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特表2024-528038調節性Ｔ細胞を標的として自己免疫疾患を処置するための滑膜細胞外マトリックス特異的キメラ抗原受容体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】調節性Ｔ細胞を標的として自己免疫疾患を処置するための滑膜細胞外マトリックス特異的キメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240719BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240719BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240719BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240719BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240719BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240719BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240719BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240719BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240719BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240719BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240719BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/705 ZNA
C12N15/115
C07K16/18
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
C12N5/0783
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P37/02
A61P29/00
A61K35/17
A61K45/00
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505229
(86)(22)【出願日】2022-07-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-25
(86)【国際出願番号】 US2022074321
(87)【国際公開番号】W WO2023010122
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】63/227,320
(32)【優先日】2021-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/339,361
(32)【優先日】2022-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524035955
【氏名又は名称】ソノマ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】524035966
【氏名又は名称】キュララ アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マッセイ， ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ファン デル ヴルスト デ フリース， アンネ－レネー
(72)【発明者】
【氏名】バイルケ， ジョシュア
(72)【発明者】
【氏名】マルムストローム， ヴィヴィアン
(72)【発明者】
【氏名】フーパー， キャスリン
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン， レベッカ
(72)【発明者】
【氏名】クラレスコッグ， ラース
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA96
4C084ZB07
4C084ZB11
4C084ZB15
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB11
4C087ZB15
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
シトルリン化ポリペプチドを認識する抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を本明細書において開示する。シトルリン化ポリペプチド、例えば、シトルリン化ビメンチン、フィブリノゲン、およびフィラグリンは、関節リウマチを有する対象の滑膜に発現する。さらに、このようなＣＡＲを発現するＴ細胞、特に、Ｔｒｅｇ細胞を開示する。このようなＣＡＲ－Ｔ細胞の投与は、関節リウマチだけでなくシトルリン化ペプチドと関連する他の疾患の処置において有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合ドメインが、３つまたはこれよりも多い異なるシトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片に特異的に結合する、ＣＡＲ。
【請求項2】
前記抗原結合ドメインが、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、および（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲンの３つすべて、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片に結合する、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項3】
前記抗原結合ドメインが、シトルリン化テネイシンＣにさらに結合する、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項4】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、（ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
（ｉｉ）標的結合ドメインの前記ＶＬドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項5】
前記細胞内シグナリングドメインが、ＣＤ３ゼータに由来する、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項6】
少なくとも１つの前記共刺激ドメインが、ＦｃｅＲ１ｇ、Ｆｃｇ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ－２８ハイブリッド、ＤＡＰ１０、ＣＤ２７、２Ｂ４、およびこれらの組合せからなる群のメンバーの共刺激（ｃｏｓ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインを含み、必要に応じて、少なくとも１つの前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項7】
前記抗原結合ドメインが、抗体、抗体断片、ラクダ類ナノボディ、重鎖のみの抗体またはアプタマーを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項8】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項9】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメインまたはＣＤ２８ヒンジドメインである、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項10】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項11】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８シグナルペプチドまたはＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドである、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項12】
抗原特異的結合ドメインが、一本鎖断片を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項13】
前記一本鎖断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項14】
前記ｓｃＦｖ断片が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、および
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項15】
前記ｓｃＦｖ断片が、（ａ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
ＨＬＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＤＴＴＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＲＧＮＴＨＹＮＳＳＬＲＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＲＦＳＬＫＶＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）から選択されるＶＨ、および
（ｂ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＬＡＰＧＥＴＡＴＩＴＣＧＧＤＤＩＥＮＱＮＶＮＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＭＬＬＩＦＦＤＴＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＲＳＥＤＴＡＮＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＤＡＤＹＦＣＱＶＹＤＲＫＴＤＨＱＶＦＧＰＧＴＴＶＴＶＬ（配列番号３）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＱＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号４）
から選択されるＶＬ
を含む、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項16】
前記ＶＨ－ＶＬ断片が、（ｉ）ＧＧＧＳ×３（配列番号２０）、（ｉｉ）Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８（配列番号２１）、および（ｉｉｉ）ＡＢ Ｐｕｒ（配列番号２２）からなる群から選択されるリンカーにより接合されている、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項17】
前記ｓｃＦｖが、（ａ）配列番号５のＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳ×３リンカー、または
（ｂ）配列番号６のＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８リンカー、または
（ｃ）配列番号７のＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー
のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＣＡＲ。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸。
【請求項19】
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項20】
前記ＶＨが、配列番号８または配列番号９を含む核酸配列によりコードされ、前記ＶＬが、配列番号１０または配列番号１１を含む核酸配列によりコードされる、請求項１８に記載の核酸。
【請求項21】
前記ＶＨおよびＶＬ断片が、リンカーにより接合されており、配列番号１２、または（ｉｉ）配列番号１３、または（ｉｉｉ）配列番号１４の核酸配列を含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項22】
請求項２１に記載の核酸配列に作動的に連結する発現制御配列を含む発現ベクター。
【請求項23】
前記発現制御配列が調節領域を含み、前記調節領域が、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化、シグナル、ならびにイントロンからなる群から選択される、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項24】
アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはプラスミドである、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項25】
請求項２４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項26】
請求項１～１７のいずれかに記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾した修飾Ｔ細胞。
【請求項27】
哺乳動物Ｔ細胞である、請求項２６に記載の修飾Ｔ細胞。
【請求項28】
Ｔｒｅｇ細胞である、請求項２７に記載の修飾Ｔ細胞。
【請求項29】
ヒトＴ細胞である、請求項２８に記載の修飾Ｔ細胞。
【請求項30】
初代Ｔ細胞である、請求項２９に記載の修飾Ｔ細胞。
【請求項31】
ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、およびＣＤ１２７ｌｏである、請求項３０に記載の修飾Ｔ細胞。
【請求項32】
請求項３１に記載の修飾Ｔ細胞の複数および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項33】
関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、有効量の、請求項３２に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項34】
前記対象がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記医薬組成物を前記対象の滑膜に投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記医薬組成物を静脈内に投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、（ａ）前記対象から得られる生体試料からＴ細胞を単離するステップと、
（ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について前記Ｔ細胞を富化するステップと、
（ｃ）富化した前記Ｔｒｅｇ細胞に、請求項１～１７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする発現ベクターをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）トランスフェクトした前記Ｔｒｅｇ細胞を増大させるステップと、
（ｅ）増大させた前記Ｔｒｅｇ細胞を前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項38】
前記増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用することを含まない、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記トランスフェクションが、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、熱ショック、バクテリオファージ、超音波処理、またはリン酸カルシウムの使用により行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
１つまたは複数の抗炎症剤および／または治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
前記抗炎症剤が、炎症性サイトカインを阻害する抗体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記抗炎症剤が、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ－６抗体、またはこれらの組合せである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
請求項３２に記載の医薬組成物を含み、流体導管を介してドリップチャンバーと連通する容器を含むキットであって、前記ドリップチャンバーが、流体導管を介して静脈内注射針と連通する、キット。
【請求項45】
前記容器がバッグを含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項46】
前記容器と前記針との間の前記流体導管が、１つまたは複数のＹ部位とローラークランプとを含む、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願では、２０２１年７月２９日出願の米国特許仮出願第６３／２２７，３２０号、および２０２２年５月６日出願の米国特許仮出願第６３／３３９，３６１号の利点を主張し、それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願では、２０２１年７月２９日出願の米国特許仮出願第６３／２２７，３２０号、および２０２２年５月６日出願の米国特許仮出願第６３／３３９，３６１号の利点を主張し、それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
電子配列表の参照
電子配列表（２３７７５２０００３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ；サイズ：５０，８４３バイト；および作成日：２０２２年７月２８日）の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
電子配列表（２３７７５２０００３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ；サイズ：５０，８４３バイト；および作成日：２０２２年７月２８日）の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【0003】
分野
本開示は、自己免疫疾患を処置するための、シトルリン化抗原に反応性のキメラ抗原受容体およびこの受容体を発現する調節性Ｔ細胞に関する。
本開示は、自己免疫疾患を処置するための、シトルリン化抗原に反応性のキメラ抗原受容体およびこの受容体を発現する調節性Ｔ細胞に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
自己免疫疾患は、相当数の人に影響を与えている。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は、末梢関節を標的とする慢性炎症性疾患であり、骨侵食、運動障害、および生活の質の低下を引き起こす。世界人口の０．５～１％に影響を与えており、発生率は上昇し続けている。ＲＡの病因は主に滑膜関節に局在し、ここでＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞で構成される免疫細胞が、滑膜に浸潤する。その上、滑膜のサブライニング層に存在する線維芽細胞様滑膜細胞が増殖して、軟骨損傷の要因となる。
自己免疫疾患は、相当数の人に影響を与えている。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は、末梢関節を標的とする慢性炎症性疾患であり、骨侵食、運動障害、および生活の質の低下を引き起こす。世界人口の０．５～１％に影響を与えており、発生率は上昇し続けている。ＲＡの病因は主に滑膜関節に局在し、ここでＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞で構成される免疫細胞が、滑膜に浸潤する。その上、滑膜のサブライニング層に存在する線維芽細胞様滑膜細胞が増殖して、軟骨損傷の要因となる。
【0005】
関節リウマチにおける滑膜過形成によって、免疫細胞による滑膜の浸潤と、引き続く軟骨損傷および骨侵食とが生じる。
【0006】
現在、ＲＡならびに他の多くの自己免疫状態の治療法は存在しない。ＲＡを有する患者には、生涯にわたる処置が通常、必要とされ、これは極めて高価であることに加えて、長期的にみて重度の副作用、例えば、感染症および関節リウマチのリスクをもたらし得る。
【0007】
本明細書に組み込み、本明細書の一部を形成する添付の図面は、例となる実施形態を例示し、本記載とともに、当業者がこのような実施形態および当業者に明らかなその他の実施形態を作製および使用できるようにするのにさらに役立つ。本発明は、次の図面と組み合わせてさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ＭＮＤプロモーターおよびＥＧＦＲｔ骨格を含む最初のデータにより、ＣＶ ＣＡＲであるＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇが、プレート結合完全長ＣＶに最も強力に応答したことが示された（ｎ＝２）。
【0009】
【図2】可溶性完全長ＣＶを用いたアッセイにより、ＣＶ ＣＡＲであるＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇ－ＨＬに対してのみ用量応答が示された（ｎ＝１）。
【0010】
【0011】
【図4】ＭＮＤ－ＳＢＴ０１Ｇが、可溶性ＣＶではなくプレート結合ＣＶ、抗体捕捉ＣＶに対してＭＮＤ－ＢＶＣＡ１よりも強力な応答を示す。
【0012】
【図5-1】Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈからの滑液の初回ロットの検査により、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりも強力な応答をもたらすことが示された。
【図5-2】Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈからの滑液の初回ロットの検査により、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりも強力な応答をもたらすことが示された。
【0013】
【図6-1】スウェーデン人患者由来の滑液試料１５個のさらなる検査により、応答がもたらされた試料では、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりも強力であることが示された。
【図6-2】スウェーデン人患者由来の滑液試料１５個のさらなる検査により、応答がもたらされた試料では、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりも強力であることが示された。
【0014】
【図7】滑液（ＳＦ）に対する初代Ｔｒｅｇ応答により、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりもＲＡ患者由来のＳＦに対してより感受性であることが実証される。
【0015】
【図8】ＢＶＣＡ１ではなくＳＢＴ０１Ｇは、プレート結合完全長ＰＡＤ２シトルリン化フィブリノゲンに対しても応答可能である。
【0016】
【図9】エフェクターおよびＴｒｅｇとしてのＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲはシトルリン化フィブリノゲンに対して応答するが、ＢＶＣＡ１は応答しない。
【0017】
【図10-1】ＥＦ１ＡおよびＭＮＤの両プロモーターにより、可溶性ビーズ結合ペプチドに対するＣＶ ＣＡＲによる機能的応答が実証される。したがって、ＣＡＲプロモーターは、Ｔｒｅｇ表現型に影響しない。
【図10-2】ＥＦ１ＡおよびＭＮＤの両プロモーターにより、可溶性ビーズ結合ペプチドに対するＣＶ ＣＡＲによる機能的応答が実証される。したがって、ＣＡＲプロモーターは、Ｔｒｅｇ表現型に影響しない。
【図10-3】ＥＦ１ＡおよびＭＮＤの両プロモーターにより、可溶性ビーズ結合ペプチドに対するＣＶ ＣＡＲによる機能的応答が実証される。したがって、ＣＡＲプロモーターは、Ｔｒｅｇ表現型に影響しない。
【図10-4】ＥＦ１ＡおよびＭＮＤの両プロモーターにより、可溶性ビーズ結合ペプチドに対するＣＶ ＣＡＲによる機能的応答が実証される。したがって、ＣＡＲプロモーターは、Ｔｒｅｇ表現型に影響しない。
【0018】
【図11】ｓｃＦｖリンカーは、ＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲに基づく機能にほとんど影響しないかまったく影響しない。
