▶ エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-26
(54)【発明の名称】ポリＡテールを安定して保持する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/68 20060101AFI20240719BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240719BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240719BHJP
C12P 19/34 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C12N15/68 Z ZNA
C12N1/21
C12P21/02 C
C12P19/34 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507933
(86)(22)【出願日】2022-08-17
(85)【翻訳文提出日】2024-02-07
(86)【国際出願番号】 KR2022012233
(87)【国際公開番号】W WO2023022490
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】10-2021-0108264
(32)【優先日】2021-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519038714
【氏名又は名称】エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】シン、ジン ファン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ヨン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム、フン
(72)【発明者】
【氏名】クォン、ヨン－ミン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ヘ－ウォン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC06
4B064CC24
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA23
(57)【要約】
本発明は、ポリＡテールを安定して保持する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む、ポリＡテールをプラスミドにおいて安定して保持する方法。
【請求項2】
前記培養するステップは、（１）前記細胞株を３１℃以下の温度条件にて回復させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記（１）の回復ステップの後に、（２）前記細胞株を３１℃以下の温度条件にて固体培地で培養してコロニーを形成することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記培養は、（３）前記（２）の固体培地培養により形成されたコロニーを３１℃以下の温度条件にて液体培地で培養するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記液体培地で培養するステップは、継代培養を行うことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記温度条件は１６℃～３１℃である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記温度条件は１９℃～２５℃である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞株は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記形質転換は、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）又はエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドを細胞株に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記導入は、３７℃～４２℃の温度で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３７℃以上の温度条件にて培養するステップを含む方法に比べて、プラスミド内のポリＡテールの安定性が向上するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ポリＡテールは、２０～４００個のアデニン（Ａ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む、ｍＲＮＡ生産のためのプラスミドの大量生産方法。
【請求項14】
ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップと、前記細胞株のプラスミドを鋳型として転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行うステップとを含む、
ポリＡテールを含むｍＲＮＡの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリＡテールを安定して保持する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ｍＲＮＡは、医薬品の有効成分（ＡＰＩ，Ａｃｔｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）として注目されている。ｍＲＮＡにはポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）という構成要素が必要であるが、ポリＡテールはＲＮＡの安定性や翻訳過程において重要な役割を果たす。ｍＲＮＡワクチンを構成するｍＲＮＡにおいて、ポリＡテールの長さは１２０個が標準サイズ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｉｚｅ）であると認識されている（非特許文献２）。細胞内で転写されるｍＲＮＡにはポリＡシグナル（ＰｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ）が存在し、転写過程後にポリＡテールが付加される過程を経る。インビトロ転写（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， ＩＶＴ）により作製されるｍＲＮＡにも、体内安定性及び翻訳効率を高めるためにポリＡテールが必要である。
【0003】
ポリＡテールを付加する方法は２つに分けられる。一方は、ＩＶＴ後にｐｏｌｙＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてポリＡテールを合成する方法であり、他方は、ＩＶＴに用いる鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にアデニン繰り返し配列が含まれるようにし、ＩＶＴによりポリＡテールが生成されるようにする方法である。
【0004】
前者の場合、ポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を活用してｍＲＮＡにポリＡテールを合成する別途の過程を必要とし、生成されるポリＡテールの長さは一定でない。しかし、後者の場合、ＩＶＴ過程以外の別途の過程を必要とせず、生成されるポリＡテールの長さは一定になる。よって、工程の効率性及びポリＡテールの長さの均一性の面から、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にポリＡテール配列が含まれるようにすることが好まれる。
【0005】
そのためには、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡにポリＡテール配列をクローニングして保持しなければならないが、一般的な方法で大腸菌を活用してそのような過程を行うと、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）及び欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が起こるので、ｍＲＮＡワクチンに用いるための標準サイズである１００個以上のアデニン繰り返し配列を含むプラスミドＤＮＡを確保することは困難である。
