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特表2024-528623質量分析計およびプロセッシング手段に接続した液体分離装置を用いたペプチドの同定に基づく微生物の同定
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】質量分析計およびプロセッシング手段に接続した液体分離装置を用いたペプチドの同定に基づく微生物の同定
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240723BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20240723BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240723BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240723BHJP
C12N 9/76 20060101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X ZNA
G01N27/62 D
C07K4/00
C12M1/34 B
C12Q1/37
C12N9/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501945
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-03-11
(86)【国際出願番号】 EP2022069857
(87)【国際公開番号】W WO2023285653
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】21305988.4
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511196870
【氏名又は名称】ユニベルシテ クロード ベルナール リヨン プルミエ
(71)【出願人】
【識別番号】594016872
【氏名又は名称】サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス）
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンスティチュート、ナシオナル、ドゥ、ラ、サンテ、エ、ドゥ、ラ、ルシェルシュ、メディカル
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ
(71)【出願人】
【識別番号】512291156
【氏名又は名称】エコール ノルマル シュペリュール デ リヨン
(71)【出願人】
【識別番号】508277405
【氏名又は名称】ホスピス・シビル・ドゥ・リヨン
【氏名又は名称原語表記】ＨＯＳＰＩＣＥＳ ＣＩＶＩＬＳ ＤＥ ＬＹＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジェローム、ルモワーヌ
(72)【発明者】
【氏名】モード、グレグソン
(72)【発明者】
【氏名】ジュリー、ジル
(72)【発明者】
【氏名】ロマン、カリエール
(72)【発明者】
【氏名】フランソワ、ヴァンデネシュ
【テーマコード（参考）】
2G041
4B029
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA12
2G041FA13
2G041GA09
2G041GA20
2G041HA01
2G041HA02
2G041JA02
2G041KA01
2G041LA07
2G041MA05
4B029AA07
4B029BB01
4B029FA01
4B063QA18
4B063QQ05
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QS02
4B063QS16
4B063QS17
4B063QS40
4H045AA10
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA10
4H045EA50
4H045GA21
4H045GA30
(57)【要約】
本発明は、サンプル中に存在する少なくとも１つの微生物を、前記微生物のリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づいて同定するための方法であって、本明細書に記載の工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）、工程ｄ）、工程ｅ）、工程ｆ）、工程ｇ）、工程ｈ）および工程ｉ）を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、前記ペプチドの検出に従って微生物が同定される方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中に存在する少なくとも１つの微生物を、前記微生物のリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づいて同定するための方法であって、以下の工程：ａ）微生物を溶解し、前記サンプル中に存在するタンパク質を切断してペプチド混合物を得る工程、
ｂ）質量分析計に接続した液体分離装置を用いて、前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程、
ｃ）前記分離装置から溶出した液体を、イオン源を用いて霧化してイオン電流を発生させる工程、
ｄ）前記質量分析計を用いて、前記イオン源からの前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、前記イオン電流に対して、トランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行する工程であって、前記トランジションは、前駆体イオンと、前記前駆体イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を用いて予め定義されたトランジションリストから読み取られ、前記一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化する工程、
