特表 2024-528537 等電点電気泳動に基づく分画と質量分析との組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-30

(54)【発明の名称】等電点電気泳動に基づく分画と質量分析との組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240723BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240723BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240723BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N27/62 X

G01N33/68

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580708

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2024-01-05

(86)【国際出願番号】 US2022035602

(87)【国際公開番号】W WO2023278634

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/217,125

(32)【優先日】2021-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/301,350

(32)【優先日】2022-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユエティエン

(72)【発明者】

【氏名】シン タオ

(72)【発明者】

【氏名】ワン シュンハイ

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA10

2G041FA11

2G041FA12

2G041HA01

2G045DA37

2G045FA34

2G045FB06

4H045AA11

4H045AA30

4H045AA50

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

4H045FA70

4H045GA21

4H045GA32

(57)【要約】

本発明は、概して、関心対象のタンパク質の電荷バリアントを特徴付ける方法に関する。特に、本発明は、キャピラリー等電点電気泳動によって分離された電荷バリアントを同定するための、脱塩サイズ排除クロマトグラフィー－還元ペプチドマッピング質量分析の使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

関心対象のタンパク質の電荷バリアントを特徴付けるための方法であって、
（ａ）関心対象のタンパク質の電荷バリアントを分離するために、前記関心対象のタンパク質を含む試料をキャピラリー等電点電気泳動に供することと、
（ｂ）前記キャピラリー等電点電気泳動のステップから画分を収集することと、
（ｃ）前記画分を脱塩サイズ排除クロマトグラフィーに供することと、
（ｄ）前記関心対象のタンパク質の前記電荷バリアントを特徴付けるために、ステップ（ｃ）からの溶出液を質量分析に供することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、又はタンパク質医薬製品である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記キャピラリー等電点電気泳動が、撮像キャピラリー等電点電気泳動である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記脱塩サイズ排除クロマトグラフィーシステムが、前記質量分析計に連結されている、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記質量分析が、インタクト質量分析又は還元ペプチドマッピング分析を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記質量分析計が、多重反応モニタリング又は並行反応モニタリングを実施することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

脱塩サイズ排除クロマトグラフィーの前に、前記画分を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの加水分解剤が、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ及びＡｒｇＣからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

脱塩サイズ排除クロマトグラフィーの前に、前記画分を少なくとも１つの還元剤に接触させるステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記脱塩サイズ排除クロマトグラフィーが、ネイティブ条件下で行われる、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２１７，１２５号及び２０２２年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／３０１，３５０号の優先権及び利益を主張し、その各々が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本出願は、治療用タンパク質の電荷バリアントの特徴付けのための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
治療用ペプチド及びタンパク質のドメイン特異的バリアントを含む生物物理学的特性は、それらの安全性、有効性及び貯蔵寿命に影響を及ぼす可能性がある。例えば、異なる電荷バリアントの存在は、タンパク質の溶解性、結合、及び安定性を変化させる可能性がある。

【0004】

抗体などの治療用ペプチド又はタンパク質は、種々の翻訳後修飾（ＰＴＭ）、タンパク質分解、酵素修飾、及び化学修飾に起因して、異なるバリアントを獲得し、不均一になる場合がある。生物物理学的特性に対するこれらの変化は、ペプチド及びタンパク質の産生中及び産生後のほぼ任意の時点で起こり得る。生物物理学的特徴に対するこれらの変化は、治療用ペプチド及びタンパク質の安全性、有効性、及び貯蔵寿命に影響を及ぼす可能性があるため、特定の治療用ペプチド又はタンパク質に対する異なるバリアントを同定すること、更に、電荷バリアントの原因となる修飾を調べることが重要である。

【0005】

等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、電荷（ｐＩ）に基づいて試料の成分を分離し、それにより、タンパク質の電荷バリアントの分離を可能にするための一般的なツールになっている。ＩＥＦ分析はまた、各電荷バリアントに関連するタンパク質についての更なる情報を得るために、質量分析（ＭＳ）と組み合わせることができる。しかしながら、従来の方法は、ＩＥＦ－ＭＳ分析において使用され得る技術では制限されている。今日まで、高分解能で、狭いＩＥＦ画分の還元ペプチドマッピング分析を実施することは不可能であった。したがって、特定の電荷バリアントに関連する特定のタンパク質修飾の部位、例えばアミノ酸残基を同定することは可能ではなかった。

【0006】

したがって、電荷バリアントに関連する治療用タンパク質の修飾を具体的に特徴付けるための方法及びシステムの必要性が存在することが理解されるであろう。

【発明の概要】

【0007】

概要
関心対象のタンパク質の電荷バリアントの特徴付けのための方法が開発されている。例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質を含む試料は、キャピラリー等電点電気泳動分析に供される。電荷バリアントに対応するＵＶピークを含む、タンパク質試料のＵＶトレースが生成される。試料の画分が等電点電気泳動後に収集される。画分は、等電点電気泳動ステップからの全試料出力を表すように高スループットの方法で収集され得、狭い間隔、例えば、１５秒間隔を含み得る。質量分析に適合するように画分緩衝液を変更することに加えて、分析物をサイズによって分離する脱塩サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、画分は更に処理される。最後に、脱塩サイズ排除クロマトグラフィーからの溶出液を質量分析に供し、これを使用して、各画分、したがって各電荷バリアントに対応する特定の翻訳後修飾を同定することができる。

