特表 2024-528034 赤血球濃縮物用添加剤溶液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】赤血球濃縮物用添加剤溶液

(51)【国際特許分類】

   A61K 41/17 20200101AFI20240719BHJP

   A61M 1/36 20060101ALI20240719BHJP

   A61J 3/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 35/18 20150101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

A61K41/17

A61M1/36 171

A61J3/00 300A

A61K9/08

A61K47/02

A61K47/22

A61K47/26

A61K47/12

A61K35/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024505219

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 DE2022100535

(87)【国際公開番号】W WO2023006151

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】102021119408.3

(32)【優先日】2021-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508189049

【氏名又は名称】ブルートシュペンデディーンスト デア ランデスフェアベンデ デス ドイチェン ローテン クロイツェス ニーダーザクセン，ザクセン－アンハルト，テューリンゲン，オルデンブルク ウント ブレーメン ゲーゲ－エムベーハー

(71)【出願人】

【識別番号】524035748

【氏名又は名称】ブルートシュペンデディーンスト デス バイアリッシェン ローテン クロイツェス，ゲメインヌッツィーゲ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】ＢＬＵＴＳＰＥＮＤＥＤＩＥＮＳＴ ＤＥＳ ＢＡＹＥＲＩＳＣＨＥＮ ＲＯＴＥＮ ＫＲＥＵＺＥＳ，ＧＥＭＥＩＮＮＵＴＺＩＧＥ ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＭＩＴ ＢＥＳＣＨＲＡＮＫＴＥＲ ＨＡＦＴＵＮＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100179648

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 咲江

(74)【代理人】

【識別番号】100222885

【弁理士】

【氏名又は名称】早川 康

(74)【代理人】

【識別番号】100140338

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100227695

【弁理士】

【氏名又は名称】有川 智章

(74)【代理人】

【識別番号】100170896

【弁理士】

【氏名又は名称】寺薗 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100219313

【弁理士】

【氏名又は名称】米口 麻子

(74)【代理人】

【識別番号】100161610

【弁理士】

【氏名又は名称】藤野 香子

(72)【発明者】

【氏名】グラヴェマン，ウーテ

(72)【発明者】

【氏名】ゼルトサム，アクセル

(72)【発明者】

【氏名】ハントケ，ヴィープケ

【テーマコード（参考）】

4C047

4C076

4C077

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C047CC01

4C047GG40

4C076AA12

4C076BB11

4C076CC50

4C076DD23

4C076DD26

4C076DD43

4C076DD60

4C076DD67

4C076DD69

4C076FF63

4C077AA13

4C077GG03

4C077JJ03

4C077JJ18

4C084AA11

4C084MA17

4C084NA03

4C084NA05

4C084ZC80

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB36

4C087DA40

4C087MA17

4C087NA03

4C087NA05

4C087ZC80

(57)【要約】

本発明は、赤血球濃縮物を保存するための添加剤溶液と、該添加剤溶液を含む赤血球濃縮物と、ＵＶ光で照射するステップを含む該添加剤溶液で希釈された赤血球濃縮物を製造するためのプロセスと、赤血球濃縮物を保存するための該添加剤溶液の使用とに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水とともに少なくとも以下の成分を含む添加剤溶液：
１２～５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
０．１～３．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
１０～９０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
０．１～３ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
１０～８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、及び
１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【請求項2】

リン酸水素二ナトリウム、アデニン、Ｄ－グルコース、グアノシン、塩化ナトリウム及びクエン酸三ナトリウムの濃度がそれぞれ個別に又は同時に以下の通りである、請求項１に記載の添加剤溶液：
１７～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
１．５～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
４５～５５ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
２０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
１４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２５～３５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【請求項3】

前記濃度の前記成分と残部の水とからなる、請求項１又は２に記載の添加剤溶液。

【請求項4】

前記添加剤溶液は２２℃の場合に、ｐＨが７以上、好ましくは７．５以上、特に８～９である、請求項１～３のいずれか１項に記載の添加剤溶液。

【請求項5】

前記添加剤溶液の浸透圧は、２６０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１～４のいずれか１項に記載の添加剤溶液。

【請求項6】

マンニトール及び／又はソルビトールを含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の添加剤溶液。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載の添加剤溶液の濃縮物又は水による希釈液。

【請求項8】

赤血球と、請求項１～６のいずれか１項に記載の添加剤溶液若しくは請求項７に記載の濃縮物若しくは希釈液、又は該添加剤溶液、濃縮物若しくは希釈液の成分とを含む赤血球濃縮物。

【請求項9】

０．４０～０．８０Ｌ／Ｌ、好ましくは０．５０～０．７０Ｌ／Ｌの赤血球と、
０．１０～０．６０Ｌ／Ｌ、好ましくは０．２５～０．５０Ｌ／Ｌの前記添加剤溶液と、を含み、
上記各場合のＬ／Ｌの体積比の合計は１Ｌ／Ｌ以下の数値になる、請求項８に記載の赤血球濃縮物。

【請求項10】

０．０００１～０．１Ｌ／Ｌの安定剤溶液、特にＣＰＤ安定剤溶液、及び／又は
０．０００１～０．２Ｌ／Ｌのヒト血漿をさらに含む、請求項８又は９に記載の赤血球濃縮物。

【請求項11】

ＵＶ照射された赤血球を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項12】

全血の際にＵＶ照射された赤血球を含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項13】

希釈赤血球濃縮物の際にＵＶ照射された赤血球を含み、
前記希釈赤血球濃縮物は、請求項１～５のいずれか１項に記載の添加剤溶液を含み、好ましくは０．５未満のｈｃｔを有し、ＵＶ照射後に濃縮される、請求項８～１２のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項14】

前記ＵＶ照射は、３００～２００ｎｍ、特に２８０～２２０ｎｍ、好ましくは２６０～２４０ｎｍの波長で行われる、請求項８～１３のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項15】

０．４～０．８、特に０．５～０．７のｈｃｔを有する、請求項８～１４のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項16】

マンニトール又はソルビトールを含まない、請求項８～１５のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項17】

１０～３０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１４～２６ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコースと、
５～１２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウムと、
０．３～１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．５～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのアデニンと、
０．２５～０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．４～０．７ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシンと、
８～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１１～２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、
６～１８ｍｍｏｌ／Ｌ、特に８～１６ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウムと、
任意に、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウムと、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸とを含む、請求項８～１６のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項18】

０．６ｍｍｏｌ／Ｌ未満、特に０．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満のリン酸二水素ナトリウムを含む、請求項８～１７のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物。

【請求項19】

－全血又は希釈された全血にＵＶ放射線を照射し、請求項１～７のいずれか１項に記載の添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分を添加することにより、前記照射された全血から赤血球濃縮物を得るステップ、
又は
－請求項１～７のいずれか１項に記載の添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分を含む赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、赤血球濃縮物は、好ましくはｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮されるステップ；
又は
－第２の添加剤溶液を含む希釈赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、希釈赤血球濃縮物は、好ましくはｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮され、
ここで、第２の添加剤溶液は、第２の添加剤溶液を基準として、少なくとも７５重量％以上、好ましくは完全に、ＵＶ照射後に請求項１～７のいずれか１項に記載の添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分と置換されるステップ；を含み、
各場合におけるＵＶ照射は、３００～２００ｎｍ、特に２８０～２２０ｎｍ、好ましくは２６０～２４０ｎｍの波長で行われる、赤血球濃縮物を製造する方法。

