呼吸単位を有し（ヒト肺は約１５０，０００の終末呼吸単位を有する）、この単位にわたり酸素と二酸化炭素の拡散が測定される（動脈血ガス）ため、これらの単位は生理学者によれば「肺胞」である。予備的な結果により、３．０ｍｇ／ＫｇでのＡＶＲ－４８が肺胞形成を促進することが示唆される（図１８Ｅ）。Ｎ＝３。

【0095】

図１９は、ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中の総タンパク質濃度を低減することを示す。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。

【0096】

図２０は、ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中のＶＥＧＦ濃度を低用量で増加し、高用量（３．０ｍｇ／ｋｇ）は効果を有しないことを示す。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。

【0097】

図２１は、ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、ＢＡＬ液中のＩＣＡＭ－１濃度を増加することを示す。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。ＡＶＲ－４８で処置された子ヒツジにおいて、肺組織病理学及び肺胞分岐数から観察して、総タンパク質の低減はより少ない肺漏出及び浮腫を示し、ＢＡＬ液中のＶＥＧＦ及びＩＣＡＭ－１の増加は肺の肺胞化の増加と相関した（図１８Ｅ）。

【0098】

図２２は、ＡＶＲ－４８での処置が、１０日後、媒体処置された子ヒツジと比較して、血漿中のＩＬ－６濃度を有意に低減することを示す。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。Ｎ＝３～４。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ。

【0099】

図２３は、子ヒツジ血漿中のＩＬ－１０に対するＡＶＲ－４８処置の効果を示す。ＩＬ－１０は媒体処置された子ヒツジ血漿において時間依存的に低減したが、ＡＶＲ－４８での処置（２／日で７日間、最初の用量を６＋時間で開始）は、異なる時点で、媒体処置された子ヒツジと比較して、過剰炎症を阻害するのに必要とされる早期の時点（１～４日）で血漿中のＩＬ－１０濃度を有意に低減した。すべての早産の子ヒツジは、７日間侵襲的人工呼吸器（挿管）下にあり、続けて３日間Ｏ_２マスク下にあった。Ｎ＝３～４。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。二元配置ＡＮＯＶＡ。

【実施例4】

【0100】

ビオチン化ＡＶＲ－４８の合成（スキーム－１）
実験手順：ＡＶＲ－４８のビオチンアナログ：無水ＣＨ_２Ｃｌ_２トリエチルアミン（１．５当量）中のＡＶＲ－４８（２．０ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を添加し、続けてＭｓＣｌ（１．０当量）を滴下添加し、終夜撹拌し、ＴＬＣにより反応の完了を報告し、カラム精製の後に中間体２を収量８９％で得た。この生成物を、さらにスペクトル分析することなく、次のステップにおいて直接使用した。無水ＤＭＦ中のＯ－メシル誘導体２（１当量）にＮａＮ３（３当量）を添加し、６５℃で６時間加熱して、ＴＬＣにより決定して、中間体３を８２％で十分に純粋な生成物として得て、いかなる精製も行うことなく次に進めた。２３℃で終夜撹拌することによる、ＴＰＰ、Ｈ_２Ｏを使用する標準的なアジドからアミンへの還元手順を使用することにより、アジド中間体３を中間体アミン４に変換した。次に、この中間体生成物４を、１．５当量のＥＤＣＩ、ＤＩＰＥＡ及び触媒量のＨＯＢｔを使用して市販のＮＨ－スクシンイミド－ビオチンとカップリングし、カラム精製の後に収率９１％のＡＶＲ－４８ビオチンアナログ（ＢＴ－ＡＶＲ－４８）を得た。ＢＴ－ＡＶＲ－４８の構造を、^１ＨＮＭＲ及びＭＳの両方により確認した。

【0101】

ＢＴ－ＡＶＲ－４８の^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６）：δ １．２５（ｍ， ２Ｈ）， １．５５－１．５８（ｍ， ４Ｈ）， １．８８（ｓ， ３Ｈ）， ２．１３（ｔ， ２Ｈ）， ２．４２－２．５９（ｄｄ， ２Ｈ）， ２．７３－２．８４（ｄｄ， １Ｈ）， ３．１２－３．１８（ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．２５（ｍ， １Ｈ）， ３．７２－３．７８（ｍ， １Ｈ）， ４．１４（ｍ， １Ｈ）， ４．２８（ｍ， １Ｈ）， ５．１５（ｄ， １Ｈ）， ６．３８－６．４３（ｄ， １Ｈ）， ７．１３－７．１６（ｄ， ２Ｈ）， ７．９１－７．９９（ｍ， ２Ｈ）， ８．１６－８．１９（ｄ， ２Ｈ）。ＬＣ－ＴＯＦ（＋ＥＳＩ）：５６８（Ｍ＋）。