【0008】

本開示は、関心対象のタンパク質の電荷バリアントの特徴付けのための方法を提供する。一部の例示的な実施形態では、方法は、（ａ）関心対象のタンパク質を含む試料をキャピラリー等電点電気泳動に供して、当該関心対象のタンパク質の電荷バリアントを分離することと、（ｂ）当該キャピラリー等電点電気泳動ステップから画分を収集することと、（ｃ）当該画分を脱塩サイズ排除クロマトグラフィーに供することと、（ｄ）ステップ（ｃ）からの溶出液を質量分析に供して、当該関心対象のタンパク質の当該電荷バリアントを特徴付けることと、を含む。

【0009】

一態様では、当該タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、又はタンパク質医薬製品である。別の態様では、当該キャピラリー等電点電気泳動は、撮像キャピラリー等電点電気泳動である。更に別の態様では、当該脱塩サイズ排除クロマトグラフィーシステムは、当該質量分析計に連結されている。

【0010】

一態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である。別の態様では、当該質量分析は、インタクト質量分析又は還元ペプチドマッピング分析を含む。更に別の態様では、当該質量分析計は、多重反応モニタリング又は並行反応モニタリングを実施することができる。

【0011】

一態様では、方法は、脱塩サイズ排除クロマトグラフィーの前に、当該画分を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを更に含む。特定の態様では、当該少なくとも１つの加水分解剤は、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ及びＡｒｇＣからなる群から選択される。

【0012】

一態様では、方法は、脱塩サイズ排除クロマトグラフィーの前に、当該画分を少なくとも１つの還元剤に接触させるステップを更に含む。別の態様では、当該脱塩サイズ排除クロマトグラフィーは、ネイティブ条件下で行われる。

【0013】

本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、種々の実施形態及びその多数の具体的詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。本発明の範囲内で、多くの置換、変更、追加、又は再配置を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】例示的な実施形態による本発明の方法のワークフローを示す。

【図2A】例示的な実施形態による、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって検出されたＵＶトレースからのピークと、脱塩サイズ排除クロマトグラフィー－質量分析（ＳＥＣ－ＭＳ）からの対応するピークとの相関を示す。

【図2B】例示的な実施形態による、脱塩ＳＥＣ－ＭＳ及び対応するｃＩＥＦピーク及び画分によって同定された電荷バリアントを示す。

【図3A】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された主なＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図3B】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出されたＢ１ ＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図3C】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出されたＢ２ ＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図3D】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出されたＡ１ ＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図3E】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出されたＡ２ ＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図3F】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出されたＡ３ ＵＶピークに対応する、脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された電荷バリアントの、デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、還元ペプチドマッピングスペクトルを示す。

【図5A】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、複数のアミノ酸残基におけるアスパラギン酸異性化の分布を示す。

【図5B】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、複数のアミノ酸残基におけるアスパラギン酸環化の分布を示す。

【図5C】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、複数のアミノ酸残基におけるアスパラギン脱アミド化の分布を示す。

【図5D】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、複数のアミノ酸残基におけるアスパラギンスクシンイミドの分布を示す。

【図5E】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、複数のアミノ酸残基におけるリジン糖化の分布を示す。

【図5F】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、各重鎖におけるＣ末端リジンの分布を示す。

【図5G】例示的な実施形態による、ｃＩＥＦによって検出された各ＵＶピークについての、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分布を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

詳細な説明
哺乳動物細胞において産生される治療用抗体（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を含む）は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、酵素修飾及び化学修飾の結果として不均一であり、これらは、サイズ及び電荷のバリアントに寄与する。これらの修飾には、例えば、グリコシル化、脱グリコシル化、アミド化、脱アミド化、酸化、糖化、末端環化、Ｃ末端リジン変異、Ｃ末端アルギニン変異、Ｎ末端ピログルタミン酸変異、Ｃ末端グリシンアミド化、Ｃ末端プロリンアミド化、スクシンイミド形成、シアリル化、又は脱シアリル化が含まれ得る。更に、タンパク質産物の凝集、分解、変性、断片化、又は異性化もまた、電荷の不均一性を導入する可能性がある。表１は、例示的なタンパク質修飾、及びペプチド又はタンパク質の電荷の変化に対するそれらの影響を示している。

【0016】

【表1】

【0017】

モノクローナル抗体などの治療用ペプチド又はタンパク質の製造中に、電荷の不均一性が、タンパク質分解及び／又はＰＴＭの存在の結果として導入される可能性がある。効力などのタンパク質の特性と電荷バリアントに関連する物理的及び化学的変化との間の相関を完全に理解するために、製造された原薬内のタンパク質の電荷バリアント形態の特徴付けが必要である。

