(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】改良された発現ベクターおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240719BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240719BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240719BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240719BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240719BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12P21/08
C07K16/46
C07K16/00
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506140
(86)(22)【出願日】2022-07-29
(85)【翻訳文提出日】2024-02-29
(86)【国際出願番号】 IB2022057073
(87)【国際公開番号】W WO2023012627
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】63/228,315
(32)【優先日】2021-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】593141953
【氏名又は名称】ファイザー・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100133927
【弁理士】
【氏名又は名称】四本 能尚
(74)【代理人】
【識別番号】100174447
【弁理士】
【氏名又は名称】龍田 美幸
(74)【代理人】
【識別番号】100185960
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 理愛
(72)【発明者】
【氏名】カルパニー ルワンマリ バンダラ
(72)【発明者】
【氏名】キャサリン メアリー ビール
(72)【発明者】
【氏名】ジョン ジョセフ スカルチェッリ
(72)【発明者】
【氏名】リン ザング
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞染色体に組み込まれた第１の外因性核酸構築物および宿主細胞染色体に組み込まれた第２の外因性核酸構築物を含む哺乳動物宿主細胞であって、第１の外因性核酸構築物が、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の外因性核酸構築物が、抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含む、哺乳動物宿主細胞。
【請求項2】
宿主細胞染色体に組み込まれた第１の外因性核酸構築物および宿主細胞染色体に組み込まれた第２の外因性核酸構築物を含む哺乳動物宿主細胞であって、第１の外因性核酸構築物が、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含み、かつ、
第２の外因性核酸構築物が、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体重鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含む、
哺乳動物宿主細胞。
【請求項3】
第２の外因性核酸構築物の第１の遺伝子が抗体重鎖をコードする、請求項１から２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項4】
第２の外因性核酸構築物の第１の遺伝子が抗体重鎖融合タンパク質をコードする、請求項１から２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項5】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列が、少なくとも１つのヌクレオチド分、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する、請求項２から４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項6】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列および第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列が、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項7】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、および第２の外因性核酸構築物の第２の組換え配列が、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項8】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列が、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有する、請求項２から７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項9】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列が、少なくとも１つのヌクレオチド分、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する、請求項２から７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項10】
第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、および第２の外因性核酸構築物の第２の組換え配列がそれぞれ、少なくとも１つのヌクレオチド分、互いに異なる、請求項２から７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項11】
第１の組換え配列が、チロシン部位特異的リコンビナーゼまたはセリン部位特異的リコンビナーゼによって認識される、請求項２から１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項12】
チロシン部位特異的リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼである、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
セリン部位特異的リコンビナーゼがＢｘｂ１リコンビナーゼである、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項14】
細胞が、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項15】
核酸構築物の一方または両方が、抗体軽鎖、抗体重鎖、および抗体重鎖融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の各々の上流にプロモーターを、下流にポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項16】
抗体または抗体融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の哺乳動物宿主細胞を提供するステップ、
（ｂ）抗体または抗体融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で宿主細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【請求項17】
発現した抗体または抗体融合タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞によってまたは請求項１６から１７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、抗体または抗体融合タンパク質。
【請求項19】
第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを含む組成物であって、第１の発現ベクターが、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の発現ベクターが、抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含む、組成物。
【請求項20】
第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを含む組成物であって、第１の発現ベクターが、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含み、かつ、
第２の発現ベクターが、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体重鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含む、
組成物。
【請求項21】
第２の発現ベクターの第１の遺伝子が抗体重鎖をコードする、請求項１９から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
第２の発現ベクターの第１の遺伝子が抗体重鎖融合タンパク質をコードする、請求項１９から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列が、少なくとも１つのヌクレオチド分、第１の発現ベクターの第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列および第２の発現ベクターの第１の組換え配列が、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列、第１の発現ベクターの第２の組換え配列、第２の発現ベクターの第１の組換え配列、および第２の発現ベクターの第２の組換え配列が、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項26】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列が、第２の発現ベクターの第１の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有する、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列が、少なくとも１つのヌクレオチド分、第２の発現ベクターの第１の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
第１の発現ベクターの第１の組換え配列、第１の発現ベクターの第２の組換え配列、第２の発現ベクターの第１の組換え配列、および第２の発現ベクターの第２の組換え配列がそれぞれ、少なくとも１つのヌクレオチド分、互いに異なる、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
第１の組換え配列が、チロシン部位特異的リコンビナーゼまたはセリン部位特異的リコンビナーゼによって認識される、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
チロシン部位特異的リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
セリン部位特異的リコンビナーゼがＢｘｂ１リコンビナーゼである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項32】
発現ベクターの一方または両方が、抗体軽鎖、抗体重鎖、および抗体重鎖融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の各々の上流にプロモーターを、下流にポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項１９から３１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書では、改良されたタンパク質発現ベクター、当該ベクターを含有する細胞、ならびに関連する組成物および方法が提供される。発現ベクターは、宿主細胞における抗体などのタンパク質の発現に使用され得る。
【背景技術】
【0002】
組換え抗体および関連分子（例えば、抗体融合タンパク質）は、複数の使用、例えば医学的治療および診断にとって重要である。組換え抗体の産生のための効果的な方法は存在しているが、組換え抗体の産生は依然として複雑で費用のかかるプロセスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
したがって、組換え抗体の産生の際に生じる組換え抗体の量および／または質を改善する組成物および方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、改良されたタンパク質発現ベクター、当該ベクターを含有する細胞、ならびに関連する組成物および方法に関する。発現ベクターは、宿主細胞における抗体などのタンパク質の発現に使用され得る。
【0005】
一部の実施形態では、宿主細胞染色体に組み込まれた第１の外因性核酸構築物および宿主細胞染色体に組み込まれた第２の外因性核酸構築物を含む哺乳動物宿主細胞であって、第１の外因性核酸構築物が、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の外因性核酸構築物が、抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含む、哺乳動物宿主細胞が本明細書で提供される。
【0006】
一部の実施形態では、宿主細胞染色体に組み込まれた第１の外因性核酸構築物および宿主細胞染色体に組み込まれた第２の外因性核酸構築物を含む哺乳動物宿主細胞であって、第１の外因性核酸構築物が、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の外因性核酸構築物が、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体重鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含む、哺乳動物宿主細胞が本明細書で提供される。
【0007】
本明細書で提供される宿主細胞において、一部の実施形態では、第２の外因性核酸構築物の第１の遺伝子は、抗体重鎖をコードする。一部の実施形態では、第２の外因性核酸構築物の第１の遺伝子は、抗体重鎖融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列は、少なくとも１つのヌクレオチド分、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列および第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列は、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される。一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、および第２の外因性核酸構築物の第２の組換え配列は、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される。
【0008】
本明細書で提供される宿主細胞において、一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列は、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列は、少なくとも１つのヌクレオチド分、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、第１の外因性核酸構築物の第２の組換え配列、第２の外因性核酸構築物の第１の組換え配列、および第２の外因性核酸構築物の第２の組換え配列はそれぞれ、少なくとも１つのヌクレオチド分、互いに異なる。
【0009】
本明細書で提供される宿主細胞において、一部の実施形態では、第１の組換え配列は、チロシン部位特異的リコンビナーゼまたはセリン部位特異的リコンビナーゼによって認識される。チロシン部位特異的リコンビナーゼは、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼであってもよい。セリン部位特異的リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１リコンビナーゼであってもよい。
【0010】
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主は、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト細胞である。
