特表 2024-528286 新規な抗ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体及びそれを発現する免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】新規な抗ＥｐｈＡ２キメラ抗原受容体及びそれを発現する免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240719BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240719BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240719BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240719BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240719BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N5/078 ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/85 Z

C07K14/705

C07K19/00

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024507172

(86)(22)【出願日】2022-08-05

(85)【翻訳文提出日】2024-02-02

(86)【国際出願番号】 KR2022011685

(87)【国際公開番号】W WO2023014182

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】10-2021-0103610

(32)【優先日】2021-08-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500197682

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

(71)【出願人】

【識別番号】524047394

【氏名又は名称】オソン・メディカル・イノベイション・ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＯＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】キム，テドン

(72)【発明者】

【氏名】イ，スヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ヒョヨン

(72)【発明者】

【氏名】カン，ヨンジュ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウンギョン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユチョン

(72)【発明者】

【氏名】キム，テヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユンジ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＥｐｈＡ２に対して特異的に結合する新規な抗体またはその抗原結合断片、抗体の抗原結合可変断片を含むキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞に関するものであって、免疫細胞は、癌を治療するための用途として有用に用いられる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
ＥｐｈＡ２に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記重鎖可変領域は、配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域は、配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、キメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン及びスぺーサドメインからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記ヒンジドメインまたはスぺーサドメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン及びＦｃからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）またはゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択される何れか１つである、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを第１シグナル伝達ドメインとして含み、
ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＥｐｈＡ２及びＣＤ８３からなる群から選択される少なくとも１つを共刺激シグナル伝達ドメインとして含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

請求項４から請求項１１のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項13】

請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項14】

請求項４から請求項１１のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現する、免疫細胞。

【請求項15】

前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択される何れか１つである、請求項１４に記載の免疫細胞。

【請求項16】

請求項１４に記載の免疫細胞を含む、癌治療用薬学的組成物。

【請求項17】

前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉種、線維性腫瘍及び脳癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１６に記載の癌治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥｐｈＡ２に対して特異的に結合する新規な抗体またはその抗原結合断片、該抗体の抗原結合可変断片を含むキメラ抗原受容体、該キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

癌を治療するための方法は、持続的な発展と変化過程とを経てきており、外科的手術、化学療法、放射線療法などの方法が現在まで利用され続けているが、このような既存の癌治療方法は、癌が転移されていない初期に限って効果がある場合がほとんどであり、既に転移が進められた状態では、例えば、外科的手術をしても、今後の再発の可能性が高いという問題点がある。これにより、最近、癌を治療するために、免疫反応を用いる方法についての研究が続いている。

【0003】

その中でも、免疫細胞を用いて、それを強化させるか、遺伝子工学的に変形して、再び患者に注入する細胞治療方法についての関心が高まっており、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）技術などが研究されている。特に、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）に抗原特異性を伝達するように設計された人工受容体であるキメラ抗原受容体の場合、前記受容体が癌細胞特異的抗原と結合することにより、前記免疫細胞を活性化し、特異的免疫性を提供することができる細胞外ドメインと、膜貫通ドメイン、そして、細胞内シグナル伝達ドメインからなっている。そして、このようなキメラ抗原受容体が発現されるＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と名づけられ（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５（１２）：９２８－９４０（２００５）；Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２（４）：２６９－２８１（２０１２））、ナチュラルキラー細胞の場合、ＣＡＲ－ＮＫ細胞と名づけられた。

【0004】

前記キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、主にＴ細胞受容体のシグナル伝達サブユニットであるＣＤ３ｚｅｔａの細胞内シグナル伝達ドメインを基本としている（１世代ＣＡＲ）。そして、これに免疫細胞の成長及び分化を促進する共同－刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを追加する形態に進化されてきた。例えば、現在、市販されているＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、それぞれＣＤ２８と４－１ＢＢ共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを使用しており（２世代ＣＡＲ）、以後、ＣＤ２８と４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを同時に含むＣＡＲ（３世代ＣＡＲ）などが試みられている（Ｓｔｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，１４（７）：４９９－５０９（２０１５））。

【0005】

一方、ＥｐｈＡ２（ｅｐｈｒｉｎ ｔｙｐｅ－Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）は、ヒトのＥＰＨＡ２遺伝子から発現されるタンパク質であって、乳癌、前立腺癌、肺癌などを含めて多種の癌で過発現されて表われると知られており、癌細胞の成長及び浸透を促進すると知られている。また、前記ＥｐｈＡ２の発現は、癌患者の生存率と関連性があると報告された。このような技術的背景下で、癌細胞で特に過発現されて表われる前記ＥｐｈＡ２をターゲットとする抗体やそれを利用した前記ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ治療剤などを開発することにより、癌を治療するためのさらに他の側面の戦略と方法とを研究しなければならない必要性が台頭している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、癌細胞で主に発現されるＥｐｈＡ２に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を提供することを目的とする。

【0007】

また、本発明は、免疫細胞で発現された時、癌細胞に対する細胞毒性または細胞溶解活性を増幅させる新規なキメラ抗原受容体を提供することを目的とする。

【0008】

また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクターを提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、前記キメラ抗原受容体を表面に発現させることにより、癌に対する治療効果に優れた免疫細胞を提供することを目的とする。

【0010】

また、本発明は、前記免疫細胞を用いて癌を治療するための薬学的組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記の目的を果たすために、本発明の一側面は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含み、ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0012】

本発明の他の側面は、ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であるキメラ抗原受容体を提供する。

【0013】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、そして、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0014】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞を提供する。
本発明の他の側面は、前記免疫細胞を含む癌治療用薬学的組成物を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明の抗体、その抗原結合断片、そして、それを利用したキメラ抗原受容体は、癌細胞で主に発現されるＥｐｈＡ２に対して特異的に結合することができ、これにより、前記キメラ抗原受容体が発現された免疫細胞でシグナル伝達が発生するにつれて、免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性を顕著に向上させ、サイトカインの分泌を促進する効果を示す。また、これにより、前記免疫細胞と共培養された癌細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を増加させる効果がある。

