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特表2024-528172様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対する防御のためのワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対する防御のためのワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/02 20060101AFI20240719BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240719BHJP
C12N 9/52 20060101ALN20240719BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20240719BHJP
C07K 14/315 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
A61K39/02
A61P31/04
C12N9/52 ZNA
C12N1/20 E
C07K14/315
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506491
(86)(22)【出願日】2022-06-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 EP2022067891
(87)【国際公開番号】W WO2023011811
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21189282.3
(32)【優先日】2021-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブス，アントニウス・アーノルドゥス・クリスチャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA49X
4B065CA45
4C085AA03
4C085BA14
4C085BB22
4C085CC07
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA11
4H045DA86
4H045DA89
4H045EA31
(57)【要約】
本発明は、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含むワクチンに関する。本発明はまた、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染からブタを防御する方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との組合せ、及び、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とをブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染から前記ブタを防御するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含むワクチン。
【請求項2】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、前記ストレプトコッカス・スイス血清型１の細菌の対応する天然起源のＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９０％の配列同一性を有する全ＩｇＭプロテアーゼ抗原であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項3】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、前記ストレプトコッカス・スイス血清型１の細菌の対応する天然起源のＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９５％の配列同一性を有する全ＩｇＭプロテアーゼ抗原であることを特徴とする、請求項１及び２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項4】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列に４つ未満の反復配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項5】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列に３つ未満の反復配列を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項6】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列に２つの反復配列を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項7】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、配列型１３のものであることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項8】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原及び前記ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６以外の他のストレプトコッカス・スイス抗原を含まないか、又は、せいぜいストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原のみを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項9】
ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染からブタを防御する方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との組合せ。
【請求項10】
前記防御が、血清型１、２、７及び９のいずれかのストレプトコッカス・スイスによる病原性感染に対するものであることを特徴とする、請求項９に記載の使用のための組合せ。
【請求項11】
前記方法が、前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と前記ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との、最長で３５日齢の前記ブタへの投与を含むことを特徴とする、請求項９及び１０のいずれかに記載の使用のための組合せ。
【請求項12】
前記方法が、雌ブタの初乳の摂取を通じてブタを防御するための、前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と前記ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との前記雌ブタへの投与を含むことを特徴とする、請求項９及び１０のいずれかに記載の使用のための組合せ。
【請求項13】
前記ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と前記ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とが、前記ブタが前記初乳を摂取する前に、前記雌ブタに２回投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組合せ。
【請求項14】
ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染に対するブタの防御用ワクチンの製造のための、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との使用。
【請求項15】
ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とをブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染から前記ブタを防御するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、様々な血清型、特に最も一般的な血清型１、２、７及び９のストレプトコッカス・スイス細菌による病原性感染に対するブタの防御に関する。
【背景技術】
【0002】
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｓ．ｓｕｉｓ）は、ブタの伝染性細菌疾患の主要な病原因子の１つである。この病原体は、髄膜炎、関節炎、心膜炎、多発性漿膜炎、敗血症、肺炎及び突然死などの様々な臨床症候群を引き起こし得る。Ｓ．ｓｕｉｓは、元々はランスフィールド群Ｒ、Ｓ、Ｒ／Ｓ又はＴとして定義されたグラム陽性の通性嫌気性球菌である。後に、細胞壁に位置する型特異的莢膜多糖類抗原に基づく新しいタイピング系が提案された。これにより、３５の血清型を含む系が導かれ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ及びＡｎｄｒｅｓｅｎ、１９９８年、「１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８、１０６３～１０６５）、そのうち血清型１、２、７及び９が現在、特にヨーロッパで最も一般的になっている。しかし、莢膜血清型は、毒性のマーカーとしては不十分であると認識されている。そこで、Ｓ．ｓｕｉｓ感染の疫学、及び血清型判定アプローチの生物学的関連性を理解するのを助ける代替系、すなわち、Ｋｉｎｇらにより、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年１０月、３６７１～３６８０頁（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ」）に記載の、いわゆる多座位配列タイピング（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ：ＭＬＳＴ）が開発された。その研究では９２の配列型が同定され、そのうちの配列型（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｅ：ＳＴ）複合体ＳＴ１、ＳＴ２７及びＳＴ８７は、それぞれ複数の配列型を含み、集団を支配している。オックスフォード大学（Ｊｏｌｌｅｙら、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓ ２０１８年、３：１２４（ウェルカム・トラストが資金提供するサイト）にあり、Ｋｉｎｇらの論文を参照し、任意のストレプトコッカス・スイス株について配列型の同定が容易にできるストレプトコッカス・スイス ＭＬＳＴウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ ｓｓｕｉｓ／）も参照されたい。
