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特表2024-528201クジノシドＡ化合物の結晶、その薬物組成物および応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】クジノシドＡ化合物の結晶、その薬物組成物および応用

(51)【国際特許分類】

C07H 15/24 20060101AFI20240719BHJP

A61K 31/7048 20060101ALI20240719BHJP

A61P 11/08 20060101ALI20240719BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20240719BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240719BHJP

A61K 36/185 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C07H15/24 CSP

A61K31/7048

A61P11/08

A61P11/00

A61P29/00

A61K36/185

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506629

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-02-14

(86)【国際出願番号】 CN2022109901

(87)【国際公開番号】W WO2023011512

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】202110891737.7

(32)【優先日】2021-08-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516294609

【氏名又は名称】上海凱屹医薬科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩＫＥＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４０８ＧＭａｉｎＢｕｉｌｄｉｎｇ，Ｎｏ．６３ＲｕｎａｎＢｌｖｄ，ＨｕａｎｇｐｕＤｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001807

【氏名又は名称】弁理士法人磯野国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】馬明

【テーマコード（参考）】

4C057

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C057AA06

4C057BB04

4C057DD01

4C057JJ55

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086AA04

4C086EA10

4C086EA11

4C086GA15

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4C086MA01

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(57)【要約】

本発明はクジノシドＡ化合物の結晶、その薬物組成物および応用を提供し、前記結晶は、結晶Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、ＫおよびＬを含み、各結晶の粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図のピークは明細書記載の通りである。本発明の結晶、特に結晶Ａ、ＣおよびＪは、適切な条件下安定に存在できる。本発明の結晶は、肺疾患を治療する薬物組成物の調製に用いられる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記結晶Ａ、Ｃ、Ｊ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＫおよびＬから選ばれるクジノシドＡ化合物の結晶であって、以下の特徴を有する、クジノシドＡ化合物の結晶。
前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：６．７°±０．２°、７．３°±０．２°、７．９°±０．２°、１０．５°±０．２°、１０．９°±０．２°、１４．１°±０．２°；
前記結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．８°±０．２°、１２．７°±０．２°、１４．４°±０．２°、１４．９°±０．２°、１６．３°±０．２°、１８．６°±０．２°、２５．１°±０．２°；
前記結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．７°±０．２°、９．３°±０．２°、１２．１°±０．２°、１４．１°±０．２°、１５．１°±０．２°、１６．６°±０．２°；
前記結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．４°±０．２°、７．９°±０．２°、１１．８°±０．２°、１２．５°±０．２°、１４．３°±０．２°、１５．４°±０．２°；
前記結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：６．２°±０．２°、９．９°±０．２°、１２．４°±０．２°；
前記結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：５．６°±０．２°、１１．１°±０．２°、１４．４°±０．２°；
前記結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：５．７°±０．２°、７．８°±０．２°、９．２°±０．２°、９．９°±０．２°、１７．５°±０．２°、１９．８°±０．２°、２０．０°±０．２°、２８．５°±０．２°、３７．８°±０．２°；
前記結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．６°±０．２°、１１．１°±０．２°、１２．１°±０．２°、１４．３°±０．２°；
前記結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：９．５°±０．２°、１２．３°±０．２°、１３．６°±０．２°、１４．５°±０．２°、１５．４°±０．２°、１６．２°±０．２°。

【請求項2】

前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．６°±０．２°、１２．８°±０．２°、１３．２°±０．２°、１３．６°±０．２°、１５．２°±０．２°、１６．１°±０．２°、１８．３°±０．２°、２４．１°±０．２°；
前記結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．８°±０．２°、８．１°±０．２°、１４．６°±０．２°；
前記結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．９°±０．２°、８．３°±０．２°、１３．２°±０．２°、１９．５°±０．２°、２０．３°±０．２°；
前記結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、７．２°±０．２°、１２．９°±０．２°、１９．０°±０．２°；
前記結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、７．７°±０．２°、１３．６°±０．２°、１８．１°±０．２°、１９．８°±０．２°、２０．８°±０．２°、２８．０°±０．２°；
前記結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．４°±０．２°、７．３°±０．２°、１２．０°±０．２°、１４．４°±０．２°、１７．０°±０．２°、１８．８°±０．２°、２２．５°±０．２°、２５．５°±０．２°、２５．７°±０．２°、２６．１°±０．２°；
前記結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．５°±０．２°、４．７°±０．２°、１２．７°±０．２°、１３．７°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．２°±０．２°、１８．１°±０．２°；
前記結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、４．９°±０．２°、５．５°±０．２°、８．２°±０．２°、１３．５°±０．２°、１８．７°±０．２°；
前記結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．７±０．２°、７．９°±０．２°、１６．９°±０．２°、１７．３°±０．２°、１８．８°±０．２°、２０．４°±０．２°；
ことを特徴とする請求項１に記載の結晶。

【請求項3】

前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１４に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１５に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１６に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１７に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表３に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２０に示される２θにピークが存在する；
前記結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２１に示される２θにピークが存在する；
ことを特徴とする請求項１または２に記載の結晶。

【請求項4】

前記結晶Ａは、以下のいずれか一つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の結晶。
（１）基本的に図１ａに示される粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する；
（２）基本的に図１ｂに示される示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する；
（３）基本的に図１ｃに示される熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する；および
（４）基本的に図１ｄに示される動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【請求項5】

前記結晶Ｃは、以下のいずれか一つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の結晶。
（１）基本的に図２ａに示される粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する；
（２）基本的に図２ｂに示される示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する；
（３）基本的に図２ｃに示される熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する；および
（４）基本的に図２ｄに示される動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【請求項6】

前記結晶Ｊは、以下のいずれか一つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の結晶。
（１）基本的に図３ａに示される粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する；
（２）基本的に図３ｂに示される示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する；
（３）基本的に図３ｃに示される熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する；および
（４）基本的に図３ｄに示される動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【請求項7】

クジノシドＡ化合物結晶Ａの作製方法であって、以下の内容を含む：
苦丁茶を浸透抽出、濃縮した後に、抽出物エキスを得る；エキスを希釈して遠心分離し、粗製品を得る；粗製品を高圧クロマトグラフィーで精製した後に、脱色、再結晶、凍結乾燥をし、最後は粉砕し、結晶Ａを得る；または
下記三方法のいずれか一つで前記結晶Ａを作製する：
方法一：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、当該溶解液を、白色沈殿が析出し、かつ蒸発液収集容器の入口に液滴がほとんど生じなくなる濃縮終点までに濃縮し、濃縮液を得る；当該濃縮液を凍結乾燥し、結晶Ａを得る；
方法二：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、当該溶解液に対し超音波処理し、その後ろ過し、ろ液を減圧濃縮した後に乾燥固体の結晶Ａを得る；
方法三：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、室温下で当該溶解液を自然揮発させ、乾燥固体の結晶Ａを得る。

【請求項8】

苦丁茶粉末とアルコールとの質量比が１：２．５－１：１．５になるように、純エタノールまたは５０－９０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液で浸透抽出する；抽出物エキスは、順次に、水および無水エタノールで希釈し、遠心分離し、粗製品を得、ただし、水の用量は苦丁茶粉末質量の０．５－１倍とし、無水エタノールの用量は苦丁茶粉末質量の０．３－０．８倍とする；エタノールまたはその水溶液で６０－９０℃で当該粗製品を溶解し、その後それを１０℃以下の条件下に置き、再結晶をする；約０℃で得られた結晶を凍結乾燥し、その後室温まで上げて乾燥し、最後は３２℃以上の温度下でさらに乾燥し、結晶Ａを得、ただし、凍結乾燥の時間は１－３時間とし、室温乾燥の時間は３－５時間とし、３２℃以上の乾燥時間は５－８時間とすることを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記方法一および方法二では、エタノール水溶液でアモルファスクジノシドＡを溶解する；前記方法三では、メタノールでアモルファスクジノシドＡを溶解する；前記方法一では、クジノシドＡの溶解液を得た後に、先にろ過して透明溶液を得て、さらに当該透明溶液を濃縮し、ただし、濃縮は５０－６０℃の水浴中で行い、回転速度は３０－８０ｒｐｍとし、真空度は０．０８ＭＰａ以上とすることを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項10】

以下の方法四～方法六のいずれか一つで結晶Ｃを作製する：
方法四：溶媒で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で３－５日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｃを得る；
方法五：酢酸エチルで結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で２－４日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｃを得る；
方法六：１５０－２００℃で結晶Ａを３－１０分間加熱し、結晶Ｃを得る；
以下の方法七～方法十のいずれか一つで結晶Ｊを作製する：
方法七：酢酸エチル飽和水溶液で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で３－５日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；
方法八：水で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で２－４日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；
方法九：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解する；水を入れ、室温下で一晩撹拌した後に、遠心分離し、その後得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；
方法十：アルコール系溶媒および水でアモルファスクジノシドＡを溶解した後に、０－１０℃で一晩撹拌した後に、遠心分離し、その後得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；
ことを特徴とするクジノシドＡ化合物の結晶ＣまたはＪの作製方法。