【請求項20】

前記赤血球濃縮物は、請求項８～１８の少なくともいずれかに記載の特徴を有する、請求項１９に記載の赤血球濃縮物を製造する方法。

【請求項21】

添加剤溶液で希釈された赤血球濃縮物を製造する方法であって、
前記添加剤溶液は、請求項１～６のいずれか１項に記載の添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分であり、前記赤血球濃縮物に添加され、好ましくは０．５以上のｈｃｔを有する前記赤血球濃縮物に添加される、方法。

【請求項22】

赤血球濃縮物、好ましくは請求項８～１８のいずれか１項に記載の赤血球濃縮物を保存するための請求項１～６のいずれか１項に記載の添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の主題は、赤血球濃縮物を保存するための添加剤溶液、その添加剤溶液を含む赤血球濃縮物、及びその添加剤溶液で希釈された赤血球濃縮物を製造するための方法であって３００～２００ｎｍの範囲のＵＶ光を照射するステップを含む方法、並びに赤血球濃縮物を保存するためのその添加剤溶液の使用又はその添加剤溶液の成分の使用である。

【背景技術】

【0002】

赤血球濃縮物（ＥＣ）は、赤血球細胞（赤血球）からなる「保存血液の単位」である。ドイツにおいて、赤血球濃縮物は、１単位当たり少なくとも４０ｇのヘモグロビンを含み０．５～０．７のヘマトクリットを有するものを市場流通可能な形態としている。ヘマトクリット（略号：ｈｃｔ）とは、血液量に占める赤血球細胞（赤血球）の割合を意味し、以下、いずれの場合も単位Ｌ／Ｌとして定義する。先行技術によると、赤血球濃縮物は、通常、添加剤溶液で希釈され、保存により適したものとされる。添加剤溶液は、よく保存溶液とも呼ばれ、赤血球を懸濁して保存する目的を果たす。

【0003】

赤血球濃縮物は、種々の方法で入手され得る。赤血球濃縮物は、全血献血から得る、又はアフェレーシス法を用いて得ることが一般的である。アフェレーシス法では、透析のような装置で赤血球をドナーの血液から連続流プロセスを用いて分離し、残った血液成分をドナーの循環系に戻す。例えば、機械的献血には抗凝固剤ＡＣＤ－Ａが用いられる。

【0004】

全血献血は、それぞれのドナーからの所定量の全血が、例えば静脈採血によって４５０ｍＬの全血が、プラスチック材料からなるそれぞれの血液バッグに充填されることによって行われる。血液バッグには、安定剤溶液が含まれており、又は安定剤溶液は、全血の保存期間を増やし、血液凝固を抑制するために全血に添加される。

【0005】

クエン酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウム、及びＤ－グルコースを含むＣＰＤ安定剤溶液は、典型的な安定剤溶液である。一般に、４５０ｍＬの全血に対して６３ｍＬのＣＰＤ安定剤溶液が用いられ、又は５００ｍＬの全血に対して７０ｍＬのＣＰＤ安定剤溶液が用いられる。全血のｐＨ値は、安定剤溶液により７．１～７．２に安定化される。

【0006】

献血された全血を個々の成分に分離すると、赤血球濃縮物（ＥＣ）等が得られる。

【0007】

一般に、全血に対して白血球除去を行う、又は赤血球濃縮物の製造前に白血球除去が行われる。白血球除去とは、ドナーの白血球を実質的に除去することであると理解されている。これは、例えばドイツ等の多くの国で法的要件となっている。白血球除去は、例えば安定剤溶液又は添加剤溶液を添加した後に血液が白血球を保持するフィルタを通過する、又は例えば遠心分離によって白血球を赤血球から分離するアフェレーシス中に行われる。用いられるフィルタは、多くの場合、ポリエステル繊維からなり、この繊維はパック内に圧縮されるため、所定のサイズの孔が形成され、又は決められた孔径を有するポリウレタンスポンジが用いられる。

【0008】

白血球除去のためのろ過は、血液を得た後、赤血球濃縮物を得る前に直接行うこともでき、又は赤血球濃縮物の保存後、任意に、患者に投与する前にまず患者のベッドサイドで行うこともできる。少なくともドイツでは、赤血球濃縮物の保存前に白血球除去を行うことが一般的である。

【0009】

赤血球濃縮物を製造するためには、全血を遠心分離する。血漿と、血小板及び白血球からなる所謂バフィーコートとを含む上清を分離し、遠心分離物又は沈殿物として残った赤血球を添加剤溶液に懸濁する。

【0010】

赤血球濃縮物は、任意に、添加剤溶液とは異なり得る栄養溶液に予めもう一度懸濁され、再度分離するために遠心分離され、赤血球が添加剤溶液に懸濁されて保存される前に、ドナーの血漿の残りが栄養溶液と置換される。このような洗浄赤血球濃縮物は、輸血前の不感症（例えば、ドナーの血漿のタンパク質に対するアレルギー反応、例えばＩｇＡ欠乏症の患者）の場合に有用である。

【0011】

遠心分離から得られる赤血球濃縮物を生理学的に適合した粘度に調整するために、保存性を高めるのに必要な物質も一緒に供給される添加剤溶液を加えなければならない。添加剤溶液は、生存率を向上し、保存中に起こる赤血球の溶血を抑制する。

【0012】

赤血球濃縮物の添加剤溶液は、それ自体既知であり、以前から種々のデザインで提案されてきた。

【0013】

塩化ナトリウム、グルコース又はフルクトース、及びアデニンに加えて糖アルコールのマンナイトを含む溶液が米国特許第４２６７２６９号から知られている。同様に、塩化ナトリウム、グルコース又はフルクトース、及びアデニンを含むが、糖アルコールとしてそれぞれソルビトール又はキシライトを含み、任意にさらにグアノシンを含む溶液が欧州特許出願公開第０１００４１９号に記載されている。欧州特許出願公開第０３０１２５０号には、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及び／又はリン酸水素ナトリウム、グルコース及び／又はフルクトース、ソルビトール、マンナイト及び／又はキシライト、アデニン及び／又はグアノシン、並びに任意にコロイドを含む添加剤溶液が開示されている。

【0014】

添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍは、例えば経済的に重要となっている。それは、アデニン、グルコース、Ｄ－マンニトール及び塩化ナトリウムを含む（C.F. Hogman, K. Hedlund, Y. Sahlestrom: “Red cell preservation in protein-poor media. III. Protection against in vitro hemolysis” in Vox Sang. 1981 Nov-Dec; 41(5-6):274-81）。

【0015】

ＰＡＧＧＳ－マンニトール（ＰＡＧＧＳ－Ｍ）は、現在水溶液として以下のように販売されており、さらに公知の添加剤溶液である。
４７．４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－グルコース一水和物
８．０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸二水素ナトリウム二水和物
８．０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム二水和物
１．４ｍｍｏｌ／Ｌ アデニン
１．４ｍｍｏｌ／Ｌ グアノシン
５４．９ｍｍｏｌ／Ｌ マンニトール
７２ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム

【0016】

W.H. Walker, M. Netz, K.H. Ganshrit: “49 Tage Lagerung von Erythrozytenkonzentraten in Blutbeuteln mit der Konservierungslosung PAGGS-Mannitol“. Beitr. Infusionsther. 26(1990): 55-59において、Walterらは、添加剤溶液ＰＡＧＧＳ－Ｍを用いた赤血球濃縮物の保存可能期間を試験し、ＣＰＤを安定剤溶液として用いた。

【0017】

血液製剤の治療適用は、血液製剤を受けた者がウイルス及び／又は細菌に感染する危険性と関連していることが知られている。これらには、例えばウイルスＢ型肝炎（ＨＢＶ）、ウエストナイル（ＷＮＶ）及びＣ型肝炎（ＨＣＶ）、並びにエイズウイルスＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、又は細菌、例えばブドウ球菌若しくは連鎖球菌が含まれる。これらの病原体を不活性化又は除去する工程が製剤の製造中に使用されない場合、そのリスクは常に存在する。

