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特表2024-528447非天然型５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域、及びその用途

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-30

(54)【発明の名称】非天然型５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域、及びその用途

(51)【国際特許分類】

C12N 15/85 20060101AFI20240723BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20240723BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240723BHJP

A61K 39/215 20060101ALI20240723BHJP

A61P 31/14 20060101ALI20240723BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20240723BHJP

A61K 31/7115 20060101ALI20240723BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z ZNA

C12N15/09 Z

A61K48/00

A61K39/215

A61P31/14

A61P37/04

A61K31/7115

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023578845

(86)(22)【出願日】2022-06-24

(85)【翻訳文提出日】2023-12-20

(86)【国際出願番号】 KR2022009020

(87)【国際公開番号】W WO2022270969

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】10-2021-0082600

(32)【優先日】2021-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0185375

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516132149

【氏名又は名称】ハンミファーマシューティカルズカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハン、スンス

(72)【発明者】

【氏名】パク、タヒョン

(72)【発明者】

【氏名】オ、ウイム

(72)【発明者】

【氏名】ホ、ヨンホ

(72)【発明者】

【氏名】イ、チンポン

(72)【発明者】

【氏名】トン、チュヨン

(72)【発明者】

【氏名】シン、スンヒョン

(72)【発明者】

【氏名】イム、チャンキュ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA03

4C085BA71

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB33

(57)【要約】

非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、非天然型または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの安定化及び翻訳効率を上昇させ、所望のポリペプチドを効率的に得るところに利用されうる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、ポリデオキシリボヌクレオチドである分離された、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうちから選択されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列を含む配列のうちから選択されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された上流プローモーター領域ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記転写可能なヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはＲＮＡをコーディングする配列である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、クローニングサイトである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドの上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されており、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号（ｐｏｌｙ（Ａ） attachment signal）のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７～１０のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列を含むものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むものであり、
前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号（ｐｏｌｙ（Ａ） attachment signal）のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

【請求項16】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または配列番号３１のヌクレオチド配列において、前記プローモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号のヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

発現構造体またはベクターである、請求項１～１６のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

テンプレートとして、請求項１～１６のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られる、ＲＮＡ。

【請求項19】

非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドであり、ポリリボヌクレオチドである、分離されたポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５または２０のヌクレオチド配列と、８０％以上の配列同一性を有するものを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列を含むものであり、
前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むものであり、
前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

前記ポリヌクレオチドにおいて、Ｕのうち１以上が、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を有するものであり、前記ポリヌクレオチドにおいて、Ｕのうち１以上が、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものである、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）または前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳効率、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の安定性、またはその組み合わせを増大させる活性を有するものである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項31】

５’末端は、５’キャップ構造を有するものである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項32】

１以上の変形されたヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項33】

前記変形されたヌクレオチドは、１以上のウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンで置換されたものである、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項34】

活性成分として、請求項１９～３３のうちいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリペプチドを個体に伝達するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非天然型５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域、及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸ワクチンは、ＤＮＡまたはＲＮＡによってコーディングされた抗原に依存する。ＤＮＡワクチンは、真核細胞プローモーター調節下において、バクテリアプラスミドに挿入された抗原コーディング遺伝子を一般的に含む。なお、ＲＮＡワクチンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または他の抗原コーディングＲＮＡを利用する。タンパク質ワクチンと類似して、核酸ワクチンは、筋肉、皮下、粘膜または経皮伝達のような多様な経路を介して伝達されうる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

ＤＮＡワクチンは、ペプチドワクチン、細胞ワクチン、ウイルスベクターワクチン及びＲＮＡワクチンに比べ、免疫反応を少なく誘導すると知られている。また、該ＤＮＡワクチンは、免疫原性が低いだけではなく、宿主ゲノムに挿入され、癌誘発（oncogenesis）を誘導する可能性がある。それにより、ＲＮＡ基盤ワクチンを求める要求がある。

【課題を解決するための手段】

【0004】

一態様は、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ：５’－untranslated region）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ：３’－untranslated region）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0005】

他の態様は、テンプレートとして、前述の第１態様のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られるＲＮＡを提供する。

【0006】

他の態様は、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0007】

他の態様は、前記ポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法を提供する。

【0008】

他の態様は、前記方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ポリペプチドを得る方法を提供する。

【0009】

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチドを個体に伝達するための組成物を提供する。

【0010】

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチドに対する免疫反応を誘導するための組成物を提供する。

【0011】

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む、前記ポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡを生産するためのベクターを示した図である。

【図2A】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図面である。

【図2B】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図面である。

【図2C】生産されたｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図面である。

【図3】生産されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが細胞に導入される場合、スパイクタンパク質が発現するところを、ウェスタンブロット（western blot）を介して確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと係わり、用語「同一性（identity）」は、配列を比較して決定される２以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を示す。前記同一性は、２以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基のストリング（string）間のマッチングの数によって決定される配列関連度（sequence relatedness）の程度を示す。関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性は、知られている方法によっても計算される。該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドに適用される「％同一性」は、候補のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、第２配列との最大パーセント同一性を得るために、整列させ（aligning）、必要であるならば、ギャップを導入した後、第２配列の残基と同一である候補配列中の残基の百分率として定義される。前記整列のための方法及びプログラムは、周知である。前記プログラムは、例えば、ＢＬＡＳＴ、Smith-Waterman algorithmまたはNeedleman-Wunsch algorithmでもある。

【0014】

本明細書において、「５’非翻訳領域」（５’－ＵＴＲ：５’－untranslated region）」は、ポリペプチドをコーディングしない開始コドン、すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写体の最初コドンから直接上流（すなわち、５’）であるｍＲＮＡの領域を示す。

【0015】

本明細書において、「３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ：３’－untranslated region）」は、ポリペプチドをコーディングしない中断コドン（stop codon）すなわち、翻訳終結（termination）を信号するｍＲＮＡ転写体のコドンから直接下流（すなわち、３’）であるｍＲＮＡの領域を示す。

【0016】

本明細書において、「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：open reading frame）」は、開始コドン、例えば、メチオニンコドン（ＡＴＧ）から始まり、中断コドン、例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡで終わり、ポリペプチドをコーディングするＤＮＡの連続領域を示す。