ｅ）プロセッサを用いて、ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する工程、
ｆ）プロセッサを用いて、前記複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる工程、
ｇ）プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの各グループにおいて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程であって、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される工程、
ｈ）あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する工程、
ｉ）場合によっては、プロセッサを用いて、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する工程
を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、前記ペプチドの検出に従って微生物が同定される、方法。
【請求項2】
前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程が、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程が、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記質量分析計がＰＲＭ（並列反応モニタリング）、ＭＲＭ（多重反応モニタリング）、ＤＩＡ（データ非依存的取得）またはＳＷＡＴＨ ＭＳ(全理論的フラグメントイオンスペクトル質量分析の逐次枠取得)を使用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記サンプルに界面活性剤を添加することにより、リボゾームタンパク質の切断から生じないペプチドを除去する予備工程を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
２つ以上の連続するトランジショングループがペプチド群と関連しており、ペプチドのそれぞれが微生物の属および／または種に特異的である、請求項１～６いずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
タンパク質の切断がトリプシン酵素での消化により行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記予め定義されたリストが、６～２０個のアミノ酸を含むペプチドに関連し、工程ｂ）で、４０％未満のアセトニトリルで脱複合体化される少なくとも１つのトランジションを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記予め定義されたリストが、配列番号１～配列番号４２３から選択される配列を示すペプチドに関連する少なくとも１つのトランジションを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記センチネル化合物が以下の化合物群：工程（ａ）の微生物タンパク質の切断から生じるペプチド、トリプシン酵素の自己切断から生じるペプチド、サンプルに導入されたタンパク質またはペプチドの切断から生じるペプチド、外因性導入ペプチド、および他の化合物から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記サンプルが、・血液、血清、リンパ、粘液、悪臭、唾液、気管気管支吸引液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、哺乳動物から得られる生物学的サンプル、または
・使用済みの水、食品、飲料、土壌サンプルおよび表面サンプルからなる群から選択されるサンプル
である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
液体分離装置に接続した質量分析計と、工程ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）の実施に適合した、特に、・ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信すること、
・複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てること、
・前記２つ以上の連続したグループの各グループにおいて少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングすること、
・あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計によって検出された場合に、次の連続するグループの少なくとも１つのトランジションのモニタリングを開始すること、および
・場合によっては、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成すること
に適合したプロセッシング手段とを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのシステム。
【請求項14】
前記ペプチドがリボゾームタンパク質から生じ、６～２０アミノ酸を含み、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて脱複合体化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法の実施に適合したペプチド群。
【請求項15】
配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を示す少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１４に記載のペプチド群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サンプル、特に、ヒト由来血液サンプルからの生物学的サンプル中の微生物を同定するための方法に関する。この方法は、敗血症、すなわち、血液感染症の検出に使用可能である。