【0011】
本明細書で提供される宿主細胞において、一部の実施形態では、核酸構築物の一方または両方は、抗体軽鎖、抗体重鎖、および抗体重鎖融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の各々の上流にプロモーターを、下流にポリ（Ａ）配列をさらに含む。
【0012】
一部の実施形態では、抗体または抗体融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ）本明細書で提供される哺乳動物宿主細胞を提供するステップ、および（ｂ）抗体または抗体融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で宿主細胞を培養するステップを含む、方法が本明細書で提供される。本方法は、発現した抗体または抗体融合タンパク質を回収するステップをさらに含んでいてもよい。
【0013】
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞によってまたは本明細書で提供される方法に従って調製された抗体または抗体融合タンパク質が本明細書で提供される。
【0014】
一部の実施形態では、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを含む組成物であって、第１の発現ベクターが、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の発現ベクターが、抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を５’から３’の順序で含む、組成物が本明細書で提供される。
【0015】
一部の実施形態では、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを含む組成物であって、第１の発現ベクターが、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含み、かつ、第２の発現ベクターが、以下のエレメント：ａ）第１の組換え配列、ｂ）抗体重鎖または抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子、ｃ）抗体重鎖をコードする第２の遺伝子、ｄ）第２の組換え配列を５’から３’の順序で含む、組成物が本明細書で提供される。
【0016】
本明細書で提供される組成物において、一部の実施形態では、第２の発現ベクターの第１の遺伝子は、抗体重鎖をコードする。一部の実施形態では、第２の発現ベクターの第１の遺伝子は、抗体重鎖融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列は、少なくとも１つのヌクレオチド分、第１の発現ベクターの第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列および第２の発現ベクターの第１の組換え配列は、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列、第１の発現ベクターの第２の組換え配列、第２の発現ベクターの第１の組換え配列、および第２の発現ベクターの第２の組換え配列は、同一のリコンビナーゼ酵素によって認識される。
【0017】
本明細書で提供される組成物において、一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列は、第２の発現ベクターの第１の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列は、少なくとも１つのヌクレオチド分、第２の発現ベクターの第１の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第１の組換え配列、第１の発現ベクターの第２の組換え配列、第２の発現ベクターの第１の組換え配列、および第２の発現ベクターの第２の組換え配列はそれぞれ、少なくとも１つのヌクレオチド分、互いに異なる。
【0018】
本明細書で提供される組成物において、一部の実施形態では、第１の組換え配列は、チロシン部位特異的リコンビナーゼまたはセリン部位特異的リコンビナーゼによって認識される。チロシン部位特異的リコンビナーゼは、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼであってもよい。セリン部位特異的リコンビナーゼは、Ｂｘｂ１リコンビナーゼであってもよい。
【0019】
本明細書で提供される組成物において、一部の実施形態では、発現ベクターの一方または両方は、抗体軽鎖、抗体重鎖、および抗体重鎖融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の各々の上流にプロモーターを、下流にポリ（Ａ）配列をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＨＣまたはＬＣのトランスジェニックＯＲＦ（長方形）を示す略図であり、ＯＲＦの５’末端の付近にあるヌクレオチド多型（ＮＰ）位置（長方形における縦の線）、および各特異的ＮＰを検出するために使用された対応するプライマー／プローブセット（長方形の上の黒い線）を示している。全プライマープローブセット（長方形の上の破線）は、ＯＲＦの３’末端の付近に位置しており、総転写産物レベルを測定するために使用される。
【図2】６つの異なるベクター構造（Ｃ１～Ｃ６）についての、各ランディングパッドに組み込まれたベクタートポロジーを示す略図である。軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）のヌクレオチド多型（ＮＰ）が、ＮＰ１～ＮＰ４で標識されている。各ＮＰは、全ての構造で、ベクターおよびランディングパッドにおける各位置が不変のままである。ＬＣおよびＨＣのＯＲＦおよび選択マーカー（「セレクト１」－ブラストサイジン耐性遺伝子、または「セレクト２」－グルタミンシンテターゼ遺伝子）が、ベクターの組換え配列（「Ｒｅｃ」）の間に含まれており、宿主ゲノムへの適正な組み込みを可能にしている。
【図3A】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを含有している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図3B】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを示している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図3C】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを示している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図3D】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを示している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図3E】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを示している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図3F】図２で概説されている６つの構造についての、各ベクターにおける各ｍＡｂ遺伝子（ヌクレオチド多型（ＮＰ）によって同定される）のｃＤＮＡレベルを測定する転写産物発現の結果をまとめた棒グラフであり、具体的には、構造Ｃ１：図３Ａ、構造Ｃ２：図３Ｂ、構造Ｃ３：図３Ｃ、構造Ｃ４：図３Ｄ、構造Ｃ５：図３Ｅ、構造Ｃ６：図３Ｆである。図３Ａ～３Ｆの各々で、バーは、左から右に向かって、ランディングパッドＡの位置１（塗りつぶしのバー）、ランディングパッドＡの位置２（右肩上がりのストライプのバー）、ランディングパッドＢの位置１（チェック柄のバー）、ランディングパッドＢの位置２（左肩上がりのストライプのバー）の順で、遺伝子の発現データを示している。結果は、全てのトランスフェクション条件での、２つまたは３つの複製プールの各々から得られた３回のｄｄＰＣＲ反応の平均を表している。
【図4A】表３の数値一覧によって予測される、図２で示されているベクター構造Ｃ６（ＬＨ ＬＨ）およびベクター構造Ｃ２（ＬＬ ＨＨ）の両方での、各構造の理論的な（予測される）転写産物レベルと比較した、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する６つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ１～ｍＡｂ６）の比率として定量された、重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ転写産物を示す棒グラフである。図４Ａでは、各ｍＡｂで、具体的なバーは、Ｃ６構造における正規化された総重鎖（ＨＣ）転写産物（左肩上がりのスラッシュ柄）、Ｃ２構造における正規化された総ＨＣ転写産物（塗りつぶし）、Ｃ６構造における正規化された総軽鎖（ＬＣ）転写産物（無地）、およびＣ２構造における正規化された総ＬＣ転写産物（平行線柄）を示している。
【図4B】５つの異なる抗体（ｍＡｂ４の力価データは入手できなかった）の１２日間の流加から得られた、ｍｇ／Ｌ単位で表されている、Ｃ６ベクター構造（無地）またはＣ２ベクター構造（塗りつぶし）のいずれかにおける各ｍＡｂの抗体力価の結果を示している。
【図5A】ベクター構造Ｃ１およびＣ２での、ｍＡｂ融合タンパク質の予測された転写産物レベルと観察された転写産物レベルとを示す棒グラフである（これらの構造の詳細については、表４を参照されたい）。左から右に向かって、３本のバーからなる各群は、ｉ）構造Ｃ１の予測値、ｉｉ）構造Ｃ１の観察値、ｉｉｉ）構造Ｃ２の予測値、ｉｖ）構造Ｃ２の観察値についてである。３本のバーからなる各セットでは、具体的なバーは、左から右に向かって、正規化された総重鎖（ＨＣ）転写産物（塗りつぶし）、正規化された総重鎖融合タンパク質（ＨＣ－Ｆ）転写産物（左肩上がりのスラッシュ柄）、および正規化された総軽鎖（ＬＣ）転写産物（無地）を示している。
【図5B】ベクター構造Ｃ１およびＣ２の各々での、ｍＡｂ融合タンパク質の１２日間の流加から得られた、ｍｇ／Ｌ単位で表されている抗体力価の結果を示す棒グラフである。
【図5C】還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥのデンシトメトリー分析によって決定された、Ｃ１およびＣ２ベクター構造の各々での、ｍＡｂ融合タンパク質の各々の個々のポリペプチド鎖のパーセントを示す棒グラフである。左から右に向かって、３本のバーからなる各群は、ｉ）構造Ｃ１、ｉｉ）構造Ｃ２についてである。３本のバーからなる各セットについて、具体的なバーは、左から右に向かって、重鎖（ＨＣ）のパーセント（塗りつぶし）、重鎖融合タンパク質（ＨＣ－Ｆ）のパーセント（左肩上がりのスラッシュ柄）、および軽鎖（ＬＣ）のパーセント（無地）を示している。
【発明を実施するための形態】
【0021】
改良されたタンパク質発現ベクター、ベクターを含有する細胞、ならびに関連する組成物および方法が本明細書で開示される。
【0022】
本明細書で提供されている開示は、タンパク質発現ベクター内の抗体コード遺伝子のある特定の構造が、遺伝子の転写の改善、ならびに抗体産物の収量の改善および質の改善の一方または両方をもたらすという発見に関する。
【0023】
一般的技術
本発明の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）中で、ならびに該当する場合には、上記参考文献の後続の版および対応するウェブサイト中で、十分に説明されている。
本発明の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）中で、ならびに該当する場合には、上記参考文献の後続の版および対応するウェブサイト中で、十分に説明されている。
【0024】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の科学用語または専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものである。一部の場合では、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするためおよび／またはすぐに参照できるようにするために本明細書において定義されており、本明細書にかかる定義を含めることは、当該技術において一般に理解されているものと大きく異なることを表すと必ずしも解釈されない。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の科学用語または専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものである。一部の場合では、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするためおよび／またはすぐに参照できるようにするために本明細書において定義されており、本明細書にかかる定義を含めることは、当該技術において一般に理解されているものと大きく異なることを表すと必ずしも解釈されない。
【0025】
以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有すると理解される。
【0026】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどへの特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、特記しない限り、特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成もまた包含する。抗原結合部分には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ科抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、イントラボディ（intrabody）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ｖ－ＮＡＲおよびｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ならびにそのポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドが含まれる。抗体には、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体、および任意の特定のクラスである必要がない抗体が含まれる。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
【0027】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。この鎖は、直鎖でも分岐鎖でもよく、改変されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸鎖、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションもまた包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）ならびに当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドもまた、この定義内に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖として、または会合した鎖として存在し得ることが理解される。
【0028】