【0017】

本明細書において、「ポリアデニレート配列（polyadenylate sequence）」または「ポリＡテール（poly(A) tail）」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲから下流、例えば、直接下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を示す。前記ポリＡテールは、１０個～３００個のアデノシン一リン酸を含むものでもある。例えば、前記ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０。６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００のアデノシン一リン酸を含むものでもある。前記ポリＡテールは、例えば、５０個～２５０個のアデノシン一リン酸を含むものでもある。細胞または個体のような生体内において前記ポリＡテールは、酵素、例えば、細胞質にある酵素の攻撃からｍＲＮＡを保護し、転写の終結、核からのｍＲＮＡ排出（export）、及び翻訳の一助の役割を行うことができる。

【0018】

本明細書において、用語「作動可能に連結された（operatively linked）」は、１つの機能が他のものによって影響を受けるように、単一核酸断片上において、ヌクレオチド配列が連結されたことを示す。例えば、プローモーターは、コーディング配列の発現に影響を及ぼしうる場合（すなわち、コーディング配列が、前記プローモーターの転写的調節下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結されているのである。コーディング配列は、センス方向またはアンチセンス方向に調節配列に作動可能に連結されてもいる。

【0019】

本明細書において、ヌクレオチド配列の位置と係わり、それとは異なる言及がなければ、５’末端から３’末端の方向に連結されるか、あるいは位置することを示す。

【0020】

本明細書において、用語「ベクター（vector）」または「核酸構造体（nucleic acid construct）」は、遺伝子、ＯＲＦまたはＤＮＡ断片を細胞に運ぶことができる任意の核酸を示す。前記ベクターは、例えば、細胞において複製されうるものでもある。前記ベクターは、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、あるいは酵母人工染色体（ＶＡＣ：yeast artificial chromosome）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ：bacterial artificial chromosome）、植物人工染色体（ＰＬＡＣ：plant artificial chromosome）のような人工染色体（artificial chromosome）でもある。

【0021】

第１態様は、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0022】

前記分離されたポリヌクレオチドは、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び非天然型３’非翻訳領域（3’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを含むものでもある。前記分離されたポリヌクレオチドは、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び天然型３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを含むものでもある。

【0023】

前記分離されたポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチドでもある。

【0024】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、非天然型ヌクレオチド配列を含むものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２、またはその組み合わせを含むものでもある。これら５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、ポリリボヌクレオチドでもある。前記非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３、またはその組み合わせを含むものでもある。これら配列は、ポリデオキシリボヌクレオチドでもある。

【0025】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、非天然型または天然型ヌクレオチド配列を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するもの、または配列番号２０のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０、またはその組み合わせを含むものでもある。前記非天然型または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0026】

前述の非天然型または天然型３’非翻訳領域をコーディングするヌクレオチド配列は、制限酵素認知配列を追加して含むものでもある。前記制限酵素は、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ、あるいはＸｈｏＩ及びＮｈｅＩでもある。

【0027】

前記分離されたポリヌクレオチドは、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列と、天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列とを含むものでもある。

【0028】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された上流プローモーター領域ヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。

【0029】

【0030】

前記転写可能なヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはＲＮＡをコーディングする配列でもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ（betacoronavirus）抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ（respiratory syncytial virus）抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ（measlesvirus）抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ（human metapneumovirus）抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ（human parainfluenza virus）抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年に確認されたものであり、ＣＯＶＩＤ－１９とも言う。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質またはその免疫原性断片でもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。

【0031】

前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、クローニングサイトでもある。前記クローニングサイトは、多重クローニングサイトでもある。該クローニングサイトは、制限酵素の認知部位、切断部位、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0032】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するように連結されたものでもある。

【0033】

前述のプローモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するように連結されたものでもある。

【0034】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号（ｐｏｌｙ（Ａ） attachment signal）のヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。

【0035】

前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。

【0036】

前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号のヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。例えば、前記ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号のヌクレオチド配列の順序で連結されたものでもある。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含むものでもある。

【0037】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された上流プローモーター領域ヌクレオチド配列、前記プローモーターに作動可能に連結された転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号のヌクレオチド配列を含み、前記転写可能なヌクレオチド配列、または前記転写可能なヌクレオチド配列を導入するためのヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。例えば、前記ポリヌクレオチドは、プローモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号のヌクレオチド配列の順序で連結されたものでもある。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３１のヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含むものでもある。

【0038】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは形成された共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。

【0039】

前述のプローモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列またはクローニングサイトヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリアデニレートまたはポリアデニレート付着信号は、インビトロまたはインビボで転写される場合、共通の転写体を形成するか、あるいは形成された共通の転写体の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）下流に、ポリＡテールを添加するように連結されたものでもある。

【0040】

前記ポリヌクレオチドは、核酸構造体またはベクターでもある。本明細書において、「ポリアデニレート付着信号」は、未成熟ｍＲＮＡにポリアデニレートを添加させるヌクレオチド配列でもある。前記核酸構造体またはベクターは、前記ポリヌクレオチドを発現するのに必要な調節配列を含むものでもある。前記発現は、転写、翻訳、またはその組み合わせでもある。前記核酸構造体またはベクターは、発現構造体またはベクターでもある。

【0041】

第２態様は、テンプレートとして、前述の第１態様のポリヌクレオチドを使用した転写によって得られるＲＮＡを提供する。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、信号配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のＵが、Ｎ１－メチルシュードウリジン（methyl－pseudouridine）で置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されてもいる。前記ｍＲＮＡは、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されており、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。

【0042】

第３態様は、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、非天然型または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0043】

該第３態様のポリヌクレオチドにおいて、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２、またはその組み合わせを含むものでもある。前記非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0044】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１５のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するもの、または配列番号２０のヌクレオチド配列と、７０％以上、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列同一性を有するものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、配列番号１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０、またはその組み合わせを含むものでもある。前述の非天然型または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0045】

該第３態様のポリヌクレオチドは、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と、天然３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）とを含むものでもある。

【0046】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチドの下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質またはその免疫原性断片でもある。前記ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然スパイクタンパク質または変異体でもある。前記変異体は、アルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体、デルタ変異体、イプシロン変異体及びオミクロン変異体を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然スパイクタンパク質またはそのアルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体、デルタ変異体、イプシロン変異体及びオミクロン変異体は、それぞれ配列番号４２～４８のアミノ酸配列を含むものでもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。

【0047】

前述の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、及びポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、共通の転写体として連結されたものでもある。

【0048】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列をさらに含むものでもある。該ポリアデニレートヌクレオチド配列は、例えば、２０個以上、４０個以上、８０個以上、または１００個以上、及び５００個以下、４００個以下、３００個以下、２００個以下、または１５０個以下のアデニルヌクレオチドを含むものでもある。

