特表 2024-528167 Ｔ細胞の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】Ｔ細胞の生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20240719BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240719BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240719BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20240719BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61K35/17

A61P35/00

C12N15/12

C12N15/867 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506477

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2022071867

(87)【国際公開番号】W WO2023012236

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】2111169.5

(32)【優先日】2021-08-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517122578

【氏名又は名称】アダプティミューン・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヤン チェン－タオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC20

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本発明は、前駆Ｔ細胞の集団を生産する方法であって、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を、メチル４－（３－ピペリジン－１－イルプロピルアミノ）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－７－カルボキシレート（ＵＭ７２９）または（１Ｒ，４Ｒ）－Ｎ１－（２－ベンジル－７－（２－メチル－２Ｈ－テトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル）シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）などのピリミドインドール化合物の存在下で前駆Ｔ細胞へと分化させることを含む、方法に関する。前駆Ｔ細胞は、例えば免疫療法に使用するために、成熟させ、活性化させ、増大させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

前駆Ｔ細胞の集団を生産する方法であって、
造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団を、ピリミドインドール化合物の存在下で前駆Ｔ細胞へと分化させることを含む、前記方法。

【請求項2】

前記ピリミドインドール化合物の存在は、前駆Ｔ細胞へと分化するＨＰＣの割合を増加させる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＨＰＣは、有効量の前記ピリミドインドール化合物を補充したリンパ球増大培地中で前記ＨＰＣの集団を培養することを含む方法により分化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項4】

前記リンパ球増大培地は、有効量のＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ７、及び前記ピリミドインドール化合物を補充した既知栄養培地からなる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＨＰＣはＣＤ３４＋表現型を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＨＰＣは、前記ＨＰＣを共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）へと分化させることと、前記ＣＬＰを前駆Ｔ細胞へと分化させることとを含む方法により分化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＨＰＣの集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からｉｎ ｖｉｔｒｏで生産される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記方法は、ｉＰＳＣの集団を準備することと、前記ｉＰＳＣをＨＰＣの集団へと分化させることとを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前駆Ｔ細胞はＣＤ５＋、ＣＤ７＋の表現型を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前駆Ｔ細胞を増大させる方法であって、
前記前駆Ｔ細胞をピリミドインドール化合物の存在下で培養することを含む、前記方法。

【請求項11】

前記ピリミドインドール化合物の存在は、前記集団における前記前駆Ｔ細胞の増大を高める、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記前駆Ｔ細胞の増大は少なくとも２１日間である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ピリミドインドール化合物は置換ピリミド［４，５－ｂ］インドールである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ピリミドインドール化合物はメチル４－（３－ピペリジン－１－イルプロピルアミノ）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－７－カルボキシレートである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ピリミドインドール化合物は（１Ｒ，４Ｒ）－Ｎ１－（２－ベンジル－７－（２－メチル－２Ｈ－テトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンである、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ピリミドインドール化合物は５μＭ未満の濃度で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記方法は、αβＴＣＲをコードする異種核酸を前記ｉＰＳＣ、前記ＨＰＣ、または前記前駆Ｔ細胞に導入することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記αβＴＣＲをコードする前記異種核酸は発現ベクターに含まれている、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記発現ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記αβＴＣＲは親和性向上型ＴＣＲである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記αβＴＣＲは、細胞によって発現される標的抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合するか、またはＭＨＣ提示とは無関係に細胞によって発現される標的抗原もしくはそのペプチドに特異的に結合する、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記αβＴＣＲは、がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合するか、またはＭＨＣ提示とは無関係にがん細胞によって発現される腫瘍抗原もしくはそのペプチド断片に特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記前駆Ｔ細胞をさらに分化させてＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を生産することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記前駆細胞が、前駆Ｔ細胞の集団をＴ細胞成熟培地中で培養することを含む方法により、さらに分化される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞がＣＤ８＋ＣＤ４＋表現型を有する、請求項２３または請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を活性化及び増大して、ＣＤ８＋単一陽性表現型またはＣＤ４＋単一陽性表現型を有するＴ細胞の集団を生産することを含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞に特異的に結合する、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記標的抗原は腫瘍抗原である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞に特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を単離または精製することをさらに含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞が磁気活性化細胞選別により単離される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を濃縮することをさらに含む、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を保存することを含む、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することを含む、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法により生産される、前駆Ｔ細胞の集団。

【請求項36】

請求項２３～３４のいずれか１項に記載の方法により生産される、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団。

【請求項37】

請求項２３～３４のいずれか１項に記載の方法により生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項38】

治療方法に使用するための、請求項２３～３４のいずれか１項に記載の方法により生産される、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団。

【請求項39】

がんの治療方法に使用するための、請求項２３～３４のいずれか１項に記載の方法により生産される、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は（例えば、免疫療法に使用するための）Ｔ細胞の生産に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫療法薬は、長期生存の見込みがあり、がん処置の様相を変容させようとしている（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０１４ Ｏｃｔ；４０（９）：１０５６－６４）。患者集団及び腫瘍型の範囲を拡大するための新しい免疫調整薬に対する、明らかな満たされていない医療ニーズが存在する。さらに、抗腫瘍応答の大きさ及び持続時間を向上させるために、新しい薬剤が必要とされている。これらの薬剤の開発は、過去２０年間でＴ細胞免疫を制御する基本原理の理解が深まったことから可能になっている（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ａｐｒ ９；１６１（２）：２０５－１４）。これには通常、ＭＨＣ分子によって提示される腫瘍関連ペプチド抗原を認識する腫瘍特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が必要である。様々なワクチン接種ストラテジー及びｅｘ ｖｉｖｏで増大した腫瘍浸潤リンパ球の養子移入は、いくつかの事例において、腫瘍特異的Ｔ細胞が末期がんを処置できることを示した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ｓｅｐ；１０（９）：９０９－１５）。

【0003】

しかし、現在の養子Ｔ細胞療法は、好適な患者及び腫瘍特異的Ｔ細胞の不足によって制限されており、免疫療法で効果的に使用するための治療上十分かつ機能的な抗原特異的Ｔ細胞が必要とされている。

【0004】

ピリミド［４，５－ｂ］インドール誘導体は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の増大を向上させるが、その分化を阻害することが報告されている（ＷＯ２０１３１１０１９８）。

【発明の概要】

【0005】

本発明者らは、ＵＭ７２９及びＵＭ１７１などのある特定のピリミドインドール化合物が、造血前駆細胞の前駆Ｔ細胞への分化及び／または前駆Ｔ細胞の集団の増大を高めるために使用され得ることを認識した。これは例えば、免疫療法用のＴ細胞の生産に有用であり得る。

【0006】

本発明の第１の態様は、前駆Ｔ細胞の集団を生産する方法であって、造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団を、ピリミドインドール化合物の存在下で前駆Ｔ細胞へと分化させることを含む、方法を提供する。

【0007】

ピリミドインドール化合物の存在は、前駆Ｔ細胞へと分化するＨＰＣの割合を増加させる可能性がある。

【0008】

第１の態様の方法は、前駆Ｔ細胞の集団を増大させることをさらに含み得る。好ましくは、前駆Ｔ細胞の集団は、ピリミドインドール化合物の存在下で培養することにより増大される。

【0009】

本発明の第２の態様は、前駆Ｔ細胞の集団を増大させる方法であって、前駆Ｔ細胞の集団を、ピリミドインドール化合物の存在下で培養することを含む、方法を提供する。

【0010】

ピリミドインドール化合物の存在は、当該培養の後に、集団中の前駆Ｔ細胞の数を増加させることができる。

【0011】

本発明の第３の態様は、Ｔ細胞の集団を生産する方法であって、
第１または第２の態様の方法により、前駆Ｔ細胞の集団を生産することと、
前駆Ｔ細胞を成熟させて、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を生産することと、
場合により、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を活性化及び増大させて、ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団またはＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生産することとを含む、方法を提供する。

【0012】

本発明の第４の態様は、第１もしくは第２の態様の方法により生産される前駆Ｔ細胞の集団、または第３の態様の方法により生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を提供する。

【0013】

本発明の第５の態様は、第３の態様のＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0014】

本発明の第６の態様は、治療方法であって、治療有効量の第３の態様のＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供する。

【0015】

本発明の第７の態様は、ＨＰＣの前駆Ｔ細胞への分化におけるピリミドインドール化合物の使用を提供する。

【0016】

本発明の第８の態様は、前駆Ｔ細胞の集団を増大させるためのピリミドインドール化合物の使用を提供する。

【0017】

本発明の他の態様及び実施形態については、以下でより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ｉＰＳＣからＴ細胞を生成するための６段階の方法の一例の概略図を示す。

【図2A】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９で２１日間処理すると、その生存率が維持されることを示している。

【図2B】造血前駆細胞を５．０μＭ以上のＵＭ７２９で２１日間処理すると、その生存率及び増殖が低下または停止することを示している。

【図3】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９で２１日にわたり処理すると、細胞のリンパ球の割合が増加し、骨髄球の割合が低下することを示している。

【図4A】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９で２１日にわたり処理すると、ｉＰｒｏＴ細胞（ＣＤ７＋、ＣＤ５＋、及びＣＤ３４－）への分化が促進されることを示している。

【図4B】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９で２１日にわたり処理すると、ｉＰｒｏＴ細胞（ＣＤ７＋、ＣＤ５＋、及びＣＤ３４－）のパーセンテージが高まることを示している。

【図5A】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で２１日にわたり処理すると、ＣＤ８＋ＣＤ４＋二重陽性細胞の割合が減少することを示している。

【図5B】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で２１日にわたり処理すると、ＣＤ８＋ＣＤ４＋二重陽性細胞の割合が減少することを示している。

【図6】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で３５日にわたり処理すると、その生存能力が維持されることを示している。

【図7】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で３５日にわたり処理すると、ｉＰｒｏＴ細胞（ＣＤ７＋、ＣＤ５＋、及びＣＤ３４－）への分化が促進されることを示している。

【図8】造血前駆細胞を０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で３５日にわたり処理すると、ＣＤ８＋ ＣＤ４＋二重陽性細胞の割合が減少することを示している。

【図9】０．２５μＭ～１．０μＭのＵＭ７２９を補った第４段階培地で処理すると、ｉＰｒｏＴ細胞の増大が大幅に向上することを示している。

【図10】第４段階培地で２１日間ＵＭ７２９で前処理した細胞が、ＵＭ７２９の非存在下の第５段階培地でさらに１４日間培養するとＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性になることを示している。

【図11】第４段階培地にＵＭ７２９を加えることで、凍結融解からのｉＰｒｏＴ細胞の回復が改善されたことを示している。細胞は溶液６（非生存細胞のみを染色するＰＩ染色、及び酸化還元状態を反映する強度依存的方式で細胞を染色するＶＢ－４８（商標））で染色した。

【図12A】第４段階培地で１μＭのＵＭ７２９により前処理した細胞が、第５段階培地で７日間培養した後に、より高い生存率を呈したことを示している。

【図12B】第４段階培地で１μＭのＵＭ７２９により前処理した細胞が、第５段階培地で７日間培養した後に、細胞増殖率の増加を呈したことを示している。

【図13A】異なる濃度のＵＭ１７１を補充した第４段階培地で２１日間培養したｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞（ＨＰＣ）の生存率を示している。

【図13B】異なる濃度のＵＭ１７１を補充した第４段階培地で２１日間培養したｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞（ＨＰＣ）の増殖率（１３Ｂ）を示している。

【図14】異なる濃度のＵＭ１７１を補充した第４段階培地でｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞（ＨＰＣ）を２１日間培養した後のＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋（共通リンパ系前駆細胞）の割合を示している。

【図15A】ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞（ＨＰＣ）を異なる濃度のＵＭ１７１を補充した第４段階培地で２１日間培養し、次に第５段階Ｔ細胞成熟培地で１４日間培養した後のＣＤ４５＋ＣＤ５＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞の割合を示す。

【図15B】ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞（ＨＰＣ）を異なる濃度のＵＭ１７１を補充した第４段階培地で２１日間培養し、次に第５段階Ｔ細胞成熟培地で１４日間培養した後のＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞及びＣＤ４－ＣＤ８＋ＳＰ Ｔ細胞の割合を示している。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、前駆Ｔ細胞の集団を生産する方法であって、造血前駆細胞（ＨＰＣ）をピリミドインドール化合物の存在下で前駆Ｔ細胞へと分化させることを含む、方法に関する。本発明はまた、前駆Ｔ細胞の集団をピリミドインドール化合物の存在下で培養することにより、前駆Ｔ細胞の集団を増大させる方法にも関する。これらの方法は、免疫療法及び他の用途に使用する免疫細胞、例えば同種異系Ｔ細胞を含むＴ細胞の生成に有用であり得る。

【0020】

造血前駆細胞（ＨＰＣ）がＴ細胞前駆細胞に分化する際にピリミドインドール化合物が存在すると、分化の際にピリミドインドール化合物が存在しない場合と比較して、分化細胞集団中の前駆Ｔ細胞の量または割合が増加する可能性がある。例えば、分化後の集団におけるＣＤ３４－ＣＤ５＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞の量または割合は、ピリミドインドール化合物の存在下で増加する可能性がある。

