▶ ドラコターピン バイオメディスン エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】ヒトインターロイキン－２変異体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/55 20060101AFI20240723BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240723BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240723BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240723BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240723BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240723BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240723BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240723BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240723BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240723BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240723BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240723BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240723BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240723BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240723BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240723BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240723BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
C07K14/55 ZNA
C07K19/00
C12N15/26
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/20
A61K47/60
A61K47/64
A61K47/54
A61K39/395 Y
A61P35/00
A61P35/04
A61P37/02
A61P3/10
A61P19/02
A61P11/06
A61P17/00
A61P37/06
A61P25/00
C07K16/30
C12N15/13
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577980
(86)(22)【出願日】2022-07-14
(85)【翻訳文提出日】2024-02-06
(86)【国際出願番号】 CN2022105789
(87)【国際公開番号】W WO2023005680
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】202110868409.5
(32)【優先日】2021-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202210621425.9
(32)【優先日】2022-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524217768
【氏名又は名称】ドラコターピン バイオメディスン エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100195556
【弁理士】
【氏名又は名称】柿沼 公二
(72)【発明者】
【氏名】ドン ミンフイ
(72)【発明者】
【氏名】ルー ヨンタオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC07
4C076CC15
4C076CC21
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD66
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084BA34
4C084BA37
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA14
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZA02
4C084ZA61
4C084ZA96
4C084ZB07
4C084ZB08
4C084ZB15
4C084ZB26
4C084ZC35
4C085AA14
4C085AA25
4C085BB11
4C085DD62
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA53
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA04
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ヒトインターロイキン－２変異体およびその使用が提供される。具体的には、高親和性受容体ＩＬ－２Ｒα／β／γとの親和性が消失または低下し、中親和性受容体ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性が維持されている、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）が提供される。また、ＩＬ－２変異体およびヒト抗体フラグメントを含む組換えタンパク質／融合タンパク質も提供される。ＩＬ－２変異体の活性は向上しており、野生型ヒトＩＬ－２の活性に近くなる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
成熟野生型ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）と比較してアミノ酸変異を含むヒトＩＬ－２変異体であって、前記変異は、置換、欠失および付加の少なくとも１つであり、好ましくは、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるとおりであり、前記変異は、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３１～４５位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３５～４１位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２または１４に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３５～４３位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３１～３２位におけるアミノ酸残基のＧＧへの変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の４３～４５位におけるアミノ酸残基のＧへの変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の１２５位におけるアミノ酸残基のＡへの変異、
任意選択で、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２のＮ末端におけるＭの付加
からなる群から選択される、ＩＬ－２変異体。
【請求項2】
前記ＩＬ－２変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、
Ｎ末端にＭが付加されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１０、およびＮ末端にＭが付加されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、
からなる群から選択される配列で示されるとおりである、請求項１に記載のＩＬ－２変異体。
【請求項3】
前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有し、および／または、前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβとの変化していないかまたは増加した親和性を有し、および／または、
前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒγとの変化していないかまたは増加した親和性を有し、
好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒα／β／γとの低下した親和性を有し、およびＩＬ－２Ｒβ／γとのＩＬ－２変異体の親和性は、維持されるか増加する、
請求項１または２に記載のＩＬ－２変異体。
【請求項4】
ＰＥＧ化、グリコシル化、アルブミンへの接合、Ｆｃへの接合、ヒドロキシエチル化、脱Ｏ－グリコシル化、からなる群から選択される修飾を有し、
好ましくは、前記Ｆｃへの接合は、請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体のＣ末端へのヒトＩｇＧ１ Ｆｃの接合を指し、
前記ＰＥＧ化は、ＩＬ－２変異体のＮ末端でのＰＥＧの結合を指し、
好ましくは、前記ＰＥＧは、５ｋＤ～８０ｋＤの分子量を有し、
より好ましくは、前記ＰＥＧは、１０ｋＤ～２０ｋＤの分子量を有し、
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体を含む、ＩＬ－２変異体の誘導体。
【請求項5】
第１の成分と、第２の成分と、
を含む接合体であって、
前記第１の成分は、前記第２の成分に、直接的に接合するかまたはリンカーを介して間接的に接合し、
前記第１の成分は、請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ-２変異体、または請求項４に記載のＩＬ-２変異体の誘導体であり、
好ましくは、前記第２の成分は、抗体またはその抗原結合断片であり、
より好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍抗原を標的とする、
接合体。