【0006】
上記問題を解決するために、アデニン繰り返し配列間にリンカー配列が含まれるようにして安定性を向上させる方法が考案されたが（非特許文献３）、アデニン繰り返し配列のみで構成されたポリＡテールが自然界に存在する本来の姿であるので、ポリＡテール間にリンカー配列が含まれるようにせず、プラスミドにクローニング及び保持する他の方法の開発が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ａｃｔａ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉａ ５０ （２０２１） ２， １８０－１８８
【非特許文献2】Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２０２１ Ｄｅｃ ３；２６：９４５－９５６
【非特許文献3】ＲＮＡ． ２０１９ Ａｐｒ；２５（４）：５０７－５１８． ｄｏｉ： １０．１２６１／ｒｎａ．０６９２８６．１１８． Ｅｐｕｂ ２０１９ Ｊａｎ １５．
【非特許文献4】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｕｃｌｅｉｃｓ．ｃｏｍ／ＤＮＡ＿ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ＤＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ＡＴ－ｓｌｉｐｐａｇｅ．ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、ポリＡテールを安定して保持する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、ポリＡテールを安定して保持する方法を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明の方法により、ポリＡテールを容易にクローニングすることができ、ポリＡ配列が安定して保持される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】摂氏３７度の条件でのＤＨ５α（ＤＨ５ａｌｐｈａ）を用いたｐｏｌｙ（Ａ）配列クローニング時のコロニーＰＣＲの結果を確認した図である。
【図2】摂氏３７度の条件でのＳｔｂｌ３を用いたｐｏｌｙ（Ａ）配列クローニング時のコロニーＰＣＲの結果を確認した図である。
【図3】低温条件でのｐｏｌｙ（Ａ）配列クローニング時のコロニーＰＣＲの結果を確認した図である。
【図4】ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を様々な温度条件にて培養し、Ａ１２４±１の割合を比較した結果を示すグラフである。
【図5】準備したストックを１３度、１６度、１９度、２２度、２５度の条件にて２００ｒｐｍで４８時間培養しながら所定の時間にＯＤ６００を測定した各温度における培養曲線結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明を実現する一態様は、ポリＡテールをプラスミドにおいて安定して保持する方法である。
一具体例において、前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
一具体例において、前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
【0013】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記培養するステップは、（１）前記細胞株を３１℃以下の温度条件にて回復させることを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、前記（１）の回復ステップの後に、（２）前記細胞株を３１℃以下の温度条件にて固体培地で培養してコロニーを形成することを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、前記（１）の回復ステップの後に、（２）前記細胞株を３１℃以下の温度条件にて固体培地で培養してコロニーを形成することを含む。
【0014】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記培養は、（３）前記（２）の固体培地培養により形成されたコロニーを３１℃以下の温度条件にて液体培地で培養するステップをさらに含む。
【0015】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、（１）ポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて回復させるステップと、（２）回復させた細胞株を３１℃以下の温度条件にて固体培養することによりコロニーを形成するステップと、（３）３１℃以下の温度条件にて液体培養を行うステップとを含む。
【0016】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記液体培地で培養するステップは、継代培養を行うことを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、ステップ（１）～（３）の温度条件は１６℃～３１℃である。
前述した具体例のいずれかにおいて、ステップ（１）～（３）の温度条件は１６℃～３１℃である。
【0017】
前述した具体例のいずれかにおいて、ステップ（１）～（３）の温度条件は１９℃～２５℃である。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記細胞株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記細胞株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【0018】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記形質転換は、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）又はエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドを細胞株に導入することを含む。
【0019】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記導入は、３７℃～４２℃の温度で行われる。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、培養した細胞株を保存するステップをさらに含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、培養した細胞株を保存するステップをさらに含む。
【0020】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記保存するステップは、細胞株を凍結及び／又は乾燥させることを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記培養は、保存されている菌株を培養して活性化するステップを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記培養は、保存されている菌株を培養して活性化するステップを含む。
【0021】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、プラスミドにより形質転換された細胞株を３７℃以上の温度で培養するステップを含む方法に比べて、プラスミド内のポリＡテールの安定性が向上することを特徴とする。
【0022】
前述した具体例のいずれかにおいて、ポリＡテールは、２０～４００個のアデニン（Ａ）を含む。
本発明を実現する他の態様は、ｍＲＮＡ生産のためのプラスミドの大量生産方法である。
本発明を実現する他の態様は、ｍＲＮＡ生産のためのプラスミドの大量生産方法である。
【0023】
一具体例において、前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