【0016】

したがって、本発明の抗体やそれを利用したキメラ抗原受容体、そして、それを発現させた免疫細胞は、癌を治療するための用途として有用に用いられる。

【0017】

但し、本発明の効果は、前述した効果に制限されず、言及されていないさらに他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合可変断片（ｓｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１）の構造を示す模式図である。

【図1B】それをクローニングした発現ベクターのマップを示した図面である。

【図2A】ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合可変断片（ｓｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含む本発明のキメラ抗原受容体（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２）の構造を示す模式図である。

【図2B】それをクローニングした発現ベクターのマップを示した図面である。

【図3A】本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞）を対象にして、それぞれ本発明のキメラ抗原受容体（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１及びＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２）の発現有無を確認した結果を示した図面である。

【図3B】本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたＴ細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２－Ｔ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２－Ｔ細胞）を対象にして、それぞれ本発明のキメラ抗原受容体（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１及びＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２）の発現有無を確認した結果を示した図面である。

【図4】乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞及び慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞を対象にしてＥｐｈＡ２の発現有無を確認した結果を示した図面である。

【図5】本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞）の、ＥｐｈＡ２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＥｐｈＡ２を発現しないＫ５６２細胞とに対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定して比較した結果を示した図面である。

【図6-7】本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞）をＥｐｈＡ２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞またはＥｐｈＡ２を発現しないＫ５６２細胞と共培養した時、ナチュラルキラー細胞から分泌するサイトカイン（ＩＦＮ－γ）の量と脱顆粒指標であるＣＤ１０７αの発現量とをそれぞれ測定して比較した結果を示した図面である。

【図8】本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたＴ細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２－Ｔ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２－Ｔ細胞）の、ＥｐｈＡ２を発現するＡ５４９細胞に対する細胞毒性（細胞溶解活性）を測定した結果を示した図面である。

【図9A】肺癌細胞株であるＨ４６０細胞でＥｐｈＡ２が発現されているということを確認した結果である。

【図9B】本発明のキメラ抗原受容体の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞）のＨ４６０細胞に対する細胞毒性（細胞溶解活性）を確認した結果である。

【図9C】Ｈ４６０細胞を実験動物に注入して、本発明のキメラ抗原受容体の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞の活性を確認した実験の概要を簡略に図式化したものである。

【図9D-9E】本発明のキメラ抗原受容体の遺伝子を導入及び発現させたナチュラルキラー細胞のＨ４６０細胞に対する細胞毒性（細胞溶解活性）による抗ガン活性をそれぞれ腫瘍のサイズと重量とで確認した結果である。

【図10A-10B】Ａ５４９－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞を注入した実験動物で、本発明のキメラ抗原受容体２種の遺伝子を導入及び発現させたＴ細胞（ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２－Ｔ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２－Ｔ細胞）のＡ５４９細胞に対する細胞毒性（細胞溶解活性）による抗ガン活性をそれぞれ腫瘍のサイズと重量とで確認した結果である。

【図10C】マウス血液内で前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の存否を確認した結果である。

【図10D】腫瘍内で前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の存否を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明を詳しく説明する。

【0020】

１．新規な抗ＥｐｈＡ２抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明の一側面は、ＥｐｈＡ２に対して特異的に結合することができる抗ＥｐｈＡ２抗体及びその抗原結合断片を提供する。

【0021】

本発明において、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫学的に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と特異的結合して反応性を有する免疫グロブリン分子を意味する。前記抗体は、単クローン抗体、多クローン抗体、全長の鎖の構造を有した抗体（全長抗体、ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、少なくとも抗原結合機能を有する機能的な断片（抗原結合断片）及び組換え抗体をいずれも含むことができ、具体的に、本発明の抗体は、単クローン抗体またはその抗原結合断片である。前記単クローン抗体は、実質的に同じ抗体集団で収得した単一分子組成の抗体分子を称し、このような単クローン抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。前記全長抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結される。前記抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ）ポリペプチドを含み、前記重鎖及び軽鎖は、可変領域及び不変領域を含みうる。

【0022】

前記不変領域は、免疫系の多種の細胞（Ｔ細胞など）、補体系の成分を含む宿主組織などに、前記抗体が結合できるように媒介する部位である。前記不変領域は、同種に由来する同じ種類の抗体であれば、抗原の種類と無関係に同じ機能を行い、それを成すアミノ酸配列も、抗体ごとに同一であるか、高い類似度を有する。前記不変領域は、重鎖の不変領域（ＣＨと略称される）と軽鎖不変領域（ＣＬと略称される）とに分けられる。前記重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及び／またはイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及び／またはアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

【0023】

前記可変領域は、抗原に対して特異性を有する抗体部位であって、重鎖の可変領域（ＶＨと略称される）と軽鎖の可変領域（ＶＬと略称される）とに分けられる。前記可変領域には、３個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、または、相補性決定領域）と４個のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）とが含まれる。前記ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列によって抗原に対する特異性が決定される。前記ＣＤＲは、その順序によってＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と称され、重鎖及び軽鎖のうち、如何なるポリペプチドのＣＤＲであるかによって、重鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３と、軽鎖可変領域の場合、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３と称される。ＦＲも同様に、重鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４と、軽鎖可変領域の場合、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４と称される。また、前記ＣＤＲ及びＦＲは、それぞれの可変領域で次のような順序で配列される。

【0024】

本発明において、用語「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合機能を保有する本発明のヒト化抗体の任意の断片を意味する。前記抗原結合断片は、「断片」、「抗体断片」などの用語と互換されて称され、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどであるが、これらに制限されるものではない。

【0025】

前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。前記「Ｆａｂ」は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点で前記Ｆａｂと差がある。前記Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。前記Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有しいる最小の抗体切片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ末端で直ちに連結されており、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成しうる。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いるか（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂが得られ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片が得られる）、または遺伝子組換え技術を通じて作製することができるが、これらに制限されるものではない。

【0026】

前記リンカーは、ペプチドリンカーであり、約１０～２５個のアミノ酸長さを有するものである。例えば、前記リンカーには、グリシン（Ｇ）及び／またはセリン（Ｓ）のような親水性アミノ酸が含まれる。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含むことができ、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であるが、これらに制限されるものではない。