【0003】
ブタ群におけるストレプトコッカス・スイスの制御は困難なようである。ストレプトコッカス・スイスは、共生的かつ日和見的なブタの病原体である。明らかに、免疫系は感染のたびに引き起こされるわけではない。また、ストレプトコッカス・スイスは、十分に被包された病原体であり、広範な毒性因子を用いて宿主免疫系を回避する。合わせて、これらの特徴が、この重要な病原体と戦うための有効なワクチン開発の課題となってきた。数年前に概要論文が発表されており、この論文では、ストレプトコッカス・スイスに対する既存のワクチン及び探索的ワクチンについて総括されている（Ｍａｒｉｅｌａ Ｓｅｇｕｒａ：「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第１４巻、２０１５年、第１２号、１５８７～１６０８頁）。この総説では、臨床現場の情報及び実験データをまとめ、比較して、以下に概説するストレプトコッカスに対するワクチン開発状況の概要が提供されている。
【0004】
現在市販されているワクチンは、主に全細胞バクテリンである。しかし、現場報告には、疾患の制御及び管理の困難さが記載されており、バクテリンワクチンを使用する場合、特に異種防御作用が非常に弱いため、特に「ワクチン不全」が通常となっている。保菌ブタが主要な感染源であり、垂直伝播及び水平伝播の両方が群れ内での疾患の拡散に関与している。離乳及び輸送などのストレスの多い条件下で、保菌動物と感受性動物とを混合すると、たいていの場合で臨床疾患が生じる。早期に投薬して離乳したり、隔離して早期離乳を実践したりしても、ストレプトコッカス・スイス感染は排除されない。したがって、疾患を予防するための有効な制御対策は、（可能な場合の）予防／集団的予防処置及びワクチン接種にかかっている。現在、現場での免疫処置の取り組みは、市販又は自家バクテリンの使用に焦点があてられている。これらのワクチン戦略は、子ブタ又は雌ブタのいずれかに適用されている。離乳期以降の子ブタは、離乳や、その後に通常行われる輸送に伴うストレスによって、ストレプトコッカス・スイス感染症に罹りやすい。したがって、子ブタに受動免疫を試み、伝達し、生後早期にこれらのストレスの多い状況下でストレプトコッカス・スイスに対する防御作用を提供するために、多くの場合、雌ブタでの分娩前免疫処置が用いられる。さらに、雌ブタのワクチン接種は費用がかからず、労働集約的であるため、子ブタのワクチン接種に代わる経済的な方法となっている。しかし、得られた結果は、バクテリンでの雌ブタのワクチン接種も議論の的であることを示しているように思われる。多くの場合、ワクチン接種された雌ブタは、分娩前に２回ワクチン接種された場合でさえ、ワクチン接種に対する応答が不十分であるか又は全く応答せず、その結果、同腹仔に移行する母子免疫が低くなる。また、母子免疫が十分なレベルで移行されたとしても、多くの場合、母体抗体は、４～７週齢の最も重要な期間における防御作用を提供するには低すぎる。
【0005】
子ブタには、特にヨーロッパにおいて、自家バクテリンが現場で頻繁に使用されている。自家バクテリンは、臨床上の問題がある飼養場で単離された毒性株から調製され、同じ飼養場に適用される。自家バクテリンの欠点の１つは、ワクチンの安全性データが不足しており、重度の有害反応が起こり得ることである。サンプリングミス（１～２頭のみのブタ又はサンプルを使用することによる）は、最近の大流行に関連する株又は血清型の同定に失敗する可能性がある。この失敗は、風土病群では特に問題となる可能性がある。最後に、自家バクテリンの最も重要なジレンマは、その実際の有効性がほとんど研究されていないことである。自家ワクチンは経験的に適用されているため、このワクチンで得られた結果が一貫せず、多くの場合に期待外れであることは驚くにあたらない。
【0006】
他の実験的ワクチンについても、文献に記載されている。Ｋａｉ－Ｊｅｎ Ｈｓｕｅｈらは、サブユニット添加バクテリンが、成功した雌ブタのワクチン接種の基礎となって、その子ブタに防御免疫を付与し得ることを示している（「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｎ ｐｌｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｏｗｓ ｃｏｎｖｅｙｓ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐｉｇｌｅｔｓ」：ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＢＭＣ ｓｅｒｉｅｓ－ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ａｎｄ ｔｒｕｓｔｅｄ、１３：１５、２０１７年１月７日）。
【0007】
文献では、弱毒化生ワクチンも企図されている。ストレプトコッカス・スイス血清型２の非被包性の同質遺伝子変異体は、無毒性であることが明確に示されている。しかし、非被包性の血清型２変異体に基づく生ワクチン製剤は、死亡に対して部分的な防御作用しか誘発せず、野生株で攻撃を与えたブタでの臨床徴候の発生を予防することができなかった（Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ ＨＪ、Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ－Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ Ｎ、Ｈｉｌｇｅｒｓ ＬＡら、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｌｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｏｎ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２．」、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、８４：１５５～１６８）。
【0008】
ここ数年間に、抗原性又は免疫原性のストレプトコッカス・スイス分子の広範なリストが報告されており、これらのほとんどは、感染したブタ又はヒトからの回復期血清、及び／又は実験室で産生された免疫血清のいずれかを使用した免疫プロテオミクスによって発見されている。国際公開第２０１５／１８１３５６号（ＩＤＴバイオロジカ社）では、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（全タンパク質、又は完全タンパク質の約３５％のみを表す高度に保存されたＭａｃ－１ドメインのいずれか）を、バクテリンを含有するプライムワクチン接種と組み合わせてもよく、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を２回投与するワクチン接種スキームにおいて、子ブタで防御免疫応答を引き起こし得ることが示されている。’３５６特許出願では、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、全てではないにしてもほとんどのストレプトコッカス・スイス血清型、特に最も一般的な血清型１、２、７及び９全体にわたって高度に保存されているという事実により、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を使用して、ストレプトコッカス・スイス血清型、特に血清型１、２、７及び９の間の広範な交差防御作用に到達し得ることが示唆されている。
【0009】
国際公開第２０１７／００５９１３号（インターバック アーベー（Ｉｎｔｅｒｖａｃｃ ＡＢ）社）では、ＩｇＭプロテアーゼが様々なストレプトコッカス・スイス血清型全体にわたって高度に保存されており、そのため、この抗原を使用して到達することが可能で予想された広範な防御作用が確認されている。
【0010】
最近、他の血清型に対する防御のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原、特に血清型２のＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用に関する特許出願が公開されている。これらの出願で、ＩｇＭプロテアーゼ抗原の交差防御性が確認されている。
【0011】
特に、国際公開第２０２０／０９４７６２号には、血清型１４による攻撃に対する血清型２のＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用について記載されている。非常に妥当な防御作用を得ることができるようである。
【0012】
国際公開第２０１９／１１５７４１号では、ＩｇＭプロテアーゼ抗原が血清型９のストレプトコッカス・スイスによる病原性感染を防御するのに有効であることが示されている。しかし、防御作用はそれほど高くなく、せいぜい通常のバクテリンワクチンで得られるレベルであり、すなわち（実際には、たいていはあまり激しくない攻撃に直面して、防御作用がより高いレベルになることを排除しない）人為的攻撃実験での死亡及び陽性血液単離において、約５０％の低減のようである。一見すると、このやや期待外れの防御作用は、ＲｉｅｃｋｍａｎｎらによってＶａｃｃｉｎｅ，３（２０１９年）１０００４６（「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ，ＩｄｅＳｓｕｉｓ，ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｓｔｒａｉｎ」）に報告されている、血清型９のストレプトコッカス・スイスによる感染に対するＩｇＭプロテアーゼ抗原で得られる高レベルの防御作用、また人為的攻撃実験における高レベルの防御作用、及び国際公開第２０２０／０９４７６２号に示されている血清型１４のストレプトコッカス・スイスに対する防御作用と矛盾しているように思われる。文献に基づけば、通常の血清型９の細菌に対する比較的低いレベルの防御作用を理解することはできない。
【0013】
少なくとも多少の防御作用が予想されるが、文献では、血清型１及び７のストレプトコッカス・スイスによる攻撃に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の防御作用については、得られたデータがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１８１３５６号
