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特表2024-528094インデックスを付したスプリントオリゴを使用したライゲーションによる長い核酸のアセンブリー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】インデックスを付したスプリントオリゴを使用したライゲーションによる長い核酸のアセンブリー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6818 20180101AFI20240719BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240719BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240719BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240719BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6818 Z
C12N15/11 Z
C12P19/34 Z
C40B40/06
C12N9/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505406
(86)(22)【出願日】2022-08-02
(85)【翻訳文提出日】2024-02-29
(86)【国際出願番号】 US2022039193
(87)【国際公開番号】W WO2023014728
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】63/228,448
(32)【優先日】2021-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】タウシッグ，デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】サンパス，ニコラス・エム．
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR20
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B064AF27
4B064CA21
4B064CA36
4B064CB30
4B064CC01
4B064CC24
4B064CD15
4B064DA01
4B064DA13
(57)【要約】
本開示は、インデックスを付したスプリントオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド分子を酵素によりライゲーションすることにより、長い核酸をアセンブルする方法に関する。開示されている方法の実施において有用な、インデックスを付したスプリントオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド構造も開示される。本発明のキットは、開示されているオリゴヌクレオチド構造を含む核酸ライブラリーを含む。オリゴヌクレオチドは、高度に特異的な順序で連接されて、最適な所望のライゲーション産物を構築する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するための方法であって、（Ａ）第１のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、前記インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされ、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、前記インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされる、ステップと、
（Ｂ）前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端を前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にライゲーションし、これにより、第１のマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
（ａ）前記インデックスを付したスプリントが、スプリント配列、ならびに前記スプリント配列にフランキングする第１のインデックス配列および第２のインデックス配列をさらに含み、（ｂ）前記スプリント配列が、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端および前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端の両方にハイブリダイズし、
（ｃ）前記第１のインデックス配列が、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズして、第１の二本鎖インデックスエレメントを形成し、前記第２のインデックス配列が、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズして、第２の二本鎖インデックスエレメントを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記インデックスを付したスプリントの前記スプリント配列が、（ａ）二本鎖５’スプリントエレメントを形成する、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする５’エレメントと、
（ｂ）二本鎖３’スプリントエレメントを形成する、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする３’エレメントと
を含有し、前記スプリント配列の前記５’エレメントおよび前記３’エレメントが、接している、すなわち、介在するヌクレオチドがない、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
（１）前記第１のインデックス配列が、前記インデックスを付したスプリントの３’端に位置し、（２）前記第２のインデックス配列が、前記インデックスを付したスプリントの５’端に位置する、
請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
（ａ）前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、（１）前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）前記マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントと
を含み、
（ｂ）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む前記マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列と
を含み、
（ｃ）前記インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）前記第２のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）前記スプリント配列であって、
前記スプリント配列の前記５’エレメントが、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
前記スプリント配列の前記３’エレメントが、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、前記スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）前記第１のインデックス配列である３’末端配列と
を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項6】
各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（１）前記第１のインデックス配列が、前記インデックスを付したスプリントの５’端に位置し、（２）前記第２のインデックス配列が、前記インデックスを付したスプリントの３’端に位置する、
請求項２または３に記載の方法。
【請求項8】
（ａ）前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、（１）前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）前記マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントと
を含み、
（ｂ）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む前記マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列と
を含み、
（ｃ）前記インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）前記第１のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）前記スプリント配列であって、
前記スプリント配列の前記５’エレメントが、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
前記スプリント配列の前記３’エレメントが、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、前記スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）前記第２のインデックス配列である３’末端配列と
を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項9】
各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
各二本鎖インデックスエレメントが、１０～４０塩基対を含む、請求項２から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
（Ｃ）前記マルチコンポーネントライゲーション産物から前記インデックスを付したスプリントを変性させるステップと、その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を反復的に行うステップと
をさらに含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第４のインデックス配列が、前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に連結される、請求項５から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントに対して３’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、前記制限酵素切断の部位が、前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第４のインデックス配列が、切断可能なリンカーによって前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、前記切断の部位が、前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記第１のライゲーション産物における前記第２のＤＮＡコンポーネントから前記第４のインデックス配列を除去するステップと、前記第４のインデックス配列を有するさらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチド、および第２のスプリント配列を含むさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、
前記第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記さらに別のインデックスを付したスプリントの前記第２のスプリント配列が、前記さらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける５’末端配列にハイブリダイズする５’エレメント、および前記第１のライゲーション産物の３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメントを含有する、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記インデックスを付したスプリントが、第５のインデックス配列に隣接する第２のスプリント配列をさらに含み、前記第２のスプリント配列の前記５’エレメントが、前記第２のＤＮＡ配列コンポーネントの前記３’末端配列にハイブリダイズすることができる、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記第３のインデックス配列が、前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に連結される、請求項５から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントに対して５’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、前記制限酵素切断の部位が、前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記第３のインデックス配列が、切断可能なリンカーによって前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、前記切断の部位が、前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記第１のライゲーション産物における前記第１のＤＮＡ配列コンポーネントから前記第３のインデックス配列を除去するステップと、前記第３のインデックス配列を有するさらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、およびさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、
前記第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記さらに別のインデックスを付したスプリントの前記スプリント配列が、前記さらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメント、および前記第１のライゲーション産物における５’末端配列にハイブリダイズする５’エレメントを含有する、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ハイブリダイズするステップが、前記インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）に基づく温度の範囲で行われ、前記ライゲーションするステップが、前記スプリント配列の前記５’および前記３’エレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも高く、前記インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度で行われる、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記ライゲーションステップの温度が、約４５°～７０℃であり、リガーゼが熱安定性である、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記インデックスエレメントの融解温度が、約６０°～９０℃である、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記５’スプリントエレメントおよび前記３’スプリントエレメントの融解温度が、約２０°～４２℃である、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するためのオリゴヌクレオチド構造であって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドと、インデックスを付したスプリントとを含み、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記インデックスを付したスプリントに部分的にハイブリダイズされている、オリゴヌクレオチド構造。
【請求項26】
請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド構造をそれぞれ有する、オリゴヌクレオチド構造のセットまたはライブラリー。
【請求項27】
請求項２５に記載のセットまたはライブラリーを含む、キット。
【請求項28】
ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項２７に記載のキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２０２１年８月２日に出願された米国特許仮出願第６３／２２８，４４８号に基づく優先権の利益を主張する。
本出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２０２１年８月２日に出願された米国特許仮出願第６３／２２８，４４８号に基づく優先権の利益を主張する。
【0002】
本開示は、分子生物学の分野に関する。特に、本開示は、長い核酸、特に、長いＤＮＡライブラリーを生成するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ＤＮＡライブラリーは、生物学研究や創薬における広範囲の適用で使用される。現在、ＤＮＡライブラリーは、ほとんどの場合、固体表面における超並列様式で、または個々に化学合成されたオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）をプールすることにより、オリゴの化学合成によって生成される。これらのアプローチの主要な限界の１つは、単鎖化学合成によって作製され得るＤＮＡ分子の長さである。最も長い市販のオリゴライブラリーは現在、３５０ヌクレオチドの最大の長さを有する。しかし、遺伝子合成、タンパク質工学、ゲノム工学および突然変異飽和スキャニング等、多くの研究適用は、より長いＤＮＡライブラリーから利益を得るであろう。
【0004】
より長い長さのライブラリーを生成するアプローチの１つは、２個以上の化学合成されたオリゴをより長いコンストラクトとなるよう連接するＤＮＡリガーゼの作用による、ライブラリーメンバーの酵素によるアセンブリーが関与する。本分野で知られている方法は、所定の順序で配列を連結するための配列の特異的なアニーリングを達成するために、特異的な二本鎖配列における一本鎖の適合性オーバーハングに頼る。例えば、米国特許第６，４９５，３１８号を参照されたい。この’３１８号特許は、各小片に相補的な領域を有する単一のスプリントオリゴにハイブリダイズされる末端一本鎖部分を有する２個の特異的配列も開示する。理想的な条件下で、オリゴは、スプリントに適切にハイブリダイズし、リガーゼは、２個の小片を連接して、より長いコンストラクトを形成する。これと同様の方法は現在、様々な研究グループによって用いられているが、成功は部分的なものである。この方法の主要な弱点は、不十分な品質のライブラリーを生じ得るハイブリダイゼーション特異性である。
【0005】
長いオリゴの酵素によるアセンブリーの代替方法は、ライゲーションに先立ちコンストラクトを空間的に隔離するための、固体表面ＤＮＡアレイへのライブラリー小片のハイブリダイゼーションが関与する。例えば、米国特許第１０，５３８，７９６号を参照されたい。
【発明の概要】
【0006】
一部の態様では、本発明は、目的の配列に対する高い特異性を有する、溶液中で実施され得る方法の必要性に取り組む。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１は、オリゴヌクレオチドをマルチコンポーネントＤＮＡコンストラクトへとアセンブルするためのオリゴヌクレオチド構造の一型を描写する。オリゴヌクレオチド構造は、各オリゴヌクレオチド小片に相補的な隣接配列領域を有する単一のスプリントオリゴヌクレオチド（スプリント）にハイブリダイズされた、２個のオリゴヌクレオチド小片（１は、上流アセンブリーコンポーネントであるアセンブリーコンポーネント１であり、２は、下流アセンブリーコンポーネントであるアセンブリーコンポーネント２である）からなる。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネント１および２の接合部である。
【図2】図２は、オリゴヌクレオチドをマルチコンポーネントＤＮＡコンストラクトへとアセンブルするためのオリゴヌクレオチド構造の別の型を描写する。オリゴヌクレオチド構造は、インデックスを付したスプリント構造にハイブリダイズされた、２個のオリゴヌクレオチド小片（アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２）からなる。インデックスを付したスプリント構造は、スプリントオリゴヌクレオチドメンバーのペアを有する。ペアの各メンバーは、他方のメンバーの他方のインデックス配列にハイブリダイズして、二本鎖インデックスエレメント（インデックス）を形成し、よって、２個のアセンブリーコンポーネントを互いにごく近づけるための機能を果たす、インデックス配列を有する。一方のスプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドに相補的なスプリント配列領域（Ｌ－スプリント）を有する。他方のスプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１の３’末端部分およびアセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’末端部分に相補的なスプリント配列領域（Ｒ－スプリント）を有する。矢じりは、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。
【図3】図３は、オリゴヌクレオチドをマルチコンポーネントＤＮＡコンストラクトへとアセンブルするためのオリゴヌクレオチド構造の別の型を描写する。オリゴヌクレオチド構造は、図２における構造と同様に、インデックスを付したスプリント構造にハイブリダイズされた、２個のオリゴヌクレオチド小片（アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２）からなる。インデックスを付したスプリント構造は、スプリントオリゴヌクレオチドメンバーのペアを有する。ペアの各メンバーは、他方のメンバーの他方のインデックス配列にハイブリダイズして二本鎖インデックスエレメントを形成する、インデックス配列を有する。この構造において、スプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端の近位にない、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドにおける配列に相補的なスプリント配列領域（Ｌ－スプリント）を有し、アセンブリーコンポーネント１のループ状の部分をもたらす。他方のスプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１の３’末端部分およびアセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’末端部分に相補的なスプリント配列領域（Ｒ－スプリント）を有する。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。