【請求項6】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ-２変異体、または請求項４に記載のＩＬ-２変異体の誘導体、または請求項５に記載の接合体、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤
を含有する、医薬組成物。
【請求項7】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ-２変異体、請求項４に記載のＩＬ-２変異体の誘導体、または請求項５に記載の接合体をコードする核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを含むこと、請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ-２変異体を発現すること、
請求項４に記載のＩＬ-２変異体の誘導体を発現すること、
請求項５に記載の接合体を発現すること、
のいずれかを含むまたは発現する、宿主細胞であって、
好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり、
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞からなる群から選択され、
最も好ましくは、前記宿主細胞は、サッカロミケス・セレビシエ細胞または大腸菌細胞である、
宿主細胞。
【請求項10】
薬剤の調製における、請求項１から３のいずれか一項に記載のＩＬ-２変異体、請求項４に記載のＩＬ-２変異体の誘導体、請求項５に記載の接合体から選択されるいずれかの使用であって、前記薬剤は、増殖性疾患、増殖性疾患の転移、免疫疾患からなる群から選択される疾患を予防または治療するためのものであり、
好ましくは、前記増殖性疾患は、腫瘍または癌であり、
好ましくは、前記免疫疾患は、糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、湿疹、喘息、自己免疫疾患および臓器移植後の自己免疫反応からなる群から選択され、
好ましくは、前記腫瘍または癌は、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、パピローマウイルスによる癌、腺癌、黒色腫、肉腫、奇形腫、肺癌、転移性肺癌、リンパ腫および転移性腎細胞癌腫からなる群から選択される、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年７月３０日に出願された特許出願（出願番号２０２１１０８６８４０９５）および２０２２年６月１日に出願された特許出願（２０２２１０６２１４２５９）の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、１つ以上のアミノ酸変異を有するヒトインターロイキン-２（ＩＬ-２）変異体（ｖａｒｉａｎｔ）またはその誘導体に関する。ＩＬ－２変異体またはその誘導体は、高親和性受容体（ＩＬ－２Ｒα／β／γ）との消失または低下した親和性を有し、中親和性受容体（ＩＬ－２Ｒβ／γ）との親和性を維持する。本開示はまた、ヒトＩＬ－２変異体、コードポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、を含む免疫接合体、それらの調製方法、治療方法および使用に関する。
【技術背景】
【0003】
ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）としても知られる。ＩＬ－２遺伝子は、第４染色体（４ｑ２７）上に位置し、合計約７ｋｂの配列を含む。ＩＬ－２は、約１３３個のアミノ酸から構成され、約１５ｋＤの分子量を有する。Ｄｏｒｉｓ Ｍｏｒｇａｎら、１９７６年および１９７７年は、活性化されたＴ細胞の培養液がＴ細胞の増殖を促進し得ることをそれぞれ発見した。培養液中の刺激因子は精製され、ＩＬ－２と同定された。
【0004】
第１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞実験では、Ｔ細胞がＴＣＲおよびＣＤ２８によって活性化された後、ＩＬ－２を分泌し、細胞表面にＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を発現し得ることが示された。ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒへの結合は、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞への影響を引き起こし得る。ＩＬ－２は、Ｔ細胞免疫応答において中心的な役割を果たす分子である。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＩＬ－２またはその受容体をノックアウトした後、動物は自己免疫を発症することが判明した。ＩＬ－２はエフェクター細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞など）だけでなく制御性Ｔ細胞も活性化し、それによって自己に対する過剰な免疫を抑制する。
【0005】
ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒを通じて作用する。ＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２Ｒα（つまりＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（つまりＣＤ１２２）、およびＩＬ－２Ｒγ（つまりＣＤ１３２）の３つのサブユニットからなる。３つのサブユニットは、３つの形態の受容体を形成し得、高親和性受容体は、すべての３つのサブユニットのＩＬ－２Ｒα／β／γを備え、中親和性受容体は、ＩＬ－２Ｒβ／γを備え、低親和性受容体は、ＩＬ－２Ｒαを備える。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγは、ＩＬ－２による下流シグナル伝達経路の活性化に必要である。ＩＬ－２がＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγに同時に結合するとき、２つの受容体サブユニットは、ヘテロ二量体を形成して細胞内ＳＴＡＴ５をリン酸化し、これは、核に入り、それによって対応する遺伝子の転写および発現を引き起こす。ＩＬ－２Ｒαは、シグナル伝達には必要ないが、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγへのＩＬ－２の結合を促進し得る。
【0006】
ＩＬ－２Ｒγは、すべての免疫細胞で発現される。ＩＬ－２Ｒβは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞で発現し、発現レベルは、Ｔ細胞の活性化後に増加する。ＩＬ－２Ｒαは、制御性Ｔ細胞で持続的に高発現し、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞で一時的に発現し、その後発現レベルが下方制御される。
【0007】
ＩＬ－２は、主に活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって合成される。Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生と末梢血リンパ球の細胞傷害性細胞とリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞によるサイトカインおよび細胞溶解性分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖および分化、およびＢ細胞による免疫グロブリン合成を促進し、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生、増殖、活性化を刺激する。ｉｎ ｖｉｖｏでリンパ球集団を拡大しこれらの細胞のエフェクター機能を向上するＩＬ－２の能力は、その抗腫瘍効果につながり、ＩＬ－２免疫療法は、特定の転移性癌患者に対する治療選択肢となる。現在、高用量のＩＬ－２は、転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の治療に承認されている。
【0008】
国際公開第２００９／１３５６１５号に開示されるＩＬ－２変異体は、２０位、８８位、または１２６位に変異を有する。国際公開第２０１２／０６２２２８号に開示されるＩＬ－２変異体は、３８位、４２位、４５位、６２位、６８位、または８８位の少なくとも１つに変異を有する。米国特許第８９０６３５６号明細書に開示されるＩＬ－２変異体は、９１位および１２６位に変異を有する。米国特許第９７３２１３４号明細書に開示されるＩＬ－２変異体は、１５位、１６位、２２位、８４位、８８位または９５位の少なくとも１つに変異を有する。米国特許７８０３３６１号明細書および米国特許８１２４０６６号明細書に開示されるＩＬ－２変異体は、変異Ｒ３８Ｗを含む。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、１つ以上のアミノ酸変異を有するＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、その接合体に関し、さらにはＩＬ－２変異体の使用および調製方法にも関する。
【0010】
（ＩＬ－２変異体またはその誘導体）
第１の態様では、本開示は、成熟野生型ヒトＩＬ-２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と比較して１つ以上のアミノ酸変異を含むＩＬ-２変異体（またはその誘導体）を提供する。
第１の態様では、本開示は、成熟野生型ヒトＩＬ-２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と比較して１つ以上のアミノ酸変異を含むＩＬ-２変異体（またはその誘導体）を提供する。
【0011】
「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」は、任意の哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類、およびマウスおよびラットなどの齧歯動物に由来する任意の天然のＩＬ－２を指す。この用語には、未処理のＩＬ－２と細胞由来の任意の処理型ＩＬ－２との両方が含まれる。この用語には、天然に存在するＩＬ－２変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も含まれる。
【0012】
「野生型ヒトＩＬ－２」は、ＩＬ－２変異体の各アミノ酸位置に野生型ＩＬ－２型のアミノ酸を有することを除いて、ＩＬ－２変異体と同一である。「野生型」という用語は、ＩＬ－２受容体への結合能力に影響を与えない、１つ以上の天然に存在するアミノ酸変異を含むことを包含することを意図する。
【0013】
