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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】核酸医薬の徐放性能の強化方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20240719BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240719BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240719BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240719BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240719BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240719BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/711
A61K48/00
A61P43/00 105
C12N15/10 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506876
(86)(22)【出願日】2022-07-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 CN2022109084
(87)【国際公開番号】W WO2023011360
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】202110883137.6
(32)【優先日】2021-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524045286
【氏名又は名称】エルエヌシーティーエーシー カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＮＣＴＡＣ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】宋 旭
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ 永云
(72)【発明者】
【氏名】袁 ▲徳▼雨
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲暁▼霞
(72)【発明者】
【氏名】▲曾▼ 秒
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076CC41
4C076EE30
4C076EE59
4C076FF31
4C084AA13
4C084NA12
4C084ZB21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA12
4C086ZB21
(57)【要約】
本発明は、核酸医薬の徐放性能の強化方法に関する。本発明の方法は、核酸医薬の５’末端および／または３’末端、および／または核酸医薬の内部に特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡを付加する工程を含む。核酸医薬の徐放性能の強化は、核酸医薬のｉｎ ｖｉｖｏでの徐放時間を遅らせ、核酸医薬のｉｎ ｖｉｖｏでの作用時間を増加させることを指す。前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡはグアニン四重鎖であり、前記グアニン四重鎖の構造はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸医薬の５’末端および／または３’末端、および／または核酸医薬の内部に特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡを付加する工程を含み、核酸医薬の徐放性能の強化は核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味し、
前記核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に延長し前記核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に増加させることが好ましい核酸医薬の徐放性能の強化方法。
【請求項2】
前記核酸医薬は無修飾核酸医薬または化学修飾核酸医薬であってもよい請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸医薬の配列の長さは８ｎｔ以上であり、好ましくは８～５０００ｎｔであり、より好ましくは８～２０００ｎｔであり、最も好ましくは８～１０００ｎｔである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸医薬は一本鎖ＤＮＡ医薬、二本鎖ＤＮＡ医薬、一本鎖ＲＮＡ医薬、二本鎖ＲＮＡ医薬、または核酸類縁体であり、好ましくは前記核酸医薬はＲＮＡ核酸アプタマー、ｍＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯ、ＤＮＡ核酸アプタマー、またはその他のＤＮＡ医薬であり、
前記ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、またはその他の調節性ＲＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡは連続Ｇ塩基が間隔を空けて現れているＤＮＡまたはＲＮＡであり、前記連続Ｇ塩基は２～１０のグアニンの繰り返し塩基であり、前記連続Ｇ塩基の間隔の数は４～１６であり、間隔を空けて現れている各連続Ｇ塩基におけるＧ塩基の繰り返しの数は同じであっても異なっていても良く、好ましくは前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡはさらに、Ｇを含むまたはＧを含まない１～６の任意の塩基の配列である、間隔を空けて現れているスペーサー配列を含有し、前記スペーサー配列の間隔の数は３～１５であり、間隔を空けて現れている各スペーサー配列は同じであっても異なっていてもよい請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡはグアニン四重鎖であり、前記グアニン四重鎖の配合はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含み、
Ｇはグアニンを表し、
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３であり、
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ，Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表し、
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０から選択された整数、好ましくは１～６から選択された整数、より好ましくは１～３から選択された整数であり、
好ましくは前記グアニン四重鎖は、
【請求項7】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡは無修飾または化学修飾配列であり、好ましくは前記化学修飾の配列は、【請求項8】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡと核酸医薬との関係が、特定の配列のＤＮＡがＤＮＡ医薬を徐放するか、特定の配列のＤＮＡがＲＮＡ医薬を徐放するか、特定の配列のＲＮＡがＤＮＡ医薬を徐放するか、または特定の配列のＲＮＡがＲＮＡ医薬を徐放することであり、
好ましくは前記特定の配列のＤＮＡがＤＮＡ医薬と結合してその徐放性能を強化するか、または前記特定の配列のＲＮＡがＲＮＡ医薬と結合してその徐放性能を強化することである請求項５に記載の方法。
【請求項9】
強化された徐放性能は核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味し、核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に増加させることが好ましい、徐放性能が強化された核酸医薬の調製におけるグアニン四重鎖の使用。
【請求項10】
グアニン四重鎖の配合はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含み、Ｇはグアニンを表し、
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３であり、
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ，Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表し、
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０から選択された整数、好ましくは１～６から選択された整数、より好ましくは１～３から選択された整数であり、
好ましくは前記グアニン四重鎖は、
【請求項11】
前記グアニン四重鎖におけるヌクレオチドは化学修飾されており、好ましくは前記化学修飾グアニン四重鎖は、
＊はホスホロチオエート結合を表し、ＭＯＥはリボースの２’位におけるヒドロキシル基（－ＯＨ）がメトキシエチルと置換されていることを表す請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
ＰＣＳＫ０をノックダウンしＬＤＬを抑制する、グアニン四重鎖含有の核酸医薬であって、前記核酸医薬は両末端に一つ以上のグアニン四重鎖が修飾されたＡＳＯであり、
（１） 前記グアニン四重鎖はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含む配合の核酸フラグメントであり、
Ｇはグアニンを表し、
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３であり、
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ，Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表し、
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０から選択された整数、好ましくは１～６から選択された整数、より好ましくは１～３から選択された整数であり、
好ましくは前記グアニン四重鎖は、