【0024】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記ｍＲＮＡは、免疫原性組成物及び／又は治療剤の一構成成分である。
本発明を実現するさらに他の態様は、ポリＡテールを含むｍＲＮＡの生産方法である。
本発明を実現するさらに他の態様は、ポリＡテールを含むｍＲＮＡの生産方法である。
【0025】
一具体例において、前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
【0026】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記方法は、細胞株からプラスミドを回収してインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写を行うことを含む。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記ｍＲＮＡは、免疫原性組成物及び／又は治療剤の一構成成分である。
前述した具体例のいずれかにおいて、前記ｍＲＮＡは、免疫原性組成物及び／又は治療剤の一構成成分である。
【0027】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0028】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【0029】
さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0030】
本発明の一態様は、ポリＡテールをプラスミドにおいて安定して保持する方法である。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
【0031】
本発明における「ポリＡテール（ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌ）」とは、典型的にＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸（ａｄｅｎｙｌａｔｅ）残基の連続又は不連続配列を意味する。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの３’、例えば３’ＵＴＲの後に続くものであってもよい。このようなポリＡテールは、約２０個以上、２５個以上、４０個以上、６０個以上、８０個以上又は１００個以上のアデニル（Ａ）ヌクレオチドから構成されてもよく、それを含んでもよい。
【0032】
一実施例として、ポリＡテールは、２０～４００個のアデニン（Ａ）を含んでもよい。例えば、２０～３００個、４０～２００個、５０～１９０個、６０～１８０個、７０～１７０個、６０～１６０個、７０～１５０個、８０～１４０個のアデニンを含んでもよい。例えば、約１２０個のアデニンを含むが、これに限定されるものではない。
【0033】
一実施例として、ポリＡテールのヌクレオチドの数を基準に、典型的に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％はＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばＵ、Ｔ又はＣであってもよい。例えば、ポリＡテールは、ｍＲＮＡの分解を遅延させる変形を含んでもよい。
【0034】
本発明において、ポリＡテールを含むプラスミドは、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、目的とするｍＲＮＡをコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含んでもよい。一実施例として、前記プラスミドは、クローニングに活用することが容易な制限酵素結合部位を含んでもよい。
【0035】
一実施例として、前記プラスミドは、形質転換されたか否かを確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含んでもよい。薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0036】
本発明のプラスミドは、プラスミドにポリＡテールをコードする配列を導入することにより、プラスミドを作製することができる。
例えば、ポリＡテールをコードする配列をＰＣＲにより増幅し、制限酵素で処理し、その後制限酵素で処理したプラスミドに連結することにより、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドを準備することができる。例えば、ポリＡテールをコードする配列の上流にｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が連結されていてもよい。例えば、前記プラスミドは、ポリＡテールをコードする配列の上流にｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの配列を含む、目的とするｍＲＮＡを転写するための鋳型として用いてもよい。
例えば、ポリＡテールをコードする配列をＰＣＲにより増幅し、制限酵素で処理し、その後制限酵素で処理したプラスミドに連結することにより、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドを準備することができる。例えば、ポリＡテールをコードする配列の上流にｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が連結されていてもよい。例えば、前記プラスミドは、ポリＡテールをコードする配列の上流にｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの配列を含む、目的とするｍＲＮＡを転写するための鋳型として用いてもよい。
【0037】
本発明のポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株は、ポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドを細胞株に導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）して準備してもよい。
【0038】
本発明において、ポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドを細胞株に導入することは、細胞株をプラスミドにより形質転換するといってもよい。
本発明において、プラスミドの「導入」又は「形質転換」とは、細胞株にプラスミドを伝達することを意味する。このような導入は、当該技術分野における通常の方法により容易に行うことができる。プラスミドを細胞株に導入するために、細胞がＤＮＡ分子に対して透過性を有するように処理する過程を経るようにしてもよい。そのような過程を経た細胞をコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）という。
本発明において、プラスミドの「導入」又は「形質転換」とは、細胞株にプラスミドを伝達することを意味する。このような導入は、当該技術分野における通常の方法により容易に行うことができる。プラスミドを細胞株に導入するために、細胞がＤＮＡ分子に対して透過性を有するように処理する過程を経るようにしてもよい。そのような過程を経た細胞をコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）という。
【0039】
一実施例として、前記導入は、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）又はエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いたものであってもよい。
熱ショックを用いたプラスミドの伝達は、ＤＮＡと細胞を混合して瞬間的に熱を加えることにより行われる。例えば、前記熱ショックによる導入は、約３７℃以上の温度条件にて行われ、具体的には約３７℃～４２℃の温度条件にて行われる。熱ショックを与える前及び／又は与えた後に、氷上で細胞を冷却するステップを含んでもよい。
熱ショックを用いたプラスミドの伝達は、ＤＮＡと細胞を混合して瞬間的に熱を加えることにより行われる。例えば、前記熱ショックによる導入は、約３７℃以上の温度条件にて行われ、具体的には約３７℃～４２℃の温度条件にて行われる。熱ショックを与える前及び／又は与えた後に、氷上で細胞を冷却するステップを含んでもよい。
【0040】