【図4】図４は、オリゴヌクレオチドをマルチコンポーネントＤＮＡコンストラクトへとアセンブルするためのオリゴヌクレオチド構造の別の型を描写する。オリゴヌクレオチド構造は、単一のインデックスを付したスプリント分子にハイブリダイズされた、２個のオリゴヌクレオチド小片（アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２）からなる。この構造において、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドは、アセンブリー配列に対して５’にある５’インデックス配列を有する。インデックス配列は、インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列にハイブリダイズして、二本鎖インデックスエレメントを形成する。スプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端におけるアセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドにおける配列およびアセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’末端部分に相補的な配列領域（Ｒ－スプリント）を有し、アセンブリーコンポーネント１のループ部をもたらす（若干図３と同様）。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。
【図5】図５Ａ～図５Ｃは、オリゴヌクレオチドをマルチコンポーネントＤＮＡコンストラクトへとアセンブルするためのオリゴヌクレオチド構造の別の型を描写する。オリゴヌクレオチド構造は、２個のオリゴヌクレオチド小片（アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２）にハイブリダイズされる、インデックスを付したスプリント分子（図５Ａに描写）を含む。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。点線は、任意選択的なスペーサー配列を表す。図５Ａに示す通り、オリゴヌクレオチド構造のこの型において、インデックスを付したスプリント分子は、スプリント配列（スプリント）ならびに２個のインデックス配列ＡおよびＢ（インデックス配列Ｂおよびインデックス配列Ａ）を含む。インデックスを付したスプリント分子の２個のインデックス配列は、介在するスペーサー配列スペーサー１およびスペーサー２（点線）と共に、スプリント配列を挟む。スプリント配列は、スプリントの拡大に描写される通り、５’エレメントおよび３’エレメントを有する。スプリント配列の５’エレメントは、アセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする。スプリント配列の３’エレメントは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする。インデックスを付したスプリント分子の一方のインデックス配列は、一方のアセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの末端におけるインデックス配列にハイブリダイズする。インデックスを付したスプリント分子の他方のインデックス配列は、他方のアセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの末端におけるインデックス配列にハイブリダイズする。図５Ａおよび図５Ｂは、オリゴヌクレオチド構造における２個のアセンブリーコンポーネントに結合するインデックスを付したスプリント分子について、２種の例示的な方向性を図示する。図５Ｂは、二本鎖インデックスエレメント（インデックス２）が、アセンブリーコンポーネント２の３’端におけるインデックス配列へのインデックス配列Ａ（インデックスを付したスプリント分子の５’端におけるインデックス配列）のハイブリダイゼーションによって形成される、方向性を描写する。二本鎖インデックスエレメント（インデックス１）は、アセンブリーコンポーネント１の５’端におけるインデックス配列にハイブリダイズされたインデックス配列Ｂ（インデックスを付したスプリント分子の３’端におけるインデックス配列）によって形成される。スプリント配列の５’エレメントは、アセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする。スプリント配列の３’エレメントは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。図５Ｃは、二本鎖インデックスエレメント（インデックス１）が、アセンブリーコンポーネント１の５’端におけるインデックス配列（セグメントＣ）へのインデックス配列Ａ（インデックスを付したスプリント分子の５’端におけるインデックス配列）のハイブリダイゼーションによって形成される、第２の方向性を描写する。二本鎖インデックスエレメント（インデックス２）は、アセンブリーコンポーネント１の３’端におけるインデックス配列（セグメントＦ）にハイブリダイズされたインデックス配列Ｂ（インデックスを付したスプリント分子の３’端におけるインデックス配列）によって形成される。スプリント配列の５’エレメントは、アセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする。スプリント配列の３’エレメントは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。
【図6】図６は、図２の変種を図示するものであり、図中、オリゴヌクレオチド構造は、スプリントにハイブリダイズしないアセンブリー配列の領域にハイブリダイズされ得る少なくとも１個のブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカー１）を含む。２個のブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカー１およびブロッカー２）が図６に描写されている。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。意図されるライゲーションポイントは、アセンブリーコンポーネントの接合部である。１個または複数のブロッキングヌクレオチドが図５Ｂおよび図５Ｃのオリゴヌクレオチド構造において利用され得る。
【図7】図７は、４パートアセンブリープロセスの第１のライゲーションステップにおいてライゲーションされることになる２種のオリゴヌクレオチド構造を描写する。（図８および図９も参照）。第１のライゲーションステップは、２パートアセンブリーと同様の機構で別々の反応において、アセンブリーコンポーネント１＋２（上部構造）およびアセンブリーコンポーネント３＋４（下部構造）をアセンブルする。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。各オリゴヌクレオチド構造における意図されるライゲーションポイントが指し示されている。第１のスプリント構造（スプリント１）に加えて、上部オリゴヌクレオチド構造のインデックスを付したスプリントは、スペーサーセクションに第２のスプリント配列（スプリント２）を、ならびに５’インデックス配列（インデックス２）および第１のスプリント構造（スプリント１）の間に別のインデックス配列（インデックス３）を含む。下部オリゴヌクレオチド構造のインデックスを付したスプリントは、第１のスプリント構造（スプリント３）および５’インデックス配列（インデックス４）の間にインデックス３の相補的配列（インデックス３相補体）を含む。
【図8】図８は、４パートアセンブリープロセスの次のステップを描写する。図７に描写されるアセンブリーステップのライゲーション産物は、図８に図示されている。ライゲーションは、２個のマルチコンポーネントライゲーション産物である、アセンブルされた産物（１－２）（（ａ）に描写）およびアセンブルされた産物（３－４）（（ｃ）に描写）を生じる。インデックス配列と、アセンブルされた産物（１－２）およびアセンブルされた産物（３－４）のためのアセンブリーコンポーネントとの間に位置するＩＩＳ型制限酵素切断部位（ＲＥカット部位）も描写されている。図７に描写されるアセンブリーステップのライゲーション産物はそれぞれ、ＩＩＳ型制限酵素による消化に付されて、ＲＥ切断部位（図７には示されていない）で切断する。（ａ）におけるライゲーション産物において、（ｂ）に図示される通り、切断は、インデックス２を除去し、アセンブルされた産物（１－２）における３’端にアセンブリーコンポーネント配列のみを残す。（ｃ）におけるライゲーション産物において、（ｄ）に図示される通り、切断は、インデックス４を除去し、アセンブルされた産物（３－４）における５’端にアセンブリーコンポーネント配列のみを残す。その結果生じる産物は、例えば、ＳＰＲＩ精製によって精製される。
【図9】図９は、４パートアセンブリープロセスの第２のライゲーションステップを描写する。次に、制限消化の精製された産物（図８における（ｂ）および（ｄ）を参照）は、模式像において描写される通りに一体にハイブリダイズされ（インデックス３を参照）、ライゲーションされて、アセンブルされた産物を産生する（１－２－３－４）。この産物は、例えば、ＳＰＲＩによって精製し、追加のライゲーションに付すかまたはＰＣＲにより増幅することができる。例えば、プライマー配列が、インデックス１およびアセンブリーコンポーネント１のアセンブリー配列の間（フォワードプライマー）ならびにインデックス５およびアセンブリーコンポーネント４のアセンブリー配列の間（リバースプライマー）に存在してもよい。
【図10】図１０は、開示されている方法のバリアント態様を模式的に図示する。図１０は、２個のアセンブリーコンポーネントのインデックス配列が、２個のインデックス配列にハイブリダイズする単一のスプリント（「インデックススプリント」）にハイブリダイズされて、二本鎖インデックス１およびインデックス２を形成する、オリゴヌクレオチド構造を図示する。
【図11】図１１は、開示されている方法のバリアント態様を模式的に図示する。図１１は、図１０のオリゴヌクレオチド構造のライゲーション産物を描写する。図１１は、インデックススプリントが、固体支持体またはインデックスを付したアレイへの取付けのためにビオチン化されている、任意選択的な態様も図示する。
【図12】図１２は、開示されている方法のバリアント態様を模式的に図示する。図１２Ａおよび図１２Ｂは、第２のスプリント分子（「コンストラクトスプリント」）が、アセンブリーコンポーネントの３’および５’端にハイブリダイズしている、オリゴヌクレオチド構造を描写する。図１２Ａは、インデックスを付したスプリントが、スペーサー（「任意選択的な繋留」）を介してコンストラクトスプリントに連結されている、オリゴヌクレオチド構造を描写する。これは、５’から３’の向きに、第１のインデックス配列（オリゴ１の５’端におけるインデックスに結合して、インデックス１を形成する）；第２のインデックス配列（オリゴ２の３’端におけるインデックスに結合して、インデックス２を形成する）；スペーサー（任意選択的な繋留）；５’エレメントがオリゴ２の５’端にハイブリダイズし、３’エレメントがオリゴ鎖１の３’端にハイブリダイズする、スプリントを含む、請求されるインデックススプリント分子の別の実施形態を表す。図１２Ｂは、インデックススプリントに連結されていない第２のスプリント分子（「コンストラクトスプリント」）が、アセンブリーコンポーネントの３’および５’端にハイブリダイズされている、オリゴヌクレオチド構造を描写する。インデックススプリントが、固体支持体またはインデックスを付したアレイへの取付けのためにビオチン化されている、任意選択的な態様も描写される。
【図13】図１３は、開示されている方法のバリアント態様を模式的に図示する。図１３は、図１２Ｂのライゲーション産物を示す。図１３は、ライゲーション産物のアセンブリーコンポーネントに関する任意選択的な追加の構造特色も示す。任意選択的な制限酵素部位が、インデックススプリントの５’端において描写される。ＰＢＳ１およびＢＰＳ１は、アセンブリー産物の増幅に有用な（任意選択的な）プライマー結合部位を表す。
【図14】図１４は、図１、図２および図３に図示されるオリゴヌクレオチド構造（それぞれ、アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２をさらに含む）に描写される通りの３つの型の検査スプリント分子を使用した、低相同性ライブラリーの溶液アセンブリーを評価する実験に関するデータのグラフを描写する。検査スプリント分子の型毎に、スプリント対コンストラクトの３つの比を検査した（１：１、２：１および４：１）。図２および図３の検査スプリント分子は、３ヌクレオチド（ｎｔ）支柱あり（＋）およびなし（－）で調製した。アセンブルされたコンストラクトは、ＰＣＲ増幅されたアセンブルされたコンストラクトの次世代配列決定（ＮＧＳ）によって特徴付けした。グラフにおけるＹ軸は、１５セットのそれぞれにおける正しくアセンブルされたコンストラクトに関するリードの平均数である。さらなる情報については実施例１を参照されたい。
【図15】図１５は、図５Ｂの検査スプリント分子の模式図（上部パネル）および概念実証実験から得たデータ（下部パネル）を描写する。矢印は、オリゴヌクレオチドの３’端を指し示し；平らな端は、オリゴヌクレオチドの５’端である。プライマーＦ － ＰＣＲのためのフォワードプライマーの位置。プライマーＲ － ＰＣＲのためのリバースプライマーの位置。Ｔｍは、左および右コンストラクトオリゴヌクレオチド（それぞれアセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２）にハイブリダイズされるスプリントの各セクションの融解温度（すなわち、５’エレメントおよび３’エレメントの融解温度）である。ＢＣ１およびＢＣ２は、ペア形成したバーコード配列のポジションを指し示す。インデックス１およびインデックス２は、オリゴヌクレオチド構造におけるインデックスエレメントを指し示す。インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列およびスプリント配列の間の点線は、この検査では２０塩基ポリＴヌクレオチド配列であるスペーサー配列を指し示す。さらなる情報については実施例２を参照されたい。
【図17】図１７は、３つの型の代表的なオリゴライブラリー（図１６を参照）における３つの型の検査スプリント分子（図１、図２および図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造を参照）を利用したアセンブリーの検査に関する代表的なデータを描写する。さらなる情報については実施例３を参照されたい。
【図18】図１８は、検査スプリント分子（図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造）の模式図、ならびに異なるスプリント長さおよびライゲーション温度で検査スプリント分子を使用したアセンブリーに関する代表的なデータを描写する。実験において、スプリント対コンストラクトのハイブリダイズしたエレメント（５’エレメントおよび３’エレメント）のそれぞれの融解温度（Ｔｍ）の範囲を設計し、８種の異なる温度におけるライゲーションを検査した。６５．９℃ライゲーションデータのリード数値の中央値の数に関するデータが、グラフに描写されている。スプリント温度毎に、正しいリードおよび間違ったリードの割合が、リード数値の中央値で表されている。さらなる情報については実施例４を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【0008】
図面または本明細書のいずれかにおける「ハーフ」の使用、例えば、「ハーフコンストラクト左」は、限定を意図するものではない。例えば、「ハーフコンストラクト左」および「ハーフコンストラクト右」は、アセンブリーコンポーネント１およびアセンブリーコンポーネント２が同じ長さであることを指し示すと意図するものではない。アセンブリーコンポーネントは、サイズが異なりうる。この文脈において、「ハーフ」は、「部分」、「パート」または「オリゴヌクレオチド分子」に匹敵する。
【0009】
詳細な説明
本開示は、とりわけ、インデックスを付したスプリントオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを酵素によりライゲーションすることにより、溶液中で長いＤＮＡライブラリーを生成するための方法に関係する。態様では、オリゴヌクレオチドは、化学合成される。方法は一般に、より短いコンポーネントをライゲーションすることにより、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む長い核酸の産生に有用である。
本開示は、とりわけ、インデックスを付したスプリントオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを酵素によりライゲーションすることにより、溶液中で長いＤＮＡライブラリーを生成するための方法に関係する。態様では、オリゴヌクレオチドは、化学合成される。方法は一般に、より短いコンポーネントをライゲーションすることにより、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む長い核酸の産生に有用である。
【0010】
Ａ．定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含む。
【0011】
本明細書で使用される場合、用語「核酸アセンブリー」は、少なくとも２個の核酸断片もしくはオリゴヌクレオチドを特異的な順序で一体に物理的に連接して、所望の核酸配列（マルチコンポーネントコンストラクト）を創出する方法、またはこのプロセスの結果生じる核酸を指す。断片またはオリゴヌクレオチドのそれぞれは、「アセンブリーコンポーネント」（時に口語的に、「ハーフコンストラクト」と本明細書で称される）である。２個のアセンブリーコンポーネントが連接される場合、上流コンポーネントが「上流アセンブリーコンポーネント」（またはアセンブリーコンポーネント１または左ハーフコンストラクトまたはハーフコンストラクト左）であり、下流コンポーネントが「下流アセンブリーコンポーネント」（またはアセンブリーコンポーネント２または右ハーフコンストラクトまたはハーフコンストラクト右）である。上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）の３’端は、下流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント２）の５’端と連接される。アセンブリーコンポーネントは、アセンブリー配列および少なくとも１個の非アセンブリー配列を含む。「アセンブリー配列」は、最終マルチコンポーネントコンストラクトに含まれる目的の配列である。非アセンブリー配列は、インデックス配列、プライマー配列、制限酵素配列、バーコード配列その他等、アセンブリーの方法に関係する配列を指す。
【0012】
本明細書で使用される場合、用語「５’末端配列」は、核酸の５’末端を含むオリゴヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「３’末端配列」は、核酸の３’末端を含むオリゴヌクレオチド配列を指す。末端配列は、２個以上の連続したヌクレオチド、３個以上の、５個以上のもしくは１０個以上の連続したヌクレオチド、３０個以上の連続したヌクレオチド、５０個以上の連続したヌクレオチド、または１００個以上の連続したヌクレオチドを含有することができる。３’または５’「実質的に末端配列」は、３’または５’末端の近位にあるがそれを含まない配列を指す。例えば、３’または５’実質的に末端配列の３’または５’端は、それぞれ３’または５’末端ヌクレオチドの約１００ヌクレオチド以内、約５０ヌクレオチド以内、約３０ヌクレオチド以内、約２５ヌクレオチド以内、約２０ヌクレオチド以内、約１５ヌクレオチド以内、約１０ヌクレオチド以内、約５ヌクレオチド以内、約４ヌクレオチド以内、約３ヌクレオチド以内、約２ヌクレオチド以内または１ヌクレオチド以内となることができる。
【0013】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらのアナログを指す。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ、およびＲＮＡ分子、例えば、ガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡを含むがこれらに限定されない。さらに、本明細書で使用される場合、この用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
【0014】
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」は、完全にまたは部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖同士が、適したハイブリダイゼーション条件下で一体になって、２本の構成鎖が水素結合によって連接された二本鎖構造または領域を形成するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、用語「部分的ハイブリダイゼーション」は、二本鎖構造または領域が、１個または複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合は典型的に、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシル（それぞれＡとＴまたはＡとＵ）またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間に形成されるが、他の非正準的塩基対が形成される場合もある（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，” １１ｔｈ ｅｄ．， １９９２を参照）。修飾ヌクレオチドが、非正準的な仕方でのハイブリダイゼーションを可能にするまたは促進する水素結合を形成することができることが考慮される。
【0015】
本明細書で使用される場合、配列の「部分」、「セグメント」、「エレメント」または「断片」という用語は、完全な配列よりも小さい、配列のいずれかの部分（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポリヌクレオチドの部分、セグメント、エレメントまたは断片は、２個以上、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または５００個以上のヌクレオチドの長さである、いずれかの長さのものとなることができる。
【0016】
本明細書で使用される場合、用語「インデックスを付したスプリント」は、（１）少なくとも１個の標的配列にハイブリダイズすることができるスプリント配列、および（２）標的分子におけるインデックス配列にハイブリダイズすることができるインデックス配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。例えば、図５Ａを参照されたい。「標的」は、アセンブリーコンポーネントである。典型的には、インデックスを付したスプリントは、マルチコンポーネントコンストラクトへの２個の標的のライゲーションを容易にするために、２個の標的にハイブリダイズするように設計される。例えば、図５Ｂを参照されたい。その目的のために、スプリント配列は典型的に、両方の標的にハイブリダイズし、一方の標的の３’端および他方の標的の５’端を近づける。標的におけるインデックス配列は、インデックスを付したスプリントにおけるインデックス配列にハイブリダイズする目的で標的に付加された余分な配列である。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「インデックスを付したスプリント特異的な順序のライゲーション」は、実質的に一本鎖断片が、リガーゼを使用して互いにライゲーションされて、マルチコンポーネント核酸ライゲーション産物を産生するプロトコールを指し、この場合、ライゲーション産物における断片の順序は、ライゲーションされる２個の断片の３’末端配列および５’末端配列にハイブリダイズするスプリントを含むインデックスを付したスプリント分子によって方向付けられる。「実質的に一本鎖断片」は、インデックスを付したスプリント分子におけるスプリント配列にハイブリダイズされた３’もしくは５’末端配列、および／またはインデックスを付したスプリント分子におけるインデックス配列にハイブリダイズされた３’もしくは５’末端インデックス配列（または３’もしくは５’の実質的に末端インデックス配列）等、部分的二本鎖部分を含む断片を指す。