【請求項11】

前記方法四では、アセトニトリルとジイソプロピルエーテルとの体積比は１：１～１：５である；結晶Ａと溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：２０～１：５０である；
前記方法五では、結晶Ａと酢酸エチルとの質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：３０である；
前記方法六では、１７０±５℃の温度下で結晶Ａを加熱し、３－７分間保温する；
前記方法七では、結晶Ａと酢酸エチル飽和水溶液との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：２０～１：５０である；
前記方法八では、結晶Ａと水との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：３０である；
前記方法九では、アルコール系溶媒は無水アルコール系溶媒であり、クジノシドＡとアルコール系溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：３０～１：１００であり、入れられる水の量はアルコール系溶媒の体積の１－１０倍である；
前記方法十では、前記アルコール系溶媒は好ましく無水アルコール系溶媒であり、アルコール系溶媒と水との体積比は１：１～１：５であり、クジノシドＡとアルコール系溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：５０である；
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

気管拡張用、抗炎用、または肺疾患治療用薬物の調製における請求項１－６に記載のいずれか一つのクジノシドＡ化合物の結晶または請求項７－１１に記載のいずれか一つの方法で調製される生成物の応用。
好ましくは、前記肺疾患は慢性閉塞性肺疾病または喘息である；
好ましくは、前記結晶は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはそれらの任意的な混合物である；
好ましくは、前記薬物は吸入製剤である；好ましくは、前記吸入製剤は粉末エアゾール吸入剤、ガス吸入剤、噴霧吸入剤、混濁吸入剤または溶液吸入剤である。

【請求項13】

有効治療量の請求項１－６に記載のいずれか一つのクジノシドＡ化合物の結晶または請求項７－１１に記載のいずれか一つの方法で調製される生成物、および薬学において許容される担体を含むことを特徴とする肺疾患を治療する薬物組成物。
好ましくは、前記結晶は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはそれらの任意的な混合物であり、前記生成物は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはそれらの任意的な混合物を含有する；
好ましくは、前記薬物組成物は吸入製剤である；好ましくは、前記吸入製剤は粉末エアゾール吸入剤、ガス吸入剤、噴霧吸入剤、混濁吸入剤または溶液吸入剤である。

【請求項14】

需要のある患者に有効量の請求項１－６に記載のいずれか一つのクジノシドＡ化合物の結晶または請求項７－１１に記載のいずれか一つの方法で調整される生成物、または前記結晶または生成物を含有する薬物組成物を投与することを含むことを特徴とする気管拡張、抗炎または肺疾患を治療する方法；好ましくは、前記結晶は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはそれらの任意的な混合物であり、前記生成物は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはそれらの任意的な混合物を含有する。

【請求項15】

前記肺疾患は、慢性閉塞性肺疾病または喘息であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、化学・医薬、結晶作製技術分野に属し、具体的にはクジノシドＡ化合物の結晶、その薬物組成物および応用に関する。

【背景技術】

【0002】

苦丁茶冬青は、モチノキ科モチノキ属の植物である苦丁茶冬青の若葉または葉であり、中国の南部および西南地域における伝統的な薬用植物として、長い歴史にわたり広く運用され、熱と解毒を取り除き、殺菌して炎症を取り除き、腸胃を蕩滌し強くにし、咳を止め痰を取り除き、唾液を分泌し喉をうるおし、眠気を覚し脳を活性化させ、目を明らかにし智慧を益する、などの効果があり、頭痛、歯痛、赤目、熱に関する病気と煩渇および痢疾等の症状の治療には相応しい；また、血管を生き生きさせ、血中脂質を調整する効果があり、高血圧および高血中脂質等の病気の治療に相応しい。さらに、気管支平滑筋を拡張する効果があるため、各気道肺疾患（例えばＣＯＰＤおよび喘息）の治療にも相応しい。

【0003】

苦丁茶冬青から、上述の効果を有する複数のクジノシド系化合物（例えばクジノシドＡ）を抽出分離することができ、これは多くの文献によって報道され、例えば、トゥ・ペンフェイなどによる（「苦丁茶冬青の化学成分およびその血中脂質減少効果に関する研究」、中国化学会第二十五回年会、２００６年）がある。クジノシドＡは、３β－［（３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－２－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－α－Ｌ－アラビノピラノシル）オキシ］－１２β，１９，２０－トリヒドロキシウルサ－１３（１８）－エン－２８－酸２８，２０－ラクトンであり、その構造は式（Ｉ）に示される：

【化1】

【0004】

薬用化合物の結晶が違うと、その物理、化学性質が違い、また溶解度および安定性も違うため、体内での分解および吸収が違い、臨床での効果が違ってくる。そのため、薬用化合物を開発するとき、異なる結晶を全面、システム的に選び、体内での効果を探索することは、最適な結晶を選び出すのに重要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】トゥ・ペンフェイ、中国化学会第二十五回年会、２００６年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明では、複数の溶媒系で、複数の結晶方法による選択することで、クジノシドＡの１１種類の結晶が得られ、それぞれ結晶Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ₁、Ｉ₂、Ｊ、ＫおよびＬとする。ただし、結晶Ｉ₁および結晶Ｉ₂は弱結晶態（または低結晶態とも言う）であり、安定に存在することができない。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そのため、本発明では、クジノシドＡの結晶Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、ＫおよびＬが提供される。本発明はまた、任意的な比例で、二種以上の任意的な前記結晶からなる混合物を含む。本発明の結晶は、適切な条件下で安定に存在し、特に結晶Ａ、ＣおよびＪは、常温条件下で乾燥粉末の形式で安定に存在する。そのため、好ましい実施形態では、本発明はクジノシドＡの結晶Ａ、ＣおよびＪおよびそれらの任意的な混合物を提供する。

【0008】

具体的には、本発明はクジノシドＡ化合物の結晶Ａを提供し、前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：６．７°±０．２°、７．３°±０．２°、７．９°±０．２°、１０．５°±０．２°、１０．９°±０．２°、１４．１°±０．２°。

【0009】

好ましい実施例では、前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．６°±０．２°、１２．８°±０．２°、１３．２°±０．２°、１３．６°±０．２°、１５．２°±０．２°、１６．１°±０．２°、１８．３°±０．２°、２４．１°±０．２°。

【0010】

好ましい実施例では、前記結晶Ａは基本的に図１ａに示されるような粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する。

【0011】

好ましい実施例では、前記結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１に示される２θにピークが存在する；

【表1】

【0012】

好ましい実施例では、前記結晶Ａは基本的に図１ｂに示されるような示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する。

【0013】

好ましい実施例では、前記結晶Ａは基本的に図１ｃに示されるような熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する。

【0014】

好ましい実施例では、前記結晶Ａは基本的に図１ｄに示されるような動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【0015】

本発明に提供されるクジノシドＡ化合物の結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．８°±０．２°、１２．７°±０．２°、１４．４°±０．２°、１４．９°±０．２°、１６．３°±０．２°、１８．６°±０．２°、２５．１°±０．２°。

【0016】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．９°±０．２°、８．３°±０．２°、１３．２°±０．２°、１９．５°±０．２°、２０．３°±０．２°。

【0017】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃは基本的に図２ａに示されるような粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する。

【0018】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２に示される２θにピークが存在する；

【表2】

【0019】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃは基本的に図２ｂに示されるような示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する。

【0020】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃは基本的に図２ｃに示されるような熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する。

【0021】

好ましい実施例では、前記結晶Ｃは基本的に図２ｄに示されるような動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【0022】

本発明に提供されるクジノシドＡ化合物の結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．７°±０．２°、９．３°±０．２°、１２．１°±０．２°、１４．１°±０．２°、１５．１°±０．２°、１６．６°±０．２°。

【0023】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．５°±０．２°、４．７°±０．２°、１２．７°±０．２°、１３．７°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．２°±０．２°、１８．１°±０．２°。

【0024】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊは基本的に図３ａに示されるような粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図を有する。

【0025】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表３に示される２θにピークが存在する；

【表3】

【0026】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊは基本的に図３ｂに示されるような示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図を有する。

【0027】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊは基本的に図３ｃに示されるような熱重量分析（ＴＧＡ）図を有する。

【0028】

好ましい実施例では、前記結晶Ｊは基本的に図３ｄに示されるような動的水分吸着（ＤＶＳ）図を有する。

【0029】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．４°±０．２°、７．９°±０．２°、１１．８°±０．２°、１２．５°±０．２°、１４．３°±０．２°、１５．４°±０．２°。