エレクトロポレーションは電気を用いてプラスミドを伝達する方法であり、短く高い電圧の電気パルス刺激を印加して細胞膜の膜電位に変化を与えると、ナノメートルサイズの小さな気孔が細胞膜の表面に生成され、ＤＮＡの透過性が高くなる。例えば、前記エレクトロポレーションによる導入は、約３７℃以上の温度条件にて行われ、具体的には約３７℃～４２℃の温度条件にて行われる。電気刺激を加える前及び／又は加えた後に、氷上で細胞を冷却するステップを含んでもよい。
【0041】
他の例として、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）という還元剤を用いることにより効率を向上させたＨａｎａｈａｎ方法、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、ＰＥＧを用いた形質転換法、硫酸デキストラン、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが用いられる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0042】
ｍＲＮＡワクチンなどの治療目的のｍＲＮＡにおいては、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率のためにポリＡテールが安定して必要であり、本出願人は、新たに前記プラスミドに存在するポリＡテールをコードする配列が消失せず、安定してクローニング、大量生産、保持することのできる方法によりクローニングした大腸菌の培養方法を提供する。
【0043】
本発明において、ポリＡテールをコードする配列を含むプラスミドを導入した細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップは、（ｉ）細胞株を回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）させるステップ、（ｉｉ）細胞株を固体培地で培養するステップ、及び（ｉｉｉ）細胞株を液体培地で培養するステップの１つ以上を含んでもよい。
【0044】
前記（ｉ）細胞株を回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）させるステップは、形質転換後にコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）状態にあった細胞株を培地で培養して生理学的機能を回復させるステップである。例えば、回復ステップの培地は非選択培地であってもよい。
【0045】
例えば、前記回復ステップにおける培養温度は、約３１℃以下、例えば約１６℃～３１℃、約１６℃～３０℃、約１６℃～２９℃、約１６℃～２８℃、約１６℃～２７℃、約１６℃～２６℃、約１６℃～２５℃、約１７℃～２５℃、約１８℃～２５℃、又は約１９℃～２５℃であってもよい。
【0046】
例えば、前記回復ステップにおける培養時間は、約５分間～２時間であってもよい。
前記（ｉｉ）細胞株を固体培地で培養するステップにより、形質転換された細胞株を培養してコロニーを形成することができる。
前記（ｉｉ）細胞株を固体培地で培養するステップにより、形質転換された細胞株を培養してコロニーを形成することができる。
【0047】
「コロニー」とは、目的とするプラスミドを導入した細胞株の群集を意味する。
「固体培地」は「固形培地」ともいう。固体培地培養において、菌株が生育したか否かと、プラスミドが導入されたか否かを確認してもよく、プラスミドが導入されたか否か確認するために選択培地（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用いてもよい。例えば、選択培地は抗生剤を含んでもよい。
「固体培地」は「固形培地」ともいう。固体培地培養において、菌株が生育したか否かと、プラスミドが導入されたか否かを確認してもよく、プラスミドが導入されたか否か確認するために選択培地（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用いてもよい。例えば、選択培地は抗生剤を含んでもよい。
【0048】
例えば、前記固体培地で培養するステップの温度は、約３１℃以下、例えば約１６℃～３１℃、約１６℃～３０℃、約１６℃～２９℃、約１６℃～２８℃、約１６℃～２７℃、約１６℃～２６℃、約１６℃～２５℃、約１７℃～２５℃、約１８℃～２５℃、又は約１９℃～２５℃であってもよい。
【0049】
前記（ｉｉｉ）細胞株を液体培地で培養するステップにより、細胞株を大量培養することができる。前記液体培地で培養するステップは、前記（ｉｉ）の固体培地培養ステップで得られた単一コロニーを培養するものであってもよい。
【0050】
例えば、前記液体培地で培養するステップの温度は、約３１℃以下、例えば約１６℃～３１℃、約１６℃～３０℃、約１６℃～２９℃、約１６℃～２８℃、約１６℃～２７℃、約１６℃～２６℃、約１６℃～２５℃、約１７℃～２５℃、約１８℃～２５℃、又は約１９℃～２５℃であってもよい。
【0051】
例えば、前記液体培地で培養するステップは、継代培養するステップを含んでもよい。継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）とは、元の培養における一部の細胞を新たな培地に移植して新たに培養することを意味する。継代培養により、細胞の密度を適宜調節することができる。例えば、前記継代培養は、２回、３回、又はそれ以上行われるが、これらに限定されるものではなく、当業者が適宜調節することができる。
【0052】
本発明の方法は、前記培養した細胞株を保存するステップをさらに含んでもよい。
前記保存するステップは、細胞株を凍結及び／又は乾燥させることを含む。凍結保存剤としては、例えばグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）やジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの当該技術分野で公知の物質を用いることができる。
前記保存するステップは、細胞株を凍結及び／又は乾燥させることを含む。凍結保存剤としては、例えばグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）やジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの当該技術分野で公知の物質を用いることができる。
【0053】
前述した具体例のいずれかにおいて、前記培養は、保存されている菌株を培養して活性化するステップを含む。保存されている菌株は、凍結した状態であってもよく、乾燥した状態であってもよい。前記活性化するステップにおける培養は、固体培養であってもよく、液体培養であってもよい。
【0054】
本発明の方法によれば、培養した細胞株を保存して活性化するステップにおいて、プラスミド内のポリＡテールが安定して保持される。
本発明の培養ステップにおいて用いられる培地は、細胞株を培養するために必要な栄養物質を含んでもよい。例えば、炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地が用いられる。また、培養ステップにおいて、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。
本発明の培養ステップにおいて用いられる培地は、細胞株を培養するために必要な栄養物質を含んでもよい。例えば、炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地が用いられる。また、培養ステップにおいて、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。
【0055】
本発明の細胞株は、特に限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。大腸菌は、ＤＮＡの大量生産やクローニングに広く用いられる宿主細胞であり、本発明の細胞株には、野生型大腸菌だけでなく、クローニングに有利な特性を有するように操作した変異型大腸菌も含まれる。例えば、ＲｅｃＡを欠失させた菌株が用いられる。しかし、これに限定されるものではない。
【0056】
プラスミドに含まれるポリＡテールは、細胞株内での組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）や欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）などにより長さが短くなる。しかし、本発明の方法により細胞を培養すると、プラスミドに含まれるポリＡテールの長さを安定して保持することができる。