【0027】

本発明において、用語、「エピトープ」は、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合断片が特異的に認識し、結合することができる抗原上の特定部位を意味する。前記エピトープは、連続アミノ酸から、またはタンパク質の３次折り曲げによって併置された不連続アミノ酸から形成されうる。

【0028】

前記「特異的に結合する」ことは、背景結合よりも大きな結合親和性で他の分子に対して結合することを意味することができ、例えば、前記細胞外ドメインは、標的抗原に対して約１０^－５Ｍ以上の親和性またはＫａ（１／Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数）で標的抗原に結合するものである。前記親和性は、Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）が１０^－５～１０^－１３Ｍまたは前記範囲以下であるものである。

【0029】

本発明の前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含み、ＥｐｈＡ２に特異的に結合する。

【0030】

前記重鎖可変領域は、配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を有するものである。

【0031】

前記軽鎖可変領域は、配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有するものである。

【0032】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ヒトに由来する抗体の重鎖不変領域及び／または軽鎖不変領域をさらに含むことができ、前記抗体またはその抗原結合断片がＥｐｈＡ２に対して特異的に結合する特性を阻害しないものであれば、前記ヒトに由来する抗体の重鎖不変領域及び／または軽鎖不変領域は、その種類やアミノ酸配列に制限なしに用いられる。

【0033】

前述したアミノ酸配列は、それを含むポリペプチドの構造、機能、活性などに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有する変異体を含みうる。また、前記アミノ酸配列は、当業者に知られている通常の変形が起こったアミノ酸を含むのであり、前記アミノ酸変形は、例えば、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などである。本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片は、前述したアミノ酸配列を含むものだけではなく、これと実質的に同じアミノ酸配列を有するものやその変異体を含む。前記実質的に同じアミノ酸配列を有するものの意味は、前述したアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであるが、これらに制限されるものではない。

【0034】

本発明において、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、標的抗原及び前記抗原を発現する細胞を認識して結合した時、これに対して免疫反応を誘導できるように設計された合成複合体である。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含みうる。キメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面に発現されて細胞外ドメインに含まれた抗原結合部位を通じて、特定の抗原、例えば、癌細胞の表面に特異的に発現される抗原を認識して結合されることにより、免疫細胞内でシグナル伝達を起こして免疫細胞の活性を変化させることができるので、特定の抗原のみを標的として免疫反応を誘発させることができる。

【0035】

本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；及び細胞内シグナル伝達ドメイン；を含む。

【0036】

前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0037】

本発明の前記キメラ抗原受容体が免疫細胞の表面に発現された時、標的抗原であるＥｐｈＡ２が前記受容体に結合すれば、免疫細胞内でシグナル伝達が発生し、前記免疫細胞の細胞毒性（または、細胞溶解活性）の向上及び／または前記免疫細胞のサイトカインの分泌促進が誘導される。前記細胞毒性（または、細胞溶解活性）の向上またはサイトカインの分泌促進は、抗原が存在しない状態の免疫細胞が表わす細胞毒性（または、細胞溶解活性）やサイトカインの分泌よりも高いレベルに細胞毒性（または、細胞溶解活性）を示すか、高いレベルにサイトカインを分泌するものである。

【0038】

前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）及びスぺーサドメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含みうる。前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、ヒンジドメイン及び／またはスぺーサドメインを通じて膜貫通ドメインと連結される。

【0039】

前記ヒンジドメインは、適切な細胞／細胞接触、適切な抗原／抗原結合部位の結合及び適切なキメラ抗原受容体の活性化を可能にするように、前記キメラ抗原受容体が発現される免疫細胞の表面から前記抗原結合部位を物理的に離隔させる部分であって、細胞外ドメインの位置決めに重要な役割を担当することができる。前記キメラ抗原受容体は、前記細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含みうる。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源に由来する。ヒンジドメインは、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含みうる。前記変化したヒンジ領域は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例：最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然発生ヒンジ領域、（ｂ）最大３０％アミノ酸変化（例：最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する少なくとも１０個のアミノ酸（例：少なくとも１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）長さの天然発生ヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域（これは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸長さである）を含む天然発生ヒンジ領域の一部を称する。特定の実施形態において、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域で１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例：１つ以上のセリン残基）で置換される。変化した免疫グロブリンヒンジ領域は、代案として、または追加的にさらに他のアミノ酸残基、例えば、システインで置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有しうる。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの類型１膜タンパク質の細胞外ドメインに由来するヒンジ領域であるが、前記抗原結合部位と膜貫通ドメイン、そして、細胞内シグナル伝達ドメインを細胞膜の間に連結可能なものであれば、如何なるものでも制限なしに用いられる。また、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であるか、変化することができる。

【0040】

前記スぺーサドメインは、連結ドメインと称され、例えば、ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／またはＣＤ８由来のヒンジドメインを含むのであり、前記ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／またはＣＤ８由来のヒンジドメインの全体または一部を含むものである。

【0041】

前記ヒンジドメイン及び／またはスぺーサドメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン及びＦｃからなる群から選択される少なくとも１つであり、具体的に、Ｍｙｃエピトープ及びＣＤ８ヒンジドメインを含むものである。より具体的に、前記Ｍｙｃエピトープは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むのであり、前記ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列を含むものである。

【0042】

前記膜貫通ドメインは、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを互いに連結して融合させ、免疫細胞の原形質膜にキメラ抗原受容体を固定させる役割を行う一部の領域を意味する。前記膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源に由来するものである。前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）またはゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択される何れか１つであるが、これらに制限されるものではない。

【0043】

前記膜貫通ドメインは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を通じて前記細胞外ドメインに付着される。例えば、リンカーは、２～１０個のアミノ酸長さの短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーであり、例えば、グリシン（Ｇ）－セリン（Ｓ）二重体（ｄｏｕｂｌｅｔ）であるが、これらに制限されるものではない。