【0018】

病原体の不活性化は、例えばＵＶ照射によって行われ得る。この種の方法は、例えば国際公開第２００７／０７６８３２号から知られている。紫外線（ＵＶ）光は、波長によって区別される。本出願では、以下のように定義する：ＵＶＡ：４００～３２０ｎｍ、ＵＶＢ：３２０～２８０ｎｍ、ＵＶＣ：２８０～２００ｎｍ。例えば血漿中又は細胞血液製剤中に含まれる細菌だけでなくウイルスも短波長の紫外線（ＵＶ）光、すなわち薬３２０ｎｍ以下の波長域（ＵＶＢ及びＵＶＣ）を照射することにより不活性化できることが知られている。３２０ｎｍ以上では、放射線のエネルギーが低すぎて微生物及びウイルスを効果的に不活性化することができない。化学的、光化学的及び光線力学的な病原体不活性化方法とは対照的に、ＵＶ光による純粋な照射は、一般的にそれ自体で効果があり、反応性化学物質又は光活性物質の添加を必要としないという利点がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

本発明の目的は、赤血球濃縮物、特に添加剤溶液に導入する前にＵＶ照射を受けた赤血球の保存性を改善すること、又は赤血球のＵＶ照射及び保存のための媒体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明は、特許請求の範囲の独立請求項により特徴付けられ、好ましい実施形態は従属請求項の主題であり、及び／又は以下に説明される。

【0021】

本発明に係る添加剤溶液は、水に加えて以下の成分を含む：
１２～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１７～５０ｍｍｏｌ／Ｌ又は２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）；
０．１～３．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１．５～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン；
１０～９０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に４５～５５ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース；
０．１～３ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン；
１０～８０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらには３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム；及び
１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ又は２５～３５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【0022】

添加剤溶液は、特に以下の成分からなる：
１２～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１７～５０ｍｍｏｌ／Ｌ又は２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）；
０．１～３．５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１．５～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン；
１０～９０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に４５～５５ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース；
０．１～３ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン；
１０～８０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらには３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム；及び
１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ又は２５～３５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム；
残りは水である。

【0023】

上記の成分は、いずれの場合も水和物としても用いられ得る。その成分は一般に溶液中で解離するように存在する。

【0024】

濃縮物又は希釈液、特に上記の添加剤溶液の希釈液も同様に請求される。

【0025】

ダイ添加剤溶液は、好ましくはｐＨが７以上、好ましくは７．５以上、特にｐＨが８～９であり、いずれも２２℃の場合である。

【0026】

添加剤溶液の浸透圧は、好ましくは２６０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。浸透圧の測定は、凝固点降下法（浸透圧計）によって行われる。

【0027】

添加剤溶液で希釈された赤血球濃縮物を製造する方法であって、赤血球濃縮物及び／又は赤血球濃縮物の前駆体、例えば全血に３００～２００ｎｍ、特に２８０～２２０ｎｍ、好ましくは２６０～２４０ｎｍの範囲の紫外線を照射するステップ（以下、通常「ＵＶ照射」又は「ＵＶ－照射」ともいう）を含む方法は、さらに本発明の主題である。

【0028】

以下の３つの設計において、赤血球濃縮物を製造する方法は以下のステップを含む：
－全血又は希釈された全血にＵＶ放射線を照射し、添加剤溶液又は添加剤溶液の成分を添加することにより、そのようにして照射された全血から赤血球濃縮物を得る；
又は
－添加剤溶液又は添加剤溶液の成分を含む赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、赤血球濃縮物は、好ましくはｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮される；
又は
－第２の添加剤溶液を含む希釈赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、希釈赤血球濃縮物は、好ましくはｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮され、
ここで、第２の添加剤溶液は、第２の添加剤溶液を基準として、少なくとも７５重量％以上、好ましくは完全に、照射後に添加剤溶液又は添加剤溶液の成分と置換され；
各場合におけるＵＶ照射は、３００～２００ｎｍ、特に２８０～２２０ｎｍ、好ましくは２６０～２４０ｎｍの波長で行われる。添加剤溶液の成分が添加される場合、これは、添加剤溶液が添加された場合と同一の濃度が各場合に生じるように添加されることを意味する。この点において、添加剤溶液が添加された場合と同一である。

【0029】

従って、本発明は、さらに、上記添加剤溶液を含む、ｈｃｔが０．１～０．４、好ましくは０．２５～０．３５の希釈赤血球濃縮物、特に白血球除去された希釈赤血球濃縮物に関する。希釈赤血球濃縮物は、例えば添加剤溶液による赤血球濃縮物の１：２希釈から得られる。ｈｃｔが０．５未満の赤血球濃縮物は、本明細書において「希釈赤血球濃縮物」とも呼ばれる。

【0030】

赤血球濃縮物は、好ましくは以下を含んで構成される（Ｌ＝リットル）：
赤血球 ０．４０～０．８０Ｌ／Ｌ、特に０．５０～０．７０Ｌ／Ｌ
添加剤溶液 ０．１０～０．６０Ｌ／Ｌ、特に０．２５～０．５０Ｌ／Ｌ
及び任意に
安定剤溶液 ０．０００１～０．１０Ｌ／Ｌ、特にＣＰＤ安定剤溶液
ヒト血漿 ０．０００１～０．２Ｌ／Ｌ
それぞれの場合の数値の合計は、１Ｌ／Ｌ以下、特に１Ｌ／Ｌの値になる。

【0031】

ＵＶ照射が全血（ＷＢ）に対して行われた場合、赤血球濃縮物の組成は、特に以下のものを含む若しくは以下のものからなる：
赤血球 ０．５～０．７Ｌ／Ｌ
添加剤溶液 ０．２７～０．４８Ｌ／Ｌ
ＣＰＤ安定剤溶液 ０．０３～０．０９Ｌ／Ｌ
ヒト血漿 ０．０２５～０．１５Ｌ／Ｌ若しくは０．０１５～０．０２５Ｌ／Ｌ
又は、赤血球濃縮物のＵＶ照射後、ＵＶ照射が全血（ＷＢ）で行われなかった場合は、以下を含む若しくは以下からなる：
赤血球 ０．５～０．７Ｌ／Ｌ
添加剤溶液 ０．２７～０．４９Ｌ／Ｌ
ＣＰＤ安定剤溶液 ０．００１～０．００９Ｌ／Ｌ又は０．００１～０．０１４Ｌ／Ｌ
ヒト血漿 ０．００５～０．０５Ｌ／Ｌ。

【0032】

一実施形態によると、適切なＣＰＤ安定剤溶液は以下のものを含み構成される：
クエン酸三ナトリウム二水和物 ８０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に８９．４ｍｍｏｌ／Ｌ
クエン酸一水和物 １３～１８ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１５．６ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＨ_２ＰＯ_４二水和物 １３～１９ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１６．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ－グルコース一水和物 １１５～１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１２８．７ｍｍｏｌ／Ｌ。

【0033】

一実施形態によると、ＣＰＤ安定剤溶液は、１：６．１～１：８．１、特に１：７．１４（各場合Ｖ／Ｖ）の体積比で全血に添加され、例えば４５０ｍＬの全血に対して６３ｍＬのＣＰＤ安定剤溶液、又は５００ｍＬの全血に対して７０ｍＬのＣＰＤ安定剤溶液が、すなわち添加剤溶液が用いられる前に添加される。再処理によると、ＣＰＤ安定剤溶液の上記成分は、その後、所定の濃度で赤血球濃縮物中に残存する。