当該分野で公知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、任意の長さおよびコンフォメーション（例えば、直鎖または環状）のヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖のアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変され得る。他の型の改変には、例えば、「キャップ」、アナログによる、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（phosphoamidate）、カルバメートなど）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなど、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）などを含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属（oxidative metal）など）を含むもの、アルキル化薬を含むもの、改変された連結によるもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびに未改変の形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を準備するために活性化され得、または固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化され得、または１～２０炭素原子のアミンもしくは有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へと誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－または２’－アジド－リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ－またはベータ－アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび無塩基ヌクレオシド（abasic nucleoside）アナログ、例えば、メチルリボシドを含む、当該分野で一般に公知の類似の形態のリボースまたはデオキシリボース糖もまた含み得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的連結基によって置き換えられ得る。これらの代替的連結基には、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート（amidate）」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール（formacetal）」）によって置き換えられた実施形態が含まれるがこれらに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈ、またはエーテル（－Ｏ－）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（araldyl）を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル（１～２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【0029】
本明細書で使用する場合、「組換え」核酸は、天然に存在しないおよび／または合成により製造されたポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。例えば、「組換え」核酸は、ベクター配列にカップリングされたタンパク質コード遺伝子を含み得る。タンパク質コード遺伝子の配列は、天然に存在してもよいが、この遺伝子は、ベクター配列と組み合わせては天然に存在しない。言い換えると、「組換え」核酸分子は、分子の一部として、天然に存在する核酸配列を含み得るが、その配列は、（核酸分子配列の全体が天然に存在しないように）別の配列にカップリングされる、および／またはこの分子は、合成により製造される。「組換え」ポリペプチドは、組換え核酸から産生されたポリペプチドを指す。
【0030】
本明細書で使用する場合、「外因性」核酸は、その導入の前にはその宿主細胞中に存在しなかった、宿主細胞中に（例えば、従来の遺伝子操作法によって、好ましくは、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはトランスフェクションによって）導入されるまたは導入された組換え核酸分子を指す。一部の状況では、外因性核酸は、宿主細胞中で天然に存在しないヌクレオチド配列を含む。かかる配列は「トランスジェニック」とも呼ばれる。一部の状況では、外因性核酸は、細胞にとって内因性である配列と同じヌクレオチド配列を含み得る（すなわち、外因性核酸分子は、宿主細胞にとって内因性である遺伝子のヌクレオチド配列を含み得、その結果、宿主細胞中への外因性核酸分子の導入は、宿主細胞中への遺伝子のさらなるコピーを導入する）。「外因性核酸」は、外因性核酸分子またはそのヌクレオチド配列を指す。
【0031】
本明細書で使用する場合、「目的のヌクレオチド配列」は、宿主細胞中に導入したいまたはベクター中に存在している任意のヌクレオチド配列を指す。目的のヌクレオチド配列は、外因性核酸中に存在し得る。最も一般的には、目的のヌクレオチド配列は、目的のポリペプチドをコードする、または目的のＲＮＡ分子の生成のための鋳型である、ＤＮＡ配列である。しかし、あるいは、目的のヌクレオチド配列は、例えば、調節性もしくは構造的機能を提供する配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列）、またはクローニング目的のための制限酵素配列など、異なる目的を果たす配列（例えば、目的のヌクレオチド配列は、マルチクローニング部位であり得る）であり得る。目的のヌクレオチド配列は、任意のヌクレオチド長のものであり得る。目的のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中に内因性に存在しない配列である。一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中に内因性に別々に存在する（すなわち、この配列はまた、宿主細胞中に導入された目的のヌクレオチド配列を含む組換え核酸構築物とは別に、宿主細胞中に存在する）。かかる実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、例えば、対応する内因性ヌクレオチド配列の比較的低い発現が存在する場合、および細胞におけるヌクレオチド配列の増加した発現を有することが望ましい場合、宿主細胞中に導入され得る。
【0032】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または選択肢の他のグループ分けの観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、その群の各メンバーを個々に、および主群の全ての可能な下位群、群メンバーのうち１つまたは複数が存在しない主群もまた包含する。本発明は、特許請求された発明中の任意の群メンバーのうち１つまたは複数の明示的な排除も想定する。
【0033】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを意味すると理解される。文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」の後に記載される任意の例は、網羅的または限定的ではないことを意味する。用語「または」は、複数の選択肢のリストに関して使用される場合（例えば、「Ａ、ＢまたはＣ」）、文脈が明らかに他を示さない限り、それらの選択肢のうち任意の１つまたは複数を含むと解釈するものとする。実施形態が「含む」という言葉を用いて本明細書に記載される場合には、「～からなる」および／または「～から本質的になる」の用語で記載される他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【0034】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
【0035】
抗体コード遺伝子を含有するベクター
一態様では、抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが本明細書で提供される。抗体ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、本明細書では「抗体コード遺伝子」とも呼ばれる。
一態様では、抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが本明細書で提供される。抗体ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、本明細書では「抗体コード遺伝子」とも呼ばれる。
【0036】
本明細書で使用する場合、「抗体ポリペプチド」は、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体軽鎖融合タンパク質、および抗体重鎖融合タンパク質を指す。「抗体重鎖」および「抗体軽鎖」という用語は、当該分野における標準的な意味を有し、例えば、本明細書の他の箇所で記載されている様々な抗体重鎖および軽鎖（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４ ｍＡｂの重鎖および軽鎖）を含む。「抗体重鎖」および「抗体軽鎖」という用語には、標準的な完全長抗体重鎖および軽鎖の両方、ならびにそれぞれの可変領域（ＶＬまたはＶＨ）を含有するこれらの誘導体が含まれる。「抗体重鎖融合タンパク質」という用語は、１つまたは複数のさらなるタンパク質またはペプチドに共有結合している抗体重鎖を含有するポリペプチドを指す。例えば、「抗体重鎖融合タンパク質」は、サイトカインに共有結合している抗体重鎖であり得る。結合は、直接的なもの、またはペプチドリンカー（例えば、グリシン－セリンリンカー）を介するものであり得る。抗体重鎖融合タンパク質において、抗体重鎖は、重鎖のＮ末端もしくはＣ末端（または両位置）で、さらなるタンパク質に連結していてよい。「抗体軽鎖融合タンパク質」という用語は、抗体軽鎖であることを除いて、「抗体重鎖融合タンパク質」について直前で記載したものと同一の意味を有する。本明細書で使用する場合、「抗体融合タンパク質」は、１つまたは複数のさらなるタンパク質またはポリペプチドに共有結合している（例えば、抗体の重鎖または軽鎖を介して）、本明細書で提供される抗体を指す。したがって、抗体融合タンパク質は、抗体融合タンパク質のポリペプチドの１つとして少なくとも１つの抗体重鎖融合タンパク質または１つの抗体軽鎖融合タンパク質を含有する。最も一般的には、抗体融合タンパク質は、２つの抗体軽鎖、１つの抗体重鎖、および１つの抗体重鎖融合タンパク質を含有する分子であり、そのため、さらなるタンパク質が抗体の重鎖の一方に連結される。
【0037】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、目的の１つまたは複数の遺伝子または配列（例えば、抗体コード遺伝子）を宿主細胞に送達し得、好ましくは宿主細胞において発現させ得る、構築物を意味する。ベクターの例としては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されず、ネイキッド核酸が含まれ得るか、または送達を促進する材料（例えば、カチオン性の縮合剤、リポソームなど）と結び付いた核酸が含まれ得る。ベクターとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ得る。「発現ベクター」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つのポリペプチドコード遺伝子、遺伝子の転写または翻訳に関連する少なくとも１つの調節エレメント（例えば、プロモーター配列、ポリ（Ａ）配列）を含むベクターを指す。典型的には、本明細書で使用されるベクターは、２つ以上の抗体コード遺伝子、ならびに１つまたは複数の調節エレメントおよび／または選択マーカーを含有する。例えば、本明細書で使用するベクターは、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＩｎｎｉｓｓ，Ｍ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日において記載されている構造を有し得る。ベクター成分には、例えば、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳制御エレメント、例えばリボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンも含まれ得る。ベクターは、「核酸構築物」を含有し得る。
【0038】
本明細書で提供される「核酸構築物」は、本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたは核酸のタイプである。「核酸構築物」は、本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたは核酸の特徴のいずれかを有し得る。典型的には、本明細書で提供される「核酸構築物」は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの鎖の中に２つ以上の機能的単位を含有する。ヌクレオチド配列内の機能的単位は、特定の機能を有するあらゆるタイプの個別のヌクレオチド配列、例えば、目的のヌクレオチド配列、ポリペプチドをコードする遺伝子、調節配列、または組換え配列であり得る。ベクターの文脈では、「核酸構築物」は、より大きなベクター配列内の「発現カセット」（本明細書では単純に「カセット」とも呼ばれる）の特徴を有し得る。例えば、核酸構築物は、抗体コード遺伝子および関連する調節エレメントを含み得る。具体的には、核酸構築物は、例えば、少なくともｉ）プロモーター配列、ｉｉ）抗体コード遺伝子、およびｉｉｉ）３’非翻訳領域を含み得る。一部の実施形態では、核酸構築物は、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）において使用される「カセット」の特徴を有し得る（例えば、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれる、Ｉｎｎｉｓｓ，Ｍ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日；Ｚｈａｎｇ Ｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ３１（６）：１６４５～１６５６、２０１５；Ｔｕｒａｎ，Ｓら、Ｇｅｎｅ、５１５（１）：１～２７、２０１３；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、２９（５）：１３０７～１３１５、２０１３；Ｋａｗａｂｅ Ｙら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６４（３）：２６７～２７９、２０１２、ならびに、Ｋｉｍ ＭＳおよびＧｙｕｎ ＭＬ、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８（７）：１３４２～１３５１、２００８を参照されたい）。例えば、「核酸構築物」は、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＩｎｎｉｓｓ，Ｍ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日において記載されているベクター成分の１つまたは複数の特徴を有し得る。例えば、Ｉｎｎｉｓｓの第１８３８頁、右欄に示されているように、「ＲＭＣＥ ｍＡｂ標的ベクター」は、以下のエレメントを順に含有する（ＦＲＴ Ｆ５ Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ部位とＢｘｂ１ ｍｕｔ ａｔｔＢ ＦＲＴ ｗｔ部位との間に）：ａ）選択マーカー（ブラストサイジン遺伝子）、ｂ）ＳＶ４０ポリＡ配列、ｃ）ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーター、ｄ）抗体コード遺伝子（軽鎖）、ｅ）ＳＶ４０ポリＡ配列、ｆ）ｈＣＭＶプロモーター、ｇ）抗体コード遺伝子（重鎖）、ｈ）ＳＶ４０ポリＡ配列。したがって、本明細書で使用する場合、「核酸構築物」は、例えば、これらのエレメントの一部または全てを含有し得る。
【0039】
例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＣＭＶプロモーターが含まれる。
【0040】
例示的な選択マーカーとしては、ブラストサイジン、ピューロマイシン、またはジェネティシン（Ｇ４１８）に対する抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【0041】
典型的には、本明細書で提供されるベクターまたは核酸構築物は、少なくとも２つの抗体コード遺伝子を含有する。２つの抗体コード遺伝子は、同一のまたは異なる遺伝子であり得る。例えば、一部の実施形態では、ベクターまたは核酸構築物は、同一の抗体軽鎖遺伝子の２つのコピーを含有し得る。あるいは、一部の実施形態では、ベクターまたは核酸構築物は、抗体軽鎖遺伝子の１つのコピーおよび抗体重鎖遺伝子の１つのコピー、または第１の抗体の抗体軽鎖遺伝子の１つのコピーおよび第２の抗体の抗体軽鎖遺伝子の１つのコピーを含有し得る。第１の抗体遺伝子および第２の抗体遺伝子を含有するベクターにおいて、上流の（すなわち、５’から３’の方向で最初に転写される）位置は本明細書では「第１の位置」と呼ばれ、下流の位置は本明細書では「第２の位置」と呼ばれる。
【0042】
本明細書で提供される一部の実施形態では、少なくとも２つのベクターが使用される。両ベクターとも、同一の宿主細胞に導入される。したがって、２つのベクターを含有する、関連する組成物、方法、および宿主細胞も本明細書で提供される。
【0043】
本明細書で提供される実施形態において少なくとも２つのベクターが使用される場合、少なくとも２つのベクターは、少なくとも２つの異なる構造を有し得る。例えば、２つの構造を有する一実施形態では、「第１のベクター」構造および「第２のベクター」構造が存在する。少なくとも１つのエレメントまたはエレメントの位置が第１のベクターと第２のベクターとの間で異なっていれば、第１のベクターは、第２のベクターと異なる構造を有していると考えられる。本明細書で使用する場合、異なる構造を有する第１のベクターおよび第２のベクターは、「第１のベクター」および「第２のベクター」と呼ばれ得る。
【0044】