【0044】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の機能（例えば、キメラ抗原受容体と抗原が結合された標的細胞に対する細胞毒性（または、細胞溶解活性）因子の放出を含む活性化、サイトカイン生成、増殖及び細胞毒性または細胞溶解活性、または、前記抗原結合で誘発されたその他の細胞反応）を誘発するために、前記キメラ抗原受容体と抗原の結合によって発生する信号を免疫細胞の内部に伝達する役割を行う部分に該当する。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、作動機能信号を伝達し、細胞が特殊な機能を行うように指示するタンパク質の一部である。

【0045】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、既存にキメラ抗原受容体の発展過程で用いられた細胞内シグナル伝達ドメインが用いられる。具体的に、１世代ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）で用いられたＣＤ３ζのみを含みうる。そして、２世代ＣＡＲで用いられたように、免疫細胞に対する反応性の向上のために、共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した形態が用いられる。また、３世代ＣＡＲで用いられたように、２種以上の共刺激ドメインが用いられ、この際、生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性の達成のために、共刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０などと結合させることができる。さらに、４世代ＣＡＲで利用したように、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５のようなサイトカインをコードする追加遺伝子を含んで、サイトカインのＣＡＲ基盤の免疫タンパク質をさらに発現させることができ、５世代ＣＡＲで利用したように、免疫細胞の強化のために、インターロイキンレセプターチェーン、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含みうる。

【0046】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを含みうる。

【0047】

より具体的に、前記細胞内シグナル伝達ドメインによる前記免疫細胞の活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインの２個の異なる部類によって媒介される。例えば、抗原－依存性一次活性化を開始する１次シグナル伝達ドメイン及び２次信号を提供するために、抗原－独立した方式で作用する共刺激シグナル伝達ドメインによって免疫細胞の活性化が媒介される。したがって、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１次シグナル伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び共刺激シグナル伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含みうる。

【0048】

前記１次シグナル伝達ドメインとは、免疫細胞の活性化を刺激または抑制方式で調節するシグナル伝達ドメインを意味する。刺激方式で作用する１次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン－基盤活性化モチーフまたはＩＴＡＭで公知されているシグナル伝達モチーフを含有することができる。１次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄなどであるが、これらに制限されるものではない。より具体的に、前記１次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（ｚｅｔａ）であるが、これらに制限されるものではない。

【0049】

前記共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＥｐｈＡ２、ＣＤ８３などからなる群から選択される共刺激シグナル伝達ドメインを含みうるが、これらに制限されるものではない。具体的に、前記共刺激分子は、ＤＡＰ１０であるが、これらに制限されるものではない。

【0050】

前記キメラ抗原受容体は、２個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、２個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合には、細胞内シグナル伝達ドメインが互いに直列連結される。または、２～１０個のアミノ酸からなるポリペプチドリンカーを通じて連結されても良く、前記リンカー配列は、例えば、グリシン－セリン連続配列である。前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）を含むことができ、例えば、（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１～１０）であるが、これらに制限されるものではない。

【0051】

前記キメラ抗原受容体は、免疫細胞の免疫機能促進因子をさらに含むことができ、例えば、前記免疫細胞の免疫機能促進因子は、インターロイキン信号配列（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。前記インターロイキン信号配列は、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－１２、ＩＬ－８、ＩＬ－２などの発現を誘導することを特徴とするが、これらに制限されるものではない。また、前記免疫細胞がＴ細胞である場合、前記免疫機能促進因子は、ＩＬ－７、ＣＣＬ１９などであるが、これらに制限されるものではない。

【0052】

本発明の具体的な一実施例では、前述したようなアミノ酸配列を有する２種（＃７９及び＃８５）の抗ＥｐｈＡ２抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインに含み、これとＭｙｃ及びヒンジドメインで連結されたＣＤ２８を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインとして含み、ＣＤ３－ｚｅｔａ及びＤＡＰ１０を細胞内シグナル伝達ドメインで連結された形態のキメラ抗原受容体を設計して、本発明のキメラ抗原受容体を製造した（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１）。また、本発明の具体的な他の実施例では、前述したようなアミノ酸配列を有する２種（＃７９及び＃８５）の抗ＥｐｈＡ２抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインに含み、これとＣＤ８をヒンジドメイン及び膜貫通ドメインとして含み、ＣＤ３－ｚｅｔａ及び４１－ＢＢを細胞内シグナル伝達ドメインで連結された形態のキメラ抗原受容体を設計して、本発明のキメラ抗原受容体を製造した（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２）。

【0053】

前述したように、本発明のキメラ抗原受容体は、免疫細胞の表面で発現してＥｐｈＡ２を認識して結合すれば、免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性を向上させるか、免疫細胞のサイトカインの分泌を促進するように誘導することができる。したがって、ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞が存在する時、前記キメラ抗原受容体の抗原結合部位が抗原を認識して結合する場合、シグナル伝達によって免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性の向上及び／またはサイトカインの分泌促進が誘導されて、癌細胞を攻撃する細胞毒性の効能または細胞溶解の効能に優れたキメラ抗原受容体として有用に用いられる。

【0054】

本発明の他の側面は、前記キメラ抗原受容体を発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクターを提供する。
前記ポリヌクレオチドは、前記キメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含む。

【0055】

本発明において、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含むものであって、基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。

【0056】

前記キメラ抗原受容体をコードするということは、前記ポリヌクレオチドが転写、翻訳などの通常のタンパク質発現過程を経て、本発明のキメラ抗原受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質が合成される遺伝情報がコードされているということを意味する。この際、前記キメラ抗原受容体と完全に同じアミノ酸配列を有するタンパク質だけではなく、前述したように、前記タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質であるが、前記タンパク質と同一及び／または類似した活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまで本発明の範囲に含まれる。

【0057】

具体的に、本発明のポリヌクレオチドは、前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗ＥｐｈＡ２抗体の抗原結合可変断片をコードする塩基配列を含むのであり、より具体的に、配列番号２０または配列番号２１の塩基配列を含むものである。

【0058】

また、本発明のポリヌクレオチドは、前記抗原結合可変断片をコードする塩基配列だけではなく、これと連結された他の細胞外ドメイン部分、前記膜貫通ドメイン及び／または前記細胞内シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列を含むものである。