【0019】
【図12-1】ＳＢＴ０１Ｇが、ＢＶＣＡ１よりも高いパーセンテージの細胞により発現するが、ＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓの類似するプロファイルを有する。
【図12-2】ＳＢＴ０１Ｇが、ＢＶＣＡ１よりも高いパーセンテージの細胞により発現するが、ＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓの類似するプロファイルを有する。
【図12-3】ＳＢＴ０１Ｇが、ＢＶＣＡ１よりも高いパーセンテージの細胞により発現するが、ＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓの類似するプロファイルを有する。
【0020】
【図13】非形質導入Ｔｒｅｇ細胞ではなくＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞（ＳＢＴ０１Ｇ）が、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）により活性化される。活性化が、増殖、ＣＤ７１発現、およびＩＬ－１０分泌の標的抗原特異的増加により実証された。
【0021】
【図14-1】ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞が、大多数のＲＡ患者由来の滑液中のシトルリン化タンパク質に応答する。対照的に、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞は、正常対照（ＲＡを有しない対象）由来の滑液に応答しない。
【図14-2】ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞が、大多数のＲＡ患者由来の滑液中のシトルリン化タンパク質に応答する。対照的に、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞は、正常対照（ＲＡを有しない対象）由来の滑液に応答しない。
【0022】
【図15】ドナー２名由来の非形質導入Ｔｒｅｇ細胞ではなくＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞（ＳＢＴ０１Ｇ）が、ＲＡ患者由来の滑液により特異的に活性化される。
【0023】
【0024】
【図17】リポ多糖（ＬＰＳ）誘発肺炎症マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞活性化のタイムラインを示す。簡潔には、０日目にヒトＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞を静脈内に（ＩＶ）投与し、ヒトＩＬ－２を腹腔内に（ＩＰ）毎日２回投与し、０、１、６、および１２日目にＬＰＳを鼻腔内に（ＩＮ）投与した。１３日目にマウスを屠殺し、臓器を回収してＴｒｅｇ細胞の解析を容易とした。
【0025】
【0026】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0027】
概要
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＲＡの患者およびマウスモデルにおいて欠損している。したがって、Ｔｒｅｇに基づく養子細胞療法（ＡＣＴ）は、ＲＡにおいて有望な手法となっている。実際、Ｔｒｅｇに基づくＡＣＴにより、ＲＡの動物モデルにおいて疾患が回復する。この研究では、ＲＡ患者から単離した抗体を使用して、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）および罹患関節の滑膜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に豊富かつほとんど独占的に見出される他の翻訳後修飾タンパク質に特異的なＣＡＲを操作した。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＲＡの患者およびマウスモデルにおいて欠損している。したがって、Ｔｒｅｇに基づく養子細胞療法（ＡＣＴ）は、ＲＡにおいて有望な手法となっている。実際、Ｔｒｅｇに基づくＡＣＴにより、ＲＡの動物モデルにおいて疾患が回復する。この研究では、ＲＡ患者から単離した抗体を使用して、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）および罹患関節の滑膜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に豊富かつほとんど独占的に見出される他の翻訳後修飾タンパク質に特異的なＣＡＲを操作した。
【0028】
自己免疫疾患と関連する抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書において開示する。特に、ＣＡＲは、翻訳後修飾抗原に特異的であり得る。特に、ＣＡＲは、ビメンチン、シトルリン化フィラグリン、およびシトルリン化フィブリノゲンを含むシトルリン化ポリペプチドに対する結合に特異的であり得る。
【0029】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者における炎症関節の細胞外マトリックス内に発現する翻訳後修飾タンパク質、すなわち、シトルリン化ビメンチン、シトルリン化フィラグリン、およびシトルリン化フィブリノゲンを特異的に標的とするように改変した。一部の実施形態では、ＣＡＲの一本鎖断片の可変（ｓｃＦｖ）部分を、ＲＡ患者の末梢血から単離したシトルリン化タンパク質に高度に特異的な抗体から得る。一実施形態では、特異的ｓｃＦｖ鎖を第２世代ＣＡＲ構築物に挿入した。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ鎖を、レンチウイルスベクターにクローニングしたＣＡＲ構築物に挿入した。詳細な説明では、抗体への参照は、文脈上他に指示しない限り本開示のＣＡＲの抗原結合ドメインに適用可能である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
詳細な説明
Ｉ．定義
他に特定しない限り、生物化学、核酸化学、分子生物学、発生生物学および分子遺伝学的用語および記号は、当技術分野における標準的約定およびテキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）；Ａｌｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， ２００６）；Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）；Ｇａｉｔｓ， ｅｄ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８４）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ｅｄ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）等によるものに従う。
Ｉ．定義
他に特定しない限り、生物化学、核酸化学、分子生物学、発生生物学および分子遺伝学的用語および記号は、当技術分野における標準的約定およびテキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）；Ａｌｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， ２００６）；Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）；Ｇａｉｔｓ， ｅｄ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８４）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ｅｄ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）等によるものに従う。
【0031】
本明細書において使用する場合、「抗原」、「免疫源」、および「抗体標的」という用語は、抗体により認識される、すなわち、抗体が結合可能な、分子、化合物、または複合体を指す。この用語は、抗体が認識可能な任意の分子、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、化学的部分、またはこれらの組合せ（例えば、リン酸化またはグリコシル化ポリペプチド等）を指し得る。この用語が、いかなる文脈においても分子が免疫原性であることを示さず、分子が抗体に標的とされ得ることを単に示すことを当業者は理解する。
【0032】
本明細書において使用する場合、「エピトープ」という用語は、抗体が認識して結合する抗原上の限局的部位を指す。エピトープは、少数のアミノ酸または少数のアミノ酸の部分、例えば、５もしくは６個またはこれよりも多く、例えば、２０個またはこれよりも多くのアミノ酸、あるいはこのようなアミノ酸の部分を含み得る。一部の場合では、エピトープは、例えば、炭水化物、核酸、または脂質由来の非タンパク質成分を含む。一部の場合では、エピトープは、３次元部分である。したがって、例えば、標的がタンパク質である場合、エピトープは、連続的アミノ酸、またはタンパク質フォールディングにより近接したタンパク質の種々の部分由来のアミノ酸（例えば、非連続的エピトープ）で構成され得る。
【0033】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合および認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。典型的には「可変領域」は、抗体の抗原結合領域（またはこの機能性等価物）を含み、結合の特異性および親和性において最も重要である。例となる免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一の対となるポリペプチド鎖で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。
【0034】
抗体は、（ｉ）重鎖定常ドメインの同一性に基づく５種の免疫グロブリン主要クラスであるアルファ（ＩｇＡ）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）、ガンマ（ＩｇＧ）およびミュー（ＩｇＭ）のいずれか、または（ｉｉ）これらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の抗体であり得る。軽鎖は、ラムダまたはカッパのいずれかであり得る。
【0035】
次は、種々の抗体型の非包括的一覧であり、すべて抗原結合活性を保持する：
（１）全免疫グロブリン（「インタクト」抗体とも呼ぶ）（２つの軽鎖および２つの重鎖、例えば、四量体）、
（２）免疫グロブリンポリペプチド（軽鎖または重鎖）、
（３）抗体断片、例えば、Ｆｖ（一価または二価の可変領域断片および、可変領域（例えば、ＶＬおよび／またはＶＨ）のみを包含し得る、Ｆａｂ（ＶＬＣＬ ＶＨＣＨ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ＶＬＶＨ）、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）（リンカー、例えば、ペプチドリンカーにより接合されたＶＬおよびＶＨを含むポリペプチド）、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃ（ＦＶ）２）、ダイアボディ（小型のペプチドリンカーにより繋がれている重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）領域からなる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の非共有結合二量体）、トリアボディは、三価のｓｃ（Ｆｖ）３または三特異性ｓｃ（Ｆｖ）３である、
（４）多価抗体（２つの異なるエピトープまたはタンパク質に結合する結合領域を含む抗体、例えば、「スコーピオン」抗体）、
（５）別のアミノ酸配列に融合する免疫グロブリン結合部分を含む融合タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）、ならびに
（６）２つの重鎖のみを有し、通常、抗体に見出される２つの軽鎖を欠く、重鎖のみの抗体または抗体断片。
（１）全免疫グロブリン（「インタクト」抗体とも呼ぶ）（２つの軽鎖および２つの重鎖、例えば、四量体）、
（２）免疫グロブリンポリペプチド（軽鎖または重鎖）、
（３）抗体断片、例えば、Ｆｖ（一価または二価の可変領域断片および、可変領域（例えば、ＶＬおよび／またはＶＨ）のみを包含し得る、Ｆａｂ（ＶＬＣＬ ＶＨＣＨ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ＶＬＶＨ）、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）（リンカー、例えば、ペプチドリンカーにより接合されたＶＬおよびＶＨを含むポリペプチド）、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃ（ＦＶ）２）、ダイアボディ（小型のペプチドリンカーにより繋がれている重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）領域からなる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の非共有結合二量体）、トリアボディは、三価のｓｃ（Ｆｖ）３または三特異性ｓｃ（Ｆｖ）３である、
（４）多価抗体（２つの異なるエピトープまたはタンパク質に結合する結合領域を含む抗体、例えば、「スコーピオン」抗体）、
（５）別のアミノ酸配列に融合する免疫グロブリン結合部分を含む融合タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）、ならびに
（６）２つの重鎖のみを有し、通常、抗体に見出される２つの軽鎖を欠く、重鎖のみの抗体または抗体断片。
【0036】
タンデムｓｃＦｖおよびダイアボディの生成および特性は、例えば、Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８６：１８１２；Ｋｅｎａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌ ２３：７８９；Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌ ２１：５９７に記載されている。
【0037】
「ＣＤＲ配列セット」という句は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載の特定の抗体の３つの重鎖および／または３つの軽鎖のＣＤＲを指す。「軽鎖」ＣＤＲ配列セットは、軽鎖ＣＤＲ配列を指す。「重鎖」ＣＤＲ配列セットは、重鎖ＣＤＲ配列を指す。「完全」ＣＤＲ配列セットは、重鎖および軽鎖の両ＣＤＲ配列を指す。ＣＤＲは、ＩＭＧＴ配列のアラインメントに基づいて予測する。
【0038】
本明細書において使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、２つまたはこれよりも多くの種に由来するアミノ酸配列を有する抗体を指す。一実施形態では、軽および重の両鎖の可変領域は、所望の特異性、親和性および能力を有する、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）のある種に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、免疫応答の誘発を回避するために、別の種に由来する配列に対して相同である（ａｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（典型的には、治療を受けている対象、例えば、ヒトにおいて）。
【0039】
本明細書において使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬ領域から得られたＣＤＲを、ヒトフレームワーク配列に移植したキメラ抗体を指す。一実施形態では、ヒト化抗体のフレームワーク残基は、抗体の特異性、親和性および能力を改良および最適化するように修飾する。ヒト化、すなわち、ヒト抗体の対応する配列に代えての非ヒトＣＤＲ配列の置換は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７ （１９８８）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３ （１９９２）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－１３ （１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－５１ （１９９６）に記載の方法に従って実施することができる。
【0040】
本明細書において使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトが生成した抗体または当技術分野において公知の任意の技術により作製されたこれに対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。
【0041】
結合の特異性は、その環境における抗体および他の物質または一般的非関連分子に関する解離定数（Ｋｄ）と比較した場合の、標的に対する抗体（または他の標的部分）の比較解離定数に関して定義することができる。Ｋｄが大きい（高い）場合、Ｋｄにより親和性相互作用が低いことが説明される。逆にＫｄが小さい（低い）場合、Ｋｄにより、親和性相互作用が高いかまたは結合が強力であることが説明される。単なる例としては、標的に特異的に結合する抗体のＫｄは、フェムトモル濃度、ピコモル濃度、ナノモル濃度、またはマイクロモル濃度であってもよく、非関連物質に結合する抗体のＫｄは、ミリモル濃度またはこれよりも大きいことがある。結合親和性は、マイクロモル濃度範囲（ｋＤ＝１０－４～１０－６）、ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌｅ）範囲（ｋＤ＝１０－７Ｍ～１０－９Ｍ）、ピコモル（ｐｉｃｏｍｏｌｅ）範囲（ｋＤ＝１０－１０Ｍ～１０－１２Ｍ）、またはフェムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ）範囲（ｋＤ＝１０－１３Ｍ～１０－１５Ｍ）内であり得る。
【0042】
本明細書において使用する場合、抗体は、１０－４Ｍ未満（すなわち、マイクロモル濃度範囲内）のＫｄで抗原またはエピトープに結合するとき、抗原またはエピトープを「結合」または「認識」する。細胞型に関して「結合する」という用語（例えば、がん細胞に結合する抗体）は典型的に、薬剤が、そのような細胞の純粋集団において細胞の大多数に結合することを示す。例えば、所与の細胞型に結合する抗体は典型的に、指定された細胞の集団において細胞の少なくとも２／３（例えば、６７、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）に結合する。一部の場合では、ポリペプチドを提示する細胞に対する抗体の結合を、ポリペプチドを発現しない細胞に対する抗体の結合（またはこの欠如）と比較することにより、ポリペプチドに対する結合をアッセイすることができる。当業者は、結合を決定する方法および／または閾値に応じて一部の可変性が生じることを認識する。標的に対する抗体の親和性は、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ｅｄ． ２００９）に概説されている方法に従って決定することができる。
【0043】
本明細書において使用する場合、「よりも大きい親和性」という用語は、本明細書において使用するとき、抗体結合の相対的程度を指し、この場合、抗体Ｘは標的Ｙに対して、標的Ｚに対する場合よりも強力に（Ｋｏｎ）および／または小さい解離定数で（Ｋｏｆｆ）結合し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して、Ｚに対するよりもより大きい親和性を有する。同様に、「より小さい親和性」という用語は、本明細書において、抗体結合の程度を指し、この場合、抗体Ｘは標的Ｙに対して、標的Ｚに対する場合ほど強力ではなく、かつ／または標的Ｚに対する場合よりも大きい解離定数で結合し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して、Ｚに対する場合より小さい親和性を有する。抗体とその標的抗原との結合親和性は、ＫＡ＝１／ＫＤとして表すことができ、この場合、ＫＤはｋｏｎ／ｋｏｆｆと等しい。ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値は、表面プラズモン共鳴技術を使用し、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定することができる。アンタゴニストまたは遮断抗体は、抗体が存在しない場合、標的抗原と関連する生物学的活性を、類似の生理学的条件下の活性と比較して部分的または完全に遮断、阻害または中和する抗体である。アンタゴニストは、競合性、非競合性または不可逆性であり得る。競合性アンタゴニストは、天然のリガンド－受容体相互作用として、同一部位で天然のリガンドまたは受容体に結合するか、または正常な結合を妨げる変化を誘導するようにアロステリックに結合する物質である。非競合性アンタゴニストは、天然リガンド－受容体相互作用とは異なる部位に結合するが、この相互作用から低いＫＤまたはシグナルが生じる。不可逆性阻害剤は、受容体に共有結合的修飾が生じて、引き続く任意の結合を妨げる。
【0044】
本明細書において使用する場合、「アビディティ」という用語は、抗体と標的抗原との結合複合体の全体的安定性を指す。これは、３つの因子、（ｉ）抗原に対する抗体の内因的親和性、（２）抗体の結合価、および（３）相互作用する成分の幾何学的配置により決定される。親和性は、抗体と単一の標的との相互作用の強度であり、一方、アビディティは、複数の親和性の累積強度である。一実施形態では、本明細書において提供する抗体は、二価である。
【0045】
本明細書において使用する場合、抗体は、それが第２の抗原に結合する場合の親和性よりも大きい親和性で第１の抗原に結合する場合、第２の抗原と比較して第１の抗原に「優先的に結合する」結合する。優先的結合は、２倍、５倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍大きい親和性の少なくともいずれかであり得る。
【0046】
本明細書において使用する場合、抗体は、１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍの少なくともいずれかの親和性で標的抗原または抗原の標的群の各メンバーに結合し、例えば、比較する非標的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で標的抗原または抗原の標的群の各メンバーに結合するとき、標的抗原または抗原の標的群「に特異的に結合する」かまたは「に特異的」である。典型的には、特異的結合は、抗体が、抗原もしくはエピトープを検出するための診断薬として、および／または抗原もしくはエピトープの標的化における治療剤として有用であるのに十分な親和性で抗原に結合することにより特徴付けられる。
【0047】
本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により繋がれている天然および／または非天然のアミノ酸の配列を有する分子を指す。「ペプチド」という用語は、短いポリペプチドを指し、典型的には、アミノ酸３０個以下の長さである。ポリペプチドのアミノ酸配列は、「一次構造」と呼ぶ。「タンパク質」という用語は、二次、三次および／または四次構造を有し、例えば、二次構造および１つより多くのタンパク質で形成される構造の間の相関である、水素結合により安定化した構造を有するポリペプチドを指す。タンパク質は、他の結合部分、例えば、炭水化物（糖タンパク質）、脂質（リポタンパク質）、リン酸基（リンタンパク質）等によりさらに修飾することができる。
【0048】
本明細書において使用する場合、アミノ酸配列は、その配列内のアミノ酸のみ「からなる」。
【0049】
本明細書において使用する場合、第１のアミノ酸配列が、（１）第２のアミノ酸配列を含み、（２）第２のアミノ酸配列よりもアミノ酸１個以下、アミノ酸２個以下またはアミノ酸３個以下の長さである場合、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【0050】
本明細書において使用する場合、第２のアミノ酸配列が第１のアミノ酸配列を含む場合、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列の「断片」である。ある特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列の断片である第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列よりもアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のいずれか以下少ないアミノ酸を有し得る。
【0051】