【0021】

前駆Ｔ細胞の培養中にピリミドインドール化合物が存在すると、前駆Ｔ細胞の増殖が増加する一方で、前駆Ｔ細胞のさらなる分化が阻害され、集団におけるそのようなＴ細胞の割合が増加する可能性がある。例えば、ＣＤ５＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞の量または数及びパーセンテージは、ピリミドインドール化合物の存在下で培養した後に増加する可能性がある。さらに、前駆Ｔ細胞を培養する際にピリミドインドール化合物が存在すると、その後の分化ステップにおけるＴ細胞の凍結／融解からの回復を改善することができる。

【0022】

Ｔ細胞（別名Ｔリンパ球）は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、他のリンパ球から区別され得る。Ｔ細胞には数種類あり、各種類が異なる機能を有する。Ｔヘルパー細胞（Ｔ_Ｈ細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４^＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、適応免疫系において重要な役割を果たし、Ｔ細胞サイトカインを放出して免疫応答の抑制または調節を助けることによって他の免疫細胞の活動を助ける。これらは、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び成長に不可欠である。ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔ_Ｃ細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８^＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊するように作用する。ほとんどのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子により感染細胞または損傷細胞の表面に提示された特異的抗原を認識することができるＴＣＲを発現する。抗原及びＭＨＣ分子へのＴＣＲ及びＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、Ｔ細胞を介した感染細胞または損傷細胞の破壊をもたらす。

【0023】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、標的抗原のペプチド断片を提示する細胞表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合し得る。例えば、ＴＣＲは、腫瘍抗原のペプチド断片を提示するがん細胞の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合し得る。あるいは、ＴＣＲは、ＭＨＣによる提示とは無関係に、特定の抗原またはそのペプチドを認識する場合がある。このようなＴＣＲを含むＴ細胞を、本発明の方法に従って生産することができる。ＭＨＣは、獲得免疫系に「外来」分子を認識させる細胞表面タンパク質のセットである。タンパク質は細胞内で分解され、ＭＨＣによって細胞の表面に提示される。ウイルスまたはがん関連ペプチドなどの「外来」ペプチドを提示するＭＨＣは、適切なＴＣＲを有するＴ細胞によって認識され、細胞破壊経路を促進する。がん細胞の表面上のＭＨＣは、腫瘍抗原、すなわち、がん細胞には存在するが対応する非がん性細胞には存在しない抗原のペプチド断片を提示し得る。これらのペプチド断片を認識するＴ細胞は、がん細胞に対してＣＤ４＋ＣＤ８＋効果を及ぼし得る。

【0024】

前駆Ｔ細胞は、αβ＋Ｔ細胞、γδ＋Ｔ細胞、組織常在性Ｔ細胞、及びＮＫＴ細胞を生じさせることができる多分化能リンパ球生成前駆細胞である。前駆Ｔ細胞は、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にαβＴ細胞系列に傾倒する可能性がある（Ｔｒｏｔｍａｎ－Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１ １２（１）５０２３、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１２ ２（６）１７２２－１７３５）。前駆Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで胸腺に定着することができる可能性があり、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にαβＴ細胞系列に傾倒することができる可能性がある。前駆Ｔ細胞は、サイトカイン生産ＣＤ３^＋Ｔ細胞に成熟することができる可能性もある。

【0025】

前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＣＤ７を発現する場合があり、すなわち、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型を有する場合がある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２５、及びＣＤ２を同時発現する場合もある。例えば、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋ＣＤ２＋表現型を有し得る。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４５を同時発現する場合もある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の発現、例えば細胞表面発現を欠く場合がある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ３４の発現、例えば細胞表面発現を欠く場合がある（すなわち、前駆Ｔ細胞はＣＤ３４－表現型を有する場合がある）。

【0026】

前駆Ｔ細胞（本明細書での別名：ｉＰｒｏＴ細胞）の集団は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）の指向性分化により、本明細書に記載されるように生産される。ＨＰＣ（別名、造血幹細胞及び造血前駆細胞またはＨＳＰＣ）は、造血系列に傾倒している多分化能幹細胞であり、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、及びＴ細胞を含む、骨髄系列及びリンパ系系列を含む、すべての血液細胞型へのさらなる造血分化が可能である。ＨＰＣはＣＤ３４を発現し得る。ＨＰＣはＣＤ４５を同時発現し得る。ＨＰＣはまた、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、及びＦＬＫ１（別称ＫＤＲまたはＶＥＧＦＲ２）も同時発現し得る。ＨＰＣは、ＣＤ３８及び他の系列特異的マーカーの発現について陰性であり得る。例えば、ＨＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ４５＋ＦＬＫ１＋ＣＤ３８－のうちの１つ以上、好ましくはすべてを示し得る。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＨＰＣは、共通のリンパ系前駆中間体を介して前駆Ｔ細胞へと分化し得る。例えば、ＨＰＣは共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）へと分化し、これがその後前駆Ｔ細胞へと分化する。ＣＬＰはリンパ球系列に傾倒している多分化能幹細胞である（Ｈｏｅｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００７ ２１（２）３１１－３１９）。ＣＬＰはＣＤ３４を発現し得る。ＣＬＰはＣＤ４５を同時発現し得る。ＣＬＰはまた、ＣＤ７も同時発現し得る。ＣＬＰはまた、ＣＤ４５ＲＡ及びＨＬＡ－ＤＲも同時発現し得る。ＣＬＰは、ＣＤ３８、ＣＤ５、ならびにｃ－ｋｉｔ及びＴｈｙ－１などの他のマーカーの発現について陰性であり得る。例えば、ＣＬＰは、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋、ＣＤ３８－、ＣＤ５－のうちの１つ以上、好ましくはすべてを示し得る。

【0028】

造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、リンパ球分化を促進する適切な条件下で、ＨＰＣの集団をピリミドインドール化合物の存在下で培養することにより、前駆Ｔ細胞へと分化し得る。例えば、造血前駆細胞は、ピリミドインドール化合物を補充したリンパ球増大培地で培養され得る。

【0029】

本発明で使用するピリミドインドール化合物は、典型的にはコアのピリミジン環及びベンゼン環上で置換されたピリミドインドールコアを有し得る。

【0030】

好ましくは、ピリミドインドール化合物はピリミド［４，５－ｂ］インドールであり、これは場合により置換され、好ましくは置換される。例えば、ピリミドインドール化合物は、ＵＳ１０３３６７４７Ｂ２及びＷＯ２０１３１１０１９８に記載されているような式（Ｉ）～（ＶＩ）のピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物であり得る。

【0031】

標準的な命名規則に従えば、ピリミジンの窒素環原子はピリミド［４，５－ｂ］インドールコアの１位及び３位に位置し、インドールの窒素環原子は９位に位置する。

【0032】

ピリミド［４，５－ｂ］インドールは置換されてもよく、好ましくは２つまたは３つの置換基で置換される。これらの置換基は、典型的には、後述するようなピリミド［４，５－ｂ］インドールのピリミジン環及びベンゼン環にもたらされる。ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物のピリミジン環は、一置換または二置換であり得る。ピリミジン環は、２位及び４位の一方または両方で置換され得る。好ましくは、ピリミジンは少なくとも４位で置換され、場合により２位で置換される。好ましくは、２位は非置換である。

【0033】

ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物は、一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶを有することができる。

【化1】

【0034】

式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶにおける置換基の定義を下記に定義する。

【0035】

Ｚは、１）－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^１）（ＯＲ^１）、２）－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１、３）－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１、４）－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、５）－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、６）－ＣＮ、７）－ＳＲ^１、８）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ_２、９）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨＲ^１、１０）－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、１１）－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、１２）－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、１３）－Ｌ、１４）－ベンジル（場合により１、２、もしくは３つのＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１５）－Ｌ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１６）－Ｌ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１７）－Ｌ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１８）－ヘテロアリール（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、または１９）－アリール（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）である。この一覧において、各置換基は、まだ存在しない場合、場合によりＬ基に結合し、（Ｒ^１）及びＲ^１が窒素原子に結合している場合、場合によりそれらは窒素原子と一緒になって、場合によりＮ、Ｏ、及びＳから選択される１個以上の他のヘテロ原子を含む３～７員環を形成し、場合により環は１つ以上のＲ^１またはＲ^Ａで置換される。

【0036】

Ｗは、Ｈ、ハロゲン、またはＮ、Ｏ、ＳもしくはＣである原子を介して分子のピリミドインドールコアに結合している基である。場合により、Ｗは、１～２０個の炭素原子を有する飽和、不飽和、直鎖状、分枝状、及び／または環式のアルキル及び／またはヘテロアルキルである少なくとも１つの部分を含む。また、場合により、当該部分は、Ｎ、Ｏ、またはＳである少なくとも１個の他のヘテロ原子を含む。

【0037】

より具体的には、Ｗは、１）－Ｈ、２）－ハロゲン、３）－ＯＲ^１、４）－Ｌ－ＯＨ、５）－Ｌ－ＯＲ^１、６）－ＳＲ^１、７）－ＣＮ、８）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^１）（ＯＲ^１）、９）ＮＨＲ^１、１０）－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、１１）－Ｌ－ＮＨ_２、１２）－Ｌ－ＮＨＲ^１、１３）－Ｌ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、１４）－Ｌ－ＳＲ^１、１５）－Ｌ－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、１６）－Ｌ－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、１７）－Ｌ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^１）（ＯＲ^１）、１８）－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１、１９）－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、２０）－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１、２１）－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、２２）－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１、２３）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、２４）－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ^１、２５）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１、２６）－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ_２、２７）－ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、２８）－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、２９）－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^１、３０）－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、３１）－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、３２）－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、３３）－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、３４）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、３５）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１、３６）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、３７）－ＮＨＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、３８）－ＮＲ^１Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、３９）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ_２、４０）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨＲ^１、４１）－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、４２）－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、４３）－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、４４）－ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、４５）－Ｓ（Ｏ）_２ＯＲ^１、４６）－ベンジル（場合により１、２、もしくは３つのＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、４７）－Ｌ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、４８）－Ｌ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、４９）－Ｌ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換、５０）－Ｌ－ＮＲ^１（Ｒ^１）、５１）－（Ｌ－）_２ＮＲ^１、５２）－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、５３）－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、５４）－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、５５）Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、５６）－Ｏ－Ｌ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、５７）－Ｏ－Ｌ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、５８）－Ｏ－Ｌ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、５９）－Ｏ－Ｌ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６０）－（Ｏ－Ｌ）_２－ＮＲ^１、６１）－Ｏ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、６２）－Ｏ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６３）－Ｏ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６４）－Ｏ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６５）－Ｓ－Ｌ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６６）－Ｓ－Ｌ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６７）－Ｓ－Ｌ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、６８）－（Ｓ－Ｌ）_２－ＮＲ^１、６９）－Ｓ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、７０）－Ｓ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロアリール（場合により１つ以上のＲ^Ａ置換基で置換）、７１）－Ｓ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロシクリル（場合により１つ以上のＲ^Ａ置換基で置換）、７２）－Ｓ－Ｌ－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－アリール（場合により１つ以上のＲ^Ａ置換基で置換）、７３）－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、７４）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、７５）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_２－ＮＲ^１、７６）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^Ａ、７７）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロアリール（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、７８）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－ヘテロシクリル（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、７９）－（Ｎ（Ｒ^１）－Ｌ）_ｎ－アリール（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、８０）－ヘテロアリール（場合により１つ以上のＲ^Ａ置換基で置換）、または８１）－アリール場合により１つ以上のＲ^Ａ置換基で置換）である。この一覧において、各置換基は、まだ存在しない場合、場合によりＬ基に結合し、２つのＲ^１置換基が同じ窒素原子上に存在する場合、各Ｒ^１置換基は、本明細書に記載されるＲ^１の値の一覧から独立して選択され、ｎは０、１、２、３、４、または５のいずれかに等しい整数であり、（Ｒ^１）及びＲ^１が窒素原子に結合している場合、場合によりそれらは窒素原子と一緒になって、場合によりＮ、Ｏ、及びＳから選択される１個以上の他のヘテロ原子を含む３員～７員環を形成し、場合により環は１つ以上のＲ^１またはＲ^Ａで置換される。

【0038】

Ｌは、１）－Ｃ_１～６アルキル、２）－Ｃ_２～６アルケニル、３）－Ｃ_２～６アルキニル、４）－Ｃ_３～７シクロアルキル、５）－Ｃ_３～７シクロアルケニル、６）ヘテロシクリル、７）－Ｃ_１～６アルキル－Ｃ_３～７シクロアルキル、８）－Ｃ_１～６アルキル－ヘテロシクリル、９）アリール、または１０）ヘテロアリールである。この一覧において、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクリル基、アリール基、及びヘテロアリール基は、各々独立して、場合により１つまたは２つのＲ^Ａ置換基で置換される。

【0039】

Ｒ^１は、１）－Ｈ、２）－Ｃ_１～６アルキル、３）－Ｃ_２～６アルケニル、４）－Ｃ_２～６アルキニル、５）－Ｃ_３～７シクロアルキル、６）－Ｃ_３～７シクロアルケニル、７）－Ｃ_１～５ペルフルオロ化、８）ヘテロシクリル、９）アリール、１０）ヘテロアリール、１１）－ベンジル、または１２）５－［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル］ペンタノイルである。この一覧において、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルケニル基、ペルフルオロ化アルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、及びベンジル基は、各々独立して、場合により１つ、２つ、または３つのＲ^ＡまたはＲ^１置換基で置換される。