第１のベクターおよび第２のベクターを伴う、本明細書で提供される実施形態において、一部の態様では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を含有し、第２のベクターは、抗体重鎖をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を含有する。一部の実施形態では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子は、同一の抗体軽鎖（例えば、同一の遺伝子の２つのコピー）をコードする。一部の他の実施形態では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子は、異なる抗体軽鎖（例えば、２つの異なる抗体軽鎖遺伝子の各々の１つのコピー）をコードする。一部の実施形態では、抗体重鎖をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子は、同一の抗体重鎖（例えば、同一の遺伝子の２つのコピー）をコードする。一部の他の実施形態では、抗体重鎖をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子は、異なる抗体重鎖（例えば、２つの異なる抗体重鎖遺伝子の各々の１つのコピー）をコードする。
【0045】
一実施例では、標準的なＩｇＧ単一特異的抗体の発現では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子が同一の抗体軽鎖をコードし、抗体重鎖をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子が同一の抗体重鎖をコードする実施形態を使用することが望ましい場合がある。この実施形態は、標準的なＩｇＧ単一特異的抗体がｉ）抗体軽鎖およびｉｉ）抗体重鎖という２つの異なるポリペプチドタイプのみを含有しているため、有用である。したがって、標準的なＩｇＧ発現では、第１のベクター内の第１および第２の位置の両方に、同一の抗体軽鎖をコードする同一の遺伝子を含有すること、ならびに第２のベクター内の第１および第２の位置の両方に、同一の抗体重鎖をコードする同一の遺伝子を含有することが可能である。
【0046】
二重特異的ＩｇＧ抗体を発現させるための別の実施例では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子が異なる抗体軽鎖をコードし、抗体重鎖をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子が異なる抗体重鎖をコードする実施形態を使用することが望ましい場合がある。この実施形態は、典型的な二重特異的ＩｇＧ抗体がｉ）第１の抗原結合部分のための抗体軽鎖、ｉｉ）第１の抗原結合部分のための抗体重鎖、ｉｉｉ）第２の抗原結合部分のための抗体軽鎖、およびｉｖ）第２の抗原結合部分のための抗体重鎖という４つの異なるポリペプチドタイプを含有するため、有用である。したがって、二重特異的ＩｇＧの発現では、第１の抗体軽鎖をコードする遺伝子を含有する第１のベクター内の第１の位置、第２の抗体軽鎖をコードする遺伝子を含有する第１のベクター内の第２の位置、第１の抗体重鎖をコードする遺伝子を含有する第２のベクター内の第１の位置、および第２の抗体重鎖をコードする遺伝子を含有する第２のベクター内の第２の位置を有することが望ましい場合がある。
【0047】
他の関連する実施形態もまた、本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、例えば、共通の軽鎖を有する二重特異的抗体の発現のための、本明細書で提供される実施形態と共に使用され得る（例えば、２０２１年６月２４日に公開されたＷＯ２０２１／１２４０７３を参照されたい）。共通の軽鎖を有する二重特異的抗体は、２つの異なる重鎖を含有し得る。この状況では、場合により、第１のベクター内の第１および第２の位置は、同一の抗体軽鎖をコードする同一の遺伝子を含有し、第２のベクター内の第１の位置は、第１の抗体重鎖をコードする遺伝子を含有し、第２のベクター内の第２の位置は、第２の抗体重鎖をコードする遺伝子を含有する。
【0048】
第１のベクターおよび第２のベクターを伴う、本明細書で提供される実施形態において、一部の他の態様では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子を含有し、第２のベクターは、抗体重鎖融合タンパク質をコードする第１の遺伝子および抗体重鎖をコードする第２の遺伝子を含有する。一部の実施形態では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子は、同一の抗体軽鎖（例えば、同一の遺伝子の２つのコピー）をコードする。一部の他の実施形態では、抗体軽鎖をコードする第１の遺伝子および抗体軽鎖をコードする第２の遺伝子は、異なる抗体軽鎖（例えば、２つの異なる抗体軽鎖遺伝子の各々の１つのコピー）をコードする。
【0049】
第１のベクターにおいて、同一の抗体軽鎖の２つのコピーを有するか、２つの異なる抗体軽鎖の各々の１つのコピーを有するかの選択は、製造される抗体分子の具体的なタイプに応じる。例えば、抗体重鎖を介して別のタンパク質に共有結合している標準的な単一特異的ＩｇＧ ｍＡｂを伴う抗体融合タンパク質では、分子は、典型的には、ｉ）抗体軽鎖、ｉｉ）抗体重鎖、およびｉｉｉ）抗体重鎖融合タンパク質という３つの個別のポリペプチドタイプを含有する。この抗体融合タンパク質分子では、抗体重鎖および抗体重鎖融合タンパク質の各々の１つの鎖、ならびに抗体軽鎖の２つのコピーが存在する。この分子には１つのタイプの抗体軽鎖しか存在しないため、同一の抗体軽鎖遺伝子の２つのコピーが第１のベクターに提供される。別の実施例では、抗体重鎖を介して別のタンパク質に共有結合している二重特異的ＩｇＧ ｍＡｂを伴う抗体融合タンパク質では、分子は、典型的には、ｉ）第１の抗原結合部分のための抗体軽鎖、ｉｉ）第１の抗原結合部分のための抗体重鎖、ｉｉｉ）第２の抗原結合部分のための抗体軽鎖、およびｉｖ）抗体重鎖部分が第２の抗原結合部分のためのものである抗体重鎖融合タンパク質という４つの個別のポリペプチドタイプを含有する。この抗体融合タンパク質分子では、抗体重鎖および抗体重鎖融合タンパク質の各々の１つのコピー、ならびに抗体軽鎖の各々の１つのコピーが存在する。この分子には２つのタイプの抗体軽鎖が存在するため、２つの異なる抗体軽鎖遺伝子が第１のベクターに提供される。
【0050】
２つの異なる抗体重鎖、または１つの抗体重鎖および１つの抗体重鎖融合タンパク質を伴う、本明細書で提供される実施形態では、場合により、重鎖は、重鎖の定常領域に、２つの異なる重鎖の間でのヘテロ二量体の形成を促進するための１つまたは複数のアミノ酸修飾を有していてもよい。このような修飾は、当該分野において公知であり、当該修飾としては、例えば、帯電に基づく静電気的なアミノ酸修飾、および立体に基づく「ノブイントゥーホール」アミノ酸修飾が含まれる。
【0051】
一部の実施形態では、本明細書で提供される核酸構築物は、構築物の一方または両方の末端に組換え配列が隣接している。「組換え配列」または「組換え部位」は、リコンビナーゼと共に、標的化された組換えに必要であり、当該組換えを可能にし、このような組換えの位置を規定する、一続きのヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、「組換え配列」は、典型的には、宿主細胞中に導入される外因性核酸構築物上の組換え配列を指すために使用され、「組換え部位」は、典型的には、宿主細胞染色体中の対応する組換え配列を指すために使用される。組換え部位は、宿主細胞ゲノムにとって非ネイティブであり得る（例えば、組換え標的部位は、ランディングパッド配列の一部として、宿主細胞染色体中に導入され得る）。
【0052】
一部の実施形態では、核酸構築物の一部または全てが、宿主細胞染色体中の対応する部位中に組み込まれ得るように、１つまたは複数の組換え配列が、本明細書で提供される核酸構築物中に含まれ得る。
【0053】
チロシンリコンビナーゼベースの系およびセチンリコンビナーゼベースの系の両方を含む、任意の適切な組換え部位、標的配列およびリコンビナーゼの組合せが、本明細書で提供される組成物および方法と共に使用され得る。本明細書で提供される核酸構築物および宿主細胞共に使用され得るリコンビナーゼ（およびそれらの対応する組換え配列）には、例えば、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ２、Ｂ３、λ、ＨＫ０２２、ＨＰ１、γδ、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、Ｇｉｎ、Ｂｘｂ１、φＣ３１、φＢＴ１およびＲ４が含まれる。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、ＴｕｒａｎおよびＢｏｄｅ、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２５（１２）：４０８８～１０７（２０１１）；Ｎｅｒｎら、ＰＮＡＳ、１０８（３４）：１４１９８～２０３（２０１１）；ならびにＸｕら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３（８７）（２０１３）中に記載されている。
【0054】
上記のように、一部の実施形態では、本明細書で提供される核酸構築物は、ＲＭＣＥで使用される「カセット」であり得るか、または当該カセットの特徴を有し得る。これらの実施形態では、核酸構築物は、構築物の一方または両方の末端に組換え配列が隣接している。核酸構築物に両末端で組換え配列が隣接している実施形態において、一部の実施形態では、いずれかの末端にある組換え配列は同一の配列を有する。他の実施形態では、いずれかの末端にある組換え配列は異なる配列を有する。宿主細胞内におけるランディングパッドへの核酸構築物／カセットの方向性のある挿入を可能にするために、核酸構築物のいずれかの末端で異なる組換え配列を提供することが望ましい場合がある（以下でさらに論じる）。例えば、様々な異なる組換え配列は互いに直交性であり（すなわち、これら配列は相互に組み合わされない）、宿主細胞におけるランディングパッドに方向性のある挿入をされ得る核酸構築物を調製するために使用され得る。例えば、Ｂｘｂ１野生型およびＢｘｂ１－ＧＡ突然変異体の配列は直交性であり（Ｊｕｓｉａｋ，Ｂ，ら、ＡＣ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．、２０１９、８（１）、第１６～２４頁）、Ｂｘｂ１リコンビナーゼを介する方向性のある挿入のために、核酸構築物のいずれかの末端で使用され得る。別の実施例では、野生型ＦＲＴおよびＦＲＴ Ｆ５突然変異体の配列が、Ｆｌｐリコンビナーゼを介する方向性のある挿入のために、核酸構築物のいずれかの末端で使用され得る。
【0055】
一部の実施形態では、本明細書で提供される第１のベクターは、５’末端で第１の組換え配列が隣接しており、３’末端で第２の組換え配列が隣接している、第１の核酸構築物を含有しており、かつ、本明細書で提供される第２のベクターは、５’末端で第１の組換え配列が隣接しており、３’末端で第２の組換え配列が隣接している、第２の核酸構築物を含有している。第１のベクターの第１の組換え配列は、第１のベクターの第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有していてよい。第１のベクターの第１の組換え配列は、第１のベクターの第２の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有していてよい。第２のベクターの第１の組換え配列は、第２のベクターの第２の組換え配列と異なるヌクレオチド配列を有していてよい。第２のベクターの第１の組換え配列は、第２のベクターの第２の組換え配列と同一のヌクレオチド配列を有していてよい。場合により、ｉ）第１のベクターの第１の組換え配列、ｉｉ）第１のベクターの第２の組換え配列、ｉｉｉ）第２のベクターの第１の組換え配列、およびｉｖ）第２のベクターの第２の組換え配列の各々は、異なるヌクレオチド配列を有する。
【0056】
一部の実施形態では、核酸構築物内の抗体コード遺伝子は、核酸構築物内の１つまたは複数の調節性の遺伝子制御エレメントに連結していてよい。ある特定の実施形態では、遺伝子制御エレメントは、目的のヌクレオチド配列の構成的発現を指示する。ある特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列の誘導性発現を提供する遺伝子制御エレメントが使用され得る。誘導性遺伝子制御エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用は、例えば、遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生のモジュレーションを可能にする。真核生物細胞における使用のための潜在的に有用な誘導性遺伝子制御エレメントの非限定的な例には、ホルモン調節型エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７、１９９３を参照されたい）、合成リガンド調節型エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９～１０２４、１９９３を参照されたい）および電離放射線調節型エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０６０７～１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４９～１０１５３、１９９２を参照されたい）が含まれる。当該分野で公知のさらなる細胞特異的または他の調節系は、本明細書で提供される方法および組成物に従って使用され得る。
【0057】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結されていてもよいが、連結されている必要はない。本明細書で提供される任意の核酸構築物またはベクター配列に対して相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で提供されるポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列が存在し得ることが、当業者によって理解される。
【0058】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、化学的合成、組換え法またはＰＣＲを使用して取得され得る。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用できる。
【0059】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに議論されるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドは、適切なベクター中に挿入され得、ベクターは次に、複製および増幅に適切な宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接的取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ－接合またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。いったん導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内で維持され得、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。そうして増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法によって、宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【0060】
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４中に記載されている。
【0061】
ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞中に挿入することによって取得され得る。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、このＲＮＡは、次いで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されるような、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
【0062】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得、または当該分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に従って変動し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、および／またはベクターを含むクローンを選択する際に使用され得るマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、限定なしに、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの供給業者から入手可能である。
【0063】
宿主細胞