【0057】
例えば、前記方法は、プラスミドを導入した細胞株を３７℃以上の温度で培養するステップを含む方法に比べて、プラスミド内のポリＡテールの安定性が向上することを特徴とする。前記培養は、（ｉ）細胞株を回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）させるステップ、（ｉｉ）細胞株を固体培地で培養するステップ、及び（ｉｉｉ）細胞株を液体培地で培養するステップの１つ以上を含んでもよい。
【0058】
本発明の他の態様は、ｍＲＮＡ生産のためのプラスミドの大量生産方法である。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップを含む。
【0059】
ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）、プラスミド、細胞株、培養及び温度条件については前述した通りである。
例えば、生産したプラスミドは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｍＲＮＡを合成するための鋳型として用いてもよい。例えば、前記方法は、プラスミドを細胞から回収するステップをさらに含んでもよい。しかし、これに限定されるものではない。
例えば、生産したプラスミドは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｍＲＮＡを合成するための鋳型として用いてもよい。例えば、前記方法は、プラスミドを細胞から回収するステップをさらに含んでもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0060】
例えば、前記プラスミドを鋳型として合成した、ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、免疫原性組成物の一構成成分として用いてもよい。
例えば、前記プラスミドを鋳型として合成した、ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、治療剤の一構成成分として用いてもよい。
例えば、前記プラスミドを鋳型として合成した、ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、治療剤の一構成成分として用いてもよい。
【0061】
本発明のさらに他の態様は、ｍＲＮＡ生産方法である。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップと、前記細胞株のプラスミドを鋳型として転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行うステップとを含む。
前記方法は、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）を含むｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養するステップと、前記細胞株のプラスミドを鋳型として転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行うステップとを含む。
【0062】
前記ポリＡテール及びそれを含むｍＲＮＡ、プラスミド、細胞株、培養並びに温度条件については前述した通りである。
例えば、前記培養ステップの後に、プラスミドを細胞株から回収してもよい。
例えば、前記培養ステップの後に、プラスミドを細胞株から回収してもよい。
【0063】
例えば、前記転写ステップは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行ってもよい。
例えば、前記生産方法は、生産したｍＲＮＡを製剤化するステップをさらに含んでもよい。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いることができる。例えば、前記製造方法は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に含まれる形態に作製するステップを含んでもよい。しかし、これに限定されるものではない。
例えば、前記生産方法は、生産したｍＲＮＡを製剤化するステップをさらに含んでもよい。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いることができる。例えば、前記製造方法は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に含まれる形態に作製するステップを含んでもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0064】
例えば、前記生産したポリＡテールを含むｍＲＮＡは、免疫原性組成物の一構成成分として用いてもよい。
例えば、前記生産したポリＡテールを含むｍＲＮＡは、治療剤の一構成成分として用いてもよい。
例えば、前記生産したポリＡテールを含むｍＲＮＡは、治療剤の一構成成分として用いてもよい。
【実施例】
【0065】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【0066】
比較例１．一般菌株を用いた通常条件のクローニング
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入したプラスミドＤＮＡを確保するために、通常用いるＤＨ５α菌株及び方法を用いた。
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入したプラスミドＤＮＡを確保するために、通常用いるＤＨ５α菌株及び方法を用いた。
【0067】
Ｐｏｌｙ（Ａ）断片及び接合体の準備
プラスミドに挿入するＰｏｌｙ（Ａ）断片を準備するために、配列番号１及び配列番号２の配列からなるＤＮＡオリゴ（ｏｌｉｇｏ）（コスモジンテック注文製作）を１：１のモル比で混合し、９５度から１分当たり１度ずつ温度を低くしてアニーリングし、Ｋｌｅｎｏｗ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）でギャップ部位を満たし、二本鎖ｐｏｌｙＡ ＤＮＡ断片を作製した。その後、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で切断し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて同じ制限酵素で切断したプラスミド（ｐＳＫＢＳ０１，配列番号３）に挿入することにより、接合体を準備した。
プラスミドに挿入するＰｏｌｙ（Ａ）断片を準備するために、配列番号１及び配列番号２の配列からなるＤＮＡオリゴ（ｏｌｉｇｏ）（コスモジンテック注文製作）を１：１のモル比で混合し、９５度から１分当たり１度ずつ温度を低くしてアニーリングし、Ｋｌｅｎｏｗ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）でギャップ部位を満たし、二本鎖ｐｏｌｙＡ ＤＮＡ断片を作製した。その後、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で切断し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて同じ制限酵素で切断したプラスミド（ｐＳＫＢＳ０１，配列番号３）に挿入することにより、接合体を準備した。
【0068】
形質転換（ＤＨ５α）
準備した接合体を大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌に接合体を入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で３０秒間熱ショックを与えた。その後、２分間氷上で冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地を摂氏３７度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
準備した接合体を大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌に接合体を入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で３０秒間熱ショックを与えた。その後、２分間氷上で冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地を摂氏３７度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