【0018】
「インデックスエレメント」は、互いの逆相補体である配列を有する２本の鎖によって形成された（で構成された）二本鎖ＤＮＡセグメントを指す。「インデックス配列」は、互いの逆相補体であり、互いへのハイブリダイゼーションによってインデックスエレメントを形成する、配列の２本の鎖の一方である配列を指す。一部の実施形態では、インデックス配列は、パリンドローム型ではない（例えば、ステムループも他の二次構造もない）。単一のインデックスを付したスプリントにおける２個のインデックス配列は、互いにハイブリダイズしない。
【0019】
本開示の方法および産物は、少なくとも一部には、図５、パネルＡに模式的に描写される通りのインデックスを付したスプリント分子の利用が、オリゴヌクレオチドライブラリーにおけるマルチコンポーネントコンストラクトの改善されたアセンブリーをもたらすという予想外の発見に基づく。ライゲーションされるアセンブリーコンポーネントの各ペアが、アセンブリーコンポーネントのペアに特異的なスプリント配列およびインデックス配列を有する対応するインデックスを付したスプリント分子を有する、インデックスを付したスプリント特異的な順序のライゲーションを使用することにより、相同オリゴライブラリー（オリゴが相当な程度の配列相同性を共有するオリゴライブラリー）における場合であっても、オリゴヌクレオチドライブラリーにおける複数の正しいコンストラクトのアセンブリーが可能となる。インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列は、コンストラクト配列の一部ではなく、よって、ライブラリーメンバー間の相同性によって影響されない。これは、マルチプレックスアセンブリーの以前のハイスループット方法を上回る予想外の利益および改善である。
【0020】
本明細書で使用される場合、「一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物」は、その中に溶解された複数の異なる一本鎖オリゴヌクレオチドを含有する水溶液を指す。混合物は、５０～例えば５０，０００の間のいずれかの値を含む、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００または少なくとも５０，０００種以上のオリゴヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドの混合物は、ｉｎ ｓｉｔｕでオリゴヌクレオチドを合成する、すなわち、アレイにおいて適所にオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、合成された後にアレイの表面からオリゴヌクレオチドを切断することにより作製することができる。例えば、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００４ １： ２４１－２４８）およびＬｅＰｒｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０ ３８： ２５２２－２５４０）を参照されたい。
【0021】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドの多量体を表示する。例えば、オリゴヌクレオチドは、約２～約２００ヌクレオチド、最大で約５０ヌクレオチド、最大で約１００ヌクレオチド、最大で約５００ヌクレオチドの長さ、または２～５００の間のいずれかの整数値のヌクレオチド数を有することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３０～３００ヌクレオチドの長さまたは３０～４００ヌクレオチドの長さの範囲内となることができる。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体（すなわち、オリゴリボヌクレオチドとなることができる）および／またはデオキシリボヌクレオチド単量体を含有することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０または３５０～４００ヌクレオチドの長さ、およびこれらの範囲の間のいずれかの整数値となることができる。
【0022】
本明細書で使用される場合、用語「マルチコンポーネントライゲーション産物を産生するためにアセンブルされ得る一本鎖オリゴヌクレオチドのセット」およびその文法上の均等物は、定義された順序で、オリゴヌクレオチドのそれぞれに由来する配列を含有する「マルチコンポーネントコンストラクト」または「マルチコンポーネントライゲーション産物」と本明細書で称されるより長い配列へと酵素によりアセンブルされ得る、オリゴヌクレオチドのセットを指す。本開示から理解される通り、セットの一本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｉ）インデックスを付したスプリント分子における相補的配列にハイブリダイズして二本鎖インデックスエレメントを形成するインデックス配列である、３’または５’末端（または実質的に末端）配列、および（ｉｉ）インデックスを付したスプリント分子におけるスプリント配列にハイブリダイズする５’または３’末端配列を含むアセンブリー配列を含有することができる。「アセンブリー配列」は、最終コンストラクトに含まれる目的の配列であり、インデックス配列、プライマー配列、制限酵素配列、バーコード配列その他等、アセンブリーの方法に関係する配列を含まない。
【0023】
本明細書で開示される場合、値の多数の範囲が提供される。当該範囲の上限および下限の間に介在する値のそれぞれもまた、特に考慮されることが理解される。記述される範囲によって包含されるより小さい範囲または介在する値のそれぞれもまた、特に考慮される。用語「約」は一般に、指し示される数のプラスマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を指し示すことができ、「約２０」は、１８～２２を意味することができる。「約」の他の意義は、四捨五入すること等、文脈から明らかとなることができるため、例えば、「約１」は、０．５～１．４を意味することもできる。
【0024】
用語の他の定義は、本明細書を通して現れる可能性がある。
【0025】
Ｂ．方法および産物の記載
所望のコンストラクトを形成するための酵素によるライゲーションのための特異的オリゴヌクレオチドをアセンブルするための一方法が、図１に描写されている。図１は、ライゲーションされる２個のオリゴヌクレオチドを描写しており、そのうち一方は、上流オリゴヌクレオチド（「アセンブリーコンポーネント１」）であり、もう一方は、下流オリゴヌクレオチド（「アセンブリーコンポーネント２」）である。上流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、ライゲーションポイントの上流（５’から３’への基盤で）にあり、下流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、ライゲーションポイントの下流にある。上流および下流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、単一のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントオリゴヌクレオチドは、相補的配列の２個の領域を有し、そのうち一方は、上流コンストラクトオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、他方は、下流コンストラクトオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、これにより、左コンストラクトの３’端が、右コンストラクトの５’端に直接隣接して、意図されるライゲーション部位を形成する。ハイブリダイゼーション条件下で、２個のアセンブリーコンポーネントは、単一のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、リガーゼは、２個の小片を連接して、より長いマルチコンポーネントコンストラクトを形成する。
所望のコンストラクトを形成するための酵素によるライゲーションのための特異的オリゴヌクレオチドをアセンブルするための一方法が、図１に描写されている。図１は、ライゲーションされる２個のオリゴヌクレオチドを描写しており、そのうち一方は、上流オリゴヌクレオチド（「アセンブリーコンポーネント１」）であり、もう一方は、下流オリゴヌクレオチド（「アセンブリーコンポーネント２」）である。上流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、ライゲーションポイントの上流（５’から３’への基盤で）にあり、下流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、ライゲーションポイントの下流にある。上流および下流コンストラクトオリゴヌクレオチドは、単一のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントオリゴヌクレオチドは、相補的配列の２個の領域を有し、そのうち一方は、上流コンストラクトオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、他方は、下流コンストラクトオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、これにより、左コンストラクトの３’端が、右コンストラクトの５’端に直接隣接して、意図されるライゲーション部位を形成する。ハイブリダイゼーション条件下で、２個のアセンブリーコンポーネントは、単一のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、リガーゼは、２個の小片を連接して、より長いマルチコンポーネントコンストラクトを形成する。
【0026】
一部の実施形態では、開示されている方法は、ライゲーションのためのアセンブリーコンポーネントをアセンブルするための、スプリント領域ならびに２個のインデックス配列ＡおよびＢを含むインデックスを付したスプリント分子（例えば、図５Ａを参照）を用いる。インデックスを付したスプリント分子の２個のインデックス配列は、介在するスペーサー配列（点線）と共に、スプリント配列を挟む。スプリント領域は、スプリントの拡大に描写される通り、５’エレメントおよび３’エレメントを有する。スプリント配列の５’エレメントは、アセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする（例えば、図５Ｂを参照）。スプリント配列の３’エレメントは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする。一部の態様では、インデックス配列ＡおよびＢは、パリンドローム型ではなく（例えば、ステムループも他の二次構造もない）、また、互いにハイブリダイズすることもない。インデックスを付したスプリント分子の一方のインデックス配列は、一方のハーフコンストラクトの末端においてインデックス配列にハイブリダイズする。インデックスを付したスプリント分子の他方のインデックス配列は、他方のハーフコンストラクトの末端におけるインデックス配列にハイブリダイズする。よって、両者が２個のハーフコンストラクトにハイブリダイズするスプリント配列およびインデックス配列により、インデックスを付したスプリントは、２個のハーフコンストラクトを近づけ、これらをライゲーションのためのポジションにおいて整列する。
【0027】
インデックス配列は、目的の配列の一部ではない。これらは、両方のアセンブリーコンポーネントの端に付加された余分な配列である。そのようなものとして、特に、複数の異なるアセンブリーコンポーネントが、同じ反応においてライゲーションされる場合（すなわち、マルチプレックス）、これらは、可能な限り反応混合物における他の配列とは異なるものとして設計され、よって、アセンブリーコンポーネントの意図されないペアの機会を低減させることができる。
【0028】
スプリントの３’エレメントおよび５’エレメントはそれぞれ、約５～２０ヌクレオチドの長さであり、任意選択的に、インデックスエレメントの融解温度に満たない融解温度を有する。一部の実施形態では、２個のアセンブリーコンポーネントの意図されないペア形成を実質的に低減または排除するために、スプリントエレメントは、単独では（すなわち、インデックスエレメントの非存在下では）、反応条件下でのハイブリダイゼーションを駆動するのに十分となるべきではないが、アセンブリーコンポーネントが、２個のアセンブリーコンポーネントへのインデックスを付したスプリントのインデックス配列のハイブリダイゼーションにより適所に保持された場合、単に一過的にハイブリダイズするであろう。これは、反応におけるアセンブリーコンポーネントが、相当な程度の相同性（例えば、相同オリゴライブラリー）を共有する場合に特に重要である。
【0029】
【0030】
図５Ｂは、インデックス配列Ａ（インデックスを付したスプリント分子の５’端におけるインデックス配列）が、アセンブリーコンポーネント２の３’端におけるインデックス配列にハイブリダイズし、二本鎖インデックスエレメント（インデックス２）を形成する方向性を描写する。インデックス配列Ｂ（インデックスを付したスプリント分子の３’端におけるインデックス配列）は、アセンブリーコンポーネント１の５’端におけるインデックス配列にハイブリダイズし、二本鎖インデックスエレメント（インデックス１）を形成する。
【0031】
図５Ｃは、インデックス配列Ａ（インデックスを付したスプリント分子の５’端におけるインデックス配列）が、アセンブリーコンポーネント１の５’においてインデックス配列にハイブリダイズし、二本鎖インデックスエレメント（インデックス２）を形成する第２の方向性を描写する。インデックス配列Ｂ（インデックスを付したスプリント分子の３’端におけるインデックス配列）は、アセンブリーコンポーネント２の３’においてインデックス配列にハイブリダイズし、二本鎖インデックスエレメント（インデックス１）を形成する。インデックスを付したスプリント分子が、アセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズするスプリントの５’エレメント、およびアセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズするスプリント配列の３’エレメント結合を収容するために、１８０°のねじれで図示されていることに留意されたい。ねじれは、単なる図示目的であり、限定を意図するものではない。
【0032】
マルチコンポーネントコンストラクトへのポリヌクレオチドのアセンブリーにおける、本発明の例示的な利点および際立った特色は、次のものを含む。本発明は、アセンブリー方法のためにアレイまたは固体支持体を要求しない。本方法を使用して、一本鎖オリゴヌクレオチドをアセンブルすることができる。一態様では、本方法は、合成オリゴヌクレオチドを使用して実行される。一態様では、本方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を含むオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して実行される。混合物は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００または少なくとも５０，０００種以上のオリゴヌクレオチドを含むことができる。その上、態様では、本方法は、ＩＩ型制限（すなわち、断片連接の部位に「傷跡がない」）のように、次のサイクルの前に非アセンブリー配列がきれいに除去され得る反復的プロセスとして行うことができる。本方法を利用して、複合ライブラリー、低相同性ライブラリーおよび高相同性ライブラリー、例えば、僅かな変種を除いて実質的に同一の配列を有するライブラリーをアセンブルすることができる。
【0033】
インデックスを付したスプリントは、他の様式で使用することができる。図２に示される一変種では、意図されるコンストラクトの左および右ハーフを表す２個のオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドメンバーのペアにハイブリダイズされる。スプリントオリゴヌクレオチドメンバーのペアの各メンバーは、ペアの他のメンバーにおけるインデックス配列の逆相補体であり、よって、互いにハイブリダイズし、インデックスエレメント（図２において「インデックス」と標識）と本明細書で称される二本鎖ＤＮＡ部分を形成することができるインデックス配列をさらに含有する。２個のインデックス配列は、２個のアセンブリーコンポーネントを一体にするように間接的に機能を果たす。インデックス配列は、アセンブリー配列それ自体の一部ではない。図２において、右インデックスを付したスプリントは、左コンストラクトオリゴヌクレオチドの３’端に相同なスプリント配列（Ｒ－スプリント）、および右コンストラクトオリゴヌクレオチドの５’端に相同なセクションを含有する。図２において、Ｒ－スプリントは、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）を含有するが、これは、例えば、約５ｎｔ～約２０ｎｔの範囲に及び得る。
【0034】
全てのスプリント配列が、標的の末端配列にハイブリダイズする必要はない。インデックスを付したスプリントの別の変種が、図３に図示されている。このオリゴヌクレオチド構造は、図２のオリゴヌクレオチド構造のバリアントである。本発明者らは、この構造が、設計されたアセンブリーコンポーネントの５’端を欠如するトランケートされた合成産物によって引き起こされる干渉を低減または排除することができると考慮した。この構造において、スプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドの３’端の近位でないアセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドにおける配列に相補的なスプリント配列領域（Ｌ－スプリント）を有し、アセンブリーコンポーネント１のループ状の部分をもたらす。他方のスプリントオリゴヌクレオチドメンバーは、アセンブリーコンポーネント１の３’末端部分およびアセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’末端部分に相補的なスプリント配列領域（Ｒ－スプリント）を有する。
【0035】
図４において、アセンブリーコンポーネント１オリゴヌクレオチドは、５’端アセンブリーコンポーネント１における５’インデックス配列を有する。インデックス配列は、インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列にハイブリダイズして、二本鎖インデックスエレメントを形成する。スプリント分子は、アセンブリーコンポーネント１の３’末端部分およびアセンブリーコンポーネント２オリゴヌクレオチドの５’末端部分に相補的な配列を有し、アセンブリーコンポーネント１のループ部をもたらす（図３と同様であるが、１個のみのインデックスを付したスプリントが使用されている）。
【0036】
本明細書に示される通り、図５Ａ～図５Ｃに図示される実施形態等の実施形態は、著しい利点を提供した。図５のインデックスを付したスプリント分子を使用した低相同性ライブラリーまたは複合ライブラリーのアセンブリーは、高い正確性（すなわち、リードの総数と比べた正しいリードの総数）を生じた。図１７を参照されたい。「複合ライブラリー」は、末梢プライマー結合部位を除いて、配列類似性がほとんどないライブラリー配列を指す。加えて、ドロップアウトコンストラクトは存在しなかった。よって、データは、図５のインデックスを付したスプリント分子を使用してアセンブリーコンポーネントをアセンブルすることが、はるかにより高い識別を可能にすることを指し示す。したがって、本発明は、図１中のもの等、スプリント分子のでたらめなハイブリダイゼーションが原因で他の仕方では不可能であろうコンストラクトの正しいアセンブリーを可能にする。
【0037】
よって、本開示は、酵素によるライゲーションのためにインデックスを付したスプリントを用いた特異的オリゴヌクレオチドを利用してマルチコンポーネントコンストラクトをアセンブルするための方法を提供する。本開示は、とりわけ、インデックスを付したスプリント特異的な順序のライゲーションによって２個以上の特異的コンポーネントをアセンブルして、予め定義された順序を有するマルチコンポーネントライゲーション産物を形成するための方法を提供する。本方法は、溶液中で、かつ固体支持体の非存在下で遂行することができる。本方法を使用して、定義された順序で２、３または４個以上の一本鎖オリゴヌクレオチド由来の配列をライゲーションすることにより、合成マルチコンポーネントコンストラクトを産生することができる。複数の異なる合成マルチコンポーネントコンストラクト（例えば、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００または少なくとも１０，０００または少なくとも１００，０００種のマルチコンポーネントコンストラクト）を同じ溶液中で産生することができるという点において、本方法はマルチプレックス化することができる。このプロセスを数回反復して、より長い核酸を産生することもできる。
【0038】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド分子は、合成有機化学の技術分野でよく知られている方法を使用した化学合成によって産生される。本明細書に記載されている一部のオリゴヌクレオチド分子は、その代わりに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および細胞に基づく発現を含む、当技術分野で知られている方法を使用して作製することができる。
【0039】
本開示の方法において使用されている様々なオリゴヌクレオチド分子と共に本方法が、次の開示においてより詳細に記載されている。
【0040】
インデックスを付したスプリント
一部の実施形態では、本開示の方法は、図５Ａに図示される通りのインデックスを付したスプリントを用いる。インデックスを付したスプリントは、スプリント領域、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列を含む。一部の実施形態では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列は、スプリント領域を挟む。第１のインデックス配列および第２のインデックス配列は、インデックスを付したスプリントの５’および３’端に位置することができる。一態様では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列の一方または両方は、インデックスを付したスプリントの末端配列（例えば、５’末端配列および／または３’末端配列）を含む。一部の実施形態では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列の一方または両方は、インデックスを付したスプリントの実質的に末端（例えば、５’実質的に末端配列および／または３’実質的に末端配列）を含むが、末端ヌクレオチドを含まない。スプリント領域は、それぞれ２個のアセンブリーコンポーネントのそれぞれにハイブリダイズし、アセンブリーコンポーネントの端を近づける、５’配列エレメントおよび３’配列エレメントを有する。図５Ａ～図５Ｃにおいて図示される通り、スプリント配列の５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント２）の５’端にハイブリダイズし、一方、スプリント配列の３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）の３’端にハイブリダイズする。結果として、下流アセンブリーコンポーネントの５’端および上流アセンブリーコンポーネントの３’端は一体にされ、リガーゼによってライゲーションされ得る。