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本明細書で提供される組換え核酸を有する、またはかかる核酸のレシピエントであり得る、細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本明細書で提供される組換え核酸を有する、またはかかる核酸のレシピエントであり得る、細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれる。
【0064】
一部の実施形態では、宿主細胞は、そのゲノム中（例えば、染色体中）の位置に安定に組み込まれた組換え核酸を有し得る。一部の実施形態では、宿主細胞中の組換え核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれない－例えば、組換え核酸は、宿主細胞中でプラスミド中に存在し得る。
【0065】
本開示の文脈では、「細胞」は、好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、イヌ細胞（例えば、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞）、霊長類細胞、ヒト細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞）、マウス細胞またはハムスター細胞であり得る。一部の実施形態では、ハムスター細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。任意選択により、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ ＳＶ細胞（Ｐｏｒｔｅｒ，ＡＪら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２６（２０１０）、１４５５～１４６４）、または別のＣＨＯ細胞株であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎臓細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（２９３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＥＲＯ－７６）、ＨｅＬａ細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞またはヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）である。一部の実施形態では、細胞は、非哺乳動物細胞（例えば、昆虫細胞または酵母細胞）である。
【0066】
細胞中へのポリヌクレオチドの導入
本明細書で提供されるポリヌクレオチド（例えば、核酸構築物、ベクターなど）は、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための方法の選択は、宿主細胞の特色に依存する場合が多い。
本明細書で提供されるポリヌクレオチド（例えば、核酸構築物、ベクターなど）は、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための方法の選択は、宿主細胞の特色に依存する場合が多い。
【0067】
哺乳動物宿主細胞中に、目的のタンパク質の発現を達成するのに十分な核酸を導入するのに適切な方法は、当該分野で公知である。例えば、その各々が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０～６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０～４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら ＥＰ １１７，０６０；およびＥＰ １１７，０５８を参照されたい。哺乳動物細胞について、哺乳動物細胞中に遺伝材料を導入する一般的な方法には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４５７、１９７８）のリン酸カルシウム沈殿方法またはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｈａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）が含まれる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的態様は、１９８３年８月１６日に発行した米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌによって記載されている。哺乳動物細胞中に遺伝材料を導入するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７～５３７、１９９０およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８～３５２、１９８８を参照されたい。核酸を導入するのに適切なさらなる方法には、例えば、ＢｉｏＲａｄ（商標）によるＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌ（商標）エレクトロポレーターまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＮｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを使用して採用されるエレクトロポレーションが含まれる。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に適切なベクターの比限定的な代表例には、以下のものが含まれ、その各々の全体は、本明細書で参照によって組み込まれる：ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ、Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６～１１４２、１９８５を参照；ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ－Ａ、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３～５１２、１９８７を参照；バキュロウイルスベクター、例えば、ｐＡＣ ３７３またはｐＡＣ ６１０；ＣＤＭ８、Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０、１９８７を参照；およびｐＭＴ２ＰＣ、Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７～１９５、１９８７を参照。
【0068】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルには、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、および欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載されるような、死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた使用され得る。
【0069】
死滅アデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照されたい）、リガンド連結したＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照されたい）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８を参照されたい）および核荷電中和（nucleic charge neutralization）または細胞膜との融合が含まれるがこれらに限定されない、非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法もまた使用され得る。
【0070】
ネイキッドＤＮＡもまた使用され得る。例示的なネイキッドＤＮＡ導入法は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ ０５２４９６８に記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。ネイキッドＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含む沈殿物を形成することによって、細胞中に導入され得る。あるいは、ネイキッドＤＮＡは、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ－デキストランの混合物を形成し、この混合物を細胞と共にインキュベートすること、または細胞およびＤＮＡを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、（例えば、エレクトロポレーションによって）細胞を高電圧電気パルスに供することによっても、細胞中に導入され得る。ネイキッドＤＮＡは、例えば、マイクロインジェクションによって、細胞中に直接注入することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡは、細胞表面受容体に対するリガンドにカップリングされたポリリジンなどのカチオンにＤＮＡを複合体化させることによって、細胞中に導入することもできる（例えば、その各々の全体が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１、１９８８；Ｗｉｌｓｏｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３～９６７、１９９２；ならびに米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。受容体へのＤＮＡ－リガンド複合体の結合は、受容体媒介性のエンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みを促進する。
【0071】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中に安定に導入される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中に一過的に導入される。
【0072】
宿主細胞染色体中への核酸の組み込み
ポリヌクレオチドが宿主細胞中に安定に導入される本明細書で提供される実施形態（例えば、ポリヌクレオチドが宿主細胞染色体中に組み込まれる状況）では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中にランダムに組み込まれ得、またはポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中の特定の位置において組み込まれ得る。これらのアプローチは、本明細書で、それぞれ、「ランダム組み込み」または「部位特異的組み込み（「ＳＳＩ」）」と呼ばれ得る。
ポリヌクレオチドが宿主細胞中に安定に導入される本明細書で提供される実施形態（例えば、ポリヌクレオチドが宿主細胞染色体中に組み込まれる状況）では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中にランダムに組み込まれ得、またはポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中の特定の位置において組み込まれ得る。これらのアプローチは、本明細書で、それぞれ、「ランダム組み込み」または「部位特異的組み込み（「ＳＳＩ」）」と呼ばれ得る。
【0073】
ランダム組み込みについて、典型的には、組換え核酸構築物が各々、少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、および少なくとも１つの選択マーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）を含む、１つまたは複数の組換え核酸構築物が調製される。
【0074】
抗体コード遺伝子の１つまたは複数を含有するポリヌクレオチドを調製した後、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞が、例えば、構築物中の抗生物質耐性遺伝子がそれに対して耐性を付与する抗生物質に対する耐性によって、選択され得る。一般に、目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドが細胞集団中に導入され、細胞が、関連する選択マーカーシステム（例えば抗生物質耐性）を介して選択された後に、１つまたは複数の抗体コード遺伝子を含むポリヌクレオチドの異なる数のコピーを含む、ならびに細胞の染色体中にポリヌクレオチドの異なる位置の組み込みを含む、細胞の不均一な集団（本明細書で細胞の「プール」とも呼ばれる）が存在し得る。任意選択により、この細胞プール由来の個々の細胞は、選別および単離され得、異なる細胞の個々の均一な細胞株集団が樹立され得る（本明細書で細胞株「クローン」とも呼ばれる）。あるいは、一部の実施形態では、本明細書で提供される第１および第２の核酸構築物を含有する細胞の異種プールが維持され得る。いずれかの型の上記細胞集団（例えば、均一または不均一な集団）が、本明細書に記載される種々の方法（例えば、タンパク質産生）のために使用され得る。
【0075】
一部の実施形態では、ランダム組み込みのための核酸構築物は、直鎖ポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、直鎖構造は、（例えば、ＰＣＲまたは化学的ポリヌクレオチド合成による）直鎖分子の合成によって生成され得る。一部の実施形態では、直鎖構造は、直鎖核酸分子を生成するための（例えば、制限酵素による）環状ベクターの切断によって生成され得る。
【0076】
一部の実施形態では、細胞の染色体中に組み込まれた本明細書で提供される１つまたは複数の核酸構築物を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、細胞の染色体に組み込まれた本明細書で提供される第１の組換え核酸構築物および第２の組換え核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書で提供される。
【0077】
部位特異的組み込みについて、一部の実施形態では、１つまたは複数の規定された染色体遺伝子座において１つまたは複数の「ランディングパッド」を含む宿主細胞が使用される。ランディングパッドは、染色体中に安定に組み込まれている、１つまたは複数の組換え部位を含む外因性ヌクレオチド配列を含む。ランディングパッド中の組換え部位に対応する１つまたは複数の組換え配列を含む外因性核酸構築物が宿主細胞中に導入される場合、外因性核酸構築物中の発現カセットは、（例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介して）ランディングパッド配列中に組み込まれ得るまたはランディングパッド配列を置き換え得る。一部の実施形態では、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＺｈａｎｇ Ｌ，ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５、３１：１６４５～１６５６）または国際公開第ＷＯ２０１３／１９００３２において例えば記載されているＳＳＩ系を、本明細書で提供される実施形態と共に使用してもよい。
【0078】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法と共に使用するための宿主細胞は、少なくとも２つの個別のランディングパッドを含有する。場合により、本明細書で提供される第１のベクターまたは第１の核酸構築物は、細胞における第１のランディングパッド内の組換え部位に対応する組換え配列を含有し得、かつ、本明細書で提供される第２のベクターまたは第２の核酸構築物は、第２のランディングパッド内の組換え部位に対応する組換え配列を含有し得る。一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞内の複数のランディングパッド部位を、２０２０年１月２日に公開されたＵＳ２０２０／０００２７２７において記載されているように使用することができる。一部の実施形態では、ランディングパッドは、２０１３年１２月２７日に公開されたＷＯ２０１３／１９００３２において記載されているようにＣＨＯ Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子内に位置していてもよい。一部の実施形態では、ランディングパッドは、２０２０年１月２日に公開されたＵＳ２０２０／０００２７２７において記載されているようにＮＬ１遺伝子座に位置していてもよい。
【0079】
一部の実施形態では、宿主細胞株中のランディングパッドは、宿主細胞のゲノム中の「ホットスポット」に位置し得る。本明細書で使用する場合、用語「ホットスポット」は、その部位において組み込まれた遺伝子（単数または複数）の安定な高い発現を提供する、宿主細胞のゲノム中の部位を意味する。
【0080】