【0049】

前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列の上流において、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）と作動可能に連結されたものでもある。前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、リボヌクレオチド配列、例えばｍＲＮＡでもある。

【0050】

前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、共通の転写体として連結されたものでもある。

【0051】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列の下流において、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と作動可能に連結されたものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、それに作動可能に連結された下流ポリアデニレートヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列と、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列の上流において、作動可能に連結されたものでもある。

【0052】

前述の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列、及びポリＡは、共通の転写体として連結されたものでもある。

【0053】

前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）または前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、及び／または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）が使用された場合に比べ、翻訳効率、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列の安定性、またはその組み合わせを増大させる活性を有するものでもある。

【0054】

前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。前記ポリヌクレオチドは、５’キャップを含むものでもある。用語「５’－キャップ（５’－cap）」は、ｍＲＮＡ分子の５’－末端で発見されるキャップ構造を示す。前記５’－キャップは、異例な（unusual）５’に対する５’トリホスフェート連結（triphosphate linkage）を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドを含むものでもある。前記グアノシンは、７位置にメチル化されたもの、例えば、ｍ^７Ｇまたは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇでもある。用語「一般的５’－キャップ（conventional ５’cap）」は、自然に存在するＲＮＡ５’キャップ、例えば、７－メチルグアノシン（methylguanosine）（ｍ７Ｇ）を示す。本明細書において、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ており、ＲＮＡに付着される場合、例えば、インビボ及び／または細胞において、ＲＮＡを安定化させる能力を有するように変形された５’キャップアナログを含む。ＲＮＡに対する５’キャップまたは５’キャップアナログの提供は、ＤＮＡテンプレートを、５’キャップまたは５’キャップアナログの存在下においてインビトロ転写し、前述の５’キャップまたは５’キャップアナログが生成されるＲＮＡ鎖に、共同転写（co-transcriptionally）挿入によって行われるか、あるいは５’キャップまたは５’キャップアナログルールの転写後（post-transcriptionally）キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して生成されうる。前記５’末端キャップ構造は、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＩｍｐＮｐ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧでもある。

【0055】

前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列は、配列番号１または１０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリアデニレートヌクレオチド配列は、配列番号１０１のヌクレオチド配列を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、制限酵素認知配列を追加して含むものでもある。前記制限酵素は、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ、あるいはＸｈｏＩ及びＮｈｅＩを含むものでもある。

【0056】

前記ポリヌクレオチドにおいて、Ｕのうち１以上が、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものでもある。

【0057】

前記ポリヌクレオチドは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものであり、前記ポリヌクレオチドにおいて、Ｕのうち１以上が、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものでもある。前記ポリヌクレオチドは、そこにおける全てのＵが、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものでもある。

【0058】

また、前記ポリヌクレオチドは、５’末端に、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）キャップ構造を有するものでもある。

【0059】

第４態様は、第１態様のポリヌクレオチドをテンプレートにし、ＲＮＡを転写する段階を含む、ＲＮＡを得る方法を提供する。前記転写は、インビトロ転写、エクスビボ転写またはインビボ転写を含むものでもある。前記インビボ転写は、個体内転写を含むものでもある。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のＵが、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されてもいる。前記ｍＲＮＡは、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されており、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル（methyl））ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。前記構造においてＡｍは、２’－Ｏ－メチルアデノシン（methyladenosine）を示す。しかしながら、前記ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、その構造に限定されるものではなく、知られている天然５’キャップ構造または５’キャップアナログで置換されうる。

【0060】

用語「インビトロ転写」または「ＲＮＡインビトロ転写」は、無細胞システム、すなわち、インビトロにおいてｍＲＮＡを含むＲＮＡが合成される過程を示す。プラスミドＤＮＡベクターを含むクローニングベクターＤＮＡが、ＲＮＡ転写体生成のためのテンプレート（template）として適用されうる。それらクローニングベクターは、一般的に、転写ベクター（transcription vector）とも言う。該ＲＮＡは、適切なＤＮＡテンプレートのＤＮＡ依存性インビトロ転写によって得られる。前記ＤＮＡテンプレートは、線形化されたプラスミドＤＮＡテンプレートでもある。該ＲＮＡインビトロ転写を制御するプローモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプローモーターでもある。前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、またはその組み合わせでもある。ＲＮＡインビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートは、核酸をクローニングし、それをＲＮＡインビトロ転写のためのベクターに導入して得られる。前記ＤＮＡは、インビトロ転写されるそれぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むものでもある。前記ＲＮＡインビトロ転写のためのベクターは、円形プラスミドＤＮＡでもある。前記ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写または化学合成によって得られる。

【0061】

前記転写ベクターは、プローモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングする配列、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリＡを含むものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうち１以上を含むものでもある。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列のうち１以上を含むものでもある。前記転写ベクターは、また大腸菌複製原点ＣｏｌＥ１ｏｒｉ、選択マーカー遺伝子、またはその組み合わせを含むものでもある。前記プローモーターは、Ｔ７プローモーターでもある。前記選択マーカーは、抗生物質、例えば、カナマイシン抵抗性酵素でもある。

【0062】

前記インビトロ転写は、前記転写ベクターを、宿主細胞、例えば、大腸菌に導入し、形質転換された宿主細胞を得て、得られた宿主細胞を培養し、ｍＲＮＡのテンプレートになるプラスミドＤＮＡを含んでいる宿主細胞を増殖させる段階を含むものでもある。前記インビトロ転写は、増殖された宿主細胞、例えば、大腸菌から、前記プラスミドＤＮＡを分離する段階を含むものでもある。前記プラスミドＤＮＡを分離する段階は、培養物における細胞層を分離し、細胞から、プラスミドＤＮＡを分離することを含むものでもある。該細胞層分離は、遠心分離、分離、沈澱、またはその組み合わせによっても行われる。該細胞からのプラスミドＤＮＡ分離は、知られている方法、例えば、アルカリ抽出法、親和性クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、電気泳動、またはその組み合わせによっても行われる。

【0063】

前記ＲＮＡを得る方法は、第１態様のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写体を生産する段階を含むものでもある。前記ＲＮＡ転写体は、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、配列番号６３～７６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、前記配列において、１以上のＵが、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されたものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル）ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されてもいる。前記ｍＲＮＡにおいて、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されており、５’末端のＧＡは、５’－［１，２－［（３’－Ｏ－メチル）ｍ７Ｇ－（５’→５’）－ｐｐｐ－Ａｍ］］のキャップ構造を有するものでもある。しかしながら、前記ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、その構造に限定されるものではなく、知られている天然５’キャップ構造または５’キャップアナログで置換されうる。