【0030】

好ましい実施例では、前記結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．８°±０．２°、８．１°±０．２°、１４．６°±０．２°。

【0031】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１４に示される２θにピークが存在する。

【0032】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：６．２°±０．２°、９．９°±０．２°、１２．４°±０．２°。

【0033】

好ましい実施例では、前記結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、７．２°±０．２°、１２．９°±０．２°、１９．０°±０．２°。

【0034】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｄの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１５に示される２θにピークが存在する。

【0035】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：５．６°±０．２°、１１．１°±０．２°、１４．４°±０．２°。

【0036】

好ましい実施例では、前記結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、７．７°±０．２°、１３．６°±０．２°、１８．１°±０．２°、１９．８°±０．２°、２０．８°±０．２°、２８．０°±０．２°。

【0037】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｅの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１６に示される２θにピークが存在する。

【0038】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：５．７°±０．２°、７．８°±０．２°、９．２°±０．２°、９．９°±０．２°、１７．５°±０．２°、１９．８°±０．２°、２０．０°±０．２°、２８．５°±０．２°、３７．８°±０．２°。

【0039】

好ましい実施例では、前記結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．４°±０．２°、７．３°±０．２°、１２．０°±０．２°、１４．４°±０．２°、１７．０°±０．２°、１８．８°±０．２°、２２．５°±０．２°、２５．５°±０．２°、２５．７°±０．２°、２６．１°±０．２°。

【0040】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｇの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表１７に示される２θにピークが存在する。

【0041】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：７．６°±０．２°、１１．１°±０．２°、１２．１°±０．２°、１４．３°±０．２°。

【0042】

好ましい実施例では、前記結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：４．５°±０．２°、４．９°±０．２°、５．５°±０．２°、８．２°±０．２°、１３．５°±０．２°、１８．７°±０．２°。

【0043】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｋの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２０に示される２θにピークが存在する。

【0044】

本発明に提供されるクジノシドＡの結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにピークが存在する：９．５°±０．２°、１２．３°±０．２°、１３．６°±０．２°、１４．５°±０．２°、１５．４°±０．２°、１６．２°±０．２°。

【0045】

好ましい実施例では、前記結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、下記２θにさらにピークが存在する：３．７°±０．２°、７．９°±０．２°、１６．９°±０．２°、１７．３°±０．２°、１８．８°±０．２°、２０．４°±０．２°。

【0046】

好ましい実施形態では、前記結晶Ｌの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図において、表２１に示される２θにピークが存在する。

【0047】

本発明はまた、クジノシドＡ化合物の結晶Ａ、Ｃ、Ｊの作製方法を提供する。

【0048】

一好適な実施例では、クジノシドＡの結晶Ａは、苦丁茶粉末を浸漬抽出・精製した後に、特定な溶媒中で結晶させることで得られる。

【0049】

好ましくは、前記結晶Ａの作製方法は以下の通りである：苦丁茶粉末を浸透抽出、濃縮した後に、抽出物エキスを得る；エキスを希釈して遠心分離し、粗製品を得る；粗製品を二回にわたり高圧クロマトグラフィーで精製した後に、活性炭で脱色し、再結晶、凍結乾燥をする；最後は粉砕し、クジノシドＡ結晶（つまり結晶Ａ）を得る。

【0050】

好ましい実施形態では、アルコール系溶媒（例えばエタノール）で浸透抽出を行う。例えば純エタノールまたは５０－９０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液で浸透抽出を行う。通常、苦丁茶粉末とアルコールとの質量比は１：２．５－１：１．５である。抽出物エキスを、順次に、水および無水エタノールで希釈し、遠心分離することで、粗製品を得る。水の用量は苦丁茶粉末質量の０．５－１倍であってもよく、無水エタノールの用量は苦丁茶粉末質量の０．３－０．８倍であってもよい。

【0051】

好ましくは、アルコールで当該粗製品を溶解し、その後それを１０℃以下の条件下に置き、再結晶を行う。アルコールはエタノールまたはその水溶液であってもよく、例えば２０－５０％（ｖ／ｖ）のエタノール溶液である。溶解は高い温度、例えば６０－９０℃下で行う。得られる結晶を凍結乾燥（例えば約０℃で凍結乾燥）してもよく、その後、室温（例えば約２０－２８℃）まで上げて乾燥し、最後は３２℃以上の温度下で乾燥し、結晶Ａを得ることができる。通常、凍結乾燥の時間は１－３時間でもよく、室温乾燥の時間は約３－５時間でもよく、３２℃以上での乾燥時間は５－８時間でもよい。

【0052】

もう一つ好適な実施例では、クジノシドＡの結晶Ａは、アモルファスクジノシドＡを特定な溶媒中で結晶させることで得られる。

【0053】

好ましくは、前記結晶Ａの作製方法は、以下三つのいずれか一つでもよい：

【0054】

方法一：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、当該溶解液を、白色沈殿が析出し、かつ蒸発液収集容器の入口に液滴がほとんど生じなくなる濃縮終点までに濃縮し、濃縮液を得る；当該濃縮液を凍結乾燥し、結晶Ａを得る；

【0055】

方法二：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、当該溶解液に対し超音波処理し、その後ろ過し、ろ液を減圧濃縮した後に乾燥固体の結晶Ａを得る；

【0056】

方法三：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解し、クジノシドＡの溶解液を得て、室温下で当該溶解液を自然揮発させ、乾燥固体の結晶Ａを得る。
好ましくは、前記アルコール系溶媒はメタノールまたはエタノールである。好ましくは、方法一および方法二ではエタノール、例えばエタノール水溶液（例えば７０％のエタノール溶液）でアモルファスクジノシドＡを溶解する。好ましくは、方法三では、メタノールでアモルファスクジノシドＡを溶解する。アルコール系溶媒の用量は特に制限がなく、当該アモルファスクジノシドＡを十分溶解できればいい。
好ましくは、方法一では、クジノシドＡの溶解液を得た後に、先にろ過して透明溶液を得て、さらに当該透明溶液を濃縮する。ろ過穴＜５マイクロメートルのフィルムでろ過してもよい。エバポレーターで当該溶解液またはその透明溶液を濃縮してもいい。濃縮は５０－６０℃の水浴中で行ってもよく、回転速度は３０－８０ｒｐｍにしてもよく、真空度は０．０８ＭＰａ以上にしてもいい。

【0057】

一好適な実施例では、クジノシドＡの結晶Ｃは、結晶Ａを特定な溶媒中で再結晶させることで得られる。
好ましくは、前記結晶Ｃの作製方法は、以下三つのいずれか一つでもよい：

【0058】

方法四：溶媒（例えばアセトニトリルおよびジイソプロピルエーテル）で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で３－５日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｃを得る；

【0059】

方法五：酢酸エチルで結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で２－４日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｃを得る；

【0060】

方法六：１５０－２００℃で結晶Ａを３－１０分間加熱し、結晶Ｃを得る。
好ましくは、前記方法四では、アセトニトリルとジイソプロピルエーテルとの体積比は１：１～１：５である。好ましくは、結晶Ａと溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：２０～１：５０である。
好ましくは、前記方法五では、結晶Ａと酢酸エチルとの質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：３０である。
好ましくは、前記方法六では、１７０±５℃の温度下で結晶Ａを加熱し、３－７分間保温する。
一好適な実施例では、クジノシドＡの結晶Ｊは、結晶Ａを特定な溶媒中で再結晶させることで得られる。
好ましくは、前記結晶Ｊの作製方法は、以下二つのいずれか一つでもよい：

【0061】

方法七：酢酸エチル飽和水溶液で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で３－５日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；

【0062】

方法八：水で結晶Ａを溶解し、混濁液を得る；室温下で２－４日撹拌し、遠心分離する；得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る。
好ましくは、前記方法七では、結晶Ａと酢酸エチル飽和水溶液との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：２０～１：５０である。
好ましくは、前記方法八では、結晶Ａと水との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：３０である。
もう一つ好適な実施例では、クジノシドＡの結晶Ｊは、アモルファスクジノシドＡを特定な溶媒中で結晶させることで得られる。
好ましくは、前記結晶Ｊの作製方法は、以下二つのいずれか一つでもよい：

【0063】

方法九：アルコール系溶媒でアモルファスクジノシドＡを溶解する；水を入れ、室温下で一晩撹拌した後に、遠心分離し、その後得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る；