【0034】

グルコース及びクエン酸三ナトリウムも安定剤溶液に含まれるため、ＣＰＤ安定剤溶液を用いた場合、赤血球濃縮物中のその割合はそれに応じて増加する。しかし、他の安定剤溶液を用いることも可能である。

【0035】

一実施形態によると、赤血球濃縮物は以下のものを含む：
１０～３０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１４～２６ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース；
５～１２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～１０ｍｍｏｌ／Ｌの、例えば二水和物としてのリン酸水素二ナトリウム；
０．３～１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．５～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン；
０．２５～０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．４～０．７ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン；
８～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１１～２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム；
６～１８ｍｍｏｌ／Ｌ、特に８～１６ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム；
及び任意に、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌの、例えば二水和物としてのリン酸二水素ナトリウム；
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌの、例えば一水和物としてのクエン酸。

【0036】

この実施形態は、例えば赤血球濃縮物が献血のためのＣＰＤ又はＣＰＤＡ－１安定剤溶液及び本発明に係る添加剤溶液の添加により得られ、リン酸二水素ナトリウム及びクエン酸が、その後にＣＰＤ安定剤溶液により導入される場合に得られ得る。

【0037】

従って、本発明は、さらに赤血球濃縮物を保存するための添加剤溶液又は添加剤溶液の成分の使用に関する。

【0038】

ＣＰＤ安定剤溶液とヒト血漿との濃度の差は、ＥＣを添加剤溶液で希釈し、その後に濃縮したことに起因する。濃縮の際に、上清の一部が除去されるため、元々含まれていた血漿及びＣＰＤ安定剤溶液の一部も除去される。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１は、保存期間中の溶血率を日数で示す。

【図2】図２は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物のグルコース濃度の保存期間中の減少を示す。

【図3】図３は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物の乳酸濃度の保存期間中の増加を示す。

【図4】図４は、ＮａＣｌ、ＳＡＧ－Ｍ又はＵＧ６５の存在下でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物の溶血率を示し、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射せずに保存したＥＣをコントロールとした。

【図5】図５は、ＮａＣｌ、ＳＡＧ－Ｍ又はＵＧ６５の存在下でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物のＡＴＰ含量を示し、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射せずに保存したＥＣをコントロールとした。

【図6】図６は、ＵＶＣ照射したＥＣと同一の添加剤溶液中で保存したＥＣの保存過程における溶血率を示す。

【図7】図７は、ＵＶＣ照射したＥＣと同じ添加剤溶液で保存したＥＣの保存終了時（５週目）におけるＡＴＰ含量を示す。

【図8】図８は、ＵＶＣ照射したＥＣと同じ添加剤溶液で保存したＥＣの保存終了時（５週目）におけるグルコース含量を示す。

【図9】図９は、ＵＶＣ照射したＥＣと同じ添加剤溶液で保存したＥＣの保存終了時（５週目）における乳酸含量を示す。

【図10】図１０は、ＵＶＣ照射した全血から得たＥＣをＵＧ６５及びＳＡＧ－Ｍで保存した際の溶血率を示す。

【図11】図１１は、ＵＶＣ照射した全血から得たＥＣをＵＧ６５及びＳＡＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）におけるＡＴＰ含量を示す。

【図12】図１２は、ＵＶＣ照射した全血から得たＥＣをＵＧ６５及びＳＡＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）におけるグルコース含量を示す。

【図13】図１３は、ＵＶＣ照射した全血から得たＥＣをＵＧ６５及びＳＡＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）における乳酸含量を示す。

【図14】図１４は、ＵＶＣ照射した全血から得られたＥＣを、ＵＧ６５及びＰＡＧＧ－Ｍで保存した際の、保存過程における溶血速度を示す。

【図15】図１５は、ＵＶＣ照射した全血から得られたＥＣを、ＵＧ６５及びＰＡＧＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）におけるＡＴＰ含量を示す。

【図16】図１６は、ＵＶＣ照射した全血から得られたＥＣを、ＵＧ６５及びＰＡＧＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）におけるグルコース含量を示す。

【図17】図１７は、ＵＶＣ照射した全血から得られたＥＣを、ＵＧ６５及びＰＡＧＧ－Ｍで保存した際の保存終了時（４週目）における乳酸含量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

一実施形態によると、赤血球濃縮物は、個々の献血から分離される、又は機械的アフェレーシスによって個々のドナーから得られる。調製物の体積は、一般に約２００～３５０ｍＬである。全血献血の体積は、４００～５００ｍＬが多い。調製物は、それぞれ平らなプラスチックバッグに保存され、通常、全血では約４℃～３７℃、赤血球濃縮物では４℃±２℃で保存される。

【0041】

白血球除去は、全血のレベル、すなわち全血の最初の遠心分離の前に、又は遠心分離によって得られた赤血球が添加剤溶液に懸濁されて希釈されたレベル、すなわち赤血球濃縮物のレベルで行われ得る。一般に、白血球除去は、ろ過によって行われる。アフェレーシスによって赤血球を得る場合、白血球除去を別に行う必要は無く、白血球除去は既にアフェレーシスの一部として行われている。

【0042】

一形態によると、白血球除去は、本発明に係る添加剤溶液で希釈された赤血球濃縮物において、例えば０．１～０．４のｈｃｔで行われる。白血球除去の後、任意にＵＶ照射が行われ、その後に特に０．５～０．７のｈｃｔに濃縮される。白血球除去は、ＵＶ照射の前でも後でもよく、好ましくは前に行われる。

【0043】

ＵＶ照射は、全血（ＷＢ）、すなわち赤血球濃縮物の製造前、又は赤血球濃縮物に対して行われ得る。ＵＶ照射されて病原体が除去された赤血球濃縮物、及び任意に白血球除去された赤血球濃縮物が、本発明に係る添加剤溶液中の製品として得られる。

【0044】

赤血球濃縮物のＵＶ照射のための出発材料は、例えばｈｃｔが０．８～１、特に０．８～０．９８の赤血球濃縮物である。一実施形態によると、それらは本発明に係る添加剤溶液によって０．５～０．７のｈｃｔに調整され、この濃度でＵＶ照射されるか又は好ましくは更なる希釈（希釈赤血球濃縮物）がなされてＵＶ照射される。本出願の観点において、ｈｃｔが０．５未満の赤血球濃縮物は希釈赤血球濃縮物と呼ばれる。

【0045】

また、白血球除去された赤血球濃縮物は、添加剤溶液でさらに希釈することにより、例えば赤血球濃縮物と添加剤溶液との１：２希釈から、０．１～０．４、好ましくは０．２５～０．３５のｈｃｔ（希釈赤血球濃縮物）に調整され得る。このようにして希釈された赤血球濃縮物は、滅菌ホース接続を介して照射バッグに移され、激しく動かされた環境下でＵＶ照射される。

【0046】

照射された赤血球濃縮物は、空のバッグに移され、例えば遠心分離及び上清の圧搾により、ｈｃｔが０．５～０．８、特に０．５～０．７にまで濃縮される。

【0047】

短波長の紫外線（ＵＶ）光の照射によって、血液製剤中の病原体を不活性化できることが知られている。これは、本発明に方法によると、血液製剤に３００～２００ｎｍ（ＵＶＢ～ＵＶＣの範囲）の紫外線（ＵＶ）光、特にＵＶＣの範囲の波長である２８０～２２０ｎｍ、特に２６０～２４０ｎｍの紫外線（ＵＶ）光を照射することにより行われる。