【特許文献2】国際公開第２０１７／００５９１３号
【特許文献3】国際公開第２０２０／０９４７６２号
【特許文献4】国際公開第２０１９／１１５７４１号
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ及びＡｎｄｒｅｓｅｎ、１９９８年、「１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８、１０６３～１０６５
【非特許文献2】Ｋｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年１０月、３６７１～３６８０頁（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ」
【非特許文献3】Ｍａｒｉｅｌａ Ｓｅｇｕｒａ：「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第１４巻，２０１５年、第１２号、１５８７～１６０８頁
【非特許文献4】Ｋａｉ－Ｊｅｎ Ｈｓｕｅｈら、「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｎ ｐｌｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｏｗｓ ｃｏｎｖｅｙｓ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐｉｇｌｅｔｓ」：ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＢＭＣ ｓｅｒｉｅｓ－ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ａｎｄ ｔｒｕｓｔｅｄ、１３：１５、２０１７年１月７日
【非特許文献5】Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ ＨＪ、Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ－Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ Ｎ、Ｈｉｌｇｅｒｓ ＬＡら、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｌｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｏｎ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２．」、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年、８４：１５５～１６８
【非特許文献6】Ｒｉｅｃｋｍａｎｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、３（２０１９年）１０００４６、「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ， ＩｄｅＳｓｕｉｓ，ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｓｔｒａｉｎ」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の目的は、ストレプトコッカス・スイスに対する、特に、血清型１、２、７及び９を含む様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対する、ブタについての（交差）防御作用を提供するための改良ワクチンを見出すことである。好ましくは、本ワクチンは、４つ未満のこれら血清型に由来する抗原を含み、４つ未満の血清型であっても、少なくともこれら４つの血清型の全てに対して、少なくとも現場に存在するこれらの血清型の代表的な株に対して、妥当な防御作用を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明の目的を果たすために、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含むワクチンを考案した。
【0018】
本発明は、２つの予想外の発見に基づいたものである。第１に、血清型２のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる異種防御作用は、特に、異なる血清型のストレプトコッカス・スイスの間でＩｇＭプロテアーゼが高度に保存されているので、先行技術の教示に基づいて予想されるほど良好ではないようであった。特に、最もよく理解されているように、Ｍａｃ－１ドメインは、今日知られている全てのストレプトコッカス・スイス血清型において非常に高い同一性レベルで存在する。血清型２の攻撃に対する血清型のＩｇＭプロテアーゼ抗原によって与えられる同種防御作用は優れているが、それでもなお、ストレプトコッカス血清型１及び７に対する防御作用は、まだ著しく改良される可能性がある。別の予想外の発見は、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原によって与えられる異種防御についても、特に血清型２及び７に対して非常に良好なことであった。特に、血清型２に対して与えられる異種防御のレベルが、血清型１に対して血清型２によって与えられる異種防御よりも著しく良好であるという事実は、全く予想外である。
【0019】
非常に予想外のさらなる発見は、血清型２、又は実際には任意の血清型のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、最も一般的な型のストレプトコッカス血清型９、すなわちストレプトコッカス血清型９、配列型１６に対する妥当な防御作用をほとんど提供しないことであった（多少の防御作用は得られるが、そのレベルは商業的に成功するワクチンには十分ではない）。一見すると、この発見は、Ｒｉｅｃｋｍａｎｎに報告されている結果と矛盾しているように思われる。しかし、詳細に検討すると、Ｒｉｅｃｋｍａｎｎの研究では、血清型９、配列型９４のストレプトコッカス・スイス株が使用されているようである。国際公開第２０１９／１１５７４１号では、示されてはいないが、配列型１６のストレプトコッカス・スイス株が使用されている。これは、Ｋｉｎｇらが記載した（上記を参照されたい）多座位配列タイピングに従って、使用した攻撃株をタイピングすることによって後に見出された。明らかに、後者の型（血清型９、配列型１６のＳ．ｓｕｉｓ）に対しては、ＩｇＭプロテアーゼ抗原により、実質的により低いレベルで防御作用が提供される。この理由は完全には明らかではないが、非常に不利であり、それは、多くの国、特にオランダなどの欧州諸国では、配列型１６のストレプトコッカス・スイスが、ストレプトコッカス・スイス血清型９の細菌の最も一般的な（約９５％までの）病原型であるからである（Ｗｉｌｌｅｍｓｅら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１９年、９：１５４２９、「Ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｃａｒｒｉａｇｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」）。このように、ＩｇＭプロテアーゼが全血清型にわたって防御作用をもたらし得るが、特にストレプトコッカス・スイス血清型９、配列型１６に関しては、有効な防御作用にギャップのあることがわかった。
【0020】
上記発見の全てを認識した後で初めて、血清型１、２、７及び９のストレプトコッカス・スイスから（したがって、最も一般的な株型から）、現場で適切に防御する改良ワクチン、本発明のワクチンを考案することができたと結論付けることができた。血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原を使用する場合、当技術分野で使用される血清型２のＩｇＭプロテアーゼで得られるよりも良好なレベルで、血清型１、２及び７に対する妥当な防御作用が得られ得ることがわかった。また、血清型９、配列型１６に対する防御作用のギャップは、血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスのバクテリンを使用して、ストレプトコッカス・スイス血清型９、配列型１６による病原性感染からブタを防御することによって埋め得ることがわかった。この組合せに存在するＩｇＭプロテアーゼは、それ自体、血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスに対する妥当な防御作用を提供するのに適してはいないが、バクテリンの防御作用をさらに改良する可能性がある。
【0021】
本発明により、２つの異なる血清型（１及び９）の２つのストレプトコッカス・スイス抗原のみを使用することによって、最も一般的なストレプトコッカス・スイス細菌に対する妥当な防御作用を得、血清型２の細菌のＩｇＭプロテアーゼを使用する場合、ストレプトコッカス・スイス細菌に対する防御作用におけるいかなるギャップ又は不足も埋めることができる。本発明により、重要な代表種である配列型１６を含む血清型９のストレプトコッカス・スイスに対する可能な最良の防御作用に到達することだけでなく、一般的な全ての血清型、特に血清型１、２、７及び９にわたって、非常に広範で高レベルの防御作用に到達する方法に到達することも可能である。
【0022】
本発明はまた、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染からブタを防御する方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との組合せに関する。
【0023】
また、本発明は、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染に対するブタの防御用ワクチンを製造するための、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６との使用、並びに、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とをブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染からブタを防御するための方法に関する。
【0024】
定義
ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ブタＩｇＭを特異的に分解する酵素であり（ブタＩｇＧ又はブタＩｇＡは分解しない。ＳｅｅｌｅらによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２０１３年、１９５、９３０～９４０、及びＶａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７～２２１２、２０１５年５月５日）、ＩｄｅＳｓｕｉｓと表されるタンパク質、又はその免疫原性部分である（概して、長さが、全長酵素の少なくとも約３０～３５％である）。全酵素は、約１０００～１１５０個のアミノ酸に対応する約１００～１２５ｋＤａの重量を有し、サイズはＳ．ｓｕｉｓの血清型に依存する。国際公開第２０１５／１８１３５６号には、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原を表すいくつかの配列が示されている。すなわち、配列番号１（本出願にも組み込まれる）、配列番号２、配列番号６、配列番号７及び配列番号５（これらの４つの配列２、６、７及び５は、本出願に組み込まれない）であり、後者は全長酵素の免疫原性部分である（Ｍａｃ－１ドメインとして示され、すなわち配列番号７のアミノ酸８０～４１４である）。全長酵素の免疫原性部分の他の例は、国際公開第２０１７／００５９１３号に示されている。ＩｇＭプロテアーゼの特定の例は、国際公開第２０１５／１８１８３５６号の配列番号１によるプロテアーゼ、又は、重複領域において少なくとも９０％、さらには９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から１００％までの配列同一性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメータでｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いてＢＬＡＳＴプログラムで確立され得る。様々な血清型のストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼは、配列同一性が７５％より高いと予想され、特に、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から１００％までであると予想される。例えば抗原の組換え産生系において収量を最適化するように作製された人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持する一方で、全酵素と比較したアミノ酸配列同一性は、８５％、８０％、７５％、７０％、６５、６０、５５又はさらには５０％などと低くなる場合があり、本発明の意味において、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ブタＩｇＭを特異的に分解する酵素であり（ブタＩｇＧ又はブタＩｇＡは分解しない。ＳｅｅｌｅらによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２０１３年、１９５、９３０～９４０、及びＶａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７～２２１２、２０１５年５月５日）、ＩｄｅＳｓｕｉｓと表されるタンパク質、又はその免疫原性部分である（概して、長さが、全長酵素の少なくとも約３０～３５％である）。全酵素は、約１０００～１１５０個のアミノ酸に対応する約１００～１２５ｋＤａの重量を有し、サイズはＳ．ｓｕｉｓの血清型に依存する。国際公開第２０１５／１８１３５６号には、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原を表すいくつかの配列が示されている。すなわち、配列番号１（本出願にも組み込まれる）、配列番号２、配列番号６、配列番号７及び配列番号５（これらの４つの配列２、６、７及び５は、本出願に組み込まれない）であり、後者は全長酵素の免疫原性部分である（Ｍａｃ－１ドメインとして示され、すなわち配列番号７のアミノ酸８０～４１４である）。全長酵素の免疫原性部分の他の例は、国際公開第２０１７／００５９１３号に示されている。ＩｇＭプロテアーゼの特定の例は、国際公開第２０１５／１８１８３５６号の配列番号１によるプロテアーゼ、又は、重複領域において少なくとも９０％、さらには９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から１００％までの配列同一性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメータでｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いてＢＬＡＳＴプログラムで確立され得る。様々な血清型のストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼは、配列同一性が７５％より高いと予想され、特に、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から１００％までであると予想される。例えば抗原の組換え産生系において収量を最適化するように作製された人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持する一方で、全酵素と比較したアミノ酸配列同一性は、８５％、８０％、７５％、７０％、６５、６０、５５又はさらには５０％などと低くなる場合があり、本発明の意味において、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
【0025】
ストレプトコッカス・スイスの全ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、少なくともＭａｃ－１ドメイン、構造的機能に関連する領域、ＣＮＶ領域を含み、細胞接着領域を含んでもよい抗原である（ストレプトコッカス・スイスのゲノムにおけるこれらの領域の同定については実施例１を参照されたい）。これは全ＩｇＭプロテアーゼ抗原と見なすことができ、それは、シグナルペプチドがいずれにしても天然起源（すなわち野生型）の分泌酵素には欠けていると考えられ、細胞接着領域はプロテアーゼとしての機能に必須ではないと考えられるためである。
【0026】
ワクチンは、対象への適用に適した構成物であり、免疫学的有効量（すなわち、標的対象の免疫系を、野生型微生物の攻撃の悪影響を少なくとも低減するのに十分な程度に刺激することができる）の１つ又は複数の抗原を、概して、薬学的に許容される担体と組み合わせて含み、対象に投与すると、感染症を治療する、すなわち感染症又はその感染症から生じる何らかの疾患若しくは障害を予防し、寛解させ、又は治療するのを助ける免疫応答を誘発する。
【0027】
ゲノム又は対応するアミノ酸配列における反復配列は、生物のゲノム又は対応するアミノ酸配列において、１回又は複数回繰り返されるコピー（全く同じであるか又は非常に類似している、例えば相同体）である。これは、ゲノムの部分が繰り返されるコピー数多型の現象の一部である。概して、反復配列の数は、同じ生物の異なる株の間で異なる。コピー数多型は、構造的多型の一種である。これは、かなりの数の塩基対、例えば、１０～１３０個の間のアミノ酸に対応する３０～４００塩基対の間のどこかに、概して影響を及ぼす重複事象の一種である。
【0028】
微生物による病原性感染に対する防御は、防御免疫に到達すること、すなわち、例えば実際の感染、又は病原体による病原性感染に起因する１つ又は複数の臨床徴候を予防又は軽減するために、その微生物による病原性感染又はその感染から生じる障害の予防、寛解又は治療を助けることと同じである。
【0029】
バクテリンは、ワクチンとして使用するための死菌の懸濁液である。
【0030】
抗原を組み合わせるとは、１つのワクチン製剤に異なる抗原を加えるによって、又は別々の製剤を同時投与するために別々の抗原製剤を使用することによって、１つのワクチン接種計画においてこれらの（個々に異なる）抗原を一緒に使用することである。
【0031】
混合ワクチン（すなわち、抗原の組合せを含むワクチン）は、様々な抗原を同時に含む１つの（単一の）製剤である。これらの様々な抗原は、それら抗原が同じ製剤になる限り、いわゆる使用準備済の混合ワクチンを提供するために工場で混合するか、又は投与直前若しくは投与中に混合することができる（例えば、別々の抗原のための２つの別々のチャンバを有する装置を使用し、投与のために装置を使用する時にこれらのチャンバの内容物が混合される）。
【0032】
ブタは、イノシシ科に属する動物のいずれかである。
【0033】
薬学的に許容される担体は、生体適合性媒体であり、すなわち、処置された対象において投与後に顕著な有害反応を誘発せず、該担体を含む組成物を投与した後に、対象の免疫系に抗原を提示することができる媒体である。そのような薬学的に許容される担体は、例えば、水及び／又は任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体、又は固体担体であってもよく、例えば、（糖及び／又はタンパク質に基づく）凍結乾燥ワクチンを得るために通常使用されるものであり、免疫賦活剤（アジュバントとも呼ばれる）を含んでもよい。対応するワクチンの意図される用途又は必要とされる特性に応じて、他の物質、例えば安定剤、粘度調整剤、又は他の成分が添加されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明によるワクチンのさらなる実施形態では、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ストレプトコッカス・スイス血清型１の細菌の対応する天然起源（すなわち野生型）のＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９０％の配列同一性を有する全ＩｇＭプロテアーゼ抗原である。文献から、ＩｇＭプロテアーゼのＭａｃ－１ドメイン（約３５％）だけでも防御作用を提供するのに十分であることが知られているが、全抗原は、より有効な免疫応答を提供すると考えられる。特に、天然起源のＩｇＭプロテアーゼと９０％以上、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又はさらには１００％の配列同一性が、妥当な同種及び異種の防御作用に到達するために好ましい。
【0035】
本発明によるワクチンのまたさらなる実施形態では、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原は、そのアミノ酸配列に４つ未満の反復配列を含む。ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造解析により、この細菌のゲノムは、ゲノムの部分が繰り返されるコピー数多型（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＮＶ）の現象を生じやすいことが明らかになっている。特に、その反復配列は、加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有している。血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２が４つの反復配列を含有するという点で、より良好な異種防御作用を提供するもの（血清型１及び７など）とは大きく異なることがわかった。したがって、反復配列の数が４つ未満、又はさらには３つ未満、例えば２つであれば、可能な限り最良の（異種）防御作用に到達するには有利であると考えられる。