【0059】

前記抗体、抗原結合可変断片、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインなど前記キメラ抗原受容体についての説明は、先立ってこれらについて説明したものと同一である。

【0060】

前記ポリヌクレオチドは、配列番号２２または配列番号２３または配列番号２４または配列番号２５の塩基配列を含むものである。本発明の具体的な一実施例では、２種（＃７９及び＃８５）の抗ＥｐｈＡ２抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインに含み、これとＭｙｃ及びヒンジドメインで連結されたＣＤ２８を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインとして含み、ＣＤ３－ｚｅｔａ及びＤＡＰ１０を細胞内シグナル伝達ドメインで連結された形態のキメラ抗原受容体を設計して、それを発現させるために、前記配列番号２２または配列番号２３の塩基配列を含むポリヌクレオチドを製造した（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１）。本発明の具体的な他の実施例では、２種（＃７９及び＃８５）の抗ＥｐｈＡ２抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインに含み、これとＣＤ８のヒンジドメインと膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインとして含み、ＣＤ３－ｚｅｔａ及び４１－ＢＢを細胞内シグナル伝達ドメインで連結された形態のキメラ抗原受容体を設計して、それを発現させるために、前記配列番号２４または配列番号２５の塩基配列を含むポリヌクレオチドを製造した（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２）。

【0061】

本発明のポリヌクレオチドは、前記羅列された塩基配列と実質的に同じ塩基配列を含みうる。前記実質的に同じ塩基配列とは、例えば、転写及び翻訳された時、同じアミノ酸が合成される場合を含み、前記羅列された塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有する塩基配列であるが、これらに制限されるものではない。

【0062】

前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、それを導入させて発現させようとする生物の種類と前記生物の転写、翻訳など発現システムによって、最適化された塩基配列を含みうる。これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）から起因したものであって、これにより、発現されるタンパク質をコードすることができる多様な組み合わせのヌクレオチド配列が存在することができ、これらは、いずれも本発明の範囲に含まれる。前記コドン最適化によるポリヌクレオチドの変形は、本発明のキメラ抗原受容体を発現させて適用させようとする生物の種類によって決定され、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物、霊長類のコドン選択に最適化して変形されたポリヌクレオチドであり、さらに具体的には、ヒトから発現させて作用するのに適するように最適化されて変形されたものである。

【0063】

本発明の発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。

【0064】

前記ポリヌクレオチドは、本発明の前記キメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むので、それを含む前記発現ベクターは、前記キメラ抗原受容体を発現させて製造するために用いられ、前記キメラ抗原受容体が発現されるように、前記ポリヌクレオチドを特定の細胞または生物に移動させる役割を行うか、前記ポリヌクレオチドを保管、保存するために用いられる。

【0065】

前記発現ベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築される。

【0066】

例えば、前記発現ベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ ａｎｄ Ｈａｇｅｎ，Ｄ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として用いられる。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９９６）２５０：７３４－７４１）またはバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターでも調節部位として用いられる。前記発現ベクターは、当業者で度々使われるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製される。

【0067】

前記発現ベクターが真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有しうる。前記発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターを有するものである。

【0068】

また、前記発現ベクターは、これにより発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合される。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。また、本発明の発現ベクターによって発現されるタンパク質がキメラ抗原受容体なので、その特性を考慮する時、精製のための追加的な配列なしにも発現されたタンパク質をタンパク質Ａカラムなどを通じて容易に精製することもできる。

【0069】

前記発現ベクターは、選択標識として当業者で通用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含みうる。

【0070】

２．ＥｐｈＡ２に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞
本発明の他の側面は、ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対して向上した細胞毒性または細胞溶解活性を示す特徴がある免疫細胞を提供する。

【0071】

前記免疫細胞は、前述した本発明の前記キメラ抗原受容体を表面に発現する。
前記キメラ抗原受容体は、先立って「１．新規な抗ＥｐｈＡ２抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」でこれについて説明したものと同一である。具体的に、前記キメラ抗原受容体は、癌細胞で発現されるＥｐｈＡ２抗原に対して特異的に結合することができる抗原結合部位を含みうる。

【0072】

前記免疫細胞は、免疫を誘導して所望の治療効果を誘発することができる細胞であれば、制限なしに用いられ、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＣＩＫ）、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択される何れか１つであるが、これらに制限されるものではない。したがって、本発明によるキメラ抗原受容体を細胞表面に発現する免疫細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などである。

【0073】

前記Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞などであるが、これらに制限されるものではない。

【0074】

前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ナチュラルキラー細胞にキメラ抗原受容体が導入された細胞を意味し、既存のＴ細胞を基盤としたＣＡＲ－Ｔ治療剤を利用した時の癌免疫治療が有している持続的な毒性による問題点、自己免疫疾患の危険、異種細胞移植に対する移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の問題点、非標的毒性問題などを反応開始（ｏｎ）／中止（ｏｆｆ）のスイッチを通じて解決するだけではなく、多様な癌細胞を標的可能にして汎用の治療剤として活用可能な長所がある。

【0075】

本発明の免疫細胞は、癌細胞で特異的に発現されるＥｐｈＡ２を特異的に認識して結合することができる抗体の抗原結合可変断片（ｓｃＦｖ）を細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体を、細胞表面に発現している。したがって、前記ＥｐｈＡ２が発現された癌細胞が存在する場合、前記キメラ抗原受容体によってシグナル伝達が発生することができ、これを通じて免疫細胞の細胞毒性または細胞溶解活性がさらに向上し、サイトカインの分泌量が増加する。したがって、本発明の免疫細胞は、癌細胞を攻撃して、それを治療する活性を有しうる。

【0076】

本発明の具体的な実施例では、本発明のＥｐｈＡ２特異的抗体２種の抗原結合可変断片を細胞外ドメインとして含むキメラ抗原受容体をナチュラルキラー細胞の表面及びＴ細胞に発現させた。前記それぞれの２種のナチュラルキラー細胞は、ＥｐｈＡ２を発現する乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共培養された時、そして、前記それぞれの２種のＴ細胞は、ＥｐｈＡ２を発現する肺癌細胞株であるＡ５４９細胞と共培養された時、いずれも細胞毒性（または、細胞溶解活性）が向上し、サイトカインの分泌量が顕著に増加するだけではなく、脱顆粒程度も増加して、本発明の免疫細胞は、ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対して卓越した治療効果があるということを確認することができた。また、前記のような癌細胞に対する治療効果は、癌細胞を移植した動物モデルでも確かに確認することができた。