一部の実施形態では、本開示の方法は、図５Ａに図示される通りのインデックスを付したスプリントを用いる。インデックスを付したスプリントは、スプリント領域、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列を含む。一部の実施形態では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列は、スプリント領域を挟む。第１のインデックス配列および第２のインデックス配列は、インデックスを付したスプリントの５’および３’端に位置することができる。一態様では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列の一方または両方は、インデックスを付したスプリントの末端配列（例えば、５’末端配列および／または３’末端配列）を含む。一部の実施形態では、第１のインデックス配列および第２のインデックス配列の一方または両方は、インデックスを付したスプリントの実質的に末端（例えば、５’実質的に末端配列および／または３’実質的に末端配列）を含むが、末端ヌクレオチドを含まない。スプリント領域は、それぞれ２個のアセンブリーコンポーネントのそれぞれにハイブリダイズし、アセンブリーコンポーネントの端を近づける、５’配列エレメントおよび３’配列エレメントを有する。図５Ａ～図５Ｃにおいて図示される通り、スプリント配列の５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント２）の５’端にハイブリダイズし、一方、スプリント配列の３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）の３’端にハイブリダイズする。結果として、下流アセンブリーコンポーネントの５’端および上流アセンブリーコンポーネントの３’端は一体にされ、リガーゼによってライゲーションされ得る。
【0041】
それぞれ図５Ｂおよび図５Ｃに示される、ライゲーションのためにオリゴヌクレオチド構造における２個のアセンブリーコンポーネントに結合するインデックスを付したスプリント分子について、２種の例示的な方向性が存在する。
【0042】
インデックス配列は、目的の配列の一部ではなく、最終アセンブリーにおいて現れることはないであろう。これらは、両方のアセンブリーコンポーネントの端に付加された余分な配列である。そのようなものとして、特に、複数の異なるアセンブリーコンポーネントが、同じ反応においてライゲーションされる場合（すなわち、マルチプレックス）、これらは、可能な限り反応混合物における他の配列とは異なるものとして設計され、よって、アセンブリーコンポーネントの意図されないペアの機会を低減させることができる。
【0043】
インデックスエレメントの特色は、次のものを含む。インデックス配列は、その相補体のみにハイブリダイズするように設計される。よって、いずれか所与のインデックスエレメントについて、いずれの配列（相補体または逆相補体）も最終コンストラクト分子に存在しない。同様に、１個または複数のスペーサー配列を含むインデックスを付したスプリント分子について、いずれのインデックス配列（相補体または逆相補体）もスペーサーに存在しない。インデックス配列は、好ましくは、ステム－ループ構造等、それ自体で安定した二次構造を有しないように設計され、したがって、パリンドローム型ではない。さらに、インデックスエレメントのヌクレオチド組成は、好ましくは、アセンブリーの方法における使用に適した融解温度（Ｔｍ）を有するように設計される。一部の実施形態では、インデックスエレメントは、スプリントエレメントが、アセンブリーコンポーネントに対して１００％同一性を有するスプリントエレメントを除いて、アセンブリーコンポーネントに単に一過的にハイブリダイズすることができる温度範囲において、ハイブリダイズされたままとなるように設計される。コンストラクトエレメントに対するスプリントエレメント配列におけるミスマッチは、ハイブリダイゼーションを不安定化する。理論に縛られることなく、この動的ハイブリダイゼーションは、１００％同一性のスプリントエレメント対アセンブリーコンポーネントのハイブリダイゼーションの形成を支持するサンプリングを可能にすると考えられる。これは、本開示の方法において形成されたマルチコンポーネントコンストラクトの高い正確性に寄与すると考えられる。一部の態様では、アセンブリー正確性（すなわち、リードの総数と比べた正しいリードの総数）は、少なくとも８０％、８５％または少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１、９２％、９３％、９４％、９５％または少なくとも９６％である。理論に縛られることなく、これは、意図されるコンストラクトのドロップアウトがほとんどないか、まったく無いことに寄与し、よって、意図されるコンストラクトが高いパーセンテージで表されるとも考えられる。一部の態様では、意図されるコンストラクトのパーセンテージは、意図されるコンストラクトの総数の少なくとも８０％、８５％または少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または少なくとも９８％である。
【0044】
任意選択的に、インデックス配列は、融解温度の予測に役立つために、塩基のバランスが保たれた（Ａ＝Ｔ＝Ｇ＝Ｃ）ランダムな高い複雑性の配列である。ホモポリマー反復が含まれてよい。他の実施形態では、インデックス配列は、反復エレメント、例えば、ホモポリマーおよび／またはジヌクレオチド反復、例えば、ＧＴＧＴＧＴＧＴを含まない。高い融解温度は、開示されている方法の実施において有用である。各インデックス配列のＴｍは、約５０℃～約８０℃、約６５℃～約７２℃、約５５℃～約７５℃、約５０℃～約７０℃または６０℃～約８０℃となることができる。ある態様では、各インデックス配列のＴｍは、約６５℃～約６９℃である。ある態様では、インデックス配列は、２０ｎｔ～６０ｎｔとなることができる。インデックス配列は、２０ヌクレオチド（ｎｔ）～５０ｎｔ、２５ｎｔ～４５ｎｔ、２５～３５ｎｔまたは２８ｎｔ～３２ｎｔとなることができる。ある態様では、インデックス配列は、約３０ヌクレオチドである。インデックス配列をより短く保つ理由は、アセンブリーコンポーネントにおけるコンストラクト配列の長さを最大化するためである。非常に短いインデックス配列を作製することの主要な妨害は、特異性および二重鎖安定性が劣化することである。インデックス配列は、配列のライブラリーとして調製することができる。潜在的なインデックス配列は、ハイブリダイズし得る配列を除外するために、適切なゲノムに対してスクリーニングされる。ある態様では、潜在的なインデックス配列は、ヒトゲノムに対してスクリーニングされる。配列のライブラリーにおけるインデックス配列は、異なるインデックス配列の間のハイブリダイゼーションを支持しないように設計しつつ、長さ、塩基バランスまたは融解温度等の一部の特色を共有するように設計することができる。ある態様では、配列のライブラリーは、他のセットとは異なるがセット内の特色を共有するインデックス配列の複数のセットを含有することができる。例えば、配列のライブラリーは、ある１つの予測される融解温度で設計されたインデックス配列の１セットを含むことができ、一方、ライブラリー内のインデックス配列の第２のセットは、異なる融解温度で設計することができる。
【0045】
スプリント
インデックスを付したスプリントは、スプリント配列を含む。スプリント配列は、２個のアセンブリーコンポーネントのペア形成の特異性をガイドすることが意図される。図５Ａに図示される通り、スプリント配列（スプリント）は、２個の配列エレメント：５’エレメント（５’－エレメント）および３’エレメント（３’エレメント）を有する。スプリント配列の５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネントの５’端にハイブリダイズする。より具体的には、５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント２）の５’末端または５’実質的に末端配列にハイブリダイズする（例えば、図５Ｂを参照）。スプリント配列の３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）の３’端にハイブリダイズする。より具体的には、３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）のセグメントＤの３’末端または３’実質的に末端配列にハイブリダイズする（例えば、図５Ｂを参照）。
インデックスを付したスプリントは、スプリント配列を含む。スプリント配列は、２個のアセンブリーコンポーネントのペア形成の特異性をガイドすることが意図される。図５Ａに図示される通り、スプリント配列（スプリント）は、２個の配列エレメント：５’エレメント（５’－エレメント）および３’エレメント（３’エレメント）を有する。スプリント配列の５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネントの５’端にハイブリダイズする。より具体的には、５’エレメントは、下流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント２）の５’末端または５’実質的に末端配列にハイブリダイズする（例えば、図５Ｂを参照）。スプリント配列の３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）の３’端にハイブリダイズする。より具体的には、３’エレメントは、上流アセンブリーコンポーネント（アセンブリーコンポーネント１）のセグメントＤの３’末端または３’実質的に末端配列にハイブリダイズする（例えば、図５Ｂを参照）。
【0046】
スプリントは典型的に、短い配列またはインデックス領域の融解温度よりも低い融解温度を有する配列である。一部の実施形態では、各スプリントエレメントは、反応条件下でハイブリダイゼーションを駆動するのにそれ自体では不十分となるように設計される。その代わりに、スプリント配列は、アセンブリーコンポーネントが、インデックスを付したスプリントオリゴヌクレオチドのインデックス配列へのハイブリダイゼーションにより適所に保持されたときに、アセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドに単に一過的にハイブリダイズするように設計される。ある態様では、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントは、介在するヌクレオチドなしで、接している。ある態様では、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントは、実質的に接しており、例えば、介在する数個の（１、２または３）ヌクレオチドが、５’エレメントおよび３’エレメントの間に存在し、介在する数個のヌクレオチドは、アセンブリーコンポーネントのいずれかのアセンブリー配列に結合することが意図されない。スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントは独立して、約５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５ヌクレオチド～約２０ヌクレオチドの長さ、または約８ヌクレオチド～約１５ヌクレオチドもしくは約１０ヌクレオチド～１３ヌクレオチドの長さとなることができる。スプリントの５’エレメントおよび３’エレメントは一般に、同様の融解温度を有する。スプリントエレメントの融解温度は、インデックスエレメントの融解温度に満たない。スプリントエレメントの融解温度の選択は、アセンブリーステップにおいて使用されるリガーゼによって影響される。一部の態様では、スプリントエレメントの融解温度（Ｔｍ）は、Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７）によって計算される場合、１０℃～８０℃、１４℃～４４℃、２０℃～４２℃または２２℃～４０℃の範囲内となることができる。当業者は、異なるリガーゼのために異なるスプリント融解温度を選択することができ、例えば、より高い温度で使用することができるリガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼ、例えば、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、より高い融解温度を有するスプリントにより使用することができることを認識するであろう。
【0047】
一部の態様では、インデックスを付したスプリントは、インデックスを付したスプリントの特異的構造特色（例えば、インデックス配列およびスプリント配列）の間のリンカーであるスペーサー配列を含む。スペーサーは、一部の実施形態では、１～３０ヌクレオチドの長さとなることができる。スペーサーは、アセンブリー配列またはインデックス配列にハイブリダイズしないように設計されたいずれかの配列または非核酸コンポーネントである。一部の実施形態では、スペーサーは、単純配列、例えば、ホモポリマー配列または短い反復配列、例えば、ジ－ヌクレオチドもしくはトリ－ヌクレオチド反復となることができる。一部の態様では、インデックスを付したスプリントは、図５Ａに図示される通り、２個のスペーサー配列を有する。一部の態様では、インデックスを付したスプリントは、１個または複数の追加の構造特色を連結するための２個を超えるスペーサー配列を有する。例えば、本明細書の他の箇所で記述される通り、反復的アセンブリー適用のためのインデックスを付したスプリントは、第２のスプリントエレメントおよび第３のインデックス配列を含有することができ、スペーサー配列は、任意選択的に、特異的構造特色を分離することができる。
【0048】
アセンブリーコンポーネント
一部の実施形態では、アセンブリーコンポーネントは、最終コンストラクトアセンブリーに存在することが所望される配列を含むオリゴヌクレオチド分子、およびインデックス配列である。アセンブリーコンポーネントにおけるインデックス配列の位置は、コンポーネントが、意図されるライゲーション反応において左（上流）コンポーネントであるか右（下流）コンポーネントであるかに依存する。
一部の実施形態では、アセンブリーコンポーネントは、最終コンストラクトアセンブリーに存在することが所望される配列を含むオリゴヌクレオチド分子、およびインデックス配列である。アセンブリーコンポーネントにおけるインデックス配列の位置は、コンポーネントが、意図されるライゲーション反応において左（上流）コンポーネントであるか右（下流）コンポーネントであるかに依存する。
【0049】
典型的には、上流アセンブリーコンポーネントにおいて、インデックスを付したスプリント配列は、アセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの５’末端または実質的に５’末端に位置する。アセンブリー配列は、アセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの３’末端領域に位置する。ある態様では、インデックス配列は、アセンブリー配列と接している。他の態様では、追加の配列（構造特色）は、インデックス配列およびアセンブリー配列の間に位置することができる。そのような構造特色は、少なくとも１個のプライマー配列、少なくとも１個のバーコード配列および／または少なくとも１個の制限酵素切断部位のうち１種または複数となることができる。態様では、ＩＩＳ型制限酵素部位は、アセンブリー配列の直接上流にある。例えば、図８、分子（ｃ）を参照されたい。本態様では、ＩＩＳ型制限酵素部位は、切断部位における酵素による切断が、アセンブリー配列から全ての非アセンブリー配列を分離するように配置される。本態様は、方法の反復的バージョンに有用であり、例えば、その場合、第１のアセンブリーステップの産物は次いで、その後のアセンブリーステップにおけるコンポーネントとして使用される。
【0050】
典型的には、下流アセンブリーコンポーネントにおいて、インデックスを付したスプリント配列は、アセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの３’末端または実質的に３’末端に位置する。アセンブリー配列は、アセンブリーコンポーネントオリゴヌクレオチドの５’末端配列に位置する。ある態様では、インデックス配列は、アセンブリー配列（セグメントＥ）と接している。他の態様では、追加の配列は、アセンブリー配列（セグメントＥ）およびインデックス配列（セグメントＦ）の間に位置することができる。そのような配列は、少なくとも１個のプライマー配列、少なくとも１個のバーコード配列および少なくとも１個の制限酵素切断部位のうち１種または複数となることができる。態様では、ＩＩＳ型制限酵素部位は、アセンブリー配列の直接下流にある。例えば、図８、分子（ａ）を参照されたい。ＩＩＳ型制限酵素部位は、切断部位における酵素による切断が、アセンブリー配列から全ての非アセンブリー配列を除去するように配置される。本態様は、方法の反復的バージョンに有用である。本態様は、例えば、第１のアセンブリーステップの産物が、次いで、その後のアセンブリーステップにおけるコンポーネントとして使用される方法の反復的バージョンに有用である。
【0051】
方法
本開示は、２個の核酸アセンブリーコンポーネントをアセンブルして、ライゲーション産物（マルチコンポーネントアセンブリー）を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、反応混合物中に存在するインデックスを付したスプリントに上流アセンブリーコンポーネントおよび下流アセンブリーコンポーネントをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイズされた構造において、上流アセンブリーコンポーネントの５’端および３’端の両方は、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされ、下流アセンブリーコンポーネントの５’端および３’端の両方は、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされる。ハイブリダイズするステップに続いて、ライゲーションするステップが行われる。ライゲーションするステップにおいて、上流アセンブリーコンポーネントの３’端は、下流アセンブリーコンポーネントの５’端にライゲーションされ、これにより、第１のライゲーション産物を産生する。ある態様では、反応混合物は、マルチプレックス化されており、複数の上流アセンブリーコンポーネント種、複数の下流アセンブリーコンポーネント種および複数のインデックスを付したスプリント分子種を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を含む。複数のインデックスを付したスプリント分子種のそれぞれは、混合物中の所定の上流アセンブリーコンポーネントおよび所定の下流アセンブリーコンポーネントにハイブリダイズすることができる。
本開示は、２個の核酸アセンブリーコンポーネントをアセンブルして、ライゲーション産物（マルチコンポーネントアセンブリー）を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、反応混合物中に存在するインデックスを付したスプリントに上流アセンブリーコンポーネントおよび下流アセンブリーコンポーネントをハイブリダイズさせるステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイズされた構造において、上流アセンブリーコンポーネントの５’端および３’端の両方は、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされ、下流アセンブリーコンポーネントの５’端および３’端の両方は、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされる。ハイブリダイズするステップに続いて、ライゲーションするステップが行われる。ライゲーションするステップにおいて、上流アセンブリーコンポーネントの３’端は、下流アセンブリーコンポーネントの５’端にライゲーションされ、これにより、第１のライゲーション産物を産生する。ある態様では、反応混合物は、マルチプレックス化されており、複数の上流アセンブリーコンポーネント種、複数の下流アセンブリーコンポーネント種および複数のインデックスを付したスプリント分子種を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を含む。複数のインデックスを付したスプリント分子種のそれぞれは、混合物中の所定の上流アセンブリーコンポーネントおよび所定の下流アセンブリーコンポーネントにハイブリダイズすることができる。
【0052】
本方法は、水溶液中で実行される。水溶液は、ハイブリダイズするステップおよびライゲーションするステップの両方で同じものとなることができる。ライゲーションステップのための水溶液は、本方法において使用されるリガーゼに適した、適したｐＨおよび塩濃度を有するいずれかの水溶液となることができる。反応溶液は典型的に緩衝されており、１種または複数の塩を含み、任意選択的に、リガーゼに適した場合、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の分子クラウディング剤を含むことができる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションステップの両方で同じ水溶液が使用される場合、バッファーのコンポーネントは、リガーゼ酵素にとってより有利もしくは不利、またはハイブリダイゼーション反応にとってより有利もしくは不利となるように選択して、最良の結果を達成することができる。例えば、マグネシウムの当該濃度が、よりストリンジェントなハイブリダイゼーションステップを支持する場合、溶液中のマグネシウムの濃度は、リガーゼ反応にとって理想的なものよりも僅かに低くまたは著しく高くなるように選択することができる。
【0053】
ハイブリダイゼーションステップは、インデックスを付したスプリントおよび２個のアセンブリーコンポーネントを含むオリゴヌクレオチド構造を形成するのに十分な期間にわたり、上昇した温度からより冷たい温度へと反応を冷却するウォーターバスにおけるインキュベーションによって実行することができる。ハイブリダイズするステップの温度プロファイルは、インデックス配列のＴｍおよびスプリント領域のＴｍによってガイドされる。例えば、ハイブリダイゼーションステップは、より高い温度で始めて、それに続いて冷却期間を設けることができる。出発温度は、いかなる二次構造も融解するように、インデックス配列のＴｍを超える。例示的な温度プロファイルは、約９５℃から約４０℃、例えば、９３℃から４４℃である。ハイブリダイゼーション冷却の持続時間は、約１５分間から数時間の範囲に及ぶことができる。例示的な持続時間は、１．７５時間である。ある態様では、ハイブリダイゼーションステップは、１．７５時間にわたり９３℃から４４℃へと冷却するステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションステップの温度は、経時的に変動され得る、または数サイクルにわたりより高い温度からより低い温度へとサイクル化され得る。
【0054】
ライゲーションステップは、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド構造をリガーゼと接触させることにより実行される。反応混合物の温度は、使用されるリガーゼに適切な温度に変更することができ、一部の実施形態では、温度は、インデックスエレメントの融解温度を下回り、スプリントエレメントの融解温度を上回る。例えば、ハイブリダイゼーション後に、反応混合物の温度は、約４５°～約７０℃、約４５°～６５℃、約５０°～６５℃または約６１℃～６５℃等の範囲まで増加され、次いで、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド構造は、熱安定性リガーゼと接触させられる。より低い温度を非熱安定性リガーゼのために使用することができる。ライゲーションステップは、数分間から数時間の範囲に及び得る、適した長さの時間にわたり実行される。任意選択的に、ライゲーションステップは、当技術分野で知られている方法によって終結される。例えば、リガーゼは、高い温度、化学的変性剤によって変性させることができる、またはＥＤＴＡを添加することができる（ライゲーション反応に必要とされるマグネシウムに結合させるために）。