【0040】

Ｒ^２は、１）－Ｈ、２）－Ｃ_１～６アルキル、３）－ＳＲ^１、４）－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、５）－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、６）－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、７）－ベンジル（場合により１、２、もしくは３つのＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、８）－Ｌ－ヘテロアリール（場合により、Ｌ及びヘテロアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡまたはＲ^１置換基で置換）、９）－Ｌ－ヘテロシクリル（場合により、Ｌ及びヘテロシクリル基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１０）－Ｌ－アリール（場合により、Ｌ及びアリール基の一方もしくは両方に結合した１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１１）－ヘテロアリール（場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）、１２）－アリール場合により１つ以上のＲ^ＡもしくはＲ^１置換基で置換）である。この一覧において、各置換基は、まだ存在しない場合、場合によりＬ基に結合する。

【0041】

Ｒ^Ａは、１）－ハロゲン、２）－ＣＦ_３、３）－ＯＨ、４）－ＯＲ^１、５）－Ｌ－ＯＨ、６）－Ｌ－ＯＲ^１、７）－ＯＣＦ_３、８）－ＳＨ、９）－ＳＲ^１、１０）－ＣＮ、１１）－ＮＯ_２、１２）－ＮＨ_２、１３）ＮＨＲ^１、１４）－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、１５）－Ｌ－ＮＨ_２、１６）－Ｌ－ＮＨＲ^１、１７）－Ｌ－Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、１８）－Ｌ－ＳＲ^１、１９）－Ｌ－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、２０）－Ｌ－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、２１）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、２２）－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１、２３）－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、２４）－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１、２５）－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、２６）－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１、２７）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、２８）－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ^１、２９）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１、３０）－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ_２、３１）－ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、３２）－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、３３）－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^１、３４）－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１、３５）－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、３６）－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、３７）－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、３８）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、３９）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１、４０）－ＮＲ^１Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、４１）－ＮＨＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、４２）－ＮＲ^１Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、４３）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ_２、４４）－Ｓ（Ｏ）_２ＮＨＲ^１、４５）－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^１）Ｒ^１、４６）－Ｓ（Ｏ）Ｒ^１、４７）－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^１、４８）－ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、４９）－Ｓ（Ｏ）_２ＯＲ^１、５０）－ベンジル、５１）－Ｎ_３、または５２）－Ｃ（－Ｎ＝Ｎ－）（ＣＦ_３）である。この一覧において、ベンジル基は、場合により１つ、２つ、または３つのＲ^ＡまたはＲ^１置換基で置換される。

【0042】

ｍは１～６の整数であり得、ｍが２以上である場合、Ｘ_ｉは同一または異なり、各々独立してＮＲ^１、ＣＨ_２、Ｏ、またはＳであり、ここでＲ^１は上記で定義されるとおりであり、Ｌ_ｉは同一または異なり、各々独立して上記で定義されるようなＬである。

【0043】

Ｒ^３及びＲ^４は同一でも異なっていてもよく、各々独立して、Ｈ、上記で定義されるようなＲ^１であるか、またはＮと一緒になって３～７員環を形成し、場合によりＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上の他のヘテロ原子を含み、場合により環は１つ以上のＲ^１またはＲ^Ａで置換される。

【0044】

いくつかの実施形態では、ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物は、下記に示す一般式ＩＩＡを有し得る。

【化2】

（式中、Ｒ^１、Ｗ、及びＲ^２は各々上記で定義されている）

【0045】

いくつかの実施形態では、ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物は、下記に示す一般式ＩＩＢを有し得る。

【化3】

（式中、Ｗ及びＲ^２は各々上記で定義されており、Ｈｅｔは、上記で定義されるように、場合により１つ以上のＲ^１またはＲ^Ａで置換された３～７員の複素環である）

【0046】

いくつかの実施形態では、ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物は、下記に示す一般式ＩＩＡＡを有し得る。

【化4】

（式中、Ｒ^１ｉはＲ^１であり、各々上記で定義されている）
いくつかの実施形態では、ピリミド［４，５－ｂ］インドール化合物は、下記に示す一般式ＩＩＢＢを有し得る。

【化5】

（式中、Ｈｅｔは上記で定義されるとおりである）

【0047】

式ＩＩＡＡ及びＩＩＢＢにおいて、Ｗ_ｉ基及びＲ^２ｉ基は、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＲ^Ｐ、－ＳＨ、－ＳＲ^Ｐ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ^Ｐ、－ＣＯＮＨＲ^Ｐ、－ＣＯＮＲＲ^Ｐ、－Ｒ^Ｐ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^Ｐ、－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｒ^Ｐ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ^Ｐ、－ＮＲ^ＰＲ^Ｑ、ハロ、－ＣＮ、及び－ＮＯ_２からなる群より独立して選択され得、ここで、各－Ｒ^Ｎは独立してアルキルであり、－Ｒ^Ｐ及び－Ｒ^Ｑの各々は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから独立して選択されるか、または－Ｒ^Ｐ及び－Ｒ^Ｑは、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式環を形成し得る。アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、及びアリール基は、各々場合により置換され得る。

【0048】

いくつかの実施形態では、－Ｒ^Ｐ及び－Ｒ^Ｑの各々は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_３～１０シクロアルキル、Ｃ_４～１２ヘテロシクリル、及びＣ_６～１０アリールから独立して選択され得る。アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、及びアリール基は、各々場合により置換され得る。

【0049】

いくつかの実施形態では、各－Ｒ^ＮはＣ_１～６アルキルである。

【0050】

いくつかの実施形態では、各－Ｒ^Ｎはメチルである。

【0051】

好ましくは、式ＩＩＡＡ及びＩＩＢＢの各々における置換基Ｒ^２ｉは、独立して、Ｈ及び－Ｒ^Ｐから選択され、より好ましくは、Ｒ^Ｐは、場合により置換されたアルキルまたはアリール、例えば場合により置換されたアルキル、例えば場合により置換されたＣ_１～６アルキルである。

【0052】

好ましくは、式ＩＩＡＡ及びＩＩＢＢの各々における置換基Ｗ_ｉは、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ^Ｐ、－ＮＲ^ＰＲ^Ｑ、及び－Ｒ^Ｐから独立して選択され、例えば－ＮＨＲ^Ｐ及び－ＮＲ^ＰＲ^Ｑから選択される。

【0053】

いくつかの実施形態では、Ｗ_ｉは－ＮＨＲ^Ｐである。

【0054】

いくつかの実施形態では、Ｗ_ｉは３－ピペリジン－１－イルプロピルアミノまたは４－Ｎ－シクロヘキサン－１，４－ジアミンである。

【0055】

いくつかの実施形態では、Ｒ^２ｉは－Ｈ及びベンジルから選択される。

【0056】

式ＩＩＡＡにおいて、置換基Ｒ^１ｉは、好ましくはアルキル、例えばＣ_１～６アルキル、例えばメチルである。アルキル基は、場合により置換され得る。

【0057】

式ＩＩＡＡにおいて、置換基Ｒ^２ｉは好ましくは－Ｈである。

【0058】

式ＩＩＢＢにおいて、置換基Ｒ^２ｉは好ましくは－Ｒ^Ｐであり、より好ましくは、－Ｒ^Ｐは、場合により置換されたアルキルまたはアリールであり、例えば場合により置換されたアルキル、例えば場合により置換されたＣ_１～６アルキルである。

【0059】

式ＩＩＢＢにおいて、置換基Ｈｅｔは、好ましくはテトラゾール－５－イルなどのテトラゾリルである。テトラゾリル基は、場合により置換されてもよく、例えばメチルで置換されてもよい。

【0060】

任意選択の置換基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、－ＯＨ、－ＯＲ^Ｓ、－ＳＨ、－ＳＲ^Ｓ、－ＣＯＯＨ、
－ＣＯＯＲ^Ｓ、－ＣＯＮＨＲ^Ｓ、－ＣＯＮＲ^ＳＲ^Ｔ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^Ｓ、－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｒ^Ｓ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ^Ｓ、－ＮＲ^ＳＲ^Ｔ、ハロ、－ＣＮ、及び－ＮＯ_２から選択され得、ここで、－Ｒ^Ｎは独立してアルキルであり、－Ｒ^Ｓ及び－Ｒ^Ｔの各々は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから独立して選択されるか、または－Ｒ^Ｓ及び－Ｒ^Ｔは、それらが結合している窒素と一緒になって複素環式基を形成し得る。

【0061】

上述の任意選択の置換基は、典型的には炭素に対する置換基である。基が窒素原子、例えばヘテロシクリル基またはアリール基内の環窒素原子を含む場合、その窒素は、場合によりアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、－ＣＯＨ、－ＣＯＲ^Ｓ、－ＣＯＮＨＲ^Ｓ、－ＣＯＮＲ^ＳＲ^Ｔ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^Ｓ、及び－ＮＲ^ＮＣ（Ｏ）Ｒ^Ｓで置換されてもよく、ここで－Ｒ^Ｎ、－Ｒ^Ｓ、及び－Ｒ^Ｔは、上記で定義されるとおりである。

【0062】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する分枝状及び直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図され、例えば、Ｃ_１～６アルキルのＣ_１～６は、直鎖状または分枝状の飽和配置で１、２、３、４、５、または６個の炭素を有する基を含むものとして定義される。上記で定義されるようなＣ_１～６アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ｉ－ブチル、ペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は、場合により置換されてもよい。

【0063】

本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する単環式の飽和脂肪族炭化水素基を意味することが意図され、例えば、Ｃ_３～７シクロアルキルのＣ_３～７は、単環式の飽和配置で３、４、５、６、または７個の炭素を有する基を含むものとして定義される。上記で定義されるようなＣ_３～７シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチルが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は、場合により置換されてもよい。

【0064】

本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、その中に指定された数の炭素原子を有し、炭素原子のうちの少なくとも２個が二重結合によって互いに結合し、ＥまたはＺのいずれかの位置化学及びそれらの組み合わせを有する不飽和の直鎖状または分枝状鎖炭化水素基を意味することが意図されている。例えば、Ｃ_２～６アルケニルのＣ_２～６は、直鎖状または分枝状に配置された２、３、４、５または６個の炭素を有し、炭素原子の少なくとも２個が二重結合により一緒に結合している基を含むものとして定義される。上記で定義したＣ_２～６アルケニルの例としては、エテニル（ビニル）、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、その中に指定された数の炭素原子を有し、少なくとも２個の炭素原子が三重結合により一緒に結合している不飽和の直鎖状炭化水素基を意味することが意図されている。例えば、Ｃ_２～４アルキニルは、鎖内に２、３、または４個の炭素原子を有し、炭素原子のうちの少なくとも２個が三重結合により一緒に結合している基を含むものとして定義される。このようなアルキニルの例としては、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

本明細書で使用される「シクロアルケニル」という用語は、その中に指定された数の炭素原子を有し、炭素原子のうちの少なくとも２個が二重結合によって互いに結合している単環式の不飽和炭化水素基を意味することが意図されている。例えば、Ｃ_３～７シクロアルケニルのＣ_３～７とは、単環式配置で３、４、５、６、または７個の炭素を有し、炭素原子のうちの少なくとも２個が二重結合により一緒に結合している基を含むものとして定義される。上記で定義されるようなＣ_３～７シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味することが意図される。

【0068】

本明細書で使用される「アリール」という用語は、単独でまたは別のラジカルとの組み合わせで芳香族、飽和または不飽和であり得る第２の５員または６員の炭素環式基にさらに縮合し得る６個の炭素原子を含む炭素環式の芳香族単環式基を意味する。アリールの例としては、フェニル、インダニル、１－ナフチル、２－ナフチル、テトラヒドロナフチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アリールは、シクロアルキル環または芳香族環上の好適な位置のいずれかで別の基と接続してもよい。アリール基は、場合により置換されてもよい。

【0069】

本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、１０個までの原子の単環式または二環式環系を意味することが意図され、少なくとも１つの環が芳香族であり、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１～４個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリールは、環炭素原子またはヘテロ原子のうちの１個のいずれかを介して結合し得る。ヘテロアリールの例としては、チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾ［ｂ］チエニル、フリル、ベンゾフラニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ－インドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ－キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル、イソチアゾリル、イソクロマニル、クロマニル、イソオキサゾリル、フラザニル、インドリニル、イソインドリニル、チアゾロ［４，５－ｂ］－ピリジン、テトラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チエニル、及びフルオレセイン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、場合により置換されてもよい。

【0070】

本明細書で使用される「複素環」、「複素環式」、または「ヘテロシクリル」という用語は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含む３、４、５、６または７員非芳香族環系を意味することが意図されている。複素環の例としては、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジル、３，５－ジメチルピペリジル、ピロリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニルなどが挙げられるが、これらに限定されず、環への結合は、環の窒素原子上または炭素原子上のいずれかであり得る。ヘテロシクリル基は、場合により置換されてもよい。

【0071】

本明細書で使用される「場合により１つ以上の置換基で置換された」という用語、またはそれに相当する「場合により少なくとも１つの置換基で置換された」という用語は、その後に記載される状況の事象が生じる場合も生じない場合もあること、そして、その記載がその事象または状況が生じる場合及び生じない場合を含むことを意味することが意図されている。この定義は、０～５つの置換基を意味することが意図されている。

【0072】

いくつかの好ましい実施形態では、ピリミドインドール化合物は、メチル４－（３－ピペリジン－１－イルプロピルアミノ）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－７－カルボキシレート（ＣＡＳ １４４８７２３－６０－１；ＵＭ７２９）である。