【0077】

３．本発明の免疫細胞の癌に対する治療用途
本発明のさらに他の側面は、前記免疫細胞を含む癌治療用薬学的組成物を提供する。
前記免疫細胞、これにより発現されるキメラ抗原受容体などに関する説明は、「１．新規な抗ＥｐｈＡ２抗体、その抗原結合断片、そして、それを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現させるためのポリヌクレオチド及び発現ベクター」及び「２．ＥｐｈＡ２に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞」でこれらについて説明したものと同一なので、繰り返し説明を避けるために、記載を省略する。

【0078】

本発明において、用語「癌」は、「腫瘍」は同じ意味として使われ、典型的に調節されていない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を称するか、意味する。
本発明の組成物で治療することができる癌または癌腫は、特に制限されず、固形癌及び血液癌をいずれも含む。例えば、前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉種、線維性腫瘍及び脳癌からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これに制限されるのではなく、前記第２キメラ抗原受容体から認識することができる抗原を含む癌細胞であれば、本発明で制限なしに適用可能である。

【0079】

本発明において、用語「治療」は、癌の発展の抑制、症状の軽減または除去を意味する。
前記薬学的組成物は、治療対象である個体の腫瘍細胞の数に比べて、前記免疫細胞の数が１～１０倍、２～１０倍、または５～８倍に含まれるが、これらに制限されるものではない。

【0080】

前記組成物は、薬学的組成物以外にも、医薬部外品組成物、健康食品用組成物などの形態である。

【0081】

本発明の癌の治療用組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。前記「薬学的に許容可能な」の意味は、有効成分の活性を抑制せずとも、適用（処方）対象が適応可能な以上の毒性を有さないというものであり、前記「担体」は、細胞または組織内への化合物の付加を容易にする化合物と定義される。

【0082】

本発明の前記薬学的組成物は、単独で、またはある便利な担体などと共に混合して投与され、そのような投与剤形は、単回投与または繰り返し投与剤形である。前記薬学組成物は、固形製剤または液状製剤である。固形製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これらに限定されるものではない。固形製剤には、担体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれるが、これらに制限されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これらに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体と乳糖、澱粉、微結晶セルロースなど薬剤学的に許容可能な適当な担体を単純混合することで製造可能である。顆粒剤は、本発明の前記多重不飽和脂肪酸のトリ－ヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な担体及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を利用した湿式顆粒法または圧縮力を利用した乾式顆粒法を用いて製造可能である。また、錠剤は、前記顆粒剤をステアリン酸マグネシウムなどの薬学的に許容可能な適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造可能である。

【0083】

前記薬学的組成物は、治療しなければならない疾患及び個体の状態によって敬具剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トランスダー末剤、トピカル剤などで投与されるが、これらに制限されるものではない。投与経路によって通常使われ、非毒性である、薬学的に許容可能な担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形で製剤化される。

【0084】

前記薬学的組成物は、毎日約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｇ／ｋｇが投与され、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇの１日投与容量で投与される。しかし、前記投与量は、前記混合物の精製程度、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性などによって多様である。必要に応じて便利性のために、１日総投与量を一日間数回分けて投与される。

【実施例】

【0085】

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。

【0086】

但し、下記の実施例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が、下記の実施例によって限定されるものではない。

【0087】

［実施例１］
［１－１］ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗体の一本鎖可変断片の作製
癌細胞で発現されるＥｐｈＡ２タンパク質に対して特異的に結合することができる抗ＥｐｈＡ２抗体配列中で、特異的結合に重要な役割を行う配列を用いて一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）２種（＃７９、＃８５）を製造した。

【0088】

＃７９ ｓｃＦｖの場合、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。そして、＃８５ ｓｃＦｖの場合、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むように設計した。

【0089】

［１－２］ナチュラルキラー細胞に導入するキメラ抗原受容体の設計
前記のように設計された２種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインとしてナチュラルキラー細胞に導入するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を設計した。具体的に、前記２種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８を膜貫通ドメインとしてＭｙｃ及びヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインでＣＤ３－ｚｅｔａと共刺激分子でＣＤ２８ ＤＡＰ１０を追加して連結することにより、いわゆる３世代ＣＡＲに分類されるキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを有するように、本発明のキメラ抗原受容体を設計した（それぞれ「ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１」及び「ＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１」とし、これらを通称して「ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１」と称する）。そして、それをコードする遺伝子コンストラクトの塩基配列をレンチウイルスベクターに挿入した（図１）。

【0090】

［１－３］Ｔ細胞に導入するキメラ抗原受容体の設計
追加的に、前記のように設計された２種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインとしてＴ細胞に導入するキメラ抗原受容体を設計した。具体的に、前記２種のｓｃＦｖを抗原結合部位として含む細胞外ドメインと、ＣＤ８を膜貫通ドメインとしてヒンジドメインで連結させ、前記膜貫通ドメインに細胞内シグナル伝達ドメインでＣＤ３－ｚｅｔａと共刺激分子で４－１ＢＢを追加して連結することにより、いわゆる２世代ＣＡＲに分類されるキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを有するように、本発明のキメラ抗原受容体を設計した（それぞれ「ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２」及び「ＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２」とし、これらを通称して「ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２」と称する）。そして、それをコードする遺伝子コンストラクトの塩基配列をレンチウイルスベクターに挿入した（図２）。

【0091】

［実施例２］
ＥｐｈＡ２に対するキメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞の製造
前記実施例１を通じて設計した本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現することができる免疫細胞を製造した。