【0018】

イオン交換クロマトグラフィー及び等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含む、タンパク質電荷バリアントの分離を可能にする複数の方法が存在する。ＩＥＦは、ｐＩに基づく試料成分の高分解能分離のためのそのキャパシティ、及び疎水性相互作用に起因する分解能の喪失を伴わずに表面露出アミノ酸及び内部アミノ酸の両方を考慮するその能力のため、より一般的な手法となっている。ＩＥＦ、特にキャピラリーＩＥＦ（ｃＩＥＦ）はまた、タンパク質試料に関する更なる情報を得るために、質量分析（ＭＳ）と組み合わせることができる。しかしながら、ｃＩＥＦ及びＭＳに使用される緩衝液は、直ちに適合するわけではなく、このことは、ＭＳ分析のためにｃＩＥＦによって分離された試料を使用する際に困難を生じる。この問題を解決するために、ＭＳへのオフライン接続又はオンライン接続のいずれかを使用する、２つの主な手法が取られている。

【0019】

オフライン接続を使用する場合、ｃＩＥＦからの画分を収集し、ＭＳに適合するように緩衝液を変更し、変更された画分をＭＳ分析に供する。しかしながら、ｃＩＥＦからの画分収集は、低スループットであり、少数の大きな画分が収集されることになり、電荷バリアント分析の分解能及び特異性を低下させる。

【0020】

あるいは、オンライン接続が使用され得、画分収集ステップを伴わずに、分離された試料をｃＩＥＦからＭＳに出力する。これは、ｃＩＥＦ分析とＭＳ分析との間で試料緩衝液を変更するために、中間のオンラインステップ（例えば、暫定的なクロマトグラフィー又は透析）を必要とする。このオンライン接続は、ｃＩＥＦの高分解能分離を維持するが、ｃＩＥＦで分離された試料の別の処理、例えば、関心対象のタンパク質の消化又は還元が可能でないため、インタクトな質量分析に限定される。

【0021】

したがって、関心対象のタンパク質の電荷バリアントを、柔軟かつ高分解能の方法で特徴付けるための方法及びシステムが必要とされている。特に、電荷バリアントに関連する部位特異的タンパク質修飾を同定する方法が必要とされている。

【0022】

本開示は、関心対象のタンパク質の電荷バリアントに関連する部位特異的タンパク質修飾を同定するための新規な方法を示す。この方法は、ＭＳへのオフライン接続を有するｃＩＥＦを使用する。以前の手法とは異なり、ｃＩＥＦ画分は、包括的かつ高スループットな方法で収集され、例えば、ｃＩＥＦキャピラリーからの全ての出力を収集し、各々が１５秒間隔を表す画分に分離される。この新規の高スループットの画分収集は、ｐＩ分解能の実質的な喪失を伴わずに、ｃＩＥＦ分離された試料のオフライン処理を可能にする。収集された画分は、例えば、それらを加水分解剤及び／又は還元剤と接触させて、還元ペプチドマッピング分析のための還元ペプチドを生成することによって、更に処理することができる。収集された画分は、ユーザの必要性に従って種々の処理ステップに供されてもよいし、又は例えば、インタクトな質量分析のために使用される場合は、処理ステップに供されなくてもよい。

【0023】

次いで、収集した画分を、例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，３１：２１７１－２１７９に記載されているような脱塩サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に個々に供する。この高スループット脱塩ＳＥＣ法は、画分の効率的な処理、サイズによる試料成分の更なる分離、並びにＭＳに適合するように画分緩衝液を変更することを可能にする。脱塩ＳＥＣシステムは、質量分析計にオンライン接続することができる。

【0024】

脱塩ＳＥＣから出力された画分は、ＭＳ分析、例えばインタクト質量分析又は還元ペプチドマッピング分析に供される。ＭＳ分析は、分析物の断片を生成し、質量対電荷（ｍ／ｚ）比に基づいてそれらを分離する。この分離は、ＰＴＭなどのタンパク質に対する修飾の同定を可能にする。特に、還元ペプチドマッピング分析の分解能は、ＰＴＭの部位特異的同定、例えば、関心対象のタンパク質上の特定のアミノ酸残基における特定の化学変化の同定を可能にする。次いで、既知のｃＩＥＦ画分から生じる同定された部位特異的修飾は、関心対象のタンパク質の特定の電荷バリアントと関連付けられ得る。この方法は、電荷バリアントを生じさせる部位特異的タンパク質修飾の高分解能、高スループット分析を可能にし、タンパク質の生物物理学的特徴及び均一性を検証及び最適化するための治療用タンパク質産生プロセスのモニタリング及び改善を可能にする。

【0025】

別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料が、実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料がここで記載される。

【0026】

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって理解されるように、標準偏差を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、終点が含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

【0027】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「関心対象のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、当技術分野で一般的に「ポリペプチド」として知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結された、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びその合成の天然に存在しないアナログから構成されるポリマーをいう。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドをいう。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。種々の固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ又は複数のポリペプチドを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。関心対象のタンパク質は、生物学的治療用タンパク質、研究又は治療において使用される組換えタンパク質、捕捉タンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体のいずれかを含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア属の種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、及び哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの、組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物学的治療用タンパク質及びそれらの産生を議論する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合部分を含む。これらの修飾、付加物及び部分としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の色素などが挙げられる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類することができ、したがって、球状タンパク質及び繊維状タンパク質などの単純タンパク質と、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートされたタンパク質と、一次由来タンパク質及び二次由来タンパク質などの由来タンパク質と、を含むことができる。