【化6】

【0073】

他の実施形態では、ピリミドインドール化合物は、（１Ｒ，４Ｒ）－Ｎ１－（２－ベンジル－７－（２－メチル－２Ｈ－テトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル）シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＣＡＳ：１４４８７２４－０９－１；ＵＭ１７１）である。

【化7】

【0074】

ピリミドインドール化合物の調製は、ＵＳ１０３３６７４７Ｂ２及びＷＯ２０１３１１０１９８に記載されており、その内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0075】

この化合物は、その塩、プロドラッグ、溶媒和物、及び結晶形態として提供され、使用され得る。

【0076】

この化合物の塩の例としては、例えば、ＨＣＩ塩及びＨＢｒ塩などの強鉱酸の酸付加塩、ならびにメタンスルホン酸塩などの強有機酸の付加塩が挙げられるがこれらに限定されない、薬学的に許容されるすべての塩が挙げられる。塩のさらなる例としては、硫酸塩及び酢酸塩、例えば酢酸塩自体、トリフルオロ酢酸塩、またはトリクロロ酢酸塩が挙げられる。

【0077】

溶媒和物の例としては、一水和物などの水和物が挙げられる。

【0078】

造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、ＯＰ９－Ｄｌ４間質細胞などの間質細胞、フィーダー細胞、または血清の非存在下で、本明細書に記載されるように前駆Ｔ細胞へと分化し得る。

【0079】

リンパ球増大培地（本明細書での別称：リンパ球前駆培地または第４段階培地）は、ＨＰＣが前駆Ｔ細胞へとリンパ球分化するのを促進する細胞培養基である。

【0080】

好適なリンパ系増大培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／または媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｖ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、リンパ系増大培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ及びＩＬ－７を含み得る。

【0081】

好ましい実施形態では、リンパ系増大培地は既知組成培地である。例えば、リンパ系増大培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なリンパ系増大培地は、当技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）リンパ系増大サプリメント（カタログ番号９９１５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を含む。

【0082】

リンパ球増大培地には、分化した集団における前駆Ｔ細胞の割合を増加させ、及び／または前駆Ｔ細胞の集団の増大を高めるのに有効な量のピリミドインドール化合物が補充され得る。例えば、０．１μＭ以上、０．２５μＭ以上、０．５μＭ以上、または１μＭ以上の濃度のピリミドインドール化合物が培地に補充され得る。

【0083】

いくつかの実施形態では、リンパ球増大培地には、その中で培養された細胞に細胞傷害性効果を及ぼすには不十分である量のピリミドインドール化合物が補充され得る。例えば、１０μＭ未満、７．５μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、または２μＭ未満の濃度が培地に補充され得る。例えば、培地には１μＭ以下の濃度のピリミドインドール化合物が補充され得る。いくつかの好ましい実施形態では、リンパ球増大培地には、０．１μＭ～１０μＭ、０．１μＭ～５μＭ、または０．１μＭ～２μＭのピリミドインドール化合物、好ましくは０．２５μＭ～５μＭまたは０．２５μＭ～２μＭのピリミドインドール化合物が補充され得る。

【0084】

例えば、リンパ球増大培地には、ＵＭ７２９が５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、または２μＭ以下、例えば１μＭ以下の濃度で補充され得る。いくつかの好ましい実施形態では、リンパ球増大培地には、０．１μＭ～２μＭ、好ましくは０．２５μＭ～２μＭのＵＭ７２９が補充され得る。リンパ球増大培地には、ＵＭ１７１が１μＭ以下または０．５μＭ以下、例えば０．２５μＭ以下の濃度で補充され得る。いくつかの好ましい実施形態では、リンパ球増大培地には０．０１μＭ～０．２５μＭの濃度のＵＭ１７１、好ましくは０．０４μＭ～０．２５μＭの濃度のＵＭ１７１が補充され得る。

【0085】

例えば、前駆Ｔ細胞、例えば第４段階（ＣＤ７＋、ＣＤ５＋）のものが、（例えば、リンパ球増大培地への補充としての）ピリミドインドール化合物の存在下で、少なくとも７日間増大され得る。いくつかの実施形態では、第４段階における前駆Ｔ細胞の増大は、少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、４２日間、４９日間、５６日間、または６３日間である。

【0086】

いくつかの実施形態では、増大後の後続の分化段階において、細胞は、ピリミドインドール化合物の非存在下で培養される（例えば、培養基にはピリミドインドール化合物が補充されなくてもよい）。いくつかの実施形態では、細胞は、第５段階でピリミドインドール化合物の非存在下で培養される。

【0087】

ＨＰＣは、前駆Ｔ細胞への分化中に表面上で培養され得る。例えば、ＨＰＣは、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。

【0088】

好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。

【0089】

表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、もしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを含み、細胞外マトリックスタンパク質または細胞表面接着タンパク質を含まないコーティングを有し得る。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンド、ビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及びＶＣＡＭ１などの細胞表面接着タンパク質を含むコーティングを有し得る。表面は、表面をコーティング溶液と接触させることにより、細胞外マトリックスタンパク質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、及び細胞表面接着タンパク質でコーティングされ得る。例えば、コーティング溶液は、表面をコーティングするために好適な条件下で、表面上でインキュベートされ得る。条件は、例えば、室温で約２時間を含み得る。細胞外マトリックスタンパク質及びＮｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子を含むコーティング溶液は、商業的供給者から入手可能である（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系分化コーティング材料；カタログ番号９９２５；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）。

【0091】

ＨＰＣは、基質上のリンパ系増大培地で、ＨＰＣを前駆Ｔ細胞へと分化させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、ＨＰＣは、２～６週間、２～５週間、または２～４週間、好ましくは３週間培養され得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣは、リンパ球増大培地で２１～２６日間培養され得る。例えば、ＨＰＣは、リンパ球増大培地で分化プロトコルの１６日目から３７～４２日目のいずれか１つまで培養され得る。

【0092】

本明細書に記載されるように、ＨＰＣを、ピリミドインドール化合物の存在下で、リンパ球増大培地で培養することにより生産される細胞の集団は、ピリミドインドール化合物の非存在下で生産される集団と比較して、前駆Ｔ細胞、例えばＣＤ５及びＣＤ７を発現するＴ細胞の割合が増加し得る。例えば、ピリミドインドール化合物を用いて生産される集団における前駆Ｔ細胞の割合は、ピリミドインドール化合物なしで生産される集団における前駆Ｔ細胞の割合よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い可能性がある。

【0093】

いくつかの実施形態では、集団におけるＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ５－リンパ球（ＣＬＰ）の量または割合も、ＵＭ１７１などのピリミドインドール化合物の存在下で、リンパ球増大培地でＨＰＣを培養することにより増加し得る。ＨＰＣを、ＵＭ１７１などのピリミドインドール化合物の存在下で、リンパ球増大培地で培養することにより生産される細胞の集団は、ピリミドインドール化合物の非存在下で生産される集団と比較して、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ５－リンパ球（ＣＬＰ）の割合が増加し得る。ピリミドインドール化合物を用いて生産される集団におけるＣＬＰの割合は、ピリミドインドール化合物なしで生産される集団におけるＣＬＰの割合よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％高い可能性がある。

【0094】

本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される前駆Ｔ細胞を生産する方法に使用するための造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団を提供することをさらに含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＣは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からｉｎ ｖｉｔｒｏで生産される。

【0095】

例えば、前駆Ｔ細胞の集団は、
（ｉ）ｉＰＳＣの集団をＨＰＣへと分化させることと、
（ｉｉ）ＨＰＣを、ピリミドインドール化合物の存在下でＴ細胞前駆細胞へと分化させることとを含む方法により、生産することができる。

【0096】

場合により、方法はさらに、（ｉｉｉ）前駆Ｔ細胞の集団をピリミドインドール化合物の存在下で培養することにより、前駆Ｔ細胞の集団を増大させることを含み得る。

【0097】

ｉＰＳ細胞は、中胚葉段階及び造血性内皮段階を含む３段階プロセスを用いて、ＨＰＣへと分化し得る。例えば、ある方法は、
（ｉ）ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させることと、
（ｉｉ）中胚葉細胞を造血内皮細胞へと分化させることと、
（ｉｉｉ）造血内皮細胞をＨＰＣの集団へと分化させることとを含み得る。

【0098】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、非多能性の完全に分化したドナーまたは前駆体細胞に由来する多能性細胞である。ｉＰＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己複製可能であり、未分化表現型を呈し、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のいずれかの胎児または成体細胞型へと分化できる可能性がある。ｉＰＳＣの集団はクローン性、すなわち、単一の共通祖先細胞の子孫である遺伝的に同一の細胞であり得る。

【0099】

ｉＰＳＣは、次の多能性関連マーカー：ＰＯＵ５ｆ１（Ｏｃｔ４）、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、ＫＬＦ４及びｃ－ｍｙｃのうちの１つ以上、好ましくはＰＯＵ５ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のうちの１つ以上を発現し得る。ｉＰＳＣは、Ｂｒａ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１及びＣＤＸ２など、特定の分化運命に関連するマーカーを欠いている場合がある。特に、ｉＰＳＣは、内胚葉運命に関連するマーカーを欠いている場合がある。

【0100】

好ましくは、ｉＰＳＣはヒトＩＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。

【0101】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ遺伝子または免疫原性もしくはＧＶＨＤに関連する他の遺伝子を不活性化または欠失させるために遺伝子編集されてもよく、例えばＴＣＲ、ＣＡＲ、またはＮＫＣＲなどの外因性抗原受容体をコードする核酸を含むように遺伝子編集されてもよい。

【0102】

ＩＰＳＣは、ドナー個体などの供給源から取得された体細胞または他の前駆体細胞であり得るドナー細胞に由来するか、またはドナー細胞からリプログラミングされ得る。ドナー細胞は、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞であり得る。好適なドナー細胞としては、成人線維芽細胞及び血液細胞、例えばＨＰＣまたは単核細胞などの末梢血細胞が挙げられる。

【0103】

本明細書に記載されるようにｉＰＳＣへとリプログラミングするために好適なドナー細胞は、ドナー個体から取得され得る。いくつかの実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載されるような生産の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体と同じ人物であり得る（自己由来処置）。他の実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載されるような生産の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体とは異なる人物であり得る（同種異系処置）。例えば、ドナー個体は、がんを患うレシピエント個体とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する（ドネーションの前か後かを問わない）健康な個体であり得る。他の実施形態では、ドナー個体は、レシピエント個体とＨＬＡが適合しなくてもよい。好ましくは、ドナー個体は新生児（新生子）であり得、例えば、ドナー細胞は、臍帯血のサンプルから取得され得る。

【0104】

好適なドナー個体は、好ましくは、伝染性ウイルス（例えばＨＩＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ）及び外来性作用因子（例えば細菌、マイコプラズマ）を有せず、既知の遺伝子異常を有しない。

【0105】

いくつかの実施形態では、リプログラミングのためのＨＰＣなどの末梢血細胞の集団は、ドナー個体から取得された血液サンプル、好ましくは臍帯サンプルから単離され得る。ＨＰＣ及び他の末梢血細胞の単離のための好適な方法は、当技術分野で周知であり、例えば、磁気活性化細胞選別（例えば、Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８６ ９０ １７９を参照のこと）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Ｒｈｅｉｎｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９７９ ７６ ４０６１を参照のこと）、及び細胞パニング（例えば、Ｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８２ ７２ １２２を参照のこと）を含む。ＨＰＣは、血液細胞のサンプル中で、ＣＤ３４の発現によって同定され得る。他の実施形態では、リプログラミングのための線維芽細胞の集団は、コラゲナーゼまたはトリプシンを使用した分散及び適切な細胞培養条件での増殖後の皮膚生検から単離され得る。

【0106】

いくつかの実施形態では、ＩＰＳＣは、抗原特異的Ｔ細胞に由来し得る。例えば、Ｔ細胞は、クラス１のＭＨＣと複合体を形成して提示される、腫瘍抗原などの抗原に結合するαβＴＣＲをコードする核酸を含み得る。ｉＰＳＣの生成に使用される抗原特異的Ｔ細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチドエピトープを有する多様なＴ細胞集団をスクリーニングすることによって、またはがん患者の腫瘍サンプルから単離することによって取得され得る。

【0107】

ドナー細胞は、典型的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４などのリプログラミング因子を細胞に導入することによってｉＰＳＣにリプログラミングされる。リプログラミング因子は、タンパク質でもコード核酸でもよく、プラスミド、トランスポゾン、またはより好ましくはウイルストランスフェクションもしくは直接タンパク質送達を含む任意の好適な技法によって、分化細胞に導入され得る。他のリプログラミング因子、例えば、Ｋｌｆ－１、Ｋｌｆ－２、Ｋｌｆ－４及びＫｌｆ－５などのＫｌｆ遺伝子；Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ及びＮ－ｍｙｃなどのＭｙｃ遺伝子；Ｎａｎｏｇ；ＳＶ４０ラージＴ抗原；Ｌｉｎ２８；ならびにｐ５３などの遺伝子を標的とする低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）も、誘導効率を高めるために細胞に導入され得る。リプログラミング因子の導入後、ドナー細胞が培養され得る。多能性マーカーを発現する細胞は、ｉＰＳＣの集団を生産するために単離及び／または精製され得る。ｉＰＳＣの生産のための技法は当技術分野で周知である（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４４８：３１３－７、Ｙａｍａｎａｋａ ６ ２００７ Ｊｕｎ ７；１（１）：３９－４９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１－６、Ｋｉｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４７２－６、Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９．９９９９（９９９Ａ）：ｐ．Ｎ／Ａ、Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ． ２０１６ Ａｕｇ；１２（４）：３９４－４２０、Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５（４），６４７－６５９）。