本明細書において使用する場合、参照アミノ酸配列の「機能性等価物」は、参照配列と同一ではないが、例えば、１つまたはいくつかのアミノ酸の挿入、欠失または置換のような軽微な変更を含む配列である。機能性等価配列は、等価な参照配列の機能（例えば、免疫原性）を保持する。参照配列に関して機能的に等価なアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む場合、これらは一般に保存的アミノ酸置換であり得る。
【0052】
本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質の所望の特性を消失させることなく、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えるものである。適する保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、およびＲ鎖長を有するアミノ酸を互いに対して置換することにより成し得る。例えば、Ｗａｔｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，” ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８７， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ， ｐ． ２２４を参照されたい。保存的アミノ酸置換の例としては、次が挙げられる（一部のカテゴリーは相互排他的ではないことに注意されたい）。
【表1】
【0053】
本明細書において使用する場合、「実質的に同一」という用語は、ｉ）第２のアミノ酸配列のアラインメントしたアミノ酸残基と同一であるか、またはｉｉ）第２のアミノ酸配列のアラインメントしたアミノ酸残基の保存的置換となるのに十分な数または最小数のアミノ酸残基を含み、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性および／または共通の免疫原性を有するような、第１のアミノ酸配列との同一性を指す。例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインまたは抗原ドメインを含むアミノ酸配列は、十分にまたは実質的に同一であると称する。ヌクレオチド配列の文脈では、「実質的に同一」という用語は、第２の核酸配列のアラインメントしたヌクレオチドと同一である十分な数または最小数のヌクレオチドを含む第１の核酸配列を指すために本明細書において使用され、ただし、第１および第２のヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインまたは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするか、または同一の免疫原性特性を有するポリペプチドをコードする。
【0054】
本明細書において使用する場合、化学的実体、例えば、ポリペプチドは、組成物中のその種（例えば、ポリペプチド）のうちの優勢な化学的実体である場合、「実質的に純粋」であるか、または「単離」されている。これは、組成物中のその種の化学的実体の５０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、９８％を超えるか、９９％を超えるか、９９．５％を超えるか、９９．９％を超えるか、または９９．９９％を超える化学的実体を含む。実質的に精製した画分は、対象種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物である。一般には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する高分子種の約８０％～９０％またはこれよりも多くが、精製した目的の種であることを意味する。組成物が単一の高分子種から本質的になる場合、対象種は、本質的に均一となる（従来の検出方法により組成物中に夾雑種が検出不可能である）まで精製する。溶媒種、低分子、安定剤（例えば、ＢＳＡ）、および元素イオン種は、この定義の目的では高分子種であるとは考えない。
【0055】
「単離抗体」という句は、抗体を産生した源、例えば、動物、ハイブリドーマまたは他の細胞株（例えば、抗体を産生する昆虫、酵母または細菌の組換え細胞）から取り出した、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成抗体を指す。
【0056】
「配列同一性」という用語は、本明細書において使用する場合、２つのポリペプチド配列間または２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適な比較目的で配列をアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸の配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置として同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドが占有する場合、その位置の分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置数の関数である（すなわち、％同一性＝同一のオーバーラップする位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同一の長さである。また、２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムであり、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：５８７３－５８７７のように改変された。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムのパラメーター設定、例えば、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２により実施して、本出願の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、例えば、ｓｃｏｒｅ－５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３に設定したＸＢＬＡＳＴプログラムのパラメーターを用いて実施して、本明細書に記載のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップを導入したアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２に記載のようにギャップを導入したＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して、反復検索を実施し、これにより分子間の距離関係を検出することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップを導入したＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔのプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非制限的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用することができる。２つの配列間のパーセント同一性は、上記に類似の技術を使用してギャップ許容の有無により決定することができる。パーセント同一性の算出では、典型的には、完全一致のみを計数する。
【0057】
抗体では、抗体配列をＩＭＧＴにより最大限にアラインメントした場合、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アラインメント後、対象抗体領域（例えば、重または軽鎖の成熟可変領域全体）を参照抗体の同一領域と比較する場合、対象と参照抗体領域とのパーセンテージ配列同一性は、対象および参照抗体の両領域の同一アミノ酸が占有する位置の数を、２つの領域のアラインメントした位置の総数で割り、１００を掛けてパーセンテージに変換した数である。
【0058】
また、パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２を使用して決定し得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９９７））。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．から入手し得る。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２では、いくつかの検索パラメーターを使用し、この場合、このような検索パラメーターはすべて、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ－ｐａｓｓ ｅ－ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ－ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ ｆｏｒ ｆｉｎａｌ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含むデフォルト値に設定する。
【0059】
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２を利用する状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに比しての、それとの、または、それに対しての％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに比しての、それとの、または、それに対してのある特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたはこれを含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現可能）は、次のように算出する：１００×（Ｘ／Ｙ）。式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２によるＡおよびＢのプログラムアラインメントから完全な一致として点数化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解される。「核酸配列」という用語は、本明細書において使用する場合、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）連結からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を指し、ｃＤＮＡを含む。また、この用語は、修飾または置換した配列を含み、天然には存在しない単量体またはこの部分を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、天然に存在する塩基を含み得る。また、配列は、修飾した塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、アザおよびデアザグアニン、アザおよびデアザシトシン、アザおよびデアザチミジン、およびアザおよびデアザウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。転写不能ヌクレオチド塩基を含むポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、プローブとして有用であり得ることが理解される。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、センス鎖またはアンチセンス鎖となり得る。さらに、「核酸」という用語は、相補性核酸配列ならびにコドン最適化または同義コドンの等価物を含む。
【0060】
「単離核酸」という用語は、本明細書において使用する場合、組換えＤＮＡ技術によって生成するときの細胞物質もしくは培養培地、または化学合成するときの化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。また、単離核酸は、その核酸が由来する核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を実質的に含まない。
【0061】
ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に生じ得る。ハイブリダイズする部分は典型的に、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者は、核酸二本鎖、またはハイブリッドの安定性はＴｍにより決定され、これは、ナトリウム含有緩衝液中では、ナトリウムイオン濃度および温度の関数であることを認識する（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）、または類似の式）。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似するが同一ではない分子を同定するために、１％の不一致によりＴｍが約１℃低下すると想定することができ、例えば、９５％を超える同一性を有する核酸分子を求める場合、最終洗浄温度を約５℃低下させる。このような考察に基づいて、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能である。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、次の条件を利用してストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成し得る：上の式に基づくＴｍ－５℃の５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳによるハイブリダイゼーション後、６０℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる洗浄。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、４２℃の３×ＳＳＣによる洗浄ステップを含む。しかし、等価なストリンジェンシーを代替の緩衝液、塩、および温度を使用して達成し得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなるガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．， ２００２、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に見出すことができる。
【0062】
本明細書において使用する場合、「発現構築物」という用語は、発現の対象となる異種ヌクレオチド配列（すなわち、発現制御配列が通常は現実には繋がれていない配列）と作動的に連結する発現制御配列を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書において使用する場合、「発現ベクター」という用語は、発現構築物、および宿主細胞における複製または宿主染色体への挿入に十分な配列を含む、ポリヌクレオチドを指す。プラスミドおよびウイルスは、発現ベクターの例である。本明細書において使用する場合、「発現制御配列」という用語は、それに作動的に連結するヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節するヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー（転写調節配列）、およびリボソーム結合部位（翻訳調節配列）を含む。
【0063】
本明細書において使用する場合、ヌクレオチド配列は、発現制御配列が細胞内で機能してヌクレオチド配列の転写を調節する場合、発現制御配列と「作動的に連結する」。これには、ポリメラーゼとプロモーターとの相互作用によるヌクレオチド配列の転写の促進を含む。
【0064】
「ベクター」という用語は、本明細書において使用する場合、核酸分子が、例えば、原核細胞および／もしくは真核細胞に導入され、ならびに／またはゲノムに組み込まれることが可能となる、前記核酸分子についての任意の中間ビヒクルを含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスに基づくベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等を含む。「プラスミド」という用語は、本明細書において使用する場合、通常は環状ＤＮＡ二本鎖である、染色体外遺伝物質の構築物を一般に指し、これは染色体ＤＮＡとは独立的に複製することができる。
【0065】
「トランスフェクション」は、細胞への新たな遺伝物質の導入を指す。これは、形質転換（細胞膜を通じたその周囲からの外因性遺伝物質の直接的取込みおよび組込み）、形質導入（バクテリオファージウイルスによる宿主細胞への外来ＤＮＡの導入）、およびコンジュゲーションを含む。
【0066】
本明細書において使用する場合、「宿主細胞」は、発現構築物を含む組換え細胞を指す。
【0067】
本明細書において使用する場合、「生体試料」という用語は、細胞（例えば、腫瘍細胞）または細胞に由来する生体分子を含む試料を指す。
【0068】
本明細書において使用する場合、「治療」、「処置」、「治療的介入」および「回復」という用語（ｔｅｒｍ ｔｅｒｍｓ）は、症状の重症度の低下をもたらす任意の活性を指す。「処置する」および「防止する」という用語は、絶対的であることは意図しない。処置および防止は、発症の遅延、症状の回復、患者生存の向上、生存時間または生存率の上昇等のいずれかを指し得る。処置および防止は、完全または部分的であり得る。処置の作用は、処置を受けていない個体もしくは個体のプール、または処置前もしくは処置中の異なる時間における同一患者と比較し得る。一部の態様では、疾患の重症度は、例えば、投与前の個体または処置を受けていない個体対照と比較して少なくとも１０％低下する。一部の態様では、疾患の重症度は、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、もしくは９０％低下するか、または一部の場合では、標準的診断技術を使用して、もはや検出不可能となる。また、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置」は、処置を受けていない場合に予想された生存と比較した生存の延長を意味し得る。また、「処置すること」および「処置」は、本明細書において使用する場合、予防的処置を含む。
【0069】
１つまたは複数の列挙する要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、詳細には列挙しない他の要素（例えば、それを含むが制限されないことを意味する無制限の用語）を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含み得る。対照的に、「からなる」という句は、制限的であり、このような実施形態がさらなる要素を含まないことを示す。「から本質的になる」という用語は、列挙する要素、および主張する組合せの基本的かつ新規の特性に実質的に影響しない他の要素（例えば、部分的制限的用語）を包含することを指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」としての本明細書に記載の態様および実施形態は、実施形態「からなる」および実施形態「から本質的になる」を含むことが理解される。
【0070】
本明細書において使用する場合、他に特定しない限り次の意味を適用する。「ｍａｙ（し得る）」の単語は、強制的意味（すなわち、ｍｕｓｔ（義務や必要）を意味する）ではなく、許容的意味（すなわち、に対し潜在性を有する意味）において使用する。「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、複数参照を含む。したがって、例えば、「エレメント」を参照する場合、１つまたは複数のエレメントについての他の用語および句、例えば、「１つまたは複数」の使用にかかわらず、２つまたはこれよりも多いエレメントの組合せを含む。「少なくとも１つ」という句は、「１つ」、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」、ならびに「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」を含む。「または」という用語は、他に指示しない限り、非排他的、すなわち、「および」ならびに「または」の両方を包含する。修飾子とシーケンスとの間に位置する「のいずれか（ａｎｙ ｏｆ）」という用語は、修飾子がシーケンスの各メンバーを修飾することを意味する。したがって、例えば、「１、２または３の少なくともいずれか」という句は、「少なくとも１、少なくとも２または少なくとも３」を意味する。
ＩＩ．キメラ抗原受容体
ＩＩ．キメラ抗原受容体
【0071】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、必要に応じたシグナルペプチド、標的結合ドメイン、必要に応じたヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内シグナリングドメイン、および必要に応じた共刺激ドメインを含む操作された分子である。ＣＡＲは、Ｔ細胞上に発現し、細胞媒介免疫応答に関与する、Ｔ細胞受容体の構造に基づく。また「標的結合ドメイン」は、本明細書において「抗原結合ドメイン」と呼び、したがって「標的」という用語は、「抗原」を包含する。
【0072】
いわゆる「第１世代」ＣＡＲは、標的ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有した。いわゆる「第２世代」ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢドメインをさらに含んだ。いわゆる「第３世代」ＣＡＲは、複数の共刺激ドメインを含む。「ＴＲＵＣＫＳ」とも呼ぶ、いわゆる「第４世代」ＣＡＲは、ＣＡＲシグナリングの際にトランスジェニックサイトカインを放出するように操作されている。
【0073】
キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）は、次のエレメント：（１）必要に応じたシグナルペプチド、（２）標的結合ドメイン、（３）必要に応じたヒンジ領域、（４）膜貫通領域、（５）シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む。必要に応じてＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、Ｆｃ受容体シグナル伝達ドメイン、共刺激（シグナル伝達）ドメインのいずれかを含み得る。すなわち、このような必要に応じたエレメントを、他の必要に応じたエレメントに加えて、またはその代わりに含み得る。標的結合ドメインは、他のドメインの少なくとも１つに対して異種である。すなわち、標的結合ドメインは、Ｔ細胞受容体上に天然には存在しないか、または他のドメインの少なくとも１つと同一のタンパク質には存在しない。
【0074】
「標的結合ドメイン」は、ＣＡＲに対する結合特異性をもたらす。「シグナルペプチド」は、細胞膜を通じてポリペプチドを導く。標的結合ドメインは、いわゆる「ユニバーサルＣＡＲ」に対する標的抗原に結合する抗体のドメインに結合し得る。「ヒンジ領域」は、可動性コネクター領域、例えば、天然もしくは合成のポリペプチド、または構造的可動性をもたらし、隣接するポリペプチド領域に間隔をあける他の任意の種類の分子である。「膜貫通ドメイン」は、典型的には疎水性の、膜を貫通するタンパク質のドメインである。「シグナル伝達ドメイン」または「シグナリングドメイン」は、結合の際、細胞内にシグナル伝達経路を通じてシグナルを伝える。このようなシグナリングにより、細胞の活性が活性化される。「共刺激ドメイン」は、シグナルをさらに伝えるアクセサリーシグナリングドメインである。
【0075】
一部の実施形態では、ＣＡＲは次を含む。
（ｉ）シトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片、例えば、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨに反応性の標的結合ドメイン（本明細書において抗原結合ドメインとも呼ぶ）。２つの可変ドメインが、１５～２５アミノ酸の長さの可動性リンカーにより分離される。
（ｉｉ）ヒンジドメイン、
（ｉｉｉ）共刺激ドメイン、および
（ｉｖ）細胞内シグナリングドメイン（本明細書において活性化ドメインとも呼ぶ）。すなわち、一部の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび活性化ドメインを含む細胞内ドメインを含む、ＣＡＲプラットフォームに融合する抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲは、ＣＡＲの発現を細胞、例えば、Ｔｒｅｇの表面に方向付けるシグナルペプチド（本明細書においてリーダー配列とも呼ぶ）をさらに含み得る。
（ｉ）シトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片、例えば、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨに反応性の標的結合ドメイン（本明細書において抗原結合ドメインとも呼ぶ）。２つの可変ドメインが、１５～２５アミノ酸の長さの可動性リンカーにより分離される。
（ｉｉ）ヒンジドメイン、
（ｉｉｉ）共刺激ドメイン、および