【0028】

一部の例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ及びそれらの組み合わせであり得る。

【0029】

本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞に導入された組換え発現ベクター上に保有される遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されるタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、抗体分子は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１）であるか、あるいは抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。

【0030】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。本発明の異なる実施形態では、抗ビッグＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、又は遺伝子操作された、ポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解消化又は抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準技術を使用して、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは公知であり、及び／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に又は分子生物学技術を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を修飾する、付加する、若しくは欠失させることなどができる。

【0031】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部（例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域）を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え一本鎖ポリペプチド分子である。一部の例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、一部の例示的な実施形態では、断片は、親抗体の親和性に匹敵する親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に産生されてもよく、及び／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって産生されてもよい。あるいは、又は更に、抗体断片は、完全に又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含み得る。あるいは、又は更に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。

【0032】

「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、一般的に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、一般的に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁又は３桁又は４桁低く、逆もまた同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）に存在し得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そしてかかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞において発現され得る。

【0033】

典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲ、続いてＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖、並びに抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合することができるか、又は各重鎖と会合することができかつ重鎖抗原結合領域によって結合されるエピトープのうちの１つ以上に結合することができるか、又は各重鎖と会合することができかつ重鎖の一方若しくは両方が一方若しくは両方のエピトープに結合することを可能にするかのいずれかである免疫グロブリン軽鎖を有する。ｂｓＡｂは、Ｆｃ領域を有するもの（ＩｇＧ様）及びＦｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分けることができ、後者は通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、トリオマブ、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワン若しくはデュアルアクションＦａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディなどであるがこれらに限定されない、異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式には、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体が含まれる（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ＆Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ＆ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）。ｂｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的結合、及び組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝学的手法に限定されない。ｂｓＡｂの例としては、参照により本明細書に組み込まれる、以下の特許出願、すなわち２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、及び２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号に開示されているものが挙げられる。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）が、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの更なる特異性を有する抗体もまた、本明細書に開示されるシステム及び方法によって対処することができる。

【0035】

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンから得ることができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。

【0036】

一部の例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。１つの例示的な特定の実施形態では、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、又は約９．０であり得る。一部の例示的な実施形態では、組成物中の関心対象のタンパク質のタイプは、２つ以上であり得る。

【0037】

一部の例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、哺乳動物細胞から産生され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源又は非ヒト起源であり得、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、樹立細胞株及びそれらの株（例えば、２９３胎児腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞又はその誘導体）、任意の組織又は器官（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）を含むが、これらに限定されない）由来の線維芽細胞、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ミディ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びジェンセン細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞又はその誘導体）を含み得る。

【0038】

一部の例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質を含む試料は、脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析の前に調製することができる。調製ステップは、アルキル化、還元、変性、及び／又は消化を含むことができる。

【0039】

本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語は、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン、又はそれらの組み合わせである。

【0040】

本明細書で使用される場合、「タンパク質変性」は、分子の三次元形状がその天然状態から変化するプロセスを指し得る。タンパク質の変性は、タンパク質変性剤を用いて行うことができる。タンパク質変性剤の非限定的な例としては、熱、高ｐＨ若しくは低ｐＨ、ＤＴＴのような還元剤（以下を参照のこと）、又はカオトロピック剤への曝露が挙げられる。複数のカオトロピック剤をタンパク質変性剤として使用することができる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することによって、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例としては、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が挙げられる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元のために使用される薬剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、又はそれらの組み合わせである。

【0042】

本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化を行うための複数の手法（例えば、酵素的消化又は非酵素的消化）が存在する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のいずれかを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）若しくは外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ又はそれらの生物学的に活性な断片若しくはホモログ又はそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク消化のための利用可能な技術を記載する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。

【0044】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「電荷バリアント」又は「バリアント」という用語は、関心対象のタンパク質の参照又は天然アミノ酸配列と少なくとも約７０～９９．９％（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９％）同一又は類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。配列比較は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実施することができ、ここで、アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致を与えるように選択される（例えば、期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大マッチ：０；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス；ギャップコスト：存在１１、拡張１；条件付き組成スコアマトリックス調整）。ポリペプチドのバリアントはまた、例えば、ミスセンス変異（例えば、保存的置換）、ナンセンス変異、欠失、又は挿入などの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）の変異を除いて、参照されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し得る。以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する。ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳＪ．２７２（２０）：５１０１－５１０９、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６、Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３、Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５－３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３－３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７、Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７）ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．；これらの全教示は、本明細書に組み込まれる。

【0045】

一部のバリアントは、ポリペプチドがそれらのリボソーム合成の間（同時翻訳修飾）又は後（翻訳後修飾「ＰＴＭ」）のいずれかに受ける共有結合修飾であり得る。ＰＴＭは一般的に、特定の酵素又は酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（例えば、シグネチャー配列）の部位に存在する。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、タンパク質の構造又は機能の何らかの側面に常に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３、その全教示は本明細書に組み込まれる）。