【0064】

方法十：アルコール系溶媒および水でアモルファスクジノシドＡを溶解した後に、０－１０℃で一晩撹拌した後に、遠心分離し、その後得られる固体を２５－３０℃の条件下で一晩真空乾燥し、結晶Ｊを得る。
好ましくは、前記方法九では、アルコール系溶媒は無水アルコール系溶媒、例えば無水エタノールである。クジノシドＡとアルコール系溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：３０～１：１００である。入れられる水の量は、アルコール系溶媒体積の１－１０倍であってもよい。通常、水を入れた後に、白色固体が析出し、その場合では室温下で一晩撹拌する。
好ましくは、前記方法十では、前記アルコール系溶媒は好ましくに無水アルコール系溶媒、例えば無水エタノールである。アルコール系溶媒と水との体積比は１：１～１：５であってもよい。クジノシドＡとアルコール系溶媒との質量体積比（グラム：ミリリトル）は１：１０～１：５０である。アルコール系溶媒、水およびクジノシドＡを混合した後に、例えば６０－８０℃の水浴中でクジノシドＡが完全に溶解するまで加熱してもよい。通常、約４℃で一晩撹拌する。

【0065】

一部の実施形態では、結晶Ｂは結晶Ａから作製される。具体的には、結晶Ａを１１０－１３０℃まで上げ、３－１０分間保温し、結晶Ｂを得ることができる。

【0066】

一部の実施形態では、アルコール系溶媒（例えばイソプロピルアルコール）およびクジノシドＡを混合し、例えば５５℃以上の水浴中で完全に溶解させた後に、ゆっくり固体を析出させ、室温まで徐冷し、３－６日撹拌し、遠心分離することで、結晶Ｄを得ることができる。アルコール系溶媒とクジノシドＡとの質量体積比（ｍｇ：ｍＬ）は４－８：１であってもよい。

【0067】

一部の実施形態では、クジノシドＡ、アルコール系溶媒および水を混合し、６０℃以上の温度かで溶解した後に、室温まで徐冷し、静置し、固体を析出させることで、結晶Ｅを得ることができる。アルコール系溶媒は、例えば無水エタノールであってもいい。アルコール系溶媒および水の用量は特に制限がなく、クジノシドＡを溶解できればよい。

【0068】

一部の実施形態では、クジノシドＡおよび有機溶媒（例えばテトラヒドロフラン）および水を混合し、完全に溶解させた後に、室温下で溶媒を揮発させることで、結晶Ｇを得ることができる。有機溶媒および水の用量は特に制限がなく、クジノシドＡを溶解できればよい。もちろん、溶媒の用量が多すぎると、揮発時間が影響され、作製時間が長くなる。具体的な用量は、当業者が実際の生産状況で確定できる。

【0069】

一部の実施形態では、無水エタノールでクジノシドＡを溶解した後に、２５－３０℃下で減圧濃縮・乾燥することで、結晶Ｋを得ることができる。

【0070】

一部の実施形態では、結晶Ｊを１１０℃以上に上げ、３－１０分間保温することで、結晶Ｌを得ることができる。

【0071】

本発明は、クジノシドＡ化合物の各結晶が肺疾患治療薬物の作製における応用を提供する。

【0072】

一好ましい実施例では、前記肺疾患は慢性閉塞性肺疾病または喘息である。

【0073】

一実施形態では、前記クジノシドＡ化合物の各結晶は、気管（支）を拡張させることで治療の目的を果たす；もう一つ実施形態では、前記クジノシドＡ化合物の各結晶は、抗炎によって治療の目的を果たす。

【0074】

本発明はまた、肺疾患を治療する薬物組成物を提供し、前記薬物組成物は、クジノシドＡ化合物の結晶Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、ＫおよびＬの一つまたは複数の混合物、及び薬学において許容される担体を含む。好ましくは、前記薬物組成物は、クジノシドＡの結晶Ａ、ＣおよびＪのいずれか一つまたは複数を含有する。好ましくは、前記薬物組成物では、前記クジノシドＡ化合物は結晶状態に保てる。

【0075】

一好適な実施例では、前記クジノシドＡ化合物の結晶は結晶Ａ、結晶Ｃまたは結晶Ｊである。

【0076】

一好適な実施例では、前記薬物組成物の剤形は吸入製剤である。

【0077】

一好ましい実施例では、前記吸入製剤は粉末エアゾール吸入剤、ガス吸入剤、噴霧吸入剤、混濁吸入剤または溶液吸入剤である。

【0078】

用語「薬学において許容される担体」は、本発明の薬物組成物におけるクジノシドＡ化合物（結晶）と適合し、つまりそれと混合する上で、通常では薬物組成物による肺疾患（例えば喘息や慢性閉塞性肺疾病）の治療効果を大幅に低減しないものを指す。

【0079】

一好適な実施例では、前記薬学において許容される担体は、潤滑剤、流動化剤、噴射剤、助溶媒、共溶媒、希釈剤、安定剤および静菌剤の一つまたは複数を含む。

【0080】

一好ましい実施例では、前記薬学上の担体は乳糖である。

【0081】

もう一つ好ましい実施例では、前記薬学上の担体はポリエチレングリコール２００、エタノールおよび１，１，１，２－テトラフルオロエタン（Ｒ１３４ａ）である。

【0082】

一部の実施形態では、本発明は気管（支）を拡張させる方法を提供する。当該方法は、需要のある気管（支）拡張対象に有効量の本文によるいずれかの実施形態に記載のクジノシドＡ化合物の結晶、または本文によるいずれかの実施形態に記載の方法で作製される生成物、または前記結晶または生成物を含有する薬物組成物を与えることを含む。一実施形態では、本発明は抗炎方法を提供する。当該方法は、需要のある抗炎対象（特に気管、気管支および／または肺部に炎症がある対象）に有効量の本文によるいずれかの実施形態に記載のクジノシドＡ化合物の結晶、または本文によるいずれかの実施形態に記載の方法で作製される生成物、または前記結晶または生成物を含有する薬物組成物を与えることを含む。一実施形態では、本発明は肺疾患治療方法を提供する。当該方法は、需要のある対象に有効量の本文によるいずれかの実施形態に記載のクジノシドＡ化合物の結晶、または本文によるいずれかの実施形態に記載の方法で作製される生成物、または前記結晶または生成物を含有する薬物組成物を与えることを含む。好ましくは、これらの方法では、前記結晶は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはその任意的な混合物であり、前記生成物は結晶Ａ、ＣまたはＪまたはその任意的な混合物を含有する。好ましくは、これらの方法では、前記対象は肺疾患対象、より好ましくは慢性閉塞性肺疾病または喘息の患者である。

【図面の簡単な説明】

【0083】

【図1a】図１ａはクジノシドＡの結晶Ａの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図であり、横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【図1b】図１ｂはクジノシドＡの結晶Ａの示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は熱流束（ワット／グラム）である。

【図1c】図１ｃはクジノシドＡの結晶Ａの熱重量分析（ＴＧＡ）図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は重量（％）である。

【図1d】図１ｄはクジノシドＡの結晶Ａの動的水分吸着（ＤＶＳ）図であり、横軸は相対湿度（％）であり、縦軸は重量（％）である。

【図2a】図２ａはクジノシドＡの結晶Ｃの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図であり、横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【図2b】図２ｂはクジノシドＡの結晶Ｃの示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は熱流束（ワット／グラム）である。

【図2c】図２ｃはクジノシドＡの結晶Ｃの熱重量分析（ＴＧＡ）図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は重量（％）である。

【図2d】図２ｄはクジノシドＡの結晶Ｃの動的水分吸着（ＤＶＳ）図であり、横軸は相対湿度（％）であり、縦軸は重量（％）である。

【図3a】図３ａはクジノシドＡの結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図であり、横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【図3b】図３ｂはクジノシドＡの結晶Ｊの示差走査熱量（ＤＳＣ）解析図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は熱流束（ワット／グラム）である。

【図3c】図３ｃはクジノシドＡの結晶Ｊの熱重量分析（ＴＧＡ）図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は重量（％）である。

【図3d】図３ｄはクジノシドＡの結晶Ｊの動的水分吸着（ＤＶＳ）図であり、横軸は相対湿度（％）であり、縦軸は重量（％）である。

【図4a】図４ａは長期試験および加速試験条件下でのクジノシドＡの結晶Ｊの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図であり、横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【図4b】図４ｂは長期試験および加速試験条件下でのクジノシドＡの結晶Ｊの熱重量分析（ＴＧＡ）図であり、横軸は温度（℃）であり、縦軸は重量（％）である。

【図5a】図５ａは結晶Ａおよび結晶Ｊの競争開始の際での混合サンプルおよび単一結晶の粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図である。横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【図5b】図５ｂは結晶Ａおよび結晶Ｊが３日間競争した後の粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）図である。横軸は２θ値（度）であり、縦軸は強度（カウント）である。