「成熟野生型ヒトＩＬ－２」とは、野生型ヒトＩＬ－２の成熟型を指す。未処理のヒトＩＬ－２はさらに、成熟ＩＬ－２分子には存在しない、約２０アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを含む。成熟野生型ヒトＩＬ－２の例示的なアミノ酸配列は、例えば、ＩＮＳＤＣデータベースの受託番号ＣＡＡ２５７４２．１、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔのＰ６０５６８．１、およびＧｅｎｂａｎｋのＮＰ＿０００５７７．２のセグメント２１－１５３であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成熟野生型ヒトＩＬ-２は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるアミノ酸配列である。組換え発現の目的については、Ｎ末端に追加のメチオニンＭが必要であることに留意されたい。しかしながら、当業者は、第１の位置にＭを有する配列または有しない配列はすべて、本出願における「成熟野生型ヒトＩＬ－２」の範囲内に含まれることを理解されたい。
【0014】
いくつかの実施形態では、本出願で実施されるアミノ酸変異は、成熟野生型ヒトＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒαに結合するＩＬ－２上の領域（アミノ酸の約２６～約４７の位置）の長さが短くなる結果となる。
【0015】
いくつかの実施形態では、アミノ酸変異には、置換、欠失（または切断）、挿入（または付加）、修飾、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、ＩＬ－２の結合特性を変更するには、１つのアミノ酸（例えば、異なる構造および／または化学的特性を有するアミノ酸）を使用して、別のアミノ酸を置き換え得る。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸および２０種類の標準アミノ酸が含まれる。アミノ酸変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成、化学修飾などを含む当技術分野で知られている方法を使用して生成され得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有し、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγとの未変化または増加した親和性を有する。
【0017】
「親和性」とは、分子の結合部位とそのリガンドとの間の非共有結合性相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書における「親和性」は、結合対の要素、例えば受容体とリガンド間の１：１での相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は通常、解離と結合速度定数との比である、解離定数（ＫＤ）として表され得る（それぞれＫ解離とＫ結合）。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野の一般的な方法によって測定され得る。
【0018】
いくつかの実施形態では、本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、高親和性受容体（ＩＬ－２Ｒα／β／γ）との低下した親和性を有するが、中親和性受容体（ＩＬ－２Ｒβ／γ）との親和性を維持するまたは増加させる。
【0019】
いくつかの実施形態では、「高親和性ＩＬ－２受容体」は、受容体γサブユニット（サイトカイン受容体共通サブユニットγ、γｃ、またはＣＤ１３２としても知られる）、受容体βサブユニット（ＣＤ１２２またはｐ７０としても知られる）、および受容体αサブユニット（ＣＤ２５またはｐ５５としても知られる）からなるヘテロ三量体形態のＩＬ－２受容体を指す。
【0020】
いくつかの実施形態では、「中親和性ＩＬ-２受容体」は、γおよびβサブユニットのみを含み、αサブユニットを含まないＩＬ-２受容体を指す（ＯｌｅｊｎｉｃｚａｋおよびＫａｓｐｒｚａｋ、ＭｅｄＳｃｉ Ｍｏｎｉｔ１４、ＲＡ１７９～１８９、２００８を参照）。
【0021】
いくつかの実施形態では、本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、低下した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化、および／または影響を受けない、もしくは増加した免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の活性化を有する。
【0022】
本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、
３１位におけるチロシン（Ｙ）、３２位におけるリジン（Ｋ）、３３位におけるアスパラギン（Ｎ）、
３４位におけるプロリン（Ｐ）、３５位におけるリジン（Ｋ）、３６位におけるロイシン（Ｌ）、
３７位におけるスレオニン（Ｔ）、３８位におけるアルギニン（Ｒ）、３９位におけるメチオニン（Ｍ）、
４０位におけるロイシン（Ｌ）、４１位におけるスレオニン（Ｔ）、４２位におけるフェニルアラニン（Ｆ）、
４３位におけるリジン（Ｋ）、４４位におけるフェニルアラニン（Ｆ）の変異、４５位におけるチロシン（Ｙ）、
１２５位におけるシステイン（Ｃ）、
の位置（連続または不連続）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１位から数えて）のいずれか１つ以上で発生する。
３１位におけるチロシン（Ｙ）、３２位におけるリジン（Ｋ）、３３位におけるアスパラギン（Ｎ）、
３４位におけるプロリン（Ｐ）、３５位におけるリジン（Ｋ）、３６位におけるロイシン（Ｌ）、
３７位におけるスレオニン（Ｔ）、３８位におけるアルギニン（Ｒ）、３９位におけるメチオニン（Ｍ）、
４０位におけるロイシン（Ｌ）、４１位におけるスレオニン（Ｔ）、４２位におけるフェニルアラニン（Ｆ）、
４３位におけるリジン（Ｋ）、４４位におけるフェニルアラニン（Ｆ）の変異、４５位におけるチロシン（Ｙ）、
１２５位におけるシステイン（Ｃ）、
の位置（連続または不連続）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１位から数えて）のいずれか１つ以上で発生する。
【0023】
本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３１～３２位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0024】
本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３５～４１位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0025】
本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、４３～４５位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0026】
本開示によるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３１～４５位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0027】
本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３１～３２位、３５～４１位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0028】
本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３５～４１位、４３～４５位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0029】
本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）のいくつかの実施形態では、変異は、３１～４３位および１２５位（連続または不連続）のいずれか１つ以上で生じる。
【0030】
いくつかの他の実施形態では、公的データベースまたは既知の文献に記載されている天然配列が野生型成熟ＩＬ－２として使用されるとき、アミノ酸変異の位置は、１位のアミノ酸Ａから数えられる。
【0031】
いくつかの特定の実施形態では、
Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｍｅｔ-Ｈｉｓ-Ｇｌｙ-Ｌｅｕ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）に変異した３１～４５位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙ－Ｇｌｙに変異した３１～３２位におけるアミノ酸、
Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２）に変異した３５～４１位におけるアミノ酸、
Ｍｅｔ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）に変異した３５～４３位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）に変異した３５～４１位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙに変異した４３～４５位におけるアミノ酸、
Ａｌａに変異した１２５位におけるアミノ酸、
の変異のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含むＩＬ－２変異体が提供される。
Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｍｅｔ-Ｈｉｓ-Ｇｌｙ-Ｌｅｕ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）に変異した３１～４５位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙ－Ｇｌｙに変異した３１～３２位におけるアミノ酸、
Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２）に変異した３５～４１位におけるアミノ酸、
Ｍｅｔ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）に変異した３５～４３位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）に変異した３５～４１位におけるアミノ酸、