（ｉｖ）細胞内シグナリングドメイン（本明細書において活性化ドメインとも呼ぶ）。すなわち、一部の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび活性化ドメインを含む細胞内ドメインを含む、ＣＡＲプラットフォームに融合する抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲは、ＣＡＲの発現を細胞、例えば、Ｔｒｅｇの表面に方向付けるシグナルペプチド（本明細書においてリーダー配列とも呼ぶ）をさらに含み得る。
【0076】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２８、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＡＲプラットフォームにインフレームで融合した抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０、配列番号１６、配列番号２８、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＡＲプラットフォームにインフレームで融合した抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０、配列番号１６、配列番号２９、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＡＲプラットフォームにインフレームで融合した抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０、配列番号１６、配列番号２９、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＡＲプラットフォームにインフレームで融合した抗原結合ドメインを含む。
Ａ．シグナルペプチド
Ａ．シグナルペプチド
【0077】
シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞膜横断を可能とする機能を有する任意のペプチドであり得る。シグナルペプチドは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＴＬＲまたは受容体の免疫グロブリンファミリーに由来し得る。
【0078】
例えば、シグナルペプチドは、次の配列を含み得る。
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１８）、または
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲ（配列番号２３）。
Ｂ．標的結合ドメイン
１．構造
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１８）、または
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲ（配列番号２３）。
Ｂ．標的結合ドメイン
１．構造
【0079】
標的結合ドメインは、標的結合機能を含む任意のポリペプチド、例えば、本明細書に定義の抗体を含み得る。一実施形態では、標的結合ドメインは、本明細書に定義の抗原結合活性を保持する抗体型を含み得る。一実施形態では、標的結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）を含み得る。ｓｃＦＶは、長さ、可動性、および起源によりＣＡＲ設計の可変性がもたらされるヒンジドメインを介して膜貫通ドメインに繋がれていてよく、膜貫通ドメインとともに、抗原との相互作用、免疫学的シナプスの構築に寄与し、頑強な活性化シグナルの付与に必要とされるさらなるタンパク質とＣＡＲとの会合に影響し得る。
２．標的／抗原
２．標的／抗原
【0080】
本明細書に開示のキメラ抗原受容体は、例えば、関節リウマチを有する対象の滑膜に見出されるシトルリン化抗原に結合する標的結合ドメイン（本明細書において抗原結合ドメインとも呼ぶ）を含む。特に、標的結合ドメインは、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲン、および（ｉｖ）これらのシトルリン化ペプチドの１つまたは複数に結合し得る。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、（ｉ）～（ｉｉｉ）のシトルリン化ペプチド断片に結合してもよく、この場合、ペプチド断片は、少なくとも１０アミノ酸の長さ、例えば、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸または少なくとも１６アミノ酸の長さのものである。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、テネイシンＣにさらに結合する。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲン、および（ｉｖ）テネイシンＣ、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片の２つまたはこれよりも多くに結合し得る。
【0081】
一部の実施形態では、標的ドメインは、次の配列から選択される１つまたは複数のシトルリン化ペプチドである。
ＳＴ（Ｃｉｔ）ＳＶＳＳＳＳＹ（Ｃｉｔ）（Ｃｉｔ）ＭＦＧＧ（配列番号２４）；
ＶＹＡＴ（Ｃｉｔ）ＳＳＡＶ（Ｃｉｔ）Ｌ（Ｃｉｔ）ＳＳＶ（配列番号２５）；
（Ｃｉｔ）ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹ（Ｃｉｔ）Ａ（Ｃｉｔ）（配列番号２６）；
ＳＨＱＥＳＴ（Ｃｉｔ）ＧＲＳＲＧＲＳＧＲＳＧＳ（配列番号２７）。
ＳＴ（Ｃｉｔ）ＳＶＳＳＳＳＹ（Ｃｉｔ）（Ｃｉｔ）ＭＦＧＧ（配列番号２４）；
ＶＹＡＴ（Ｃｉｔ）ＳＳＡＶ（Ｃｉｔ）Ｌ（Ｃｉｔ）ＳＳＶ（配列番号２５）；
（Ｃｉｔ）ＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹ（Ｃｉｔ）Ａ（Ｃｉｔ）（配列番号２６）；
ＳＨＱＥＳＴ（Ｃｉｔ）ＧＲＳＲＧＲＳＧＲＳＧＳ（配列番号２７）。
【0082】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、１つまたは複数のシトルリン化ペプチドに結合するが、非シトルリン化対応物には結合しない。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＳＴＲＳＶＳＳＳＳＹＲＲＭＦＧＧ（配列番号４５）ではなく、配列番号２４として記載のシトルリン化ビメンチンペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＹＡＴＲＳＳＡＶＲＬＲＳＳＶ（配列番号４６）ではなく、配列番号２５として記載のシトルリン化ビメンチンペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲＡＲ（配列番号４７）ではなく、配列番号２６として記載のシトルリン化フィブリノゲンペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＳＨＱＥＳＴＲＧＲＳＲＧＲＳＧＲＳＧＳ（配列番号４８）ではなく、配列番号２７として記載のシトルリン化フィラグリンペプチドに結合する。
【0083】
標的結合ドメインは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来の配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、２つのＶＨドメインのみを有する、重鎖のみの抗体または抗体断片由来の配列を含み得る。これは、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来の特定のＣＤＲセットを含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号１または配列番号２のＶＨドメイン由来のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号３または配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号１のＶＨドメインおよび配列番号３のＶＬドメイン由来のＣＤＲをそれぞれ含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号１のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲをそれぞれ含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号２のＶＨドメインおよび配列番号３のＶＬドメイン由来のＣＤＲをそれぞれ含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号２のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲをそれぞれ含む。
【0084】
一部の実施形態では、標的結合ドメインは、配列番号１のＶＨドメイン（ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ））および配列番号４のＶＬドメイン（ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ））由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、標的結合ドメインのＶＨドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、標的結合ドメインのＶＬドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
【表2】
【0085】
ある特定の実施形態では、標的結合ドメインは、
（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
ＨＬＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＤＴＴＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＲＧＮＴＨＹＮＳＳＬＲＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＲＦＳＬＫＶＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）；
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるＶＨ配列を含むが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
ＨＬＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＤＴＴＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＲＧＮＴＨＹＮＳＳＬＲＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＲＦＳＬＫＶＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）；
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるＶＨ配列を含むが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0086】
標的結合領域は、
（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＬＡＰＧＥＴＡＴＩＴＣＧＧＤＤＩＥＮＱＮＶＮＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＭＬＬＩＦＦＤＴＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＲＳＥＤＴＡＮＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＤＡＤＹＦＣＱＶＹＤＲＫＴＤＨＱＶＦＧＰＧＴＴＶＴＶＬ（配列番号３）；
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＱＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号４）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるＶＬ配列を含み得るが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＬＡＰＧＥＴＡＴＩＴＣＧＧＤＤＩＥＮＱＮＶＮＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＭＬＬＩＦＦＤＴＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＲＳＥＤＴＡＮＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＤＡＤＹＦＣＱＶＹＤＲＫＴＤＨＱＶＦＧＰＧＴＴＶＴＶＬ（配列番号３）；
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＱＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号４）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるＶＬ配列を含み得るが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0087】
別の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号１または配列番号２のＶＨドメインのアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＶＨドメインを含むｓｃＦＶを含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号１または配列番号２の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0088】
一部の実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号３または配列番号４のＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号３または配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0089】
一部の実施形態では、ｓｃＦＶドメインは、配列番号１および配列番号３のＶＨドメインおよびＶＬドメインをそれぞれ含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号１または配列番号３の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２から選択されるリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置される。
【0090】
一部の実施形態では、ｓｃＦＶドメインは、配列番号１および配列番号４のＶＨドメインおよびＶＬドメインをそれぞれ含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号１および配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２から選択されるリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置される。
【0091】
一部の実施形態では、ｓｃＦＶドメインは、配列番号２および配列番号３のＶＨドメインおよびＶＬドメインをそれぞれ含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号２および配列番号３の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２から選択されるリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置される。
【0092】
一部の実施形態では、ｓｃＦＶドメインは、配列番号２および配列番号４のＶＨドメインおよびＶＬドメインをそれぞれ含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、配列番号２および配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２から選択されるリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置される。
【0093】
別の実施形態では、抗原結合領域は、
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳｘ３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
（ＧＧＧＳｘ３リンカーに下線を付す）；
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
（Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカーに下線を付す）；
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
（ＡＢ ｐｕｒリンカーに下線を付す）；または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳｘ３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
【化1】
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
【化2】
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
【化3】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、標的結合ドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0094】
例えば、リンカーは、配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のＧＧＧＳ×３リンカー、または
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２１）のＷｈｉｔｌｏｗ２１８リンカー、または
ＡＳＳＧＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＳＧＳＡＲ（配列番号２２）のＡＢ ｐｕｒリンカー
を含み得る。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のＧＧＧＳ×３リンカー、または
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２１）のＷｈｉｔｌｏｗ２１８リンカー、または
ＡＳＳＧＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＳＧＳＡＲ（配列番号２２）のＡＢ ｐｕｒリンカー
を含み得る。
【0095】
必要に応じて、前述の配列のいずれかは、上記のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来のＣＤＲセットを含み得る。
Ｃ．ヒンジ領域
Ｃ．ヒンジ領域
【0096】
一部の実施形態では、開示するＣＡＲのヒンジ領域は、当業者に公知でありＧｅｎＢａｎｋデータベースに見出すことができるように、ＣＤ８、ＣＤ４、またはＣＤ２８細胞外ドメイン、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域、またはＴＬＲ受容体のいずれかの細胞外ドメインから選択され得る。
【0097】
例えば、ヒンジ領域は、配列：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号３０）（ＣＤ２８）、または
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１５）（ＣＤ８）、または
前述のヒンジ領域配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
Ｄ．膜貫通ドメイン
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号３０）（ＣＤ２８）、または
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１５）（ＣＤ８）、または
前述のヒンジ領域配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
Ｄ．膜貫通ドメイン
【0098】
膜貫通ドメインは、免疫グロブリンファミリー受容体、例えば、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、Ｔ細胞上の膜を貫通する任意の分子から選択され得る。例えば、開示するＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ２８、ＣＤ２４７、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４、またはＣＤ８のＴＭドメインを含み得る。
【0099】
例えば、膜貫通ドメインは、配列：
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１６）、または
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１７）、または
前述のヒンジ領域配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
Ｅ．シグナル伝達ドメイン
１．ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１６）、または
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１７）、または
前述のヒンジ領域配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
Ｅ．シグナル伝達ドメイン
１．ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
【0100】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含む。開示するＣＡＲ分子のＣＤ３ζシグナリングドメインは、ＣＤ３ζアミノ酸配列、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み得る。
【0101】
例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１９）、または
前述のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１９）、または
前述のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
【0102】
例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号１９に示す配列のアミノ酸２１～１６３、３１～１４２、６８～８９、および／もしくは１３８～１５８、またはこれらの機能性バリアントを含み得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～２０アミノ酸の置換、欠失、または付加を有する）。
２．Ｆｃ受容体シグナル伝達ドメイン
２．Ｆｃ受容体シグナル伝達ドメイン
【0103】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｆｃシグナリングドメインを含む。Ｆｃシグナリングドメインは、Ｆｃアルファ、Ｆｃガンマ、Ｆｃイプシロン、Ｆｃミュー、およびＦｃデルタのいずれか１つの受容体であり得る。例えば、Ｆｃ受容体シグナリングドメインは、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（例えば、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ、およびＳｒｃ）ならびにＺＡＰ－７０ファミリーキナーゼとの相互作用に関与するアミノ酸、例えば、１つまたは複数のＩＴＡＭドメインを含み得る（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍｅｊｏｒａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ． ６３：５３１；Ｇａｒｃｉａ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ． ７２：１０９２を参照）。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体シグナル伝達ドメインは、例えば、Ｆｃアルファ、Ｆｃガンマ、Ｆｃイプシロン、Ｆｃミュー、およびＦｃデルタのいずれか１つの受容体由来であるか、またはこれらと実質的に同一の、少なくとも１つのＩＴＡＭドメインを含む。
【0104】
また、配列は、次のように見出すことができる。
Ｆ．共刺激ドメイン