【0064】

第５態様は、第３態様のＲＮＡ、または第４態様の方法によって得られたＲＮＡを翻訳する段階を含む、ポリペプチドを得る方法を提供する。該第３態様のＲＮＡ、または該第４態様の方法によって得られたＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡでもある。

【0065】

前記方法は、第１態様のポリヌクレオチドを含む細胞を培養し、前記ポリペプチドを生産する段階を含むものでもある。

【0066】

第６態様は、活性成分として、第３態様のポリヌクレオチドを含む、ポリペプチドを個体に伝達するための組成物を提供する。該第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。該第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。

【0067】

第７態様は、活性成分として、第３態様のポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するための組成物を提供する。該第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。該第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。

【0068】

第６態様及び第７態様において、前記組成物は、免疫原性または疾病を治療するためのものでもある。前記疾病は、選択されたポリペプチドによっても異なりる。前記疾病は、例えば、ウイルスまたは外来細胞による感染症、癌、代謝性疾患、炎症、胃腸管疾患、内分泌疾患、敗血症、または自己免疫疾患でもある。前記疾病は、ハンター症侯群、ゴーシェ病、ファブリー病のように、酵素欠乏によって生じ、酵素代替療法によって治療が可能な疾患でもある。前記疾病において、前記外来細胞は、原核細胞または真核細胞でもある。前記外来細胞は、バクテリアでもある。

【0069】

前記ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ウイルス抗原性ポリペプチドでもある。前記ウイルス抗原性ポリペプチドは、１以上のＢｅｔａＣｏＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＲＳＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＭｅＶ抗原性ポリペプチド、１以上のｈＭＰＶ抗原性ポリペプチド、１以上のＰＩＶ抗原性ポリペプチド、それらの抗原性断片、またはそれらの組み合わせでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記抗原性ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶのスパイクタンパク質、またはその免疫原性断片でもある。前記治療的ポリペプチドは、例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、その誘導体、またはそれらの組み合わせでもある。前記組成物は、個体において、症状または感染を予防、治療または診断するためのものでもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。前記感染は、バクテリア感熱またはウイルス感熱でもある。前記ウイルスは、ＢｅｔａＣｏＶ、ＲＳＶ、ＭｅＶ、ｈＭＰＶまたはＰＩＶでもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記組成物は、免疫効果器細胞（immune effector cell）をプライミング（priming）するのにも使用される。例えば、前記組成物は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をエクスビボ活性化させ、個体に注入する（infuse）のに使用されうる。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはその変異体に対する免疫反応を誘導するのに使用するためのものでもある。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはその変異体感染症を予防するのに使用するためのものでもある。

【0070】

前記組成物は、個体に投与され、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビボで翻訳され、抗原性ポリペプチドを生産することができる。

【0071】

抗原性ポリペプチドをコーディングする１以上の翻訳可能な領域を有するポリヌクレオチドを含む「効果的な量（effective amount）」の前記組成物は、細胞、組織または個体と接触されうる。

【0072】

前記効果的な量、標的組織、標的細胞、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、大きさ及び変形されたヌクレオシドの含量など）、並びに組成物の他の成分に基づいて定められる。一般的に、効果的な量の前記組成物は、細胞において、抗原生産の関数として誘導されたり（induced）、ブーストされたり（boosted）する免疫反応を引き起こすことができる。

【0073】

前記組成物は、他の予防的または治療的な化合物と共に投与されうる。前述の予防的または治療的な化合物は、例えば、アジュバントまたはブースター（booster）でもある。本明細書において、ワクチンのような予防的組成物を参照するとき、用語「（booster）」は、前記予防的組成物の追加的投与を示す。ブースターまたはブースターワクチンは、前記予防的組成物の初期投与後に与えられうる。前記予防的組成物の初期投与と、前記ブースターとの間の投与時間は、１週、２週、３週、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年でもある。また、前記組成物は、アジュバントを含まないものでもある。

【0074】

前記組成物は、筋肉内、皮下、鼻内、鼻腔または肺に投与されうる。

【0075】

前記組成物は、１以上の薬剤学的に許容可能な賦形剤を含むものでもある。前記組成物においてポリヌクレオチドは、前記賦形剤と剤形化されているか、あるいは複合体化されてもいる。前記賦形剤は、当業界に知られているものでもある。

【0076】

本明細書において、用語「活性成分（active ingredient）」は、前記組成物、またはそれに含まれたポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含むＲＮＡポリヌクレオチドを示す。前記ＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、抗原性ポリペプチドまたは治療的ポリペプチドをコーディングするものでもある。

【0077】

前記組成物に含まれる活性成分、薬剤学的に許容可能な賦形剤、及び／または他の付加的成分の相対的量は、治療される個体のアデンティティー（identity）、大きさ及び／または条件、並びに投与される経路によっても異なりる。例えば、前記組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５％～５０％、１．０％～３０％、５．０％～８０％、または８０％（ｗ／ｗ）以上の活性成分を含むものでもある。

【0078】

前記組成物において、前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡでもある。前記ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び／または３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む安定化エレメントを含むものでもある。前記ｍＲＮＡは、５’－キャップ構造または３’－ポリＡテールのような追加の構造をさらに含むものでもある。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、一般的に、ゲノムＤＮＡから転写されて未成熟のｍＲＮＡのエレメントである。５’－キャップ及び３’－ポリＡテールのような成熟したｍＲＮＡの構造的特徴（feature）は、ｍＲＮＡ加工過程の間に転写された（未成熟）ｍＲＮＡに一般的に添加される。前記ポリＡテールは、一般的に転写されたｍＲＮＡに添加されたアデニンヌクレオチドの領域（stretch）である。前記ポリＡテールは、例えば、４００個アデニンヌクレオチド以下を含むものでもある。一部具体例において、前記３’－ポリＡテールの長さは、個別ｍＲＮＡの安定性において必須エレメントでもある。