Ｇｌｙに変異した４３～４５位におけるアミノ酸、
Ａｌａに変異した１２５位におけるアミノ酸、
の変異のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含むＩＬ－２変異体が提供される。
【0032】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、および３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、および４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、１２５位におけるＣのＡへの変異、または、
（２）３１～４５位におけるアミノ酸のＧＧＮＰＭＨＧＬＤＧＦＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
からなる群から選択され、
変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２または１５である、
変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、および３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、および４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、１２５位におけるＣのＡへの変異、または、
（２）３１～４５位におけるアミノ酸のＧＧＮＰＭＨＧＬＤＧＦＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
からなる群から選択され、
変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２または１５である、
変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0033】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0034】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0035】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0036】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、
（２）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、
（２）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0037】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
（１）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、
（２）４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
（１）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異、
（２）４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0038】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、
（２）４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
（１）３１～３２位におけるＹＫのＧＧへの変異、
（２）４３～４５位におけるＫＦＹのＧへの変異、
（３）１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異、
であり、変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0039】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
３５～４３位におけるＫＬＴＲＭＬＴＦＫのＭＧＧＬＧＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
３５～４３位におけるＫＬＴＲＭＬＴＦＫのＭＧＧＬＧＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0040】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体が、
３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＧＧＧＧＧＧへの変異、４３～４５位におけるアミノ酸のＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＧＧＧＧＧＧへの変異、４３～４５位におけるアミノ酸のＧへの変異、および１２５位におけるアミノ酸のＡへの変異であり、変異配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０である、
からなる群から選択される変異を含むとき、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を維持または増加させながら、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有する。
【0041】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１０から選択される。
【0042】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0043】
天然に発現されるヒトＩＬ－２は、合計１５３個のアミノ酸を有し、１～２０位のアミノ酸はシグナルペプチドである。これは、シグナルペプチドの切断後に合計１３３個のアミノ酸（すなわち、成熟ヒトＩＬ-２）を有し、本開示におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１～１３３位に対応する。組換え発現を目的として、人工的に生成されたＩＬ－２は、第１の位置（開始コドンＡＵＧに対応）に追加のメチオニンを有する。
【0044】
【0045】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体は、単量体形態である。
【0046】
第２の態様では、本開示は、ＰＥＧ化、グリコシル化、アルブミンへの接合、Ｆｃへの接合、ヒドロキシエチル化、脱Ｏ－グリコシル化からなる群から選択される修飾を有する本開示のＩＬ－２変異体を含むＩＬ－２変異体の誘導体を提供する。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体の誘導体には、本開示のＩＬ－２変異体の全長もしくは一部、あるいは本開示のＩＬ－２変異体に基づいてさらに得られるその機能的誘導体、機能的断片、生理活性ペプチド、融合タンパク質、アイソフォームもしくはそれらの塩、例えば、ＩＬ－２変異体、ＩＬ－２変異体の二量体、三量体、または多量体を含む融合タンパク質が含まれる。ＩＬ－２変異体の様々な修飾型（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、アルブミンへの接合、Ｆｃへの接合、ヒドロキシエチル化、脱Ｏ－グリコシル化などの後）。
【0048】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体の誘導体は、ＰＥＧ化される（ＰＥＧ－ＩＬ－２として表現され得る）。
【0049】
いくつかの他の実施形態では、ＰＥＧ-ＩＬ-２変異体は、メトキシ-ＰＥＧ-アルデヒド（ｍＰＥＧ-ＡＬＤ）リンカーを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は、約５ｋＤ～約５０ｋＤ、特に５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｋＤ、または約５ｋＤ～約４０ｋＤ、または約１０ｋＤ～約３０ｋＤ、または約１０ｋＤから約３０ｋＤの間、または約１５ｋＤから約３０ｋＤの間、約２０ｋＤである。
【0050】
ある特定の実施形態では、ｍＰＥＧ-ＡＬＤリンカーは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａおよび約２０ｋＤａからなる群から選択される平均分子量を有するＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｍＰＥＧ-ＡＬＤのアルデヒド基は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、またはブチルアルデヒドなどであり得る。
【0051】
一実施形態では、ＩＬ－２変異体の誘導体は、成熟野生型ヒトＩＬ－２と比較して長い血清半減期を有する。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体の誘導体は、抗体またはその抗原結合断片に接合したＩＬ－２変異体である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体の誘導体は、ヒト抗体のＦｃ断片に接合したＩＬ－２変異体である。特定の実施形態では、ＩＬ-２変異体の誘導体は、そのＣ末端でヒト抗体のＦｃ断片に接合したＩＬ-２変異体である（すなわち、本出願によるＩＬ-２変異体は、ヒト抗体のＦｃ断片のＮ末端に接合している）。
【0053】
場合によっては、ＩＬ－２変異体の誘導体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかの二量体形態である。一例として、ヘテロ二量体化を促進するために、Ｆｃフラグメントに修飾が導入される。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）構造を含み、これは、第１のＦｃフラグメントの界面にノブ構造を導入することおよび第２のＦｃフラグメントの界面にホール構造を導入すること、ならびにその逆を含む。これによって、ノブ構造がホール構造内に局在化することが可能になり、ヘテロ二量体の形成が促進され、ホモ二量体の形成が抑制される。ノブ構造は、第１のＦｃフラグメントの界面からの小さなアミノ酸側鎖をチロシンまたはトリプトファンなどのより大きな側鎖に置き換えることによって構築されるが、一方、細孔構造は大きなアミノ酸側鎖を第２のＦｃフラグメントの界面にあるアラニンまたはスレオニンなどのより小さなアミノ酸側鎖に置き換えることによって構築される。
【0054】
（接合体）