【0048】

放射線エネルギーは、全血では好ましくは０．３～１０Ｊ／ｃｍ^２、より好ましくは２．５～５．５Ｊ／ｃｍ^２、特に好ましくは３～５Ｊ／ｃｍ^２であり、赤血球濃縮物では好ましくは１．５～４．５Ｊ／ｃｍ^２、特に好ましくは２～４Ｊ／ｃｍ^２である（いずれの場合も血液製剤に作用する放射線エネルギーに基づく）。照射バッグのような容器に作用する放射線エネルギーは、材料にもよるが、照射バッグが一般的に関連波長の放射線エネルギーを吸収するため、実際にはより大きくなる。

【0049】

照射が紫外線を吸収する媒体を通して行われる場合、照射エネルギーはそれに応じて増加する。ＥＶＡ（エチレンビニルアセテート）製の照射バッグは、例えば放射線エネルギーの約３０～４０％を吸収する。照射は、特に２～３７℃の血液製剤の温度で行われる。

【0050】

紫外線照射のためのこの種の方法は、例えば国際公開第２００７／０７６８３２号から知られており、本発明に係る赤血球濃縮物に適用される。これによると、調製物、すなわちドナー血液（全血）及び／又は赤血球濃縮物（ＥＣ）は、サンプルの一定の循環が容器内で行われるように、照射バッグ内で適切な方法で動かされる。これにより、液体又は懸濁液内のいくつかの領域において、用いられる光が透過可能な程度に薄い層がそれぞれ形成されるように激しく動かされる。その動作は、それぞれ液体又は懸濁液がバッグの中で効果的に混合されるように行われる。この両方は、例えば以下の条件がそろえば特に実現する：
１．照射バッグは柔軟性がある。
２．照射バッグは、最大充填量の４０％、特に最大充填量の３０％、特に最大充填量の１５％まで充填されている。
３．照射バッグは、例えば水平方向に（前後方向に直線的に、又は円形若しくは楕円形に）、及び／又は垂直方向（揺動）に激しく動かされる。
同時に行われる一定の混合に関連して、製剤全体（及びその中に含まれる病原体）が最終的に照射され、その結果、病原体が減少する。

【0051】

照射バッグは、オービタルシェーカー、プラットフォームシェーカー、ロッキングシェーカー又はウォブルシェーカーを用いて振盪することができ、好ましくは全照射時間の少なくとも４分の３の間、動かされ得る。照射バッグは、通常、最大で５０００ｍＬの容積を有する。照射バッグが一側面に配置されている場合、照射バッグの高さは、照射バッグが載置されている面と照射バッグの上面との交点との間の面法線に沿った距離に基づいて、バッグ内容物と接触している照射バッグの上面全体に亘って、それぞれ移動または振盪に起因して絶えず変化する。

【0052】

照射バッグは、ＵＶ透過性のプラスチック材料からなる。適切なプラスチックは、例えばエチレンビニルアセテート及びポリオレフィンであり、フィルム厚さは例えば１ｍｍ以下、特に０．５ｍｍ以下である。照射バッグは、平坦に形成され、好ましくは２００～３２０ｎｍの範囲に吸収極大を有さない。水平に充填された状態において、照射バッグは、わずか数ｍｍ、例えば１０ｍｍ未満、特に５ｍｍ、さらに好ましくは３ｍｍ未満の厚さを有し、例えば最大６００ｍＬのサンプル体積を収容することが意図される。しかし、照射バッグの最大容積（体積）は、そこに収容される実際のサンプル体積よりも大きく、好ましくは少なくとも３倍、一般的には少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍である。例えば、水平時の照射バッグの底面は１９×３８ｃｍ、充填量は５００～６００ｍＬであり、水平で静止状態での平均充填高さは６．９～８．３ｍｍとなる。

【0053】

ＵＶ照射された各ユニットは、好ましくはドナーまで遡ることができる。

【0054】

ヘマトクリット（ｈｃｔ）は、血液中の細胞成分の割合を示す。血液中のヘマトクリット値の正常値は、男性で０．４２～０．５、女性で０．３７～０．４５である。本症例では、Ｌ／Ｌで特定されている。赤血球は生理学的に血球の全容積の９９％を占めることから、ｈｃｔ値はその細胞容積の割合にほぼ一致する。

【0055】

ｈｃｔは、ＤＩＮ５８９３３－１：１９９５－０１に従って、チューブ内の非凝固血液サンプルを遠心分離することによって測定される。その際、ＥＤＴＡ（四酢酸エチレンジアミン）又はヘパリン等の抗凝固剤を添加し、血液の凝固を防ぐ。重い赤血球が血漿から分離すると、全血液量に対する赤血球量の高さが測定される。赤血球、白血球／血小板、及び血漿の境界は肉眼で確認できる。白血球及び／又は血小板と血漿とが既に分離している場合、沈殿する固形物はほとんど赤血球のみからなる。

【実施例】

【0056】

ＵＶＣ照射された血液製剤の品質及びＵＶ照射による血液製剤の病原体不活性化効果に及ぼす添加剤溶液ＵＧ６５の影響を試験した。

【0057】

（成分の製造）
全血献血（４５０～５００ｍＬ）を７０ｍＬの抗凝固剤ＣＰＤ中に収集し（０日目）（以下、全血献血と総称する）、室温で一晩保存した。抗凝固剤ＣＰＤには、水以外に以下の成分が含まれていた。

【0058】

１日目、全血を病原体不活性化試験に直接に用いる、又はさらに赤血球濃縮物に処理した。この目的のために、赤血球は、従来のバッグ遠心分離機で遠心分離し、圧搾機で自動成分分離した後、「乾燥」赤血球濃縮物として得られ、その後、それぞれの特定の添加剤溶液（１１０ｍＬ）に懸濁した。白血球除去は、白血球除去フィルタによる全血レベルでのろ過（「全血ろ過」）又は赤血球濃縮物のろ過（遠心分離及び圧搾後のろ過）によって行った。

【0059】

添加剤溶液ＵＧ６５の組成：
その水溶液は以下の成分を含む：
２２．７ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム二水和物
１．８５ｍｍｏｌ／Ｌ アデニン
５１．６ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－グルコース一水和物
１．４４ｍｍｏｌ／Ｌ グアノシン
４０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム
２８．４ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸三ナトリウム二水和物
残り 水。

【0060】

添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍの組成：
その水溶液は以下の成分を含む：
１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ アデニン
４５．４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－グルコース一水和物
２８．８ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－マンニトール
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム
残り 水

【0061】

（ＵＶ照射による病原体不活性化）
添加剤溶液で希釈した全血（５２０～５７０ｍＬ）又は赤血球濃縮物（６００ｍＬ、ｈｃｔが約０．３）をＵＶ透過性バッグ（底面１９×３８ｃｍ、ＥＶＡ製）に充填し、ＵＶ照射システム（Ｍａｃｏｔｒｏｎｉｃ ＵＶ）でＵＶＣ光（２５４ｎｍ）をそれぞれ４．５Ｊ／ｃｍ^２（ＥＣ）又は６Ｊ／ｃｍ^２（ＷＢ）照射し、同時に振盪した（３００ｒｐｍ）。

【0062】

その後、遠心分離及び自動分離により、全血又は希釈赤血球濃縮物からｈｃｔが０．５～０．７の通常の赤血球濃縮物を得た。

【0063】

照射されたエネルギーに関する情報は、照射バッグの外側に影響する。照射エネルギーの約５０～７５％、本実施例では約６０％が照射バッグを透過すると推定される。照射バッグは上から及び下から照射される。

【0064】

（品質パラメータの測定）
溶血率（％）は、全含有量に対する赤血球濃縮物の上清中の遊離ヘモグロビンの割合として定義される。
溶血率（％）＝（（１００－ヘマトクリット^＊１００）×上清中の遊離ヘモグロビン／総ヘモグロビン）。