さらに前記グアニン四重鎖のヌクレオチドは化学修飾されていても良く、
好ましくは前記化学修飾されたグアニン四重鎖は、
＊はホスホロチオエート結合を表し、ＭＯＥはリボースの２’位におけるヒドロキシル基（－ＯＨ）がメトキシエチルと置換されていることを表し、
（２）前記ＡＳＯは以下の配列、
【請求項13】
前記核酸医薬が以下の配列、【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は中国特許庁に２０２１年８月２日に出願された中国特許出願公開第２０２１１０８８３１３７．６号明細書を基礎とする優先権を主張するものであり、その開示の全てをここに取り込む。
【0002】
本発明は生物医学およびバイオテクノロジーの分野に関し、さらに具体的には核酸医薬の徐放性能の強化方法に関する。
【背景技術】
【0003】
徐放剤は、投与後の薬を長時間継続的に放出させ、長期効果を発揮させることができる製剤である。半減期が短い薬または頻繁に投与が必要な薬に対してこのような製剤を用いることで、投与回数を減少させ、薬の血中濃度の変動を抑えて血中濃度を安定化させ、薬の毒性作用と副作用の低減に寄与し、総投与量を減らして最小の投与量で最大の効果を発揮させることが可能である。さらに、刺激を抑え、治療効果を長時間持続させることができ、安全であるという利点もある。そのため、病院では徐放剤への関心が益々高まっている。
【0004】
核酸医薬の徐放を実現する方法として現在報告されているものは、主に核酸徐放アジュバントを用いる方法と核酸医薬をポリマーナノ粒子として調製する方法である。核酸徐放アジュバントはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃの徐放アジュバント、またホワイトオイル、ステアリン酸アルミニウム、スパン８０等を用いて調製した徐放アジュバントを含む。ポリマーナノ粒子は、核酸を用いてキトサンおよびＰＬＡ－ＰＥＧから形成したナノ粒子等を含む。しかし、これらの調製方法は複雑であり現時点で広く使われていない。
【0005】
グアニン四重鎖は、反復した連続のグアニン（Ｇ）に富むＤＮＡまたはＲＮＡを折り重ね形成された高次構造である。Ｇ－カルテットは四重鎖の構造単位である。四つのグアニン塩基はフーグスティーン型水素結合によって連結し平面のリング構造を成すことができる。複数のＧ―カルテットがπ－πスタッキングによって重層しグアニン四重鎖を形成する。グアニン四重鎖は安定した二次構造を持つオリゴヌクレオチドの一種である。
【0006】
現時点で、グアニン四重鎖や類似の構造が核酸の徐放性能を強化させる役割を担うといった報告はない。
【0007】
前述に基づき本発明を提案する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明によって解決する技術課題は、核酸医薬の生物中における徐放性能を強化できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前述の技術課題を解決するため、本発明は以下の技術的解決策を採用する。
【0010】
核酸医薬の５’末端および／または３’末端、および／または前記核酸医薬の内部に特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡを付加する工程を含む核酸医薬の徐放性能の強化方法。
【0011】
ここで核酸医薬の徐放性能の強化とは、核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し、核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味する。核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に延長することが好ましく、核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に増加することが好ましい。
【0012】
前記核酸医薬は無修飾核酸医薬または化学修飾核酸医薬であってもよい。
【0013】
さらに、前記核酸医薬の配列の長さは、８ｎｔ以上、好ましくは８～５０００ｎｔ、より好ましくは８～２０００ｎｔ、最も好ましくは８～１０００ｎｔである。
【0014】
さらに、前記核酸医薬は一本鎖ＤＮＡ医薬、二本鎖ＤＮＡ医薬、一本鎖ＲＮＡ医薬、二本鎖ＲＮＡ医薬、または核酸類縁体である。
【0015】
さらに、前記核酸医薬は、ＲＮＡ核酸アプタマー、ｍＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ核酸アプタマー、またはその他のＤＮＡ医薬である。
【0016】
さらに、前記ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ等の調節性ＲＮＡである。
【0017】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡは、連続Ｇ塩基が間隔を空けて現れているＤＮＡまたはＲＮＡである。前記連続Ｇ塩基は２～１０Ｇの繰り返し塩基である。前記連続Ｇ塩基の間隔の数は４～１６であり、間隔を空けて現れている連続Ｇ塩基それぞれにおいて、Ｇ塩基の繰り返しの数は同じであるか異なる。
【0018】
好ましくは、前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡはさらに、Ｇを含むまたはＧを含まない１～６の任意の塩基の配列である、間隔を空けて現れているスペーサー配列を含有する。前記スペーサー配列の間隔の数は３～１５であり、間隔を空けて現れている各スペーサー配列は同じであるか異なる。
【0019】
より好ましくは、前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡはグアニン四重鎖である。
【0020】
グアニン四重鎖の配合はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含む。
【0021】
Ｇはグアニンを表す。
【0022】
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３である。
【0023】
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表す。
【0024】
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは１～３から選択された整数である。
【0025】
前記グアニン四重鎖は好ましくは、
【0026】
本発明のさらなる改良として、前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡは、いかなる修飾もされていない配列または化学修飾された配列である。前記化学修飾はＭＯＥ修飾および硫黄修飾であることが好ましく、３’末端または５’末端の塩基における修飾であることが好ましい。より好ましくは、前記化学修飾配列は、
【0027】
ここで、＊はホスホロチオエート結合を表し、ＭＯＥはリボースの２’位におけるヒドロキシル基（－ＯＨ）がメトキシエチルと置換されていることを表す。
【0028】
特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡと核酸医薬の関係において、
特定の配列のＤＮＡがＤＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＤＮＡがＲＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＲＮＡがＤＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＲＮＡがＲＮＡ医薬を徐放してもよい。
特定の配列のＤＮＡがＤＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＤＮＡがＲＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＲＮＡがＤＮＡ医薬を徐放してもよく、特定の配列のＲＮＡがＲＮＡ医薬を徐放してもよい。
【0029】
前記特定の配列のＤＮＡはＤＮＡ医薬して徐放性能を強化することが好ましく、また前記特定の配列のＲＮＡはＲＮＡ医薬と結合して徐放性能を強化することが好ましい。
【0030】
さらに本発明は、徐放性能が強化された核酸医薬の調製におけるグアニン四重鎖の使用に関する。
【0031】
ここで徐放性能の強化とは、核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し、核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味する。核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に延長することが好ましく、核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に増加させることが好ましい。
【0032】
前記グアニン四重鎖の配合はＧｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含む。
【0033】
Ｇはグアニンを表す。
【0034】
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３である。
【0035】
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表す。
【0036】
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは１～３から選択された整数である。
【0037】
好ましくは、前記グアニン四重鎖は
【0038】
さらに本発明は、ＰＣＳＫ９をノックダウンさせ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を抑制する、グアニン四重鎖を含有する核酸医薬に関する。前記核酸医薬は両末端が一つ以上のグアニン四重鎖で修飾されたオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。
【0039】
（１）前記グアニン四重鎖は、Ｇｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含む配合の核酸フラグメントである。
【0040】
Ｇはグアニンを表す。
【0041】
ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３である。
【0042】
Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表す。
【0043】
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは１～３から選択された整数である。