第３の態様では、本開示は、第１の成分と第２の成分とを含む接合体を提供し、第１の成分は、第２の成分に直接的に接合している（またはリンカーを介して間接的に接合している）。第１の成分は、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）であり、第２の成分は、ＩＬ－２またはＩＬ－２変異体（またはその誘導体）ではない。
第３の態様では、本開示は、第１の成分と第２の成分とを含む接合体を提供し、第１の成分は、第２の成分に直接的に接合している（またはリンカーを介して間接的に接合している）。第１の成分は、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）であり、第２の成分は、ＩＬ－２またはＩＬ－２変異体（またはその誘導体）ではない。
【0055】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、少なくとも１つの第２の成分に結合される。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）および第２の成分は、ペプチド結合を介して融合タンパク質を形成する。
【0057】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、第２の成分のカルボキシル末端に結合される（またはリンカーを介して間接的に結合される）。
【0058】
いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、第２の成分のアミノ末端に接合される（またはリンカーを介して間接的に接合される）。
【0059】
いくつかの実施形態では、第２の成分は、抗原結合成分である。抗原結合成分とは、エピトープに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。
【0060】
いくつかの実施形態では、抗原結合成分は、それに接続された部分（例えば、本開示のＩＬ－２、その変異体または誘導体）を標的部位（例えば、腫瘍細胞または腫瘍）に導き得る。抗原結合成分は、抗体または抗原結合断片であり得る。
【0061】
抗体は、本明細書において最も広い意味で使用され、抗原結合活性を示す限り、様々な抗体構造が包含される。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）および抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体には、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびラクダ抗体が含まれ得る。
【0062】
いくつかの特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド複合体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ペプチボディ、ドメイン抗体、および多重特異性抗体（二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ）からなる群から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＩＬ-２変異体（またはその誘導体）は、２つ以上の抗原結合成分に接続される場合、各抗原結合成分は、抗体および抗原結合断片から独立して選択され得る。例えば、第１の抗原結合成分はＦａｂ分子であり得、第２の抗原結合成分はｓｃＦｖ分子であり得る。例えば、第１の抗原結合成分はｓｃＦｖ分子であり得るが、一方、第２の抗原結合成分もまた、ｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原結合成分は、独立して、異なる抗原または同じ抗原に対して向けられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は腫瘍抗原を標的とする。
【0064】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、例えば、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ-Ａ１、ＭＡＧＥ-Ａ２、ＭＡＧＥ-Ａ３、ＭＡＧＥ-Ａ４、ＭＡＧＥ-Ａ５、ＭＡＧＥ-Ａ６、ＭＡＧＥ-Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９）、ＭＡＲＴ－１／ Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、ＤＰＰＩＶ、ＡＤＡｂｐ、シクロフィリン、ＣＥＡ、ＣＡＰ－１、ＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、ＰＳＡ（ＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２およびＰＳＡ－３）、ＰＳＭＡ、Ｔ細胞受容体、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１、ＣＴ－７であるが、それらに限定されない。
【0065】
（医薬組成物）
第４の態様では、本開示は、本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）または接合体、および必要に応じて薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または注射用溶液であり得る。
第４の態様では、本開示は、本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）または接合体、および必要に応じて薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または注射用溶液であり得る。
【0066】
いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物の単位用量は、０．０１ｗｔ％～９９ｗｔ％のＩＬ-２変異体（またはその誘導体）または接合体を含有し得る。あるいは、医薬組成物の単位用量中に含有されるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）または接合体の量は、０．１～２０００ｍｇ（例えば、１～１０００ｍｇ；１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ｍｇ）である。
【0067】
（ポリヌクレオチド）
第５の態様では、本開示は、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
第５の態様では、本開示は、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0068】
当業者は、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が異なり得ることを理解されたい。異なる宿主におけるコドン縮重およびコドンバイアスによって、異なるヌクレオチド配列は、同じアミノ酸配列をコードし得、これらの配列はすべて本開示の範囲内に含まれる。
【0069】
（発現ベクター）
第６の態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、またはシャトル発現ベクターであり得る。
第６の態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、またはシャトル発現ベクターであり得る。
【0070】
（宿主細胞）
第７の態様では、本開示は、本開示による発現ベクターを含む、または本開示によるＩＬ-２変異体を発現する、または本開示による接合体を発現する、宿主細胞を提供する。
第７の態様では、本開示は、本開示による発現ベクターを含む、または本開示によるＩＬ-２変異体を発現する、または本開示による接合体を発現する、宿主細胞を提供する。
【0071】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む（例えば、形質転換またはトランスフェクトされる）。
【0072】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
【0073】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌、酵母、または哺乳動物の細胞、特にピキア・パストリスまたはサッカロミケス・セレビシエである。
【0074】
いくつかの特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物である。
【0075】
いくつかの特定の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。
【0076】
いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドを発現する植物細胞および昆虫細胞などの宿主細胞が使用される。脊椎動物細胞はまた、宿主細胞として、例えば、浮遊培養の哺乳類細胞株、サル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓細胞株（２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、ＶＥＲＯ－７６、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞株（ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、Ｓｐ２／０など）としても使用され得る。
【0077】
（使用および治療方法）
第８の態様では、本開示は、薬剤の製造における本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）、接合体および医薬組成物の使用を提供する。
第８の態様では、本開示は、薬剤の製造における本開示によるＩＬ-２変異体（またはその誘導体）、接合体および医薬組成物の使用を提供する。
【0078】
いくつかの実施形態では、増殖性疾患および免疫疾患の治療、Ｔ細胞媒介免疫応答の調節、および個体の免疫系の刺激におけるＩＬ－２変異体（またはその誘導体）の使用が提供される。
【0079】
いくつかの実施形態では、増殖性疾患は、腫瘍または癌（例えば、転移性腫瘍または癌）であり得るか、または固形腫瘍であり得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ-２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、宿主の免疫系を治療および刺激するために（特に、細胞性免疫応答を増強するために）使用され得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、細胞性免疫応答の増強には、Ｔ細胞機能の向上、Ｂ細胞機能の向上、リンパ球機能の回復、ＩＬ-２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ＩＬ-２受容体の活性の増加、ナチュラルキラー細胞またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0082】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、癌などの増殖性状態を治療するために使用される。癌の非限定的な例としては、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、腎臓癌が挙げられる。