ＳＳＩのためのランディングパッドを含む細胞は、本明細書で「ＳＳＩ宿主細胞」とも呼ばれ得る。本明細書で使用する場合、「ＳＳＩ宿主細胞」は、少なくとも１つの組換え部位（例えば、ランディングパッド）を含む外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を指す。宿主細胞中の組換え部位は、宿主細胞のゲノム中への外因性ヌクレオチド配列の部位特異的組み込みを可能にし、したがって、宿主細胞のゲノム中の所望の場所における所望のヌクレオチド配列の所定の局在化され指示された組み込みを可能にする。したがって、一部の実施形態では、部位特異的組み込み宿主細胞は、宿主細胞の染色体中への本明細書に記載される組換え核酸構築物（またはその中の発現カセット）の標的化された組み込みが可能である。一部の実施形態では、部位特異的組み込み宿主細胞は、組換え媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による発現カセットの標的化された組み込みが可能である。
【0081】
上記のような、宿主細胞ゲノム中への外因性核酸構築物の組換えが関与する本明細書で提供される組成物および方法について、リコンビナーゼもまた宿主細胞中に存在し、または宿主細胞中に導入される。外因性核酸構築物を導入することが関与する本明細書で提供される方法は、宿主細胞中に、リコンビナーゼをコードする遺伝子を導入することを含み得る。
【0082】
一部の実施形態では、細胞の染色体中の特定の位置中に組み込まれた外因性組換え核酸構築物を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。核酸構築物は、本明細書で提供される核酸構築物の特性のいずれかを有し得る。
【0083】
組換え抗体
別の態様では、本明細書で提供される組成物および方法を介して産生される組換え抗体（本明細書では「組換えタンパク質」および「組換えポリペプチド」とも呼ばれる）が本明細書で提供される。例えば、本明細書で提供される組換え核酸構築物の一成分である抗体コード遺伝子によってコードされる抗体が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書で提供される組成物および方法を介して産生される組換え抗体（本明細書では「組換えタンパク質」および「組換えポリペプチド」とも呼ばれる）が本明細書で提供される。例えば、本明細書で提供される組換え核酸構築物の一成分である抗体コード遺伝子によってコードされる抗体が本明細書で提供される。
【0084】
宿主細胞において発現可能な任意の抗体は、本発明の教示に従って産生され得、本発明の方法に従って、または本発明の細胞によって産生され得る。
【0085】
発現された抗体の単離
一般に、本発明に従って発現された抗体を単離および／または精製することが、典型的には望ましい。ある特定の実施形態では、発現された抗体は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固形物は、例えば、精製プロセス中の第１のステップとして、遠心分離または濾過などによって除去され得る。あるいは、発現された抗体は、細胞中に残存し得、または宿主細胞の表面に結合され得る。かかる状況では、培地は除去され得、タンパク質を発現する宿主細胞は、精製プロセス中の第１のステップとして溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段によって達成され得る。
一般に、本発明に従って発現された抗体を単離および／または精製することが、典型的には望ましい。ある特定の実施形態では、発現された抗体は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固形物は、例えば、精製プロセス中の第１のステップとして、遠心分離または濾過などによって除去され得る。あるいは、発現された抗体は、細胞中に残存し得、または宿主細胞の表面に結合され得る。かかる状況では、培地は除去され得、タンパク質を発現する宿主細胞は、精製プロセス中の第１のステップとして溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段によって達成され得る。
【0086】
発現された抗体は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離もしくは示差的溶解度、エタノール沈殿が含まれるがこれらに限定されない標準的な方法によって、および／またはタンパク質の精製のための任意の他の利用可能な技術によって、単離および精製され得る（例えば、その各々が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。特に免疫親和性クロマトグラフィーについて、タンパク質は、そのタンパク質に対して惹起され静置支持体に固定された抗体を含むアフィニティカラムにそのタンパク質を結合させることによって単離され得る。あるいは、親和性タグ、例えば、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジンまたはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが、適切なアフィニティカラムを通過させることによる容易な精製を可能にするために、標準的な組換え技術によってタンパク質に結合され得る。プロテアーゼ阻害剤、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンが、精製プロセスの間のタンパク質の分解を低減または排除するために、任意のまたは全ての段階で添加され得る。プロテアーゼ阻害剤は、発現された抗体を単離および精製するために細胞が溶解される必要がある場合、特に有利である。
【0087】
細胞培養および細胞培養培地
用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」などは、本明細書で使用する場合、成長中の哺乳動物細胞に栄養分を与える構成成分または栄養素を含む溶液を指す。典型的には、栄養素には、最低限の成長および／または生存のために細胞が必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素が含まれる。かかる溶液は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物、アミノ酸、脂質ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源が含まれるがこれらに限定されない、最小速度を上回って成長および／または生存を増強するさらなる栄養素または補足的構成成分もまた含み得る。一部の実施形態では、培地は、有利には、細胞の生存および増殖にとって最適なｐＨおよび塩濃度になるように製剤化される。一部の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される供給培地である。
用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」などは、本明細書で使用する場合、成長中の哺乳動物細胞に栄養分を与える構成成分または栄養素を含む溶液を指す。典型的には、栄養素には、最低限の成長および／または生存のために細胞が必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素が含まれる。かかる溶液は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物、アミノ酸、脂質ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源が含まれるがこれらに限定されない、最小速度を上回って成長および／または生存を増強するさらなる栄養素または補足的構成成分もまた含み得る。一部の実施形態では、培地は、有利には、細胞の生存および増殖にとって最適なｐＨおよび塩濃度になるように製剤化される。一部の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される供給培地である。
【0088】
広範な種々の哺乳動物成長培地が、本発明に従って使用され得る。一部の実施形態では、細胞は、種々の化学的に規定された培地のうち１つにおいて成長され得、この培地の構成成分は、公知であり、管理されている。一部の実施形態では、細胞は、培地の構成成分が必ずしも全て公知ではないかおよび／または管理されていない複合的な培地中で成長させることもできる。
【0089】
哺乳動物細胞培養のための化学的に規定された成長培地は、過去数十年間にわたって幅広く開発され、公開されている。規定された培地の全ての構成成分は、十分に特徴付けられており、したがって、規定された培地は、血清または加水分解産物などの複雑な添加物を含まない。初期の培地製剤は、タンパク質産生についてほとんどまたは全く気にせずに、細胞の成長および生存度の維持を可能にするために開発されたものである。より最近では、培地製剤は、高度に生産的な組換えタンパク質産生細胞培養物を支持するという明確な目的をもって開発されている。かかる培地は、本発明の方法における使用に好ましい。かかる培地は、一般に、高密度での細胞の成長および／または維持を支持するために、高い量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要に応じて、これらの培地は、本発明の方法における使用のために、当業者によって改変され得る。例えば、当業者は、本明細書で開示される方法における基本培地または供給培地としての使用のために、これらの培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／またはメチオニンの量を減少させ得る。
【0090】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物には、細胞培養物および細胞培養培地が関与する。用語「培養物」および「細胞培養物」は、本明細書で使用する場合、細胞集団の生存および／または成長に適切な条件下で培地中にある細胞集団を指す。当業者に明らかなように、一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で使用する場合、細胞集団および集団がその中に存在する培地を含む組合せを指す。一部の実施形態では、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞培養物は、懸濁物中の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞培養物は、基材上で成長した細胞を含む。
【0091】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組換え核酸構築物を含有する、本明細書で提供される宿主細胞を、本明細書で提供される第１の核酸構築物および第２の核酸構築物によってコードされる抗体を産生するために使用してもよい。同様に、本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法および組成物は、本明細書で提供される第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含有する宿主細胞を得るために使用され得、このような核酸構築物によってコードされるポリペプチドが産生および精製され得る。加えて、このような宿主細胞が生成および培養され得る。
【0092】
本発明は、所望のプロセス（例えば、本明細書で提供される方法に従う組換え核酸構築物の導入、および組換えタンパク質（例えば、抗体）の産生）に適した任意の細胞培養法と共に使用され得る。非限定的な例として、細胞は、バッチまたは流加培養で成長され得、この場合、培養は、組換えタンパク質（例えば、抗体）の十分な発現後に終結され、その後、発現されたタンパク質（例えば、抗体）が収集される。あるいは、別の非限定的な例として、細胞は、バッチ再供給（batch-refeed）で成長され得、この場合、培養は終結されず、新たな栄養素および他の構成成分が、培養物に周期的または継続的に添加され、その間、発現された組換えタンパク質（例えば、抗体）は、周期的または継続的に収集される。他の適切な方法（例えば、スピンチューブ）培養）が、当該分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。
【0093】
一部の実施形態では、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、本明細書で提供される方法に従って宿主細胞から産生された抗体、および１種または複数の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤を含む組成物が、本明細書で提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、その投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。
【0094】
方法
一部の態様では、本明細書で提供される宿主細胞を選択する方法、本明細書で提供される宿主細胞を調製する方法、および本明細書で提供される組換え抗体を産生するための方法が、本明細書で提供される。
一部の態様では、本明細書で提供される宿主細胞を選択する方法、本明細書で提供される宿主細胞を調製する方法、および本明細書で提供される組換え抗体を産生するための方法が、本明細書で提供される。
【0095】
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸構築物またはこのような核酸構築物を含有するベクターは、組換え核酸の調製のための当該分野において公知の標準的な技術によって調製され得る。
【0096】
本明細書で提供される核酸構築物を含有する宿主細胞は、本明細書の他の箇所で記載されているように、当該分野において公知の方法で関連する核酸構築物を宿主細胞に導入することによって調製され得る。
【0097】
一部の実施形態では、抗体を産生するための方法が本明細書で提供される。このような方法に従って、本明細書で提供される細胞（本明細書で提供される方法に従って選択されたまたは本明細書で提供される方法に従って調製された細胞を含む）は、例えば、宿主細胞における、第１の核酸構築物および第２の核酸構築物によってコードされる抗体または抗体融合タンパク質の発現に使用され得る。
【0098】
当業者は、正確な精製技術が、精製される抗体の特徴、タンパク質が発現される細胞の特徴、および／または細胞が成長した培地の組成に依存して変動することを理解する。
【0099】
米国仮特許出願第６３／２２８，３１５号（２０２１年８月２日出願）の内容は、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれる。
【0100】
以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することは決して意図しない。実際、本明細書に示され記載されるものに加えた、本発明の種々の改変は、上述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。
【実施例】
【0101】
（実施例１）
デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系での、ベクター内のｍＡｂコード遺伝子の順序および位置の影響の評価
目的：
この実施例では、デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系における、転写およびｍＡｂ力価に対する、発現ベクター内での抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の位置の影響を評価した。
デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系での、ベクター内のｍＡｂコード遺伝子の順序および位置の影響の評価
目的：
この実施例では、デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系における、転写およびｍＡｂ力価に対する、発現ベクター内での抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の位置の影響を評価した。
【0102】
材料および方法：
順序および位置の影響を評価するためのｍＡｂ遺伝子の修飾
ｍＡｂ遺伝子の転写に対する、発現ベクター内の抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の位置の順序および位置の影響を評価するために、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ１」）の重鎖および軽鎖のオープンリーディングフレームに、それぞれの配列の５’末端の付近の１つのアルギニンに対するサイレント突然変異を導入した。これらの突然変異、すなわちヌクレオチド多型（ＮＰ）を、各発現ベクター位置から生じる転写産物のレベルを追跡するためのバイオマーカーとして使用した。ＮＰとして使用でき、ＣＨＯゲノムにおいてほぼ等しい頻度で出現する、６つの異なるコドンが存在していたため、アルギニンを選択した。４つの異なる発現ベクター位置を評価するために、各重鎖遺伝子（ＨＣ）および軽鎖遺伝子（ＬＣ）について４つの異なるＮＰを導入した。異なるＮＰを以下の表１に示す。
順序および位置の影響を評価するためのｍＡｂ遺伝子の修飾