【0046】

特定の例示的な実施形態では、タンパク質組成物は、関心対象のタンパク質の１つより多くの型のバリアントを含み得る。かかるバリアントは、酸性種及び塩基性種の両方を含み得る。酸性種は、典型的には、ＣＥＸからのメインピークよりも早く、又はＡＥＸからのメインピークよりも遅く溶出するバリアントであり、塩基性種は、ＣＥＸからのメインピークよりも遅く、又はＡＥＸからのメインピークよりも早く溶出するバリアントである。例示的な実施形態では、塩基性種は、ｃＩＥＦからのメインピークよりも早く溶出し得、酸性種は、ｃＩＥＦからのメインピークよりも遅く溶出し得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「酸性種」、「ＡＳ」、「酸性領域」及び「ＡＲ」という用語は、全体的な酸性電荷によって特徴付けられるタンパク質のバリアントを指す。

【0048】

特定の実施形態では、試料は、１つより多くのタイプの酸性種バリアントを含み得る。例えば、限定するものではないが、総酸性種は、出現するピークのクロマトグラフィー保持時間に基づいて、又はＩＥＦを使用して生成されるＵＶピークによって分類することができる。

【0049】

酸性又は塩基性種の原因となる化学分解経路の中で、タンパク質及びペプチドにおいて生じる２つの最もよく観察される共有結合修飾は、脱アミノ化及び酸化である。メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンは、最も酸化を受けやすいアミノ酸の一部である。Ｍｅｔ及びＣｙｓはそれらの硫黄原子が理由であり、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒはそれらの芳香環が理由である。

【0050】

本明細書で使用される場合、「酸化種」、「ＯＳ」、又は「酸化バリアント」という用語は、酸化によって形成されるタンパク質のバリアントを指す。かかる酸化種は、イオン交換、例えば、ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱陽イオン交換クロマトグラフィー）、又はＩＥＦなどの種々の方法によっても検出することができる。酸化バリアントは、ヒスチジン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン及び／又はチロシン残基で起こる酸化から生じ得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、「塩基性種」、「塩基性領域」、及び「ＢＲ」という用語は、タンパク質内に存在する一次電荷バリアント種と比較して、全体的な塩基性電荷を特徴とする、タンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合部分のバリアントを指す。例えば、組換えタンパク質調製物において、かかる塩基性種は、種々の方法（例えば、イオン交換（例えば、ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱陽イオン交換クロマトグラフィー））又はＩＥＦ）によって検出され得る。例示的なバリアントには、リジンバリアント、アスパラギン酸の異性化、アスパラギンでのスクシンイミド形成、メチオニン酸化、アミド化、不完全なジスルフィド結合形成、セリンからアルギニンへの変異、非グリコシル化、断片化及び凝集が含まれ得るが、これらに限定されない。通常、塩基性種は、ＣＥＸ中のメインピークより遅く溶出するか、又はＡＥＸ分析中のメインピークより早く溶出する。（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ．２０１２ Ｓｅｐ １；４（５）：５７８－５８５．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２１３２８、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0052】

特定の実施形態では、試料は、２つ以上のタイプの塩基性種バリアントを含むことができる。例えば、限定するものではないが、全塩基性種は、出現するピークのクロマトグラフィー保持時間に基づいて、又はＩＥＦを使用して生成されるＵＶピークに基づいて分割することができる。全基本種が分割され得る別の例は、バリアント － 複数のバリアント、構造バリアント、又は断片化バリアントの、タイプに基づき得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「試料」は、細胞培養流体（ＣＣＦ）、採取された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）、下流処理における任意のステップ、原薬（ＤＳ）、又は最終製剤化製品を含む製剤（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。一部の他の特定の例示的な実施形態では、試料は、清澄化、クロマトグラフィー生成、ウイルス不活性化、又は濾過の下流プロセスの任意のステップから選択され得る。一部の特定の例示的な実施形態では、製剤は、診療所、出荷、保管、又は取り扱いにおいて、製造された製剤から選択することができる。

【0054】

一部の態様では、開示される方法は、試料をキャピラリー等電点電気泳動に供して、当該関心対象のタンパク質の電荷バリアントを分離することを含み得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、「等電点電気泳動」又は「ＩＥＦ」（単に電気泳動としても知られる）は、荷電分子（通常、タンパク質又はペプチド）を、それらの等電点（ｐＩ）（例えば、分子が電荷を有さないｐＨ）に基づいて分離するための技術である。電場において、ｐＨ勾配中の分子がそれらのｐＩに向かって移動することが理由で、ＩＥＦが機能する。ＩＥＦを行うための種々の技術が存在する。例えば、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）において、試料は、印加された電場に基づいてキャピラリーを通って移動する。ＵＶ検出器は、キャピラリーに沿った点で使用されて、分析物（例えば、タンパク質）がキャピラリーのその点を横切る時間を検出し得る。キャピラリーを通る移動時間は、分析物の電荷（ｐＩ）に直接関連するため、経時的なキャピラリー中の点からのＵＶシグナルは、ＵＶトレースとして表され得、これは、試料成分の多様な電荷（ｐＩ）を表す。例示的な実施形態では、ｃＩＥＦによって生成されたＵＶトレースは、関心対象のタンパク質の電荷バリアントを表し、各ＵＶピークは、有意な電荷バリアントを表す。ｃＩＥＦの変形、例えば、撮像ｃＩＥＦ（ｉｃＩＥＦ）も使用することができる。