【0036】
最も好ましいのは、２つの反復配列を含有する配列型１３のストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原である。
【0037】
ワクチンは、例えば血清型２のＩｇＭプロテアーゼなどの追加的なストレプトコッカス・スイス抗原を含んでもよいが、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６以外の他のストレプトコッカス・スイス抗原を含まなくても、又は、せいぜいストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原のみを含んでいれば十分であることがわかった。抗原が多くなるということは、原価が高くなり、かつ、抗原負荷が高くなることによる副作用の危険性が高くなることを意味する。
【0038】
ストレプトコッカス・スイスに対する防御において使用するための組合せのさらなる実施形態では、その防御は、血清型１、２、７及び９のいずれかのストレプトコッカス・スイスによる病原性感染に対するものである。
【0039】
本発明による使用のための組合せのまたさらなる実施形態では、本方法は、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とを、最長で３５日齢のブタに投与することを含む。
【0040】
代替の実施形態では、本方法は、雌ブタの初乳の摂取を通じてブタ（通常は子ブタ）を防御するために、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原とストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６とをこの雌ブタに投与することを含む。ＩｇＭプロテアーゼ（国際公開第２０１９／１９３０７８号を参照されたい）は、ワクチン接種した雌ブタから子ブタが初乳を摂取した場合、その子ブタに妥当でかつ長期の防御作用を提供することが知られている。また、バクテリンによって与えられる防御作用は、初乳を介して子ブタに移行することが一般的に知られている。
【0041】
一実施形態では、ストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原、及びストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６は、子ブタが前記初乳を摂取する前に、雌ブタに２回投与されている。
【0042】
次に、以下の具体例を用いて本発明をさらに説明する。
【0043】
［実施例］
実施例１ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造解析。
実施例１ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造解析。
【0044】
実施例２では、血清型１に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御作用について研究する。
【0045】
実施例３では、血清型７に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御作用について研究する。
【0046】
実施例４では、血清型９、配列型１６に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御作用について研究する。
【0047】
実施例５では、血清型１による攻撃に対して、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる防御作用について研究する。
【0048】
実施例６では、血清型２による攻撃に対して、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる防御作用について研究する。
【0049】
実施例７では、血清型７による攻撃に対して、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる防御作用について研究する。
【0050】
実施例８では、血清型９、配列型１６による攻撃に対して、バクテリンによって与えられる防御作用について研究する。
【0051】
［実施例１］
この実施例では、ストレプトコッカス・スイスのゲノム、すなわちＩｇＭプロテアーゼをコードする部分について、ゲノムのこの部分がどのように構造化されているかを示すために解析する。このために、本発明者らは、国際公開第２０１５／１８１３５６号から既知であり、その特許出願において配列番号１として公開されている血清型２の細菌のストレプトコッカス・スイスのゲノムを使用する。その配列は、配列番号１として本特許の配列表にも含まれている。タンパク質アノテーション（ＰＤＢＳｕｍ及びＩｎｔｅｒＰｒｏ）に加えて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアライメント（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら１９７０年、Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら１９９７年、Ａｐｗｅｉｌｅｒら２０００年、デフォルト設定を参照されたい）を用いた配列類似性検索により、ＩｇＭプロテアーゼゲノムについての構造が明らかになっており、５つの領域を同定することができる。
この実施例では、ストレプトコッカス・スイスのゲノム、すなわちＩｇＭプロテアーゼをコードする部分について、ゲノムのこの部分がどのように構造化されているかを示すために解析する。このために、本発明者らは、国際公開第２０１５／１８１３５６号から既知であり、その特許出願において配列番号１として公開されている血清型２の細菌のストレプトコッカス・スイスのゲノムを使用する。その配列は、配列番号１として本特許の配列表にも含まれている。タンパク質アノテーション（ＰＤＢＳｕｍ及びＩｎｔｅｒＰｒｏ）に加えて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアライメント（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら１９７０年、Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら１９９７年、Ａｐｗｅｉｌｅｒら２０００年、デフォルト設定を参照されたい）を用いた配列類似性検索により、ＩｇＭプロテアーゼゲノムについての構造が明らかになっており、５つの領域を同定することができる。
【0052】
領域１（Ｍｅｔ １－Ｔｈｒ ３４）：位置１からのシグナル配列
領域２（Ｖａｌ ３５－Ｇｌｕ ４２６）：予測される加水分解酵素活性を有するＭａｃ－１ドメイン
領域３（Ｔｈｒ ４２７－Ｐｒｏ ６８７）：構造的機能（例えば、適切な折り畳みに関与する）及び基質結合に関連する領域
領域４（Ｔｈｒ ６８８－Ｓｅｒ ９１９）：加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有する４つの反復配列（１＊｛Ｔｈｒ ６８８－Ｓｅｒ ７４４｝、２＊｛Ｔｈｒ ７４５－Ｓｅｒ ８０１｝、３＊｛Ｔｈｒ ８０２－Ｓｅｒ ８５８｝、４＊｛Ｔｈｒ ８５９－Ｓｅｒ ９１９｝）からなる領域
領域５（Ｔｈｒ ９２０－Ｌｙｓ １１４１）：細胞壁アンカー機能を示す予測膜貫通領域を含有する。
領域２（Ｖａｌ ３５－Ｇｌｕ ４２６）：予測される加水分解酵素活性を有するＭａｃ－１ドメイン
領域３（Ｔｈｒ ４２７－Ｐｒｏ ６８７）：構造的機能（例えば、適切な折り畳みに関与する）及び基質結合に関連する領域
領域４（Ｔｈｒ ６８８－Ｓｅｒ ９１９）：加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有する４つの反復配列（１＊｛Ｔｈｒ ６８８－Ｓｅｒ ７４４｝、２＊｛Ｔｈｒ ７４５－Ｓｅｒ ８０１｝、３＊｛Ｔｈｒ ８０２－Ｓｅｒ ８５８｝、４＊｛Ｔｈｒ ８５９－Ｓｅｒ ９１９｝）からなる領域
領域５（Ｔｈｒ ９２０－Ｌｙｓ １１４１）：細胞壁アンカー機能を示す予測膜貫通領域を含有する。
【0053】
他の血清型のストレプトコッカス・スイス細菌の構造はほぼ同じであるが、血清型９、配列型１６については、実質的な違いが存在する（以下に示す）。
【0054】
－シグナルペプチドは、ストレプトコッカス・スイス株間で高度に保存されている。
【0055】
－Ｍａｃ－１ドメインは常に存在し、血清型９、配列型１６株を含む全ての既知の株の間で高度に保存されている。
【0056】
－構造的機能に関連する領域３は常に存在し、また高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の長さの約半分しかない。
【0057】
－ＣＮＶ領域に関して、反復配列は異なる血清型間で非常に類似しているが、数は様々であり、概して２～６の間である。血清型９、配列型１６は、他の血清型のものと比較してはるかに短い完全に異なる型の１２個の反復配列を有し（すなわち、約６０個に対して１２個のアミノ酸）、３つの実質的に異なる反復配列に細分することができる。
【0058】
－細胞接着領域も、異なる血清型間で高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の株の領域とのアミノ酸配列同一性はほとんどない。
【0059】
要するに、ほとんどの血清型及び配列型の間で、ゲノムはほぼ同じ構造であり、最も顕著な違いは、ＣＮＶ領域における反復配列の数である。血清型９、配列型１６のゲノムのＩｇＭプロテアーゼ部分は、Ｍａｃ－１ドメインに関する限り非常に類似しているが、残りの部分については実質的に異なる。
【0060】
［実施例２］
研究の目的
先行技術から、ストレプトコッカス・スイス血清型２（配列番号１）の完全ＩｇＭプロテアーゼは、同種攻撃に対する優れた防御作用を提供することが知られている。また、血清型９及び１４に対する多少の交差防御作用は、文献から既知である。この実施例では、血清型１の攻撃に対するこの抗原による防御作用の実際のレベルを評価する。このために、配列型１３の株を使用したが、これは細菌の通常の型であり、現場におけるこの血清型の良い代表例である。
研究の目的