【実施例5】

【0102】

ＡＶＲ－４８はマウス脾臓由来の単球において単球と結合し、これらを用量依存的に非炎症性Ｍ２／常在マクロファージへと極性化する。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｎ＝３～５）の初代脾臓細胞をＡＶＲ４８で７２時間処置した。ＰＭＡ（２００ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。細胞を洗浄し、ＣＤ１１ｂ及びＭＨＣ－IIについて染色し、ＦＡＣＳにより分析した。分析中、死細胞をＬｉｖｅ／ｄｅａｄ染色により除外した。脾臓細胞中、ＡＶＲ４８刺激の際に、ＭＨＣ－II及びＣＤ１１ｂの発現レベルが用量依存的に増加したことが観察された。単球をＬｙ６ｃについてさらに分析した。（Swirski et al, J Clin Invest, 2007, 117(1):195-205. doi:10.1172/JCI29950）により記載されるように、ＬＹ６ｃ ｈｉの脾臓細胞を炎症性と考え、Ｌｙ６ｃ ｌｏｗを常在及び抗炎症性と考えた（図２４Ａ）。次に、ＣＤ１１ｂ ｈｉ及びＣＤ１１ｃ ｌｏｗである生シングレット細胞を、Ｆ４／８０及びＭＨＣ－II発現についてゲーティングした。Ｆ４／８０及びＭＨＣ－IIの発現が増加した細胞をマクロファージと考え、Ｆ４／８０の発現が低い細胞を単球と考えた。

【0103】

ビオチン化コンジュゲートＡＶＲ－４８の脾臓単球／マクロファージへの結合。

【0104】

図２４Ａ～２４Ｃは、４８～７２時間のＡＶＲ－４８（化合物８）での処置が、より多くの常在／抗炎症性マクロファージ（Ｌｙ６ｃ ｈｉ／ｌｏｗ）を産生したことを示す（図２４Ａ、２４Ｂ）。ＦＡＣＳ分析により決定した場合、ビオチンコンジュゲートＡＶＲ－４８（ＢＴ－ＡＶＲ－４８）はマウス脾臓単球（ＬＹ６ｃ＋、ＣＤ１９－、ＣＤ３－）と用量依存的に結合する（図２４Ｃ）。

【0105】

簡潔には、細胞を４℃で１時間インキュベートし、続けて、単球（Ｌｙ６Ｃ）マーカーとともに、ビオチン化ＡＶＲ４８（０．２５μＭ、２．５μＭ、２５μＭ及び２５０μＭ）とインキュベートした。次に、ＦＡＣＳにより、細胞を適切な蛍光結合ストレプトアビジンでプローブした。分析中、死細胞を除外した（図２４Ｃ）。Ｎ＝２～３。

【0106】

脾臓単球／マクロファージ中の、ビオチン化コンジュゲートＡＶＲ－４８のＴＬＲ４及びＣＤ１６３受容体タンパク質への結合

【0107】

図２５Ａ及び２５Ｂは、ＦＡＣＳ分析により決定した場合、ビオチンコンジュゲートＡＶＲ－４８（ＢＴ－ＡＶＲ－４８）での処置が、マウス脾臓由来単球（ＬＹ６ｃ＋、ＣＤ１９－、ＣＤ３－）中のｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びＣＤ１６３スカベンジャー受容体タンパク質の両方と用量依存的に結合することを示す。

【0108】

簡潔には、細胞を４℃で１時間インキュベートし、続けて、ＰＥ抗マウスＣＤ２８４（ＴＬＲ４）抗体（Biolegend社）及びBrilliant Violet 421（商標）抗－マウスＣＤ１６３抗体（Biolegend社）とともにビオチン化ＡＶＲ４８（１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭ）とインキュベートした。次に、ＦＡＣＳにより、細胞を適切な蛍光結合ストレプトアビジンでプローブした。分析中、死細胞を除外した（図２５Ａ及び２５Ｂ）。Ｎ＝３。