【0044】
好ましくは、前記グアニン四重鎖は
【0045】
さらに、前記グアニン四重鎖のヌクレオチドは化学修飾されていてもよい。好ましくは、化学修飾されたグアニン四重鎖は、
【0046】
＊はホスホロチオエート結合を表し、ＭＯＥはリボースの２’位におけるヒドロキシル基（－ＯＨ）がメトキシエチルと置換されていることを表す。
【0047】
（２） 前記ＡＳＯは以下の通りである。
【0048】
好ましくは、前記核酸医薬は以下の任意の配列または以下を任意に組み合わせた配列の核酸である。
【発明の効果】
【0049】
前述の技術的解決策により、本発明は少なくとも以下の利点を持つ。
【0050】
（１）発明者は特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡにより生体における核酸医薬の徐放性能を強化できることを発見した。また、発明者は本発明の方法により、異なる配列および長さの一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＲＮＡの動物における徐放性能を強化できることを実験的に証明した。本発明の方法により、異なる構造の核酸医薬の動物における徐放性能を強化し、さらに核酸医薬の応用を促進できることを証明した。
【0051】
（２）本発明の方法を用いて、５０００ｎｔ以下の長さの核酸医薬の徐放および長期改善を行うことができ、徐放効果を著しく改善できる。すなわち、核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで約２～２０日に延長し、核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで約２～２０日に増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【0052】
［用語の説明］
【0053】
「核酸」、「核酸分子」、および／または「核酸医薬」
【0054】
本明細書においてこれらの用語は同じ意味で使われ、任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを指す。これらはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドでもよい。これらは無修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。これらの用語は一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を混合したＤＮＡ，一本鎖および二本鎖ＲＮＡ，一本鎖および二本鎖領域を混合したＲＮＡ、および一本鎖または二本鎖の、または一本鎖および二本鎖領域を混合したＤＮＡおよびＲＮＡを含有するハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。
【0055】
本発明における「核酸」、「核酸分子」、および／または「核酸医薬」の用語は、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、遺伝子活性化、遺伝子修飾、遺伝子編集、遺伝子調節、タンパク質発現、タンパク質調節、または生体検知等、様々な用途に用いられ、核酸医薬としても用いられる。
【0056】
「核酸修飾」、「化学修飾」、および／または「化学修飾核酸」
【0057】
本明細書においてこれらの用語は同じ意味で使われ、以下の記載のいずれか一つまたは組み合わせを指す。
【0058】
（１）核酸構造の修飾
【0059】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸（例えば、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ）は一つ以上の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾等）を含有し、これにより新しいまたは強化された特性（例えば、強化された安定性）を持つ核酸となる。当該技術において公知の通り、ヌクレオシドは塩基と糖の化合物である。ヌクレオシドの塩基部分は通常ヘテロ環塩基である。このようなヘテロ環塩基に最も多い二種類はプリンとピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドと、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基とを含む。ペントフラノースを含むこのようなヌクレオシドにおいて、糖の２’、３’、または５’のヒドロキシル部分にリン酸基が結合していてもよい。核酸の形成過程において、リン酸基は隣り合うヌクレオシドと共有結合し直鎖状の重合性化合物を形成する。反対に、直鎖状の高分子化合物のそれぞれの末端がさらに結合して環状化合物を形成してもよい。一般的には直鎖化合物が適している。さらに、直鎖化合物は内部ヌクレオチド塩基相補性を有していてもよく、そうすることによって、このように折り重なり全体または一部が二本鎖である化合物を生成してもよい。核酸内におけるリン酸基は、核酸を形成するヌクレオシド間バックボーンと呼ばれることが多い。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常結合またはバックボーンは３’と５’のホスホジエステル結合である。
【0060】
（２）修飾バックボーンおよび修飾ヌクレオシド間結合
【0061】
好適な修飾核酸は例えば、修飾バックボーンまたは人工のヌクレオシド間結合を有する核酸である。核酸（修飾バックボーンを有する核酸）としては、バックボーンにリン原子を保持する核酸、およびバックボーンにリン原子を有していない核酸を含む。
【0062】
リン原子含有の好適な修飾核酸は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスフェートを含むメチルおよびその他のアルキルホスフェート、５’アルキレンホスフェート、キラルホスフェート、ホスホネート、３’アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、ジアミノホスフェート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’－５’結合を有するセレノホスフェートおよびボロホスフェート、２’－５’結合したこれらの類縁体、および反転した極性を有する核酸であり、一つ以上のヌクレオチド間結合は３’と３’、５’と５’、または２’と２’の結合である。反転した極性を有する核酸は、ヌクレオチド間結合に３’と３’の単結合を含有する。すなわち、塩基を有さない（核酸塩基が失われた、またはヒドロキシル基と置換された）単反転ヌクレオシドの残留物であってもよい。様々な塩（カリウム塩やナトリウム塩等）、混合塩、および遊離酸構造も含まれる。
【0063】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸は一つ以上のホスホロチオエート結合および／またはリン原子ヌクレオシド間結合を含有し、これらの結合は具体的にはＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、または－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－（天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合は－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２－として表される）でもよい。
【0064】
その他のバックボーン修飾としては、例えば、モルフォリノバックボーン構造を有する核酸を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、リボース環の代わりに六員のモルフォリン環を含む。いくつかの実施形態において、ホスホジエステル結合の代わりにジアミノホスフェートまたはその他のホ非ホスホジエステルヌクレオシド間結合が含まれている。
【0065】
リン原子を含有しない好適な修飾ポリヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルとのヌクレオシド間結合、または一つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式のヌクレオシド間結合によって形成されたバックボーンを有する。これらのバックボーンとしては、モルフォリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から成る）を有するバックボーン、シロキサンバックボーン、スルフィドおよびスルホキシドおよびスルホンバックボーン、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン、リボアセチルバックボーン、アルキレン含有バックボーン、スルファメートバックボーン、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン、スルフォネートおよびスルホンアミドバックボーン、アミドバックボーン、および混合のＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素を有するその他のバックボーンを含む。
【0066】
その他のバックボーン修飾としては、２’ヒドロキシルが糖環の４’の炭素原子と結合し、２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン結合を形成することで二環性糖部分を成すロック核酸（ＬＮＡ）を含む。鎖はメチレン（－ＣＨ２－）（２’の酸素原子と４’の炭素原子を架橋する基）でもよく、ｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５－４５６）。ＬＮＡおよびＬＮＡ類縁体は相補的なＤＮＡおよびＲＮＡによって高い二本鎖の熱安定性（Ｔｍ＝＋３℃～＋１０℃）、３’－核酸エキソ分解に対する安定性と優れた可溶性を発揮する。
【0067】
ＬＮＡのアデニン、シトシン、グアニン、５－メチル－シトシン、チミン、およびウラシルモノマーの合成および調製、またこれらのオリゴマー化および核酸の認識性については、先行技術（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７－３６３０）に記載されている。
【0068】
（３）修飾糖部分
【0069】