【0108】

ｉＰＳＣの培養及び維持のためには、従来の技術を用いることができる（Ｖａｌｌｉｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．２７５，４０３－４２１（２００４）、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３－１３５６（２００４）、Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４，２３０－２３５（２００６）Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１６３６－１６４１（２００５）、Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１８５－１８７（２００６））。本件の方法で使用するＩＰＳＣは、規定の条件下またはフィーダー細胞上で成長させることができる。例えば、ｉＰＳＣは、培養ディッシュにおいて、適切な密度（例えば１０^５～１０^６細胞／６０ｍｍディッシュ）で、照射されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞層上で、または適切な基質において、フィーダー馴化済みもしくは定義されたｉＰＳＣ維持培地で、従来どおりに培養され得る。本件の方法で使用するｉＰＳＣは、酵素的または機械的手段によって継代され得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ（商標）１もしくはｍＴｅＳＲ（商標）２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥ８ ｆｌｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｈｅｒｍｏ）培養培地などのｉＰＳＣ維持培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはビトロネクチンなどのＥＣＭタンパク質上で継代され得る。

【0109】

本明細書に記載される方法の工程における細胞集団の分化及び成熟は、分化因子のセットを補充した培養培地で細胞を培養することによって誘導される。各培養培地について挙げられる分化因子のセットは、好ましくは網羅的であり、培地は他の分化因子を欠いていてもよい。好ましい実施形態では、培養培地は既知組成培地である。例えば、培養培地は、後述するように、有効量の１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。既知組成栄養培地は、１つ以上の無血清培養培地サプリメントを補充した基本培地を含み得る。

【0110】

分化因子は、哺乳動物細胞の分化を媒介するシグナル伝達経路を調整、例えば促進または阻害する因子である。分化因子は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、もしくはＢＭＰ、またはこれらのシグナル伝達経路のうちの１つ以上を調整する成長因子、サイトカイン、及び小分子を含み得る。分化因子の例としては、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、レチノイン酸、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＧＦβリガンド、ＧＤＦ、ＬＩＦ、インターロイキン、ＧＳＫ－３阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤が挙げられる。

【0111】

本明細書に記載される培地のうちの１つ以上で使用される分化因子には、ＴＧＦβリガンド、例えばアクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ－９９０２１）、インターロイキン、ならびにＩＧＦ－１及びアンギオテンシンＩＩなどのホルモンが含まれる。分化因子は、培地で培養される細胞におけるシグナル伝達経路を調整するのに有効な量で、本明細書に記載される培地に存在し得る。

【0112】

いくつかの実施形態では、培養培地中の、上記または下記に挙げる分化因子を、同じシグナル伝達経路に対して同じ効果（すなわち刺激または阻害）を及ぼす因子によって置き換えてもよい。好適な因子は、当技術分野で公知であり、タンパク質、核酸、抗体、及び小分子を含む。

【0113】

各工程中の細胞集団の分化の程度は、分化中の細胞の集団における１つ以上の細胞マーカーの発現をモニター及び／または検出することによって決定され得る。例えば、分化度の高い細胞型に特徴的なマーカーの発現の増加、または分化度の低い細胞型に特徴的なマーカーの発現の減少が決定され得る。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学、免疫蛍光、ＲＴ－ＰＣＲ、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び酵素分析を含む任意の好適な技法によって決定され得る。好ましい実施形態では、マーカーが細胞表面上で検出可能であれば、細胞はマーカーを発現すると言える。例えば、本明細書においてマーカーを発現しないと記載される細胞は、マーカー遺伝子の活発な転写及び細胞内発現を示す可能性があるが、細胞の表面に検出可能なレベルのマーカーは存在しない可能性がある。

【0114】

本明細書に記載される方法の工程によって生産される、部分的に分化した細胞の集団、例えば中胚葉細胞、造血内皮細胞（ＨＥ、すなわちｈａｅｍｏｇｅｎｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌまたはＨＥＣ）、ＨＰＣ、またはＴ細胞前駆体の集団は、次の分化工程の前に、培養、維持、または増大され得る。部分的に分化した細胞は、任意の簡便な技法によって増大させることができる。

【0115】

各工程の後に、その工程により生産される部分的に分化した細胞の集団は、他の細胞型を含まないか、または実質的に含まない可能性がある。例えば、培地で培養した後、この集団は６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の部分的に分化した細胞を含み得る。好ましくは、細胞の集団は、精製が必要とされない程度に他の細胞型を含まない。必要な場合、部分的に分化した細胞の集団は、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳなどの任意の簡便な技法によって精製することができる。

【0116】

細胞は、フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた表面または基質上で、フィーダー細胞の非存在下で単層において培養され得る。細胞培養に好適な技法は当技術分野で周知である（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５ Ｏｃｔ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９ Ｄｅｃ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ（２ Ａｕｇ ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３、Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０－５２、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ｅｄ．Ｒ．Ｌａｎｚａ）ＩＳＢＮ：０１２４３６６４３０）Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９７）、‘Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’ｂｙ Ａ．Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）、‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ’ｂｙ Ａ．Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｍ．Ｒａｏ（２００３）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ’ｂｙ Ａ．Ｂｏｎｇｓｏ（２００５）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＆Ｌｏｒｉｎｇ（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｕａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ（２００６）を参照のこと）。培地及びその成分は、商業的供給源（例えばＧｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から取得され得る。上記の培養工程では、標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、５％または２１％の酸素、５％の二酸化炭素を用いることができる。培地は２日おきに交換し、細胞を重力によって沈降させることが好ましい。

【0117】

細胞は培養容器内で培養され得る。好適な細胞培養容器は、当技術分野で周知であり、培養プレート、ディッシュ、フラスコ、バイオリアクター、及びマルチウェルプレート、例えば６ウェル、１２ウェル、または９６ウェルプレートを含む。

【0118】

培養容器は、例えば、フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質で容器の１つ以上の表面をコーティングすることによって、組織培養のために処理されることが好ましい。培養容器は、標準的技法を使用して、例えば本明細書に記載されるコーティング溶液と共にインキュベートすることによって組織培養のために処理してもよく、または商業的供給者から前処理されたものを取得してもよい。

【0119】

第１段階では、中胚葉分化を促進する好適な条件下でｉＰＳＣの集団を培養することにより、ｉＰＳＣが中胚葉細胞へと分化し得る。例えば、中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地でｉＰＳＣ細胞を順次培養してもよい。

【0120】

好適な第１の中胚葉誘導培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３、及び／またはＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。例えば、第１の中胚葉誘導培地はアクチビンを含み得る。

【0121】

好適な第２の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し得る。例えば、第２の中胚葉誘導培地は、アクチビン、好ましくはアクチビンＡ、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、及びＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦを含み得る。

【0122】

好適な第３の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害し得る。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、アクチビン、好ましくはアクチビンＡ、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。

【0123】

第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は、上記の分化因子以外の分化因子を欠いていてもよい。

【0124】

ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３、及び／またはＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介細胞内シグナル伝達経路は、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第１のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。第１のＴＧＦβリガンドはアクチビンであり得る。アクチビン（アクチビンＡ：ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６２４核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２ ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１ ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路の刺激を介して様々な細胞効果を及ぼす二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１８：４４９５－４５０９（２００５））。アクチビンは、商業的供給源（例えばＳｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される培地中のアクチビンの濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５～５０ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0125】

第２及び第３の中胚葉誘導培地の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性は、培地中の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の存在によって提供され得る。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することによって細胞の成長、増殖、及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。好適な線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＦＧＦ１～ＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３のいずれか１つを含む。好ましくは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２（別称ｂＦＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、ＦＧＦ７（別称ケラチノサイト成長因子（またはＫＧＦ）、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、またはＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子はＦＧＦ２である。

【0126】

好都合なことに、本明細書に記載される培地中のＦＧＦ２などのＦＧＦの濃度は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子は、慣例的な組換え技法を使用して生産するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。

【0127】

ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９媒介細胞内シグナル伝達経路は、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第２のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。

【0128】

第２のＴＧＦβリガンドは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）であり得る。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９によって媒介される経路を通じて細胞内シグナル伝達を刺激する。好適な骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰファミリーのいずれかのメンバー、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７を含む。好ましくは、第２のＴＧＦβリガンドは、ＢＭＰ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５０、核酸配列ＮＭ＿００１２００．２ ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１ ＧＩ：４５５７３６９）またはＢＭＰ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５２、核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３ ＧＩ：１５７２７６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２ ＧＩ：１５７２７６５９３）である。好適なＢＭＰはＢＭＰ４を含む。好都合なことに、本明細書に記載される培地中のＢＭＰ２またはＢＭＰ４などの骨形態形成タンパク質の濃度は、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。ＢＭＰは、慣例的な組換え技法を使用して生産するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。

【0129】

第３の中胚葉誘導培地中のＧＳＫ３β阻害活性は、培地中のＧＳＫ３β阻害剤の存在によって提供され得る。ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（遺伝子ＩＤ ２９３２：ＥＣ２．７．１１．２６）の活性を阻害する。好ましい阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの活性を特異的に阻害する。好適な阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６－（（２－（（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル；Ｒｉｎｇ Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５８８－５９５（２００３））アルステルパウロン、ケンパウロン、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ｊａｎ；１０（１）：５５－６３）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、リチウム及びＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；Ｃｏｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；７（１０）：７９３－８０３）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。好適なグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤は、商業的供給者（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＭＩ ＵＳＡ；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，ＭＡ ＵＳＡ）から取得することができる。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、０．１～１００μＭ、好ましくは約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤を含み得る。

【0130】

好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は既知組成培地である。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充した既知組成栄養培地からなることができ、第２の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦとを補充した既知組成栄養培地からなることができ、第３の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ－９９０２１、例えば１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１とを補った既知組成栄養培地からなることができる。

【0131】

既知組成培地（ＣＤＭ）は、特定の成分、好ましくは既知の化学構造をもつ成分のみを含む、細胞を培養するための栄養溶液である。ＣＤＭは、未定義の構成要素または構成成分、例えばフィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン、及びマトリゲル（商標）などの複雑な細胞外マトリックスを欠いている。例えば、ＣＤＭは、ＤＬＬ１またはＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９細胞のような間質細胞を含まない。

【0132】

ＣＤＭまたは既知組成栄養培地は、既知組成基本培地を含み得る。好適な既知組成基本培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、改良されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ（２００３），２５ ３－６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１３９－１４２（１９７４））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ．３，５０３－５０８）、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。

【0133】

基本培地は、培地中に無血清培養培地サプリメント及び／または追加の成分を補充してもよい。好適なサプリメント及び追加の成分は上述されており、Ｌ－グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）などの代替物、アスコルビン酸、モノチオールグリセロール（ＭＴＧ）、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質、ヒト血清アルブミン、例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｉｇｍａ）及びＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（商標）（ａｌｂｕｍｅｄｉｘ．ｃｏｍ）などの組換えヒト血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、ならびに２－メルカプトエタノールを含み得る。基本培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの血清代替物を補充してもよい。

【0134】

ｉＰＳＣは、中胚葉細胞の集団を生産するために、第１の中胚葉誘導培地で１～１２時間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間のいずれか、好ましくは約４時間培養され、次いで第２の中胚葉誘導培地で３０～５４時間、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０時間のいずれか、好ましくは約４４時間培養され、次いで第３の中胚葉誘導培地で３６～６０時間、例えば３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３時間のいずれか、好ましくは約４８時間培養され得る。

【0135】

中胚葉細胞は、中胚葉系列に傾倒している部分的に分化した前駆細胞であり、適切な条件下で間葉（線維芽細胞）、筋肉、骨、脂肪、血管、及び造血系のすべての細胞型へと分化できる。中胚葉細胞は、１つ以上の中胚葉マーカーを発現し得る。例えば、中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６及びＰＤＧＦαＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つすべてを発現し得る。

【0136】

第２段階では、ＨＥ分化を促進する好適な条件下で中胚葉細胞の集団を培養することにより、中胚葉細胞が造血性内皮（ＨＥ）細胞へと分化し得る。例えば、中胚葉細胞は、ＨＥ誘導培地で培養され得る。

【0137】

好適なＨＥ誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激する。例えば、ＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ及びＶＥＧＦを含み得る。

【0138】

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ受容体に結合し、脈管形成及び血管新生を刺激するＰＤＧＦファミリーのタンパク質因子である。好適なＶＥＧＦは、ＶＥＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＶＥＧＦ－Ａ～ＶＥＧＦ－Ｄ及びＰＩＧＦのうちのいずれか１つを含む。好ましくは、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ（別称ＶＥＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４２２、核酸配列ＮＭ＿００１０２５３６６．２、アミノ酸配列ＮＰ＿００１０２０５３７．２）である。好ましくは、ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）及び／またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）媒介シグナル伝達経路である。ＶＥＧＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載されるＨＥ誘導培地中のＶＥＧＦの濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0139】