ｍＡｂ遺伝子の転写に対する、発現ベクター内の抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の位置の順序および位置の影響を評価するために、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ１」）の重鎖および軽鎖のオープンリーディングフレームに、それぞれの配列の５’末端の付近の１つのアルギニンに対するサイレント突然変異を導入した。これらの突然変異、すなわちヌクレオチド多型（ＮＰ）を、各発現ベクター位置から生じる転写産物のレベルを追跡するためのバイオマーカーとして使用した。ＮＰとして使用でき、ＣＨＯゲノムにおいてほぼ等しい頻度で出現する、６つの異なるコドンが存在していたため、アルギニンを選択した。４つの異なる発現ベクター位置を評価するために、各重鎖遺伝子（ＨＣ）および軽鎖遺伝子（ＬＣ）について４つの異なるＮＰを導入した。異なるＮＰを以下の表１に示す。
【0103】
【表1】
【0104】
ロックド核酸技術を利用するプローブでのｄｄＰＣＲを使用して、重鎖および軽鎖の総転写産物レベルに対するヌクレオチド多型を定量し、これは、分子の３’末端の付近の個別のプライマー／プローブセットによって測定された（図１）。重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子、および他の遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ）はまた、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）とも呼ばれる。
【0105】
発現ベクター
２つの異なる発現ベクターを、デュアルランディングパッド宿主細胞系と共に使用するために設計し、ここで、各ベクターは、宿主細胞内の２つの独立したランディングパッド（「ランディングパッドＡ」および「ランディングパッドＢ」）の一方に標的化されており、リコンビナーゼ介在性の挿入を介して宿主細胞染色体に組み込まれる。ランディングパッドおよびベクターは、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＩｎｎｉｓｓ，Ｍ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日において記載されているものと類似の構造を有している。各ランディングパッドの占有を確実にするために、一方の発現ベクターはブラストサイジン耐性を付与し［ブラストサイジン耐性遺伝子、Ｋｉｍｕｒａ Ｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２１９（３）：６５３～６５９、１９９４を参照されたい］、他方は、他の理由でグルタミンシンテターゼがノックアウトされている宿主におけるグルタミン合成を可能にする（グルタミンシンテターゼ遺伝子、Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５、ｅ３７～４２、２００８を参照されたい）。各発現ベクターは、オープンリーディングフレームの挿入のための２つの多重クローニング部位を有する。各オープンリーディングフレームは、挿入部位の３’側にｈＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ尾部が隣接している。これらのベクターは、全部で少なくとも４つの導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに挿入されることを可能にし（ベクター当たり２つの導入遺伝子）、その各々には同一の調節配列が隣接している。
２つの異なる発現ベクターを、デュアルランディングパッド宿主細胞系と共に使用するために設計し、ここで、各ベクターは、宿主細胞内の２つの独立したランディングパッド（「ランディングパッドＡ」および「ランディングパッドＢ」）の一方に標的化されており、リコンビナーゼ介在性の挿入を介して宿主細胞染色体に組み込まれる。ランディングパッドおよびベクターは、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＩｎｎｉｓｓ，Ｍ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日において記載されているものと類似の構造を有している。各ランディングパッドの占有を確実にするために、一方の発現ベクターはブラストサイジン耐性を付与し［ブラストサイジン耐性遺伝子、Ｋｉｍｕｒａ Ｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２１９（３）：６５３～６５９、１９９４を参照されたい］、他方は、他の理由でグルタミンシンテターゼがノックアウトされている宿主におけるグルタミン合成を可能にする（グルタミンシンテターゼ遺伝子、Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５、ｅ３７～４２、２００８を参照されたい）。各発現ベクターは、オープンリーディングフレームの挿入のための２つの多重クローニング部位を有する。各オープンリーディングフレームは、挿入部位の３’側にｈＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ尾部が隣接している。これらのベクターは、全部で少なくとも４つの導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに挿入されることを可能にし（ベクター当たり２つの導入遺伝子）、その各々には同一の調節配列が隣接している。
【0106】
発現ベクターを、重鎖および軽鎖の様々な位置および順序を評価するために生成した。図２に示す構造を有する、発現ベクター構造の６つの異なる組合せを準備した（図２の略図は、プロモーターおよびポリＡ尾部などの、ベクター内の全ての特徴を含んでいない）。図２における異なるベクター内の抗体遺伝子の構造を、表２にまとめる。
【0107】
【表2】
【0108】
発現ベクターを、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用するＰＣＲで目的の遺伝子を増幅することによって構築した。増幅の際、オリゴタグを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、制限消化された発現ベクターの所望の位置の目的の標的遺伝子に付加した。ヌクレオチド多型を、オーバーラップ伸長増幅を介するサイレント突然変異を組み込むためのオリゴを使用して、オープンリーディングフレームの５’末端に導入した。
【0109】
宿主細胞
宿主細胞は、転写活性が高いことが示されているゲノムの区域に２つの独立したランディングパッド（「ランディングパッドＡ」および「ランディングパッドＢ」）を有するように遺伝子操作された、自社のＰｆｉｚｅｒ宿主ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯＫ１誘導体）であった。
宿主細胞は、転写活性が高いことが示されているゲノムの区域に２つの独立したランディングパッド（「ランディングパッドＡ」および「ランディングパッドＢ」）を有するように遺伝子操作された、自社のＰｆｉｚｅｒ宿主ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯＫ１誘導体）であった。
【0110】
トランスフェクションおよび通常の細胞培養
Ｎｅｏｎエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して約１Ｅ７個の細胞を１０ｕｇのベクターと組み合わせることによって（各発現ベクター：リコンビナーゼをコードするベクターの比が３：１）、各発現ベクター構造について３重のトランスフェクションを行った。細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）＋８ｍＭのグルタミンを含有するＴ－７５フラスコに２日間回収した。ＣＤ－ＣＨＯ培地＋５ｕｇ／ｍｌのブラストサイジン中に細胞を再懸濁することによって、選択を行った。回収の際、細胞を１２５ｍＬの振とうフラスコにスケールアップし、３日間／４日間のスケジュールでＣＤ－ＣＨＯ培地中で２～３回継代し、次いで、さらなる継代および試料の採取のために、適当な自社の培地に移した。
Ｎｅｏｎエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して約１Ｅ７個の細胞を１０ｕｇのベクターと組み合わせることによって（各発現ベクター：リコンビナーゼをコードするベクターの比が３：１）、各発現ベクター構造について３重のトランスフェクションを行った。細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）＋８ｍＭのグルタミンを含有するＴ－７５フラスコに２日間回収した。ＣＤ－ＣＨＯ培地＋５ｕｇ／ｍｌのブラストサイジン中に細胞を再懸濁することによって、選択を行った。回収の際、細胞を１２５ｍＬの振とうフラスコにスケールアップし、３日間／４日間のスケジュールでＣＤ－ＣＨＯ培地中で２～３回継代し、次いで、さらなる継代および試料の採取のために、適当な自社の培地に移した。
【0111】
試料の調製
細胞を、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡの調製のために、３日目の継代培養物から採取した。ゲノム試料を、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して準備し、ナノドロップを使用して定量した。１ｕｇの全ゲノムＤＮＡを、ＭｓｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、断片ゲノムＤＮＡに消化した。ＲＮＡ試料を、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、ナノドロップを使用して定量した。２ｕｇの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに変換した。
細胞を、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡの調製のために、３日目の継代培養物から採取した。ゲノム試料を、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して準備し、ナノドロップを使用して定量した。１ｕｇの全ゲノムＤＮＡを、ＭｓｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、断片ゲノムＤＮＡに消化した。ＲＮＡ試料を、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、ナノドロップを使用して定量した。２ｕｇの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに変換した。
【0112】
ヌクレオチド多型の定量
ゲノム鋳型およびｃＤＮＡ鋳型を、ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲシステム（ｄｄＰＣＲ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量した。ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ＬＮＡ ｑＰＣＲプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各ヌクレオチド多型（ＮＰ）を定量し、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全重鎖、全軽鎖および、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を検出した。ＰＣＲを、標準的な条件を使用して３重で行った。ゲノムＤＮＡを、全重鎖および軽鎖に対する各ＮＰの比率として測定した。ｃＤＮＡを、ＧＡＰＤＨハウスキーピング（内因性ＣＨＯ）遺伝子に対する全重鎖または軽鎖の比率として測定し、次いで、全重鎖または軽鎖に対するＮＰの比率に基づく各々の個々のＮＰのデシマルパーセンテージをかけた。
ゲノム鋳型およびｃＤＮＡ鋳型を、ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲシステム（ｄｄＰＣＲ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量した。ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ＬＮＡ ｑＰＣＲプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各ヌクレオチド多型（ＮＰ）を定量し、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全重鎖、全軽鎖および、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を検出した。ＰＣＲを、標準的な条件を使用して３重で行った。ゲノムＤＮＡを、全重鎖および軽鎖に対する各ＮＰの比率として測定した。ｃＤＮＡを、ＧＡＰＤＨハウスキーピング（内因性ＣＨＯ）遺伝子に対する全重鎖または軽鎖の比率として測定し、次いで、全重鎖または軽鎖に対するＮＰの比率に基づく各々の個々のＮＰのデシマルパーセンテージをかけた。
【0113】
流加培養
プールを、ａｍｂｒ（登録商標）１５機器を使用して、１２日間の流加培養プロセスにかけた。各プールを、自社の産生培地および供給培地を使用して、２本の容器に約１．５ｅ６個細胞／ｍＬの流量で播種した。プールを、Ｐｆｉｚｅｒのプラットフォーム流加プロセスを使用して、ａｍｂｒ（登録商標）機器で評価した（Ｌｉｅｓｋｅ，Ｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ、第１５巻（４）、１９００３０６、２０２０年４月を参照されたい）。さらに、細胞懸濁液を回収して、７日目、１０日目、および１２日目にＨＰＬＣを使用して力価の評価を行った。多重特異的発現プールでは各容器を回収し、選択されたプールでは、ランの終了時に、馴化培地を産物品質分析にかけた。
プールを、ａｍｂｒ（登録商標）１５機器を使用して、１２日間の流加培養プロセスにかけた。各プールを、自社の産生培地および供給培地を使用して、２本の容器に約１．５ｅ６個細胞／ｍＬの流量で播種した。プールを、Ｐｆｉｚｅｒのプラットフォーム流加プロセスを使用して、ａｍｂｒ（登録商標）機器で評価した（Ｌｉｅｓｋｅ，Ｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ、第１５巻（４）、１９００３０６、２０２０年４月を参照されたい）。さらに、細胞懸濁液を回収して、７日目、１０日目、および１２日目にＨＰＬＣを使用して力価の評価を行った。多重特異的発現プールでは各容器を回収し、選択されたプールでは、ランの終了時に、馴化培地を産物品質分析にかけた。
【0114】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
およそ５０ｍｇの各タンパク質試料を、３０℃で維持したＹＭＣ－Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ－２００サイズ排除カラム（３００×８ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓカタログ番号ＤＬ２０Ｓ０５３００８ＷＴ）に注入した。高分子量種（ＨＭＭＳ）、モノマー、およびＬＭＭＳを、２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび４００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．２の移動相を用いるイソクラティック溶出を使用して分離した。
およそ５０ｍｇの各タンパク質試料を、３０℃で維持したＹＭＣ－Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ－２００サイズ排除カラム（３００×８ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓカタログ番号ＤＬ２０Ｓ０５３００８ＷＴ）に注入した。高分子量種（ＨＭＭＳ）、モノマー、およびＬＭＭＳを、２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび４００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．２の移動相を用いるイソクラティック溶出を使用して分離した。
【0115】
キャピラリーゲル電気泳動（ｃＧＥ）
およそ５ｍｇの各タンパク質試料を、還元（ＤＴＴ）および非還元（ヨードアセトアミド）条件下で、７０℃で１０分間インキュベートし、Ｃｈｅｎ，Ｘら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２９巻（２４）４９９３～５００２、２００８年７月に従って、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓチップを使用して分析した。
およそ５ｍｇの各タンパク質試料を、還元（ＤＴＴ）および非還元（ヨードアセトアミド）条件下で、７０℃で１０分間インキュベートし、Ｃｈｅｎ，Ｘら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２９巻（２４）４９９３～５００２、２００８年７月に従って、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓチップを使用して分析した。