【表3】
【0105】
本開示のＣＡＲは、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体のシグナル伝達ドメインに加えて１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３Ｌ、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４などに由来し得る。ＣＡＲ構築物は、２つまたはこれよりも多い共刺激シグナリングドメイン（例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢ）を含み得る。
【0106】
１つまたは複数の共刺激ドメインは、シグナル伝達ドメインと膜貫通領域との間に位置し得る。
【0107】
特定の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列：
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２９）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２９）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
【0108】
ある特定の実施形態では、４１ＢＢ共刺激ドメインは、配列：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２８）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
ＩＩＩ．核酸
Ａ．ＣＡＲをコードする核酸
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２８）、または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含み得る。
ＩＩＩ．核酸
Ａ．ＣＡＲをコードする核酸
【0109】
本開示のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ポリヌクレオチド）を本明細書において開示する。開示するＣＡＲの核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ等を含む。
【0110】
例えば、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、
（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含む。
（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
【化4】
【化5】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含む。
【0111】
ある特定の実施形態では、ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、
（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含む。
（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
【化6】
【化7】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を含む。
【0112】
別の実施形態では、ＶＨドメインをコードする核酸分子は、配列番号８または配列番号９を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインをコードする核酸分子は、配列番号８または配列番号９の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有する核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0113】
一部の実施形態では、ＶＬドメインをコードする核酸分子は、配列番号１０または配列番号１１を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインをコードする核酸分子は、配列番号１０または配列番号１１の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有する核酸配列を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0114】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインをコードする核酸分子は、配列番号８および配列番号１０を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖをコードする核酸分子は、配列番号８または配列番号１０の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0115】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインをコードする核酸分子は、配列番号８および配列番号１１を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖをコードする核酸分子は、配列番号８または配列番号１１の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0116】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインをコードする核酸分子は、配列番号９および配列番号１０を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖをコードする核酸分子は、配列番号９または配列番号１０の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0117】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインをコードする核酸分子は、配列番号９および配列番号１１を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖをコードする核酸分子は、配列番号９または配列番号１１の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。
【0118】
別の実施形態では、核酸分子はｓｃＦｖ分子をコードし、ヌクレオチド配列：
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳｘ３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
（ＧＧＧＳｘ３リンカーに下線を付す）；または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳｘ３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
【化8-1】
【化8-2】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
【0119】
別の実施形態では、核酸分子はｓｃＦｖ分子をコードし、ヌクレオチド配列：
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
（Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカーに下線を付す）；または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
【化9】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
【0120】
別の実施形態では、核酸分子はｓｃＦｖ分子をコードし、ヌクレオチド配列：
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
（ＡＢ ｐｕｒリンカーに下線を付す）；または
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
【化10】
前述の配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性の少なくともいずれかを有する配列
を有する。
【0121】
必要に応じて、これらは、本明細書に記載のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来のＣＤＲセットをコードする配列を含み得る。
【0122】
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはこの両方における変更を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされたＣＡＲポリペプチドの特性または活性は変更しない変更を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、アミノ酸配列のいかなる変化をももたらさない変更を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、遺伝子コードの縮重による「サイレント」置換を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由から、例えば、特定の宿主のコドンの発現を最適化するために生成し得る。
【0123】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単離されている。
【0124】
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、単離した分子であるか、またはベクター、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体もしくはウイルス内に含まれ得る。このようなベクターを、標的細胞をトランスフェクトするために使用し得る。
Ｂ．発現構築物およびベクター
Ｂ．発現構築物およびベクター
【0125】
本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と作動的に連結する調節エレメントを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の転写調節エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含んでもよく、ポリヌクレオチドが細胞に存在する場合、これにより、ＣＡＲをコードする配列が細胞内で発現するようになる。
【0126】
本明細書に開示の核酸は、細胞をトランスフェクト可能なベクターに組み込むことができる。このようなベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミド、およびマイクロベシクル、例えば、リポソームが挙げられるが、これらに制限されない。例となるウイルスベクターは、アデノウイルスベクター Ａｄ、ＡＡＶ、レンチウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびレトロウイルス。レンチウイルスは、レトロウイルス科（の属であり、ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶを含む。レンチウイルスは、大量の遺伝物質を宿主細胞のＤＮＡへと送達することができる。これらは、非分裂細胞に感染することが可能である。
ＩＶ．細胞
ＩＶ．細胞
【0127】
一部の実施形態では、開示のＣＡＲをコードする核酸分子を有する組換え（宿主）細胞であって、ここで、核酸分子が、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と作動的に連結する発現制御配列をさらに含み得る。アセンブルしたＣＡＲ（当業者に公知のように合成、部位特異的変異誘発または別の方法により）、開示のＣＡＲをコードする核酸分子は、発現ベクターに挿入し、所望の宿主における開示のＣＡＲの発現に適切な発現制御配列に作動的に連結させることができる。正しいアセンブリは、ヌクレオチドシーケンシング、制限酵素マッピング、および／または適する宿主におけるＣＡＲポリペプチドの発現により確認することができる。当技術分野において周知のように、宿主において高発現レベルのトランスフェクト遺伝子を得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能性である転写および翻訳の発現制御配列に作動的に連結していなくてはならない。
【0128】
また、本開示では、ＣＡＲをコードし、および／またはＣＡＲを発現する核酸分子を含む細胞（例えば、組換え細胞）を提供する。
【0129】
開示のＣＡＲをコードする核酸分子は、当業者に公知のようにプラスミドまたはウイルスベクターにより、制限されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄前駆細胞、マクロファージ等を含む宿主細胞に送達することができる。生じる組換え（宿主）細胞は、当業者に公知のようにＴ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、ならびにＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩを発現する細胞を含み得るが、これらに制限されない。一部の実施形態では、開示のＣＡＲをコードする核酸分子を有する組換え（宿主）細胞は、当業者に公知のように一般的骨髄前駆細胞、顆粒球マクロファージ前駆細胞、巨核球赤血球前駆細胞、顆粒球前駆細胞、および単球前駆細胞からなる群から選択される骨髄前駆細胞であり得る。一部の実施形態では、骨髄細胞は、自家または同種異系の細胞である。
【0130】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲを発現する細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。「調節性Ｔ細胞」、または「Ｔｒｅｇ細胞」は、免疫応答を抑制するように作用し、これにより恒常性および自己寛容を維持するＴ細胞の特殊化した亜集団に属する細胞である。Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞の増殖およびサイトカインの産生を阻害し、自己免疫の防止において重要な役割を果たすことが可能である。Ｔｒｅｇは、ＦｏｘＰ３の発現により特徴付けられる。Ｔｒｅｇの表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ２５ｈｉｇｈ（高分子密度）、およびＣＤ１２７ｌｏｗ（低分子密度）を含む。マウスおよびヒトのＴｒｅｇは、ＧＩＴＲ／ＡＩＴＲおよびＣＴＬＡ－４を発現する。ヒトＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、３つの亜集団：（１）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３ｌ０ｗ休止Ｔｒｅｇ細胞、（２）ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ活性化Ｔｒｅｇ細胞、および（３）炎症性サイトカイン産生ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３ｌｏｗ非抑制性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）に分けることがきる。
【0131】
本明細書に開示の核酸を用いて形質転換する細胞は、組換え細胞を投与する対象から採取した細胞であり得る。このようにして、同種異系免疫応答の問題を軽減することができる。
【0132】
細胞は、対象への投与前にｅｘ ｖｉｖｏで増大させることができる。
【0133】
本開示のＣＡＲを発現する核酸を組み込んだＴｒｅｇ細胞は、このようなＣＡＲを発現させ、関節リウマチを処置する本明細書に記載の方法において使用することができる。
【0134】
また、形質転換／組換え宿主により産生されるタンパク質は、適する任意の方法に従って精製することができる。このような方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解度、または他の任意の標準的タンパク質精製技術によるものが挙げられる。親和性タグ、例えば、ヘキサ－ヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオンＳトランスフェラーゼをタンパク質に結合させて、適切な親和性カラムを通過させることより精製を容易とすることができる。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質分解、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴、およびＸ線結晶解析のような技術を使用して物理的に特性決定することができる。
Ｖ．組成物
Ｖ．組成物
【0135】
また、開示のＣＡＲポリペプチドをコードし、および／または開示のＣＡＲポリペプチドを発現する核酸分子を有する組換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、ならびに関節リウマチ処置における使用の方法を開示する。
【0136】
本明細書において使用する場合、「医薬組成物」という用語は、医薬化合物（例えば、薬物または本明細書に記載の組換えＴｒｅｇ細胞）と薬学的に許容される担体とを含む組成物を指す。
【0137】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の他の成分と適合し、対象に安全に投与可能な担体を指す。この用語は、「生理学的に許容される」および「薬理学的に許容される」と同義的に使用する。医薬組成物ならびにこれらの調製および使用のための技術は、本開示を踏まえて当業者に公知である。これらの投与に適する薬理学的組成物および技術の詳細な一覧については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ． １９８５；Ｂｒｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， ２００５；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ｅｄｓ．）， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，” Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ｅｄｓ．）， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，” Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００８のようなテキストを参照することができる。
【0138】
薬学的に許容される担体は一般に、少なくともヒトに使用するためには無菌である。医薬組成物は一般に、緩衝および貯蔵所における保存のための作用物質（ａｇｅｎｔ）を含み、適切に送達するためのバッファーおよび担体を投与経路に応じて含み得る。薬学的に許容される担体の例としては、生理（０．９％）食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、および多電解質溶液、例えば、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0139】
医薬組成物は、粘膜（例えば、鼻、舌下、膣、頬側、もしくは直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、もしくは動脈内への注射、ボーラスもしくは注入のいずれか）、経口、または経皮を含む任意の投与経路用に製剤化し得る。
【0140】
注射用（例えば、静脈内）組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に懸濁した組成物の溶液を含み得る。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．９％等張食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース等のいずれかを使用することができ、安定性の増強のために糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等を含み得る。緩衝生理食塩水（１３５～１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用することが多い。組成物は、生理学的条件に近付けるために薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等を含み得る。一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与用のキットに製剤化し得る。
【0141】
例えば、関節腔内（関節内）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適する製剤は、水性および非水性の等張滅菌注射用液剤を含み、これらは、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁剤を含み得る。注射用液剤および懸濁剤は、滅菌した粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、顆粒剤、および錠剤から調製することもできる。本発明の実践では、組成物は、例えば、静脈内注入により、局所的、腹腔内、膀胱内、または髄腔内に投与することができる。組成物の製剤は、単位用量または複数用量の密封した容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提供することができる。
【0142】
細胞は凍結保存し得る。凍結保存は、凍結保存剤、例えば、ＤＭＳＯを用いた細胞の製剤化を含み得る。市販の培地としては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから入手可能なＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）およびｐＺｅｒｖｅ（登録商標）が挙げられる。
【0143】
組成物は、投与のための剤形として製剤化することができる。「剤形」という用語は、医薬品の特定の形態を指し、投与経路に依存する。剤形の例としては、分散液剤；坐剤；軟膏剤；パップ剤（湿布剤）；ペースト剤；粉剤・散剤；包帯剤；クリーム剤；硬膏剤；液剤；パッチ剤；エアロゾル剤（例えば、鼻スプレー剤または吸入剤）；ゲル剤；懸濁剤（例えば、水性もしくは非水性の液剤懸濁剤、水中油型乳剤、または油中水型乳剤）、液剤、およびエリキシル剤を含む患者への経口または粘膜投与に適する液体剤形；患者への非経口投与に適する液体剤形；ならびに患者への非経口投与に適する液体剤形を提供するために復元することが可能な滅菌固形剤（例えば、結晶性または非晶質の固体）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0144】
「用量」および「投与量」という用語は、本明細書において互換的に使用する。用量は、各投与時に個体に与えられる活性成分の量を指す。用量は、投与頻度；個体のサイズおよび忍容性；状態の重症度；副作用のリスク；投与経路；ならびに検出可能な標識（存在する場合）のイメージング様式を含むいくつかの因子に応じて変動し得る。当業者は、上の因子に応じて、または治療の進行に基づいて用量を修正し得ることを認識する。
【0145】
医薬調製物は、単位剤形にパッケージングまたは調製することができる。このような形態では、調製物は、例えば、治療剤の用量または組成物の濃度に応じて、適切な量の活性成分を含む単位用量に細分する。単位剤形は、パッケージングした調製物であってもよく、そのパッケージは、個別の量の調製物を含む。所望の場合、組成物は、他の適合する治療剤をも含み得る。
【0146】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１または配列番号２のＶＨドメイン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号３または配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１のＶＨドメインおよび配列番号３のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２のＶＨドメインおよび配列番号３のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメイン由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0147】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１のＶＨドメイン（ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ））および配列番号４のＶＬドメイン（ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ））由来のＣＤＲを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのＶＨドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、ＣＡＲポリペプチドのＶＬドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0148】