【背景技術】
【0002】
感染症の原因となる微生物を同定することは、患者を管理する上で不可欠な工程である。感染部位からの病原体の持続的な拡散によって引き起こされ、その後、敗血症候群に至り得る症候性菌血症の場合、この同定情報への迅速なアクセスがより重要となる。敗血症は軽症から重症となり、最終的には敗血症性ショックに発展し、死亡率は最大８０％に達する。
【0003】
したがって、菌血症の原因となっている病原体を迅速に特定することは、抗菌薬療法の選択を方向づける、または最初の広域抗菌薬療法の漸減を進めることを可能とするための重要な工程である。このような迅速な診断によって期待されることは、患者における治療上の副作用を軽減するだけでなく、抗生物質の使用が新たな抗菌薬耐性株または耐性メカニズムの出現に寄与することを抑制することである。
【0004】
ヒトの健康以外の分野では、サンプル中に存在する微生物の迅速な同定は、抗菌戦略を適応させるための重要な要素でもある。
【0005】
過去２０年間で、以前使われていた生化学的技術に比べて同定時間を大幅に短縮することにより微生物同定を革新した２種類の技術が登場した。これらはＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量分析法と分子生物学に基づくツールである。
【0006】
Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型）質量分析法による病原体同定の原理は、対象とする微生物の溶解によって放出される低分子量タンパク質のフィンガープリントの実験的質量スペクトルと、既知の微生物の菌株から得られたフィンガープリントの数万の質量スペクトルを含むデータベースとの比較に基づいている。そして、病原体の属または病原体の属と種を同定するための一致スコアが確立される。Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆによる微生物の同定原理は、低分子量タンパク質について１９９９年に初めて記載されている（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【0007】
その後、この技術はＶＩＴＥ（登録商標）ＭＳ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）およびＭＡＬＤＩ Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（登録商標）（Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）という銘柄で広く病院に導入された。
【0008】
血液サンプルに適用する場合、質量スペクトル上の干渉シグナルのソースを制限するために、血球を溶解して除去する必要がある。特許ＵＳ８５６９０１０は、Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆ分析前の効率的な血球溶解を補助するドデシルナトリウム洗剤の使用に基づいたプロトコールを開示している。
【0009】
事前に微生物の分離を必要とする生化学的同定技術と比較して、Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆ技術は同定時間を約２４時間短縮することができ、したがって死亡率統計または平均入院期間に直接的影響を与えることができる。さらに、１サンプル当たりの算定分析コストは非常に低く、この技術は病院廃棄物もほとんど出さない。これらの有利な医療経済的特徴が、Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆの病院への迅速な導入を説明する。
【0010】
しかしながら、Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆ法には限界がある。例えば、系統学的に近い種（すなわち、エシェリヒア・コリ（大腸菌）(Escherichia
coli)／シゲラ（赤痢菌）属(Shigella)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter
freundii)またはエンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)群に属すもの）ｉｉまたはエンテロバクター・クロアカグループのメンバーなど）の同定は難しい。同様に、多微生物感染の場合には、フィンガープリントが重複しているため、またはある微生物が別の優勢種に比べて発現が乏しいために、同定が難しくなる。このような状況は一般に、消化器の多微生物感染症（腹膜炎、腹腔内膿瘍）に関する菌血症の状況で遭遇する。
【0011】
このような感度の低さは、分子生物学に基づく技術ではそれほど問題ではない。広義の分子生物学を用いた市販のソリューションは、ｉ）蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ｉｉ）ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション、ｉｉｉ）核酸増幅（ＰＣＲ）、またはｉｖ）それらの組合せに基づく方法を採用しているかどうかによって、４つのカテゴリーに区別することができる。
【0012】
理想的な病原体同定技術は、敗血症に関連する大部分の菌種をカバーし、陽性血液培養アリコートから直接導入でき、可能な限り短時間で（理想的には１時間未満）、経済的に実行可能で、多微生物感染を構成する種々の病原体の同定を可能とし、付随的には、病原体の相対的または絶対的な定量を推定できるものでなければならない。理想的には、この技術を単一の分析プラットフォームに導入し、同定された病原体に関連する可能性のある抗生物質耐性メカニズムまたは感受性プロファイルを何らかの方法で同時にまたは連続的に同定できなければならない。
【0013】
最近、細菌を同定するために、液体クロマトグラフィーと質量分析計の組合せをボトムアッププロテオミクス解析アプローチと併用することの潜在的な関心が、いくつかの探索的研究で評価されている。このアプローチでは、細菌または酵母のタンパク質含量に特定の酵素消化を施してペプチドを生成し、次に、クロマトグラフィー工程で部分的に分離した後に、特徴的なイオンに再構成した質量スペクトルおよび／またはクロマトグラムを作成し、これを公開または独自のデータベースと比較する。質量分析は、ノンターゲット法またはターゲット法で実施することができる。