【0079】

前記組成物は、ナノ粒子として剤形化されたものでもある。前記ナノ粒子は、ｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドを細胞に伝達するためのものとして知られているものでもある。例えば、前記ナノ粒子は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する免疫反応を誘導するために使用されるワクチン、例えば、ＲＮＡワクチンに使用される知られているナノ粒子でもある。前記ナノ粒子は、リピッドナノ粒子（ＬＮＰ：lipid nanoparticle）でもある。前記組成物は、リピッドナノ粒子（ＬＮＰ）として剤形化されたもの、またはリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）に結合されているものでもある。前記結合は、リピッドナノ粒子（ＬＮＰ）内またはリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）表面に結合することを含む。例えば、前記組成物は、リピッドポリ陽イオン（lipid polycation）複合体内に剤形化されたもの、またはリピッドポリ陽イオン複合体に結合されているものでもある。前記リピッドポリ陽イオン複合体は、陽イオン性リピッドナノ粒子（cationic lipid nanoparticle）とも言う。前記ポリ陽イオンは、ＭＣ３、Ｌｉｐｉｄ３１９、Ｃ１２－２００、５Ａ２－ＳＣ８、３０６Ｏｉ１０、ＭｏｄｅｒｎａＬｉｐｉｄ５、ＡｃｕｉｔａｓＡ９、ＳＭ－１０２、ＡＬＣ－０３１５、ＡｒｃｔｕｒｕｓＬｉｐｉｄ２，２（８，８）４ＣＣＨ３、ＧｅｎｅｖａｎｔＣＬ１、ポリリシン、ポリオルニチン、及び／またポリアルギニンのような陽イオン性ポリペプチドを含むものでもある。また、前記組成物は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ：distearoylphosphatidylcholine）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロールのようなステロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような非陽イオン性リピッドを含むリピッドナノ粒子に剤形化されるか、あるいは結合されてもいる。また、前記組成物は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧ－ＤＭＡ）のようなＰＥＧリピッドを含むリピッドナノ粒子に剤形化されるか、あるいは結合されてもいる。

【0080】

リピッドナノ粒子剤形は、陽イオン性脂質、リン脂質、コレステロールのようなステロール、ＰＥＧ-脂質、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。リピッドナノ粒子剤形は、例えば、陽イオン性脂質、リン脂質、コレステロールのようなステロール、及びＰＥＧ-脂質を含むものでもある。また、リピッドナノ粒子は、ＰＥＧ変形されたリピッド、非陽イオン性リピッド、ステロール、及びイオン化可能なリピッド、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。前記リピッドナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％ＰＥＧ変形されたリピッド、５～２５ｍｏｌ％非陽イオン性リピッド、２５～５５ｍｏｌ％ステロール、及び２０～６０ｍｏｌ％イオン化可能なリピッドを含むものでもある。前記ＰＥＧ変形されたリピッドは、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）であり、非陽イオン性リピッドは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、前記イオン化可能な陽イオン性リピッドは、下記構造の化合物１でもある。

【0081】

【化1】

【0082】

前記ＰＥＧ変形されたリピッドは、下記構造の化合物２（ＡＬＣ－０１５９）であり、非陽イオン性リピッドは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、前記イオン化可能な陽イオン性リピッドは、下記構造の化合物３（ＡＬＣ－０３１５）でもある。

【0083】

【化2】

【0084】

【化3】

【0085】

前記組成物は、活性成分として、前記ポリヌクレオチド、及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはその変異体に対する免疫反応を誘導するための組成物でもある。前記組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはその変異体感染症を予防するためのものでもある。

【0086】

第８態様は、第３態様のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する段階を含む、前記ポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。該第３態様のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡでもある。該第３態様のポリヌクレオチドは、第４態様の方法によって得られたＲＮＡでもある。

【0087】

前記方法において、前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡでもある。前記宿主細胞は、個体由来の任意細胞でもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。前記細胞は、例えば、幹細胞、生殖細胞または体細胞でもある。前記方法において、前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、前記宿主細胞は、樹枝状細胞を含む抗原提供細胞、モノサイトまたはマクロファージでもある。

【0088】

前記方法は、第３態様のポリヌクレオチドを個体に投与する段階を含むものでもある。前記投与は、非経口投与または経口投与でもある。前記投与は、筋肉内、皮下、鼻内、鼻腔または肺内の投与でもある。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。

【0089】

前記方法は、個体を前記ポリペプチドに対して免疫化するものでもある。また、前記方法は、個体において、疾病を治療するものでもある。前記ポリペプチドは、ＢｅｔａＣｏＶの抗原タンパク質でもある。前記ＢｅｔａＣｏＶは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせでもある。前記方法は、個体において、ＢｅｔａＣｏＶ、例えば、そのスパイクタンパク質、あるいはその変異体またはサブユニットに対して免疫反応を誘導するものでもある。前記方法は、個体において、ＢｅｔａＣｏＶ、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＮＬ、ＨＣｏＶ－ＮＨ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、それらの変異体、またはその組み合わせの感染症を予防することでもある。

【0090】

前述の第３～第８態様において、前記ポリヌクレオチドは、５’末端キャップを含むものでもある。前記５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＩｍｐＮｐ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧでもある。

【0091】

前述の第３～第７態様において、前記ポリヌクレオチドは、１以上の化学的変形を有するヌクレオチドを含むものでもある。前記変形は、前記ヌクレオチドにわたって均一に（uniformly）なされたものでもある。本明細書において、「化学的変形（chemical modification）」及び「化学的に変形された（chemically modified）」は、アデノシン（Ａ），グアノシン（Ｇ），ウリジン（Ｕ），チミン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドに対するそれらの位置、パターン、百分率または母集団（population）のうち１以上における変形を示す。一般的に、それら用語は、自然に存在する５’－末端ｍＲＮＡキャップモイエティにおいて、リボヌクレオチド変形を示さない。

【0092】

ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含むＲＮＡは、１以上の他の変形を含むものでもある。該ポリヌクレオチドの特定領域は、１以上のヌクレオシドまたはヌクレオチド変形を含むものでもある。変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された分解を示しうる。また、変形されたポリヌクレオチドは、細胞または個体に導入される場合、変形されていないポリヌクレオチドに比べ、細胞または個体において、低減された免疫原性（例えば、低減された先天反応（innate response））を示しうる。

【0093】

変形されたシトシンを有するヌクレオシドは、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例：５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン（N4-acetyl-cytidine (ac4C), 5-methyl-cytidine (m5C), 5-halo-cytidine (e.g., 5-iodo-cytidine), 5-hydroxymethyl-cytidine (hm5C)）、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0094】

変形されたアデニンを有するヌクレオシドは、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）（7-deaza-adenine, 1-methyl-adenosine (m1A), 2-methyl-adenine (m2A), N6-methyl-adenosine (m6A)）、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0095】