ＨＥ誘導培地のいくつかの例では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ（またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１））及び／またはＶＥＧＦＲ（またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１））媒介シグナル伝達経路を刺激するＶＥＧＦアクチベーターまたはアゴニストで置き換えることができる。好適なＶＥＧＦアクチベーターは、当技術分野で公知であり、グレムリンなどのタンパク質（Ｍｉｔｏｌａ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１６（１８）３６７７－３６８０）、ｓｈＲＮＡなどの核酸（例えば、Ｔｕｒｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００９ Ｓｅｐ １１；１０５（６）：６０４－９）、ＣＲＩＳＰＲベースのプラスミド（例えば、ＶＥＧＦ ＣＲＩＳＰＲ活性化プラスミド；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、抗体及び小分子を含む。

【0140】

幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ＫＩＴ受容体（ＫＩＴ癌原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ）（ＣＤ１１７；ＳＣＦＲ）に結合するサイトカインであり、造血に関与する。ＳＣＦ（別名ＫＩＴＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４２５４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８９９．５またはＮＭ＿０３９９４．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８９０．１またはＮＰ＿００３９８５．５を有し得る。ＳＣＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載されるＨＥ誘導培地中のＳＣＦの濃度は、１～１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0141】

好ましい実施形態では、ＨＥ誘導培地は既知組成培地である。例えば、ＨＥ誘導培地は、有効量のＶＥＧＦ、例えば１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと、ＳＣＦ、例えば１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦとを補充した既知栄養培地からなり得る。好ましくは、中胚葉細胞は既知栄養培地及び２つの分化因子からなるＨＥ誘導培地で培養され、ここで、この２つの分化因子はＳＣＦ及びＶＥＧＦである。

【0142】

好適な既知栄養培地は上述されており、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または後述するようなアルブミン、インスリン、セレニウムトランスフェリン、及び脂質を補充したＩＭＤＭなどの基礎培地を含む。

【0143】

中胚葉細胞をＨＥ誘導培地で２～６日間、または３～５日間、好ましくは約４日間培養して、ＨＥ細胞の集団を生産することができる。

【0144】

造血内皮（ＨＥ）は、造血潜在能力を有し、適切な条件下で造血系列へと分化することができる、部分的に分化した内皮前駆細胞である。ＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する場合があり、いくつかの実施形態では、ＣＤ７３またはＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、ＨＥ細胞は、表現型ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または表現型ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－を有し得る。

【0145】

第３段階では、造血分化を促進する好適な条件下でＨＥ細胞の集団を培養することにより、造血内皮（ＨＥ）細胞が造血前駆細胞（ＨＰＣ）へと分化し得る。例えば、ＨＥ細胞は造血誘導培地で培養され得る。

【0146】

好適な造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路、好ましくはＶＥＧＦＲ２及び／またはＶＥＧＦＲ２媒介シグナル伝達経路、（ｉｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路、（ｉｖ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路、（ｖ）ＩＧＦ１Ｒ及び／またはＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達経路、（ｖｉ）ＳＭＡＤ１、５及び９及び／またはＳＭＡＤ１、５及び９媒介シグナル伝達経路、（ｖｉｉ）ヘッジホッグ及び／またはヘッジホッグシグナル伝達経路、（ｖｉｉｉ）ＥｐｏＲ及び／またはＥｐｏＲ媒介シグナル伝達経路、ならびに（ｉｘ）ＡＧＴＲ２及び／またはＡＧＴＲ２媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。好適な造血誘導培地はまた、ＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１））及び／またはＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１））媒介シグナル伝達経路も阻害し得る。好適な造血誘導培地は、インターロイキン（ＩＬ）活性及びＦＧＦ活性も有し得る。

【0147】

例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１）アンタゴニストを含み得る。好適な造血誘導培地の一例は、以下の表１に示す第３段階培地である。

【0148】

トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板の生産を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＴＰＯ（別名ＴＨＰＯ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０６６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００４６０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００４５１．１を有し得る。ＴＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＴＰＯの濃度は、３～３００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、または２９０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0149】

Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドまたはＦＬＴ３Ｌ）は、ＦＬＴ３受容体に結合する造血活性を有するサイトカインであり、前駆細胞の増殖及び分化を刺激する。Ｆｌｔ３リガンド（別名ＦＬＴ３ＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３２３）は、参照核酸配列ＮＭ＿００１２０４５０２．２及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１４３１．１を有し得る。Ｆｌｔ３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＦｌｔ３リガンドの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0150】

インターロイキン（ＩＬ）は、免疫の発達及び機能において重要な役割を果たすサイトカインである。造血誘導培地中のＩＬには、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、及びＩＬ－１１が含まれ得る。

【0151】

ＩＬ－３（別名ＩＬ３またはＭＣＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６２）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００５８８．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５７９．２を有し得る。ＩＬ－３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－３の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0152】

ＩＬ－６（別名ＩＬ６またはＨＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６００．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５９１．５を有し得る。ＩＬ－６は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－６の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0153】

ＩＬ－７（別名ＩＬ７、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５７４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８８０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８７１．１を有し得る。ＩＬ－７は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－７の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0154】

ＩＬ－１１（別名ＡＧＩＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５８９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６４１．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６３２．１を有し得る。ＩＬ－１１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－１１リガンドの濃度は、０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0155】

インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）は、チロシンキナーゼＩＧＦ－１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）及びインスリン受容体に結合するホルモンであり、複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＩＧＦ－１（別名ＩＧＦまたはＭＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３４７９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６１８．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６０９．１を有し得る。ＩＧＦ－１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＧＦ－１の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２３、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0156】

ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、脊椎動物の器官形成を調節するヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドである。ＳＨＨ（別名ＴＰＴまたはＨＨＧ１、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００１９３．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００１８４．１を有し得る。ＳＨＨは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＳＨＨの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２３、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0157】

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）に結合する糖タンパク質サイトカインであり、赤血球形成を刺激する。ＥＰＯ（別名ＤＢＡＬ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２０５６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００７９９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００７９０．２を有し得る。ＥＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＥＰＯの濃度は、０．０２～２０Ｕ／ｍｌ、例えば約０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、または１９Ｕ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２Ｕ／ｍｌであり得る。

【0158】

アンギオテンシンＩＩは、アンギオテンシンＩに対するアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用によって形成されるヘプタペプチドホルモンである。アンギオテンシンＩＩは、血管収縮を刺激する。アンギオテンシンＩ及びＩＩは、参照核酸配列ＮＭ＿００００２９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００００２０．１を有し得るアンギオテンシノーゲン（別名ＡＧＴ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１８３）の切断によって形成される。アンギオテンシンＩＩは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｔｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩの濃度は、０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0159】

アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１）アンタゴニスト（ＡＲＢ）は、ＡＴ_１受容体（ＡＧＴＲ１；遺伝子ＩＤ １８５）の活性化を選択的にブロックする化合物である。好適なＡＴ_１アンタゴニストとしては、ロサルタン（２－ブチル－４－クロロ－１－｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）－４－ビフェニリル］メチル｝－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール）、バルサルタン（（２Ｓ）－３－メチル－２－（ペンタノイル｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）ビフェニル－４－イル］メチル｝アミノ）ブタン酸）、及びテルミサルタン（４’［（１，４’－ジメチル－２’－プロピル［２，６’－ビ－１Ｈ－ベンズイミダゾール］－１’－イル）メチル］［１，１’－ビフェニル］－２－カルボン酸が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＴ_１アンタゴニストはロサルタンである。好適なＡＴ_１アンタゴニストは、商業的供給業者（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＭＩ ＵＳＡ）から取得することができる。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１）アンタゴニストの濃度は、１～１０００μＭ、例えば約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００μＭのいずれか、好ましくは約１００μＭであり得る。

【0160】

好ましい実施形態では、造血誘導培地は既知組成培地である。例えば、造血誘導培地は、有効量の、例えば１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと、例えば１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦと、例えば３０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３と、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６と、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７と、例えば５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１と、ＢＭＰ、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、例えば２５ｎｇ／ｍｌのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）と、例えば２ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と、例えば１０μｇ／ｍｌのアンギオテンシンＩＩと、アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ_１）アンタゴニスト、例えば１００μＭのロサルタンとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。

【0161】

好適な既知栄養培地は上述されており、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４ ＰＬＵＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または後述するようなアルブミン、インスリン、セレニウムトランスフェリン、及び脂質を補充したＩＭＤＭなどの基礎培地を含む。

【0162】

ＨＥ細胞を造血誘導培地で８～２１日間、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間、好ましくは約１６日間培養して、ＨＰＣの集団を生産することができる。

【0163】

ＨＥ細胞からＨＰＣを生成した後、１つ以上のＣＤ３４などの細胞表面マーカーを発現するＨＰＣの集団は、さらなる分化に供する前に、例えば磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により精製することができる。例えば、ＣＤ３４＋ＨＰＣの集団が精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、ＨＥ誘導培地で８日間、例えば８、９、または１０日間の培養後に精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、分化から１６日後、例えば分化方法の１６日目、１７日目、または１８日目に精製され得る。

【0164】

上記の方法により生産した後、前駆Ｔ細胞の集団を増大させることができる。例えば、前駆Ｔ細胞の集団を好適な条件下で培養して、その集団における前駆Ｔ細胞の数の増加を促進することができる。好適な条件としては、ピリミドインドール化合物の存在を挙げることができる。

【0165】

例えば、前駆Ｔ細胞の集団は、上述のように、ピリミドインドール化合物を補充したリンパ球増大培地で培養され得る。

【0166】

前駆Ｔ細胞は、上述した方法による生産、及び場合によっては増殖の後に、成熟させるか、またはＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞などの免疫細胞へとさらに分化させることができる。

【0167】

いくつかの好ましい実施形態では、前駆Ｔ細胞はＴＣＲαβ＋Ｔ細胞に成熟させることができる。例えば、前駆Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の成熟を促進する好適な条件下で培養され得る。好適な条件としては、ピリミドインドール化合物の非存在を挙げることができる。

【0168】

いくつかの実施形態では、前駆Ｔ細胞はＴ細胞成熟培地で培養され得る。Ｔ細胞成熟培地は、成熟型Ｔ細胞への前駆Ｔ細胞の成熟を促進する細胞培養培地である。好適なＴ細胞成熟培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路、（ｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ７を含み得る。

【0169】

好ましくは、Ｔ細胞成熟培地はピリミドインドール化合物を含まない。例えば、前駆Ｔ細胞の集団を、本明細書に記載されるようにピリミドインドール化合物の存在下で分化させ、場合により増大させた後に、集団をピリミドインドール化合物の非存在下で成熟させ、活性化させ、及び／または増大させることができる。

【0170】

好ましい実施形態では、Ｔ細胞成熟培地は既知組成培地である。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なＴ細胞成熟培地は、当技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）Ｔ細胞成熟サプリメント（カタログ番号９９３０；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）、ならびにＥｘＣｅｌｌｅｒａｔｅヒトＴ細胞増大培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）のようなＰＢＭＣ及びＣＤ３＋細胞の増大に好適な他の培地を含む。他の好適なＴ細胞成熟培地には、本明細書の他の箇所に記載されるような、ＩＴＳ、アルブミン及び脂質を補充し、有効量の上記の分化因子をさらに補充した、ＩＭＤＭなどの基本培地が含まれ得る。

【0171】

前駆Ｔ細胞は表面上で培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。好適なコーティングは、当技術分野で周知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0172】

前駆Ｔ細胞は、基質上のＴ細胞成熟培地で、前駆Ｔ細胞をＴＣＲαβ＋Ｔ細胞に成熟させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、１～４週間、好ましくは２または３週間培養され得る。

【0173】

本明細書に記載されるように生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、成熟型ＣＤ３＋Ｔ細胞であり得る。例えば、細胞はαβＴＣＲ＋ＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＣＤ２８＋の表現型を有し得る。

【0174】

いくつかの実施形態では、前駆Ｔ細胞の成熟によって生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞（第５段階）は、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である場合も、主にそれである場合もある。

【0175】

第６段階では、単陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはより好ましくは単陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生産するように、またはその割合を増加させるように、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を活性化及び／または増大させることができる。本明細書に記載される方法によって生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であっても、単一陽性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。

【0176】

Ｔ細胞を活性化及び増大させるための好適な方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞は、適切な培養条件下でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露され得る。好適なＴＣＲアゴニストとしては、ビーズまたは樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子（ＭＨＣ－ペプチド複合体）上に提示されるペプチドなどのリガンド、及び抗ＴＣＲ抗体などの可溶性因子、例えば抗ＣＤ２８抗体、及びＭＨＣ－ペプチド四量体、五量体またはデキストラマーなどの多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体が挙げられる。

【0177】

活性化とは、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン生産、及び検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を起こしているＴ細胞を指す。

【0178】

抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３またはαＣＤ２８のような、ＴＣＲの成分に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に好適な抗ＴＣＲ抗体は、当技術分野で周知であり（例えばＯＫＴ３）、商業的供給者（例えばｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣＯ ＵＳＡ）から入手可能である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及びＩＬ２、ＩＬ－７、またはＩＬ１５への曝露によって活性化され得る。より好ましくは、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及び抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化される。活性化は、ＣＤ１４^＋単球の存在下でも非存在下でも起こり得る。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣあるいはＣＤ４^＋及び／またはＣＤ８^＋細胞を含むＴ細胞サブセットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）または抗原を用いずに、抗体でコーティングされたビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して活性化され得る。他の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２細胞表面リガンドと結合する可溶性四量体抗体複合体、例えば、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ ＡｃｔｉｖａｔｏｒまたはＨｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒを使用して、Ｔ細胞を活性化することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、場合により抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて、ＭＨＣ－ペプチド複合体、好ましくは多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体で活性化され得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、例えば二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ－１５を補充した、本明細書に記載されるＴ細胞成熟培地で培養され得る。培地には、上述のように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、例えば１つ以上の抗ＴＣＲ抗体、例えば抗αＣＤ３抗体、及び抗αＣＤ２８抗体をさらに補充してもよい。