【発明を実施するための形態】

【0084】

以下の説明では、本発明の様々な実施形態を完全に理解するための詳細が記載される。しかしながら、当業者は、本発明がこれらの詳細がなくても実施できることを理解するべきである。いくつかの実施形態に対する以下の説明は、本開示が特許請求される主題の例とみなされるべきであることを理解してなされるものであり、添付の特許請求の範囲を示される特定の実施形態に限定する意図はない。本開示の全ての見出しは、便宜のためにのみ提供されており、いかなる形でも特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。見出しの下に示される実施形態は、他の見出しの下に示される実施形態と組み合わせることができる。

【0085】

明細書および特許請求の範囲全体を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「含む」という語およびその変形は、オープンで包括的な意味、つまり「含むがそれに限定されない」と解釈されるべきであり、「含む」やその変形には、「主に…からなる」と「…からなる」が含まれる。

【0086】

本明細書における「一実施形態」または「実施形態」では、当該実施形態において記載される特定の特徴、構造または特性は、本発明の少なくとも一実施形態に含まれる。そのため、本明細書全体に現れる「一実施形態において」または「ある実施形態において」という語句は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の実施形態において適切な方法で組み合わせることができる。

【0087】

本文では、「薬学において許容される担体」には、ＦＤＡまたはＮＭＰＡまたはその他の関連機関によってヒトまたは家畜への使用が許容されると承認されている任意の助剤、担体、賦形剤、流動化剤、甘味料、希釈剤、防腐剤、染料/着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒または乳化剤を含むが、それに限定されない。

【0088】

本文では、「薬物組成物」は、本発明の化合物と、生物学的に活性な化合物を哺乳動物（ヒトなど）に送達するための当技術分野で一般に認められている媒体を含む製剤である。この媒体は、このための全ての薬学において許容される賦形剤を含む。

【0089】

本文では、「有効量」または「治療有効量」とは、本発明の化合物の量であり、需要のある患者に投与する場合、化合物が有用な病状、障害または疾患の治療を果たすことができる。このような量は、研究者または臨床医が求める組織系または患者の生物学的または医学的反応を引き出すのに十分である。治療有効量を構成する本発明の化合物の量は、以下の要因に応じて変化する：化合物およびその生物学的活性、投与に使用される組成物、投与時間、投与経路、化合物の排泄速度、治療継続期間、治療しようとする病状または障害の種類および重症度、本発明の化合物と組み合わせてまたは併用して使用される薬剤、ならびに患者の年齢、体重、一般的な健康、性別、食事。このような治療有効量は、当業者であれば、自身の知識、従来技術、および本開示に基づいて決定することができる。

【0090】

他に説明がない限り、本明細書の「治療」という用語は、その用語が適用される障害もしくは病状、またはそのような障害もしくは病状の１つ以上の症状を逆転させる、軽減する、進行を阻害する、または予防することを意味する。「予防」とは、疾患または病状の臨床症状の発現を阻止する疾患または病状のあらゆる治療を意味する。

【0091】

本文では、「対象」または「患者」とは、治療、観察または実験の対象となったことがある、または対象となる哺乳動物（ヒトを含む）などの動物を指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療および／または獣医学へ応用できる。一部の実施形態では、対象は哺乳動物（または患者）である。一部の実施形態では、対象（または患者）は、ヒト、家畜（例えばイヌおよびネコ）、農場動物（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタ）および／または実験動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウサギ、イヌおよびサル）である。一部の実施形態では、対象（または患者）はヒトである。「需要のあるヒト（または患者）」とは、特定の治療、例えば、本明細書に記載の本明細書に開示される化合物による治療から恩恵を受ける疾患または症状を患っている可能性がある、または患っていると疑われるヒトを指す。

【0092】

本文における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」という説明には、「Ｘ」に関する説明が含まれる。さらに、単数形「一」および「当該」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。そのため、例えば、「当該化合物」への言及には、様々なそのような化合物が含まれ、「当該測定」への言及には、当業者に公知の１つ以上の測定およびその等価物への言及が含まれる。

【0093】

本文では、「薬学において許容される」または「生理学において許容される」とは、獣医学またはヒトの医薬応用に適した薬物組成物の調製に有用な化合物、塩、組成物、剤形および他の物質を指す。

【0094】

本文では、「単位剤形」は、対象（例えば、ヒト対象および他の哺乳類）に対する単位用量として適した物理的に別個の単位であり、各単位は、必要な治療活性物質を適切な医薬賦形剤とともに生成するように計算された所定の量を含有する。

【0095】

本文では、例えば、ＸＲＰＤ図、ＤＳＣサーモグラム、ＤＶＳ図、またはＴＧＡ図に言及する場合、「基本的に…に示されるように」という用語は、必ずしも正確に本明細書に記載されるものではないが、当業者が考慮した場合、実験誤差または偏差の範囲内にあるグラフ、サーモグラムまたは図を含むことを意味する。

【0096】

一部の実施形態では、化合物の特定の結晶形に関して、「基本的に純」または「基本的に含まない」という用語は、その結晶形を含む組成物が２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、または１重量％未満の他の結晶形および／または不純物を含む他の物質を含有することを意味する。一部の実施形態では、「基本的に純」または「基本的に含まない」とは、他の結晶形および／または不純物を含む他の物質を含まない物質を指す。例えば、不純物には、化学反応による副生成物または残留試薬、汚染物質、分解生成物、他の結晶形、水、および溶媒が含まれる場合がある。

【0097】

本文では、結晶の特徴的な粉末Ｘ線回折ピーク位置について、角度位置(２θ)の許容誤差を±０．２°とする。この誤差は、２つの粉末Ｘ線回折図を比較するときに用いられる。ある図の特定の回折ピークが、測定されたピーク位置から±０．２°の特定の角度位置範囲（２θ）として割り当てられ、別の図の回折ピークが、測定されたピーク位置から±０．２°の別の角度位置範囲として割り当てられ、しかもこれらのピーク範囲が重なる場合、この２つのピークは同じ角度位置（２θ）を持つと見なされる。例えば、図の回折ピークが５．２０°にあると測定された場合、比較の目的で、許容誤差によりそのピークに５．００°－５．４０°の範囲を割り当てることができる。比較の目的で、別の回折図の対照ピークが５．３５°にあると測定された場合、許容誤差により、そのピークには５．１５°－５．５５°の範囲が割り当てられる。２つのピーク位置範囲には重複があるため、比較される２つのピークは同じ角度位置(2θ)を持つと見なされる。一部の実施形態では、角度位置（２θ）の許容誤差は±０．１°とする。

【0098】

本文では、「超音波」または「超音波処理」は、溶液中の物質を完全に混合または完全に溶解するために使用される。超音波処理のプロセスパラメータは、異なる処理対象に応じて変化し、実際の使用条件に従って当業者が設定することができる。例えば、超音波治療出力は６０ワット－２０００ワット、周波数は２０キロヘルツ～８０キロヘルツ、時間は５分間－１５０分間に設定することができる。

【0099】

本発明は、複数の機械分析方法で、作製されるクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊを同定（例えば粉末Ｘ線回折解析）するとともに、それらの性質を研究（例えば示差走査熱量解析、熱重量分析および動的水分吸着解析）する。

【0100】

粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）は、結晶構造解析によく使われ、その回折強度は結晶単位中の原子の元素や数、およびその配列で決定される。結晶の粉末Ｘ線回折測定方法は当業者にとって既知であり、本発明は粉末Ｘ線回折機でクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊに対し測定を行い、具体的な測量条件は表４に示される（特別な説明がない限り、そしてサンプルは測定まで研磨されない）：

【表4】

【0101】

測定した結果、結晶Ａ、Ｃ、Ｊは、粉末Ｘ線回折図において、特定のピークを有する；具体的には、結晶Ａ、Ｃ、Ｊに関しては、表１、２、３に示される２θにそれぞれピークが存在する。

【0102】

示差走査熱量解析（ＤＳＣ）は重要な熱解析方法であり、サンプルの吸熱または放熱速度（単位：ミリジュール/秒）を縦軸とし、温度または時間を横軸とし、例えば結晶速度、溶融温度、物質の相転移温度等の複数の熱力学および動力学パラメータの測定に用いられる。結晶の示差走査熱量解析法は当業者にとって既知であり、本発明は示差走査熱量解析機でクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊに対し測定を行い、具体的な測量条件は表５に示される。

【表5】

【0103】

発明者は、上述の方法で、主にクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊの脱溶媒ピークおよび融点などのパラメータを測定した。
結晶Ａの示差走査熱量解析の結果は図１ｂに示される：その脱溶媒ピークの温度範囲は約３０℃～１２０℃であり、その融点は約２０５℃である。
結晶Ｃの示差走査熱量解析の結果は図２ｂに示される：その脱溶媒ピークの温度範囲は約２０℃～６０℃であり、その融点は約３１０℃である。
結晶Ｊの示差走査熱量解析の結果は図３ｂに示される：その脱溶媒ピークの温度範囲は約２０℃～１２０℃であり、その融点は約３０９℃である。