本発明の核酸はさらに一つ以上の置換された糖部分を含んでいてもよい。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ、Ｆ、Ｏ－またはＳ－またはＮ－アルキル、Ｏ－またはＳ－またはＮ－アルケニル、Ｏ－またはＳ－またはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択された糖置換基を含み、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニルは置換されたまたは置換されていない炭素数１～１０のアルキルまたは炭素数２～１０アルケニルおよびアルキニルでもよい。特に好適な糖置換基としては、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２を含み、ｎおよびｍは１から約１０である。その他の好適なポリヌクレオチドは、炭素数１～１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、アラルキル、Ｏ－アルキルアリール、またはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、核酸の薬物動態特性を高める基または核酸の薬力学的特性を高める基、および同様の特性を持つその他の基から選択された糖置換基を含む。好適な修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）、２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわちアルコキシーアルコキシ基を含む。その他の好適な修飾は、以下の実施例で記載する２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術において２’－Ｏ－ジメチルーアミノーエトキシルーエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとして知られる）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【0070】
その他の好適な糖置換基としては、メトキシル（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロピルオキシル（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフッ素（Ｆ）を含む。２’糖置換基はアラビノース（上部の）位置またはリボース（下部の）位置でもよい。好適な２’－アラビノース修飾は２’－Ｆである。同様の修飾はオリゴマー化合物上のその他の位置でなされていてもよく、具体的には２’－５’結合核酸における３’末端のヌクレオシドまたは糖の３’位および５’末端のヌクレオチドの５’位である。さらにオリゴマー化合物はペントフラノースの代わりにシクロブチル部分等の糖の模倣体を有していてもよい。
【0071】
（４）塩基修飾および置換
【0072】
本発明の核酸はさらに核酸塩基（当該技術において単に「塩基」とも呼ぶ）の修飾または置換を含む。ここで用いる「無修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２ーアミノアデニン、６－メチルおよびアデニンとグアニンのその他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンとグアニンのその他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基のその他のアルキル誘導体、６－アゾウラシルおよびシトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８―置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ（特に５－ブロモ）、５－トリフルオロメチルおよびその他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノーアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニン等の、その他の合成のまたは天然の核酸塩基を含む。その他の修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）およびフェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）等の三環系ピリミジン、置換されたフェナジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）等のＧ－クリップを含む。
【0073】
ヘテロ環式塩基部分としてはさらに、プリン塩基またはピリミジン塩基が７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、２－アミノピリジン、および２－ピリドン等の他のヘテロ環と置き換えられたヘテロ環式塩基部分を含んでもよい。その他の核酸塩基としては、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐｐ．８５８－８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されている核酸塩基、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄｉｔｉｏｎ，３０，６１３，１９９１に開示されている核酸塩基、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９－３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されている核酸塩基を含む。これらの核酸塩基の中には、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有効なものもある。これらの核酸塩基は、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリンを含む。例えば、５―メチルシトシン置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６℃～１．２℃高め（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３，２７６－２７８）、好適な塩基置換であり、特に２’－Ｏメトキシエチル糖修飾と組み合わせるとさらに好適であることが示されている。
【0074】
（５）コンジュゲート修飾
【0075】
その他の本発明の核酸の修飾としては、ポリヌクレオチドに対する核酸の活性、細胞分布、または細胞吸収を強化する一つ以上の部分またはコンジュゲートとの化学結合を伴う修飾でもよい。これらの部分またはコンジュゲートは、第一級ヒドロキシル基または第二級ヒドロキシル基等の官能基を共有結合させるコンジュゲート基を含んでいてもよい。コンジュゲート基は、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル類、オリゴマー類の薬力学的特性を高める基、およびオリゴマー類の薬物動態特性を高める基を含むがこれらに限定されない。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナンスリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含むがこれらに限定されない。薬力学的特性を高める基としては、吸収の促進、耐劣化性の強化、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションの促進のための基を含む。薬物動態特性を高める基は、本発明の核酸の吸収、分布、代謝、または排泄を促進する基を含む。コンジュゲート部分としては、以下の脂質部分を含むが、これらに限定されない。
【0076】
コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４，４，１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２，６６０，３０６－３０９； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２，２０，５３３－５３８）、脂肪鎖族、例えばドデカンジオールまたはウンデシルの残留物（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１， １０：１１１１－１１１８； Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０，２５９：３２７－３３０； Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９－５４）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデチル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデチル―ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４； Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３－９３７）等。
【0077】
「グアニン四重鎖」
【0078】
グアニン四重鎖は、反復した連続のグアニン（Ｇ）に富むＤＮＡまたはＲＮＡを折り重ねて形成した高次構造である。Ｇ－カルテットは四重鎖の構造単位である。四つのグアニン塩基はフーグスティーン型水素結合によって連結し平面のリング構造を成すことができる。複数のＧ―カルテットがπ－πスタッキングによって重層しグアニン四重鎖を形成する。グアニン四重鎖は安定した二次構造を持つ核酸の一種である（Ｚａｈｌｅｒ， Ａ．Ｍ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｃｅｃｈ， Ｔ．Ｒ． ＆ Ｐｒｅｓｃｏｔｔ． Ｄ．Ｍ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｂｙ Ｇ－ｑｕａｒｔｅｒ ＤＭＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３５０，７１８－７２０（１９９１）参照、またこれを本明細書の一部として全ての目的のために援用する）。グアニン四重鎖は、カルテットの各ペアの間の中央部位にカチオン、特カリウムが存在することで、さらに安定化する。グアニン四重鎖はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、およびＰＮＡにより形成されていてもよく、分子内、二分子型、または四分子型グアニン四重鎖でもよい。グアニン四重鎖の構造は、カルテットまたはカルテットの一部を形成するストランドの配向によってパラレル型またはアンチパラレル型と呼ぶことができる（例えば、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ｇ Ｎ， Ｌｅｅ Ｍ Ｐ Ｈ， Ｎｅｉｄｌｅ Ｓ， Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｒａｌｌｅｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ＤＮＡ． Ｎａｔｕｒｅ ４１７（６８９１）：８７６－８８０（２００２）、Ｗａｎｇ Ｙ， Ｐａｔｅｌ Ｄ Ｊ， Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｒｅｐｅａｔ ｄ［ＡＧ３（Ｔ２ＡＧ３）３］ Ｇ－ｔｅｔｒａｐｌｅｘ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １（４）： ２６３－２８２（１９９３）、およびＤａｉ Ｊ． Ｃａｒｖｅｒ Ｍ．， Ｙａｎｇ Ｄ，． Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｎｉｅｒｉｃ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．９０（８）：１１７２－１１８３ （２００８）参照、またこれらを本明細書の一部として全ての目的のために援用する）。