別の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１または配列番号２のＶＨドメインのアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＶＨドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１または配列番号２の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0149】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号３または配列番号４のＶＬドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号３または配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0150】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１および配列番号３のＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１または配列番号３の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0151】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１および配列番号４のＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１および配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0152】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２および配列番号３のＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２および配列番号３の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【0153】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２および配列番号４のＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦＶを含むＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を有する組換え細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２および配列番号４の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の少なくともいずれかを有するアミノ酸配列を含むｓｃＦＶを含むが、ただし、ｓｃＦＶドメインは、本明細書に記載のシトルリン化抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８アルファＴ細胞、ＣＤ８ベータＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、巨核球、単球、マクロファージ、および樹状細胞、または幹細胞メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
ＶＩ．使用の方法
ＶＩ．使用の方法
【0154】
本明細書に開示のＣＡＲを発現する、Ｔ細胞および特に、Ｔｒｅｇ細胞は、関節リウマチの処置において有用である。使用の方法は、有効量の本開示の医薬組成物を、それを投与することを必要とする対象、例えば、関節リウマチに罹患している対象に投与するステップを含む。
【0155】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、個々の動物を指す。「患者」という用語は、本明細書において使用する場合、医療提供者、例えば、医師または看護師の医療または監視下の対象を指す。対象は、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル、ならびにイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、および他の哺乳動物種を含む。また、対象は、トリを含み得る。患者は、処置、モニタリング、既存の治療レジメンの調整または修正等を求める個体であり得る。「関節リウマチ対象」という用語は、関節リウマチと診断されている個体を指す。関節リウマチ患者は、処置を受けていない個体、現在処置を受けている個体、処置を受けていた個体、および処置を中断した個体を含み得る。
【0156】
本明細書において使用する場合、「有効量」、「有効用量」、および「治療有効量」という用語は、所望の応答を生じるのに、例えば、状態の徴候もしくは症状を減少もしくは除去するかまたは障害を回復させるのに十分な薬剤の量を指す。一部の例では、「有効量」は、１つもしくは複数の症状および／または障害もしくは疾患のいずれかの基礎をなす原因を処置し（予防を含む）、ならびに／あるいは疾患の増悪を防止する量である。例えば、所与のパラメーターでは、治療有効量により、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％の少なくともいずれか、または少なくとも１００％の治療効果の増加または低下が示される。また、治療有効性は、「～倍」の増加または低下として表し得る。例えば、治療有効量は、対照に対して１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはこれよりも大きい効果の少なくともいずれかを有し得る。
【0157】
医薬組成物は、制限されないが、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内経路を含む適する任意の経路により投与し得る。医薬組成物の投与の例は、４℃での注射用に滅菌等張水性食塩液中１０ｍｇ／ｍｌの組成物を貯蔵するステップと、患者への投与前に注射用に０．９％の塩化ナトリウム１００ｍｌまたは２００ｍｌのいずれかにこれを希釈するステップとを含む。医薬組成物は、０．２～１０ｍｇ／ｋｇの間の用量で１時間にわたって静脈内注入により投与する。他の実施形態では、医薬組成物は、１５分～２時間の期間にわたって静脈内注入により投与する。なお他の実施形態では、投与手順は、皮下ボーラス注射を介する。
【0158】
組成物の用量は、患者に有効な治療を提供するために選択され、０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約２５ｍｇ／ｋｇ体重未満の範囲または患者１名あたり１ｍｇ～２ｇの範囲である。一部の場合では、用量は、１～１００ｍｇ／ｋｇ、またはおよそ５０ｍｇ～８０００ｍｇ／患者の範囲である。用量は、組成物の薬物動態（例えば、循環中の組成物の半減期）および薬力学的応答（例えば、組成物の治療効果の持続期間）に応じて、適切な頻度で反復してもよく、この頻度は、１日１回～３ヵ月毎に１回の範囲であり得る。一部の実施形態では、約７～約２５日のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期および組成物投与は、１週間に１回～３ヵ月毎に１回で反復する。
【0159】
投与は、定期的であり得る。投与経路に応じて、例えば、１、３、５、７、１０、１４、２１、もしくは２８日またはこれよりも長い期間毎に１回（例えば、２、３、４、または６ヵ月毎に１回）用量を投与し得る。一部の場合では、投与は、さらに頻繁であり、例えば、１日に２または３回である。当業者により認識されるように、患者をモニターし、治療の進行および有害な任意の副作用に応じて投与量および投与頻度を調整し得る。
【0160】
したがって、一部の実施形態では、さらなる投与は、患者の進行に依存し、例えば、投与間に患者をモニターする。例えば、最初の投与または繰り返しの投与の後、腫瘍成長の速度、再発（例えば、術後患者の場合）、または疾患と関連する全身的症状、例えば、脱力、疼痛、悪心等について患者をモニターし得る。
【0161】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞は、関節リウマチを有する対象の関節の滑膜に投与する。このような投与は、関節への直接的注射によってであり得る。
【0162】
本開示の例となる方法としては、対象から得られる生体試料からＴリンパ球を単離するステップが挙げられる。このようなＴ細胞は、例えば、誘導体化固体支持体および抗ＣＤ４抗体を使用する免疫親和性により単離し得る。ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、マーカープロファイルに基づいて非Ｔｒｅｇ細胞から分離することができる。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７ｌｏである。非Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、およびＣＤ１２７＋である。次いで、単離したＴｒｅｇ細胞は、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターをトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞は、増大させる。増大させた細胞は、対象に投与する。
ＶＩＩ．キット
ＶＩＩ．キット
【0163】
本明細書において使用する場合、「キット」という用語は、一緒に使用することを意図する一群の品目を指す。キットは必要に応じて、参照剤および／またはその使用のための指示を含み得る。キットは、本明細書に開示の組成物を含むバイアルのような容器を保持するように構成された輸送用の容器をさらに含み得る。キットは、一群の品目を内包する容器を含み得る。
【0164】
本開示のキットは、本明細書に記載の医薬組成物を静脈内投与用のバッグまたはビンのような容器に含み得る。また、ドリップチャンバーを有する流体導管、例えば、プラスチックチューブをキットに含み得る。ドリップチャンバーは、流体導管を介して静脈内注射針と連通し得る。また、流体導管は、１つまたは複数のＹ部位とローラークランプとを含み得る。
【実施例】
【0165】
略語：ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）、ＣＦ（シトルリン化フィブリノゲン）、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）、ＣＶ（シトルリン化ビメンチン）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＩＮ（鼻腔内）、ＩＶ（静脈内）、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＰＡＤ２（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ２）、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＲＡ（関節リウマチ）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ＳＦ（滑液）、Ｔｅｆｆ（エフェクターＴ細胞）、Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）、およびＵＴＤ（非形質導入）。
（実施例１）
ルシフェラーゼ系においてＳＢＴ０１ＧはＢＶＣＡ１と同等に、またはこれよりも優位に一貫して機能した
（実施例１）
ルシフェラーゼ系においてＳＢＴ０１ＧはＢＶＣＡ１と同等に、またはこれよりも優位に一貫して機能した
【0166】
ジャーカットＦＦルシフェラーゼ形質導入 － １ウェルあたり５０，０００細胞を平底の９６ウェルプレート２つそれぞれの２×硫酸プロタミンを加えたＲＰＭＩ中にプレーティングした。ウイルスは、１００μｌでおよそのＭＯＩが１となるようにＲＰＭＩ中に希釈した。次いで、１００μｌを各９６ウェルプレートの１列に加えた。次いで、プレートを回転させてインキュベーターに入れた。その翌日に試料をプールした。形質導入細胞は、培地中に再懸濁し、１００μｌをＵ底プレートに二連で移した。細胞は、１：１００の抗ＥＧＦＲ－ＰＥを用いて、ＣＶ－ＡＦ４８８およびＣＶ－ＡＦ６４７により４℃で２０分間染色して１回洗浄し、次いで、Ｎｏｖｏｃｙｔｅにより解析した。次いで、新鮮培地３ｍｌを加えることにより６ウェルプレートへと試料をスケールアップさせた。
【0167】
プレートコーティング － シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）を最初に１：１００でＰＢＳ ４ｍｌ中に希釈した。１ｍｌを３ｍｌに移すことにより５段階の４倍希釈物を作製した。次いで、１００μｌを９６ウェルプレートに加えた。プレートを４℃で置いて一晩コーティングした。
【0168】
ルシフェラーゼアッセイ － 正規化形質導入細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ １ｍｌ中に再懸濁した。ＣＶコーティングプレートをＰＢＳで３回洗浄した。細胞５０μｌをプレートに加えた。３×ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ ２５μｌを加え、プレートを３７℃のインキュベーターに入れた。およそ２４時間後、ＢｉｏＧｌｏ試薬７５μｌを加え、暗所で２～３分インキュベートし、プレートを読み取ることによりルシフェラーゼプレートを読み取った。
【0169】
図１は、種々の濃度の完全ＣＶコーティングプレートに対するウイルス形質導入ジャーカットＦＦルシフェラーゼ細胞の応答を示す。結果は、プレートに結合した完全長ＣＶに対してＢＶＣＡ１およびＳＴＢ０１が最も強力に応答したことを示す。
【0170】
図２は、種々の濃度の可溶性ＣＶに対するウイルス形質導入ジャーカットＦＦルシフェラーゼ細胞の応答を示す。結果は、可溶性の完全長ＣＶに対してＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇ－ＨＬのみが用量依存的に応答したことを示す。
【0171】
図３は、可溶性ビーズ結合ペプチドを用いたアッセイにおいて、ＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１により、ＣＶに対する結合特異性が実証されたことを示す。
【0172】
図４は、種々のタンパク質濃度における、プレート結合ＣＶ、抗体（Ｖ９）捕捉ＣＶ、および可溶性ＣＶに対するＢＶＣＡ１およびＳＢＴ０１Ｇの応答を示す。結果は、ＳＢＴ０１Ｇが、可溶性ＣＶではなくプレート結合ＣＶおよび抗体（Ｖ９）捕捉ＣＶに対してＢＶＣＡ１よりも強力に応答したことを示す。
（実施例２）
ＳＢＴ０１およびＢＶＣＡ１は関節リウマチ患者からの滑液に応答する
（実施例２）
ＳＢＴ０１およびＢＶＣＡ１は関節リウマチ患者からの滑液に応答する
【0173】
ジャーカットＦＦルシフェラーゼ形質導入 － ２４×１０６ジャーカットＦＦ－ｌｕｃ細胞をペレット化し、硫酸プロタミンおよびＭＯＩ ３のウイルスを含むＲＰＭＩ ２４ｍｌ中に再懸濁して、ｐＳＢ＿０１４７、ｐＳＢ－０１４９、およびｐＳＢ０１３９のＣＡＲを発現させた。細胞を混合し、４ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに等分した。次いで、プレートを回転させてインキュベーターに一晩入れた。細胞をペレット化し、Ｔ７５フラスコ内のＲＰＭＴ ２５ｍｌ中に再播種した。
【0174】
滑液の刺激 － 形質導入細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ中に再懸濁し、黒／白プレートのウェルに入れた。ＲＡ患者由来の滑液（ＳＦ）試料を解凍し、ボルテックスし、ＲＰＭＩ中に希釈した後、形質導入細胞を含むプレートに加えた。細胞は、ＳＦとともに３７℃で培養した。
【0175】
ルシフェラーゼアッセイ － およそ２４時間後、ＢｉｏＧｌｏ試薬７５μｌを各ウェルに加え、プレートを暗所で２～３分インキュベートした。次いで、発光をプレートリーダーで読み取った。
【0176】
Ｔｒｅｇの単離および組織培養 － 初代ヒトＴｒｅｇ細胞は、健常ドナーの白血球除去チャンバー残留物またはリューコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）から調達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によりＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを使用して単離した。ＣＤ２５＋細胞は、正の選択により富化した。次いで、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞についてゲーティングすることにより単離した。単離後、細胞は、ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）により１：１のビーズ対細胞比で刺激し、１０％のＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびベータ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地中で、３００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２とともに、２５～３０万細胞／ｍＬの密度で培養した。増大から９日目に、新鮮なＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒを１：１のビーズ対細胞比で加えた。
【0177】
初代Ｔｒｅｇの形質導入 － 増大から２日目に初代ＴｒｅｇにＣＶ－ＣＡＲ構築物をスピンオキュレーションにより硫酸プロタミンの存在下で形質導入した。
【0178】
Ｔｒｅｇの活性化 － ＣＶ－ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１：５～１：１６０の範囲の滑液試料の希釈物とともに培養した。Ｔｒｅｇの活性化は、ＣＤ７１の発現を測定することにより評価した。
【0179】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析 － 活性化培養物を採取し、３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、バイアビリティー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＥＧＦＲ表面染色抗体、およびＣＤ７１表面染色抗体を加えた１×Ｆｌｏｗｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。Ｔｒｅｇは、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離して１×Ｆｌｏｗ ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。染色した細胞は、ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、次いで、フローサイトメトリーにより解析した。
【0180】
図５は、ＲＡ患者由来の滑液に対するＳＢＴ０１ＧおよびＢＶＣＡ１の応答を示す。データは、ＳＢＴ０１Ｇが、ＲＡ患者数名由来の滑液に対してＢＶＣＡ１よりも強力な応答をもたらすことを示す。
【0181】
図６は、応答が引き起こされたスウェーデン人ＲＡ患者由来の滑液試料では、ＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１よりもやはり強力であったことを示す。
【0182】
図７は、複数のＲＡ患者由来の滑液に対するＣＶ－ＣＡＲを形質導入した初代Ｔｒｅｇ細胞の応答を示す。ＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲを発現する初代Ｔｒｅｇ細胞は、ＢＶＣＡ１ ＣＡＲを発現する初代Ｔｒｅｇ細胞よりもＲＡ患者由来の滑液に対して感受性である。
（実施例３）
シトルリン化フィブリノゲンに対するＳＢＴ０１およびＢＶＣＡ１の応答
（実施例３）
シトルリン化フィブリノゲンに対するＳＢＴ０１およびＢＶＣＡ１の応答
【0183】
プレートコーティング － シトルリン化タンパク質をＰＢＳ中に希釈し、黒／白アイソプレートのウェルに加えた。プレートは、４℃で一晩置いてプレートウェルをコーティングした。
【0184】
ルシフェラーゼアッセイ － 安定に形質導入したジャーカットＦＦ－ｌｕｃ細胞株および非形質導入（ＵＴＤ）ジャーカットＦＦ－ｌｕｃ細胞株をペレット化し、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に再懸濁した。シトルリン化タンパク質をコーティングしたプレートは、ＰＢＳで３回洗浄した。１ウェルあたり７５μｌ中５０，０００細胞をコーティングプレートに加えた。ＲＰＭＩ中の１５×ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ ５μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃のインキュベーターに入れた。およそ２４時間後、ＢｉｏＧｌｏ試薬７５μｌを各ウェルに加え、プレートを暗所で２～３分インキュベートした。次いで、発光をプレートリーダーで読み取った。
【0185】
Ｔｒｅｇの単離および組織培養 － 初代ヒトＴｒｅｇ細胞は、健常ドナーの白血球除去チャンバー残留物またはリューコパックから調達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によりＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを使用して単離した。ＣＤ２５＋細胞は、正の選択により富化した。次いで、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞についてゲーティングすることにより単離し、Ｔｅｆｆは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＣＤ１２７ｐｏｓについてＦＡＣＳゲーティングを使用して単離した。単離後、細胞は、ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）により１：１のビーズ対細胞比で刺激し、１０％のＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびｂ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地中で、３００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２とともに、２５～３０万細胞／ｍＬの密度で培養した。増大から９日目に、新鮮なＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒを１：１のビーズ対細胞比で加えた。
【0186】
初代ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの形質導入 － 増大から２日目に初代ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆにＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＶ－ＣＡＲ構築物をスピンオキュレーションにより硫酸プロタミンの存在下で形質導入した。
【0187】
Ｔｒｅｇの活性化 － 活性化培養の開始前に、ＣＡＲを発現するＴｒｅｇおよびＴｅｆｆを増殖色素ＣＦＳＥで標識した。ＣＤ１９－ＣＡＲおよびＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞は、３０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの用量範囲にわたるプレートにコーティングしたシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）またはシトルリン化フィブリノゲン（ＣＦ）とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。Ｔｒｅｇの活性化は、増殖細胞のパーセンテージの測定およびＣＤ７１の発現により評価した。
【0188】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析 － 活性化培養物を採取し、３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、バイアビリティー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＥＧＦＲおよびＣＤ７１表面染色抗体を加えた１×Ｆｌｏｗｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。Ｔｒｅｇを、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離して１×Ｆｌｏｗｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。染色した細胞を、ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、次いで、フローサイトメトリーにより解析した。