【実施例6】

【0109】

ＡＶＲ－４８は、ヒト血液細胞及び全臍帯血中で抗炎症及び免疫調節活性を示す。

【0110】

気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は、未熟な乳児における一般的な慢性の呼吸器疾患である。炎症は、早産の赤子における、ＢＰＤをもたらす肺傷害の要である。ＡＶＲ－４８は、リスクのある早産乳児におけるＢＰＤの予防のための小分子免疫調節剤（１－４）である。ＡＶＲ－４８は、高酸素誘発性マウスモデル及び早産の子ヒツジにおけるＢＰＤ表現型の予防に有効であった。目的は、ヒト肺上皮細胞、臍帯血単核細胞及び全臍帯血を使用して、ＡＶＲ－４８の免疫調節及び抗炎症効果を実証することであった。

【0111】

図２６Ａ～２６Ｃは、ＡＶＲ－４８がＴＨＰ－１ヒト単球細胞中のＴＬＲ４に結合し（図２６Ａ）、ＩＬ－１０産生を増加する（図２６Ｂ）ことを示す。ＥＬＩＳＡにより決定した場合、ＡＶＲ－４８は、２４時間前処理したときにＬＰＳ誘発性ＴＮＦ－α産生を低減する（図２６Ｃ）。

【0112】

図２６Ａ、ＴＬＲ４アッセイ：１×１０^５個のＴＨＰ細胞（ＡＴＣＣ）を２４ウェルプレートに播種し、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ、２００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間刺激した。細胞ライセートを調製し、総タンパク質を定量化し、異なる濃度（４、１６、６２．５及び２５０μＭ）のＡＶＲ－４８で２時間処置した。後でＥＬＩＳＡを行って、製造元の使用説明書（Raybiotech社）に従って非結合のＴＬＲ４を評価した。ＡＶＲ－４８のＴＬＲ４ ＩＣ_５０を、GraphPadPrism７．０４を使用して計算した。

【0113】

図２６は、ヒト末梢血液単球（ｈＰＢＭＣ）の上清中、ＡＶＲ－４８が処置２４時間後に分泌されるＩＬ－１０レベルを用量依存的に増加することを示す。図２１Ｃ、ｈＰＢＭＣへのＡＶＲ－４８の前処置（２４時間）、続けて６時間のＬＰＳ（２５ｎｇ／ｍＬ）での処置は、ｈＰＢＭＣ細胞上清中、分泌されるＴＮＦ－α産生を低減した。Ｎ＝３。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ。

【0114】

図２７は、ＡＶＲ－４８処置後のマクロファージ集団の変化を示す。簡潔には、ｈＰＢＭＣを９６ウェルプレートに播種し、AVR 48で７２時間処置した。細胞を洗浄し、ＣＤ３２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ２０６抗ヒト抗体について染色し、ＦＡＣＳにより分析した。分析中、死細胞をｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色（７ＡＡＤ）により除外した。親細胞の中間マクロファージの％を、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ２０６表面マーカーの両方についてマクロファージ染色陽性として決定する。ＡＶＲ－４８での処置後の、親マクロファージ集団（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）の中間マクロファージ（Ｍｉｎｔ）のパーセンテージを表す棒グラフ。ｎ＝２の技術的反復、及び実験を３回繰り返した。ＡＶＲ－４８は、単球上のｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）及びＣＤ１６３受容体の両方に結合する。ｈＰＢＭＣでは、７２時間のＡＶＲ－４８処置は、中間体マクロファージのパーセンテージを増加し、Ｍ１マクロファージを低減した。

【0115】

図２８Ａ～２８Ｂは、ＡＶＲ－４８単独で処置したヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣ）が、０．１～１０μＭでＩＬ－１０の増加（約２．５倍）を示したことを示す。ＬＰＳ処置は、ＩＬ－１０（約５倍）、ＩＬ－１β（約３０倍）を有意に増加した（図２８Ａ及び図２８Ｂ）。ＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８は、１０μＭで、ＩＬ－１０及びＩＬ－１βの両方を有意に低減した。