【0069】
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列挿入の確認
形質転換後に選択培地に形成されたコロニーに対して、コロニーＰＣＲによりｐｏｌｙ（Ａ）断片の挿入可能性の有無を把握し、次いで断片の挿入可能性を確認したコロニーからプラスミドを分離し、次いで塩基配列分析により挿入した配列を確認した。
形質転換後に選択培地に形成されたコロニーに対して、コロニーＰＣＲによりｐｏｌｙ（Ａ）断片の挿入可能性の有無を把握し、次いで断片の挿入可能性を確認したコロニーからプラスミドを分離し、次いで塩基配列分析により挿入した配列を確認した。
【0070】
コロニーＰＣＲにはＭ１３－フォワード及びＭ１３－リバースプライマー（配列番号４，５）を用い、ｐｏｌｙ（Ａ）が挿入された場合は、５５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が生成され、挿入されていないプラスミドの場合は、４４６ｂｐの大きさのものが生成されるようにした。４０個のコロニーに対してＰＣＲを行い、アガロースゲルでＰＣＲ産物を確認した。コロニーＰＣＲの結果、１９個は明確に４４６ｂｐを示し、ｐｏｌｙ（Ａ）が挿入されていないことが分かった。残りの２１個はマルチバンドの様相を示すが、５５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が含まれているようであった（図１）。断片挿入可能性が確認されたそれら２１個を摂氏３７度で液体培養し、その後プラスミドを分離し、サンガーシーケンシング（ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により塩基配列分析を行った。
【0071】
しかし、塩基配列を分析した全てのコロニーにおいて、ｐｏｌｙ（Ａ）配列が挿入されていないことが確認された。
これは、通常条件のクローニングにおいてはポリＡテールが全て消失することを裏付ける結果である。
これは、通常条件のクローニングにおいてはポリＡテールが全て消失することを裏付ける結果である。
【0072】
比較例２．不安定な断片のクローニングに特化された菌株を用いたクローニング
ｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入したプラスミドＤＮＡを確保するために、繰り返し配列を含む不安定な断片のクローニングに特化された菌株の１つであるＳｔｂｌ３菌株を用いた。形質転換の際の培養温度は、前述した比較例１と同様に摂氏３７度にした。
ｐｏｌｙ（Ａ）配列を挿入したプラスミドＤＮＡを確保するために、繰り返し配列を含む不安定な断片のクローニングに特化された菌株の１つであるＳｔｂｌ３菌株を用いた。形質転換の際の培養温度は、前述した比較例１と同様に摂氏３７度にした。
【0073】
形質転換（Ｓｔｂｌ３）
比較例１で準備した接合体を大腸菌Ｓｔｂｌ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃ７３７３０３）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌に接合体を入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で４２秒間熱ショックを与えた。その後、２分間氷上で冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地を摂氏３７度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
比較例１で準備した接合体を大腸菌Ｓｔｂｌ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃ７３７３０３）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌に接合体を入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で４２秒間熱ショックを与えた。その後、２分間氷上で冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地を摂氏３７度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
【0074】
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列挿入の確認
比較例１と同様にコロニーＰＣＲを行った。２５個のコロニーに対してＰＣＲを行い、アガロースゲルでＰＣＲ産物を確認した。１７個は明確に４４６ｂｐを示し、ｐｏｌｙ（Ａ）が挿入されていないことが分かった。残りの８個はマルチバンドの様相を示すが、５５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が含まれているようであった（図２）。断片挿入可能性が確認されたそれら８個を摂氏３７度で液体培養し、その後プラスミドを分離し、サンガーシーケンシングにより塩基配列分析を行った。
比較例１と同様にコロニーＰＣＲを行った。２５個のコロニーに対してＰＣＲを行い、アガロースゲルでＰＣＲ産物を確認した。１７個は明確に４４６ｂｐを示し、ｐｏｌｙ（Ａ）が挿入されていないことが分かった。残りの８個はマルチバンドの様相を示すが、５５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が含まれているようであった（図２）。断片挿入可能性が確認されたそれら８個を摂氏３７度で液体培養し、その後プラスミドを分離し、サンガーシーケンシングにより塩基配列分析を行った。
【0075】
しかし、塩基配列を分析した全てのコロニーにおいて、ｐｏｌｙ（Ａ）配列が挿入されていないことが確認された。
これは、不安定な断片を安定してクローニングできる特殊菌株においてもポリＡテールが全て消失し、安定したｍＲＮＡワクチンを製造するには不安定であることを裏付ける結果である。
これは、不安定な断片を安定してクローニングできる特殊菌株においてもポリＡテールが全て消失し、安定したｍＲＮＡワクチンを製造するには不安定であることを裏付ける結果である。
【実施例1】
【0076】
低温条件を用いたクローニング
上記比較例から、ｐｏｌｙ（Ａ）配列を大腸菌に導入し、その後摂氏３７度で培養する通常の方法においては、ｐｏｌｙ（Ａ）配列が正しく挿入されない、又は安定して保持されないという問題があることが確認された。
上記比較例から、ｐｏｌｙ（Ａ）配列を大腸菌に導入し、その後摂氏３７度で培養する通常の方法においては、ｐｏｌｙ（Ａ）配列が正しく挿入されない、又は安定して保持されないという問題があることが確認された。
【0077】
よって、安定したポリＡテール保持のための方法を新たに確立した。そのために、形質転換の際の大腸菌培養温度を通常の摂氏３７度より低くした。
形質転換（ＤＨ５α，Ｓｔｂｌ３）
比較例１で準備した接合体を大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）及びＳｔｂｌ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃ７３７３０３）にそれぞれ形質転換した。大腸菌培養温度を除く他の条件は、比較例１、２における条件と同一にした。大腸菌に熱ショックを与えて摂氏２５度で回復させ、抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹し、その後摂氏２５度で培養してコロニーが生成されるようにした。
形質転換（ＤＨ５α，Ｓｔｂｌ３）
比較例１で準備した接合体を大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）及びＳｔｂｌ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃ７３７３０３）にそれぞれ形質転換した。大腸菌培養温度を除く他の条件は、比較例１、２における条件と同一にした。大腸菌に熱ショックを与えて摂氏２５度で回復させ、抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹し、その後摂氏２５度で培養してコロニーが生成されるようにした。
【0078】