先行技術から、ストレプトコッカス・スイス血清型２（配列番号１）の完全ＩｇＭプロテアーゼは、同種攻撃に対する優れた防御作用を提供することが知られている。また、血清型９及び１４に対する多少の交差防御作用は、文献から既知である。この実施例では、血清型１の攻撃に対するこの抗原による防御作用の実際のレベルを評価する。このために、配列型１３の株を使用したが、これは細菌の通常の型であり、現場におけるこの血清型の良い代表例である。
【0061】
研究デザイン
まず、血清型１の細菌による攻撃に対する防御作用を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３週齢の子ブタに攻撃を与えるモデルである。これは、ＩｇＭプロテアーゼ抗原によって誘発される防御効果を評価するためには、子ブタ自体へのワクチン接種が、その後に有効な免疫応答が発生するための時間が短すぎると予想されるため、不可能であることを意味する。したがって、ワクチンによって与えられる防御作用を評価するために、雌ブタに分娩前にワクチン接種し、これにより、誘発された抗体を初乳の摂取を介して子ブタに移行させる。ＩｇＭプロテアーゼ抗原により、ワクチン接種した動物自体に防御作用が提供されると、ワクチン接種した雌ブタの子孫にも優れた防御作用が提供されることが、文献（米国特許第１０，７５１，４０３号明細書）から既知である。換言すれば、この（間接的）攻撃モデルに見られる防御作用は、当然ながら、ワクチン接種した雌ブタの初乳の摂取を介して子ブタに提供される防御作用に加えて、ワクチン接種した動物自体に提供される防御作用を示す。
まず、血清型１の細菌による攻撃に対する防御作用を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３週齢の子ブタに攻撃を与えるモデルである。これは、ＩｇＭプロテアーゼ抗原によって誘発される防御効果を評価するためには、子ブタ自体へのワクチン接種が、その後に有効な免疫応答が発生するための時間が短すぎると予想されるため、不可能であることを意味する。したがって、ワクチンによって与えられる防御作用を評価するために、雌ブタに分娩前にワクチン接種し、これにより、誘発された抗体を初乳の摂取を介して子ブタに移行させる。ＩｇＭプロテアーゼ抗原により、ワクチン接種した動物自体に防御作用が提供されると、ワクチン接種した雌ブタの子孫にも優れた防御作用が提供されることが、文献（米国特許第１０，７５１，４０３号明細書）から既知である。換言すれば、この（間接的）攻撃モデルに見られる防御作用は、当然ながら、ワクチン接種した雌ブタの初乳の摂取を介して子ブタに提供される防御作用に加えて、ワクチン接種した動物自体に提供される防御作用を示す。
【0062】
この研究では、妊娠中の雌ブタ１０匹を使用し、それぞれ雌ブタ５匹の２つの群に分けた。予定の出産の６週間前及び２週間前に、水中油型アジュバント（μディルバックフォルテ（μＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ）、ＭＳＤアニマルヘルス社）中に１用量当たり８０μｇで血清型２の組換えｒＩｄｅＳｓｕｉｓ ＩｇＭプロテアーゼ抗原（Ｓｅｅｌｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７～２２１２、２０１５年５月５日、項目２．２．）を含むサブユニットワクチンを１つの群にワクチン接種し、もう１つの群は非ワクチン接種対照群として残した。出産後、３週齢で、ワクチン接種した雌ブタからの子ブタ１０匹、及び対照雌ブタからの子ブタ１０匹（各群は雌ブタ１匹あたり子ブタ２匹を含んでいた）を攻撃のために選択した。子ブタ（２×１０、ワクチン接種及び対照）に、カテーテルを使用し、（５．０×１０１０ＣＦＵ／ｍｌを目標とした）１０ｍｌの攻撃接種菌液で気管内攻撃を与えるか、あるいは（それが不可能であれば）、経気管注射を用いて攻撃を与えた。攻撃後、子ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について毎日観察し、０（徴候なし）から、重篤な症例の場合の３までの、系統立った採点システムを用いて採点した。人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させた。ワクチン接種の前後の定期的な時間（雌ブタ１０匹）及び攻撃の直前（子ブタ２０匹）に、抗体決定のために血清血液を採取した。攻撃（子ブタ２０匹）の前後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。研究終了時（すなわち攻撃１１日後）に、生存している全ての子ブタを安楽死させた。
【0063】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位（すなわち局所的）反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表１に示す。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位（すなわち局所的）反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表１に示す。
【表1】
【0064】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型１のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型１のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
【0065】
［実施例３］
研究の目的
この実施例では、血清型７の攻撃に対する、実施例２で使用したのと同じ抗原（血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による防御作用の実際のレベルを評価する。このために、配列型２９の株を使用したが、これは細菌の通常の型であり、現場におけるこの血清型の代表例である。
研究の目的
この実施例では、血清型７の攻撃に対する、実施例２で使用したのと同じ抗原（血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による防御作用の実際のレベルを評価する。このために、配列型２９の株を使用したが、これは細菌の通常の型であり、現場におけるこの血清型の代表例である。
【0066】
研究デザイン
血清型１と同様に、血清型７の細菌による攻撃に対する防御作用を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３．５週齢の子ブタに攻撃を与えるモデルである。したがって、この研究においても、雌ブタに分娩前にワクチン接種し、これにより、誘発された抗体を初乳の摂取を介して子ブタに移行させる。
血清型１と同様に、血清型７の細菌による攻撃に対する防御作用を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３．５週齢の子ブタに攻撃を与えるモデルである。したがって、この研究においても、雌ブタに分娩前にワクチン接種し、これにより、誘発された抗体を初乳の摂取を介して子ブタに移行させる。
【0067】
この研究では、妊娠中の雌ブタ１０匹を使用し、それぞれ雌ブタ５匹の２つの群に分けた。予定の出産の６週間前及び２週間前に、水中油型アジュバント（μディルバックフォルテ（μＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ）、ＭＳＤアニマルヘルス社）中に１用量当たり８０μｇで血清型２の組換えｒＩｄｅＳｓｕｉｓ ＩｇＭプロテアーゼ抗原（Ｓｅｅｌｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７～２２１２、２０１５年５月５日、項目２．２．）を含むサブユニットワクチンを１つの群にワクチン接種し、もう１つの群は非ワクチン接種対照群として残した。出産後、３．５週齢で、ワクチン接種した雌ブタからの子ブタ１０匹、及び対照雌ブタからの子ブタ１０匹（各群は雌ブタ１匹あたり子ブタ２匹を含んでいた）を攻撃のために選択した。子ブタ（２×１０、ワクチン接種及び対照）に、（１．０ｘ１０９ＣＦＵ／ｍｌを目標とした）１０ｍｌの攻撃接種菌液で気管内攻撃を与えた。攻撃後、子ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について毎日観察し、０（徴候なし）から、重篤な症例の場合の３までの、系統立った採点システムを用いて採点した。人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させた。ワクチン接種の前後の定期的な時間（雌ブタ１０匹）及び攻撃の直前（子ブタ２０匹）に、抗体決定のために血清血液を採取した。攻撃の前後の定期的な時間に（子ブタ２０匹）、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。研究終了時（すなわち攻撃１１日後）に、生存している全ての子ブタを安楽死させた。
【0068】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表２に示す。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表２に示す。
【表2】
【0069】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型７のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型７のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
【0070】
［実施例４］
研究の目的
この研究の目的は、血清型９の攻撃、特に血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する、実施例２及び３で使用したのと同じ抗原（すなわち血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による防御作用の実際のレベルを試験することであった。
研究の目的
この研究の目的は、血清型９の攻撃、特に血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する、実施例２及び３で使用したのと同じ抗原（すなわち血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による防御作用の実際のレベルを試験することであった。
【0071】
研究デザイン