【0116】
結果：
ｄｄＰＣＲアッセイの精度を評価するために、ゲノムＤＮＡを、構造Ｃ２およびＣ３の細胞プールから採取した。８つのＮＰ（４つの重鎖ＮＰおよび４つの軽鎖ＮＰ）の全てが、これら２つのプールセットで存在している。各プールは２つの重鎖遺伝子および２つの軽鎖遺伝子を有しているため、各ＮＰは、各プール内の各遺伝子に対して、全シグナルの５０％を占めると予想される（例えば、Ｃ２プールでは、ＮＰ１はＬＣ遺伝子シグナルの５０％を占めると予想され、ＮＰ２はＬＣ遺伝子シグナルの５０％を占めると予想された）。各ＮＰは、予想した通り、各プール内の各遺伝子に対して、全シグナルのおよそ５０％を占めることが分かり、ｄｄＰＣＲアッセイの精度が確認された。
ｄｄＰＣＲアッセイの精度を評価するために、ゲノムＤＮＡを、構造Ｃ２およびＣ３の細胞プールから採取した。８つのＮＰ（４つの重鎖ＮＰおよび４つの軽鎖ＮＰ）の全てが、これら２つのプールセットで存在している。各プールは２つの重鎖遺伝子および２つの軽鎖遺伝子を有しているため、各ＮＰは、各プール内の各遺伝子に対して、全シグナルの５０％を占めると予想される（例えば、Ｃ２プールでは、ＮＰ１はＬＣ遺伝子シグナルの５０％を占めると予想され、ＮＰ２はＬＣ遺伝子シグナルの５０％を占めると予想された）。各ＮＰは、予想した通り、各プール内の各遺伝子に対して、全シグナルのおよそ５０％を占めることが分かり、ｄｄＰＣＲアッセイの精度が確認された。
【0117】
次に、各構造での各発現ベクター位置の転写産物レベルを評価するために、ＲＮＡを細胞から回収し、ｃＤＮＡに変換した。ＮＰ、全重鎖または軽鎖、およびＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子レベルを、各試料について測定した。全重鎖または軽鎖をＧＡＰＤＨに対して正規化し、次いで、全重鎖または軽鎖に対するＮＰの比率に基づく各ＮＰのデシマルパーセンテージをかけた。図３Ａ～図３Ｆは、試験した全ての構造の各発現ベクター位置から得られた転写産物レベルを示している。トランスフェクション構造１（Ｃ１）は、全ての発現ベクター位置で軽鎖が占有しており、全ての発現ベクター位置にわたって相対的強度を評価するために同一のＧＯＩを使用する直接的な比較が可能となっている。軽鎖をあまり伴わない重鎖の発現は細胞毒性を生じさせ得るため、重鎖の代わりに軽鎖をこの評価に使用した。各ランディングパッド内の各発現ベクターの第１の位置が第２の位置よりも強力であることが観察された。ランディングパッドＡに占有する発現ベクターの第１の位置がランディングパッドＢに占有する発現ベクターの第１の位置よりも強力であることも分かった。これらの結果は、転写産物レベルの差が発現ベクター内の導入遺伝子の位置および各ランディングパッド間での転写の差に基づいて生じることを示している。
【0118】
条件Ｃ２およびＣ３は、ランディングパッドＢまたはランディングパッドＡのいずれかにそれぞれ重鎖を導入している。Ｃ１と比較して、全ての発現ベクター位置で、産生された重鎖転写産物は軽鎖転写産物よりも少ない。結果はまた、両ランディングパッドで第１の位置の重鎖転写産物が第２の位置の重鎖転写産物よりも多く産生されることも示しており、このことは、Ｃ１から得られた軽鎖の結果と一致している。さらに、Ｃ２およびＣ３の軽鎖転写産物レベルは、Ｃ１の軽鎖転写産物レベルと同等であり、このことは、ランディングパッドが互いに独立しており、その結果、一方のランディングパッドにおける遺伝子インサートの占有の変化が他方のランディングパッドに影響しないことを示唆している。これらの結果は、重鎖および軽鎖の転写に差があること、ならびに、重鎖の転写の結果生じる転写産物レベルが軽鎖と比較して低いことを示している。しかし、各ランディングパッドで第１の位置が第２の位置よりも多くの転写産物を生じさせるという発見は、軽鎖および重鎖の両方で維持されている。
【0119】
トランスフェクションＣ４およびＣ５は、各ランディングパッドでの、軽鎖の後ろに重鎖がある場合、および重鎖の後ろに軽鎖がある場合の、発現ベクターの位置の影響の効果を評価している。両イテレーションにおいて、結果は、各ランディングパッドで、重鎖が位置１に占有している場合であっても、位置１からの転写産物レベルが位置２と比較して多いことを示している。Ｃ４およびＣ５とＣ１とで、第２の位置の軽鎖レベルを比較すると、第１の位置に重鎖が占有している場合、軽鎖の場合と比較して、観察される軽鎖転写産物が少ない。逆に、Ｃ４およびＣ５とＣ２およびＣ３とで、第２の位置の重鎖レベルを比較すると、第１の位置に軽鎖が占有している場合、重鎖の場合よりもより多くの重鎖が観察される。これらの結果は、第２の位置の転写産物レベルが発現ベクターの第１の位置の占有に依存していることを強力に示唆している。しかし、全ての条件で第１の位置の重鎖および軽鎖を比較すると、重鎖および軽鎖の転写産物レベルは、第２の位置の占有に関係なく一定のままである。これらの結果は、第１の位置の転写産物レベルが第２の位置の占有に依存していないことを示唆している。
【0120】
構造Ｃ６は、このＣＨＯ発現系でこれまでに利用されたベクター構造である（上記のＩｎｎｉｓｓを参照されたい）。構造Ｃ６から得られた結果は、各ランディングパッドが重鎖転写産物よりもかなり多くの軽鎖転写産物を生じさせることを示している。Ｃ６の結果は、発現生産量が、重鎖転写産物レベルを増大させることおよび軽鎖転写産物に対する重鎖転写産物の比率を増大させることによって改良され得ることを示唆した。
【0121】
図３Ａ～図３Ｆのデータを使用して、標準的なｍＡｂの各ランディングパッド内の全ての考えられる発現ベクター構造の推定される転写産物レベルを予測するための数値一覧（表３）を得た。この一覧は、各々の個々のランディングパッドの各発現ベクター構造で見られた平均転写産物レベルを考慮して作成された。表３では、平均転写産物レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する比率（例えば、ある位置における「４．４」という値は、ＧＡＰＤＨの転写産物レベルに対する、その位置にある導入遺伝子の転写産物レベルの相対的比率を示す）、ならびに、全ての考えられる占有の組合せでの、各ランディングパッドにおける第１および第２の発現ベクター位置での軽鎖（Ｌ）および／または重鎖（Ｈ）の相対的パーセンテージ（Ｌ／Ｌ構造では、ランディングパッドＡにおける第１のＬ鎖に対する；太字の値を参照されたい）として定量した。
【0122】
【表3】
【0123】
表３の情報を使用して、Ｃ２で概略されるベクター構造［ランディングパッドＡのベクターが位置１に軽鎖を、位置２に軽鎖を有し（「ＬＬ」）、また、ランディングパッドＢのベクターが位置１に重鎖を、位置２に重鎖を有する（「ＨＨ」）ため、本明細書では「ＬＬ ＨＨ」とも呼ばれる］がベクター構造Ｃ６（本明細書では、Ｃ２で説明したものと同一の理論的根拠に基づいて「ＬＨ ＬＨ」と呼ばれる）と比較して優れた転写産物プロファイルを有し、したがって生産性を向上させることが予測された。これは以下のように計算した。ＬＬ ＨＨ（Ｃ２）構造では、総軽鎖値は６．４［４．４（第１の位置）＋２．０（第２の位置）という加算によって計算された］であり、総重鎖値は２．２［１．７（第１の位置）＋０．５（第２の位置）という加算によって計算された］である。したがって、Ｃ２（ＬＬ ＨＨ）構造での、細胞における重鎖転写産物に対する軽鎖転写産物の比率は、２．２に対して６．４、すなわち１重鎖当たり約２．９の軽鎖である。Ｃ６（ＬＨ ＬＨ）構造では、総軽鎖値は７．６［４．３（第１の位置、ランディングパッドＡ）＋３．３（第１の位置、ランディングパッドＢ）という加算によって計算された］であり、総重鎖値は１．５［０．７（第２の位置、ランディングパッドＡ）＋０．８（第２の位置、ランディングパッドＢ）という加算によって計算された］である。したがって、ＬＨ ＬＨ構造での、細胞における重鎖転写産物に対する軽鎖転写産物の比率は、１．５に対して７．６、すなわち１重鎖当たり約５．１の軽鎖である。総合すると、この情報は、ＬＬ ＨＨ（Ｃ２）構造を有する細胞（１に対して約２．９）では、ＬＨ ＬＨ（Ｃ６）構造を有する細胞（１に対して約５．１）よりも、重鎖転写産物に対する軽鎖転写産物が少ないことを示した。
【0124】
構造Ｃ２とＣ６とを複数の抗体の発現について試験するために、両発現ベクター構造を６つの異なるｍＡｂ（ｍＡｂ１～ｍＡｂ６）について作製した。各ベクターをＣＨＯ宿主細胞系にトランスフェクトして、３つの個別のプールを作製し、その後、選択および回収を行った。回収した細胞を振とうフラスコ内で継代し、試料を採取して、転写産物の分析を行った。図４Ａは、６つのｍＡｂ全ての観察された転写産物レベルと比較した、表３の数値一覧によって予測された各ベクター構造での重鎖および軽鎖の転写産物レベルを示す。予測した通り、重鎖転写産物レベルは、６つのｍＡｂ全てで、ＬＬ ＨＨ（Ｃ２）ベクター構造で、ＬＨ ＬＨ（Ｃ６）構造と比較して有意に増大した。軽鎖レベルは６つのｍＡｂのうちの４つで低下したが、全てが統計的に有意であったわけではない。しかし、全てのケースにおいて、軽鎖に対する重鎖の比率は増大し、転写産物プロファイルの全体的な改善は、１２日間の流加培養の後のＣ２（ＬＬ ＨＨ）プールのｍＡｂの産生量をＣ６（ＬＨ ＬＨ）プールと比較して増大させた（図４Ｂ）。各ベクター構造の６つのｍＡｂ全てでの転写産物プロファイルの持続的なパターン、および産生量の一貫した向上は、この研究からの学習が標準的なｍＡｂに普遍的に適用され得、事前の合理的な発現ベクターの設計を可能にすることを示唆している。
【0125】
（実施例２）
デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系での、ベクター内のｍＡｂ融合タンパク質コード遺伝子の順序および位置の影響の評価
目的：
この実施例では、デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系における、転写および力価に対する、発現ベクター内でのｍＡｂ融合タンパク質（抗体重鎖、抗体軽鎖、および抗体重鎖サイトカイン融合体）のポリペプチドをコードする３つの異なる遺伝子の位置の影響を評価した。
デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系での、ベクター内のｍＡｂ融合タンパク質コード遺伝子の順序および位置の影響の評価
目的：
この実施例では、デュアルランディングパッドＣＨＯ細胞系における、転写および力価に対する、発現ベクター内でのｍＡｂ融合タンパク質（抗体重鎖、抗体軽鎖、および抗体重鎖サイトカイン融合体）のポリペプチドをコードする３つの異なる遺伝子の位置の影響を評価した。
【0126】
材料および方法：
別段の記載がない限り、材料および方法は、使用した、ｍＡｂ融合タンパク質のポリペプチドをコードする遺伝子を除いて（実施例１の標準的なｍＡｂ重鎖および軽鎖遺伝子の代わりに）、実施例１で記載した通りに使用した。
別段の記載がない限り、材料および方法は、使用した、ｍＡｂ融合タンパク質のポリペプチドをコードする遺伝子を除いて（実施例１の標準的なｍＡｂ重鎖および軽鎖遺伝子の代わりに）、実施例１で記載した通りに使用した。
【0127】
ｍＡｂ融合タンパク質は、３つの異なるポリペプチド種：ｉ）抗体重鎖（ＨＣ）、ｉｉ）抗体軽鎖（ＬＣ）、およびｉｉｉ）抗体重鎖サイトカイン融合体（ＨＣ－Ｆ）（重鎖のＣ末端に共有結合しているサイトカイン）を有している。ｍＡｂ融合タンパク質におけるこれらのポリペプチド種の比率は、１重鎖：１重鎖サイトカイン融合体：２軽鎖（１ＨＣ：１ＨＣ－Ｆ：２ＬＣ）である。ｍＡｂ融合タンパク質はまた、ｍＡｂの重鎖のうちの１つのＮ末端にサイトカインが共有結合している、標準的なｍＡｂとしても記載される。
【0128】
表４に示すように、２つの異なる発現ベクター構造を評価のために選択した。
【0129】
【表4】
【0130】
構造Ｃ１は、１重鎖（ＨＣ）：１重鎖サイトカイン融合体（ＨＣ－Ｆ）：２軽鎖（ＬＣ）という所望の比率に近い転写産物レベルとなるように、表３の情報に基づいて設計した。構造Ｃ２は、表３の情報に基づいて設計したが、大きな重鎖サイトカイン融合ポリペプチドの翻訳および／または安定性の比率が標準的な重鎖ポリペプチドと比較して潜在的に異なることも考慮し、したがって、ＨＣと比較した、ＨＣ－Ｆの翻訳および／または安定性の予想される低減を補うために、ＨＣ転写産物よりも多くのＨＣ－Ｆ転写産物を生成することを目的とした。
【0131】
結果：
各ベクター構造の予測されたおよび観察された転写産物レベルを図５Ａに示す。図５Ａに示されるように、構造１（Ｃ１）および構造２（Ｃ２）の両方で、全ての遺伝子の観察された転写産物レベルは、それぞれの構造における遺伝子の予測された転写産物レベルとほとんど適合していた。具体的には、ベクター構造Ｃ１は、転写産物の予測された１ＨＣ：１ＨＣ－Ｆ：２ＬＣという比率に非常に近かったが、構造Ｃ２は、予測された、ＨＣと比較して多くのＨＣＦ転写産物を示している。
各ベクター構造の予測されたおよび観察された転写産物レベルを図５Ａに示す。図５Ａに示されるように、構造１（Ｃ１）および構造２（Ｃ２）の両方で、全ての遺伝子の観察された転写産物レベルは、それぞれの構造における遺伝子の予測された転写産物レベルとほとんど適合していた。具体的には、ベクター構造Ｃ１は、転写産物の予測された１ＨＣ：１ＨＣ－Ｆ：２ＬＣという比率に非常に近かったが、構造Ｃ２は、予測された、ＨＣと比較して多くのＨＣＦ転写産物を示している。
【0132】
細胞から得られる抗体力価もまた評価した。１２日間の流加の後に良好な産生量が両構造で見られ、構造Ｃ１はＣ２よりも高い生産量を示した（それぞれ、約５５００ｍｇ／Ｌ対約３８００ｍｇ／Ｌ）（図５Ｂ）。
【0133】
還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のデンシトメトリーを介して測定されたポリペプチドレベルは、構造Ｃ１ではＨＣ－Ｆに対して過剰なＨＣを、構造Ｃ２ではほぼ等しいレベルのＨＣおよびＨＣ－Ｆを示し（図５Ｃ）、このことは、より大きなＨＣ－Ｆポリペプチドで翻訳率／安定性が低減していることを示唆している。次に、産物品質分析を、分析用サイズクロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）およびキャピラリーゲル電気泳動（「ｃＧＥ」）を介して、Ｃ１およびＣ２産物で行った。結果を表５に示す。
【0134】
【表5】
【0135】
図５Ａおよび表５のデータは、構造Ｃ１は標的化された１ＨＣ：１ＨＣ－Ｆ：２ＬＣ比に最も近い転写産物比率を有していたが（図５Ａ）、ＨＣ－Ｆポリペプチドの翻訳率および／または安定性の低減が余剰のＨＣポリペプチドを生じさせ、これがおそらく、Ｃ１産物における低分子量種（「ＬＭＭＳ」）のパーセンテージの増大をもたらした（表５）ことを示した。逆に、構造Ｃ２から生じた産物は優れた品質プロファイルを示し（表５）、これは、例えば、Ｃ１と比較した、Ｃ２における、はるかに高い目的のタンパク質（ＰＯＩ）の％（ＰＯＩはｍＡｂ融合タンパク質である）およびインタクトタンパク質の％、ならびにはるかに低いＬＭＭＳ％によって証明され、このことは、Ｃ２産物のほとんどがインタクトなｍＡｂ融合タンパク質であるが、Ｃ１の産物のほぼ半分がＬＭＭＳであることを示している。Ｃ２構造からの産物の優れた品質プロファイルは、同様のレベルのＨＣおよびＨＣ－Ｆポリペプチドの存在に起因する可能性が高い（図５Ｃ）。
【0136】
全体として、この実施例のデータは、デュアル発現ベクターに基づくタンパク質発現系の一部としてのｍＡｂ融合タンパク質の産生にとっての、Ｃ２ベクター構造（ＬＣ－ＬＣ／ＨＣ－Ｆ－ＨＣ）の利益を示している。
【0137】
開示された教示は、種々の適用、方法、キットおよび組成物に関して記載されてきたが、種々の変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求された本発明から逸脱することなしになされ得ることが理解される。上述の実施例は、開示された教示をよりよく説明するために提供されるのであって、本明細書に提示された教示の範囲を限定する意図はない。本明細書の教示は、これらの例示的な実施形態に関連して記載されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が、過度の実験なしに可能であることを容易に理解する。全てのかかるバリエーションおよび改変は、本明細書の教示の範囲内である。
【0138】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用された全ての参考文献、およびそれらの中で引用された参考文献は、まだ引用されていない範囲まで、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などが含まれるがこれらに限定されない、組み込まれた文献および同様の資料のうち１つまたは複数が、本出願とは異なる場合または本出願と矛盾する場合には、本出願が支配する。
【0139】
先の記載および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって検討される最良の態様を記載している。しかし、先の記載が本明細書においていかに詳述されていても、本発明は多くの手段で実施され得、本発明は添付の特許請求の範囲およびあらゆるそれらの同等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【国際調査報告】