【0065】

ｈｃｔは、ヘマトクリット遠心分離機（Ｈａｅｍａｔｏｋｒｉｔ２１０、Ｈｅｔｔｉｃｈ）を用いて測定した。上清中の遊離ヘモグロビンは、Ｈａｒｂｏｅによる３波長法によって光学的に測定した（M. Harboe, A method for determination of hemoglobin in plasma by near-ultraviolet spectrophotometry. Scand J Clin Lab Invest, 1959. 11(1): p. 66-70を参照）。総ヘモグロビンは、血液学的測定装置（ＸＳ１０００ｉ又はＸＮ５５０、ｓｙｓｍｅｘ）によって測定した。

【0066】

グルコース及び乳酸の濃度の測定は、血液ガス分析装置ＡＢＬ９０ＦＬＥＸ（ラジオメーター）を用いて行った。赤血球のＡＴＰ含量は、市販のキットＡＴＰ Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ ＦＳ（Ｄｉａｓｙｓ Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いて測定した。ｐＨは、従来のｐＨメーターを用いて２２℃で測定した。体積は、赤血球濃縮物の比重を考慮し、秤量によって決定した。

【0067】

（試験１）
ＵＧ６５でＵＶＣ照射され、ＵＧ６５で保存された赤血球濃縮物の品質パラメータ
添加剤溶液ＵＧ６５中の赤血球濃縮物（ｎ＝９）をＵＶＣ照射し、上記のように再度濃縮した。約０．６のｈｃｔを有する完成した赤血球濃縮物は、その後４±２℃で保存され、インビトロ品質を決定するためのサンプルが毎週採取された。

【0068】

（結果）
ＵＶＣ照射した赤血球濃縮物のｈｃｔは０．５９～０．６４であり、欧州評議会のガイドラインに適合していた。溶血率は、保存期間中に増加した。しかし、保存開始から３６日目には、９種類全ての赤血球濃縮物が溶血率０．８％未満を示し、欧州評議会のガイドラインの品質要件を満たしていた。

【0069】

ＵＶＣ照射された赤血球濃縮物のｐＨ値は、２日目に７．１４±０．０６であったが、保存期間中に減少し、３６日目には６．５４±０．０５となった。これと並行して、赤血球濃縮物のグルコース含量は３７．８±１．６から２３．７±１．９に減少し、乳酸濃度は６．９±０．６から３０．４±１．６に増加した。

【0070】

図１は、保存期間中の溶血率を日数で示したものである。

【0071】

図２は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物のグルコース濃度の減少を示し、図３は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物の乳酸濃度の保存期間中の増加を示す。

【0072】

値は、いずれも９サンプルの平均値である。

【0073】

新たに開発された添加剤は、ＵＶＣ照射された赤血球濃縮物を良好な品質で製造するのに適していることがわかった。

【0074】

（試験２）
添加剤溶液ＵＧ６５中で保存される赤血球濃縮物のＵＶＣ照射の際の添加剤溶液の違いによる影響
４つの乾燥赤血球濃縮物をプールし、再度分割した。赤血球濃縮物を１１０ｍＬのＵＧ６５に懸濁し、白血球除去のためにろ過した（ＵＶＣ照射無しの未処理コントロール）。

【0075】

残りの３つの赤血球濃縮物については、プールした赤血球濃縮物を１１０ｍＬの等張食塩水（ＮａＣｌ０．９％）、１１０ｍＬの添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ及び１１０ｍＬの添加剤溶液ＵＧ６５にそれぞれ懸濁し、ろ過し、その後にそれぞれの同じ添加剤溶液で約０．３のｈｃｔに希釈した。ＵＶＣ照射は、４．５Ｊ／ｃｍ^２のＵＶＣ線量で上記のように行った。ＵＶＣ照射された赤血球濃縮物は、その後に遠心分離され、上清が除去され、全ての赤血球がそれぞれ再びＵＧ６５に懸濁された。添加剤溶液ＵＧ６５中における赤血球濃縮物の保存は、４±２℃で行われ、インビトロ品質を決定するためのサンプルは毎週採取された。

【0076】

（結果）
図４に示すように、非照射コントロールと比較して、ＵＶＣ照射では溶血率が上昇した。溶血率は、ＮａＣｌ又はＳＡＧ－Ｍ存在下で赤血球が照射された場合に最も高かった。ＵＶＣ照射された赤血球濃縮物の品質が最も優れていたのは、照射の際に添加剤溶液ＵＧ６５が存在した場合であった。

【0077】

赤血球のエネルギー状態のパラメータであるＡＴＰ含量も同様にＵＶＣ照射の影響を受けた。保存終了時のＡＴＰ含量は、赤血球をＵＧ６５の存在下で照射した場合に最も高かった（図５）。赤血球濃縮物にＮａＣｌ又はＳＡＧ－Ｍ存在下で照射すると、非照射コントロールと比較して、ＡＴＰ含量が減少した。

【0078】

図４は、ＮａＣｌ、ＳＡＧ－Ｍ又はＵＧ６５の存在下でＵＶＣ照射し、ＵＧ６５中で保存した赤血球濃縮物の溶血率を示し、図５は、それらの場合のＡＴＰ含量を示す。ＵＧ６５中でＵＶＣ照射せずに保存したＥＣをコントロールとした。

【0079】

一連の試験から、ＵＶＣ照射の際に添加剤溶液ＵＧ６５で赤血球濃縮物を希釈することは、赤血球の品質に良好な効果をもたらすことがわかった。新規に開発された添加剤溶液は、生理食塩水又は従来の添加剤溶液等の他の可能性がある希釈溶液と比較して利点を提供する。

【0080】

（試験３）
添加剤溶液ＵＧ６５中で照射及び保存されたＵＶＣ照射赤血球濃縮物と従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ中で照射及び保存された赤血球濃縮物との品質比較
「乾燥」赤血球濃縮物（ヘマトクリット＞０．８）を上記のようにして得た。２つの乾燥赤血球濃縮物をプールし、再び分割し、その後に一つを市販の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ（コントロール）１１０ｍＬに懸濁し、一つを新規に開発した添加剤溶液ＵＧ６５（試験）１１０ｍＬに懸濁した。白血球除去は、従来の白血球除去フィルタを用いて、これらの赤血球濃縮物をろ過することによって行った。ろ過後、それぞれの赤血球濃縮物を、同量のそれぞれの添加剤溶液（ｗ／ｗ）と混合した。希釈した赤血球濃縮物６００ｇをＵＶＣ透過性照射バッグに移した。ＵＶＣ照射は上記のように行った。続いて、希釈赤血球濃縮物から、遠心分離及び自動分離により、従来の赤血球濃縮物を得た。完成した赤血球濃縮物（ｎ＝３、試験及びコントロール）を４±２℃で保存し、インビトロ品質を決定するためのサンプルを毎週採取した。

【0081】

（結果）
製造後、試験赤血球濃縮物及びコントロール赤血球濃縮物は、体積、ｈｃｔ及び単位当たりのヘモグロビンについて同等の値を示した（表１）。

【表1】

【0082】

赤血球濃縮物の最も重要な品質パラメータである溶血率は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射及び保存された赤血球濃縮物では、従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ中でＵＶＣ照射及び保存された赤血球濃縮物と比較して、有意に低かった（図６）。保存期間中、その他の品質パラメータも全て、コントロール赤血球濃縮物と試験赤血球濃縮物との間で有意差を示した（図７～９）。