変形されたグアニンを有するヌクレオ塩基またはヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシン（inosine (I), 1-methyl-inosine (m1I), wyosine (imG), methylwyosine (mimG), 7-deaza-guanosine, 7-cyano-7-deaza-guanosine (preQ0), 7-aminomethyl-7-deaza-guanosine (preQ1), 7-methyl-guanosine (m7G), 1-methyl-guanosine (m1G), 8-oxo-guanosine, 7-methyl-8-oxo-guanosine）、またはその組み合わせを含むものでもある。

【0096】

前記化学的変形を有するヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、Ｎ１－エチル－シュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、５－メチルウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（pseudouridine, N1-methylpseudouridine, N1-ethylpseudouridine, 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcytosine, 5-methyluridine, 2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine, 2-thio-1-methyl-pseudouridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thio-dihydropseudouridine, 2-thio-dihydrouridine, 2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 4-thio-pseudouridine, 5-aza-uridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, 2'-O-methyluridine）、またはそれらの組み合わせでもある。前記化学的変形は、ウラシルの５位置にありうる。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－メチルシュードウリジン（methylpseudouridine）への変形でもある。前記化学的変形は、ウラシルのＮ１－エチルシュードウリジン（ethylpseudouridine）への変形でもある。
［発明の効果］

【0097】

一態様による非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、非天然型または天然型３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む分離されたポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを安定化させ、それにより、翻訳効率を上昇させるのに使用されうる。

【0098】

他の態様によるＲＮＡは、相対的に安定し、翻訳効率が高く、ＲＮＡを効率的に翻訳するのに使用されうる。

【0099】

他の態様による分離されたポリヌクレオチドは、相対的に安定し、翻訳効率が高く、ＲＮＡを効率的に翻訳するのに使用されうる。

【0100】

他の態様によるＲＮＡを得る方法によれば、ＲＮＡを効率的に得ることができる。

【0101】

他の態様によるポリペプチドを得る方法によれば、ポリペプチドを効率的に得ることができる。

【0102】

他の態様による免疫原性組成物は、個体を効率的に免疫化するのに使用されうる。

【0103】

他の態様によるポリヌクレオチドを利用する方法は、個体を効率的に免疫化するのに使用されうる。

【実施例】

【0104】

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであるが、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

【0105】

実施例１：ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を設計した。

【0106】

その結果、配列番号１～１２のヌクレオチド配列を有する１２個の非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を得た。配列番号２のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、安定したヘアピン構造を形成する配列（ＧＵＣＣＣＵＣＵＧＡ（配列番号１３））の位置を、そこから前に移動させた配列である。配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、グアニン一部をユリジンで置換した配列である。

【0107】

配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列において、一部を連続されたユリジンで置換した配列である。配列番号５，６，７及び８のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１のヌクレオチド配列において、一部をアデニンが豊富な配列で置換した配列である。配列番号９，１０及び１１のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列において、一部をランダムに他のヌクレオチドで置換した配列である。

【0108】

配列番号１２のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列において、グアニンを追加した配列である。

【0109】

配列番号１～１２のヌクレオチド配列において、それぞれのヌクレオチドは、天然型から変形されるものでもある。例えば、前記配列において、１以上のＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されうる。前記配列において、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されうる。

【0110】

実施例２：ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子発現を増大させる３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列
ｍＲＮＡをコーディングする遺伝子の発現を増大させる３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を設計した。

【0111】

その結果、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列を有する７個の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を得た。

【0112】

配列番号１４のヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ結合予測部位を含まない配列でもある。配列番号１５及び１８のヌクレオチド配列は、ＣＵ－リッチエレメント（ＵＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＵＣＵＣＣ（配列番号２１））を含むものでもある。

【0113】

配列番号１６及び１９のヌクレオチド配列は、抗原Ｒ結合エレメント（ＵＵＧＧＵＵＵ）を含むものでもある。

【0114】

配列番号１４～２０のヌクレオチド配列において、それぞれのヌクレオチドは、天然型から変形されるものでもある。例えば、前記配列において、１以上のＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されうる。前記配列において、全てのＵは、Ｎ１－メチルシュードウリジンで置換されうる。

【0115】

実施例３：非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を使用したテンプレートベクター作製
実施例１及び実施例２で得られた配列番号１～１２のヌクレオチド配列を含む非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、配列番号１４～２０のヌクレオチド配列を含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）ヌクレオチド配列をコーディングする配列のうち１以上、及びポリペプチドをコーディングする遺伝子を作動可能に連結して製造されたベクターを製造した。

【0116】

具体的には、前記ベクターは、プローモーター、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、ポリペプチドをコーディングするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及びポリＡが連結されたものでもある。前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号２２～３３のヌクレオチド配列のうち１以上を使用した。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列のうち１以上を使用した。配列番号１０９～１１５のヌクレオチド配列は、それぞれの５’末端にＸｈｏＩ酵素認知配列を含み、それぞれの３’末端にＮｈｅＩ酵素認知配列を含む、配列番号３４～４０のヌクレオチド配列に該当する配列である。

【0117】

前記ポリＡをコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列を有する。前記ベクターは、また大腸菌複製原点ＣｏｌＥ１ｏｒｉ及び選択マーカー遺伝子を含むものでもある。前記プローモーターは、Ｔ７プローモーターでもある。前記選択マーカーは、カナマイシン抵抗性酵素でもある。

【0118】

選抜された非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列、及び／または３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコーディングする配列と連結された場合、前記ポリペプチド生産が増大されるだけではなく、非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列、ポリペプチドをコーディングする配列、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を含むｍＲＮＡの安定性が顕著に上昇した。前記ポリペプチドは、配列番号４２～４８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはそのアルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体、デルタ変異体、イプシロン変異体及びオミクロン変異体でもある。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはそのアルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体、デルタ変異体、イプシロン変異体及びオミクロン変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列を有するものであり、そのｍＲＮＡは、それぞれ配列番号５６～６２のヌクレオチド配列を有するものでもある。前記ポリペプチド、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡのクローニング過程は、次の通りである。

【0119】

（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及びその変異体ｍＲＮＡ生産のためのテンプレートベクター作製
設計された１２個５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列のうち１つ；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列のうち１つ；７個３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列のうち１つ；及びポリＡを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体ｍＲＮＡ及び／またはそのタンパク質産物生産用ベクターを作製し、そのベクターを微生物細胞に導入して得られた微生物細胞を培養し、クローニングベクターを生産した。生産されたベクターをテンプレートにしたインビトロ転写を介し、ｍＲＮＡを生産した。前記変異体は、アルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体、デルタ変異体、イプシロン変異体及びオミクロン変異体を含む。