【0014】
ノンターゲット分析の場合、質量分析計は、例えば、酵素的加水分解から得られた混合物中のペプチドそれぞれの正確な（モノアイソトピック）質量または化学質量または分子質量または平均質量に関する情報を得るような方法で作動させることができる。この場合、ＭＳまたはＭＳ１と呼ばれる単純な分析が実行され、Ｍａｌｄｉ－Ｔｏｆの場合と同様に、酵素消化から得られたペプチドの全ての質量の実験的フィンガープリント（または質量電荷比値；ｍ／ｚ）が、全ての細菌または酵母プロテオームの同じ酵素消化により得られた全ての理論的フィンガープリントと比較される。これは（Ｌａｓｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０２０）に記載されているようにＬＣ－ＭＳ１と称されるアプローチである。
【0015】
別の実施態様では、このプロセスは、ペプチド質量情報に加えて、またはペプチド質量情報の代わりに、ペプチドにフラグメント化を行う工程を含む。この工程は、無傷のペプチドのｎ個の質量（または質量電荷比の値；ｍ／ｚ）のクロマトグラムの時間ｔにおける予備的な観察によって条件付けることができる。この操作様式はデータ依存的取得(Data Dependent Acquisition)（ＤＤＡ）と呼ばれ、ショットガンプロテオミクスまたは情報依存的取得(Information Dependent Acquisition)（ＩＤＡ）としても知られている。次に、ペプチドの実験的フラグメント化スペクトルとそれらの質量に関する情報を組み合わせて、または組み合わせずに、細菌または酵母プロテオームの酵素消化から得られた全てのペプチドの理論的フラグメント化スペクトルと比較して病原体を同定する。このプロセスは、例えば、（Ｂｏｕｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． ２０１７）で使用される。
【0016】
あるいは、ペプチドは、質量スペクトルから個々に選択されず、理論的フラグメントイオンスペクトル質量分析のシークエンシャル・ウインドウ取得(Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra)（ＳＷＡＴＨ）またはＭＳＥとしても知られるデータ非依存的取得(Data Independent Acquisition)（ＤＩＡ）と呼ばれる取得様式に従う盲検様式で体系的にフラグメント化される。これは、抗生物質耐性に関与するタンパク質の酵素消化から生じるペプチドを検出するために、（Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）によって用いられる方法である。
【0017】
標的取得様式は、選択反応モニタリング(Selected Reaction Monitoring)（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング(Parallel Reaction Monitoring)（ＰＲＭ）、多重反応モニタリング－高分解能(Multiple Reaction Monitoring-High Resolution)（ＭＲＭ－ＨＲ）、多重反応モニタリングキューブ(Multiple Reaction Monitoring cubed)（ＭＲＭ３）と呼ばれている。細菌または酵母の同定を目的とした、例えば尿中、気管気管支吸引液中、または分離コロニーから細菌を同定するためのターゲット質量分析の実施に関するいくつかの研究が報告されている。この方法はまた、アシネトバクター属の細菌のタイプ分け、毒素の検出と定量、抗生物質耐性機序の検出のためにも実施されている。
【0018】
国際出願ＷＯ２０１１／０４５５４４は、分離コロニーからのスタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）(Staphylococcus
aureus)株のタイプ分けおよび病原性因子と抗生物質耐性の並行検出のための、このターゲット質量分析法とクロマトグラフィー分離システムの併用を記載している。同様に、出願ＷＯ２０１２／１４３５３５およびＷＯ２０１２／１４３５３４は、種々の抗生物質耐性機序に関連するタンパク質を検出するための、この同じ方法の使用を記載している。
【0019】
しかしながら、これまでにペプチド分離法と質量分析によるそれらの検出を併用するこの方法に基づく血液感染の診断方法はないことに留意されたい。その理由は２つある。
【0020】
第一に、これらの分析方法の時間が長すぎ、ほとんどの場合、クロマトグラフィー分離は３０～１２０分である。このため１日当たりに分析できるサンプルの数が限定され、分析コストが上昇する。
【0021】
第二に、ターゲット質量分析法では、多数のターゲットがサンプリングされる場合、これらのターゲットのシグナルは、それらが検出されると予想されるクロマトグラフィーの保持時間枠でのみ追跡しなければならない。これにより、化合物のクロマトグラフィピークの形状を十分な精度で定義できるようにするためには、クロマトグラフィー分離システムから溶出した化合物のシグナル強度を少なくとも８回測定する。このアプローチは、質量分析メーカーにより「スケジュールＭＲＭ、スケジュールＭＲＭ ＨＲ、タイムドＭＲＭ、ダイナミックＭＲＭ」と呼ばれている。欠点は、保持時間が予期せず変更された場合（例えば、サンプル組成もしくは濃度、またはクロマトグラフィーカラムの摩耗の影響による）、標的化合物がスケジュールされた保持枠から外れて検出されない可能性があることである。この制限を考慮し、ユーザーは通常、十分に広い保持時間枠をとるが、この予防措置は、この方法で検出できる化合物の数の減少を意味する。
【0022】
特許ＥＰ３３８４５１７には、これらの制限を克服する技術が記載されている。この方法は、クロマトグラフィー分離スケール上に広がる化合物に属する「センチネルシグナル」のモニタリングに頼るものである。センチネルシグナルが定義された閾値を超えて検出されると、新しいセンチネルシグナルが検出されるまで、それが対象とする標的分子に特異的なシグナルのセットをモニタリングするトリガーとなる。したがって、保持時間のドリフトにもかかわらず、全ての標的化合物が確実に検出され続ける。