【0116】

図２９は、ＣＢＭＣ中のＡＶＲ－４８の免疫刺激作用及びＩＬ－１２ｐ４０サイトカインの増加を示す。ＩＬ－１２ｐ４０は、感染に対する自然免疫応答についてのマーカーであり、ＣＢＭＣ中で下方調節される。ＡＶＲ－４８（１０μＭ）単独又はＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８処置はいずれもＬＰＳのみよりも高いＩＬ－１２ｐ４０応答をもたらし、これは活性な免疫系の促進を示す。しかし、市販のＴＬＲ４アンタゴニストＴＡＫ２４２は、試験されたときにＩＬ－１２ｐ４０レベルのＬＰＳ誘発性の増加の低減を示し、これはＡＶＲ－４８がＴＬＲ４アンタゴニストではなくＴＬＲ４調節因子であり、ＡＶＲ－４８処置が正準のＴＬＲ４アンタゴニストのように免疫抑制的でないことを明白に実証した。

【0117】

図３０Ａ～３０Ｂは、ＡＶＲ－４８単独で処置した全臍帯血（ＷＣＢ）が、１０μＭでＩＬ－１０の増加（約１．５倍）を示したことを示す。ＬＰＳ処置は、ＩＬ－１０を適度に増加した（約２．５倍）。ＬＰＳ＋ＡＶＲ－４８は、１０μＭでＩＬ－１０を有意に増加した（図３０Ａ）。ＴＮＦ－αはＷＣＢ中で既に上方調節され、ここでＡＶＲ－４８での処置は、ＴＮＦ－αレベルを単独で又はＬＰＳとの組合せで有意に低減した（図３０Ｂ）。ＩＬ－１β及びＩＦＮ－γは、ＡＶＲ－４８の単独又はＬＰＳとの組合せのいずれでも検出されなかった。Ｎ＝３、ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。

【実施例7】

【0118】

ＡＶＲ－４８は、ヒト肺上皮細胞中で抗炎症活性を示す。

【0119】

図３１Ａ及び３１Ｂは、ＥＬＩＳＡにより決定した場合、ＡＶＲ－４８が、ＬＰＳと併用処置したときにヒト肺Ｉ型肺胞上皮細胞（ＡＴ１）においてＴＮＦ－α及び一酸化窒素（ＮＯ）産生の両方を低減したことを示す。上皮細胞中、有意なレベルのＩＬ－１０又はＩＬ－βは、単球／マクロファージ細胞において観察されたようには検出されなかった。

【0120】

血液中又は肺中のＡＶＲ－４８の単球／マクロファージの表面受容体への結合は、おそらくサブナノモルのＥＣ_５０での表面受容体ＴＬＲ４を介するものであることが見出された。ＡＶＲ－４８は、ＴＡＫ２４２のような正準のＴＬＲ４阻害剤／アンタゴニストではなく、受容体調節因子である。ＡＶＲ－４８の前処置は、単球を非炎症性／常在マクロファージへと選択的に変換する。ＩＬ－１０は、ヒト末梢及び臍帯血単球へのＡＶＲ－４８処置の後に上昇するようである。ヒトＣＢＭＣ、全臍帯血中、並びに肺上皮細胞中、ＬＰＳによるＴＬＲ４活性化は炎症反応をもたらし、ＡＶＲ－４８はＴＮＦ－αレベルを有意に低減した。ＡＶＲ－４８は、ＢＰＤの予防を含む肺傷害の予防のための潜在的な治療的利益を有する、有望な分子である。

【0121】

図３２は、ＢＴ－ＡＶＲ－４８の合成を示す。図３３は、ＩＶ及び経口投薬によるｐＫ及び製剤の結果を示す。静脈内投与による単回投与後の、生理食塩水溶液として血漿中３．０ｍｇ／ｋｇ／用量（有効用量、ｎ＝３の早産の子ヒツジ）で投与されたＡＶＲ－４８の最大薬物濃度（Ｃ_ｍａｘ）は、薬物濃度の直線的な減少を示し、半減期は０．５６＋１．５時間であり、Ｃ_ｍａｘ＝１２．２±５．６μＭであった。

【0122】

図３４は、早産の子ヒツジへの７日間の反復的なＩＶ投薬後に薬物の蓄積がみられないことを示し、良好なクリアランスを示す。

【0123】

製剤の調製及び経口経路を介するラットへの送達のための方法

【0124】

製剤：

【0125】

【表1】

【0126】

被験品目、安定剤（ＨＰＣ－ＳＳＬ）及びサーファクタント（ＳＤＳ）を正確に秤量し、６ｍＬのイットリウム安定化ジルコニアビーズ（０．８ｍｍ）を仕込んだ１５ｍＬのアンバーガラス瓶に移した。所望の最終濃度を達成するために、懸濁物を、水を用いて最終重量にした。製剤を、少なくとも１分のボルテックスを使用して混合し、次にローラーミル（Unitized Jar Mill、モデル755 RMV、U.S. Stoneware社製（Fisher Scientific社、Canada、カタログ番号０８－３８１－１から購入）を５０ｒｐｍで４８時間使用して均質化した。