【0079】
いくつかの実施形態において、本発明のグアニン四重鎖の配合を持つ核酸は、Ｇｘ１Ｎｙ１Ｇｘ２Ｎｙ２Ｇｘ３Ｎｙ３Ｇｘ４を含み、Ｇはグアニンを表し、ｘ１～ｘ４はそれぞれ独立して２～１０から選択された整数、好ましくは３～５から選択された整数、最も好ましくは３である。Ｎはそれぞれ独立して任意の塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、好ましくはＴまたはＵを表す。
【0080】
ｙ１～ｙ３はそれぞれ独立して１～１０、好ましくは１～６、より好ましくは１～３から選択された整数である。
【0081】
いくつかの実施形態において、本発明のグアニン四重鎖は分子内、二分子型、または四分子型グアニン四重鎖でもよい。いくつかの実施形態において、本発明のグアニン四重鎖は、カリウムやナトリウムイオン等の一価カチオン類等のカチオン類、およびマグネシウム、カルシウム、亜鉛、銅イオン等の二価カチオン類等のカチオン類を含んでいてもよい。
【0082】
「コンジュゲート」、「付加」、および「連結」
【0083】
本発明において、「コンジュゲート」、「付加」、および「連結」の用語は同じ意味で使われ、全て特定のフラグメントを化学結合によって連結または挿入することを指す。
【0084】
「薬学的に許容可能な担体」
【0085】
上記には、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、吸収抑制剤等の、投薬と適合する任意のまたは全ての溶媒が含まれている。このような担体や試薬の使用は当該技術において周知である。本明細書において提案される物質と不適合でない限り、任意の担体または試薬を構成物に使用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【0086】
【図9】図９は５’末端および／または３’末端のＧ１および内部と外部に含有されたＧ１の徐放効果の評価結果（図９のＡ）、また異なる種類の核酸における異なる種類のＧ１の徐放効果の評価結果（図９のＢ）である（動物のｉｎ ｖｉｖｏ結果）
【実施例】
【0087】
特に断らない限り、以下実施例で用いた素材は全て市販のものであり、実験に用いた様々な特定の実験手法は当該技術における従来の実験方法であるか、または製造元が提案する手順や条件に従って行われており、必要に応じて当業者によって常習的に決定してもよい。
【0088】
［実施例１］
本発明の方法によって強化したアプタマーの動物における徐放の評価結果
本発明の方法によって強化したアプタマーの動物における徐放の評価結果
【0089】
本発明の方法によって強化したアプタマーの動物における徐放性能を評価するために、本発明の方法によって強化した核酸アプタマーをＣｙ５．５で標識した。ＣＤ３５配列の両末端にそれぞれＧ１配列を付加し、Ｃｙ５．５を用いて（Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＣＤ３５）を形成した。
【0090】
まず、特定の無修飾ＤＮＡ（Ｇ１）の、アプタマーの徐放を強化する性能を検証した。Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＣＤ３５を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部脱毛したマウスに注射した。以下の方法でマウスに皮下注射を行った。マウスを掴み固定し、後肢の間の皮膚をアルコール綿球で拭き、体重に応じた量の薬剤を注射器で抽出し、針を上向きにしてそっと皮膚に刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど針を皮下に刺し入れゆっくりと注射を行う。皮下注射の成功後、マウスの皮膚の注射部位が膨れ、針が刺し入れた方向とは逆方向に滑らかに引き出され注射が完了となる。注射後０日目、１日目、３日目、５日目、１０日目、２０日目にそれぞれｉｎ ｖｉｖｏ撮像を行い、皮下注射後のＣｙ５．５－Ｇ１－ＣＤ３５の分布を観察した。
【0091】
図１の結果に示す通り、本発明の方法を採用したＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＣＤ３５の注射後２０日目にはまだ蛍光を検出できた。また、２０日目に検出した前記蛍光は、本発明の強化方法を採用していないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ１（ＲＳ１配列においては、Ｇ１配列の代わりにＧ１配列と同じ長さの無作為の配列をＣＤ３５の両末端に付加しコントロールとした）において２４時間後に検知した蛍光より強かった。
【0092】
その後、マウスを解剖し、臓器における蛍光強度を検知した。図２の結果に示す通り、Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＣＤ３５を注射したマウスの肝臓には蛍光を検知できたが、コントロールのマウスには蛍光を検知できなかった。つまり、本発明の方法により強化したアプタマーは動物における優れた徐放性能を有していた。
【0093】
さらに、特定の化学修飾ＤＮＡ（Ｇ１Ｍ）によって強化したアプタマーの動物における徐放性能を検証した。同じ注射方法を用いて、本発明の徐放化の方法を採用した徐放性Ｃｙ５．５標識Ｃｙ５．５－＊Ｇ１－ＣＤ３５を注射したところ、２０日目においてまだ蛍光を検出できた。加えて、２０日目に検知した前記蛍光は、本発明の強化方法を採用していないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ１において２４時間後に検知した蛍光より強かった。つまり、アプタマーの動物における徐放性能は、特定の化学修飾ＤＮＡを用いても強化できることが示された。
【0094】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0095】
［実施例２］
本発明の方法によって強化した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の動物における徐放の評価結果
本発明の方法によって強化した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の動物における徐放の評価結果
【0096】
本発明の方法によって強化したｄｓＤＮＡの動物における徐放性能を評価するために、本発明の方法によって強化したｄｓＤＮＡをＣｙ５．５で標識した。ＣＤ３５配列の両末端それぞれにＧ１配列を付加し、Ｃｙ５．５を用いてＣｙ５．５－Ｇ１－ｄｓＤＮＡ１を形成した。
【0097】
Ｃｙ５．５－Ｇ１－ｄｓＤＮＡ１を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部脱毛したマウスに注射した。以下の方法でマウスに皮下注射を行った。マウスを掴み固定し、後肢の間の皮膚をアルコール綿球で拭き、体重に応じた量の薬剤を注射器で抽出し、針を上向きにしてそっと皮膚に刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど針を皮下に刺し入れゆっくりと注射を行う。皮下注射の成功後、マウスの皮膚の注射部位が膨れ、針が刺し入れた方向とは逆方向に滑らかに引き出され注射が完了となる。注射後の異なる時点でｉｎ ｖｉｖｏ撮像を行い、皮下注射後のＣｙ５．５－Ｇ１－ｄｓＤＮＡ１の分布を観察した。
【0098】
図３の結果に示す通り、徐放化のための本発明の方法を採用したＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｇ１－ｄｓＤＮＡ１の注射後２日目にはまだ明らかな蛍光を検出できた一方で、本発明の方法を採用していないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ１のケースでは蛍光をほとんど検出できなかった。つまり、本発明の方法によって強化したｄｓＤＮＡは動物における優れた徐放性能をまだ有していた。
【0099】
ｄｓＤＮＡ１については以下の通りである。
【0100】
［実施例３］
本発明の方法によって強化したｓｓＲＮＡの動物における徐放の評価結果
本発明の方法によって強化したｓｓＲＮＡの動物における徐放の評価結果
【0101】
本発明の方法によって強化したｓｓＲＮＡの動物における徐放性能を評価するために、本発明の方法によって強化したｓｓＲＮＡをＣｙ５．５で標識した。ＣＤ３５配列の両末端それぞれにＧ１Ｒ配列を付加し、Ｃｙ５．５を用いてＣｙ５．５－Ｇ１－ｓｓＲＮＡ１を形成した。
【0102】
Ｃｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｓｓＲＮＡ１を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部脱毛したマウスに注射した。以下の方法でマウスに皮下注射を行った。マウスを掴み固定し、後肢の間の皮膚をアルコール綿球で拭き、体重に応じた量の薬剤を注射器で抽出し、針を上向きにしてそっと皮膚に刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど針を皮下に刺し入れゆっくりと注射を行う。皮下注射の成功後、マウスの皮膚の注射部位が膨れ、針が刺し入れた方向とは逆方向に滑らかに引き出され注射が完了となる。注射後の異なる時点でｉｎ ｖｉｖｏ撮像を行い、皮下注射後のマウスにおけるＣｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｓｓＲＮＡ１の分布および劣化を観察した。
【0103】