【0104】

熱重量分析（ＴＧＡ）は熱重分析ともいい、プログラム制御された温度下で、測定しようとするサンプルの質量と温度または時間の変化との関係を測定する熱分析方法を指し、サンプルの熱安定性および考えられる中間生成物成分などの品質に関する情報を研究するために用いられる。包括的な熱分析を実行するために、他の熱分析手法と組み合わせて用いられることがある。結晶の熱重量分析法は当業者にとって既知であり、本発明は熱重量分析機でクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊに対し測定を行い、具体的な測量条件は表６に示される。

【表6】

【0105】

結晶Ａの熱重量分析の結果は図１ｃに示される：その８０℃前の重量減少は約６．８％であり、かつその分解温度は約３１８℃である。
結晶Ｃの熱重量分析の結果は図２ｃに示される：その７０℃前の重量減少は約１．２％であり、かつその分解温度は約３１５℃である。
結晶Ｊの熱重量分析の結果は図３ｃに示される：その１２０℃前の重量減少は約５．８％であり、かつその分解温度は約３２４℃である。

【0106】

動的水分吸着（ＤＶＳ）法は、サンプルの水分吸着性を解析し、水分吸着等温線を記録する検出法であり、化合物の水分吸着能力を確認することでその安定性を判断する。結晶の動的水分吸着解析法は当業者にとって既知であり、本発明は動的水分吸着機でクジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊに対し水分吸着解析を行い、具体的な測量条件は表７に示される。

【表7】

【0107】

結晶Ａの熱重量分析の結果は図１ｄに示される：相対湿度が０％～８０％であると、その重量変化は約１２％であるため、結晶Ａは吸湿性がある。
結晶Ｃの熱重量分析の結果は図２ｄに示される：相対湿度が０％～８０％であると、その重量変化は約１．８％であるため、結晶Ｃは吸湿性がややある。
結晶Ｊの熱重量分析の結果は図３ｄに示される：相対湿度が０％～８０％であると、その重量変化は約４．７％であるため、結晶Ｊは吸湿性がある。

【0108】

本発明で言及された上記の特徴、または実施例で言及された特徴は、任意に組み合わせることができる。本願明細書に開示されているすべての特徴は、任意の構成形態と組み合わせて使用することができ、明細書に開示されている各特徴は、同等、類似、または同様の目的を提供できる任意の代替特徴に置き換えることができる。従って、特に明記されていない限り、開示されている特徴は、同等または類似の特徴の一般的な例に過ぎない。

【0109】

特に定義がない限り、本文で使用されているすべての専門用語及び科学用語は、当業者によく知られている用語と同じ意味を有する。さらに、記載された内容と類似または同等のすべての方法および材料を、本発明の方法に適用することができる。本文における好ましい実施形態と材料は、説明のためだけに使用される。

【0110】

本明細書では、特に説明がない限り、前記数値または数値範囲は、前置詞「約」の存在有無にかかわらず、当業者に理解される当該数値または数値範囲に均等な範囲を含み、例えば当該数値または端点値±１０％の範囲、もしくは±５％、±３％、±２％、±１％または±０．５％の範囲であってもいい。

【0111】

以下、実施例に基づき、本発明のより詳細な説明を行う。しかし、これらの実施例は説明のために挙げられ、本発明の範囲を限定するものではないのは、理解されるべきである。

【実施例1】

【0112】

実施例１：クジノシドＡ結晶Ａの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0113】

クジノシドＡ結晶Ａの作製の具体的な手順は以下の通りである：
２０ｋｇ苦丁茶粉末を３４．４ｋｇの８０％エタノール溶液で浸透抽出し、濃縮した後の抽出物エキスに水を入れて、１７ｋｇの最終エキスを得た；１０．２ｋｇ無水エタノールで希釈して遠心分離し、粗製品を得た。
粗製品を順次に３０μｍフィラーのクロマトグラフィーおよび１０μｍフィラーのクロマトグラフィーを通過させ、計二回の高圧クロマトグラフィーで精製した後に、さらに活性炭で脱色し、クジノシドＡ粗製粉末を得た；後に、３５％エタノールで８０℃水浴の条件下でクジノシドＡ粗製粉末を溶解し、それを６℃水浴の条件下に置き、結晶を析出させた；結晶を０℃で二時間凍結乾燥し、その後２５℃に上げて４時間乾燥し、最後は３５℃で６時間乾燥した；最後は、粉砕して、約１７０ｇのクジノシドＡ結晶（つまり結晶Ａ）を得た。
上述のように作製された結晶ＡでＸ線回折測定を行った。使用された機械やそのパラメータは表４に示される。得られたデータは表１に示され、表１に示される２θにピークが存在する。

【実施例2】

【0114】

実施例２：クジノシドＡ結晶Ｃの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0115】

クジノシドＡ結晶Ｃの作製の具体的な手順は以下の通りである：
a. 実施例１に示される作製方法で、まず結晶Ａを作製した；
b. １００ｍｇの結晶Ａに１ｍＬアセトニトリルおよび２ｍＬジイソプロピルエーテルを入れて混濁液を得て、室温の条件下で４日間撹拌し、その後遠心分離した。沈殿物を３０℃で一晩真空乾燥して、結晶Ｃを得た。
クジノシドＡ結晶Ｃで粉末Ｘ線回折測定を行った。使用された機械やそのパラメータは表４に示される。得られたデータは表２に示され、表２に示される２θにピークが存在する。

【実施例3】

【0116】

実施例３：クジノシドＡ結晶Ｊの作製およびその粉末Ｘ線回折測定
クジノシドＡ結晶Ｊの作製の具体的な手順は以下の通りである：
a. 実施例１に示される作製方法で、まず結晶Ａを作製した；
b. １００ｍｇの結晶Ａに３ｍＬ酢酸エチル飽和水溶液を入れて混濁液を得て、室温の条件下で４日間撹拌し、遠心分離し、３０℃で一晩真空乾燥して、結晶Ｊを得た。
クジノシドＡ結晶Ｊで粉末Ｘ線回折測定を行った。使用された機械やそのパラメータは表４に示される。得られたデータは表３に示され、表３に示される２θにピークが存在する。

【実施例4】

【0117】

実施例４：クジノシドＡ結晶Ａの安定性試験

【0118】

実施例１で作製された結晶Ａで、表８に示される条件で安定性試験を行った。このうち、結晶Ａは低ホウケイ酸ガラスバイアルに入れ、医薬品複合袋(つまりアルミ箔袋とシリカゲル乾燥剤の小袋)で包み、真空引きした後、密封して保管した。

【表8】

【0119】

高速液体クロマトグラフィーで結晶Ａにおける性状、水分、クジノシドＡ含有量および関連物質に対し測定し、機械はＤＡＤ（またはＰＤＡ）検出器を備えた超高速液体クロマトグラフであり、パラメータは以下のとおりである：
カラム: ＡｇｉｌｅｎｔＣ１８（２．１＊１００ｍｍ、１．８－Ｍｉｃｒｏｎ）;
移動相Ａ：アセトニトリル；
移動相Ｂ：超純水；
検出波長：２２５ｎｍ；
流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；
注入量：５μl；
カラム温度：３８℃；
作動時間：２８分間；
定組成溶出：移動相Ａ：移動相Ｂ＝２６：７４（Ｖ／Ｖ）；
希釈液：ニトリル：水＝３０：７０（Ｖ／Ｖ）；
ブランク溶液：希釈液。

【0120】

一、クジノシドＡ含有量の具体的な測定手順は以下の通りである：
不純物Ａ原液の準備：不純物Ａ（つまりクジノシドＢ）約１０ｍｇを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、希釈液で溶解し、適量に希釈し、よく混ぜ、１ｍＬごとに約１００μｇ不純物Ａを含む溶液を作製し、不純物Ａ原液とする。
不純物Ｄ原液の準備：不純物Ａ原液の作製手順と同じように、不純物Ａを不純物Ｄ（つまりクジノシドＣ）に置き換え、１ｍＬごとに約１００μｇ不純物Ｄを含む溶液を作製する。
不純物Ｆ原液の準備：不純物Ａ原液の作製手順と同じように、不純物Ａを不純物Ｆ（つまりクジノシドＤ）に置き換え、１ｍＬごとに約１００μｇ不純物Ｆを含む溶液を作製する。
分離度溶液の準備：クジノシドＡ約５０ｍｇを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、希釈液で溶解し、適量に希釈し、よく混ぜる；その後、当該溶液１ｍＬおよび不純物Ａ、Ｄ、Ｆ原液それぞれ０．６ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜ、１ｍＬごとに約クジノシドＡ５０μｇ、不純物Ａ６μｇ、不純物Ｄ６μｇ、不純物Ｆ６μｇを含む溶液を作製し、分離度溶液とする。
標準溶液１の準備：クジノシドＡ標準物を約５０ｍｇを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、希釈液で溶解し、適量に希釈し、よく混ぜる；１ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜ、１ｍＬごとにＫＡ約５０μｇを含む溶液を作製し、標準溶液１とする。
標準溶液２の準備：標準溶液１の作製手順と同じように、標準溶液２を作製する。
測定対象溶液の準備：約５０ｍｇのサンプルを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、希釈液で溶解し、適量に希釈し、よく混ぜる；１ｍＬ溶液を１０ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜて得る（測定対象溶液の濃度は５０μｇ／ｍＬ）（同じように二つ作製する）。
ＵＰＬＣ解析を実行する前に、すべてのサンプル溶液を０．２２μｍＰＴＦＥニードルフィルターで濾過する必要がある。
注入手順：クロマトグラフィーの条件に応じて、ブランク溶液、分離度溶液、標準溶液１、標準溶液２、測定対象溶液、標準溶液１をそれぞれ注入し、クロマトグラフィーの全プロセスを記録する。
結果の計算：標準溶液１で外部標準法によりクジノシドＡの含有量を算出する。