【0055】
本方法は、いかなるリガーゼを用いて実行することもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼは市販されている。その代わりに、リガーゼは、化学合成することができるか（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ＮＹ， １９９２を参照）、または細胞における発現等の分子生物学方法による組換えにより作製することができる。組換えリガーゼは、例えば、精製を助けるために、融合タンパク質として調製することができる。ある特定の態様では、リガーゼは、精製または単離された形態で提供される。ある特定の実施形態では、リガーゼは、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％純度で提供される。ある特定の実施形態では、リガーゼは、組成物の一部として提供される。ある特定の実施形態では、リガーゼは、マルチコンポーネント構築のアセンブリーのための組成物としての使用またはその中への包含に適した水性組成物において提供される。当業者であれば、そのようなリガーゼ反応組成物中に含まれ得る様々な物質に気づく筈である。
【0056】
リガーゼの選択は、ライゲーションするステップの温度に影響を与えるであろう。異なるリガーゼは、異なる効率、異なる温度における異なる活性、およびライゲーション部位におけるミスマッチに対する異なる感受性を有することができる。より低い温度範囲で機能する中温性ＤＮＡリガーゼの多くの例がある。熱安定性リガーゼも利用できる。熱安定性リガーゼは、より高い温度、例えば、最大で６５℃におけるリガーゼ反応条件を可能にする。より高い温度反応条件は、より正確なアセンブルされたコンストラクトに寄与することができる。ある態様では、熱安定性リガーゼは、ライゲーションがライゲーション部位で起こる前に、より大きいフットプリント要件（例えば、約２５ヌクレオチドのハイブリダイズされた配列）を有する。この特色は、より優れた特異性に寄与することができ、ライゲーションされた産物の、より良い純度をもたらす。ある態様では、複数のリガーゼを使用することができる。ある態様では、異なるリガーゼを、同じハイブリダイゼーション反応に逐次に添加することができる。ある態様では、異なるリガーゼが同じ反応に含まれてよい。例えば、中温性リガーゼおよび熱安定性リガーゼが反応に含まれてよく、好熱性リガーゼのために温度を上げる前に、中温性リガーゼをより低い温度で使用することができる。そのような実施形態は、ある１つの予測される融解温度で設計されたインデックス配列の１セットを含む配列のライブラリーを用いた方法であって、ライブラリー内のインデックス配列の第２のセットが、異なる融解温度で設計することができる、方法の実施により適用可能となることができる。
【0057】
オリゴヌクレオチドコンポーネントの濃度は、ライゲーションの正確性に影響する反応パラメータである。高い濃度のオリゴヌクレオチドコンポーネントは、間違ったライゲーション結果の可能性を増加させる。よって、より低い濃度は、ライゲーション産物の改善された正確性をもたらすことができる。
【0058】
一般に、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイズされた配列の長さ、およびライゲーション条件は、正確にアセンブルされたコンストラクトの最高収率を達成するために変動され得る。例えば、条件のセットが、コンポーネントの特定のセットの不正確なアセンブリーを生じる場合、より高いライゲーション温度および／またはよりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することができる。ハイブリダイゼーション条件およびリガーゼ条件の最適化は、本開示および当技術分野の従来知識を考慮して、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）またはＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１ｓｔ Ｅｄ．， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ （１９９９）を参照されたい。
【0059】
ある態様では、本方法は、図２のおよび少なくとも１個のブロッキングヌクレオチドをさらに含むインデックスを付したスプリントを使用して実行することができる。図６は、オリゴヌクレオチド構造を図示し、このオリゴヌクレオチド構造は、アセンブリーコンポーネントのアセンブリー配列における一本鎖領域にハイブリダイズされた少なくとも１個のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。この変種は、意図されないハイブリダイゼーションを防止するために考慮される。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、一本鎖領域の一部または全てをブロックするように設計することができる。図６の描写されている実施形態では、オリゴヌクレオチド構造は、２本のさらに別のオリゴヌクレオチド鎖を含み、そのうち１本は、アセンブリーコンポーネント１配列にハイブリダイズし、もう１本は、アセンブリーコンポーネント２配列にハイブリダイズする。ブロッキングオリゴヌクレオチドを、図６に描写されるインデックスを付したスプリント分子の２個のオリゴヌクレオチド分子の一部として合成することができることが考慮される。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、図５または本発明の他の実施形態のオリゴヌクレオチド構造において用いることもできる。ブロッキングオリゴヌクレオチドを、図５に描写されるインデックスを付したスプリント分子の一部として合成することができることが考慮される。
【0060】
本方法は、反復的に実行することができる。ある態様では、下流アセンブリーコンポーネントは、３’端に除去可能な（取り外し可能な）インデックス配列を含む。アセンブリーコンポーネントを含むライゲーション産物を提供するためのハイブリダイゼーションおよびライゲーションステップ後に、ライゲーションされた産物の３’末端配列が、アセンブリー配列の３’配列となるように、インデックス配列は除去される（例えば、酵素による切断または切断可能なリンカーの切断により）。この第１のライゲーションされた産物は次いで、方法のさらなる繰り返しにおいて上流アセンブリーコンポーネントとして利用して、第２のライゲーションされた産物を産生する。反応混合物は、第１のライゲーションされた産物および別の下流アセンブリーコンポーネントにハイブリダイズするインデックスを付したスプリント分子を含む。
【0061】
ある態様では、除去可能な（または取り外し可能な）インデックス配列は、制限酵素部位を含む。ある態様では、制限酵素部位は、ＩＩＳ型制限酵素のためのものである。ＩＩＳ型制限酵素は、非対称ＤＮＡ配列を認識し、その認識配列の外側の定義された距離で、通常、１～２０ヌクレオチド以内で切断する酵素の特異的な群を含む。ＩＩＳ型制限酵素のこの特異的な切断作用機序は、所望のアセンブリー配列が保持され、非アセンブリー配列が除去されるような切断を可能にする。これは、最終アセンブリー配列を変更しないＤＮＡ操作を可能にし、よって、マルチコンポーネントコンストラクトにおける傷跡がない継ぎ目の生成を可能にする。
【0062】
ある態様では、除去可能な（または取り外し可能な）インデックス配列は、切断可能なリンカーによってアセンブリー配列に連結されたインデックス配列となることができる。光切断可能なリンカー化学が当技術分野で知られており、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されている。
【0063】
ある態様では、本方法は、第１のアセンブリーのライゲーション産物においてアセンブリープロセスが反復される、図７～図９に図示される通りの４パートアセンブリーである。本態様では、制限酵素消化ステップによって分離された２回のライゲーションステップが存在する。ハイブリダイゼーションステップは、図７に描写される２種のオリゴヌクレオチド構造を形成する。図７に描写される上部オリゴヌクレオチド構造において、オリゴヌクレオチド構造は、図５Ｂに図示される方向性である（ただし、図５Ｃに描写される方向性で設計することができる）。インデックスを付したスプリント分子は、５’から３’の向きに、下流アセンブリーコンポーネント２にハイブリダイズされてインデックス２を形成する第１のインデックス配列と、スプリント配列（スプリント１）と、上流アセンブリーコンポーネント１にハイブリダイズされてインデックス１を形成する第２のインデックス配列とを含む。スプリント１は、上流アセンブリーコンポーネント１の３’末端配列および下流アセンブリーコンポーネント２の５’末端配列にハイブリダイズされる。第１のスプリント構造（スプリント１）に加えて、上部オリゴヌクレオチド構造のインデックスを付したスプリントは、スペーサーセクションにおける第２のスプリント配列（スプリント２）、ならびに５’インデックス配列（インデックス２）および第１のスプリント構造（スプリント１）の間の別のインデックス配列（インデックス３を形成する）をさらに含む。下流アセンブリーコンポーネント２は、アセンブリー配列の３’にある制限酵素配列である、さらに別の構造特色を含む（図８に描写）。
【0064】
図７に描写される下部オリゴヌクレオチド構造において、オリゴヌクレオチド構造は、図５Ｃに図示される方向性である（ただし、図５Ｂの方向性で設計することができる）。インデックスを付したスプリント分子は、５’から３’の向きに、上流アセンブリーコンポーネント３にハイブリダイズされてインデックス４を形成する第１のインデックス配列と、スプリント配列（スプリント３）と、下流アセンブリーコンポーネント４にハイブリダイズされてインデックス５を形成する第２のインデックス配列とを含む。スプリント３は、上流アセンブリーコンポーネント３の３’末端配列および下流アセンブリーコンポーネント４の５’末端配列にハイブリダイズされる。下部オリゴヌクレオチド構造のインデックスを付したスプリントは、５’インデックス配列（インデックス４）およびスプリント３の間にインデックス３の相補的配列（インデックス３相補体）をさらに含む。
【0065】
ライゲーションステップは、それぞれ図８、構造（ａ）および（ｃ）に図示される通り、コンポーネント１＆２、アセンブルされた産物（１－２）のライゲーション産物と、コンポーネント３＆４、アセンブルされた産物（３－４）の第２のライゲーション産物とを産生する。図８に図示される通り、上部構造（ａ）のインデックスを付したスプリントは、アセンブリーコンポーネント２のアセンブリー配列の３’かつインデックス２に対して５’にある制限酵素部位（ＲＥカット部位）を含む。構造（ｃ）のインデックスを付したスプリントは、アセンブリーコンポーネント３のアセンブリー配列の５’かつインデックス３の３’にある制限酵素部位を含む。インデックスを付したスプリントは、スプリント２およびインデックス４のインデックス配列の間に位置する、インデックス３を形成するための相補体配列であるインデックス配列、ならびにインデックス４のインデックス配列の５’にある制限酵素部位である、２個のさらに別の構造特色を含む。ライゲーション産物は、ＩＩＳ型制限酵素消化に付されて、アセンブルされた産物１－２およびアセンブルされた産物３－４における制限酵素部位を切断して、それぞれインデックス２およびインデックス４を除去する。結果的に、方法のさらなる繰り返しにおいて、ライゲーション産物１－２の消化産物は、上流アセンブリーコンポーネントとなることができ、ライゲーション産物３－４の消化産物は、下流アセンブリーコンポーネントとなることができる。消化産物は、例えば、ＳＰＲＩ精製（例えば、ＳＰＲＩは、固相可逆的固定化の略語である）によって精製し、次いでハイブリダイゼーションステップに付すことができる。ハイブリダイゼーションステップは、図９に図示されるオリゴヌクレオチド構造を産生する。図示される通り、二本鎖インデックス３は、２個のインデックスを付したスプリント分子のインデックス３配列のハイブリダイゼーションによって形成される。スプリント２は、アセンブリーコンポーネントにハイブリダイズしてライゲーション部位を形成するように作用する；５’エレメントは、アセンブルされた産物（３－４）の５’端に結合し、３’エレメントは、アセンブルされた産物（１－２）の３’端に結合する。第２のライゲーションステップが行われ、マルチコンポーネントライゲーション産物１－２－３－４を産生する（示されていない）。第２のライゲーションステップの産物は、任意選択的に、ＳＰＲＩ精製し、ＰＣＲにより増幅することができる。
【0066】
本明細書に示される通り、インデックスに基づくライゲーションにおいて、２個の相補的インデックス配列を有する共通のインデックスを付したスプリント分子への２個のアセンブリーコンポーネントの反対の端のハイブリダイゼーションは、優れた特異性を提供する。例えば、インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）は、２個のハイブリダイズされたスプリントエレメントのそれぞれの融解温度（Ｔｍ）よりも高くなることができない。このようにして、インデックス結合は、ハイブリダイゼーション条件下で安定する一方で、スプリント結合は準安定である。よって、特異的に設計されたインデックス配列は、ハイブリダイゼーション反応を駆動し、反応混合物におけるスプリント配列および意図されない標的の間の望まれない結合を回避することができる。
【0067】
さらにより大型の産物のアセンブリーのために同じプロセスを反復することができる。
【0068】
開示されている方法の変種によって特異性が改善され得る条件が存在し得ることがさらに考慮される。次に、インデックス配列の融解温度を増加させ、よって、特異性を増加させるための方法について記載する。本態様はまた、２ステップライゲーションプロセスに頼る。簡潔に説明すると、また、図１０～図１３に図示される通り、第１のライゲーションステップにおいて、２個のアセンブリーコンポーネントオリゴは、互いに隣接する２個のインデックス配列を含むがスプリント領域を含まない分子（図１０における「インデックススプリント」を参照）にハイブリダイズされ、それらのインデックス付け配列で一体にライゲーションされ、第１のライゲーションステップにおいてはるかにより長いオリゴを形成する（図１１を参照）。第１のライゲーションステップ（インデックス配列の端をライゲーションする）の後に、温度を、それらの相補的スプリント配列を有するインデックス付け配列の融解温度を上回るように増加させることができ、第２の分子（２個のアセンブリー標的にハイブリダイズする「コンストラクトスプリント」）が、このより高い温度で付加され（図１２Ｂを参照）、より高いストリンジェンシーを可能にし、相同コンストラクトの間の交差ハイブリダイゼーションの機会を減らし、したがって、以前に記載された実施形態よりも潜在的にさらにより良い特異性をもたらす。第１のライゲーションのライゲーション産物の遊離端がスプリントオリゴとハイブリダイズし、その後ライゲーションされて一本鎖ループを形成する際に、分子毎の第２のライゲーション事象が起こる（図１３を参照）。ループの形成を安定化するために、第２のスプリントのセクションの一方は、他方のセクションよりも実質的に長くなり、一方の端において安定した二重鎖を形成することができ、一方、他方の端は、それがライゲーションされてループを形成するようになるために、二重鎖端と短時間接触することのみを必要とする。その上、キメラ形成は、さらに多くのバッファー溶液の添加によって、第１のライゲーションステップの後に溶液を希釈することにより阻害することができる。これは、溶液のエントロピーを増加させることにより、分子間ライゲーションよりも分子内ライゲーションおよびループ形成の確率を増加させる。
【0069】
図１０に図示される通り、２個のアセンブリーコンポーネントは、一方のアセンブリーコンポーネントの５’端におけるインデックス配列および他方のアセンブリーコンポーネントの３’端におけるインデックス配列によってスプリント分子にハイブリダイズされる。ライゲーション後に、ライゲーション産物は、２個のアセンブリーコンポーネントを含み、そこで、２個のインデックス配列は、隣接しており、ライゲーションされた産物の中央で互いにライゲーションされる。図１１を参照されたい。ライゲーション後に、ライゲーション産物は、インデックススプリントへの現在ライゲーションされている２個のインデックス配列（インデックス１－インデックス２）によってハイブリダイズされたままであり、著しく増加された融解温度を有する。例えば、ある態様では、各インデックス配列が３０ヌクレオチド長であり、各インデックスエレメントが約６９℃の融解温度を有する場合、二重鎖における２個のインデックス配列の組み合わせた融解温度は、約１７℃高くなり、約８６℃の平均温度となる。これは、二重鎖を変性させることなく、反応溶液の温度を８０代前半の温度まで上げることができることを意味する。
【0070】
任意選択的に、方法のステップの間で、結合されていない断片またはライゲーションされていない産物は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液を洗い流して反応溶液を清浄化することによって、反応溶液から除去することができる。任意選択的に、この清浄化は、インデックス付けスプリントオリゴを固体支持体に結合させることにより行うことができる。例えば、インデックススプリントオリゴは、その３’端（図１１に示す通り）またはその５’端のいずれかに取り付けられたビオチンを有することができる。次に、オリゴ二重鎖は、標的富化のために一般的に使用されている磁気ストレプトアビジンビーズに結合させることができる。ＳＰＲＩビーズで一般的に行われる通り、これらをチューブ内で混合し、数分間インキュベートし、次いで、強い勾配の磁場を用いてチューブの側面または底面に引き寄せる必要がある。次に、ハイブリダイゼーション溶液を取り除き、容器を再充填し、１回または複数回チューブ内でライゲーションされた産物を洗浄バッファーでリンスすることにより、洗浄ステップを達成することができる。これは、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドの濃度を低減させ、第２のライゲーションステップにおける正しくないライゲーション事象の見込みを低減させるであろう。
【0071】
ライゲーションされた産物は、水もしくはよりストリンジェントなライゲーションバッファーを添加することにより、またはバッファーに適切な融解温度を超えるまで加熱することにより、二重鎖から（よって、ビーズから）放出することができる。熱安定性リガーゼ、例えば、９°Ｎ（商標）リガーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をリガーゼバッファーに添加し、温度を８０℃以上にまたは別の熱安定性リガーゼが活性を維持する最高温度に増加させることができ、このポイントで、ライゲーション産物の遊離端のためのスプリント分子をチューブに添加することができる。その代わりに、加熱前に混合物にスプリントを添加し、加熱後にリガーゼを添加することができる。このステップは、溶液中のオリゴを用いて行うことも、または磁気ビーズに結合させたままで行うこともできる。この第２のライゲーション事象は、図１２および図１３に描写されている。ライゲーション反応の期間の後に、ＥＤＴＡを添加することにより、または単純に、室温までもしくは室温で迅速に冷却することにより、ライゲーション反応を停止することができる。
【0072】
図１３は、例えば、プライマー結合部位（ＰＢＳ１およびＢＰＳ１）および任意選択的な制限酵素部位を含む、オリゴにおける任意選択的な追加の構造特色を示す。増幅は、ＰＣＲまたはローリングサークル増幅のいずれかによって行うことができる。ローリングサークル増幅は、ループ状のオリゴにおけるいずれかのプライマー結合部位に相補的な単一のプライマーおよび高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼをチューブに添加することにより行われる。その代わりに、ポリメラーゼ、プライマーのペアおよびｄＮＴＰにより、次いでサーマルサイクラーにおける熱サイクリングにより、ＰＣＲを行うことができる。
【0073】
時に、アセンブルされた産物のＰＣＲ増幅の際に、非ライゲーションオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長され、望まれないキメラを創出する場合がある。環状化ＤＮＡを創出する図１２および図１３に示す実施形態は、エキソヌクレアーゼステップの追加によって、このキメラ産生を低減させることができる。この追加のステップにおいて、エキソヌクレアーゼを使用して、環状ＤＮＡアセンブリーを後に残しつつ、その５’端から一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖を消化することができる。エキソヌクレアーゼステップは、ＰＣＴ増幅に先立ち実行するべきである。消化プロセスは、ＥＤＴＡの添加によりもしくは反応混合物を７５℃に加熱することにより酵素を死滅させることにより、またはその両方により停止することができる。このような環状コンストラクトはその後、ＰＣＲによって、または高い処理能力のポリメラーゼ、例えば、ｐｈｉ２９を使用するローリングサークル増幅によって増幅される。
【0074】
ある態様では、図１０における２個のアセンブリーコンポーネントをライゲーションするための第１のライゲーションステップは省略される。第２のスプリント（「コンストラクトスプリント」）は、２個のアセンブリーコンポーネントの５’および３’遊離端においてコンストラクト配列にハイブリダイズし、これらは次いでライゲーションされる。
【0075】
図１０～図１３に関係する別の実施形態では、インデックススプリントおよびコンストラクトスプリントは、リンカー分子または配列（図１２Ａにおける「任意選択的な繋留」）を用いて接続される。分子は、図５Ａのインデックスを付したスプリントのコンポーネントを有するが、異なる５’から３’への順序である。
【0076】
本開示の一部の実施形態では、マルチコンポーネントコンストラクトは先ず、本開示に従って溶液中でアセンブルし、当技術分野で知られているいずれかの方法によってアセンブリー後に固体基材に取り付けることができる。よって、本開示を使用して、マルチコンポーネントコンストラクトのアレイを調製することができ、それによると、マルチコンポーネントコンストラクトは、アセンブリー後にアレイ基材に取り付けられる。その後、マルチコンポーネントコンストラクトまたはマルチコンポーネントコンストラクトのプールもしくは複数のプールは、アレイ基材から任意選択的におよび選択的に切断し、ライブラリー（単数または複数）として使用することができる。その代わりに、マルチコンポーネントコンストラクトは、ビーズに取り付けることができる。コンストラクトは、化学的手段によりまたは特異的ハイブリダイゼーションによってビーズに取り付けることができる。取付け方法に応じて、異なるビーズを使用して、特異的な異なるコンストラクトを捕捉することができる、または１種のビーズが、複数のコンストラクトを捕捉することができる。ビーズへのライブラリーの取付けは、ライブラリーを貯蔵、洗浄、濃縮または酵素により操作するための利点を提供することができる。
【0077】
キット