【0056】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はゲル濾過は、それらの分子サイズの関数としての成分の分離に依存する。分離は、流体中の時間と比較して、物質が多孔質固定相中で費やす時間の量に依存する。分子が細孔内に存在する確率は、分子及び細孔のサイズに依存する。更に、物質が細孔内に行き渡る能力は、高分子の拡散移動度によって決定され、この拡散移動度は、小さい高分子ほど高い。非常に大きな高分子は、固定相の細孔に全く行き渡らないことがあり、非常に小さな高分子については、行き渡る確率は１に近い。より大きな分子サイズの成分は、より迅速に固定相を通過するが、小さな分子サイズの成分は、固定相の細孔を通るより長い経路長を有し、したがって、固定相中に、より長く保持される。

【0057】

クロマトグラフィー材料はサイズ排除材料を含むことができ、サイズ排除材料は、樹脂又は膜である。サイズ排除のために使用されるマトリックスは、好ましくは、不活性ゲル媒体であり、これは、架橋多糖類（例えば、球状ビーズの形態の架橋アガロース及び／又はデキストラン）の複合体であり得る。架橋度は、膨潤したゲルビーズ中に存在する細孔のサイズを決定する。特定のサイズより大きい分子は、ゲルビーズに入らず、したがって、最も速くクロマトグラフィーベッドを通って移動する。界面活性剤、タンパク質、ＤＮＡなどのより小さい分子は、それらのサイズ及び形状に依存して種々の程度までゲルビーズに入り、ベッドを通過するのが遅れる。したがって、分子は、おおむね、分子サイズが減少する順序で溶出される。

【0058】

ウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適切な多孔性クロマトグラフィー樹脂は、異なる物理的特性を有するデキストロース、アガロース、ポリアクリルアミド、又はシリカから作製され得る。ポリマーの組み合わせも使用することができる。最もよく使用されるのは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている商品名「ＳＥＰＨＡＤＥＸ」のものである。異なる構築材料由来の他のサイズ排除支持体もまた適切であり、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５Ｆ（ポリメタクリレート、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｐａ．）及びＢｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－３０ Ｆｉｎｅ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）である。

【0059】

一部の例示的な実施形態では、ＳＥＣは、ネイティブＭＳ検出の前にオンライン緩衝液交換を達成するために、「脱塩モード」で操作され得る。脱塩は、水と（ＳＥＣ樹脂を予め平衡化するために使用される水とともに）交換して、試料から緩衝塩を除去するという目標を達成する。本発明の方法に好適な脱塩ＳＥＣ法は、例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，３１：２１７１－２１７９に記載されている。脱塩ＳＥＣは、ｃＩＥＦから溶出された試料のその後のＭＳ分析を可能にし、そうでなければ、適合しない緩衝液条件を有し得る。

【0060】

関心対象のタンパク質を含む試料のタンパク質負荷は、約５０ｇ／Ｌ～約１０００ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ～約１５０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの、カラムへの総タンパク質負荷に調整することができる。特定の実施形態では、ロードタンパク質混合物のタンパク質濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌの、カラム上にロードされる材料のタンパク質濃度に調整される。

【0061】

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し得そしてそれらの正確な質量を測定し得るデバイスを含む。この用語は、ポリペプチド又はペプチドが特徴付けられ得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、３つの主要部分、すなわち、イオン源、質量分析器、及び検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物原子、分子、又はクラスタは、気相に移動され、同時に（エレクトロスプレーイオン化におけるように）、又は別個のプロセスを通して、イオン化され得る。イオン源の選択は用途に依存する。一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、試料分子についての構造情報が、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって得られる技術を含む。必要条件は、第１の質量選択ステップの後に断片が予測可能かつ制御可能な方法で形成されるように、試料分子が気相に変換され、イオン化されることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、又はＭＳ^ｎは、意味のある情報を得ることができるか、又は断片イオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ^２）を選択及び単離すること、それを断片化すること、一次断片イオン（ＭＳ^３）を単離すること、それを断片化すること、二次断片（ＭＳ^４）を単離することなどによって実施され得る。タンデムＭＳは、広範な分析器の組み合わせを用いて正常に実施されている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、コスト、及び利用可能性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がスペース内で又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆体イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非捕捉質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、生成イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように設計され得る。タンデムインタイムの場合、イオン源で生成された質量分析計のイオンは、同じ物理的デバイスで捕捉、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用され得る。それらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質特徴付けのために使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特徴付けとしては、限定されるものではないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質シーケンシングの決定、タンパク質デノヴォシーケンシングの決定、翻訳後修飾の位置決定、若しくは翻訳後修飾の同定、若しくは同等性/同質性分析、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0062】

一部の例示的な態様では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレー又はナノスプレーを搭載し動作することができる。

【0063】

本明細書で使用される「ナノエレクトロスプレー」又は「ナノスプレー」という用語は、多くの場合、外部溶媒送達を使用しない、非常に低い溶媒流量、典型的には、数百ナノリットル／分以下の試料溶液におけるエレクトロスプレーイオン化を指す。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入セットアップは、静的ナノエレクトロスプレーエミッタ又は動的ナノエレクトロスプレーエミッタを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッタは、長期間にわたって少量の試料（分析物）溶液の連続分析を行う。動的ナノエレクトロスプレーエミッタは、キャピラリーカラム及び溶媒送達システムを使用して、質量分析計による分析の前に混合物に対してクロマトグラフィー分離を行う。