【0083】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、泌尿生殖器系に位置する新生物を治療するために使用される。
【0084】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、前癌状態または癌転移を治療するために使用される。癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳癌および頭頸部癌からなる群から選択される。
【0085】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性状態、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球症を治療するために使用される。
【0086】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ-２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、自己免疫疾患、移植拒絶反応、外傷後免疫応答および感染症を治療するために使用される。
【0087】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、慢性胃炎、クローン病、バセドウ病、ベヒテレフ病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、ＡＰＥＣＥＤ、チャーグストラウス症候群、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、硬化性苔癬、全身性エリテマトーデス、ＰＡＮＤＡＳ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、白斑、自己免疫性腸症、グッドパスチャー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、自己免疫アレルギー、喘息からなる群から選択され得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２変異体（またはその誘導体）は、免疫抑制剤と組み合わせて使用され得る。
【0089】
いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、グルココルチコイド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＴＮＦ－α抗体、メトトレキサート、シクロスポリン、シロリムス、エベロリムス、フィンゴリモドおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。
【0090】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物が対象に投与される。
【0091】
いくつかの実施形態では、患者または個人などの、必要とされる対象は、通常、ヒトなどの哺乳動物である。
【0092】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、少なくとも１日２回、少なくとも１日１回、少なくとも４８時間毎に１回、少なくとも７２時間毎に１回、少なくとも１週間に１回、少なくとも２週間毎に１回、少なくとも１か月に１回、少なくとも２か月毎に１回、または少なくとも３か月毎に１回、対象に投与される。
【0093】
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ-２変異体（またはその誘導体）、接合体、または医薬組成物は、任意の経路を介して投与され、例えば、非経口注射（例えば、皮下注射または静脈内注射）によって投与される。
【図面の簡単な説明】
【0094】
【図1】野生型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－２変異体またはその誘導体とＩＬ－２Ｒα受容体との間の相互作用の曲線である。
【図2】野生型ヒトＩＬ－２、ＩＬ－２変異体またはその誘導体とＩＬ－２Ｒβ／γ受容体との間の相互作用の曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0095】
下記の実施例は本開示をさらに説明するために組み込まれるが、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものではない。
【0096】
（実施例１．野生型ヒトＩＬ－２およびＩＬ－２変異体またはその誘導体の組換え発現および調製）
ＩＬ－２変異体の核酸配列の合成、発現および精製。
ＩＬ－２変異体の核酸配列の合成、発現および精製。
【0097】
１．この例では、野生型ヒトＩＬ－２とＩＬ－２変異体（ＩＬ－２－１～ＩＬ－２－９）とを別々に発現させ、分子のＣ末端においてＨＰＣ４タグを使用して精製および調製した。ＩＬ－２－１０は、ＩＬ－２－１のＣ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列を付加した変異体であり、これは、次いで精製および調製された。
【0098】
全遺伝子を合成し、各タンパク質のコード配列を二重酵素消化によって発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。最終的な発現ベクターは、酵素消化および配列決定によってその精度が確認され、最終的にＤＨ５αクローン株にトランスフェクトされた。トランスフェクションに適したプラスミドをプラスミド抽出キットによって抽出し、一過性発現用のトランスフェクション試薬を使用して哺乳類ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、各タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【0099】
２．ＤＨ５αのプラスミド形質転換
コード配列を含有する発現プラスミド８０～１００ｎｇを、事前に調製したＤＨ５αコンピテント細胞にピペットで移した。コンピテントセルを、プラスミドの添加後に熱ショックによって形質転換した。
コード配列を含有する発現プラスミド８０～１００ｎｇを、事前に調製したＤＨ５αコンピテント細胞にピペットで移した。コンピテントセルを、プラスミドの添加後に熱ショックによって形質転換した。
【0100】
形質転換されたコンピテントセルをＬＢ液体培地に添加し、３７℃の振盪機に置き、２００ｒｐｍで約３０分間振盪培養した。培養したコンピテントセルをシェーカーから取り出し、懸濁液の一部をピペッティングしてアンピシリンを含むプレートに広げ、インキュベーターに入れて３７℃で一晩培養した。
【0101】
新鮮な培養プレートから単一クローンを選択し、２～５ｍＬのＬＢ培地中で３７℃、２００ｒｐｍで８時間培養した。培養物を１／５００の比率で２００ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した。培養菌懸濁液を収集し、遠心分離して上清を除去した。
【0102】
３．ＨＥＫ２９３細胞の解凍および継代
ウォーターバスを３７℃に設定して、培地を３７℃に予熱した。
ウォーターバスを３７℃に設定して、培地を３７℃に予熱した。
【0103】
ＨＥＫ２９３細胞を液体窒素タンクから取り出し、すぐに３７℃のウォーターバスに入れ穏やかに振って急速解凍した（約１分間）。
【0104】
チューブの外壁を７５％エタノールで滅菌し、チューブをバイオセーフティキャビネットに置いた。細胞を、１０ｍＬの培地を含有する１５ｍＬ遠心管に移し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、細胞を少量の新鮮な培地に再懸濁し、次いで培養フラスコに移した、新鮮な培地を加え、細胞を均一に分散させるためにフラスコを穏やかに振盪し、計数および生存率検出のために細胞サンプルを収集した。密度は３×１０５～４×１０５細胞／ｍＬに制御され、生存率は９５％超であった。
【0105】
細胞を３７℃、１１０ｒｐｍ、５％ＣＯ２のインキュベーター内に置いた。２．０×１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで２～３日間細胞培養した後、新鮮な培地を補充することによって細胞を継代した。細胞の密度および生存率をモニタリングした。
【0106】
４．ＨＥＫ２９３細胞のプラスミドトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３細胞を１×１０６細胞／ｍＬの接種密度で１Ｌの懸濁液中において培養し、インキュベーターに入れて３７℃、１１０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２で培養した。トランスフェクション当日、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬ～１．５×１０６細胞／ｍＬに制御した。
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３細胞を１×１０６細胞／ｍＬの接種密度で１Ｌの懸濁液中において培養し、インキュベーターに入れて３７℃、１１０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２で培養した。トランスフェクション当日、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬ～１．５×１０６細胞／ｍＬに制御した。
【0107】
ＤＮＡトランスフェクション試薬の混合物：ＤＮＡとトランスフェクション試薬をトランスフェクション緩衝液に加え、よく混合し、３７℃で培養した。ＤＮＡトランスフェクション試薬の混合物を、トランスフェクトされる細胞に加え、インキュベーターに置き、３７℃、１１０ ｒｐｍ、５％ ＣＯ２で培養した。トランスフェクションから約４～６日後、細胞培養物をインキュベーターから取り出し、遠心分離して上清と細胞とを収集した。
【0108】
５．タンパク質の精製