本開示はまた、開示されている方法の実行に有用なキットを提供する。一態様では、少なくとも１つの型の上流アセンブリーコンポーネント、１つの型の下流アセンブリーコンポーネント、およびアセンブリーコンポーネントのライゲーションを方向付けるためのインデックスを付したスプリントを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を含むオリゴヌクレオチドライブラリー、ならびにＤＮＡリガーゼを含む、上述の方法を行うための試薬を含有するキットが提供される。ある特定の実施形態では、本キットは、１種または複数の他の反応コンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、適切な量の１種または複数の反応コンポーネントは、１個もしくは複数の容器内に提供されるか、または基材に保持される。キットの追加のコンポーネントの例は、反応バッファー、ライゲーション産物を検出するための１種または複数の試薬（例えば、プローブまたはＰＣＲプライマー）その他を含むがこれらに限定されない。使用される反応コンポーネントは、種々の形態で提供することができる。例えば、コンポーネント（例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液に懸濁することができる、またはビーズに結合させることができる、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末もしくはペレットとして提供することができる。本開示のキットは、いずれか適した温度で提供することができる。例えば、液体におけるタンパク質コンポーネントまたはその複合体を含有するキットの貯蔵のため、おそらくグリセロールまたは他の適した不凍剤を含有する凍結抵抗性溶液中で、０℃未満、好ましくは約－２０℃で提供および維持されることが好まれる。
本開示はまた、開示されている方法の実行に有用なキットを提供する。一態様では、少なくとも１つの型の上流アセンブリーコンポーネント、１つの型の下流アセンブリーコンポーネント、およびアセンブリーコンポーネントのライゲーションを方向付けるためのインデックスを付したスプリントを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を含むオリゴヌクレオチドライブラリー、ならびにＤＮＡリガーゼを含む、上述の方法を行うための試薬を含有するキットが提供される。ある特定の実施形態では、本キットは、１種または複数の他の反応コンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、適切な量の１種または複数の反応コンポーネントは、１個もしくは複数の容器内に提供されるか、または基材に保持される。キットの追加のコンポーネントの例は、反応バッファー、ライゲーション産物を検出するための１種または複数の試薬（例えば、プローブまたはＰＣＲプライマー）その他を含むがこれらに限定されない。使用される反応コンポーネントは、種々の形態で提供することができる。例えば、コンポーネント（例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液に懸濁することができる、またはビーズに結合させることができる、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末もしくはペレットとして提供することができる。本開示のキットは、いずれか適した温度で提供することができる。例えば、液体におけるタンパク質コンポーネントまたはその複合体を含有するキットの貯蔵のため、おそらくグリセロールまたは他の適した不凍剤を含有する凍結抵抗性溶液中で、０℃未満、好ましくは約－２０℃で提供および維持されることが好まれる。
【0078】
キットまたはシステムは、少なくとも１回のアッセイに十分な量で、本明細書に記載されているコンポーネントのいずれかの組合せを含有することができる。一部の適用では、１種または複数の反応コンポーネントは、個々の、典型的には使い捨ての、チューブまたは均等な容器において、予め測定された１回使用量で提供することができる。キットにおいて供給されるコンポーネントの量は、いずれか適切な量となることができ、製品が標的とする市場に依存することができる。コンポーネントが供給される容器（複数可）は、供給された形態を保持することができるいずれか従来の容器、例えば、微量遠心チューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、ボトルまたは一体型の検査デバイス、例えば、流体デバイス、カートリッジ、側方流または他の同様のデバイスとなることができる。
【0079】
本キットは、容器または容器の組合せを保持するための包装材料を含むこともできる。そのようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料は、種々の構成（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイその他における）のいずれかにおいて反応コンポーネントまたは検出プローブを保持する固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微小粒子その他）を含む。本キットは、コンポーネントの使用のための、有形の形態で記録された説明書をさらに含むことができる。
【0080】
アセンブリーの開示されている方法は、インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列およびアセンブリーコンポーネント分子の間の安定したかつ特異的なハイブリダイゼーションに頼る。対照的に、アセンブリーを方向付けるためにスプリントを利用した先行技術方法は、スプリント分子および２個のアセンブリーコンポーネントの間の安定したかつ特異的なハイブリダイゼーションに頼る。理論に縛られることなく、本開示のアプローチ（図５Ａ～図５Ｃ）と先行技術アプローチの間の根本的な区別は、開示されている方法において、所望のアセンブリー配列が、ライゲーションのためのポジションに小片をアセンブルさせるために使用されないことであると考えられる。アセンブリーの開示されている方法におけるスプリント配列は、安定したハイブリダイゼーションとなるには短すぎるように設計され、よって、アセンブリー非存在インデックスハイブリダイゼーションを可能にするには十分ではない。インデックスを付したスプリント分子のインデックス配列は、コンストラクト配列の一部ではなく、よって、ライブラリーメンバー間の相同性によって影響されない。これは、マルチプレックスアセンブリーの以前のハイスループット方法を上回る予想外の利益および改善である。
【実施例】
【0081】
本教示の態様は、決して本教示の範囲の限定として解釈されるべきではない次の実施例を踏まえて、さらに理解することができる。
【0082】
［実施例１］
次の実験を設計および実施して、図１、図２および図３に描写されるオリゴヌクレオチドスプリント構造を使用した溶液における低相同性ライブラリーの調製を評価した。よって、評価される３つの型の検査スプリント分子が存在した。用語「検査スプリント分子」は、図１における単一のスプリント分子を指す。図２および図３において、「検査スプリント分子」は、インデックスエレメントを形成する相補的なインデックス配列のハイブリダイゼーションによって形成された２個のオリゴヌクレオチド構造を指す。図２および図３におけるインデックスエレメントは同じものであり、６０℃～７５℃の範囲内のＴｍを有した。ハイブリダイズされたインデックスの高いＴｍは、Ｔｍを下回る温度で、有効に２個のヌクレオチド構造を単一の分子にする。
次の実験を設計および実施して、図１、図２および図３に描写されるオリゴヌクレオチドスプリント構造を使用した溶液における低相同性ライブラリーの調製を評価した。よって、評価される３つの型の検査スプリント分子が存在した。用語「検査スプリント分子」は、図１における単一のスプリント分子を指す。図２および図３において、「検査スプリント分子」は、インデックスエレメントを形成する相補的なインデックス配列のハイブリダイゼーションによって形成された２個のオリゴヌクレオチド構造を指す。図２および図３におけるインデックスエレメントは同じものであり、６０℃～７５℃の範囲内のＴｍを有した。ハイブリダイズされたインデックスの高いＴｍは、Ｔｍを下回る温度で、有効に２個のヌクレオチド構造を単一の分子にする。
【0083】
コンストラクト配列を、低相同性ゲノム配列、ＵＴＲ（非翻訳領域）のセットから得た。１４０種のＵＴＲをアセンブルした。検査されるスプリント分子の設計により、正しいコンストラクトは、同じＵＴＲ配列にライゲーションされるＵＴＲ配列であった。よって、１４０種の異なるＵＴＲについて、１４０種の異なる検査スプリント分子およびアセンブルするための可能な１４０種の全ての正しいコンストラクト、ならびに可能な１９，４６０種の全ての正しくないコンストラクトが存在した。典型的には、１４０種のＵＴＲのそれぞれが、本来のオリゴライブラリーにおいて２種のバージョンを有する：ＰＣＲ増幅およびＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に要求されるアダプターの導入のために、一方のバージョンは５’端にプライマー部位を有し、もう一方のバージョンは３’端にプライマー部位を有する。
【0084】
検査スプリント分子対コンストラクトの３種の比（１：１、２：１および４：１）を検査スプリント分子の型毎に検査した。図２および図３の検査スプリント分子（どちらもインデックスを有する）について、＋／－３ヌクレオチドスペーサー（支柱と称される）も検査した。３ヌクレオチド支柱は、検査スプリント分子のインデックスおよびスプリント部分の間に位置した。結果として、本実験においてアセンブルされる１５セットが存在した。各セットは、４２０種の異なるＵＴＲ配列からアセンブルされ得る１４０種の正しいＵＴＲコンストラクトを有した。異なるセット由来の産物は、配列決定によって区別可能であり、それによると、異なる配列は、ＤＮＡライブラリー材料の産生においてサブセット毎に異なる分子コピー番号をプリントされた。
【0085】
セット毎に、オリゴライブラリーを、ＵＴＲおよび検査スプリント分子から調製した。約８０ｎｇのライブラリーを可溶化し（キナーゼ反応およびリガーゼ反応の両方に適したバッファー中に）、次いで、ＤＮＡオリゴの５’末端をリン酸化するために、製造業者の推奨に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用したキナーゼ反応に付した。キナーゼ処理された産物を、１．７５時間にわたり９３℃から４４℃へと冷却するウォーターバスにおけるインキュベーションによってハイブリダイズさせて、図１、図２および図３に描写されるオリゴヌクレオチド構造を形成した。次に、ハイブリダイズされた産物をライゲーション温度に加熱し、１マイクロリットル（μｌ）の９°Ｎ（商標）リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加した。ライゲーション反応を１時間進めた。ライゲーションされた産物を、１．５×ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＮＧＳ（次世代配列決定）によって配列決定して、各セットにおける正しいアセンブリーの程度を特徴付けた。
【0086】
結果
ＮＧＳリードデータを図１４に示す。データは、検査スプリント分子の３つの型全て（図１、図２または図３に描写されるオリゴヌクレオチド構造の）が、１５セット全てにおいて機能したことを示す。図１の検査スプリント分子が、最も良く機能した。特に、スプリント／コンストラクト分子比が４：１であったセットが、検査した３種の比の中で最も良く機能し、７００個に近い平均数の正しくアセンブルされたコンストラクトに関するリードを有した。図２および図３のデータは、互いに同様であり、図２データが、僅かにより多い平均数の正しくアセンブルされたコンストラクトに関するリードを示す。図２の検査スプリント分子における３ヌクレオチド支柱の存在は、図２の検査スプリント分子にほとんど影響がなかった。図３の検査スプリント分子における３ヌクレオチド支柱の存在は、支柱がない検査スプリント分子のデータと比べて、僅かに低減した平均数のリードをもたらした。
ＮＧＳリードデータを図１４に示す。データは、検査スプリント分子の３つの型全て（図１、図２または図３に描写されるオリゴヌクレオチド構造の）が、１５セット全てにおいて機能したことを示す。図１の検査スプリント分子が、最も良く機能した。特に、スプリント／コンストラクト分子比が４：１であったセットが、検査した３種の比の中で最も良く機能し、７００個に近い平均数の正しくアセンブルされたコンストラクトに関するリードを有した。図２および図３のデータは、互いに同様であり、図２データが、僅かにより多い平均数の正しくアセンブルされたコンストラクトに関するリードを示す。図２の検査スプリント分子における３ヌクレオチド支柱の存在は、図２の検査スプリント分子にほとんど影響がなかった。図３の検査スプリント分子における３ヌクレオチド支柱の存在は、支柱がない検査スプリント分子のデータと比べて、僅かに低減した平均数のリードをもたらした。
【0087】
［実施例２］
実施例１におけるものとは異なる検査スプリント分子を試験するために、次の実験を設計および実施した。本実験は、図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造に図示される通りの検査スプリント分子を使用した。検査スプリント分子は、検査スプリント分子の５’および３’末端に位置し、２個のアセンブリーコンポーネントに結合するスプリント領域を挟む、インデックス配列を含有する単一のオリゴヌクレオチド配列である、インデックスを付したスプリント分子である。アセンブリーコンポーネント（ライゲーションされて、アセンブルされたコンストラクトを形成することになるアセンブリー配列を含む）は、検査スプリント分子のインデックス配列に対する逆相補体配列をさらに含み、これにより、２個の位置におけるアセンブリーコンポーネントへの検査スプリント分子のハイブリダイゼーションを可能にするように調製した。左アセンブリーコンポーネントについて、検査スプリント分子は、（１）左アセンブリーコンポーネントの３’端における特異的配列に結合するスプリントエレメントにおいて、および（２）左アセンブリーコンポーネントの５’末端におけるインデックス配列において（ハイブリダイズして、インデックスエレメントを形成する）結合する。右アセンブリーコンポーネントについて、検査スプリント分子は、（１）右アセンブリーコンポーネントの５’端における特異的配列に結合するスプリントエレメントにおいて、および（２）右アセンブリーコンポーネントの５’端におけるインデックス配列において（ハイブリダイズして、別のインデックスエレメントを形成する）結合する。左アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントは、右アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントとは異なる配列を有するため、２個の別々のインデックスエレメントの間に交差ハイブリダイゼーションは存在しない。左アセンブリーコンポーネントの５’末端におけるインデックスエレメントは、３０ヌクレオチドからなり、６５～７２℃の範囲内のＴｍを有し、右アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントは、３０ヌクレオチドからなり、６５～７２℃の範囲内のＴｍを有する。
実施例１におけるものとは異なる検査スプリント分子を試験するために、次の実験を設計および実施した。本実験は、図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造に図示される通りの検査スプリント分子を使用した。検査スプリント分子は、検査スプリント分子の５’および３’末端に位置し、２個のアセンブリーコンポーネントに結合するスプリント領域を挟む、インデックス配列を含有する単一のオリゴヌクレオチド配列である、インデックスを付したスプリント分子である。アセンブリーコンポーネント（ライゲーションされて、アセンブルされたコンストラクトを形成することになるアセンブリー配列を含む）は、検査スプリント分子のインデックス配列に対する逆相補体配列をさらに含み、これにより、２個の位置におけるアセンブリーコンポーネントへの検査スプリント分子のハイブリダイゼーションを可能にするように調製した。左アセンブリーコンポーネントについて、検査スプリント分子は、（１）左アセンブリーコンポーネントの３’端における特異的配列に結合するスプリントエレメントにおいて、および（２）左アセンブリーコンポーネントの５’末端におけるインデックス配列において（ハイブリダイズして、インデックスエレメントを形成する）結合する。右アセンブリーコンポーネントについて、検査スプリント分子は、（１）右アセンブリーコンポーネントの５’端における特異的配列に結合するスプリントエレメントにおいて、および（２）右アセンブリーコンポーネントの５’端におけるインデックス配列において（ハイブリダイズして、別のインデックスエレメントを形成する）結合する。左アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントは、右アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントとは異なる配列を有するため、２個の別々のインデックスエレメントの間に交差ハイブリダイゼーションは存在しない。左アセンブリーコンポーネントの５’末端におけるインデックスエレメントは、３０ヌクレオチドからなり、６５～７２℃の範囲内のＴｍを有し、右アセンブリーコンポーネントの３’末端におけるインデックスエレメントは、３０ヌクレオチドからなり、６５～７２℃の範囲内のＴｍを有する。
【0088】
コンストラクト配列（２２５０種の配列）を、低相同性ゲノム配列、ＵＴＲ（非翻訳領域）のセットから得た。アセンブリー配列は、２００ヌクレオチドの長さであった。アセンブリーコンポーネントは、ＵＴＲコンストラクト配列、インデックス配列、バーコードおよびプライマー配列を含んだ。図１５に図示される通り、左アセンブリーコンポーネント（左）は、５’から３’の向きに、インデックス配列（インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされたときにインデックス１を形成するため）、プライマー配列（プライマーＦ）、バーコード（ＢＣ１）およびアセンブリー配列を含んだ。右アセンブリーコンポーネント（右）は、５’から３’の向きに、アセンブリー配列、バーコード（ＢＣ２）、プライマー配列（プライマーＲ）およびインデックス配列（インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされたときにインデックス２を形成するため）を含んだ。
【0089】
検査スプリント分子は、５’から３’の向きに、インデックス配列（右アセンブリーコンポーネントにハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド構造におけるインデックス２を形成する）、スペーサー（点線）、スプリント配列、別のスペーサー（点線）および別のインデックス配列（ハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド構造におけるインデックス１を形成する）を含んだ。スプリント配列は、右アセンブリーコンポーネントのアセンブリー配列の５’末端配列にハイブリダイズする５’配列エレメントと、右アセンブリーコンポーネントのアセンブリー配列の３’末端配列にハイブリダイズする３’配列とを含有する。スプリントの５’配列エレメントおよび３’配列エレメントのそれぞれは、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、それぞれ、２８℃以上のＴｍを有する（ＥＱ．１：Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７を使用して計算される通り）。
【0090】
実験において利用されるスプリント分子の設計により、正しいコンストラクトは、同じＵＴＲにライゲーションされるＵＴＲであり、４００ヌクレオチドマルチコンポーネントコンストラクト（非コンストラクト配列を含まない）を生じた。各ＵＴＲアセンブリーコンポーネントは、６つの特有のバーコードペアをさらに含むように設計された。正しいコンストラクトは、アセンブルされたコンストラクトにおいて正しくペア形成されている左および右バーコードによって指し示される。よって、ＵＴＲ毎に、可能な６個の正しいコンストラクト（および可能な３０個の正しくないコンストラクト）が存在する。２２５０個の異なるＵＴＲ配列および６個の特有のバーコードペアが検査されたため、総計１３，５００個の特有のインデックスを付したスプリント分子（２２５０×６）および可能な１３，５００個の特有の正しいコンストラクトが存在する。
【0091】
ＵＴＲコンポーネント構築およびインデックスを付したスプリント分子を含有するオリゴライブラリーを調製した。約８０ｎｇのライブラリーを可溶化し、次いで、ＤＮＡオリゴの５’末端をリン酸化するために、製造業者の推奨に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用したキナーゼ反応に付した。キナーゼ処理された産物を、１．７５時間にわたり９３℃から４４℃へと冷却するウォーターバスにおけるインキュベーションによってハイブリダイズさせた。次に、ハイブリダイズされた産物を、ライゲーション温度６０．６℃に加熱し、１マイクロリットル（μｌ）の９°Ｎ（商標）リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加した。ライゲーション反応を１０分間進めた。ライゲーションされた産物を、１．５×ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＮＧＳ（次世代配列決定）によって配列決定して、正しいアセンブリーの程度を特徴付けた。
【0092】
結果
データを、図１５中の表に示す。１３，５００個の可能な正しい構築のうち、１３，４６５は、１０，０００，０００個よりも少ないリードによるライブラリーの配列決定により検出された。アセンブリーの反対の端に位置する特有のバーコードに基づき、このデータは、可能な正しい構築の９９．７０％が、反応においてアセンブルされたことを示すが、バーコード間で各配列の全長配列正確性を示すものではない。
データを、図１５中の表に示す。１３，５００個の可能な正しい構築のうち、１３，４６５は、１０，０００，０００個よりも少ないリードによるライブラリーの配列決定により検出された。アセンブリーの反対の端に位置する特有のバーコードに基づき、このデータは、可能な正しい構築の９９．７０％が、反応においてアセンブルされたことを示すが、バーコード間で各配列の全長配列正確性を示すものではない。
【0093】
よって、図５Ｂオリゴヌクレオチド構造は、著しく多い数の正しいコンストラクトを可能にした。これは、オリゴヌクレオチドライブラリーの調製に対して非常に結果的に必然な数である。
【0094】
［実施例３］
次の実験を設計および実施して、図１、図２および図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造を使用したアセンブリーを検査した。実験を設計して、３つの型のオリゴヌクレオチドライブラリー：（ａ）複合ライブラリー、（ｂ）タイル状のライブラリーおよび（ｃ）相同ライブラリーを比較した。３つの型のライブラリーは、図１６に模式的に描写されている。
次の実験を設計および実施して、図１、図２および図５Ｂのオリゴヌクレオチド構造を使用したアセンブリーを検査した。実験を設計して、３つの型のオリゴヌクレオチドライブラリー：（ａ）複合ライブラリー、（ｂ）タイル状のライブラリーおよび（ｃ）相同ライブラリーを比較した。３つの型のライブラリーは、図１６に模式的に描写されている。
【0095】
本実験の複合ライブラリーにおいて、配列は、末梢プライマー部位を除いて配列類似性がほとんどない。複合ライブラリー（ａ型）は、６００個の別個のＵＴＲ配列（すなわち、総計６００個の可能な正しいアセンブルされたコンストラクト）を有した。相同ライブラリー（ｃ型）は、６０個の別個のＵＴＲ配列を利用し、別個のＵＴＲ配列のそれぞれは、１０個の特有にバーコード付けされたコンストラクト（総計６００個の可能な正しいアセンブルされたコンストラクト）を有した。本実験のタイル状のライブラリーにおいて、各メンバーは、３種の他のメンバーと配列同一性を重複する。タイル状のライブラリー（ｂ型）について、１５０個の別個のＵＴＲ配列のそれぞれに対して４個のタイル状のコンストラクト（８２～２４６塩基対の重複配列同一性で）が存在した（総計６００個の可能な正しいアセンブルされたコンストラクト）。ライブラリー毎に、アセンブルされたコンストラクトは、４００塩基長であった。