血清陰性の特定病原体がない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ：ＳＰＦ）３週齢の子ブタ２４匹を使用した。子ブタを、１０匹ずつの２つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群は、実施例２及び３に記載したように、３週齢及び５週齢で２回、筋肉内にワクチン接種し、第２群は、非ワクチン接種攻撃対照群として残した。７週齢で、上記のＳ．ｓｕｉｓ血清型９の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、１０日間毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動性又は神経性）徴候を示した後に人道的エンドポイントに達した動物は、剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させ、Ｓ．ｓｕｉｓ感染を確認するために、細菌学的検査を含めて剖検した。攻撃の前後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。ブタは、最初のワクチン接種の日（５週齢）に、血清型２由来ＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
血清陰性の特定病原体がない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ：ＳＰＦ）３週齢の子ブタ２４匹を使用した。子ブタを、１０匹ずつの２つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群は、実施例２及び３に記載したように、３週齢及び５週齢で２回、筋肉内にワクチン接種し、第２群は、非ワクチン接種攻撃対照群として残した。７週齢で、上記のＳ．ｓｕｉｓ血清型９の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、１０日間毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動性又は神経性）徴候を示した後に人道的エンドポイントに達した動物は、剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させ、Ｓ．ｓｕｉｓ感染を確認するために、細菌学的検査を含めて剖検した。攻撃の前後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。ブタは、最初のワクチン接種の日（５週齢）に、血清型２由来ＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
【0072】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表３に示す。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表３に示す。
【表3】
【0073】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型９、配列型１６ストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼでは、血清型９、配列型１６ストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する防御作用は与えられていない。
【0074】
［実施例５］
研究の目的
この実施例では、血清型１の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、抗原を、実施例２、３及び４で使用した血清型２のＩｇＭプロテアーゼに対応させて、すなわち文献に記載（Ｓｅｅｌｅら、上記を参照されたい）の大腸菌発現系を使用して作製した。血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用される配列を添付の配列番号２に示し、一方、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用される配列を添付の配列番号３に示す。両方の配列は、Ｍａｃ－１領域に加えてＣＮＶ領域を含み、このＣＮＶ領域に２つの反復配列を有する。攻撃株は、実施例２で使用したものと同じものとした。
研究の目的
この実施例では、血清型１の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、抗原を、実施例２、３及び４で使用した血清型２のＩｇＭプロテアーゼに対応させて、すなわち文献に記載（Ｓｅｅｌｅら、上記を参照されたい）の大腸菌発現系を使用して作製した。血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用される配列を添付の配列番号２に示し、一方、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用される配列を添付の配列番号３に示す。両方の配列は、Ｍａｃ－１領域に加えてＣＮＶ領域を含み、このＣＮＶ領域に２つの反復配列を有する。攻撃株は、実施例２で使用したものと同じものとした。
【0075】
研究デザイン
研究デザインは実施例２及び３と同じものとしたが、それぞれの場合で、攻撃のために３．５週齢の子ブタを使用し、１０匹の子ブタの群を使用した。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３の攻撃に対応した。第１群には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第２群には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第３群は攻撃対照として残した。
研究デザインは実施例２及び３と同じものとしたが、それぞれの場合で、攻撃のために３．５週齢の子ブタを使用し、１０匹の子ブタの群を使用した。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３の攻撃に対応した。第１群には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第２群には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第３群は攻撃対照として残した。
【0076】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表４に示す。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表４に示す。
【表4】
【0077】
結論
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。血清型１の抗原によって与えられる同種防御作用は、血清型７の抗原によって与えられる異種防御作用よりもわずかに良好であるように思われる。
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。血清型１の抗原によって与えられる同種防御作用は、血清型７の抗原によって与えられる異種防御作用よりもわずかに良好であるように思われる。
【0078】
［実施例６］
研究の目的
この実施例では、血清型２の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、実施例５と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場における株の代表例である血清型２、配列型１の株とした。
研究の目的
この実施例では、血清型２の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、実施例５と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場における株の代表例である血清型２、配列型１の株とした。
【0079】
研究デザイン
研究デザインは、実施例４とほぼ同じものにした。３週齢の子ブタ３０匹を使用した。子ブタを、１０匹ずつの３つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群及び第２群には、３週齢及び５週齢でそれぞれのサブユニットワクチンを２回筋肉内ワクチン接種したが、第３群にはワクチン接種しなかった。７週齢で、Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２の株の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後の１１日間、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、毎日観察した。人道的エンドポイント（ｈｕｍａｎｅ ｅｎｄｐｏｉｎｔ：ＨＥＰ）に達した動物を安楽死させた。攻撃の直前、攻撃の２日後、及び該当する場合はＨＥＰの日（安楽死の直前）に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。
研究デザインは、実施例４とほぼ同じものにした。３週齢の子ブタ３０匹を使用した。子ブタを、１０匹ずつの３つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群及び第２群には、３週齢及び５週齢でそれぞれのサブユニットワクチンを２回筋肉内ワクチン接種したが、第３群にはワクチン接種しなかった。７週齢で、Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２の株の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後の１１日間、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、毎日観察した。人道的エンドポイント（ｈｕｍａｎｅ ｅｎｄｐｏｉｎｔ：ＨＥＰ）に達した動物を安楽死させた。攻撃の直前、攻撃の２日後、及び該当する場合はＨＥＰの日（安楽死の直前）に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。
【0080】
子ブタは、最初のワクチン接種の日に、血清陰性であったか、又は、特定のＩｇＭ抗体の酵素結合免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）において力価が非常に低かった。ワクチン接種後、第１群及び第２群はＩｇＭプロテアーゼに対して良好な抗体応答を示したが、対照は非常に低いレベルのままであった。
【0081】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表５に示す。ストレプトコッカス・スイスではない特有の理由のために、第１群の１匹の動物を攻撃後に安楽死させなければならなかった。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表５に示す。ストレプトコッカス・スイスではない特有の理由のために、第１群の１匹の動物を攻撃後に安楽死させなければならなかった。