【0120】

具体的には、まず、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ^Ｒベクター（Addgene社）から、抗生物質抵抗遺伝子をカナマイシン抵抗性遺伝子で置換されたベクターｐＵＣ５７－Ｋａｎ^Ｒを作製した。作製されたｐＵＣ５７－Ｋａｎ^Ｒベクターを、制限酵素ＨｉｎｄIII及び制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して切断した後、切断されたベクターを、合成作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドとリガーゼ（ligase）とを使用して連結し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列が挿入されたｐＵＣ５７－Ｋａｎ^Ｒベクターを得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号４９～５５のヌクレオチド配列を有する。挿入されたスパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列とを含んでおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のヌクレオチド配列の５’から８７９番目ヌクレオチドには、ＢａｍＨＩ制限酵素認識配列が存在し、追って、その認識配列を切断し、前記設計された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列を導入するのに使用した。

【0121】

（２）５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列との連結
前記作製されたテンプレートベクターの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列を、配列番号１～１２の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列をコーディングするヌクレオチド配列で置換するために、当該配列を含むプライマー、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＢａｍＨＩ制限酵素認識部位配列を含むプライマーをプライマーセットにし、前記テンプレートベクターをテンプレートにしたＰＣＲ反応を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を、さらに安定して確保するために、１つの配列当たり、ＰＣＲ反応を二段階にわたって進めた。一次プライマーを利用してＰＣＲを進めた後、得られた遺伝子をテンプレートにし、二次プライマーを使用し、２番目ＰＣＲを遂行し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片を得た。そこに使用されたプライマー配列は、配列番号７７～１００のポリヌクレオチドであった。

【0122】

ＰＣＲ反応を介して確保された前記１２個５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列含有ＤＮＡ断片それぞれと、（１）で作製されたテンプレートベクターとを、制限酵素ＨｉｎｄIIIと制限酵素ＢａｍＨＩとで処理して切断し、それら切断された配列を、リガーゼを使用して連結した。その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、配列番号１～１２のそれぞれの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列で置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするベクターを作製した。

【0123】

（３）３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列の連結
（２）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列が、配列番号２２～３３のそれぞれの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列で置換されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするベクターにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列の３’末端に、配列番号１０９～１１５のそれぞれの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチドを連結した。配列番号１０９～１１５のそれぞれのヌクレオチド配列は、それぞれの５’末端にＸｈｏＩ酵素認知配列を含み、それぞれの３’末端にＮｈｅＩ酵素認知配列を含む配列番号３４～４０のヌクレオチド配列に該当する配列である。

【0124】

具体的に、配列番号１０９～１１５のそれぞれの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングするヌクレオチド配列は、合成を介して確保した。配列番号１０２～１０８の配列は、配列番号１０９～１１５の配列に対応するＲＮＡ配列である。

【0125】

確保された配列と、（２）で作製された前記テンプレートベクターとを、ＸｈｏＩ制限酵素及びＮｈｅＩ制限酵素で切断した後、その産物をＤＮＡリガーゼを利用して連結した。その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の構造を含むベクターを作製した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列は、配列番号２２～３３のそれぞれの５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列を示す。前記３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列は、配列番号１０９～１１５のそれぞれの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列は、配列番号４２～４８のそれぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体のアミノ酸配列を示す。

【0126】

（４）連続されたアデニンヌクレオチドの連結
（３）で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列の構造を含むベクターにおいて、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の３’末端部分に連続されたアデニンヌクレオチド配列を連結した。

【0127】

配列番号４１の連続されたアデニレート配列において、５’末端と３’末端とにそれぞれＮｈｅＩ配列とＥｃｏＲＩ配列とが追加されたポリアデニレートの合成を介して得た。確保された配列と、テンプレートベクターとを、ＮｈｅＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素でそれぞれ切断し、切断された産物をＤＮＡリガーゼを使用して連結した。

【0128】

その結果、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ポリＡの構造を含むベクターを作製した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列については、前述の通りある。また、ポリＡは、配列番号４１のヌクレオチド配列を有する。

【0129】

図１は、作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングするｍＲＮＡを生産するためのベクターを示した図面である。

【0130】

実施例４：非天然型５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）配列及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）配列を使用した遺伝子産物の生産
実施例３で作製された５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をコーディングする配列－ポリＡの構造を含むベクターを大腸菌に導入し、形質転換された大腸菌を得て、得られた大腸菌を培養し、ｍＲＮＡのテンプレートになるプラスミドＤＮＡを含んでいる大腸菌を増殖させた。増殖された大腸菌は、高速遠心分離を介して培養液と分離された後、既存に知られているアルカリ抽出法を使用し、細胞由来テンプレートＤＮＡを確保した。確保されたテンプレートＤＮＡは、ポリＡ末端に位置した制限酵素認識配列を利用して線形化した。線形化された細胞由来テンプレートＤＮＡを利用し、インビトロ転写を介し、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列－３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）－ポリＡのヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを生産した。ここで、前記５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、ポリＡ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体をコーディングする配列については、前述の通りである。

【0131】

具体的には、線形化されたプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ／μｌ、CleanCap（Ｒ） Reagent AG ４ｍＭ、ＮＴＰ５ｍＭ、Ｎ１－メチルシュードユリジン５ｍＭ、マグネシウムイオン塩２０ｍＭ、ＤＴＴ１０ｍＭ、無機ピロリン酸分解酵素（inorganic pyrophosphatase (PPase)）０．０１Ｕ／μｌ、及びＲＮＡ分解酵素抑制剤１Ｕ／μｌを含む水性溶液に、Ｔ７ＲＮＡ重合酵素５Ｕ／μｌを添加し、得られた反応混合物を３７℃で１時間以上インキュベーションし、インビトロ転写反応が進められるようにした。CleanCap^（Ｒ） Reagent AGは、ｍＲＮＡの転写と同時キャッピング（co-transcriptional capping）のための試薬として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧキャップ構造が形成されるようにする。反応物をＤＮＡ分解酵素で処理し、Monarch（Ｒ） RNA Cleanup Kit（New England Biolabs社）を介してＲＮＡを精製した。その結果、配列番号６３～７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを生産した。それらｍＲＮＡに含まれた５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはその変異体配列、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、及びポリＡのヌクレオチド配列構成は、以下の表１の通りである。

【0132】

【表1】

【0133】

図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、生産されたｍＲＮＡにおいて、配列番号６７，７０及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを、クロマトグラフィを介して分析した結果を示した図面である。図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃにおいて、最大のピークが、それぞれ配列番号６７，７０及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡを示す。図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示されているように、配列番号６７，７０及び７６のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡの純度は、それぞれ８３．０％、８１．９％及び８３．１％であった。