【0121】

二、関連物質含有量の具体的な測定手順は以下の通りである：
まず、上述のクジノシドＡ含有量の測定法に従い、不純物Ａ、Ｄ、Ｆ原液、標準溶液１、標準溶液２を作製する。次に、以下の溶液を作製する。
分離度溶液：クジノシドＡ６０ｍｇを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、不純物Ａ、不純物Ｄおよび不純物Ｆ原液各０．９ｍＬをそれぞれ入れ、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜて得る（クジノシドＡ、不純物Ａ、不純物Ｄおよび不純物Ｆの濃度はそれぞれ６００、０．９、０．９および０．９μｇ／ｍＬである）。
感度溶液：１ｍＬ標準溶液１を１００ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜる；３ｍＬ溶液を１００ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈し、よく混ぜ、１ｍＬごとにＫＡを約０．１５μｇ含む溶液を調製し、感度溶液（０．０２５％不純物限界溶液に相当）とする。
測定サンプル溶液：クジノシドＡ６０ｍｇを精密に量り、１００ｍＬメスフラスコに置き、希釈液で溶解し、適量に希釈し、よく混ぜて得る。同じように二つサンプルを作製し、ＴＳ１およびＴＳ２とする。
対照溶液：測定サンプル溶液１ｍＬを１００ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈する。１ｍＬ溶液を１０ｍＬメスフラスコに精密に量り、希釈液で適量に希釈する。同じように二つサンプルを作製し、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２とする。
ＵＰＬＣ解析を実行する前に、すべてのサンプル溶液を０．２２μｍＰＴＦＥニードルフィルターで濾過する必要がある。
注入手順：クロマトグラフィーの条件に応じて、ブランク溶液、分離度溶液、感度溶液、標準溶液１、標準溶液２、測定対象溶液、対照溶液、標準溶液１をそれぞれ注入し、クロマトグラフィーの全プロセスを記録する。
結果の計算：補正係数を用いた自己対照法により、測定サンプル溶液中の各物質の含有量を算出する。そのうち、不純物Ａ（つまりクジノシドＢ）、不純物Ｄ（つまりクジノシドＣ）、不純物Ｆ（つまりクジノシドＤ）の補正係数はそれぞれ１．１３、０．８０、０．８２である。

【0122】

上記の方法によって得られた結晶Ａの安定性データは表９、１０および１１に示される。

【表9】

【表10】

【表11】

【0123】

表９－１１に示される結果からわかるように、実施例１で作製される結晶Ａは、いずれかの試験条件下でも、規定の標準を満たすため、良好な安定性を有することが証明される。

【実施例5】

【0124】

実施例５：クジノシドＡの結晶Ａ、Ｃ、Ｊの吸湿性試験

【0125】

実施例１－３で作製された結晶Ａ、Ｃ、Ｊを各約１０ｍｇ取り、動的水分吸着機（ＤＶＳ）でそれぞれの吸湿性を測定（試験条件：温度は２５℃で、相対湿度は０％～８０％とする）し、以下の表１２に示される標準で各結晶の吸湿性特徴を判断した。この吸湿性試験の手順および判断標準は《中華人民共和国薬典２０２０年版（四部）》通則９１０３―薬物吸湿性試験指導原則に参照する。

【表12】

【0126】

本試験では、結晶Ａ、Ｃ、Ｊの動的水分吸着（ＤＶＳ）図はそれぞれ図１ｄ、２ｄ、３ｄに示される。そして、その吸湿性の結果は表１３に示される。

【表13】

【0127】

表１３からわかるように、結晶Ａ、Ｃ、Ｊの吸湿性は：Ａ＞Ｊ＞Ｃ。２０２０年版の吸湿性標準によると、結晶Ｃはやや吸湿性がある；結晶ＡおよびＪは吸湿性がある。結晶Ｃは吸湿性に関して明らかに有利である。

【実施例6】

【0128】

実施例６：クジノシドＡの結晶Ｊの安定性実験

【0129】

２５ｍｇ結晶Ｊを取り、シャーレに平らに広げ、長期条件（温度：２５℃±２℃；相対湿度：６５％±１０％）および加速条件（温度：４０℃±２℃；相対湿度：７５％±１０％）下で、覆わずに暗所に１０日間放置し、粉末Ｘ線回折測定および熱重量分析を行った。粉末Ｘ線回折機およびそのパラメータは表４に示される；熱重量分析器およびそのパラメータは表６に示される。測定結果は図４に示される。

【0130】

図４ａからわかるように、長期試験および加速試験の条件下では、結晶Ｊの粉末Ｘ線回折図におけるピークはいずれも変わっていないため、結晶が変わっていないのが証明される；図４ｂからわかるように、長期試験および加速試験の条件下では、結晶Ｊの重量減少は変わっていない。つまり、結晶Ｊの安定性が良好である。

【実施例7】

【0131】

実施例7：クジノシドＡの結晶Ａおよび結晶Ｊの競争実験

【0132】

まず、初期混合サンプルを作製する：同じ量のクジノシドＡの結晶Ａ、結晶Ｊサンプルを取り、よく混ぜ、サンプリングしてＸＲＰＤを行った。用いられる機械やそのパラメータは表４に示され、図５ａに示される比較図が得られた。
サンプルに水を加えて混濁液を形成し、室温下で撹拌し、３日間後に、遠心分離し、サンプリングしてＸＲＰＤを行った（ウェットサンプル）；３０℃で真空乾燥した後に、ＸＲＰＤを行った（ドライサンプル）。用いられる機械やそのパラメータは表４に示され、測定結果は図５ｂに示される。
図５ｂからわかるように、ドライサンプルであっても、ウェットサンプルであっても、測定により、得られる水和物はいずれも結晶Ｊである。つまり、一定の条件下で、結晶Ａは結晶Ｊに変わりやすい。

【実施例8】

【0133】

実施例８：クジノシドＡの他の新型結晶の作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0134】

1. 結晶Ｂの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0135】

クジノシドＡ結晶Ｂの作製方法：実施例１に示される作製方法でまず結晶Ａを作製した。適量の結晶Ａサンプルを取り、加熱で１２０℃まで上げ、５分間保温して、結晶Ｂを得た。

【0136】

上述のように作製された結晶ＢでＸ線回折測定を行った。使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られるデータは表１４に示される。

【表14】

【0137】

結晶Ｂは、上記の表１４に記載の２θにピークが存在する。そして、結晶Ｂは高温条件でしか安定に存在できない。

【0138】

2. 結晶Ｄの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0139】

約１００ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、１５ｍＬイソプロピルアルコールを入れ、超音波をかけ、６０℃の水浴中で完全に溶解するまで撹拌し、その後固体がゆっくり析出し、室温まで徐冷し、４日間撹拌し、遠心分離し、結晶Ｄを得た。

【0140】

上述のように作製された結晶ＤでＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表１５に示される。

【表15】

【0141】

結晶Ｄは、上記の表１５に記載の２θにピークが存在する。そして、結晶Ｄは潤った状態のウェットサンプルでしか安定に存在できない。

【0142】

3. 結晶Ｅの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0143】

クジノシドＡ結晶Ｅの作製方法：約３０ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、０．８ｍＬエタノールおよび０．２ｍＬ水を入れ、７０℃の水浴中で完全に溶解するまで加熱し、室温まで徐冷し、一晩放置した後に、固体を析出させ、結晶Ｅを得た。

【0144】

上述のように作製された結晶ＥでＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表１６に示される。

【表16】

【0145】

結晶Ｅは、上記の表１６に記載の２θにピークが存在する。そして、結晶Ｅは潤った状態のウェットサンプルでしか安定に存在できない。

【0146】

4. 結晶Ｇの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0147】

クジノシドＡ結晶Ｇの作製方法：約１００ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、３ｍＬテトラヒドロフランおよび１．２ｍＬ水を入れ、完全に溶解するまで超音波をかけ、室温で覆わずに放置し、揮発させ、結晶Ｇを得た。