【0189】
図８は、プレートに結合した完全長のペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）シトルリン化フィブリノゲンに対するＳＢＴ０１ＧおよびＢＶＣＡ１の応答を示す。結果は、ＢＶＣＡ１ではなくＳＢＴ０１Ｇもプレート結合完全長ＰＡＤ２シトルリン化フィブリノゲンに応答可能であることを示す。
【0190】
図９は、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞上に発現したＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲが、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）およびシトルリン化フィブリノゲン（ＣＦ）に応答することを示す。対照的に、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞上に発現したＢＶＣＡ１ ＣＡＲは、ＣＦではなくＣＶに応答する。
【0191】
したがって、図１～９は、すべてのアッセイ系においてＳＢＴ０１ＧがＢＶＣＡ１と同等に、またはこれよりも優位に一貫して機能したことを示す。
（実施例４）
種々のプロモーターおよびリンカーを使用する場合ＣＶ ＣＡＲにより機能的応答が実証される
（実施例４）
種々のプロモーターおよびリンカーを使用する場合ＣＶ ＣＡＲにより機能的応答が実証される
【0192】
Ｔｒｅｇの単離および組織培養 － 初代ヒトＴｒｅｇ細胞は、健常ドナーの白血球除去チャンバー残留物またはリューコパックから調達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によりＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを使用して単離した。ＣＤ２５＋細胞は、正の選択により富化した。次いで、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞についてゲーティングすることにより単離した。単離後、細胞は、ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）により１：１のビーズ対細胞比で刺激し、１０％のＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびｂ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地中で、３００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２とともに、２５～３０万細胞／ｍＬの密度で培養した。増大から９日目に、新鮮なＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒを１：１のビーズ対細胞比で加えた。
【0193】
初代Ｔｒｅｇの形質導入 － 増大から２日目に初代ＴｒｅｇにＣＶ－ＣＡＲ構築物をスピンオキュレーションにより硫酸プロタミンの存在下で形質導入した。
【0194】
Ｔｒｅｇの活性化 － 活性化培養の開始前に、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇを増殖色素ＣＦＳＥで標識した。ＣＶ－ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ細胞は、ビーズで捕捉したＣＶペプチドとともにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。Ｔｒｅｇの活性化は、増殖細胞のパーセンテージの測定により評価した。
【0195】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析活性化アッセイ － 活性化培養物を採取し、３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、バイアビリティー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＥＧＦＲ表面染色抗体を加えた１×Ｆｌｏｗｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。Ｔｒｅｇは、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離して１×Ｆｌｏｗｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。染色した細胞を、ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、次いで、フローサイトメトリーにより解析した。
【0196】
Ｔｒｅｇ表現型のフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析 － 増大から１４日目に、非形質導入（ＵＴＤ）Ｔｒｅｇ、ＣＤ１９－ＣＡＲおよびＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇを、転写因子ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓについて染色した。細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦｏｘＰ３転写因子緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して固定および透過処理した。
【0197】
Ｔｒｅｇ培養物の休止 － 増大から１４日目に、ＣＤ１９－ＣＡＲおよびＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇを回収し、磁石を使用してビーズを除去し、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２のみとともに５０万細胞／ｍｌで培養を行った。
【0198】
ＣＡＲ発現のフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析 － 増大から１４日目および休止から２または５日後にＣＤ１９－ＣＡＲおよびＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇを、バイアビリティー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＥＧＦＲ表面染色抗体で染色した。ＣＶ－ＣＡＲ発現は、１μｇ／ｍｌのＣＶとともに、続いてＦＩＴＣ標識抗ビメンチン（クローンＶ９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに細胞をインキュベートすることにより検出した。
【0199】
プレートコーティング － シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）をＰＢＳ中に希釈し、黒／白アイソプレートのウェルに加えた。プレートは、４℃で一晩置いてプレートウェルをコーティングした。
【0200】
ルシフェラーゼアッセイ － 安定に形質導入したジャーカットＦＦ－ｌｕｃ細胞株および非形質導入（ＵＴＤ）ジャーカットＦＦ－ｌｕｃ細胞株をペレット化し、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に再懸濁した。シトルリン化タンパク質をコーティングしたプレートを、ＰＢＳで３回洗浄した。７５μｌ中１ウェルあたり５０，０００細胞をコーティングプレートに加えた。ＲＰＭＩ中の１５×ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ ５μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃のインキュベーターに入れた。およそ２４時間後、ＢｉｏＧｌｏ試薬７５μｌを各ウェルに加え、プレートを暗所で２～３分インキュベートした。次いで、発光をプレートリーダーで読み取った。
【0201】
図１０Ａは、ＥＦ１ＡおよびＭＮＤの両プロモーターが、可溶性ビーズ結合シトルリン化ペプチド（ｐＣＶ）に対するＣＶ－ＣＡＲ Ｔ細胞による発現および機能的応答を駆動することを示す。図１０Ｂは、種々のプロモーターの使用によりＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞の表現型は変化しないことを示す。
【0202】
図１１は、ｓｃＦｖリンカーの選択は、完全長ＣＶに対するＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞応答にほとんど影響しないかまったく影響しないことを示す。
【0203】
図１２Ａは、ＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲベクターによる形質導入によって、ＢＶＣＡ１ ＣＡＲベクターにより形質導入した場合よりも高いパーセンテージの細胞においてＣＶ－ＣＡＲ発現が生じたことを示す。図１２Ｂは、ＳＢＴ０１Ｇ ＣＡＲおよびＢＶＣＡ１ ＣＡＲのＴｒｅｇ細胞が、ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓの類似のプロファイルを有することを示す。
【0204】
図１０～１２は、ＳＢＴ０１Ｇが高いパーセンテージのＣＡＲ陽性Ｔｒｅｇを示し、ＳＢＴ０１Ｇが高いレベルのＣＡＲ発現を示したことを示す。
（実施例５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシトルリン化ビメンチンによるＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化の評価
（実施例５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシトルリン化ビメンチンによるＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化の評価
【0205】
Ｔｒｅｇの単離および組織培養 － 初代ヒトＴｒｅｇ細胞は、健常ドナーの白血球除去チャンバー残留物またはリューコパックから調達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によりＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを使用して単離した。ＣＤ２５＋細胞は、正の選択により富化した。次いで、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞についてゲーティングすることにより単離した。単離後、細胞を、ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）により１：１のビーズ対細胞比で刺激し、１０％のＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で、３００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２とともに、２５～３０万細胞／ｍＬの密度で培養した。
【0206】
Ｔｒｅｇの活性化 － 非形質導入Ｔｒｅｇ細胞およびＣＶ－ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの用量範囲にわたるシトルリン化ビメンチン抗原とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。Ｔｒｅｇの活性化は、増殖細胞のパーセンテージの測定ならびにＣＤ７１発現およびＩＬ－１０分泌のレベルにより評価した。
【0207】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ解析：非形質導入Ｔｒｅｇ細胞およびＣＶ－ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ細胞を採取し、３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、ＣＤ７１表面染色抗体およびＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）バイアビリティー色素カクテル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた１×ＲｏｂｏＳｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁した。Ｔｒｅｇは、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離して１×ＲｏｂｏＳｅｐ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。次いで、染色した細胞を、フローサイトメトリーにより解析した。
結果
結果
【0208】
シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に応答したＴｒｅｇの活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。図１３は、増殖細胞、ＣＤ７１発現、およびＩＬ－１０分泌の増加により実証されたようにＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞の用量依存的なＣＶ誘導活性化を示す。対照的に、非形質導入Ｔｒｅｇ細胞はＣＶにより活性化されなかった。このような結果により、ＣＶによる刺激の際のＴｒｅｇの活性化は、ＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇに特異的であることが実証される。
【0209】
健常ドナーおよび関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑液に存在するＣＶの量を、図１４に示すようにＥＬＩＳＡにより評価した。３つの異なるＣＶ－ＣＡＲのうちの１つまたは対照ＣＤ１９－ＣＡＲを発現するジャーカットレポーター細胞を漸増量の滑液とともにインキュベートし、ＣＶ－ＣＡＲ結合およびＴ細胞活性化のためのシグナル伝達の指標として応答を測定した。図１４は、ＣＶ－ＣＡＲ３（Ｃ０３）またはＣＤ１９－ＣＡＲではなく、ＣＶ－ＣＡＲ１（ＢＶＣＡ１）およびＣＶ－ＣＡＲ２（ＳＢＴ０１Ｇ）を発現するジャーカット細胞（不死化ヒトＴリンパ球）が、滑液（ＳＦ）に応答して増加を示したことを示す。また、図１４は、ＣＶ－ＣＡＲ２（ＳＢＴ０１Ｇ）Ｔ細胞が、ＲＡ患者由来のＳＦ試料によって、ＣＶ－ＣＡＲ１（ＢＶＣＡ１）Ｔ細胞よりも活性化されたことを示す。
【0210】
ＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇがＲＡ患者の滑液中のシトルリン化抗原により活性化されることを実証するために、非形質導入ＴｒｅｇおよびＣＶ－ＣＡＲ２ ＴｒｅｇをＲＡ滑液またはビヒクルとともにインキュベートし、増殖およびＣＤ７１発現のレベルを測定した。図１５は、ドナー２名由来のＣＶ－ＣＡＲ２ Ｔｒｅｇ細胞が、ＲＡ滑液特異的に活性化されたことを示す。
【0211】
まとめると、このような結果により、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞は、ＲＡ滑液中に存在するシトルリン化抗原に結合して、抑制機能に必要な活性化を生じさせることが可能であることが確立される。
（実施例６）
ＣＶ－ＣＡＲ ＴｒｅｇによるＴｅｆｆ細胞のＣＶ誘導抑制の評価
（実施例６）
ＣＶ－ＣＡＲ ＴｒｅｇによるＴｅｆｆ細胞のＣＶ誘導抑制の評価
【0212】
Ｔｒｅｇ抑制アッセイ － ＣＶ－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞を、９６ウェルのＵ底プレート内で新鮮なヒトリューコパックから上記のように調製した。Ｔｒｅｇを、抗原刺激としてＣＶまたはビヒクル対照とともにインキュベートした。Ｔｒｅｇを、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔｅｆｆ細胞またはＣＤ１９－ＣＡＲ特異的Ｔｅｆｆ細胞のいずれかと共培養して、標的細胞のＴｒｅｇによる抑制を評価した。Ｔｅｆｆ細胞は、次のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比：（ＣＤ３／ＣＤ２８活性化）１：４＝０．２５、１：２＝０．５、１：１＝１、２：１＝２、および４：１＝４、または（ＣＤ１９特異的）１：４、１：２、１：１、２：１、および４：１で共培養した。
結果
結果
【0213】
図１６Ａは、ＣＶにより刺激されたＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇが、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔｅｆｆ細胞の増殖を低いＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で抑制可能であったことを示す。図１６Ｂは、ＣＶにより刺激されたＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇも、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔｅｆｆ細胞の増殖を低いＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で抑制可能であったことを示す。
（実施例７）
ＣＶ関連肺炎症の齧歯動物モデルにおけるＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの解析
（実施例７）
ＣＶ関連肺炎症の齧歯動物モデルにおけるＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの解析
【0214】
ヒト関節リウマチ（ＲＡ）患者では、一貫して高い濃度の滑液中シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）が、ヒトＲＡについての関連バイオマーカーとしてＣＶを同定する。しかし、現在のＲＡマウスモデルでは、矛盾したＣＶレベルを呈し、これによりｉｎ ｖｉｖｏでのＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ解析が複雑となる。ＣＶの産生および細胞外マトリックスへの放出を誘導するために、ＬＰＳ誘発肺炎症マウスモデルを開発した。このモデルは、ＬＰＳの鼻腔内曝露後数日以内の、肺好中球増加症、炎症性サイトカインであるインターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１ｂ）、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の分泌増加、ならびに肺組織内でのＣＶ蓄積を含む急性炎症応答により特徴付けられる。ＣＶに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、肺組織内に蓄積したＣＶタンパク質に反応することが示されており、これによってそれぞれのＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞の抗原特異的な生存、増殖、および抑制活性の増加をもたらす。
方法
方法
【0215】
６～８週齢の免疫不全ＮＣＧマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。マウスは体重により無作為化し、５～１０匹の動物群に分けた。０、１、６、および１２日目にマウスをＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）による鼻腔内（ＩＮ）処置に供して肺炎症を誘発し、罹患組織内にシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）を放出および蓄積させた。０日目にＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞を活発に成長している培養物から回収し、刺激ビーズを磁気的に除去し、その後、ＴｒｅｇをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。最初のＬＰＳチャレンジ後約４時間に、ＣＴＶ標識Ｔｒｅｇを０．９％の滅菌食塩水（ＮａＣｌ）により２５×１０６細胞／ｍＬに調整し、用量２００μｌを静脈内に（ＩＶ）注射して各マウスに総量５×１０６細胞を投与した。ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇまたは対照ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの養子細胞移植後、１、２、５、６、７、８、９、および１２日目にすべてのマウスにＩＬ－２（１６０，０００ＩＵ）の腹腔内（ＩＰ）注射を与えた。マウスは、窮迫のあらゆる臨床的徴候について毎日モニタリングし、体重を１週間に２回測定した。１３日目にマウスを安楽死させ、脾臓および肺を回収し、単一細胞懸濁物へと処理して、ヒトＣＶ－ＣＡＲ ＴｒｅｇおよびＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔｒｅｇのフローサイトメトリー解析を行った。
結果
結果
【0216】
図１７は、マウスにおけるＣＶに関連する肺炎症の誘発およびｉｎ ｖｉｖｏでのＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞の活性化についての例となるタイムラインを示す。
結果
結果
【0217】
【0218】
図１９Ａは、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの絶対数が、ＬＰＳ誘発肺炎症を有するマウス由来の肺組織において有意に富化されたことを示す。図１９Ｂは、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの増殖比が、ＬＰＳ誘発肺炎症を有するマウス由来の肺組織において有意に増加したことを示す。このような結果により、ＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは対照Ｔｒｅｇと比較して、シトルリン化ビメンチンの蓄積により特徴付けられる炎症肺組織に磨きをかけ、該炎症肺組織において増殖する能力が向上していることが実証される。したがって、このマウス肺炎症モデルにより、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＣＶ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの検査が可能となる。
例となる実施形態
１．抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原結合ドメインが、シトルリン化ポリペプチドに結合し、必要に応じて、抗原結合ドメインが、３つまたはこれよりも多い異なるシトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片に特異的に結合する、ＣＡＲ。
２．抗原結合ドメインが、異なるシトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片の複数に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
３．抗原結合ドメインが、例えば、１０、１２、１４または１６アミノ酸の少なくともいずれかの、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲン、および（ｉｖ）これらのシトルリン化ペプチド断片の１つまたは複数に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
４．抗原結合ドメインが、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、および（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲンの少なくとも２つ、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
５．抗原結合ドメインが、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、および（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲンの３つすべて、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
６．シトルリン化テネイシンＣにさらに結合する、実施形態５に記載のＣＡＲ。
７．抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、
（ｉ）ＶＨドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
（ｉｉ）標的結合ドメインのＶＬドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
８．細胞内シグナリングドメインが、ＣＤ３ゼータに由来する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