【0180】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を、任意の簡便な方法を用いて培養して、増大された集団を生産することができる。好適な培養系には、攪拌タンクファーメンター、エアリフトファーメンター、ローラーボトル、培養バッグまたはディッシュ、及び他のバイオリアクター、特に中空糸バイオリアクターが含まれる。そのような系の使用は、当技術分野で周知である。

【0181】

本明細書に記載されるように生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、標的抗原と結合するαβＴＣＲを発現し得る。例えば、αβＴＣＲは腫瘍抗原を発現するがん細胞に特異的に結合し得る。Ｔ細胞は、後述するように、例えば免疫療法において有用であり得る。

【0182】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるαβＴＣＲは、天然に発現され得る（すなわち、内因性ＴＣＲ）。例えば、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するｉＰＳＣから、本明細書に記載されるように生産され得る。ＴＩＬ、例えば腫瘍常在性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、標準的技法を使用して、がん病態を有する個体から取得することができる。あるいは、樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチド断片に結合するＴ細胞に由来するｉＰＳＣから、本明細書に記載されるようにＴ細胞を生産してもよく、または、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞の集団を、クラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチド断片への結合についてスクリーニングし、提示されたペプチド断片に結合するＴ細胞を同定してもよい。

【0183】

他の実施形態では、αβＴＣＲは、細胞によって天然には発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性または異種である）。好適な異種αβＴＣＲは、標的抗原のペプチド断片を提示するクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、がん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子に特異的に結合する異種αβＴＣＲを発現するように改変され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＭＨＣ提示とは無関係に、がん細胞上の標的抗原または標的抗原のペプチド断片を認識し得る。がん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的技法を使用して同定され得る。好ましい腫瘍抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１０及びＭＡＧＥ Ｂ２を含み、最も好ましくはＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４及びＭＡＧＥ－Ａ１０である。

【0184】

異種ＴＣＲは、合成または人工のＴＣＲ、すなわち天然には存在しないＴＣＲであり得る。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原に対するその親和性またはアビディティを増加させるようにエンジニアリングされ得る（すなわち、親和性向上型ＴＣＲ）。親和性向上型ＴＣＲは、天然に発生するＴＣＲに比した１つ以上の突然変異、例えば、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における１つ以上の突然変異を含み得る。これらの突然変異は、がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させる。親和性向上型ＴＣＲを生成する好適な方法は、ファージまたは酵母ディスプレイを使用するＴＣＲ突然変異体のライブラリのスクリーニングを含み、当技術分野で周知である（例えばＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６、Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８（３）２８１－２８３、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２ ３４８－２５６、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５ ９０１を参照のこと）。好ましい親和性向上型ＴＣＲは、腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１０及びＭＡＧＥ Ｂ２のうちの１つ以上を発現するがん細胞に結合し得る。

【0185】

異種αβＴＣＲの発現は、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞の免疫原性特異性を変化させて、それらが、がんを有する個体のがん細胞の表面上に存在する腫瘍抗原などの１つ以上の標的抗原を認識するか、またはその認識の向上を示すようにすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、異種αβＴＣＲの非存在下では、がん細胞への結合の低減を示すか、または結合を示さない場合がある。例えば、異種αβＴＣＲの発現は、αβＴＣＲを発現しないＴ細胞に比して、Ｔ細胞のがん細胞結合の親和性及び／または特異性を増加させ得る。

【0186】

「異種」という用語は、宿主細胞などの特定の生体系にとって外来であり、その系に天然には存在しないポリペプチドまたは核酸を指す。異種ポリペプチドまたは核酸は、人工的手段、例えば組換え技法を使用して生体系に導入され得る。例えば、ポリペプチドをコードする異種核酸を好適な発現構築物に挿入し、次にこれを使用して宿主細胞を形質転換し、ポリペプチドを生産することができる。異種ポリペプチドまたは核酸は、合成もしくは人工でもよく、または異なる種もしくは細胞型などの異なる生体系に存在してもよい。内因性ポリペプチドまたは核酸は、宿主細胞などの特定の生体系に固有であり、その系に天然に存在する。組換えポリペプチドは、人工的手段により、例えば組換え技法を使用して細胞に導入された異種核酸から発現される。組換えポリペプチドは、細胞内に天然に存在するポリペプチドと同一の場合もあれば、その細胞内に天然に存在するポリペプチドと異なる場合もある。

【0187】

Ｔ細胞は、本明細書に記載される方法におけるいずれかの段階で細胞に異種コード核酸を導入することにより、異種αβＴＣＲを発現するように改変され得る。例えば、異種コード核酸は、ｉＰＳＣ、ＨＰＣ、または前駆Ｔ細胞に導入され得る。いくつかの好ましい実施形態では、例えば、本明細書に記載されるようなリンパ系増大培地での２週間の培養（第４段階）の後、リンパ系増大培地中で培養後のαβＴＣＲをコードする異種核酸を細胞に形質導入してもよい。ＴＣＲをコードする異種核酸は、受容体のすべてのサブユニットをコードし得る。例えば、ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列と、ＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列とを含み得る。

【0188】

核酸は、任意の簡便な技法によって細胞に導入され得る。ｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞に異種核酸を導入するまたは組込む場合、当業者には周知である、ある特定の検討事項を考慮しなければならない。挿入される核酸は、Ｔ細胞での転写を駆動する有効な調節エレメントを含む構築物またはベクター内でアセンブルされるべきである。例えば、核酸構築物の調製、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現における、核酸の操作及び形質転換のための多くの公知の技法及びプロトコルが、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、核酸は、遺伝子編集によって細胞に導入され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系により、標的部位でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することができ、ＤＳＢの修復により、標的部位で細胞ゲノムに異種核酸を導入してもよく、または、ｒＡＡＶベクターを使用して核酸を導入してもよい（ＡＡＶ媒介遺伝子編集；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１１４ ２９１－３０７）。

【0189】

ｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞に発現ベクターを導入するための好適な技法は、当技術分野で周知であり、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、遺伝子編集、及びワクシニアまたはレンチウイルスなどのレトロウイルスまたは他のウイルスを使用した形質導入を含む。好ましくは、異種αβＴＣＲをコードする核酸は、ウイルスベクター、最も好ましくはガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、例えばＶＳＶｇ偽型レンチウイルスベクターに含まれ得る。本明細書に記載される方法は、細胞、例えばｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞の集団に、ウイルスベクターを形質導入して、遺伝子改変細胞の形質導入集団を生産することを含み得る。細胞は、核酸を含むウイルス粒子との接触によって形質導入され得る。形質導入のためのウイルス粒子は、公知の方法に従って生産され得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ウイルスパッケージング及びエンベロープエレメントをコードするプラスミド、ならびにコード核酸を含むレンチウイルスベクターをトランスフェクトしてもよい。ＶＳＶｇ偽型ウイルスベクターを水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて生産して、偽型ウイルス粒子を生産してもよい。例えば、固相形質導入は、レトロネクチンでコーティングされ、レトロウイルスベクターが予めロードされた組織培養プレートで培養することにより、選択をせずに行うことができる。

【0190】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＳＰ ＣＤ４＋細胞またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、生産後、単離及び／または精製され得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または抗体でコーティングされた磁気粒子を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含め、任意の簡便な技法を使用することができる。

【0191】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＳＰ ＣＤ４＋細胞、またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、増大及び／または濃縮させてもよい。場合により、本明細書に記載されるように生産されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は、使用前に、例えば凍結保存によって貯蔵され得る。

【0192】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は、バッファー、担体、希釈剤、防腐剤、及び／または薬学的に許容される賦形剤のような他の試薬と混合され得る。好適な試薬については、以下でより詳細に説明する。本明細書に記載される方法は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を薬学的に許容される賦形剤と混和することを含み得る。

【0193】

投与（例えば注入による）に好適な医薬組成物には、抗酸化剤、バッファー、防腐剤、安定化剤、静菌薬、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性の等張でパイロジェンフリーの無菌注射液、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。このような製剤に使用される好適な等張ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルについては、標準的な薬学の文献、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に見出すことができる。

【0194】

いくつかの好ましい実施形態では、ＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞、または好ましくはＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得るＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、個体への静脈内注入に好適な医薬組成物に配合され得る。

【0195】

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、物質、組成物、及び／または剤形に関する。各担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。

【0196】

本発明の１つの態様は、上述の方法によって生産される、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を提供する。

【0197】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は、医薬品として使用するためのものであり得る。例えば、本明細書に記載される成熟型ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は、がん免疫療法、例えば養子Ｔ細胞療法に使用され得る。

【0198】

養子細胞療法または養子免疫療法とは、標的細胞上に発現した抗原またはそのペプチドに特異的なＴＣＲ、及び／または標的細胞上に発現したペプチドＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲを発現するヒトＴリンパ球の養子移入を指す。

【0199】

これは、がんを処置するための腫瘍特異的抗原など、選択された標的に応じて様々な疾患を処置するために使用され得る。養子細胞療法には、ドナーまたは患者の細胞、例えば、白血球の一部を取り出すことが含まれる。次いで、これらの細胞を使用してｉＰＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、これらのｉＰＳＣを使用することで、本明細書に記載されるような、標的細胞で発現される抗原もしくはそのペプチドに特異的なＴ細胞、及び／または標的細胞上のペプチドＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞が効率的に生成される。Ｔ細胞は、患者が細胞の注入を受ける準備が整うまで、試験、輸送、及び貯蔵の時間を確保するために、増大させ、洗浄し、濃縮し、及び／またはその後に凍結してもよい。

【0200】

本発明の他の態様は、がんを処置するための医薬の製造のための本明細書に記載されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団の使用、がんを処置するための本明細書に記載されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団、及び、本明細書に記載されるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、がんの処置の方法を提供する。

【0201】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は自己由来であり得る。すなわち、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、それらが後に投与されるのと同じ個体から元々取得されたものである（すなわち、ドナーとレシピエント個体とが同じである）。

【0202】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は同種異系であってもよく、すなわち、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、それらが後に投与されるのと異なる個体（すなわち、ドナー及びレシピエントが異なる個体）に元々由来してもよく、すなわち、ｉＰＳＣを生成するために使用される細胞が取得された個体は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞が投与される個体とは異なってもよい。同種異系とは、同じ種に属する異なる動物に由来する移植片を指す。

【0203】

ＧＶＨＤ及び拒絶反応などの他の望ましくない免疫効果を回避するために、ドナー及びレシピエント個体のＨＬＡは適合してもよい。あるいは、ドナー及びレシピエント個体のＨＬＡは適合しなくてもよく、またはドナー個体の細胞内のＨＬＡ遺伝子は、レシピエントとのＨＬＡミスマッチをなくすように、例えば遺伝子編集によって改変されてもよい。

【0204】

レシピエント個体への投与に好適なＴＣＲαβ＋Ｔ細胞集団は、ドナー個体から取得された細胞、好ましくはＴ細胞の初期集団を用意することと、細胞をｉＰＳＣへとリプログラミングすることと、レシピエント個体において、がん細胞、及び／または場合によりＭＨＣと複合体を形成するがん細胞によって提示される抗原もしくはそのペプチドに特異的に結合するαβＴＣＲを発現するＴ細胞へと、ｉＰＳＣを分化させることとを含む方法により、生産され得る。

【0205】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の投与後、レシピエント個体は、レシピエント個体のがん細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答を呈し得る。これは、個体のがん病態に対して有益な効果を有し得る。

【0206】

本明細書で使用される「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は同義に使用され、単数形でも複数形でも、宿主生物にとって病的なものとなる悪性形質転換を起こした細胞を指す。

【0207】

原発がん細胞は、十分に確立された技法、特に組織学的検査により、非がん性細胞から容易に区別することができる。がん細胞には、原発がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来する任意の細胞も含まれ得る。これには、転移したがん細胞、ならびにがん細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株が含まれる。通常は固形腫瘍として現れるがんの種類について言及する場合、「臨床的に検出可能」な腫瘍は、腫瘍塊に基づいて、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、もしくは身体検査での触診などの手順によって検出可能であるもの、及び／または患者から取得可能なサンプル中の１つ以上のがん特異的抗原の発現のために検出可能であるものである。

【0208】

がん病態は、悪性がん細胞の異常な増殖によって特徴付けることができ、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ及びＣＬＬなどの白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫などのリンパ腫、ならびに肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵癌、腎癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆管のがん、甲状腺癌、胸腺癌、骨のがん、及び大脳癌などの固形がん、ならびに原発不明がん（ＣＵＰ）を含み得る。

【0209】

個体内のがん細胞は、個体の正常な体細胞とは免疫学的に異なり得る（すなわち、がん性腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、がん細胞は、個体において、がん細胞によって発現される１つ以上の抗原に対する全身性免疫応答を誘発することができる可能性がある。免疫応答を誘発する腫瘍抗原は、がん細胞に特異的な場合もあれば、個体における１つ以上の正常細胞によって共有される場合もある。