５日間培養した後の細胞培養液を収集して遠心分離し、上清を収集して０．２２μｍのフィルターで濾過した。サンプルを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の緩衝液を用いて４℃で透析した。透析後、ＨＰＣ４抗体を接合させた培地を使用したアフィニティー精製にサンプルを供し、さらにｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用したゲル濾過クロマトグラフィーに供してさらに精製し、高純度の目的タンパク質を得た。
５日間培養した後の細胞培養液を収集して遠心分離し、上清を収集して０．２２μｍのフィルターで濾過した。サンプルを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の緩衝液を用いて４℃で透析した。透析後、ＨＰＣ４抗体を接合させた培地を使用したアフィニティー精製にサンプルを供し、さらにｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用したゲル濾過クロマトグラフィーに供してさらに精製し、高純度の目的タンパク質を得た。
【0109】
（実施例２．野生型ヒトＩＬ－２およびＩＬ－２変異体またはその誘導体のＩＬ－２Ｒαとの親和性の決定）
実施例１で得られた野生型ヒトＩＬ－２およびそのＩＬ－２変異体または誘導体（ＩＬ－２－１～ＩＬ－２－１０）のＩＬ－２Ｒαに対する結合特性を、Ｏｃｔｅｔプラットフォームによって検出した。Ｏｃｔｅｔプラットフォームによって、生物層干渉法（ＢＬＩ）に基づいて生体分子間の相互作用を検出および分析した。
実施例１で得られた野生型ヒトＩＬ－２およびそのＩＬ－２変異体または誘導体（ＩＬ－２－１～ＩＬ－２－１０）のＩＬ－２Ｒαに対する結合特性を、Ｏｃｔｅｔプラットフォームによって検出した。Ｏｃｔｅｔプラットフォームによって、生物層干渉法（ＢＬＩ）に基づいて生体分子間の相互作用を検出および分析した。
【0110】
１．実験器具、試薬および消耗品
Ｏｃｔｅｔ（登録商標） Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅシステム（カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｃｏｒｐ）、
分析緩衝液：ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０１％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）、
酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０、５．０、６．０）、
ＡＲ２Ｇ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０９２）、
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ 部品番号６５５２０９）。
Ｏｃｔｅｔ（登録商標） Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅシステム（カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｃｏｒｐ）、
分析緩衝液：ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０１％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）、
酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０、５．０、６．０）、
ＡＲ２Ｇ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０９２）、
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ 部品番号６５５２０９）。
【0111】
２．下記の実験計画を参照して実験を実施した。
実験全体は、３０℃、１０００ｒｐｍ、２２０μｌ／ウェルの条件下で完了した。実験で使用したタンパク質は、ＩＬ２－Ｒα－ｈｉｓ、およびＨＥＫ２９３での一過性発現およびアフィニティー精製によって得られたＩＬ－２変異体またはその誘導体であった。
実験全体は、３０℃、１０００ｒｐｍ、２２０μｌ／ウェルの条件下で完了した。実験で使用したタンパク質は、ＩＬ２－Ｒα－ｈｉｓ、およびＨＥＫ２９３での一過性発現およびアフィニティー精製によって得られたＩＬ－２変異体またはその誘導体であった。
【0112】
分析対象サンプルは、ＩＬ－２Ｒα、希釈緩衝液は、ＳＤ緩衝液であった。分析対象物の濃度は、５００ｎＭ、２４０ｎＭ、１２０ｎＭ、６０ｎＭ、３０ｎＭ、１５ｎＭ（および一部の変異体では追加の濃度１０００ｎＭ）であった。
【0113】
３．実験データおよび処理
実験データを、データ分析ソフトウェア９．０を使用して処理した。１：１モデル、つまり１つのＩＬ－２Ｒαに結合した１つの野生型ヒトＩＬ－２またはＩＬ－２変異体（具体的にはＩＬ－２－１～ＩＬ－２－１０）をフィッティングのために選択した。グローバルフィッティングの方法を適用した、つまり、６つの濃度がグループとして分析された。フィッティング結果を図１に示す。
実験データを、データ分析ソフトウェア９．０を使用して処理した。１：１モデル、つまり１つのＩＬ－２Ｒαに結合した１つの野生型ヒトＩＬ－２またはＩＬ－２変異体（具体的にはＩＬ－２－１～ＩＬ－２－１０）をフィッティングのために選択した。グローバルフィッティングの方法を適用した、つまり、６つの濃度がグループとして分析された。フィッティング結果を図１に示す。
【0114】
実験で得られたデータを１：１結合モデルに当てはめて、野生型ヒトＩＬ－２またはＩＬ２変異体または誘導体の受容体ＩＬ－２Ｒαとの親和性Ｋｄ値を取得した。
【0115】
野生型ヒトＩＬ－２およびＩＬ－２変異体またはその誘導体のＩＬ－２Ｒαとの結合データを図１および表２に示した。
【0116】
その結果、ＩＬ－２－１、ＩＬ－２－６、ＩＬ－２－８、ＩＬ－２－９、およびＩＬ－２－１０はＩＬ－２Ｒαに結合せず、ＩＬ－２－２、ＩＬ－２－３、ＩＬ－２－４、ＩＬ－２－５、ＩＬ－２－７およびＩＬ－２Ｒα間の相互作用は、ある程度まで低下するか、または維持されたことが示された。
【0117】
これは、次のことを示唆した。
（１）３１～３２位におけるアミノ酸のＧＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に有意な影響を及ぼさなかった。
（２）４３～４５位におけるアミノ酸のＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に一定の影響を及ぼした。
（３）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に有意な影響を及ぼさなかった。
（４）上記３つの変異の組み合わせによってタンパク質の構造が大きく変化し、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαへの結合が大幅に減少したが、実験条件下では両者の結合は観察されなかった。
（１）３１～３２位におけるアミノ酸のＧＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に有意な影響を及ぼさなかった。
（２）４３～４５位におけるアミノ酸のＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に一定の影響を及ぼした。
（３）３５～４１位におけるＫＬＴＲＭＬＴのＭＨＧＬＤＧへの変異は、ＩＬ-２のＩＬ-２Ｒαへの結合に有意な影響を及ぼさなかった。
（４）上記３つの変異の組み合わせによってタンパク質の構造が大きく変化し、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαへの結合が大幅に減少したが、実験条件下では両者の結合は観察されなかった。
【0118】
【表2】
【0119】
（実施例３．野生型ヒトＩＬ－２およびＩＬ－２変異体またはその誘導体のＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性の決定）
実施例１における野生型ヒトＩＬ－２およびその変異体または誘導体のＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を実験によって検出した。
実施例１における野生型ヒトＩＬ－２およびその変異体または誘導体のＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性を実験によって検出した。
【0120】
１．実験器具、試薬および消耗品
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅシステム（カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｃｏｒｐ）、
分析緩衝液：ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０１％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）、
酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０、５．０、６．０）、
ＡＲ２Ｇ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０９２）、
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ 部品番号６５５２０９）。
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅシステム（カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｃｏｒｐ）、
分析緩衝液：ＳＤ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０１％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）、
酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０、５．０、６．０）、
ＡＲ２Ｇ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０９２）、
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ 部品番号６５５２０９）。
【0121】
ＩＬ－２Ｒβ／γ－Ｆｃヘテロ二量体の調製のために、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットをクローニングし、それぞれＦｃホールおよびＦｃノブに融合させた。ＩＬ－２Ｒβ－Ｆｃ－ホールおよびＩＬ－２Ｒγ－Ｆｃ－ノブをＨＥＫ２９３細胞に同時にトランスフェクトした。ヘテロ二量体を、プロテインＡとモレキュラーシーブＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００とを使用して精製した。