【0127】

試験化合物の化学安定性は評価されていないため、ＡＶＲ－４８及びＡＶＲ－８４の含有量アッセイを、ＨＰＬＣによるナノミリングプロセスの終了時に評価した。

【0128】

生じた懸濁物は水と混合したときに透明な溶液を生成し、粒径分析の前に希釈が必要であったため、粒径測定は不可能であった。

【0129】

動物試験については、５０ｍｇ／ｍＬで調製した懸濁物を、表Ｉに示すものと同じ割合の賦形剤を使用して調製したブランクの媒体を使用して、１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＡＶＲ－８４の濃縮懸濁物を希釈することにより澄明な溶液が得られ、ＡＶＲ－４８については、溶液は均一な濁った溶液であった。

【0130】

動物及び投薬：雄のＳＤラット（Ｎ＝３）を、Charles River社から得た。被験品目の投与前に各動物を秤量した。投薬の後、動物を潜在的な臨床徴候について観察した。特定の時点、ｔ＝１５’、３０’、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間（Ｎ＝３）で、血液（１００μＬ）を、MINIVETTE（登録商標）POCT K3-EDTAを使用し、伏在静脈を介して収集した。血液試料を、収集３０分以内に１０分、９６５ｇ及び４℃で遠心分離にかけ、血漿を得た。血漿試料を－８０℃で冷凍保存した。血漿試料を氷上で解凍し、試料の調製の間、氷の上に保持した。３０μＬの血漿試料に、７５μＬの沈殿溶液（ＩＳを含有する８０％のアセトニトリル及び２０％のメタノール）を加えて混合した。試料を混合し、３５００ｒｐｍで１０分、４℃で遠心分離にかけた。４０μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、８０μＬの水＋０．１％のギ酸を添加し、社内で開発したＨＰＬＣ法を使用して分析した。

【0131】

図３５は、ＡＶＲ－４８（化合物８）の経口製剤を調製し、成体ラット（ｎ＝３）に１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与したことを示す。血漿は、前に報告したＩＶプロファイルと一致する薬物濃度の直線的な減少を示し、Ｔ_ｍａｘは０．７±０．３時間、半減期（Ｔ_１／２）は０．６±０．４時間、及びＣ_ｍａｘは３．６４±０．６６μＭであった。

【0132】

図３６は、ＡＶＲ－８４（化合物１７）の経口製剤を調製し、成体ラット（ｎ＝３）に１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与したことを示す。血漿は薬物濃度の直線的な減少を示し、Ｔ_ｍａｘは０．５±０．０時間、半減期（Ｔ_１／２）は１．６６±１．０時間、及びＣ_ｍａｘは４．５６±０．７７μＭであった。

【0133】

本明細書において論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実行することができ、その逆も同様であることが企図されている。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。

【0134】

本明細書において記述されている特定の実施形態は、例示として示され、本発明を限定するものではないことが理解される。本発明の主要な特色は、本発明の範囲から逸脱することなく、多様な実施形態において利用することができる。当業者は、本発明において記述される特定の手順に対する多数の等価物を、認識するか、又は日常的な実験だけを使用して確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内であり、請求項に含まれると考えられる。

【0135】

本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が具体的に及び個別に参照により組み込まれることを示すように、同程度に本明細書に参照により組み込まれる。

【0136】

「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、請求項及び／又は本明細書において「を含む」という用語と合わせて使用されるとき、「１つ」を意味し得るが、「１又は２以上（one or more）」「少なくとも１つ」及び「１又は２以上（one or more than one）」の意味とも一致する。本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指すという定義を支持するが、請求項における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すために明白に示さない限りにおいて、又は代替物が互いに排他的でない限りにおいて、「及び／又は」を意味するのに使用される。本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、装置についての固有の誤差の変動、値を決定するのに利用される方法、又は試験対象中に存在する変動を含むことを示すのに使用される。