【0210】

本明細書に記載される処置に好適な個体のがん細胞は、抗原を発現する場合があり、及び／またはＴ細胞によって発現されるαβＴＣＲに結合する適正なＨＬＡ型である場合がある。

【0211】

上述のような処置に好適な個体は、哺乳動物であり得る。好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えばマウス、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ動物）を用いることができる。

【0212】

いくつかの実施形態では、個体は、最初のがんの処置の後に最少残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。

【0213】

がんを有する個体は、当技術分野で公知の臨床基準に従ってがんの診断を下すのに十分である、少なくとも１つの識別可能な徴候、症状、または検査所見を示し得る。このような臨床基準の例は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１などの医学教本に見出すことができる。場合によっては、個体におけるがんの診断は、個体から取得された体液または組織のサンプル中の特定の細胞型（例えば、がん細胞）の同定を含み得る。

【0214】

抗腫瘍効果は、腫瘍成長速度の低下、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、またはがん性病態に関連する様々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果である。「抗腫瘍効果」は、そもそもの腫瘍の発生の防止における、本発明の方法に従って生産されるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、特にＴ細胞、及び本明細書に記載される抗体の能力によって現れる場合もある。

【0215】

処置は、ヒトのものか動物のものか（例えば獣医学的用途）を問わず、いくらかの所望の治療効果、例えば、病態の進行の阻害または遅延が達成される、あらゆる処置及び／または療法であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒または寛解（部分的か完全かを問わない）、病態の１つ以上の症状及び／または徴候の防止、遅延、軽減または抑止、あるいは処置の非存在下で予想されるものを超えた対象または患者の生存期間の延長を含む。

【0216】

処置は予防的（すなわち予防）でもよい。例えば、がんに罹患しやすい個体、またはその発生もしくは再発のリスクがある個体は、本明細書に記載されるように処置され得る。このような処置は、個体におけるがんの発生または再発を防止するか、または遅延させ得る。

【0217】

特に、処置には、がんの完全寛解を含むがんの成長の阻害、及び／またはがんの転移の阻害が含まれ得る。がんの成長とは、概して、より発達した形態へのがんにおける変化を示す複数の指標のうちのいずれか１つを指す。したがって、がんの成長の阻害を測定するための指標には、がん細胞の生存率の減少、腫瘍体積または形態における（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像法を使用して決定される）減少、腫瘍成長の遅延、腫瘍血管構造の破壊、遅延型皮膚過敏反応テストの成績の向上、Ｔ細胞の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。本明細書に記載されるように改変されたＴ細胞の投与は、がんの成長、特に対象に既に存在するがんの成長に抵抗する個体の能力を向上させ、及び／または個体におけるがんの成長の傾向を減少させ得る。

【0218】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞またはＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を含む医薬組成物は、全身性／末梢性か、所望の作用部位においてかを問わず、非経口を含むがこれに限定されない、例えば注入による、任意の簡便な投与経路によって対象に投与され得る。注入は、針またはカテーテルを介した、好適な組成物中のＴ細胞の投与を含む。典型的には、Ｔ細胞は静脈内または皮下に注入されるが、Ｔ細胞は、筋肉内注射及び硬膜外経路など、他の非経口経路を介して注入されてもよい。好適な注入技法は、当技術分野で公知であり、療法において一般的に使用されている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。

【0219】

典型的には、投与される細胞の数は、体重１Ｋｇ当たり約１０^５個～約１０^１０個、例えば、個体当たり細胞約１、２、３、４、５、６、７、８、または９、×１０^５、×１０^６、×１０^７、×１０^８、×１０^９、または×１０^１０個のいずれか、典型的には個体当たり細胞２×１０^８～２×１０^１０個であり、典型的には３０分間にわたり、必要に応じて、例えば数日から数週間の間隔で処置を繰り返す。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、及びＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を含む組成物の適切な投与量は、患者ごとに異なり得ることが理解されるであろう。最適な投与量を決定することは、一般に、本発明の処置のリスクまたは有害な副作用に対する治療利益のレベルを釣り合わせることを伴う。選択される投与量レベルは、特定の細胞の活性、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、投与経路、投与時間、細胞の喪失または不活性化の比率、処置期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／または物質、ならびに患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康状態、及び病歴を含むがこれらに限定されない、種々の因子に依存する。細胞の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量に委ねられるが、一般に、投与量は、実質的に有害（ｈａｒｍｆｕｌ）または有害（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する作用部位での局所濃度を達成するものとなる。

【0220】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は単独で投与してもよく、状況によっては、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団のｉｎ ｖｉｖｏでの増大を促進するために、標的抗原、標的抗原を表示するＡＰＣ、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＩＬ－２、ＩＬ７、及び／またはＩＬ１５と組み合わせてＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を投与してもよい。組み合わせの投与は、組み合わせた成分の別個、同時、または順次の投与によるものであり得る。

【0221】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の集団は、１つ以上の他の療法、例えばＩＬ－２などのサイトカイン、ＣＤ４＋ＣＤ８＋化学療法、放射線、ならびに抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＴＩＭ３、抗ＫＩＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＣＴＬＡ４抗体などのチェックポイント阻害剤を含む免疫腫瘍薬と組み合わせて投与され得る。組み合わせの投与は、組み合わせた成分の別個、同時、または順次の投与によるものであり得る。

【0222】

１つ以上の他の療法は、任意の簡便な手段によって、好ましくはＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の投与部位から離れた部位で投与され得る。

【0223】

ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の投与は、１用量で、連続的または断続的に（例えば、適切な間隔において分割用量で）治療過程を通じて、実施され得る。投与の最も効果的な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、療法に使用される製剤、療法の目的、処置される標的細胞、及び処置される対象に応じて異なる。単回または複数回の投与を行うことができ、用量レベル及びパターンは担当医によって選択される。好ましくは、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、例えば５億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１１０億、１２０億、１３０億、１４０億、１５０億個のいずれかのＴ細胞、例えば少なくとも１×１０^９個のＴ細胞の単回輸注で投与される。

【0224】

本発明の他の態様及び実施形態は、上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語に置き換えたもの、ならびに上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に置き換えたものを提供する。

【0225】

文脈上別段の解釈を必要としない限り、本願は、上記の態様及び上述の実施形態のいずれかの相互のあらゆる組み合わせを開示するものであることを理解されたい。同様に、本願は、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単独で、または他の態様のいずれかと合わせて、好ましい及び／または任意選択の特徴のあらゆる組み合わせを開示する。

【0226】

上記の実施形態の改変形態、さらなる実施形態、及びそれらの改変形態は、本開示を読めば当業者には明らかとなり、したがって、これらは本発明の範囲内にある。

【0227】

本明細書で言及されるすべての文書及び配列データベースエントリーは、あらゆる目的のために、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。

【0228】

本明細書で使用される「及び／または」は、指定された２つの特徴または構成要素の各々の具体的開示であり、他方の有無にかかわらないものとして解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書で個別に明記されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的開示として解釈されるべきである。

【実施例】

【0229】

材料及び方法
ＵＭ７２９の調製
５ｍＭのＵＭ７２９のストック溶液を、ＤＭＳＯ中での再構成により作製した。このストック溶液を－２０℃で保存した。実験当日に作業ストック溶液をＤＭＳＯ中１ｍＭで作製し、適切な濃度（０．２５μＭ～５μＭ）で培地に補充するのに使用した。

【0230】

多能性幹細胞からのｉＰｒｏＴ細胞の分化
発明者らの独自の内製培地を用いて、ｉＰＳＣ細胞（ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２）を１６日目まで分化させた。ＭＡＣＳを用いてＨＰＣ（ＣＤ３４＋細胞）を単離し、これらの細胞の凍結保存バンクを、ｉＴ細胞へのさらなる分化のために作出した。

【0231】

次いでＨＰＣを解凍し、標準的ＳＣＴのコーティング（２．５μＬ／ｃｍ^２）上の１ｍｌのリンパ球前駆細胞（第４段階；ＬＰ）培地に５０００細胞／ｃｍ^２で播種した。ＵＭ７２９を０．２５μＭ～５μＭの範囲の濃度で培地に加えた。３日目に、必要な濃度のＵＭ７２９を補った１ｍＬのＬＰ培地を加え、さらなる半量の培地交換を必要な培地濃度で３日ごとに行った。１４日ごとに細胞を培養物から取り出し、ＮＣ－２５０を用いてカウントした。次いで細胞を新鮮なＳＣＴマトリックス上に再播種し、ＵＭ７２９を適切な濃度で培地に加えた。２１、３５、及び４２日後に培養物から細胞を取り出し、表１のパネルを用いてフェノタイピングした。これらの時点において、細胞を適切なＵＭ７２９濃度のリンパ球前駆細胞培地で培養を継続するか、またはＴ細胞成熟条件に移行した。

【0232】

Ｔ細胞の成熟
培養の２１、３５、及び４２日目に、ｉＰｒｏＴ細胞を新鮮なＳＣＴマトリックス（２．５μｌ／ｃｍ^２）に２５０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。細胞を、ＵＭ７２９（０．２５－５μＭ）ありまたはなしのＴ細胞成熟培地で、３日ごとに培地を交換しながら２週間培養した。２週間の成熟後、ＮＣ－２５０を用いて細胞をカウントし、表１のパネルを用いてフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。

【0233】

細胞のフェノタイピング
アッセイの当日、細胞をカウントし、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、Ｔ細胞マーカーについてフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。使用した抗体の一覧を表１に見出すことができる。

【0234】

結果
ＵＭ７２９及びＵＭ１７１の効果を、６段階の分化プロセスにおける第４段階及び第５段階の両方で評価した（図１）。分化プロセスの第４段階では、第３段階から単離されたＨＰＣを増殖させ、ＣＤ５＋ＣＤ７＋であるｉＰｒｏＴ細胞へとさらに分化させる。プロセスの第５段階では、これらのｉＰｒｏＴ細胞はＣＤ４＋ＣＤ８＋αβＴ細胞に成熟する。

【0235】

ＵＭ７２９を、第４段階のリンパ球増殖培地（ＬＰ）または第５段階のＴ細胞成熟培地（ＴＭ）のいずれかに最大１μＭの濃度で加えたところ、培養の２１日後及び３５日後におけるｉＰｒｏＴ細胞の生存率に影響を及ぼさないことが示された（図２Ａ及び図６）。ただし、細胞傷害効果は５μＭ以上の濃度で観察され、全細胞の生存率は比較的低く、細胞を５μＭの濃度で２１日間処理すると全細胞の増殖が停止した（図２Ｂ）。

【0236】

培養してリンパ系前駆細胞にしたＨＰＣは、骨髄系細胞へと分化する潜在可能性も有する（図３）。フローサイトメトリーにより、ＵＭ７２９を加えることで、この細胞汚染を用量依存的に低減すると判定された（図３）。

【0237】

第４段階培地にＵＭ７２９を加えると、ＣＤ７＋ＣＤ５＋ｉＰｒｏＴ細胞の収量が増加し（図４Ａ）、ＣＤ７＋ＣＤ５＋ｉＰｒｏＴ細胞のパーセンテージも濃縮されることがわかった（図４Ｂ）。ただし、ＵＭ７２９を第４段階培地に加えたところ、未熟な単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞へのさらなる分化を阻害する発生遮断が生じた（図５Ａ及び図５Ｂ）。この発生遮断により、ｉＰｒｏＴ細胞段階における分化培養物の同期及び濃縮が可能になった。ＵＭ７２９を第５段階培養物にも使用した場合、発生遮断は継続し、培養物中のＣＤ７＋ＣＤ５＋ｉＰｒｏＴ細胞のパーセンテージは増加し、ＣＤ４＋ＣＤ８＋の発生は用量依存的に阻害された（図７及び図８）。

【0238】

ＵＭ７２９の存在により生じる発生遮断を使用して、第４段階の細胞を継続的に増大させ、ｉＰｒｏＴ細胞の増殖が４２日にわたり支持された。これに対し、ＵＭ７２９非存在下の培養物は、２１日目以降は増殖能力を維持できなかった（図９）。重要なことには、Ｔ細胞成熟培地中のＵＭ７２９を除去することにより、発生遮断が除去され、ＣＤ４＋ＣＤ８＋αβＴ細胞の分化が可能になった（図１０）。

【0239】

凍結したｉＰｒｏＴ細胞（第４段階細胞）を第５段階培地で融解すると細胞死に至ったが、第４段階培地にＵＭ７２９を加えると凍結融解からの回復が改善した（図１１）。第５段階培地で７日間培養した後、１μＭのＵＭ７２９で前処理した細胞は高い生存率を示し、細胞増殖の増加を示した（図１２）。

【0240】

ＵＭ１７１を加えた場合、低濃度では増殖及び生存率に影響を及ぼさなかったものの、第４段階のリンパ球増殖培地（ＬＰ）中でＵＭ７２９に使用したのと同じ濃度（０．２５ｕＭ以上）で使用すると、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の増殖を停止させることがわかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。また、第４段階のリンパ球増殖培地（ＬＰ）にＵＭ１７１を加えると、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞（ＣＬＰ）が用量依存的に濃縮されることもわかった（図１４）。また、ＵＭ１７１処理細胞は、第５段階でＣＤ７ＣＤ５ ｉＰｒｏＴ細胞及びＣＤ４ＣＤ８ ＤＰ Ｔ細胞に進行することも示された（図１５Ａ及び１５Ｂ）。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【国際調査報告】