【0122】
２．実験全体は、３０℃、１０００ｒｐｍ、２２０μｌ／ウェルの条件下で完了した。
【0123】
分析物サンプルはＩＬ－２Ｒβ／γヘテロ二量体であり、希釈緩衝液はＳＤ緩衝液であった。分析対象物の濃度は、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．３ｎＭであった。
【0124】
３．実験データおよび処理
実験データを、データ分析ソフトウェア９．０を使用して処理した。１：１モデル、すなわち、１つのＩＬ-２Ｒβ／γに結合した１つの野生型ヒトＩＬ-２またはＩＬ-２変異体もしくはその誘導体（ＩＬ-２-１～ＩＬ-２-１０）をフィッティングのために選択した。グローバルフィッティングの方法を適用した、つまり、６つの濃度がグループとして分析された。
実験データを、データ分析ソフトウェア９．０を使用して処理した。１：１モデル、すなわち、１つのＩＬ-２Ｒβ／γに結合した１つの野生型ヒトＩＬ-２またはＩＬ-２変異体もしくはその誘導体（ＩＬ-２-１～ＩＬ-２-１０）をフィッティングのために選択した。グローバルフィッティングの方法を適用した、つまり、６つの濃度がグループとして分析された。
【0125】
実験で得られたデータを１：１結合モデルに当てはめて、野生型ヒトＩＬ－２またはＩＬ２変異体またはその誘導体のＩＬ－２Ｒβ／γとの親和性Ｋｄ値を取得し、結合データを図２および表３に示した。
【0126】
結果は、ＩＬ－２変異体またはその誘導体（ＩＬ－２－１からＩＬ－２－１０）とＩＬ－２Ｒβ／γとの間の相互作用が変化しないことを示した。
【0127】
【表3】
【0128】
（実施例４．野生型ＩＬ－２、ＩＬ－２変異体またはその誘導体に対するＣＴＬＬ－２細胞増殖活性アッセイ）
ＩＬ－２の生物学的活性は、異なるＩＬ－２濃度下での依存性細胞株ＣＴＬＬ－２の増殖速度に従って検出された。
ＩＬ－２の生物学的活性は、異なるＩＬ－２濃度下での依存性細胞株ＣＴＬＬ－２の増殖速度に従って検出された。
【0129】
細胞は、１０％ウシ胎児血清および１％の２つの抗生物質（ペニシリン－ストレプトマイシン溶液）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養された。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、顕微鏡下で計数し、１×１０４～５×１０４細胞／ｍｌの細胞懸濁液として調製した。懸濁液１００μｌを、９６ウェル培養プレートの３つの同一のウェルに、細胞の種類ごとにプレートあたり３つずつ、１×１０３～５×１０３細胞／ウェルにおいてピペットで移し、ブランク対照として培地１００μｌを使用した。プレートを３７℃で一晩培養した。
【0130】
ブランク、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭの異なる濃度のグループを設定した。
【0131】
０時間および２４時間の時点で、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８ （ＣＣＫ－８）と無血清最小必須培地とを体積比１：１０で混合し、１ウェルあたり１００μＬでテストウェルに添加し、５％ ＣＯ２で１時間恒温槽内において培養した。
【0132】
波長４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した 各プレートの値を記録した。
【0133】
結果は表４に示すとおりであった。ＩＬ－２変異体またはその誘導体はすべてＣＴＬＬ－２細胞増殖活性を有しており、変異がＩＬ－２Ｒβ／γ受容体サブユニット複合体のシグナル伝達機能に有意な影響を及ぼさないことが示された。ＣＴＬＬ－２細胞上のＩＬ－２－１、ＩＬ－２－６、ＩＬ－２－８、およびＩＬ－２－９変異体の増殖活性は、陽性対照の増殖活性よりも有意に低かった。陽性対照はＩＬ－２Ｒα受容体に結合しなかったが、陽性対照はＩＬ－２Ｒα受容体に結合し、それによってＩＬ－２Ｒβ／γへの結合が増強され、ＣＴＬＬ－２細胞に対する増殖活性がより高かった。
【0134】
ＩＬ－２－１０は、ＩＬ－２－１変異体のＣ末端をＦｃフラグメントのＮ末端に接続することによって形成された組換えタンパク質であった（本出願ではＩＬ－２変異体の誘導体として定義される）。ＩＬ－２Ｒβ／γへの結合を増強するのに十分な分子量を持っていたため、ＣＴＬＬ－２細胞に対して野生型ヒトＩＬ－２と同様の増殖活性を維持することができた。データを表４に示した。
【0135】
【表4】
【図1】
【図2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
成熟野生型ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）と比較してアミノ酸変異を含むヒトＩＬ－２変異体であって、前記変異は、置換、欠失および付加の少なくとも１つであり、好ましくは、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるとおりであり、前記変異は、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３１～４５位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３５～４１位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２または１４に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３５～４３位におけるアミノ酸残基のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に示す配列への変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の３１～３２位におけるアミノ酸残基のＧＧへの変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の４３～４５位におけるアミノ酸残基のＧへの変異、
前記成熟野生型ヒトＩＬ－２の１２５位におけるアミノ酸残基のＡへの変異、
任意選択で、前記成熟野生型ヒトＩＬ－２のＮ末端におけるＭの付加
からなる群から選択される、ＩＬ－２変異体。
【請求項2】
前記ＩＬ－２変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、
Ｎ末端にＭが付加されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１０、およびＮ末端にＭが付加されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、
からなる群から選択される配列で示されるとおりである、請求項１に記載のＩＬ－２変異体。
【請求項3】
前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒαとの低下した親和性を有し、および／または、前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβとの変化していないかまたは増加した親和性を有し、および／または、
前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒγとの変化していないかまたは増加した親和性を有し、
好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒα／β／γとの低下した親和性を有し、およびＩＬ－２Ｒβ／γとのＩＬ－２変異体の親和性は、維持されるか増加する、
請求項１に記載のＩＬ－２変異体。
【請求項4】
ＰＥＧ化、グリコシル化、アルブミンへの接合、Ｆｃへの接合、ヒドロキシエチル化、脱Ｏ－グリコシル化、からなる群から選択される修飾を有し、
好ましくは、前記Ｆｃへの接合は、請求項１に記載のＩＬ－２変異体のＣ末端へのヒトＩｇＧ１ Ｆｃの接合を指し、
前記ＰＥＧ化は、ＩＬ－２変異体のＮ末端でのＰＥＧの結合を指し、
好ましくは、前記ＰＥＧは、５ｋＤ～８０ｋＤの分子量を有し、
より好ましくは、前記ＰＥＧは、１０ｋＤ～２０ｋＤの分子量を有し、
請求項１に記載のＩＬ－２変異体を含む、ＩＬ－２変異体の誘導体。
【請求項5】
第１の成分と、第２の成分と、
を含む接合体であって、
前記第１の成分は、前記第２の成分に、直接的に接合するかまたはリンカーを介して間接的に接合し、
前記第１の成分は、請求項１に記載のＩＬ－２変異体であり、
好ましくは、前記第２の成分は、抗体またはその抗原結合断片であり、
より好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍抗原を標的とする、
接合体。
【請求項6】
請求項１に記載のＩＬ－２変異体、または請求項４に記載のＩＬ－２変異体の誘導体、または請求項５に記載の接合体、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤
を含有する、医薬組成物。
【請求項7】
請求項１に記載のＩＬ－２変異体、請求項４に記載のＩＬ－２変異体の誘導体、または請求項５に記載の接合体をコードする核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを含むこと、請求項１に記載のＩＬ－２変異体を発現すること、
請求項４に記載のＩＬ－２変異体の誘導体を発現すること、
請求項５に記載の接合体を発現すること、
のいずれかを含むまたは発現する、宿主細胞であって、
好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり、
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞からなる群から選択され、
最も好ましくは、前記宿主細胞は、サッカロミケス・セレビシエ細胞または大腸菌細胞である、
宿主細胞。
【請求項10】
薬剤の調製における、請求項１に記載のＩＬ－２変異体、請求項４に記載のＩＬ－２変異体の誘導体、請求項５に記載の接合体から選択されるいずれかの使用であって、前記薬剤は、増殖性疾患、増殖性疾患の転移、免疫疾患からなる群から選択される疾患を予防または治療するためのものであり、
好ましくは、前記増殖性疾患は、腫瘍または癌であり、
好ましくは、前記免疫疾患は、糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、湿疹、喘息、自己免疫疾患および臓器移植後の自己免疫反応からなる群から選択され、
好ましくは、前記腫瘍または癌は、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、パピローマウイルスによる癌、腺癌、黒色腫、肉腫、奇形腫、肺癌、転移性肺癌、リンパ腫および転移性腎細胞癌腫からなる群から選択される、
使用。
【国際調査報告】