【0083】

図６は、ＵＶＣ照射したＥＣと同一の添加剤溶液中で保存したＥＣの保存過程における溶血率を示す。

【0084】

それぞれＵＶＣ照射したＥＣと同じ添加剤溶液で保存したＥＣの保存終了時（５週目）において、図７はＡＴＰ含量、図８はグルコース含量、図９は乳酸含量を示す。

【0085】

保存の過程において、新規に開発された添加剤溶液ＵＧ６５の赤血球濃縮物へのＵＶＣ照射における大きな利点が明らかとなった。ＵＧ６５中でＵＶＣ照射され、ＵＧ６５中で保存されたＥＣは、従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ中で保存したＥＣよりも品質が優れていた。

【0086】

（試験４）
全血レベルでのＵＶＣ照射後の赤血球濃縮物の品質における添加剤溶液ＵＧ６５と従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍとの比較
全血献血（約５７０ｎｍ）を上記のようにＵＶＣで照射し、その後、圧搾機による自動成分分離によって、「乾燥」赤血球濃縮物（ヘマトクリット＞０．８）を得た。２つの乾燥赤血球濃縮物をプールし、再び分割し、その後に一つを市販の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ（コントロール）１１０ｍＬに懸濁し、一つを新規に開発した添加剤溶液ＵＧ６５（試験）１１０ｍＬに懸濁した。白血球除去は、市販の白血球除去フィルタによるこれらの赤血球濃縮物のろ過によって行った。赤血球濃縮物（ｎ＝４、試験及びコントロール）は、その後、４±２℃で保存し、インビトロ品質を決定するためのサンプルを毎週採取した。

【0087】

（結果）
製造後、試験赤血球濃縮物及びコントロール赤血球濃縮物は、体積、ｈｃｔ及び単位当たりのヘモグロビンについて同等の値を示した（表２）。

【表2】

【0088】

赤血球濃縮物の最も重要な品質パラメータとして、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射した全血から得られた赤血球濃縮物の溶血率は、従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍ中でＵＶＣ照射した全血から得られた赤血球濃縮物の溶血率と比較して有意に低かった（図１０）。保存過程において、更なる品質パラメータもコントロール赤血球濃縮物と試験赤血球濃縮物との間で有意差を示した（図１１～１３）。

【0089】

図１０は、ＵＶＣ照射した全血から得たＥＣをＵＧ６５及びＳＡＧ－Ｍで保存した際の溶血率を示す。

【0090】

それぞれ保存終了時（４週目）において、図１１はＡＴＰ含量を示し、図１２はグルコース含量を示し、図１３は乳酸含量を示す。

【0091】

保存過程において、新規に開発した添加剤溶液ＵＧ６５の、ＵＶＣ照射された全血からの赤血球濃縮物の製造における優れた利点が明らかとなった。ＵＧ６５を添加したＵＶＣ照射全血からのＥＣの品質は、従来の添加剤溶液ＳＡＧ－Ｍを添加したものよりも優れている。

【0092】

（試験５）
細菌不活性化
細菌株Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＰＥＩ－Ｂ－Ｐ－０８－０１）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（ＰＥＩ－Ｂ－Ｐ－５６）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＰＥＩ－Ｂ－Ｐ－７７）をＣＡＳＡブイヨンで増殖させ、人アルブミンと混合し、試用まで凍結保存した（U. Gravemann, et al., Bacterial inactivation of platelet concentrates with the THERAFLEX UV-Platelets pathogen inactivation system. Transfusion, 2019. 59(4): p. 1324-1332.を参照）。全血又はｈｃｔが約０．３の希釈赤血球濃縮物に約１×１０^６ＫＢＥ／ｍＬの細菌懸濁液をスパイクし（各使用細菌ごとにｎ＝３）、その後にＵＶＣ光を照射し、振盪した。その後、希釈赤血球濃縮物又は全血から従来の赤血球濃縮物を得た。サンプルは異なる時点で採取し、寒天プレートへのプレーティングにより細菌数を測定した。

【0093】

（結果）
赤血球濃縮物（表３）及び全血（表４）では、４～６ｌｏｇレベルの対数減少値で用量依存的に細菌が不活性化された。この試験は、本方法の細菌不活性化効率を証明した。

【表3】

【表4】

【0094】

（試験６）
ウイルス不活性化
ＥＭＶＣ（ＥＭＣ株、ＡＴＣＣ ＶＲ１２９Ｂ）、シンドビスウイルス（Ａｒ３３９株、ＡＴＣＣ ＶＲ－６８）及びＶＳＶ（インディアナ株、ＡＴＣＣ ＶＲ－１５８）をＶｅｒｏ細胞（腎臓組織由来のアフリカミドリザル細胞株、ＡＴＣＣ，Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ番号ＢＥ７６－１０８Ｂ）上で増殖させ、滴定した。培養及び滴定は、Ｍｏｈｒらに記載のように行った（H. Mohr et al., A novel approach to pathogen reduction in platelet concentrates using short-wave ultraviolet light. Transfusion, 2009. 49(12): p. 2612-24）。

【0095】

全血又はｈｃｔが約０．３の添加剤溶液ＵＧ６５で希釈された赤血球濃縮物に、ウイルス懸濁液（１０％ｖ／ｖ、使用ウイルスごとにｎ＝３）をスパイクし、その後にＵＶＣ光を照射し、振盪照射した。その後、希釈赤血球濃縮物又は全血から従来の赤血球濃縮物を得た。異なる時点でサンプルを採取し、滴定の終点によりウイルス力価を測定した。検出限界に達した時点で、滴定の終点の代わりに大容量プレート法を適用した。

【0096】

赤血球濃縮物中（表５）及び全血中（表６）において、対数減少値が３から５ｌｏｇで、用量依存的にウイルスが不活性化された。この試験は、この方法のウイルス不活性化効率を証明した。

【表5】

【表6】

【0097】

（試験７）
全血レベルでのＵＶＣ照射後の赤血球濃縮物の品質についての添加剤溶液ＵＧ６５と添加剤溶液ＰＡＧＧＳ－Ｍとの比較
２つの全血献血（いずれの場合も約５００ｍＬの全血＋７０ｍＬのＣＰＤ安定剤溶液）をプールし、再び分割した。全血は、上記のようにＵＶＣで照射され、その後に圧搾機による自動成分分離によって「乾燥」赤血球濃縮物（ヘマトクリット＞０．８）を得た。

【0098】

２つの乾燥赤血球濃縮物をプールし、再び分割し、その後に１つを１１０ｍＬの市販の添加剤溶液ＰＡＧＧＳ－Ｍに上記のように懸濁し（コントロール、組成は上記の通り）、１つを１１０ｍＬの新規に開発した添加剤溶液ＵＧ６５に懸濁した（試験）。白血球除去は、従来の白血球除去フィルタによるこれらの赤血球濃縮物のろ過によって行った。その後、赤血球濃縮物（ｎ＝４、試験及びコントロール）を４±２℃で保存し、インビトロ品質を決定するためのサンプルを毎週採取した。同量のＣＰＤを用いた場合、赤血球濃縮物は、本発明に係る添加剤溶液を加えた赤血球濃縮物は、マンニトールを含んでおらず、リン酸水素二ナトリウム及びクエン酸三ナトリウムの含量が、ＣＰＤ及びＰＡＧＧＳ－Ｍを含むものと比較して、本発明に係る赤血球濃縮物は、有意に大きかったという点で、少なくとも各場合においてその組成が異なっていた。