９．少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＦｃｅＲ１ｇ、Ｆｃｇ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ－２８ハイブリッド、ＤＡＰ１０、ＣＤ２７、および２Ｂ４からなる群のメンバーに由来し、必要に応じて、少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
１０．抗原結合ドメインが、抗体、抗体断片、ラクダ類ナノボディ、重鎖のみの抗体またはアプタマーを含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
１１．膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメインまたはＣＤ２８ヒンジドメインである、および／またはシグナルペプチドをさらに含み、必要に応じて、シグナルペプチドが、ＣＤ８シグナルペプチドまたはＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
１２．抗原特異的結合ドメインが、一本鎖断片を含む、実施形態１１に記載のＣＡＲ。
１３．一本鎖断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、必要に応じて、ｓｃＦｖ断片が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、および
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、実施形態１２に記載のＣＡＲ。
１４．ｓｃＦｖ断片が、
（ａ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
ＨＬＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＤＴＴＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＲＧＮＴＨＹＮＳＳＬＲＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＲＦＳＬＫＶＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）から選択されるＶＨ、および
（ｂ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＬＡＰＧＥＴＡＴＩＴＣＧＧＤＤＩＥＮＱＮＶＮＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＭＬＬＩＦＦＤＴＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＲＳＥＤＴＡＮＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＤＡＤＹＦＣＱＶＹＤＲＫＴＤＨＱＶＦＧＰＧＴＴＶＴＶＬ（配列番号３）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＱＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号４）
から選択されるＶＬ
を含む、実施形態１３に記載のＣＡＲ。
１５．ＶＨ－ＶＬ断片が、（ｉ）ＧＧＧＳ×３（配列番号２０）、（ｉｉ）Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８（配列番号２１）、および（ｉｉｉ）ＡＢ Ｐｕｒ（配列番号２２）からなる群から選択されるリンカーにより接合されている、実施形態１４に記載のＣＡＲ。
１６．ｓｃＦｖが、
（ａ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳ×３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
（ＧＧＧＳｘ３リンカーに下線を付す）、または
（ｂ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
（Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカーに下線を付す）、または
（ｃ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
（ＡＢ ｐｕｒリンカーに下線を付す）
のアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のＣＡＲ。
１７．共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、またはＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ－Ｒ共刺激ドメインを含む、実施形態１～１６のいずれかに記載のＣＡＲ。
１８．実施形態１～１７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸。
１９．ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、実施形態１８に記載の核酸。
２０．ＶＨが、
を含む核酸配列によりコードされ、
ＶＬが、
を含む核酸配列によりコードされる、実施形態１８に記載の核酸。
２１．ＶＨおよびＶＬ断片が、リンカーにより接合されており、（ｉ）配列番号１２、（ｉｉ）配列番号１３、または（ｉｉｉ）配列番号１４の核酸配列を含む、実施形態２０に記載の核酸。
２２．実施形態１６～２１のいずれかに記載の核酸配列に作動的に連結する発現制御配列を含む発現ベクター。
２３．発現制御配列が調節領域を含み、調節領域が、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化、シグナル、ならびにイントロンからなる群から選択される、実施形態２２に記載の発現ベクター。
２４．アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはプラスミドである、実施形態２３に記載の発現ベクター。
２５．実施形態２２、２３または２４の発現ベクターを含む宿主細胞。
２６．実施形態１～１７のいずれかに記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾した修飾Ｔ細胞。
２７．哺乳動物Ｔ細胞である、実施形態２６に記載の修飾Ｔ細胞。
２８．Ｔｒｅｇ細胞である、実施形態２７に記載の修飾Ｔ細胞。
２９．ヒトＴ細胞である、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。
３０．初代Ｔ細胞である、実施形態２９に記載の修飾Ｔ細胞。
３１．ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、およびＣＤ１２７ｌｏである、実施形態３０に記載の修飾Ｔ細胞。
３２．実施形態２６～３１のいずれかに記載の修飾Ｔ細胞の複数および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３３．関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、有効量の、実施形態３２に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
３４．対象がヒトである、実施形態３３に記載の方法。
３５．医薬組成物を対象の滑膜に投与する、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６．医薬組成物を静脈内に投与する、実施形態３３または３４に記載の方法。
３７Ａ．投与するステップが、
（ａ）対象から得られる生体試料からＴ細胞を単離するステップと、
（ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）についてＴ細胞を富化するステップと、
（ｃ）富化したＴｒｅｇ細胞に、シトルリン化ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結する発現制御配列を含む発現ベクターをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）トランスフェクトしたＴｒｅｇ細胞を増大させるステップと、
（ｅ）増大させたＴｒｅｇ細胞を対象に投与するステップと
を含む、実施形態３３に記載の方法。
３７Ｂ．関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、
（ａ）対象から得られる生体試料からＴ細胞を単離するステップと、
（ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）についてＴ細胞を富化するステップと、
（ｃ）富化したＴｒｅｇ細胞に、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のＣＡＲをコードする発現ベクターをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）トランスフェクトしたＴｒｅｇ細胞を増大させるステップと、
（ｅ）増大させたＴｒｅｇ細胞を対象に投与するステップと
を含む、方法。
３８．増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用することを含む、実施形態３７に記載の方法。
３９．増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用しない、実施形態３７に記載の方法。
４０．トランスフェクションが、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、熱ショック、バクテリオファージ、超音波処理、またはリン酸カルシウムの使用により行われる、実施形態３７～４０のいずれかに記載の方法。
４１．１つまたは複数の抗炎症剤および／または治療剤を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態３７に記載の方法。
４２．抗炎症剤が、炎症性サイトカインを阻害する抗体を含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．抗炎症剤が、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ－６抗体、またはこれらの組合せである、実施形態４２に記載の方法。
４４．実施形態３２に記載の医薬組成物を含み、流体導管を介してドリップチャンバーと連通する容器を含むキットであって、ドリップチャンバーが、流体導管を介して静脈内注射針と連通する、キット。
４５．容器がバッグを含む、実施形態４４に記載のキット。
４６．容器と針との間の流体導管が、１つまたは複数のＹ部位とローラークランプとを含む、実施形態４４に記載のキット。
例となる実施形態
１．抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原結合ドメインが、シトルリン化ポリペプチドに結合し、必要に応じて、抗原結合ドメインが、３つまたはこれよりも多い異なるシトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片に特異的に結合する、ＣＡＲ。
２．抗原結合ドメインが、異なるシトルリン化タンパク質またはこのシトルリン化断片の複数に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
３．抗原結合ドメインが、例えば、１０、１２、１４または１６アミノ酸の少なくともいずれかの、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲン、および（ｉｖ）これらのシトルリン化ペプチド断片の１つまたは複数に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
４．抗原結合ドメインが、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、および（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲンの少なくとも２つ、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
５．抗原結合ドメインが、（ｉ）シトルリン化ビメンチン、（ｉｉ）シトルリン化フィラグリン、および（ｉｉｉ）シトルリン化フィブリノゲンの３つすべて、またはこれらのシトルリン化ペプチド断片に結合する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
６．シトルリン化テネイシンＣにさらに結合する、実施形態５に記載のＣＡＲ。
７．抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、
（ｉ）ＶＨドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
（ｉｉ）標的結合ドメインのＶＬドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
８．細胞内シグナリングドメインが、ＣＤ３ゼータに由来する、実施形態１に記載のＣＡＲ。
９．少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＦｃｅＲ１ｇ、Ｆｃｇ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ－２８ハイブリッド、ＤＡＰ１０、ＣＤ２７、および２Ｂ４からなる群のメンバーに由来し、必要に応じて、少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
１０．抗原結合ドメインが、抗体、抗体断片、ラクダ類ナノボディ、重鎖のみの抗体またはアプタマーを含む、実施形態１に記載のＣＡＲ。
１１．膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメインまたはＣＤ２８ヒンジドメインである、および／またはシグナルペプチドをさらに含み、必要に応じて、シグナルペプチドが、ＣＤ８シグナルペプチドまたはＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
１２．抗原特異的結合ドメインが、一本鎖断片を含む、実施形態１１に記載のＣＡＲ。
１３．一本鎖断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、必要に応じて、ｓｃＦｖ断片が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、および
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、実施形態１２に記載のＣＡＲ。
１４．ｓｃＦｖ断片が、
（ａ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｍ）
ＨＬＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＤＴＴＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＲＧＮＴＨＹＮＳＳＬＲＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＲＦＳＬＫＶＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＨ（Ｇ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）から選択されるＶＨ、および
（ｂ）（１）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｍ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＬＡＰＧＥＴＡＴＩＴＣＧＧＤＤＩＥＮＱＮＶＮＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＭＬＬＩＦＦＤＴＲＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＲＳＥＤＴＡＮＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＤＡＤＹＦＣＱＶＹＤＲＫＴＤＨＱＶＦＧＰＧＴＴＶＴＶＬ（配列番号３）、または
（２）ＳＢＴ０１ ＶＬ（Ｇ）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＱＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号４）
から選択されるＶＬ
を含む、実施形態１３に記載のＣＡＲ。
１５．ＶＨ－ＶＬ断片が、（ｉ）ＧＧＧＳ×３（配列番号２０）、（ｉｉ）Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８（配列番号２１）、および（ｉｉｉ）ＡＢ Ｐｕｒ（配列番号２２）からなる群から選択されるリンカーにより接合されている、実施形態１４に記載のＣＡＲ。
１６．ｓｃＦｖが、
（ａ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＧＧＧＳ×３リンカー－ｐＳＢ＿０１４９
【化11】
（ｂ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗ２１８リンカー－ｐＳＢ＿０１５８
【化12】
（ｃ）ＳＢＴ０１Ｇ－ＶＨＶＬ－ＡＢ ｐｕｒリンカー－ｐＳＢ＿０１５９
【化13】
のアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のＣＡＲ。
１７．共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、またはＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ－Ｒ共刺激ドメインを含む、実施形態１～１６のいずれかに記載のＣＡＲ。
１８．実施形態１～１７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸。
１９．ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、実施形態１８に記載の核酸。
２０．ＶＨが、
【化14】
ＶＬが、
【化15】
２１．ＶＨおよびＶＬ断片が、リンカーにより接合されており、（ｉ）配列番号１２、（ｉｉ）配列番号１３、または（ｉｉｉ）配列番号１４の核酸配列を含む、実施形態２０に記載の核酸。
２２．実施形態１６～２１のいずれかに記載の核酸配列に作動的に連結する発現制御配列を含む発現ベクター。
２３．発現制御配列が調節領域を含み、調節領域が、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化、シグナル、ならびにイントロンからなる群から選択される、実施形態２２に記載の発現ベクター。
２４．アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはプラスミドである、実施形態２３に記載の発現ベクター。
２５．実施形態２２、２３または２４の発現ベクターを含む宿主細胞。
２６．実施形態１～１７のいずれかに記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾した修飾Ｔ細胞。
２７．哺乳動物Ｔ細胞である、実施形態２６に記載の修飾Ｔ細胞。
２８．Ｔｒｅｇ細胞である、実施形態２７に記載の修飾Ｔ細胞。
２９．ヒトＴ細胞である、実施形態２８に記載の修飾Ｔ細胞。
３０．初代Ｔ細胞である、実施形態２９に記載の修飾Ｔ細胞。
３１．ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、およびＣＤ１２７ｌｏである、実施形態３０に記載の修飾Ｔ細胞。
３２．実施形態２６～３１のいずれかに記載の修飾Ｔ細胞の複数および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
３３．関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、有効量の、実施形態３２に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
３４．対象がヒトである、実施形態３３に記載の方法。
３５．医薬組成物を対象の滑膜に投与する、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６．医薬組成物を静脈内に投与する、実施形態３３または３４に記載の方法。
３７Ａ．投与するステップが、
（ａ）対象から得られる生体試料からＴ細胞を単離するステップと、
（ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）についてＴ細胞を富化するステップと、
（ｃ）富化したＴｒｅｇ細胞に、シトルリン化ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結する発現制御配列を含む発現ベクターをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）トランスフェクトしたＴｒｅｇ細胞を増大させるステップと、
（ｅ）増大させたＴｒｅｇ細胞を対象に投与するステップと
を含む、実施形態３３に記載の方法。
３７Ｂ．関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、
（ａ）対象から得られる生体試料からＴ細胞を単離するステップと、
（ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）についてＴ細胞を富化するステップと、
（ｃ）富化したＴｒｅｇ細胞に、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のＣＡＲをコードする発現ベクターをトランスフェクトするステップと、
（ｄ）トランスフェクトしたＴｒｅｇ細胞を増大させるステップと、
（ｅ）増大させたＴｒｅｇ細胞を対象に投与するステップと
を含む、方法。
３８．増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用することを含む、実施形態３７に記載の方法。
３９．増大が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズを使用しない、実施形態３７に記載の方法。
４０．トランスフェクションが、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、熱ショック、バクテリオファージ、超音波処理、またはリン酸カルシウムの使用により行われる、実施形態３７～４０のいずれかに記載の方法。
４１．１つまたは複数の抗炎症剤および／または治療剤を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態３７に記載の方法。
４２．抗炎症剤が、炎症性サイトカインを阻害する抗体を含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．抗炎症剤が、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ－６抗体、またはこれらの組合せである、実施形態４２に記載の方法。
４４．実施形態３２に記載の医薬組成物を含み、流体導管を介してドリップチャンバーと連通する容器を含むキットであって、ドリップチャンバーが、流体導管を介して静脈内注射針と連通する、キット。
４５．容器がバッグを含む、実施形態４４に記載のキット。
４６．容器と針との間の流体導管が、１つまたは複数のＹ部位とローラークランプとを含む、実施形態４４に記載のキット。
【0219】
本記載および本図面は、開示する特定の形態に本発明を制限することは意図しないが、反対に、添付の特許請求の範囲により定義する本発明の趣旨および範囲に含まれるすべての修正形態、均等物、および代替物を包含することを意図することを理解すべきである。本発明の種々の態様のさらなる修正形態および代替実施形態は、本記載を考慮すれば当業者に明らかである。したがって、本記載および本図面は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実行する一般的様式を当業者に教示する目的のためのものである。本明細書において指示および記載する本発明の形態は、実施形態の例として解釈されることを理解すべきである。要素および材料は本明細書において例示および記載するものと置換してもよく、部分およびプロセスは逆行または省略してもよく、すべては本発明の記載の利点を有した後に当業者に明らかとなるように、本発明のある特定の特徴を独立的に利用してもよい。次の特許請求の範囲に記載する本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の要素の変更を行い得る。本明細書において使用する見出しは、単なる構成目的のためのものであり、本記載の範囲を制限するために使用することは意図しない。
【0220】
本明細書において言及するすべての公表文献、特許、および特許出願は、個々の公表文献、特許、または特許出願をそれぞれ参照により組み込むものと詳細かつ個別に示す場合と同様に参照により本明細書において組み込む。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【配列表】
【国際調査報告】