図４の結果に示す通り、本発明の徐放化の方法を採用したＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｓｓＲＮＡ１の注射後２日目にはまだ明らかな蛍光が検出できた一方で、徐放化されていないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ３のケースにおいては蛍光をほとんど検出できなかった。つまり、本発明の方法によって強化したｓｓＲＮＡは動物における優れた徐放性能をまだ有していた。
【0104】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0105】
［実施例４］
本発明の方法によって強化したｄｓＲＮＡの動物における徐放の評価結果
本発明の方法によって強化したｄｓＲＮＡの動物における徐放の評価結果
【0106】
本発明の方法によって強化したｄｓＲＮＡの動物における徐放性能を評価するために、本発明の方法によって強化したｄｓＲＮＡをＣｙ５．５で標識した。ＣＤ３５配列の両末端それぞれにＧ１Ｒ配列を付加し、Ｃｙ５．５を用いてＣｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｄｓＲＮＡ１を形成した。
【0107】
Ｃｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｄｓＲＮＡ１を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部脱毛したマウスに注射した。以下の方法でマウスに皮下注射を行った。マウスを掴み固定し、後肢の間の皮膚をアルコール綿球で拭き、体重に応じた量の薬剤を注射器で抽出し、針を上向きにしてそっと皮膚に刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど針を皮下に刺し入れゆっくりと注射を行う。皮下注射の成功後、マウスの皮膚の注射部位が膨れ、針が刺し入れた方向とは逆方向に滑らかに引き出され注射が完了となる。注射後の異なる時点でｉｎ ｖｉｖｏ撮像を行い、皮下注射後のＣｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｄｓＲＮＡ１の分布を観察した。
【0108】
図５に示す通り、本発明の方法を採用したＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｇ１Ｒ－ｄｓＲＮＡ１の注射後２日目にはまだ明らかな蛍光を検出できた一方で、本発明の方法を採用していないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ４のケースではほとんど蛍光を検出できなかった。つまり、本発明の方法によって強化したｄｓＲＮＡは動物における優れた徐放性能をまだ有していた。
【0109】
［実施例５］
本発明の方法によって強化したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の動物における徐放の評価結果
本発明の方法によって強化したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の動物における徐放の評価結果
【0110】
本発明の方法によって強化したＡＳＯの動物における徐放性能を評価するために、本発明の方法によって強化したＡＳＯをＣｙ５．５で標識した。ＣＤ３５配列の両末端それぞれにＧ１配列を付加し、Ｃｙ５．５を用いてＣｙ５．５－Ｇ１－ＡＳＯ１を形成した。
【0111】
Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＡＳＯ１を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部脱毛したマウスに注射した。以下の方法でマウスに皮下注射を行った。マウスを掴み固定し、後肢の間の皮膚をアルコール綿球で拭き、体重に応じた量の薬剤を注射器で抽出し、針を上向きにしてそっと皮膚に刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど針を皮下に刺し入れゆっくりと注射を行う。皮下注射の成功後、マウスの皮膚の注射部位が膨れ、針が刺し入れた方向とは逆方向に滑らかに引き出され注射が完了となる。注射後の異なる時点でｉｎ ｖｉｖｏ撮像を行い、皮下注射後のＣｙ５．５－Ｇ１－ＡＳＯ１の分布を観察した。
【0112】
図６の結果に示す通り、本発明の方法を採用したＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｇ１－ＡＳＯ１の注射後２０日後にまだ蛍光を検出できた。２０日目に検出した前記蛍光は、本発明の強化方法を採用していないＣｙ５．５標識Ｃｙ５．５－Ｒｓ５において２４時間後に検出した蛍光より強かった。つまり、本発明の方法によって強化したＡＳＯは動物における優れた徐放性能をまだ有していた。
【0113】
前記ＡＳＯの配列情報は以下の通りである。
【0114】
［実施例６］
動物における核酸の徐放性能の強化における、異なるグアニン四重鎖の評価結果
動物における核酸の徐放性能の強化における、異なるグアニン四重鎖の評価結果
【0115】
７つの異なるグアニン四重鎖配列を選択し、それぞれ核酸Ｓ１の両末端に付加した。いかなる配列も付加されていない核酸Ｓ１をコントロールとして用いた。Ｃｙ５．５を用いて標識を行い、前述の配列をそれぞれ動物に注射して蛍光を検出した。
【0116】
図７のＧ５とＧ１１の結果に示す通り、異なるグアニン四重鎖は全て核酸の徐放性能を有していた。使用したグアニン四重鎖における連続するＧの数は２～４であり、任意の塩基の数は１～６であり、連続Ｇの繰り返しの数は４～１６であり、中間における任意の塩基の繰り返しの数は３～１５であった。
【0117】
前記グアニン四重鎖の配列情報は以下の通りである。
【0118】
［実施例７］
動物における核酸の徐放性能の強化における、Ｇ１に基づいて修飾した配列の評価結果
動物における核酸の徐放性能の強化における、Ｇ１に基づいて修飾した配列の評価結果
【0119】
Ｇ１配列を選択し異なる方法で修飾した。修飾した配列をそれぞれ核酸Ｓ１の両末端に付加した。いかなる配列も修飾していない核酸Ｓ１をコントロールとして用いた。Ｃｙ５．５を用いて標識を行い、核酸における修飾配列の徐放性能を評価し、前述の配列をそれぞれ動物に注射し蛍光を検出した。
【0120】
図８のＧ１～１８、Ｇ１～２２、およびＧ１～２３の結果に示す通り、異なる修飾は全て核酸に対する徐放性能を有していた。なお、使用した特定の配列における連続するＧの数は２～１０であり、任意の塩基の数は１～５であり，連続Ｇの繰り返しの数は４～８であり、中間における任意の塩基の繰り返しの数は３～７であった。
【0121】
Ｇ１に基づいて修飾した配列の配列情報は以下の通りである。
【0122】
［実施例８］
動物における核酸の徐放性能の強化における、５’末端および／または３’末端のＧ１、および内部に含有されたＧ１の評価結果
動物における核酸の徐放性能の強化における、５’末端および／または３’末端のＧ１、および内部に含有されたＧ１の評価結果
【0123】
５’末端および／または３’末端のＧ１の、動物において核酸を徐放する性能を評価するため、Ｇ１を選択し異なる長さの核酸（Ｓ１，Ｓ２，およびＳ３）の５’末端、３’末端、および両末端に付加した。なお、Ｓ１は２１ｎｔ、Ｓ２は８ｎｔ、Ｓ３は１３ｎｔであった。Ｃｙ５．５を用いて標識を行い、前述の核酸をそれぞれ動物に注射して蛍光を検出した。
【0124】
図９のＡの結果に示す通り、５’末端（Ｃｙ５．５－５’）のみ、３’末端（ＣＹ５．５－３’）のみ、および両末端（ＣＹ５．５－５’＋３’）Ｇ１に付加した際にＧ１は核酸に対する徐放性能を有していた。
【0125】
さらに、核酸配列内に付加されたＧ１の徐放性能を評価した。２つの異なる配列Ｇ１－ＩｎおよびＧ１－Ｄを設計した。Ｇ１－ＩｎはＧ１配列が核酸配列の内部に一度だけ現れている配列であり、Ｇ１－ＤはＧ１配列が標的配列の両末端に付加され核酸配列の内部に位置している配列である。Ｃｙ５．５を用いて標識を行い、前述の配列を動物に注射して蛍光を検出した。図９のＡに示す通り、核酸配列の内部にあるＧ１は明白な徐放性能をまだ有していた。
【0126】
上記における配列情報は以下の通りである。
下線部の配列がＧ１であった。
【0127】
［実施例９］
本発明の方法によって構成されたキメラの動物における徐放性能の評価
本発明の方法によって構成されたキメラの動物における徐放性能の評価
【0128】
動物において核酸を徐放するキメラの性能を評価するために、２種類の核酸を選択した。Ｓｒ（ＲＮＡ）の徐放化のためにはＧ１を選択し、Ｓ１（ＤＮＡ）の徐放化のためにはＧ１Ｒ（ＲＮＡ）を選択した。無作為な配列Ｒｓ１をコントロールとして用いた。Ｃｙ５．５を用いて標識を行い、前述の核酸をそれぞれ動物に注射して蛍光を検出した。図９のＢの結果に示す通り、異なる種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）のＧ１が異なる種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の核酸に対する徐放性能を有し、必ずしも一致している必要はなかった。
【0129】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0130】
［実施例１０］
動物における長時間のＰＣＳＫ９ノックダウンおよびＬＤＬの抑制における、本発明の方法を用いて徐放したＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの性能の評価結果
動物における長時間のＰＣＳＫ９ノックダウンおよびＬＤＬの抑制における、本発明の方法を用いて徐放したＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの性能の評価結果
【0131】
本発明の方法によって強化したアンチセンスオリゴヌクレオチドの動物における効果を評価するために、本発明はＰＣＳＫ９を標的とするＡＳＯ配列を設計し、本発明の方法を用いて前記ＡＳＯ配列の徐放性能を強化した。徐放化処理を施していないＡＳＯをネガティブコントロールとして用いて、２つの異なる方法による動物におけるＰＣＳＫ９ノックダウンの長期効果を比較した。
【0132】
本実験に必要な“ｓｓＤＮＡ”を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、ＡＳＯ（０．８μｍｏｌ／ｋｇ）、ＬＴ－００１（３．２μｍｏｌ／ｋｇ）、およびＬＴ－００１（０．８μｍｏｌ／ｋｇ）の３つのグループに分けた。空の２ｍｌ針管および４．５番の針を用いて注射を行った。希釈したｓｓＤＮＡ生理食塩水を注射した。注射後、最初の３日間は毎日、また５日目と３０日目に尾を切って血液サンプルを採取した。
【0133】