【発明の概要】
【0023】
本特許出願は、１０分未満、好ましくは５～７分で微生物を迅速に同定するための方法であって、前記微生物のリボソームタンパク質の酵素消化に由来するペプチドのみから選択されるバイオマーカーペプチドを標的とする方法を記載する。
【0024】
本方法は、この同定法を実施するために徹底的に選択されたペプチドのリストに基づく。これらのペプチドは同定される種に特異的であり、分離工程のために設定された仕様を満たす、すなわち約５分の勾配時間中に最適なピークキャパシティを持つことを可能にする物理化学的特性を備えている。
【0025】
本発明は、サンプル中に存在する少なくとも１つの微生物を、前記微生物のリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づいて同定するための方法であって、以下の工程：
ａ）微生物を溶解し、前記サンプル中に存在するタンパク質を切断してペプチド混合物を得る工程、
ｂ）質量分析計に接続した液体分離装置を用いて、前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程、
ｃ）前記分離装置から溶出した液体を、イオン源を用いて霧化してイオン電流を発生させる工程、
ｄ）前記質量分析計を用いて、前記イオン源からの前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、前記イオン電流に対して、トランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行する工程であって、前記トランジションは、前駆体イオンと、前記前駆体イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を用いて予め定義されたトランジションリストから読み取られ、前記一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化する工程、
ｅ）プロセッサを用いて、ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する工程、
ｆ）プロセッサを用いて、前記複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる工程、
ｇ）プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの各グループにおいて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程であって、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される工程、
ｈ）あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのトランジションのモニタリングを開始する工程、
ｉ）場合によっては、プロセッサを用いて、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する工程
を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、前記ペプチドの検出に従って微生物が同定される方法に関する。
ａ）微生物を溶解し、前記サンプル中に存在するタンパク質を切断してペプチド混合物を得る工程、
ｂ）質量分析計に接続した液体分離装置を用いて、前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程、
ｃ）前記分離装置から溶出した液体を、イオン源を用いて霧化してイオン電流を発生させる工程、
ｄ）前記質量分析計を用いて、前記イオン源からの前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、前記イオン電流に対して、トランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行する工程であって、前記トランジションは、前駆体イオンと、前記前駆体イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を用いて予め定義されたトランジションリストから読み取られ、前記一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化する工程、
ｅ）プロセッサを用いて、ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する工程、
ｆ）プロセッサを用いて、前記複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる工程、
ｇ）プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの各グループにおいて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程であって、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される工程、
ｈ）あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのトランジションのモニタリングを開始する工程、
ｉ）場合によっては、プロセッサを用いて、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する工程
を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、前記ペプチドの検出に従って微生物が同定される方法に関する。
【0026】
本発明はまた、上記で定義されるような方法を実施するためのシステムであって、液体分離装置に接続した質量分析計と、工程ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）の実施に適合した、特に、
・ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する、
・複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる、