【0134】

実施例５：遺伝子産物ｍＲＮＡがローディングされたリピッドナノ粒子の製造
イオン化可能な脂質として、ＡＬＣ－０３１５、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)）（BLDpharm Ltd.（中国））、リン脂質として、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ：distearoylphosphatidylcholine）（Avanti（米国））、コレステロールとして、Synthechol（Ｒ）（Sigma（米国））、脂質ＰＥＧ-接合体として、ALC-0159, 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide（SINOPEG（中国））を、４６．３：９．４：４２．７：１．６のモル比でエチルアルコールに溶かし、脂質複合体溶液を準備した。

【0135】

実施例４で作られたｍＲＮＡ０．３ｍｇを、１００ｍＭ酢酸ナトリウムに、０．０８ｍｇ／ｍＬになるように希釈させ、ｍＲＮＡ含有溶液を得た。得られたｍＲＮＡ溶液と、前記脂質複合体溶液とを、ｍＲＮＡと脂質複合体との重量比１：２５．４になるように、５：１の体積比で、マイクロ流体装置（microfluidic device）（Ignite Nanoassemblr（ＰＮＩ）（カナダ））のそれぞれのマイクロチャネルに、１２ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入させ、ｍＲＮＡ溶液と前記脂質複合体溶液とを混合させた。前記混合により、脂質複合体溶液中のエチルアルコールは、臨界エタノール濃度（critical ethanol concentration）に希釈され、ｍＲＮＡローディングされた脂質ナノ粒子が形成されることになる。該マイクロ流体装置は、２個のマイクロチャネルが収束されて形成されたマイクロチャネルを含み、１つのマイクロチャネルに、ｍＲＮＡ溶液を流し込み、他のマイクロチャネルに、脂質複合体溶液を流し込み、２つの溶液を流しつつ混合されるようにする装置である。該マイクロ流体装置のマイクロチャネルを介して溶出された混合物は、ｍＲＮＡがローディングされた脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡＬＮＰ（loaded lipid nanoparticle））である。

【0136】

製造されたｍＲＮＡローディングされたリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）を１０，０００Ｄａの遠心分離フィルタに積載し、０．４５ｍＭ塩化カリウム、０．２４ｍＭ一塩基性リン酸カリウム、２０．５３ｍＭ塩化ナトリウム、１．３１ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム及び２％スクロース（ｐＨ６．９～７．９）含有バッファでバッファ交換をさせた。その後、前記バッファにおいて、ｍＲＮＡローディングされたリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）溶液を、０．２μｍフィルタで濾過し、最終ｍＲＮＡローディングされたリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）を製造した。

【0137】

実施例６：脂質ナノ粒子の特性確認
（１）脂質ナノ粒子のカプセル化効率の確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡローディングされたリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）（以下、「ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」ともする）のローディングまたはカプセル化効率（encapsulation efficiency（％））は、Quant-iT RiboGreen RNA Kit（Invitrogen（米国））を、製造社の指針に従って使用して確認した。具体的には、前記キット中のTriton Ｘと、ｍＲＮＡローディングされたリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）とを混合し、リピッドナノ粒子（ＬＮＰ）を変性させ、ｍＲＮＡが放出されるようにした。前記混合溶液を、Ribogreen試薬が含まれたウェルに添加し、Ribogreen試薬から放出される蛍光を検出し、放出されたｍＲＮＡを検出した。カプセル化効率は、下記数式によって計算した。

【0138】

カプセル化効率（％）＝（Triton Ｘで処理したリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）の蛍光度－Triton Ｘで処理していないリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）の蛍光度）／（Triton Ｘで処理したリピッドナノ粒子（ＬＮＰ）の蛍光度）ｘ１００

【0139】

【表2】

【0140】

表２に示しれているように、野生型Ｓ、デルタＳ及びオミクロンＳｍＲＮＡ－ＬＮＰは、高いカプセル化効率でもってｍＲＮＡをローディングしていることを確認した。

【0141】

（２）脂質ナノ粒子の大きさ確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズと多分散指数（ＰＤＩ：polydispersity index）とを、Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments（イギリス））を利用して確認した。該Zetasizerは、動的光散乱技術を利用し、粒子サイズと粒度分布とを定める装置である。表３は、粒子サイズと多分散指数との測定結果を示した表である。

【0142】

【表3】

【0143】

表３に示されているように、野生型Ｓ、デルタＳ及びオミクロンＳｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズは、８０ｎｍ～１００ｎｍの範囲であった。

【0144】

実施例７：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現確認
実施例５で製造されたｍＲＮＡ含有脂質ナノ粒子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に伝達し、ｍＲＮＡ発現を確認した。そのために、以下のように、試験管内（in vitro）実験を進めた。

【0145】

６ウェルプレートに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ｘ１０^５cells／２ｍＬ／ウェルにシーディング（seeding）した後、２４時間後、脂質ナノ粒子それぞれを、０．５μｇあるいは２μｇ添加し、２４時間培養した。該培養は、培地において３７℃で行った。該培養の終了後、破裂バッファ（lysis buffer）、Ｍ－ＰＥＲ^ＴＭ（Mammalian Protein Extraction Reagent）（ＣａｔＮｏ．７８５０１（Thermo Scientific^ＴＭ））１６０μｌ／ウェルをウェルに添加して細胞を破裂させ、タンパク質を抽出した後、Pierce^ＴＭ BCA Protein Assay Kit（ＣａｔＮｏ．２３２２５（（Thermo Scientific^ＴＭ）））を使用し、ＢＣＡタンパク質定量を実施した。得られた試料を、破裂バッファ及び５ｘ還元染料（reducing dye）（１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、０．５％２－メルカプトエタノール、２５０ｍＭｔｒｉｓｐＨ６．８）で希釈し、タンパク質濃度を同一にした。得られた希釈された試料に対し、Anti-SARS-CoV-2 Spike S1 Subunit monoclonal antibody（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＣａｔＮｏ．ＭＡＢ１０５４０３）を利用し、ウェスタンブロット（western blot）実験を行った。

【0146】

図３は、生産されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが細胞に導入される場合、スパイクタンパク質が発現するところを、ウェスタンブロット（western blot）を介して確認した結果を示す図面である。図３に示されているように、Ｓタンパク質は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ処理濃度上昇により、発現が増大した。

【図1】