【表5】
【0082】
結論
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。
【0083】
［実施例７］
研究の目的
この実施例では、血清型７の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、実施例５及び６と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場における株の代表例である血清型７、配列型２９の株とした。
研究の目的
この実施例では、血清型７の攻撃に対する防御作用を、血清型１及び血清型７のストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について評価する。このために、実施例５及び６と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場における株の代表例である血清型７、配列型２９の株とした。
【0084】
研究デザイン
研究デザインは、（攻撃株は別として）実施例５と同じものとした。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３の攻撃に対応した。第１群には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第２群には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第３群は攻撃対照として残した。
研究デザインは、（攻撃株は別として）実施例５と同じものとした。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３の攻撃に対応した。第１群には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第２群には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、第３群は攻撃対照として残した。
【0085】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表６に示す。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表６に示す。
【表6】
【0086】
結論
攻撃は以前の研究のように毒性が低いようであったが、データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。
攻撃は以前の研究のように毒性が低いようであったが、データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７の株による毒性攻撃から防御すると結論付けることができる。
【0087】
［実施例８］
研究の目的
この研究の目的は、血清型９の攻撃、特に現場で広まっている株の代表例である血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する防御抗原を見出すことであった。評価した選択肢は、バクテリン単独、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンである。ＩｇＭプロテアーゼは、文献では、バクテリンの有効性を改良するものと理解されている（Ｓｅｅｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、９３０～９４０頁、２０１３年３月、第１９５巻、第５号、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｈｏｓｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ」、国際公開第２０１５／１８１３５６号で確認）。
研究の目的
この研究の目的は、血清型９の攻撃、特に現場で広まっている株の代表例である血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する防御抗原を見出すことであった。評価した選択肢は、バクテリン単独、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンである。ＩｇＭプロテアーゼは、文献では、バクテリンの有効性を改良するものと理解されている（Ｓｅｅｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、９３０～９４０頁、２０１３年３月、第１９５巻、第５号、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｈｏｓｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ」、国際公開第２０１５／１８１３５６号で確認）。
【0088】
研究デザイン
研究デザインは実施例４で使用したものと同じものとしたが、非ＳＰＦの子ブタを使用し、１２匹ずつの３つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群には、血清型９、配列型１６の不活化ストレプトコッカス・スイス細菌を２×１０９細胞のレベルで含有するバクテリンワクチンを、３週齢及び５週齢で２回筋肉内ワクチン接種した。第２群は加えて、実施例２のＩｇＭプロテアーゼを１用量当たり８０μｇで含有した。両方のワクチンを、他の実施例で使用した水中油型アジュバントにおいて製剤化した。第３群は、非ワクチン接種攻撃対照群として残した。７週齢で、上記のＳ．ｓｕｉｓ血清型９の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、１０日間毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動性又は神経性）徴候を示した後に人道的エンドポイントに達した動物は、剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させ、Ｓ．ｓｕｉｓ感染を確認するために、細菌学的検査を含めて剖検した。攻撃の前後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。ブタは、最初のワクチン接種の日（５週齢）に、血清型２由来ＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
研究デザインは実施例４で使用したものと同じものとしたが、非ＳＰＦの子ブタを使用し、１２匹ずつの３つの群（異なる同腹仔について均等に分配）に割り当てた。第１群には、血清型９、配列型１６の不活化ストレプトコッカス・スイス細菌を２×１０９細胞のレベルで含有するバクテリンワクチンを、３週齢及び５週齢で２回筋肉内ワクチン接種した。第２群は加えて、実施例２のＩｇＭプロテアーゼを１用量当たり８０μｇで含有した。両方のワクチンを、他の実施例で使用した水中油型アジュバントにおいて製剤化した。第３群は、非ワクチン接種攻撃対照群として残した。７週齢で、上記のＳ．ｓｕｉｓ血清型９の毒性培養物で、ブタに気管内攻撃を与えた。攻撃後、ブタを、うつ状態、運動障害及び／又は神経性徴候などのＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候について、１０日間毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動性又は神経性）徴候を示した後に人道的エンドポイントに達した動物は、剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的エンドポイントに達した動物は安楽死させ、Ｓ．ｓｕｉｓ感染を確認するために、細菌学的検査を含めて剖検した。攻撃の前後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。ブタは、最初のワクチン接種の日（５週齢）に、血清型２由来ＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
【0089】
結果
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表７に示す。ストレプトコッカス・スイスではない特有の理由のために、第２群の１匹の動物を攻撃後に安楽死させなければならなかった。
いずれのワクチンも、許容できないいかなる部位反応又は全身反応も誘発しなかったため、安全であると見なすことができた。安楽死前の期間についての攻撃後のデータを表７に示す。ストレプトコッカス・スイスではない特有の理由のために、第２群の１匹の動物を攻撃後に安楽死させなければならなかった。
【表7】
【0090】
結論
血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスの毒性攻撃に対する防御作用は、その血清型のバクテリン、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンによって提供され得る。その２つの型の抗原は負に干渉せず、先行技術に基づいて予想されたものと一致する。
血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスの毒性攻撃に対する防御作用は、その血清型のバクテリン、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンによって提供され得る。その２つの型の抗原は負に干渉せず、先行技術に基づいて予想されたものと一致する。
【0091】
上記の実施例に基づけば、本発明の目的は、混合ワクチン接種計画において、ストレプトコッカス・スイス血清型７又は１のＩｇＭプロテアーゼ抗原を、ストレプトコッカス・スイスのバクテリン血清型９、配列型１６と組み合わせることによって果たすことができる。また、必要に応じて、２つのＩｇＭプロテアーゼ抗原を同様に組み合わせて、血清型１及び７の両方の攻撃に対してより良好な防御作用に到達する可能性があると考えられる。また、交差防御作用のレベルは、ＩｇＭプロテアーゼのＣＮＶ領域における反復配列の数と関係していると考えるのが合理的であり、これは、血清型２と比較した場合、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼ分子との間に違いがあるためである。つまり、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼはそれぞれ２回の反復配列を有しているのに対し、血清型２は４回の反復配列を有している。交差防御作用に違いがある理由はクリートではないが、反復配列の数が少ないと、交差防御作用がより良好なレベルに到達するのに有利なようである。
【配列表】
【国際調査報告】