【0092】

［２－１］ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１を発現するナチュラルキラー細胞の製造
前記実施例１－２で準備したレンチウイルスベクターを、ウイルスパッケージングベクター（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ；ｐＭＤＬＧ／ＲＲＥ、ｐＲＳＶ／ＲＥＶ、ＶＳＶＧ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換し、それからＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１を発現するレンチウイルスを収得した後、それを超高速遠心分離機を用いて濃縮させた後、Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ方法（３６０ｇ、９０ｍｉｎ、ＲＴ）で感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）が３０になるようにナチュラルキラー細胞に感染させた。前記のように感染されたナチュラルキラー細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５時間培養した後、新鮮な培地に交換し、３日後に十分に感染されたナチュラルキラー細胞の選別のために、３ｕｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を処理して培養を進行し続けた。対照群として、感染されていないナチュラルキラー細胞にもピューロマイシンを処理し、対照群でナチュラルキラー細胞がピューロマイシンによっていずれも死滅するまでピューロマイシンが処理された培地を用いて培養を続けた。対照群のナチュラルキラー細胞がいずれも死滅した時点で感染されたナチュラルキラー細胞を選別して実験を行った。

【0093】

前記のように作製及び選別されたＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１を発現するナチュラルキラー細胞（それぞれ「ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞」及び「ＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞」とし、これらを通称して「ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞」と称する）に、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１のｍｙｃに特異的に結合する抗ｍｙｃ抗体（ＣＳＴ；９Ｂ１１）を処理し（４℃、雌牛で３０分）、流細胞分析を通じてＭｙｃの発現を確認した。この際、対照群としては、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１を発現しない本来のナチュラルキラー細胞を使用した。

【0094】

その結果、図３Ａに示したように、対照群に比べて２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞いずれもでＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１が十分に発現されていると確認された。

【0095】

［２－２］ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２を発現するＴ細胞の製造
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴ細胞に分化させた後、前記実施例１－３で準備したレンチウイルスベクターを前記実施例２－１とは同じウイルス収得及びＳｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ方法（５ＭＯＩ、３００ｇ、３２℃、９０ｍｉｎ）に分化されたＴ細胞に感染させて、ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２を発現するＴ細胞（それぞれ「ＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ２－Ｔ細胞」及び「ＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ２－Ｔ細胞」とし、これらを通称して「ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞」と称する）を作製した。その後、抗ＥｐｈＡ２抗体（Ｈｉｓ－ｔａｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥｐｈＡ２（ＮＫＭＡＸ）及びＡｎｔｉ－６Ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ^{（登録商標）} ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ））を用いて流細胞分析器を通じてＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２の発現を確認し、この際、対照群としては、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２を発現しない本来のＴ細胞を使用した。

【0096】

その結果、図３Ｂに示したように、対照群に比べて２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞いずれもでＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２が十分に発現されていると確認された。

【0097】

［実施例３］
ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対する、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の細胞毒性（または、細胞溶解活性）の確認
前記実施例２で製造したもののように、本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現するナチュラルキラー細胞及びＴ細胞は、ＥｐｈＡ２に対して特異的に結合するｓｃＦｖを抗原結合部位として含んでいるので、前記ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対する細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認した。

【0098】

［３－１］ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞の選別
まず、ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞で乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（韓国細胞株銀行）と肺癌細胞株であるＡ５４９細胞（韓国細胞株銀行）とを、そして、ＥｐｈＡ２を発現しない癌細胞で慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞（韓国細胞株銀行）を選定し、抗ＥｐｈＡ２抗体（Ｈｕｍａｎ ＥｐｈＡ２／Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２Ａ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^{（登録商標）} ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））を１ｕｌ／１００ｕｌの量で処理して反応させた後（４℃、雌牛で３０分）、流細胞分析器を通じて３つの細胞株でＥｐｈＡ２の発現程度を確認した。

【0099】

その結果、図４に示したように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＡ５４９細胞は、ＥｐｈＡ２を発現していると、そして、Ｋ５６２細胞は、ＥｐｈＡ２を発現していないと確認された。

【0100】

［３－２］ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対するＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞の活性確認
前記のようにＥｐｈＡ２の発現有無が確認されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＫ５６２細胞とに対して、前記実施例２－１で製造した２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞の細胞毒性をカルセインＡＭ分析法で確認した。具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＫ５６２細胞とにカルセインを５ｕｇ／ｍｌの濃度で処理して反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２、雌牛で１時間）、カルセインで染色されたそれぞれの癌細胞に本来のナチュラルキラー細胞と前記２種の各ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞とをそれぞれ５：１、１：１、０．５：１の比率（ナチュラルキラー細胞：癌細胞）で処理して反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２条件で４時間）、上澄み液１００ｕｌを取って上澄み液内に存在するカルセインの量を確認した。

【0101】

その結果、下記の図５に示したように、ＥｐｈＡ２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対しては、前記２種のＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２＃８５－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞がいずれも対照群ナチュラルキラー細胞に比べて遥かに高い細胞毒性を示すだけではなく、このような細胞毒性が、処理されたＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞に濃度依存的であると確認された。それに対して、ＥｐｈＡ２を発現しないＫ５６２細胞に対しては、対照群と前記２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞いずれも細胞毒性をほとんど示さないと確認された。

【0102】

さらに、前記２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞に対してサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）とグレニュル（ｇｒａｎｕｌｅ）との分泌を確認した。具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＫ５６２細胞とに本来のナチュラルキラー細胞または前記実施例２－１で製造した２種の各ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞を１：１に処理して反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２条件で１６時間）、上澄み液を集めて上澄み液内に存在するＩＮＦ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）をＥＬＩＳＡを通じて確認した。この際、本来のナチュラルキラー細胞とＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞との単独から分泌されるサイトカインの量を対照群として使用した。

【0103】

その結果、図６に示したように、ＥｐｈＡ２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に処理したＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞のみでＩＮＦ－γの分泌量が著しく向上したと確認された。

【0104】

また、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＫ５６２細胞と本来のナチュラルキラー細胞または前記実施例２－１で製造した２種の各ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞をＲＰＭＩ（１０％ ＦＢＳ）で１：１に混合して反応させた後（３７℃、５％ ＣＯ_２条件で４時間）、ナチュラルキラー細胞を選別できるように抗ＣＤ５６抗体を処理して染色し、流細胞分析を通じて本来のナチュラルキラー細胞と前記２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞とでＣＤ１０７ａが発現される程度を分析した。