マウスの血漿におけるＰＣＳＫ９およびＬＤＬ（低密度リポタンパク質）の含有率をＥＬＩＳＡによって検出した。動物における長時間のＰＣＳＫ９ノックダウンに対する、本発明の方法を用いて徐放したＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べた。図１０のＡおよびＢの結果に示す通り、ＬＴ－００１を注射したマウスのＰＣＳＫ９およびＬＤＬの値は、徐放化処理を施していないＡＳＯを注射したマウスと比べて著しく低く、３０日目にもまだ効果を発揮していた。つまり、本発明の方法によってＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスヌクレオチドの動物における徐放性能が強化され、長時間ＰＣＳＫ９をノックダウンできＬＤＬの含有率を抑制できた。
【0134】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0135】
さらに、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡに応じて１６種類の特定のＡＳＯを設計し、ＡＳＯの両末端にＧ１を付加した（Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ）。Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯを肝細胞癌細胞ＨＣＣ９７Ｈ内にリポフェクタミン２０００のリポソームによって２０ｐｍｏｌの投与量で導入した。導入後４８時間後に細胞を回収し、細胞の全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬によって抽出し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのノックダウン効果をＲＴ－ｑＰＣＲによって検出した。結果によると、１６種類のＧ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯによってＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡを効果的にノックダウンすることができた（図１０のＣ）。
【0136】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0137】
［実施例１１］
動物における長期的なタンパク質阻害に対する、本発明の方法を用いて徐放したアプタマーの効果の評価結果
動物における長期的なタンパク質阻害に対する、本発明の方法を用いて徐放したアプタマーの効果の評価結果
【0138】
長期的なタンパク質活性の阻害に対する、核酸アプタマーの徐放方法の性能を評価するため、タンパク質の阻害活性試験に選択したアプタマーをマウスに注射し、タンパク質活性を評価した。コントロール（アプタマー２）と比較し、アプタマーの両末端にＧ１を付加したＧ１―アプタマー２を注射した動物におけるタンパク質活性は、アプタマー２を注射した場合より著しく低かった。つまり、この方法によってアプタマーの徐放性能が強化され、タンパク質活性が長期的に阻害された。
【0139】
片方の末端にＧ１を付加したＦＧＬ－１のアプタマー（Ｇ１アプタマー２）、およびそのコントロール（アプタマー２）をスクリーニングした。
【0140】
腫瘍細胞を注入してから６日経過後、マウスの腫瘍体積はおよそ１００ｍｍ３であった。この時点で、各グループ６体となるようマウスを無作為に２つのグループに分けた。マウスを計量し、１５ｍｇ／ｋｇの投与量でＧ１アプタマー２およびアプタマー２をそれぞれ注射した。ブランク（ＮＣ）として生理食塩水を注射した。
【0141】
マウスの腫瘍サイズと体重を２または３日おきに観察した。マウスの腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｓ）を電子ノギスによって測定し、３つの測定値の平均値を各測定において記録し、マウスの腫瘍体積をＶ＝Ｌ×Ｓ２／２の式で計算した。
【0142】
図１１の結果に示す通り、Ｇ１－アプタマー２を注射した動物の抗腫瘍効果はアプタマー２を注射した動物と比べて優れていた。つまり、この方法によって核酸アプタマーの徐放性能が強化され、タンパク質の活性が長時間阻害された。
【0143】
上記における配列情報は以下の通りである。
【0144】
［実施例１２］
動物における長時間のＲＮＡ転写において、本発明の方法によるＤＮＡの徐放の性能の評価結果
動物における長時間のＲＮＡ転写において、本発明の方法によるＤＮＡの徐放の性能の評価結果
【0145】
ｄｓＤＮＡの徐放性能を強化する本発明の方法の性能を評価するために、蛍光タンパク質のＤＮＡを選択し転写能の検証を行った。選択したＤＮＡをマウスに注射し、蛍光タンパク質のｍＲＮＡ発現を定量ＰＣＲによって分析した。コントロール（ｄｓＤＮＡ２）と比較し、ｄｓＤＮＡの両末端にＧ１を付加したＧ１－ｄｓＤＮＡ２を注射した動物における蛍光タンパク質のｍＲＮＡ含有率は、ｄｓＤＮＡ１を注射した動物よりも著しく高かった。つまり、この方法によってｄｓＤＮＡの徐放性能が強化され、ｄｓＤＮＡが長時間転写された。
【0146】
ＧＦＰを持つｄｓＤＮＡ２を選択し、転写能の検証を行った。ｄｓＤＮＡ２配列の両末端にＧ１を付加し（Ｇ１－ｄｓＤＮＡ２）、蛍光タンパク質のｍＲＮＡ発現を定量ＰＣＲによって分析した。
【0147】
ｄｓＤＮＡ２およびＧ１－ｄｓＤＮＡ２を注射前に生理食塩水で希釈した。マウスを計量し、４ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射を行った。注射後２４、４８、７２、９６時間後に血漿サンプルを採取し、蛍光の定量を検出した。ブランク（ＮＣ）としては生理食塩水を注射した。
【0148】
図１２の結果に示す通り、Ｇ１－ｄｓＤＮＡ２を注射した動物における蛍光タンパク質のｍＲＮＡ含有率は、ｄｓＤＮＡ２を注射した動物よりも著しく高かった。つまり、この方法によってｄｓＤＮＡの徐放性能が強化され、ｄｓＤＮＡが長時間転写された。
【0149】
上記における配列情報は以下の通りであった（下線部がＧ１配列）
ｄｓＤＮＡ２（配列番号７７）：
Ｇ１－ｄｓＤＮＡ２（配列番号７８）：
ｄｓＤＮＡ２（配列番号７７）：
【0150】
［実施例１３］
動物における長時間のタンパク質翻訳における、本発明の方法によるＤＮＡの徐放の性能の評価結果
動物における長時間のタンパク質翻訳における、本発明の方法によるＤＮＡの徐放の性能の評価結果
【0151】
ＲＮＡの徐放性能を強化する本発明の方法の性能を評価するために、蛍光タンパク質のＲＮＡを選択し徐放性能の検証を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡをマウスに注射し、蛍光タンパク質の蛍光強度を測定した。コントロール（ｍＲＮＡ１）と比較し、ＲＮＡの両末端にＧ１を付加したＧ１－ｍＲＮＡ１を注射した動物のＥＧＦＰ蛍光保持時間は、ｍＲＮＡ１を注射した動物より長かった。つまり、この方法によって、ｍＲＮＡの徐放性能が強化され、ＲＮＡが長時間転写された。
【0152】
マーカー遺伝子（ｍＲＮＡ１）としてホタルルシフェラーゼを選択し、ｍＲＮＡの徐放性能の検証を行った。ｍＲＮＡ１の両末端にＧ１Ｒを付加してＧ１－ｍＲＮＡ１を形成し、ホタルルシフェラーゼを持つプラスミドをポジティブコントロール（ＰＣ）として用いた。
【0153】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ（またはプラスミド）を無菌のＤＰＢＳで希釈した後、ヌードマウスを計量し、５ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射を行った。皮下注射成功後、マウスの皮膚が膨んだ。注射後の異なる時点におけるｉｎ ｖｉｖｏ撮像観察の前に、Ｄ－ルシフェリン基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ社製造、製品番号：７７０５０４）を１５０ｍｇ／ｋｇの投与量で尾静脈に注射した。５分後、マウスにガス麻酔（イソフルラン３％）をかけ、小動物用ｉｎ ｖｉｖｏ撮像システムＩＶＩＳに入れ撮像を行った。基質注射後２０分で撮像が完了し、図１３の結果に示す通り、Ｇ１－ｍＲＮＡ１を注射した動物の蛍光保持時間は４８時間にまで達していた。つまり、この方法によってｍＲＮＡの徐放性能が強化され、タンパク質が長時間翻訳された。
【0154】
上記における配列情報は以下の通りである。
ｍＲＮＡ１（配列番号７９）：
Ｇ１－ｍＲＮＡ１（配列番号８０）：
ｍＲＮＡ１（配列番号７９）：
【0155】
［実施例１４］
動物におけるｎｃＲＮＡの長期効果を実現するための、本発明の方法によるｎｃＲＮＡ徐放の性能の評価結果
動物におけるｎｃＲＮＡの長期効果を実現するための、本発明の方法によるｎｃＲＮＡ徐放の性能の評価結果
【0156】
ｎｃＲＮＡの徐放性能を強化する本発明の方法の性能を評価するために、徐放性能試験にｎｃＲＮＡ（標的を調節する機能を持つ）を選択しマウスに注射した。コントロール（ｎｃＲＮＡ１）と比較し、ｎｃＲＮＡの両末端にＧ１を付加したＧ１－ｎｃＲＮＡ１を注射した動物においては、ｎｃＲＮＡ１を注射した動物よりも著しく長い時間標的を制御していた。つまり、この方法によってｎｃＲＮＡの徐放性能が強化され、ｎｃＲＮＡの効果時間が延長された。
【0157】
ＢＧＬＴ３（ｎｃＲＮＡ１）を選択し徐放性能の検証を行った。ＢＧＬ３がその上流遺伝子ＨＢＧ１（Ｉｖａｌｄｉ ＭＳ．ｅｔｃ． Ｂｌｏｏｄ．）の発現を積極的に制御したことが指摘されている。ｎｃＲＮＡ１の両末端にＧ１を付加しＧ１－ｎｃＲＮＡ１を形成した。定量ＰＣＲによってＨＧＢ１発現の分析を行った。
【0158】
ｎｃＲＮＡを注射前に生理食塩水で希釈した。生後２週間のＢＡＫＢ／ｃマウスを計量し、４ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射を行った。ブランク（ＮＣ）として生理食塩水を注射した。注射後４、６、８時間後にそれぞれ肝臓のＲＮＡを抽出した。定量ＰＣＲによってＨＧＢ１発現を検出した。
【0159】
図１４の結果に示す通り、Ｇ１－ｎｃＲＮＡ１を注射した動物は、ｎｃＲＮＡ１を注射した動物より著しく長い時間ＨＧＢ１を制御していた。つまり、この方法によってｎｃＲＮＡの徐放性能が強化され、ｎｃＲＮＡの効果時間が延長された。
【0160】
上記における配列情報は以下の通りである。
ｎｃＲＮＡ１（配列番号８１）：
Ｇ１－ｎｃＲＮＡ１（配列番号８２）：
ｎｃＲＮＡ１（配列番号８１）：
【0161】
最後に、前述の実施形態は当業者にとって本発明の本質の理解を容易にするためのものであり、本発明の保護範囲を制限するものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸医薬の５’末端および／または３’末端、および／または核酸医薬の内部に特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡを付加する工程を含み、特定の配列の前記ＤＮＡまたはＲＮＡは、