【0064】

一部の例示的な実施形態では、ＳＥＣ－ＭＳは、ネイティブ条件下で実施することができる。

【0065】

本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件」という用語は、分析物中の非共有結合性相互作用を保存する条件下で質量分析を行うことを含み得る。ネイティブＭＳについての詳細な総説については、総説Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅ－ｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ１１７６－１１９２（２０１５）を参照されたい。

【0066】

一部の例示的な態様では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、試料分子についての構造情報が、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって得られる技術を含む。必要条件は、試料分子が気相に移動され得、そしてインタクトなままイオン化され得ること、及びこれらの分子が、第１の質量選択ステップ後に、いくらかの予測可能かつ制御可能な方法でばらばらになるように誘導され得ることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、又はＭＳ^ｎは、意味のある情報を得ることができるか、又は断片イオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ^２）を選択及び単離すること、それを断片化すること、一次断片イオン（ＭＳ^３）を単離すること、それを断片化すること、二次断片（ＭＳ^４）を単離することなどによって実施され得る。タンデムＭＳは、広範な分析器の組み合わせを用いて正常に実施されている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、コスト、及び利用可能性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がスペース内で又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆体イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非捕捉質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、生成イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように設計され得る。タンデムインタイムの場合、イオン源で生成された質量分析計イオンは、同じ物理的デバイスで捕捉、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。

【0068】

質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用され得る。それらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質特徴付けのために使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特徴付けとしては、限定されるものではないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質シーケンシングの決定、タンパク質デノヴォシーケンシングの決定、翻訳後修飾の位置決定、若しくは翻訳後修飾の同定、若しくは同等性/同質性分析、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0069】

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、試料中に存在する可能性があるタンパク質配列の、編集されたコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、研究される種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公的データベースは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－ｐｒｏｔによって管理されるデータベースを含んでいた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール」と称されるものを使用して検索することができる。バイオインフォマティクスツールは、データベース中の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索するキャパシティを提供し、出力として解釈された（アノテーションされた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。

【0070】

一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、クロマトグラフィーシステム、例えば、ＳＥＣ又は脱塩ＳＥＣに連結される。

【0071】

本発明は、前述のタンパク質、抗体、ｐＩ、タンパク質アルキル化剤、タンパク質変性剤、タンパク質還元剤、消化酵素、加水分解剤、電荷バリアント、翻訳後修飾、試料、ＩＥＦシステム、ＳＥＣシステム、質量分析計、データベース、又はバイオインフォマティクスツールのいずれにも限定されず、任意のタンパク質、抗体、ｐＩ、タンパク質アルキル化剤、タンパク質変性剤、タンパク質還元剤、消化酵素、加水分解剤、電荷バリアント、翻訳後修飾、試料、ＩＥＦシステム、ＳＥＣシステム、質量分析計、データベース、又はバイオインフォマティクスツールは、任意の好適な手段によって選択され得ることが理解される。

【0072】

本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0073】

実施例１．本発明の方法の概要
関心対象のタンパク質の電荷バリアントを特徴付けるための新規な方法が、本明細書中に開示される。本発明の方法の例示的なワークフローを図１に示している。試料、例えば、治療用タンパク質産物又は任意の関心対象のタンパク質の生成ステップからの試料は、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）に供される。ｃＩＥＦは、関心対象のタンパク質の電荷バリアントを分離することを含めて、電荷（ｐＩ）に基づいてタンパク質試料の成分を分離する。ｃＩＥＦキャピラリーを横切る試料成分のＵＶトレースが生成され、タンパク質濃度の極大値は「ピーク」と考えられ、タンパク質電荷バリアントに対応する。画分はキャピラリーから連続的に収集される。画分は、ｃＩＥＦ溶出液の全てが収集されるように高スループット方法で収集され得、画分は、狭い間隔（例えば、１５秒間隔）を示す。この高スループット画分収集は、後のＭＳ分析のために質量分析計へのオンライン接続を必要とすることなく、ｃＩＥＦの高分解能分離の維持を可能にする。

【0074】

任意選択的に、画分は、加水分解剤、アルキル化剤及び／又は還元剤に接触されて、関心対象のタンパク質の還元ペプチド断片を生成し得る。画分は、分析の所望の濃度及び分解能に依存して、その後の分析の前に再び組み合わされ得る。

【0075】

次いで、画分を脱塩サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。脱塩ＳＥＣは、収集されたｃＩＥＦ画分からの緩衝液を、質量分析（ＭＳ）に適合する緩衝液と交換すること、及びサイズに基づいて画分成分を更に分離することの、二重の目的を果たす。