【0105】

その結果、図７に示したように、ＩＮＦ－γの場合と同様に、ＥｐｈＡ２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に処理したＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞のみでＣＤ１０７ａの発現が著しく向上していると確認された。

【0106】

［３－３］ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対するＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の活性確認
前記のようにＥｐｈＡ２の発現有無が確認されたＡ５４９細胞でＧＦＰを発現させ、これにより、前記実施例２－２で作製したＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞をそれぞれ２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１の比率（Ｔ細胞：癌細胞）で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ装備で４８時間培養しながら４時間隔でデータを収集し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭプログラムを使用してＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の細胞毒性を分析した。

【0107】

その結果、図８に示したように、ＥｐｈＡ２を発現するＡ５４９細胞に対しては、前記２種のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞が細胞毒性を示すと確認された。

【0108】

［実施例４］
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞及びＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の細胞毒性（または、細胞溶解活性）の確認
前記実施例３で確認された本発明のキメラ抗原受容体を表面に発現するナチュラルキラー細胞及びＴ細胞のＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対する細胞毒性を動物モデルでもう一度確認した。

【0109】

［４－１］ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対するＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞の活性確認
まず、前記実施例［３－１］とは同じ方法で肺癌細胞株であるＨ４６０細胞（韓国細胞株銀行）でＥｐｈＡ２が発現されているということを確認し（図９Ａ）、前記実施例［３－２］とは同じ方法で前記Ｈ４６０細胞に対してＥｐｈＡ２＃７９－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞が細胞外ドメインが除去されたＣＡＲを発現する対照群ナチュラルキラー細胞（ｄＥＣＴＯ）に比べて遥かに高い細胞毒性を示すということを確認した（図９Ｂ）。

【0110】

次いで、図９Ｃに示したように、前記Ｈ４６０細胞３ｘ１０^６個を約６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（セロンバイオ）のわき腹の部分に皮下注射し、１０日経過後に腫瘍のサイズが５０ｍｍ^３程度になった時、前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞または対照群ナチュラルキラー細胞２ｘ１０^６個を３日または４日間隔で５回にわたって静脈注射した。その後、２４日にわたって腫瘍のサイズと重量とを測定した。

【0111】

その結果、図９Ｄ及び図９Ｅに示したように、対照群ナチュラルキラー細胞を投与したマウスに比べて、本発明のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ１－ＮＫ細胞を投与したマウスで腫瘍のサイズと重量とが著しく減少したと確認された。

【0112】

［４－２］ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞に対するＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞の活性確認
次いで、ＥｐｈＡ２を発現する肺癌細胞株であるＡ５４９細胞にルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が導入されたＡ５４９－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）１ｘ１０^６個を６週齢の雄ＮＯＧマウス（株式会社コアテック）の右側わき腹の部分に皮下注射し、腫瘍のサイズが２００ｍｍ^３程度になった時、前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞または細胞外ドメインが除去されたＣＡＲを発現する対照群Ｔ細胞（ｄＥＣＴＯ）５ｘ１０^６個を静脈注射した。その後、４５日にわたって週２回ずつ腫瘍のサイズ、マウスの重量及びＩＶＩＳを測定した。

【0113】

その結果、図１０Ａ、図１０Ｂに示したように、前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞が腫瘍を効果的に抑制すると確認され、図１０Ｃに示したように、静脈注射後、マウス血液内で前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞と対照群Ｔ細胞との存在も確認された。また、図１０Ｄに示したように、前記ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ２－Ｔ細胞が対照群Ｔ細胞に比べて腫瘍内にさらに多くの量で存在すると確認された。

【0114】

［整理］
前記のような実験の結果を総合してみる時、本発明の２種の抗ＥｐｈＡ２抗体（＃７９、＃８５）は、ＥｐｈＡ２に対して特異的な結合力を示すだけではなく、前記ＥｐｈＡ２を発現する癌細胞のＥｐｈＡ２を認識して結合する場合、前記抗体の抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体が表面に発現された免疫細胞（ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞）でシグナル伝達を誘発し、これにより、免疫細胞が癌細胞を攻撃することができる各種の免疫反応を誘発させる効果があるということをインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）だけではなく、インビボでも確かに確認することができた。

【0115】

以上、本発明は、記載の実施例に対してのみ詳しく説明されたが、本発明の技術思想の範囲内で多様な変形及び修正が可能であることは当業者にとって明らかなものであり、このような変形及び修正が添付の特許請求の範囲に属すことも当然である。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【配列表】

2024528286000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-02-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
ＥｐｈＡ２に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記重鎖可変領域は、配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域は、配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位を含む細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内信号伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号１または配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号４または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、キメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ＥｐｈＡ２に特異的に結合する抗原結合部位は、
配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗ＥｐｈＡ２抗体の一本鎖可変断片である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記細胞外ドメインは、ヒンジドメイン及びスペーサドメインからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記ヒンジドメインまたはスペーサドメインは、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジドメイン及びＦｃからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ（α）、ベータ（β）またはゼータ（ζ）鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択される何れか１つである、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記細胞内信号伝達ドメインは、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ（ζ）、ＦｃＲガンマ（γ）、ＦｃＲベータ（β）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される少なくとも１つを第１信号伝達ドメインとして含み、
ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＥｐｈＡ２及びＣＤ８３からなる群から選択される少なくとも１つを共刺激信号伝達ドメインとして含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

請求項４から請求項１１のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項13】

請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項14】

請求項４から請求項１１のうち何れか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現する、免疫細胞。

【請求項15】

前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラーT細胞（ＮＫＴ ｃｅｌｌ）、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）、マクロファージ及び樹状細胞からなる群から選択される何れか１つである、請求項１４に記載の免疫細胞。

【請求項16】

請求項１４に記載の免疫細胞を含む、癌治療用薬学的組成物。

【請求項17】

前記癌は、肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、皮膚癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、血液癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、胸腺癌、骨肉種、線維性腫瘍及び脳癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１６に記載の癌治療用薬学的組成物。

【国際調査報告】