【0137】

本明細書及び請求項において使用されるように、「を含む（comprising）」（並びに「を含む（comprise）」及び「を含む（comprises）」のような、を含む（comprising）の任意の型）、「を有する（having）」（並びに「を有する（have）」及び「を有する（has）」のような、を有する（having）の任意の型）、「を含む（including）」（並びに「を含む（includes）」及び「を含む（include）」のような、を含む（including）の任意の型）、又は「を含有する（containing）」（並びに「を含有する（contains）」及び「を含有する（contain）」のような、を含有する（containing）の任意の型）という語は、包括的又は制限のないものであり、さらなる、列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書において提供される、組成物及び方法のいずれかの実施形態において、「を含む」は、「本質的に～からなる」又は「からなる」と代替することができる。本明細書において使用される「本質的に～からなる」という語法は、特定の完全体又はステップ、並びに特許請求される本発明の特徴又は機能に物質的な影響を与えないものを必要とする。本明細書において使用される「からなる」という用語は、列挙された完全体（例えば、特色、要素、特徴、特質、方法／過程ステップ若しくは制限）又は完全体の群（例えば、特色（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）、特質（複数可）、方法／過程ステップ又は制限（複数可））の存在を示すことにのみ使用される。

【0138】

本発明において使用される「又はそれらの組合せ」という用語は、用語に先行して列挙された項目の、すべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣ、及び特定の文脈において順序が重要である場合、また、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図する。この実施例に続き、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等のような、１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せも明確に含まれる。当業者は、他に文脈から明白でない限りにおいて、典型的に、いかなる組合せにおいても項目又は用語の数に制限が存在しないことを理解する。

【0139】

本明細書において使用される、限定するものではないが、「約」「実質的」又は「実質的に」のような近似の語は、そのように修正されたものが必ずしも絶対又は完全ではないことが理解されるが、存在するような状態を設計することを保証するために当業者に十分近いと考えられるであろう状態を指す。本明細書が変動し得る範囲は、どの程度大きな変化が起こることがあるかに依存し、なお、当業者に、修正された特色を、求められている修正されていない特色の特徴及び能力をなお有するものとして認識させる。概して、しかし先行する議論を条件として、「約」のような近似の語で修正された本明細書の数値は、記載された値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％、変動することがある。

【0140】

加えて、本明細書における項の見出しは、米国特許法施行規則１．７７に基づく示唆と整合するように、又は、他の様態で、構成上の指示をもたらすために設けられている。これらの見出しは、本開示に由来し得る任意の請求項に記載されている本発明を限定又は特徴付けるものではない。具体的に、例として、見出しは「技術分野」に言及するが、そのような請求項は、この見出しの下の文言により、いわゆる技術分野を記載するように限定されるべきではない。さらに、「背景技術」の項における技術の説明は、その技術が、本開示における任意の発明に対する先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。「発明の概要」も、発行される請求項に記載されている本発明の特徴付けと考えられるべきではない。さらに、本開示における単数形の「発明」に対するいかなる参照も、本開示において新規性が１点しか存在しないことを主張するために使用されるものではない。本開示に由来する複数の請求項の限定に従って複数の発明が記載されている場合があり、したがって、そのような請求項は、それによって保護される本発明及びそれらの均等物を規定する。すべての事例において、そのような請求項の範囲は、本開示に照らしたそれらの真価によって考慮されるべきであり、本明細書に記載されている見出しによって制約されるものではない。

【0141】

本明細書において開示され、特許請求されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして不適当な実験なしに作成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態の点から記述されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法、並びにステップ又は本明細書で記述される方法の一連のステップに、変動が適用されることが当業者に明白である。当業者に明白な、すべてのこのような類似した代替物及び修正は、付随する請求項により定義される、本発明の精神、範囲及び概念内にあると考えられる。

【0142】

特許庁、及びこの出願に基づいて発行された任意の特許の任意の読者が、本願に添付された請求項を解釈するのを支援するために、出願人らは、「ための手段」又は「ためのステップ」という言葉が、特定の請求項において明確に使用されない限り、出願人らは添付の請求項のいずれも、米国特許法第１１２条パラグラフ６、第１１２条パラグラフ（ｆ）又は同等のものを、それがこの出願日に存在する通りに適用させることを意図していないことに留意してほしいと考えている。

【0143】

各請求項について、先行する請求項が請求項の用語又は要素について適切な先行詞を持つ限り、すべての請求項について、各従属請求項は、独立請求項及び先行する従属請求項の各々の両方に従属し得る。

【0144】

（参考文献）
実施例１
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【0145】

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実施例２
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【国際調査報告】