【表7】

【表8】

【0099】

（結果）
製造後、試験及びコントロールの赤血球濃縮物は、体積、ｈｃｔ及び単位当たりのヘモグロビンについて同等の値を示した（表９）。

【表9】

【0100】

赤血球濃縮物の最も重要な品質パラメータである溶血率は、ＵＧ６５中でＵＶＣ照射した全血から得られた赤血球濃縮物では、従来の添加剤溶液ＰＡＧＧ－Ｍ中でＵＶＣ照射した全血から得られた赤血球濃縮物と比較して有意に低かった（図１４）。保存過程において、更なる品質パラメータもコントロール赤血球濃縮物と試験赤血球濃縮物との間で有意差を示した（図１５～１７）。

【0101】

図１４は、ＵＶＣ照射した全血から得られたＥＣを、ＵＧ６５及びＰＡＧＧ－Ｍで保存した際の、保存過程における溶血速度を示す。

【0102】

それぞれ保存終了時（４週目）において、図１５はＡＴＰ含量、図１６はグルコース含量、図１７は乳酸含量を示す。

【0103】

保存過程において、ＵＶＣ照射された全血からの赤血球濃縮物の製造において、新規に開発した添加剤溶液ＵＧ６５の大きな利点が明らかとなった。ＵＧ６５中のＵＶＣ照射された全血からのＥＣの品質は、添加剤溶液ＰＡＧＧＳ－Ｍを用いたものよりも優れている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2023-05-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

赤血球濃縮物を製造する方法であって、
前記赤血球濃縮物はＵＶ照射された赤血球を含み、
前記方法は、
－全血又は希釈された全血にＵＶ放射線を照射し、添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分を添加することにより、前記照射された全血から赤血球濃縮物を得るステップ、
又は
－添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分を含む、赤血球濃縮物又は０．５未満のｈｃｔを有する希釈赤血球濃縮物にＵＶ照射し、前記ＵＶ照射後に０．５以上のｈｃｔに濃縮されるステップ、
又は
－第２の添加剤溶液を含む希釈赤血球濃縮物にＵＶ照射し、前記第２の添加剤溶液は、第２の添加剤溶液を基準として少なくとも７５重量％以上が、ＵＶ照射後に前記添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分と置換されるステップ；を含み、
前記ＵＶ照射は、３００～２００ｎｍの波長で行われ、
選択肢Ａによると、前記添加剤溶液は、水とともに少なくとも以下の成分を含み：
１２～５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
０．１～３．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
１０～９０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
０．１～３ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
１０～８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、及び
１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム、
又は選択肢Ｂによると、前記添加剤溶液の成分は以下の成分を含み：
リン酸水素二ナトリウム、アデニン、Ｄ－グルコース、グアノシン、塩化ナトリウム及びクエン酸三ナトリウム、
前記選択肢Ｂにおける前記成分は、
１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
５～１２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
０．３～１．２ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
０．２５～０．９ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
８～２５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、及び
６～１８ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム
を含む前記赤血球濃縮物を得るための量で用いられる、方法。

【請求項2】

リン酸水素二ナトリウム、アデニン、Ｄ－グルコース、グアノシン、塩化ナトリウム及びクエン酸三ナトリウムの前記添加剤溶液中における濃度がそれぞれ個別に又は同時に以下の通りである、請求項１に記載の方法：
１７～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
１．５～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
４５～５５ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
２０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
１４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２５～３５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【請求項3】

前記添加剤溶液は、前記濃度の前記成分と残部の水とからなる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記添加剤溶液は２２℃の場合に、ｐＨが７以上、好ましくは７．５以上、特に８～９である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記添加剤溶液の浸透圧は、２６０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記添加剤溶液は、マンニトール若しくはソルビトールを含まない、又はマンニトール及びソルビトールの両方を含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記赤血球濃縮物は、
０．４０～０．８０Ｌ／Ｌ、好ましくは０．５０～０．７０Ｌ／Ｌの赤血球と、
０．１０～０．６０Ｌ／Ｌ、好ましくは０．２５～０．５０Ｌ／Ｌの前記添加剤溶液と、を含み、
上記各場合のＬ／Ｌの体積比の合計は１Ｌ／Ｌ以下の数値になる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記赤血球濃縮物は、
０．０００１～０．１Ｌ／Ｌの安定剤溶液、特にＣＰＤ安定剤溶液、及び／又は
０．０００１～０．２Ｌ／Ｌのヒト血漿をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記赤血球濃縮物は、全血の際にＵＶ照射された赤血球を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記赤血球濃縮物は、希釈赤血球濃縮物の際にＵＶ照射された赤血球を含み、
前記希釈赤血球濃縮物は、好ましくは０．５未満のｈｃｔを有し、ＵＶ照射後に濃縮される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記赤血球濃縮物は、０．４～０．８、特に０．５～０．７のｈｃｔを有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記赤血球濃縮物は、マンニトール若しくはソルビトールを含まない、又はマンニトール及びソルビトールの両方を含まない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記赤血球濃縮物は、選択肢Ａとして、
１０～３０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１４～２６ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコースと、
５～１２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に６～１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウムと、
０．３～１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．５～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのアデニンと、
０．２５～０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．４～０．７ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシンと、
８～２５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１１～２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、
６～１８ｍｍｏｌ／Ｌ、特に８～１６ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウムと、
任意に、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウムと、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸とを含む、
又は、選択肢Ｂとして、
１４～２６ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコースと、
６～１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウムと、
０．５～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのアデニンと、
０．４～０．７ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシンと、
１１～２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、
８～１６ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウムと、
任意に、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウムと、
０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、特に０．０２～０．８ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸とを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記赤血球濃縮物は、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ未満、特に０．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満のリン酸二水素ナトリウムを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

－前記添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分を含む赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、赤血球濃縮物は、ｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮されるステップ；
又は
－第２の添加剤溶液を含む希釈赤血球濃縮物をＵＶ照射し、ここで、希釈赤血球濃縮物は、ｈｃｔが０．５未満の希釈赤血球濃縮物であり、ＵＶ照射後にｈｃｔが０．５以上に濃縮され、
ここで、第２の添加剤溶液は、第２の添加剤溶液を基準として、少なくとも７５重量％以上、好ましくは完全に、ＵＶ照射後に前記添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分と置換されるステップ；を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＵＶ照射は、２８０～２２０ｎｍ、好ましくは２６０～２４０ｎｍの波長で行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記添加剤溶液又は該添加剤溶液の成分は、０．５以上のｈｃｔを有する前記赤血球濃縮物に添加される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

ＵＶ照射された赤血球を含む赤血球濃縮物を保存するための添加剤溶液の使用であって、
前記添加剤溶液は、水とともに少なくとも以下の成分を含む、使用：
１２～５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
０．１～３．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
１０～９０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
０．１～３ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
１０～８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、及び
１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【請求項19】

前記リン酸水素二ナトリウム、アデニン、Ｄ－グルコース、グアノシン、塩化ナトリウム及びクエン酸三ナトリウムの濃度がそれぞれ個別に又は同時に以下の通りである、請求項１８に記載の使用：
１７～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム、
１．５～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのアデニン、
４５～５５ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコース、
１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌのグアノシン、
２０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、
１４～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に２５～３５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム。

【請求項20】

前記添加剤溶液は、前記濃度の前記成分と残部の水とからなる、請求項１８又は１９に記載の使用。

【請求項21】

前記添加剤溶液は、２２℃の場合に、ｐＨが７以上、好ましくは７．５以上、特に８～９である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の使用。

【請求項22】

前記添加剤溶液の浸透圧は、２６０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項23】

前記添加剤溶液は、マンニトール若しくはソルビトールを含まない、又はマンニトール及びソルビトールの両方を含まない、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項24】

前記添加剤溶液は、水による前記添加剤溶液の希釈液、又は前記添加剤溶液の濃縮液である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の使用。

【国際調査報告】