【0076】

最後に、脱塩ＳＥＣからの溶出液を、質量分析、例えば、インタクト質量分析又は還元ペプチドマッピング分析に供する。脱塩ＳＥＣは、質量分析計（脱塩ＳＥＣ－ＭＳ）とオンラインで接続されてもよい。特に、還元ペプチドマッピング分析は、電荷変動に寄与し得る部位特異的タンパク質修飾の同定を可能にする。同定されたタンパク質修飾は既知の画分から生じ、画分はｃＩＥＦ ＵＶトレースの既知の部分と一致するため、部位特異的タンパク質修飾とタンパク電荷バリアントとの間に因果関係をもたらすことができる。

【0077】

実施例２．タンパク質電荷バリアントのインタクトな質量分析
本発明の方法を用いて、二重特異性抗体ｂｓＡｂ－１を、ｃＩＥＦ、分画、及び脱塩ＳＥＣ－ＭＳのステップに供した。ｃＩＥＦによって生成されたＵＶトレース（赤色で示される）及び脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって生成されたＭＳシグナル（青色で示される）は、図２Ａに示されるように相関させることができる。６つのＵＶピーク（電荷バリアントに対応する）、すなわちＢ２、Ｂ１、メイン、Ａ１、Ａ２、及びＡ３（塩基性から酸性の順）を、このＵＶトレースに指定した。各青色ピークは、画分の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析を表す。

【0078】

ｃＩＥＦ画分の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析は、図２Ｂに示されるように、電荷バリアントに対する特定のタンパク質修飾の割り当てを可能にする。各脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析は既知の画分から生じ、各画分はＵＶトレースの既知の部分を表すため、ＭＳによって検出されるタンパク質修飾は、ｃＩＥＦによって検出される電荷バリアントと直接関連付けることができる。このようにして、関心対象のタンパク質の電荷バリアントの具体的な原因を明らかにすることができる。

【0079】

更なる分析を図３に示している。脱塩ＳＥＣ－ＭＳによって検出された、ｂｓＡｂ－１の各電荷バリアントについてのデコンボリューションされた質量スペクトルが示され、各々が、特定のタンパク質修飾で同定され得る種々のｍ／ｚピークを特徴とする。図３Ａは、主要な電荷バリアントと、主要なｍＡｂ種を表すピークとを示している。図３Ｂは、Ｂ１電荷バリアントと、Ｃ末端リジンを有する種を表すピークとを示している。図３Ｃは、Ｂ２電荷バリアントと、２つのＣ末端リジンを有する種を表すピークとを示している。図３Ｄは、Ａ１電荷バリアントと、糖化修飾を有する種を表す１つのピークと、脱アミド化修飾を有する種を表す１つのピークとを示している。図３Ｅは、Ａ２電荷バリアントと、糖化／グルクロニル修飾を有する種を表す１つのピークと、脱アミド化修飾を有する種を表す１つのピークと、Ｎ－アセチルノイラミン酸修飾を有する種を表す１つのピークとを示している。図３Ｆは、Ａ３電荷バリアントと、糖化／グルクロニル修飾を有する種を表す１つのピークと、脱アミド化修飾を有する種を表す１つのピークと、及び２つのＮ－アセチルノイラミン酸修飾を有する種を表す１つのピークとを示している。

【0080】

これらの実験は、脱塩ＳＥＣ－ＭＳを使用して、ｃＩＥＦによって検出された電荷バリアントに対応し、その原因となる特定のタンパク質修飾を決定する本発明の方法のキャパシティを実証するものである。

【0081】

実施例３．タンパク質電荷バリアントの還元ペプチドマッピング分析
本発明の方法はまた、関心対象のタンパク質の特定の残基でのタンパク質修飾を同定し、そしてこれらの部位特異的修飾をタンパク質の電荷バリアントと関連付けるために、還元ペプチドマッピング分析とともに使用され得る。二重特異性抗体ｂｓＡｂ－１を、以前に記載されたように、ｃＩＥＦ、分画、及び脱塩ＳＥＣ－ＭＳのステップに供した。画分をタンパク質還元及び加水分解に供した後、脱塩ＳＥＣに供して、還元ペプチド断片を生成した。

【0082】

ｃＩＥＦによって検出された各電荷バリアントに対応する例示的なＭＳシグナルを図４に示している。ペプチドマッピングを用いてペプチドを分析し、図５に示すように、特定の残基での特定のタンパク質修飾を同定した。この方法を使用して、特定のアミノ酸残基におけるタンパク質修飾の電荷バリアントにわたる統計的分布を確立することができた。図５Ａ～図５Ｇは、アスパラギン酸異性化、アスパラギン酸環化、アスパラギン脱アミド化、アスパラギンスクシンイミド、リジン糖化、Ｃ末端リジン、又はＮ－アセチルノイラミン酸を含む、電荷バリアントをもたらし得る例示的な修飾を示している。特定の修飾残基は、ｂｓＡｂ－１の軽鎖（ＬＣ）、第１の重鎖（ＨＣ）又は第２の重鎖（ＨＣ＊）にわたって同定される。

【0083】

これらの実験は、本発明の方法が、関心対象のタンパク質の特定の電荷バリアントを生じ得る特定のタンパク質修飾についてのアミノ酸残基レベル分解能を提供するキャパシティを実証する。この情報は、例えば、許容可能な生物物理学的特性及び産物の均一性を達成するために、治療用タンパク質の生成プロセスをモニタリング及び／又は修飾するために使用され得る。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【国際調査報告】