【0148】

上述のように作製された結晶ＧでＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表１７に示される。

【表17】

【0149】

結晶Ｇは、上記の表１７に記載の２θにピークが存在する。そして、結晶Ｇは潤った状態のウェットサンプルでしか安定に存在できない。

【0150】

5. 結晶Ｉ₁の作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0151】

クジノシドＡ結晶Ｉ₁の作製方法：約３０ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、１ｍＬトリフルオロエタノールを入れ、完全に溶解するまで超音波をかけ、室温で覆わずに放置し、揮発させ、結晶Ｉ₁を得た。

【0152】

上述のように作製された結晶Ｉ₁でＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表１８に示される。

【表18】

【0153】

結晶Ｉ₁は、上記の表１８に記載の２θにピークが存在する。

【0154】

6. 結晶Ｉ₂の作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0155】

クジノシドＡ結晶Ｉ₂の作製方法：約１００ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、３ｍＬトリフルオロエタノールを入れ、完全に溶解するまで超音波をかけ、ろ過、室温で覆わずに放置し、乾燥まで揮発させ、結晶Ｉ₂を得た。

【0156】

上述のように作製された結晶Ｉ₂でＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表１９に示される。

【表19】

【0157】

結晶Ｉ₂は、上記の表１９に記載の２θにピークが存在する。

【0158】

7. 結晶Ｋの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0159】

クジノシドＡ結晶Ｋの作製方法：約１００ｍｇアモルファスクジノシドＡを取り、１５ｍＬエタノールを入れ、完全に溶解するまで超音波をかけ、ろ過、２８℃下で減圧濃縮して乾燥し、結晶Ｋを得た。

【0160】

上述のように作製された結晶ＫでＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表２０に示される。

【表20】

【0161】

結晶Ｋは、上記の表２０に記載の２θにピークが存在する。

【0162】

8. 結晶Ｌの作製およびその粉末Ｘ線回折測定

【0163】

クジノシドＡ結晶Ｌの作製方法：実施例３に示される作製方法でまず結晶Ｊを作製した；適量の結晶Ｊを取り、加熱で１２０℃まで上げ、５分間保温して、結晶Ｌを得た。

【0164】

上述のように作製された結晶ＬでＸ線回折測定を行い、使用された機械やそのパラメータは表４に示され、得られたデータは表２１に示される。

【表21】

【0165】

結晶Ｌは、上記の表２１に記載の２θにピークが存在する。そして、結晶Ｌは高温条件でしか安定に存在できない。

【実施例9】

【0166】

実施例９：クジノシドＡの生物学的な活性

【0167】

1. クジノシドＡによる気管支平滑筋の拡張効果

【0168】

まず、異なる濃度のクジノシドＡ溶液を調製した：実施例１で得られたクジノシドＡ結晶Ａ０．３２５３ｇを量り、１ｍＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて溶解し、クジノシドＡ結晶Ａ原液を調製し、その後、ＤＭＳＯで１μＭ、３．２μＭ、１０μＭ、３２μＭクジノシドＡ結晶Ａ溶液にそれぞれ希釈した。
そして、気管支輪を作製した：６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを頸椎脱臼により殺し、左右の気管支を除去し、実体顕微鏡下で気管支を解剖して左右の気管支を取得し、それらを長さ約２ｍｍの気管支輪に切断した。
さらに、気管支輪の張力のバランスをとた：気管支輪を二つの金属ワイヤーで固定し、５ｍＬの平衡食塩水（Ｋｒｅｂ溶液）を入れた３７℃の水槽に吊るし、５％二酸化炭素および９５％酸素からなる混合ガスを連続注入した；次に、張力トランスデューサーを使用して気管支輪の張力のバランスをとり、６０ｍＭ塩化カリウムを使用して事前刺激してからバランスを再調整した。
最後に、気道張力測定と投与を行った:機械を校正し、検出システムをゼロ調整した；マウスの張力が安定したときに、張力値Ａを記録した；最終濃度を１０μＭにするように、５μＬ、１０ｍＭメラニン凝集ホルモンを５ｍＬＫｒｅｂ溶液に添加して、気管支輪の収縮張力が最高ピークに達したとき、５μＬ異なる濃度（１μＭ、３．２μＭ、１０μＭ、３２μＭ）のクジノシドＡ結晶Ａ溶液を添加し、表２２に示すように、気管支張力の変化を記録し、気道張力緩和のパーセンテージを計算した。このうち、クジノシドＡ溶液を添加する時点の１分間前の張力の平均値をＢとし、クジノシドＡ添加した２０分間後の張力の平均値をＣとし、気道張力緩和のパーセンテージ＝（Ｂ―Ｃ）／（Ｂ―Ａ）。

【0169】

【表22】

【0170】

上記の表２２から、クジノシドＡの濃度が１μＭである条件下では、それは気管支平滑筋に対して緩和効果を有さない；しかし、クジノシドＡの濃度が３．２μＭ、１０μＭ、３２μＭである条件下では、気管支平滑筋に対して緩和効果がある程度あり、ＫＡ濃度が高いほど、気管支平滑筋に対して緩和効果が強くなることが分かる。

【0171】

2. クジノシドＡの抗炎効果

【0172】

まず、異なる濃度のクジノシドＡ溶液を準備した。具体的な手順は以下のとおりである。

【0173】

（１）１５ｍｇ／ｍＬのクジノシドＡ結晶Ａ原液の調製：実施例１で得られたクジノシドＡ結晶Ａ０．５０９９０ｇを量り、３３．９９３ｍＬのプロピレングリコールを加え、超音波で溶解して約４０ｍＬ、１５ｍｇ/ｍＬのクジノシドＡ結晶Ａ原液を得て、暗所、室温で保存した；
（２）１．５ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液の調製:１５ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ結晶Ａ原液２ｍＬを量り、１８ｍＬ２５％プロピレングリコールを加えて希釈し、２０ｍＬ１．５ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液を得て、すぐに使う。
（３）０．３ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液の調製:１．５ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液４ｍＬを量り、１６ｍＬ３２．５％プロピレングリコールを加えて希釈し、２０ｍＬ０．３ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液を得て、すぐに使う。
（４）０．０６ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液の調製:０．３ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ作業溶液３ｍＬを量り、１２ｍＬ３２．５％プロピレングリコールを加えて希釈し、１５ｍＬ０．３ｍｇ／ｍＬクジノシドＡ溶液を得て、すぐに使う。

【0174】

次に、明らかな肺炎症を伴う喘息マウスモデルを構築した：Ｂａｌｂ／ｃマウスに、初日に６ｍｇ／ｍＬ鶏卵アルブミン１００μＬと４ｍｇ水酸化アルミニウムを腹腔内注射し、８日目には３．６ｍｇ／ｍＬ鶏卵アルブミン１００μＬと４ｍｇ水酸化アルミニウムを注射し、１５日目には１ｍｇ／ｍＬ鶏卵アルブミン１００μＬと４ｍｇ水酸化アルミニウムを注射し、２０－２３日目に毎日３０分間かけて６ｍＬ２％鶏卵アルブミンで刺激をかけ、明らかな肺炎症を伴う喘息マウスモデルを構築した。このうち、マウスのブランク対照群では、鶏卵アルブミンの代わりに１００μＬＰＢＳを使用した。

【0175】

最後に噴霧治療を行った。２４日目から異なる濃度（０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ）のクジノシドＡ溶液を1日２回、1回３０分間で合計１２ｍＬ投与し、噴霧治療を行い、噴霧治療の１時間後に６ｍＬ２％鶏卵アルブミンを使用して３０分間刺激をかけ、そのように１５日間投与・刺激した；最後の投与・刺激の２４時間後、つまり３９日目にサンプルを取って、サンプルを取る前に、２回で各回３０分間、合計１２ｍＬのクジノシドＡ溶液を、対応する噴霧治療濃度でクジノシドＡ溶液を投与することで治療し、上記は、異なる用量のクジノシドＡ治療の実験群スキームである。陰性対照群のマウスでは、クジノシドＡを３０％プロピレングリコールに置き換え、噴霧投与を行った。

【0176】

フローサイトメトリーを使用して、マウス肺胞洗浄液サンプル中の白血球における好酸球（ＥＯ）の割合を検出した。このうち、ブランク群には１５匹のマウス、陰性対照群には１２匹のマウス、そして高濃度、中濃度、低濃度のクジノシドＡ実験群にはそれぞれ１８匹、１３匹、１４匹のマウスがいた。結果を以下の表２３に示される。

【0177】

【表23】