【0096】
【0097】
【表1】
【0098】
９つのカテゴリーは全て同じライブラリー中にあり、一体にアセンブルされた。ＰＣＲ産物をＮＧＳ（次世代配列決定）によって配列決定して、正しいアセンブリーの程度を特徴付けた。
【0099】
結果
データを図１７に示す。リード（正しいおよび正しくない）の総数についてのデータは、左上グラフに描写されている。これらのデータは、相同性ライブラリー（ｃ型）における図１および図２のインデックスを付したスプリントが、大多数の正しくなくアセンブルされたコンストラクトをもたらしたことを示す。パーセント正確性データ（すなわち、リードの総数と比べた正しいリードの総数）は、左下グラフに描写されている。インデックスを付したスプリント分子の３つの型全てが、複合ライブラリー（ａ型）において高い正確性を生じ、タイル状のライブラリー（ｂ型）において中等レベルの正確性を生じた。図５Ｂのスプリント分子のみが、相同ライブラリー（ｃ型）に対して高い正確性を有した。正しいリードデータの中央値は、右上グラフに描写されている。ドロップアウトコンストラクトの数についてのデータは、右下グラフに描写されている。「ドロップアウトコンストラクト」は、正しいリードが存在しない正しいコンストラクトを指す（ライブラリー毎に６００個の可能な正しいコンストラクトが存在する）。これらのデータは、図１および図２アセンブリーのインデックスを付したスプリントが、ライブラリーの型毎にドロップアウトコンストラクトを有したことを示す。例えば、図１インデックスを付したスプリントは、複合ライブラリー（ａ型）について５０個を超えるドロップアウトコンストラクト、タイル状のライブラリー（ｂ型）について６０個を超えるドロップアウトコンストラクト、および相同ライブラリー（ｃ型）について７０個に近いドロップアウトコンストラクトを示した。図５Ｂインデックスを付したスプリントのライブラリーのいずれについてもドロップアウトコンストラクトは存在しなかった。
データを図１７に示す。リード（正しいおよび正しくない）の総数についてのデータは、左上グラフに描写されている。これらのデータは、相同性ライブラリー（ｃ型）における図１および図２のインデックスを付したスプリントが、大多数の正しくなくアセンブルされたコンストラクトをもたらしたことを示す。パーセント正確性データ（すなわち、リードの総数と比べた正しいリードの総数）は、左下グラフに描写されている。インデックスを付したスプリント分子の３つの型全てが、複合ライブラリー（ａ型）において高い正確性を生じ、タイル状のライブラリー（ｂ型）において中等レベルの正確性を生じた。図５Ｂのスプリント分子のみが、相同ライブラリー（ｃ型）に対して高い正確性を有した。正しいリードデータの中央値は、右上グラフに描写されている。ドロップアウトコンストラクトの数についてのデータは、右下グラフに描写されている。「ドロップアウトコンストラクト」は、正しいリードが存在しない正しいコンストラクトを指す（ライブラリー毎に６００個の可能な正しいコンストラクトが存在する）。これらのデータは、図１および図２アセンブリーのインデックスを付したスプリントが、ライブラリーの型毎にドロップアウトコンストラクトを有したことを示す。例えば、図１インデックスを付したスプリントは、複合ライブラリー（ａ型）について５０個を超えるドロップアウトコンストラクト、タイル状のライブラリー（ｂ型）について６０個を超えるドロップアウトコンストラクト、および相同ライブラリー（ｃ型）について７０個に近いドロップアウトコンストラクトを示した。図５Ｂインデックスを付したスプリントのライブラリーのいずれについてもドロップアウトコンストラクトは存在しなかった。
【0100】
このデータにおいて図５Ｂデータの２つの注目すべき側面が観察される。第一に、図５Ｂインデックスを付したスプリント分子を使用したアセンブリー方法は、有用なレベルの正確性でｃ型（複合ライブラリー）のライブラリー型をアセンブルすることができる唯一のものであった（左下グラフを参照）。第二に、図５Ｂインデックスを付したスプリント分子を使用したアセンブリー方法は、ドロップアウトがなかった（右下グラフを参照）。可能な正しいアセンブルされたコンストラクトの全６００個は、図５Ｂアセンブリーにおいてアセンブルされた。対照的に、他の２種のアプローチは、５０～８０個のドロップアウト、すなわち、６００個の可能な正しいコンストラクトで構築されなかったコンストラクトを有した。
【0101】
これらのデータは、図５Ｂに描写されているインデックスを付したスプリント分子を使用した正しいアセンブリーにおける効果を指し示し、スプリント分子のでたらめなハイブリダイゼーションが原因で他の仕方では不可能であろうコンストラクトの正しいアセンブリーを実証する。
【0102】
［実施例４］
次の実験を設計および実施して、図５Ｂに示す通りのインデックスを付したスプリント分子を利用したコンストラクトのアセンブルにおける２種の実験変数の効果を測定した。
次の実験を設計および実施して、図５Ｂに示す通りのインデックスを付したスプリント分子を利用したコンストラクトのアセンブルにおける２種の実験変数の効果を測定した。
【0103】
コンストラクト配列を、低相同性ゲノム配列、ＵＴＲ（非翻訳領域）のセットから得た。融解温度（Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７によって計算されたＴｍ）によって組織化された、スプリントを付した配列のハーフ毎に１６種の可変的な長さを設計した。２℃における１４℃～４４℃の温度閾値をスプリントハーフのために調製した。４０個のＵＴＲ特有の配列をスプリント設計毎にアセンブルした（１６×４０＝総計６４０個のＵＴＲ配列）。ＵＴＲ配列のそれぞれに対して１０個の特有のバーコードを使用した（総計６，４００個の可能な正しいコンストラクト）。アセンブルされたコンストラクトにおいてバーコードが正しくペア形成された場合（ＮＧＳによって測定）、「正しい」ペアをコールした。アセンブリーコンポーネントは、フォワードプライマー（上流アセンブリーコンポーネント）およびリバースプライマー（下流アセンブリーコンポーネント）のための配列をさらに含んで、ＰＣＴ増幅を可能にした。８種の異なるライゲーション温度でライブラリーをアセンブルした。図１８は、本実験の図５Ｂ検査スプリント分子の模式図を描写する。
【0104】
オリゴライブラリーを、ＵＴＲアセンブリーコンポーネントおよび様々な検査スプリント分子から調製した。約８０ｎｇのライブラリーを可溶化し（キナーゼ反応およびリガーゼ反応の両方に適したバッファー中に）、次いで、ＤＮＡオリゴの５’末端をリン酸化するために、製造業者の推奨に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用したキナーゼ反応に付した。キナーゼ処理された産物を、１．７５時間にわたり９３℃から４４℃へと冷却するウォーターバスにおけるインキュベーションによってハイブリダイズさせて、図５Ｂに描写されているオリゴヌクレオチド構造を形成した。次に、ハイブリダイズされた産物を検査されているライゲーション温度の１つに加熱し、１マイクロリットル（μｌ）の９°Ｎ（商標）リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を添加した。ライゲーション反応を１時間進めた。ライゲーションされた産物を、１．５×ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＮＧＳ（次世代配列決定）によって配列決定して、正しいアセンブリーの程度を特徴付けた。
【0105】
結果
データは全般的に、アセンブリーの特異性が、より高いライゲーション温度で増加することを実証する。データはまた全般的に、短くされたスプリント長さ（より低いＴｍ）を有するアセンブリーコンストラクトの効率が、高いライゲーション温度で減少することを実証する。代表的なデータは、図１８中のグラフに描写されている。データは、２個のスプリントセグメントに対するＴｍの範囲にわたる、図５Ｂにおけるインデックスを付したスプリント分子を利用して可能な高い程度の正しいアセンブリーを図示する。
データは全般的に、アセンブリーの特異性が、より高いライゲーション温度で増加することを実証する。データはまた全般的に、短くされたスプリント長さ（より低いＴｍ）を有するアセンブリーコンストラクトの効率が、高いライゲーション温度で減少することを実証する。代表的なデータは、図１８中のグラフに描写されている。データは、２個のスプリントセグメントに対するＴｍの範囲にわたる、図５Ｂにおけるインデックスを付したスプリント分子を利用して可能な高い程度の正しいアセンブリーを図示する。
【0106】
例示的な実施形態
産物
実施形態１． ２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するためのオリゴヌクレオチド構造であって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドと、インデックスを付したスプリントとを含み、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、インデックスを付したスプリントに部分的にハイブリダイズされている、オリゴヌクレオチド構造。
実施形態２． （ａ）インデックスを付したスプリントが、スプリント配列、ならびにスプリント配列を挟む第１のインデックス配列および第２のインデックス配列を含み、
（ｂ）スプリント配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端の両方にハイブリダイズされ、
（ｃ）第１のインデックス配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズされて、第１の二本鎖インデックスエレメントを形成し、第２のインデックス配列が、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズされて、第２の二本鎖インデックスエレメントを形成する、
実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態３． インデックスを付したスプリントのスプリント配列が、
（ａ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズされる（それに対する逆相補体である）５’エレメントと、
（ｂ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズされる（それに対する逆相補体である）３’エレメントと
を含有し、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントが、接している、すなわち、介在するヌクレオチドがない、実施形態２に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態４． （ａ）の５’ハイブリダイズされたスプリントエレメントおよび（ｂ）の３’ハイブリダイズされたスプリントエレメントのそれぞれが、約１４℃～約４４℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態５． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付した配列の５’端に位置する、
実施形態２、３および４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態６． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第２のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし（その逆相補体であり）、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする（その逆相補体である）、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第１のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態５に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態７． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態６に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態８． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付した配列の３’端に位置する、
実施形態２、３および４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態９． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第１のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズされ（その逆相補体であり）、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列にハイブリダイズされる（その逆相補体である）、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第２のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態８に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１０． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態８または９に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１１． 各二本鎖インデックスエレメントが、１０～４０塩基対を含む、実施形態２から１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１２． 各二本鎖インデックスエレメントが、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２から１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１３． 第４のインデックス配列（セグメントＦ）が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態６、７、９、１０および１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１４． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに対して３’にあるＩＩ型制限酵素部位をさらに含み、切断の制限酵素部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１５． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーによって第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結され、切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１６． セグメントＤまたはセグメントＥの配列セグメントにハイブリダイズされる（その逆相補体である）少なくとも１個のブロッキングオリゴヌクレオチドコンポーネントをさらに含み、配列セグメントが、スプリントにハイブリダイズされる配列を除外する、実施形態２から１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１７． 実施形態１から１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造のセットまたはライブラリー。
実施形態１８． 実施形態１７に記載のセットまたはライブラリーを含むキット。
実施形態１９． ＤＮＡリガーゼをさらに含む、実施形態１８に記載のキット。
産物
実施形態１． ２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するためのオリゴヌクレオチド構造であって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドと、インデックスを付したスプリントとを含み、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、インデックスを付したスプリントに部分的にハイブリダイズされている、オリゴヌクレオチド構造。
実施形態２． （ａ）インデックスを付したスプリントが、スプリント配列、ならびにスプリント配列を挟む第１のインデックス配列および第２のインデックス配列を含み、
（ｂ）スプリント配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端の両方にハイブリダイズされ、
（ｃ）第１のインデックス配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズされて、第１の二本鎖インデックスエレメントを形成し、第２のインデックス配列が、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズされて、第２の二本鎖インデックスエレメントを形成する、
実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態３． インデックスを付したスプリントのスプリント配列が、
（ａ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズされる（それに対する逆相補体である）５’エレメントと、
（ｂ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズされる（それに対する逆相補体である）３’エレメントと
を含有し、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントが、接している、すなわち、介在するヌクレオチドがない、実施形態２に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態４． （ａ）の５’ハイブリダイズされたスプリントエレメントおよび（ｂ）の３’ハイブリダイズされたスプリントエレメントのそれぞれが、約１４℃～約４４℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態５． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付した配列の５’端に位置する、
実施形態２、３および４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態６． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第２のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし（その逆相補体であり）、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする（その逆相補体である）、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第１のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態５に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態７． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態６に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態８． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付した配列の３’端に位置する、
実施形態２、３および４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態９． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第１のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズされ（その逆相補体であり）、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド（左アセンブリーコンポーネント）の３’末端配列にハイブリダイズされる（その逆相補体である）、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第２のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態８に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１０． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態８または９に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１１． 各二本鎖インデックスエレメントが、１０～４０塩基対を含む、実施形態２から１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１２． 各二本鎖インデックスエレメントが、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２から１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１３． 第４のインデックス配列（セグメントＦ）が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態６、７、９、１０および１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１４． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに対して３’にあるＩＩ型制限酵素部位をさらに含み、切断の制限酵素部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１５． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーによって第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結され、切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１６． セグメントＤまたはセグメントＥの配列セグメントにハイブリダイズされる（その逆相補体である）少なくとも１個のブロッキングオリゴヌクレオチドコンポーネントをさらに含み、配列セグメントが、スプリントにハイブリダイズされる配列を除外する、実施形態２から１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造。
実施形態１７． 実施形態１から１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド構造のセットまたはライブラリー。
実施形態１８． 実施形態１７に記載のセットまたはライブラリーを含むキット。
実施形態１９． ＤＮＡリガーゼをさらに含む、実施形態１８に記載のキット。
【0107】
方法
実施形態２０． ２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するための方法であって、