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列挿入の確認
比較例１と同様にコロニーＰＣＲを行った。各菌株当たり１０個のコロニーに対してＰＣＲを行い、アガロースゲルでＰＣＲ産物を確認した。
比較例１と同様にコロニーＰＣＲを行った。各菌株当たり１０個のコロニーに対してＰＣＲを行い、アガロースゲルでＰＣＲ産物を確認した。
【0079】
ＤＨ５αでは５個、Ｓｔｂｌ３では７個が明確に４４６ｂｐを示し、ｐｏｌｙ（Ａ）が挿入されていないことが分かった。残りのコロニーでは、比較例１、２とは異なり、マルチバンドの様相を示さず、明確に５５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が観察された（図３）。断片挿入可能性が確認されたそれらのコロニーは、摂氏２５度で液体培養し、その後プラスミドを分離し、サンガーシーケンシングにより塩基配列分析を行った。
【0080】
実験の結果、塩基配列を分析した全てのコロニーにおいて、ｐｏｌｙ（Ａ）配列が挿入されたことが確認された。
よって、一般菌株及び不安定な断片クローニングに特化された菌株の全てにおいて、ｐｏｌｙ（Ａ）テールを安定してクローニングするためには、摂氏３７度より低い低温条件が有利であることが確認された。
よって、一般菌株及び不安定な断片クローニングに特化された菌株の全てにおいて、ｐｏｌｙ（Ａ）テールを安定してクローニングするためには、摂氏３７度より低い低温条件が有利であることが確認された。
【実施例2】
【0081】
温度条件の探索：一般菌株を用いた形質転換及び配列の確認
ｐｏｌｙ（Ａ）テールを安定して保持することのできる温度範囲を探索するために、様々な温度条件にてｐｏｌｙ（Ａ）テールを含むプラスミドＤＮＡを形質転換して液体培養を行い、それらの塩基配列を分析してｐｏｌｙ（Ａ）テールが保持されることを確認した。
ｐｏｌｙ（Ａ）テールを安定して保持することのできる温度範囲を探索するために、様々な温度条件にてｐｏｌｙ（Ａ）テールを含むプラスミドＤＮＡを形質転換して液体培養を行い、それらの塩基配列を分析してｐｏｌｙ（Ａ）テールが保持されることを確認した。
【0082】
形質転換（ＤＨ５α）
前述した方法（比較例１）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）テールの長さが１２４個であるプラスミドＤＮＡを作製し、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）に形質転換した。大腸菌にプラスミドＤＮＡを入れ、氷上で３０分間静置し、その後摂氏４２度で４０秒間熱ショックを与えた。その後、氷上で２分間冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度、３４度、３２度、３１度、２８度、２５度、２２度、１９度でそれぞれ１時間培養して回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地は、大腸菌を回復させた温度と同じ温度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
前述した方法（比較例１）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）テールの長さが１２４個であるプラスミドＤＮＡを作製し、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ， ＣＰ０１０）に形質転換した。大腸菌にプラスミドＤＮＡを入れ、氷上で３０分間静置し、その後摂氏４２度で４０秒間熱ショックを与えた。その後、氷上で２分間冷却し、次いでＳＯＣ培地を添加して摂氏３７度、３４度、３２度、３１度、２８度、２５度、２２度、１９度でそれぞれ１時間培養して回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地は、大腸菌を回復させた温度と同じ温度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
【0083】
Ｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さの確認
塩基配列分析のためのプラスミドを分離するために、固形培地に生成されたコロニーを２４個又は２５個ずつ選択し、固形培地を培養した温度と同じ温度で液体培養した。液体培養後に、プラスミドを分離し、ｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さ及び塩基配列をサンガーシーケンシングにより分析した。塩基配列分析にはＡｔａｉｌ－ｓｅｑ－Ｒ（配列番号６）プライマーを用いた。
塩基配列分析のためのプラスミドを分離するために、固形培地に生成されたコロニーを２４個又は２５個ずつ選択し、固形培地を培養した温度と同じ温度で液体培養した。液体培養後に、プラスミドを分離し、ｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さ及び塩基配列をサンガーシーケンシングにより分析した。塩基配列分析にはＡｔａｉｌ－ｓｅｑ－Ｒ（配列番号６）プライマーを用いた。
【0084】
塩基配列分析の結果、摂氏３７度ではｐｏｌｙ（Ａ）配列が保持されず、摂氏３１度以下で培養するとｐｏｌｙ（Ａ）の長さの安定性が大幅に向上することが確認された。よって、ｐｏｌｙ（Ａ）配列の安定性は、大腸菌培養温度が低くなるにつれて向上することが確認された。
【0085】
サンガーシーケンシングによる塩基配列分析の際に、１つの配列が長く繰り返される鋳型を分析すると、ポリメラーゼのスリップ現象により、分析結果においてヌクレオチドが１つ抜けるか、１つ加えられることがある（非特許文献４）。よって、挿入したｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さにおける誤差範囲が１個以内であるＡ１２４±１の割合を指標とした。その結果を表１及び図４に示す。
【0086】
【表1-1】
【0087】
【表1-2】
【0088】
表１及び図４に示すように、ポリＡテール（ｐｏｌｙ（Ａ） ｔａｉｌ）をコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された細胞株を３１℃以下の温度条件にて培養した場合に、Ａ１２４±１の割合が２１．７～５５．０％であったので、プラスミドにおいてポリＡテールが安定して保持されていることが分かる。しかし、１６℃未満の温度条件では大腸菌の生長がほとんど起こらないので（非特許文献１）、１６℃未満の温度条件は大量のワクチン製品生産工程に適用することができない。１６℃未満の温度条件を工程に適用することができないことは、後述する実施例５においても再度確認される。
【実施例3】
【0089】
継代培養時の安定性：不安定な断片を保持するのに特化された菌株を用いた形質転換及び継代培養
低温条件での連続した継代培養の際にｐｏｌｙ（Ａ）配列が正常に保持されるか否かを確認するために、不安定な断片を保持するのに特化された菌株の１つであるＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ菌株を用いて摂氏３７度及び摂氏２５度で形質転換及び継代培養を行った。
低温条件での連続した継代培養の際にｐｏｌｙ（Ａ）配列が正常に保持されるか否かを確認するために、不安定な断片を保持するのに特化された菌株の１つであるＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ菌株を用いて摂氏３７度及び摂氏２５度で形質転換及び継代培養を行った。
【0090】
形質転換（ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ）
実施例２において用いたプラスミドＤＮＡを大腸菌ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ（ＮＥＢ， Ｃ３０４０Ｈ）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌にプラスミドＤＮＡを入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で４０秒間熱ショックを与えた。その後、５分間氷上で冷却し、次いでＮＥＢ １０－ｂｅｔａ／Ｓｔａｂｌｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ培地を添加して摂氏３７度又は２５度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地は、大腸菌を回復させた温度と同じ温度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