（１）間隔の数が４～１６であり、各フラグメントにおいてＧ塩基の数が同じである、間隔を空けて現れている連続Ｇ塩基フラグメントと、
（２）Ｇを含まない１～６の任意の塩基の配列であり、前記連続Ｇ塩基フラグメントの間に位置し、間隔の数が３～１５である、間隔を空けて現れているスペーサーフラグメントと、
（３）前記配列の５’末端および３’末端に付加されたＧ塩基フラグメントとを含み、
核酸医薬の徐放性能の強化は核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味する核酸医薬の徐放性能の強化方法。
【請求項2】
核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２～２０日に増加させる請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸医薬は無修飾核酸医薬または化学修飾核酸医薬でもよい請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸医薬の配列の長さは８ｎｔ以上である請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記核酸医薬の配列の長さは８～５０００ｎｔである請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸医薬は一本鎖ＤＮＡ医薬、二本鎖ＤＮＡ医薬、一本鎖ＲＮＡ医薬、二本鎖ＲＮＡ医薬、または核酸類縁体である請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記核酸医薬はＲＮＡ核酸アプタマー、ｍＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳＯ、ＤＮＡ核酸アプタマー、またはその他のＤＮＡ医薬であり、
前記ｎｃＲＮＡはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、またはその他の調節性ＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡは、
Ｇ１：ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧまたは化学修飾Ｇ１、または
Ｇ１Ｒ：ＧＧＧＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＧＧＧまたは化学修飾Ｇ２である請求項１記載の方法。
【請求項9】
前記化学修飾Ｇ１の配列は、
【請求項10】
前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡと核酸医薬との関係は、
特定の配列のＤＮＡがＤＮＡ医薬を徐放するか、特定の配列のＤＮＡがＲＮＡ医薬を徐放するか、特定の配列のＲＮＡがＤＮＡ医薬を徐放するか、または特定の配列のＲＮＡがＲＮＡ医薬を徐放することである請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記核酸医薬はＡＳＯである請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ＡＳＯは以下の配列、
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１：ＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－２：ＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－３：ＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－４：ＴＴＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－５：ＴＴＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－６：ＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＡＡ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－７：ＴＴＣＡＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－８：ＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－９：ＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１０：ＴＴＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１１：ＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１２：ＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１３：ＴＴＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１４：ＴＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１５：ＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴ
ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１６：ＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴ．
のいずれか一つである請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記５’末端に前記特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡが付加された前記核酸医薬は以下の配列、
（１）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（２）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－２：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（３）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－３：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（４）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－４：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（５）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－５：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（６）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－６：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（７）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－７：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（８）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－８：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（９）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－９：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１０）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１０：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１１）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１１：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１２）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１２：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１３）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１３：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１４）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１４：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１５）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１５：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ
（１６）Ｇ１／ＰＣＳＫ９－ＡＳＯ－１６：
ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧのいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項14】
核酸医薬の５’末端および／または３’末端、および／または核酸医薬の内部に特定の配列のＤＮＡまたはＲＮＡを付加する工程を含み、
特定の配列の前記ＤＮＡまたはＲＮＡは、
（１）間隔の数が４であり、各フラグメントにおけるＧ塩基の数が２～６である、間隔を空けて現れている連続のＧ塩基フラグメントと、
（２）Ｇを含まない１～３の任意の塩基の配列であり、前記連続Ｇ塩基フラグメントの間に位置し、間隔の数が３である、間隔を空けて現れているスペーサーフラグメントと、
（３）前記配列の５’末端および３’末端に付加されたＧ塩基フラグメントとを含み、
核酸医薬の徐放性能の強化は核酸医薬の徐放時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く延長し核酸医薬の作用時間をｉｎ ｖｉｖｏで２日より長く増加させることを意味する核酸医薬の徐放性能の強化方法。
【国際調査報告】