（Ａ）第１のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズさせるステップであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされ、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされる、ステップと、
（Ｂ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端を第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にライゲーションし、これにより、第１のマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するステップとを含む方法。
実施形態２１． （ａ）インデックスを付したスプリントが、スプリント配列、ならびにスプリント配列を挟む第１のインデックス配列および第２のインデックス配列をさらに含み、
（ｂ）スプリント配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端の両方にハイブリダイズし、
（ｃ）第１のインデックス配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズして、第１の二本鎖インデックスエレメントを形成し、第２のインデックス配列が、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズして、第２の二本鎖インデックスエレメントを形成する、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２． インデックスを付したスプリントのスプリント配列が、
（ａ）二本鎖５’スプリントエレメントを形成する、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする５’エレメントと、
（ｂ）二本鎖３’スプリントエレメントを形成する、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする３’エレメントと
を含有し、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントが、接している、すなわち、介在するヌクレオチドがない、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３． 二本鎖５’スプリントエレメントおよび二本鎖３’スプリントエレメントがそれぞれ、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置する、
実施形態２１、２２または２３に記載の方法。
実施形態２５． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第２のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第１のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置する、
実施形態２１、２２または２３に記載の方法。
実施形態２８． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第１のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第２のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態２７または２８に記載の方法。
実施形態３０． 各二本鎖インデックスエレメントが、１０～４０塩基対を含む、実施形態２１から２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１． 各二本鎖インデックスエレメントが、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２１から３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２． （Ｃ）マルチコンポーネントライゲーション産物からインデックスを付したスプリントを変性させるステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を反復的に行うステップと
をさらに含む、実施形態２０から３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３． 第４のインデックス配列が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態２０から３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに対して３’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、制限酵素切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５． 第４のインデックス配列が、切断可能な（または取り外し可能な）リンカーによって第２のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３６． 第１のライゲーション産物における第２のＤＮＡコンポーネントから第４のインデックス配列を除去するステップと、
第４のインデックス配列を有するさらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチド、および第２のスプリント配列を含むさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の第１の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
さらに別のインデックスを付したスプリントの第２のスプリント配列が、さらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける５’末端配列にハイブリダイズする５’エレメント、および第１のライゲーション産物の３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメントを含有する、実施形態３３から３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７． インデックスを付したスプリントが、第５のインデックス配列に隣接する第２のスプリント配列をさらに含み、第２のスプリント配列の５’エレメントが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの３’末端配列にハイブリダイズすることができる、実施形態３３から３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８． 第３のインデックス配列が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態２０から３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９． 第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第１のＤＮＡ配列コンポーネントに対して５’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、制限酵素切断の部位が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０． 第３のインデックス配列が、切断可能な（または取り外し可能な）リンカーによって第１のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、切断の部位が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４１． 第１のライゲーション産物における第１のＤＮＡ配列コンポーネントから第３のインデックス配列を除去するステップと、
第３のインデックス配列を有するさらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、およびさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の第２の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
さらに別のインデックスを付したスプリントのスプリント配列が、さらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメント、および第１のライゲーション産物における５’末端配列にハイブリダイズする（それに対する逆相補体である）５’エレメントを含有する、実施形態３８から４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２． ハイブリダイズするステップが、インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）に基づく温度の範囲で行われ、
ライゲーションするステップが、スプリント配列の５’および３’エレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも高く、インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度で行われる、実施形態２０から４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３． ライゲーションステップの温度が、約４５°～７０℃であり、リガーゼが熱安定性である、実施形態２０から４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４． インデックスエレメントの融解温度が、約６０°～９０℃である、実施形態２０から４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５． ５’スプリントエレメントおよび３’スプリントエレメントの融解温度が、約２０°～４２℃である、実施形態２０から４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０． ２個の核酸コンポーネントをアセンブルしてマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するための方法であって、
（Ａ）第１のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のＤＮＡ配列コンポーネントを含む第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズさせるステップであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされ、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端および３’端の両方が、インデックスを付したスプリントにハイブリダイズされる、ステップと、
（Ｂ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端を第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にライゲーションし、これにより、第１のマルチコンポーネントライゲーション産物を産生するステップとを含む方法。
実施形態２１． （ａ）インデックスを付したスプリントが、スプリント配列、ならびにスプリント配列を挟む第１のインデックス配列および第２のインデックス配列をさらに含み、
（ｂ）スプリント配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端の両方にハイブリダイズし、
（ｃ）第１のインデックス配列が、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズして、第１の二本鎖インデックスエレメントを形成し、第２のインデックス配列が、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズして、第２の二本鎖インデックスエレメントを形成する、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２． インデックスを付したスプリントのスプリント配列が、
（ａ）二本鎖５’スプリントエレメントを形成する、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’端にハイブリダイズする５’エレメントと、
（ｂ）二本鎖３’スプリントエレメントを形成する、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’端にハイブリダイズする３’エレメントと
を含有し、スプリント配列の５’エレメントおよび３’エレメントが、接している、すなわち、介在するヌクレオチドがない、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３． 二本鎖５’スプリントエレメントおよび二本鎖３’スプリントエレメントがそれぞれ、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置する、
実施形態２１、２２または２３に記載の方法。
実施形態２５． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第２のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第１のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７． （１）第１のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの５’端に位置し、
（２）第２のインデックス配列が、インデックスを付したスプリントの３’端に位置する、
実施形態２１、２２または２３に記載の方法。
実施形態２８． （ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含む第３のインデックス配列と、
（２）マルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第１のＤＮＡ配列コンポーネントであって、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第１のＤＮＡ配列コンポーネントとを含み、
（ｂ）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’から３’の向きに、
（１）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列を含むマルチコンポーネントライゲーション産物へとライゲーションされる第２のＤＮＡ配列コンポーネントと、
（２）第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列を含む第４のインデックス配列とを含み、
（ｃ）インデックスを付したスプリントが、５’から３’の向きに、
（１）第１のインデックス配列である５’末端配列と、
（２）任意選択的な第１のスペーサー配列と、
（３）スプリント配列であって、
スプリント配列の５’エレメントが、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端配列にハイブリダイズし、
スプリント配列の３’エレメントが、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端配列にハイブリダイズする、スプリント配列と、
（４）任意選択的な第２のスペーサー配列と、
（５）第２のインデックス配列である３’末端配列とを含む、
実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９． 各スペーサー配列が独立して、１～３０ヌクレオチドからなる、実施形態２７または２８に記載の方法。
実施形態３０． 各二本鎖インデックスエレメントが、１０～４０塩基対を含む、実施形態２１から２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１． 各二本鎖インデックスエレメントが、約１０℃～約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、
Ｔｍ＝（２＊（Ａ数値＋Ｔ数値））＋（４＊（Ｃ数値＋Ｇ数値））－７である、
実施形態２１から３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２． （Ｃ）マルチコンポーネントライゲーション産物からインデックスを付したスプリントを変性させるステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を反復的に行うステップと
をさらに含む、実施形態２０から３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３． 第４のインデックス配列が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態２０から３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４． 第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントに対して３’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、制限酵素切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５． 第４のインデックス配列が、切断可能な（または取り外し可能な）リンカーによって第２のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、切断の部位が、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの直接３’にある、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３６． 第１のライゲーション産物における第２のＤＮＡコンポーネントから第４のインデックス配列を除去するステップと、
第４のインデックス配列を有するさらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチド、および第２のスプリント配列を含むさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の第１の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
さらに別のインデックスを付したスプリントの第２のスプリント配列が、さらに別の第２の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける５’末端配列にハイブリダイズする５’エレメント、および第１のライゲーション産物の３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメントを含有する、実施形態３３から３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７． インデックスを付したスプリントが、第５のインデックス配列に隣接する第２のスプリント配列をさらに含み、第２のスプリント配列の５’エレメントが、第２のＤＮＡ配列コンポーネントの３’末端配列にハイブリダイズすることができる、実施形態３３から３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８． 第３のインデックス配列が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントに除去可能に（または取り外し可能に）連結される、実施形態２０から３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９． 第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが、第１のＤＮＡ配列コンポーネントに対して５’にあるＩＩｓ型制限酵素部位をさらに含み、制限酵素切断の部位が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０． 第３のインデックス配列が、切断可能な（または取り外し可能な）リンカーによって第１のＤＮＡ配列コンポーネントに連結され、切断の部位が、第１のＤＮＡ配列コンポーネントの直接５’にある、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４１． 第１のライゲーション産物における第１のＤＮＡ配列コンポーネントから第３のインデックス配列を除去するステップと、
第３のインデックス配列を有するさらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、およびさらに別のインデックスを付したスプリントを用意するステップと、
その後、ステップ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行うステップと
をさらに含み、第１のライゲーション産物が、ステップ（Ａ）の第２の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
さらに別のインデックスを付したスプリントのスプリント配列が、さらに別の第１の一本鎖オリゴヌクレオチドにおける３’末端配列にハイブリダイズする３’エレメント、および第１のライゲーション産物における５’末端配列にハイブリダイズする（それに対する逆相補体である）５’エレメントを含有する、実施形態３８から４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２． ハイブリダイズするステップが、インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）に基づく温度の範囲で行われ、
ライゲーションするステップが、スプリント配列の５’および３’エレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも高く、インデックスエレメントの融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度で行われる、実施形態２０から４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３． ライゲーションステップの温度が、約４５°～７０℃であり、リガーゼが熱安定性である、実施形態２０から４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４． インデックスエレメントの融解温度が、約６０°～９０℃である、実施形態２０から４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５． ５’スプリントエレメントおよび３’スプリントエレメントの融解温度が、約２０°～４２℃である、実施形態２０から４４のいずれか１つに記載の方法。
【0108】
例示的なまたは好まれる実施形態の先の記載は、特許請求の範囲によって定義される本開示の限定ではなく例証として解釈されるべきである。容易に認められる通り、特許請求の範囲に示す本開示から逸脱することなく、上に示す特色の多数の変種および組合せを利用することができる。そのような変種は、本開示の範囲からの逸脱として考慮されず、そのような変種は全て、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。本明細書に引用されるあらゆる参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】