実施例２において用いたプラスミドＤＮＡを大腸菌ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ（ＮＥＢ， Ｃ３０４０Ｈ）に形質転換した。氷上で形質転換用大腸菌にプラスミドＤＮＡを入れて３０分間静置し、その後摂氏４２度で４０秒間熱ショックを与えた。その後、５分間氷上で冷却し、次いでＮＥＢ １０－ｂｅｔａ／Ｓｔａｂｌｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ培地を添加して摂氏３７度又は２５度で１時間回復させ、次いで抗生剤選択固形培地に大腸菌を塗抹した。大腸菌を塗抹した培地は、大腸菌を回復させた温度と同じ温度で培養し、コロニーが生成されるようにした。
【0091】
形質転換後のｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さの確認
各温度での形質転換後に生成されたコロニーから２５個を選択し、固体培養した温度と同じ温度で液体培養した。プラスミドを分離し、サンガーシーケンシングによりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さを分析した。塩基配列分析には３ＵＴＲ－Ｘｂａ１－Ｆ（配列番号７）プライマーを用いた。前述した実施例２における、通常用いられるＤＨ５αにおいて得られた結果に比べて、摂氏３７度での形質転換時にｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが１２０個以上保持されたコロニーの割合が比較的高いことが確認された。不安定な断片を保持するのに特化された菌株を用いることにより、これらの結果が生じたものと考えられる。
各温度での形質転換後に生成されたコロニーから２５個を選択し、固体培養した温度と同じ温度で液体培養した。プラスミドを分離し、サンガーシーケンシングによりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さを分析した。塩基配列分析には３ＵＴＲ－Ｘｂａ１－Ｆ（配列番号７）プライマーを用いた。前述した実施例２における、通常用いられるＤＨ５αにおいて得られた結果に比べて、摂氏３７度での形質転換時にｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが１２０個以上保持されたコロニーの割合が比較的高いことが確認された。不安定な断片を保持するのに特化された菌株を用いることにより、これらの結果が生じたものと考えられる。
【0092】
しかし、Ａ１２４±１の割合から確認できるように、形質転換に用いたプラスミドが本来有していた１２４個のｐｏｌｙ（Ａ）に近接して保持されたコロニーは、摂氏２５度に比べて、摂氏３７度では非常に低いので、菌株に関係なく、ｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さ保持に低温が有利であることが再度確認された。
【0093】
【表2】
【0094】
継代培養
前述した形質転換後の塩基配列分析によりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが確認されたコロニーから、摂氏３７度では６個、摂氏２５度では９個を選択した。選択したコロニーの培養液を新たな液体培地に１／１０００の体積で接種し、その後同じ温度で継代培養を行った。摂氏３７度では２回の継代培養、摂氏２５度では３回の継代培養を経た。
前述した形質転換後の塩基配列分析によりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが確認されたコロニーから、摂氏３７度では６個、摂氏２５度では９個を選択した。選択したコロニーの培養液を新たな液体培地に１／１０００の体積で接種し、その後同じ温度で継代培養を行った。摂氏３７度では２回の継代培養、摂氏２５度では３回の継代培養を経た。
【0095】
継代培養によるｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さの確認
継代培養中の一部の培養液からプラスミドを分離し、サンガーシーケンシングによりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さを分析した。塩基配列分析には３ＵＴＲ－Ｘｂａ１－Ｆ（配列番号７）プライマーを用いた。
継代培養中の一部の培養液からプラスミドを分離し、サンガーシーケンシングによりｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さを分析した。塩基配列分析には３ＵＴＲ－Ｘｂａ１－Ｆ（配列番号７）プライマーを用いた。
【0096】
摂氏３７度で継代培養を行った結果、ほとんどのコロニーにおいてｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが保持されないことが確認された（表３）。それに対して、摂氏２５度で継代培養を行うと、全てのコロニーのｐｏｌｙ（Ａ）配列の長さが保持されることが確認された（表４）。
【0097】
【表3】
【0098】
【表4】
【0099】
よって、継代培養の際に３１℃以下の温度で培養することがプラスミドのｐｏｌｙ（Ａ）配列の保持に適した条件であることが確認された。
【実施例4】
【0100】
細胞株のストック作製後の安定性の確認
形質転換により作製した細胞株の保管容易性を確認するために、前述した実施例３において２５度の条件でＡの長さが１２４個であることが確認された形質転換細胞株をグリセロールストック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｔｏｃｋ）の形態にし、－７０℃の冷凍庫に保管した。冷凍状態で保管していたストックを取り出し、各試験管において１６度、２５度、３０度の条件で液体培養し、その後各プラスミドを分離して配列分析を行った。培養した大腸菌から分離したプラスミドから分析されたＡの長さは全て１２４個であったので、ストック作製後の培養時にＡの長さが完全に保持されることが確認された。
形質転換により作製した細胞株の保管容易性を確認するために、前述した実施例３において２５度の条件でＡの長さが１２４個であることが確認された形質転換細胞株をグリセロールストック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｔｏｃｋ）の形態にし、－７０℃の冷凍庫に保管した。冷凍状態で保管していたストックを取り出し、各試験管において１６度、２５度、３０度の条件で液体培養し、その後各プラスミドを分離して配列分析を行った。培養した大腸菌から分離したプラスミドから分析されたＡの長さは全て１２４個であったので、ストック作製後の培養時にＡの長さが完全に保持されることが確認された。
【0101】
【表5】
【実施例5】
【0102】
各温度における培養曲線の確認
１６度未満の条件での培養は工程適用に適切でないことを確認するために、次の実験を行った。
１６度未満の条件での培養は工程適用に適切でないことを確認するために、次の実験を行った。
【0103】
実施例２及び３において２５度の条件でＡの長さが１２４個であることが確認された形質転換細胞株ＤＨ５α及びＮＥＢ ｓｔａｂｌｅをそれぞれグリセロールストック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｔｏｃｋ）の形態にし、－７０℃の冷凍庫に保管した。各温度における培養曲線を確認するために、ストックを取り出し、１３度、１６度、１９度、２２度、２５度の条件にて２００ｒｐｍで４８時間培養しながら、所定の時間にＯＤ６００を測定した。実験の結果、１６度未満である１３度では細胞の成長がほとんどないことが確認された（図５）。
【0104】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0105】
（配列表）
【0106】
【化1】
【0107】
【化2】
【0108】
【化3】
【0109】
【化4】
【0110】
【化5】
【0111】
【化6】
【0112】
【化7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0108】
【化3-1】
【化3-2】
【国際調査報告】