・前記２つ以上の連続したグループの各グループにおいて少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする、
・あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計によって検出された場合に、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する、および
・場合によっては、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する
に適合したプロセッシング手段とを含むシステムに関する。
・ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する、
・複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる、
・前記２つ以上の連続したグループの各グループにおいて少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする、
・あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計によって検出された場合に、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する、および
・場合によっては、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する
に適合したプロセッシング手段とを含むシステムに関する。
【0027】
本発明はまた、上記のような方法の実施に適合したペプチド群に関し、前記ペプチドは、リボゾームタンパク質から生じ、６～２０アミノ酸を含み、脱複合体化工程で、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて脱複合体化される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】図１は、「センチネル－内因性」法で得られたクロマトグラムである。ペプチドの強度が保持時間の関数で示されている。強度はカウント／秒で表される。グループａ：腸内細菌目(Enterobacterales)グループは、１８の腸内細菌目に共通するペプチドと各腸内細菌目に特異的なペプチドに関連するトランジション（１３５のトランジション）を含む。グループｂ：シュードモナス・エルギノーザ（緑膿菌）(Pseudomonas
aeruginosa)グループは、シュードモナス・エルギノーザに特異的な１２のペプチド（配列番号２９０～３００の配列を示す）に関連する４７のトランジションを含む。グループｃ：スタフィロコッカス・アウレウス＿アルゲンテウスグループは、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）およびスタフィロコッカス・アルゲンテウス(Staphylococcus
argenteus)に特異的な１０のペプチド（配列番３２８～３３７号の配列を示す）に関連する３５のトランジションを含み、これらの選択されたペプチドは、パネルの他のスタフィロコッカス（ブドウ球菌）種（コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス）には存在しない（３５のトランジション）。グループｄ：アシネトバクター(Acinetobacter)グループは、４つのアシネトバクターに共通する１６のペプチド（配列番号１８～３３の配列を示す）と各アシネトバクターに特異的なペプチドに関連するトランジション（１２８のトランジション）を含む。グループｅ：エンテロコッカス（腸球菌）(Enterococcus)グループは、２つのエンテロコッカスに共通するペプチドと各エンテロコッカスに特異的なペプチドに関連するトランジション（５３のトランジション）を含む。グループｆ：カンジダ(Candida)グループは、７つのカンジダに共通するペプチドと各カンジダに特異的なペプチドに関連するトランジション（８１トランジション）を含む。グループｇ：その他の種のグループは、３１の他の種に特異的なペプチドに関連するトランジション（１３９のトランジション）を含む。グループｈ：「ストレプトコッカス（連鎖球菌）(Streptococcus)属その他」のグループは、１７のストレプトコッカス属および特定のストレプトコッカス属またはストレプトコッカス属のグループに特異的なペプチドに関連するトランジションを含む。このグループはまた、他の７種のトランジションも含む。これはセンチネルペプチドによってトリガーされない唯一のグループである（１０５のトランジション）。
【図2】図２は、トリプシン自己消化から生じた以下の４つのセンチネルペプチドのクロマトグラフィー勾配上での分布を示す。・ＮＫＰＧＶＹＴＫ（配列番号４２４）・ＶＡＴＶＳＬＰＲ（配列番号４２５）・ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ（配列番号４２６）・ＩＩＴＨＰＮＦＮＧＮＴＬＤＮＤＩＭＬＩＫ（配列番号４２７）
【発明の具体的説明】
【0029】
本発明の方法の目的は、短時間で、特に１０分未満の時間で、高度な資格を有する人員を必要とせずに日常的に使用可能な安価なプロセスで微生物の同定を可能にすることである。
【0030】
特に、本発明は、サンプル中に存在する少なくとも１つの微生物を、前記微生物のリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づいて同定するための方法であって、以下の工程：
ａ）微生物を溶解し、前記サンプル中に存在するタンパク質を切断してペプチド混合物を得る工程、
ｂ）質量分析計に接続した液体分離装置を用いて、前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程、
ｃ）前記分離装置から溶出した液体を、イオン源を用いて霧化してイオン電流を発生させる工程、
ｄ）前記質量分析計を用いて、前記イオン源からの前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、前記イオン電流に対して、トランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行する工程であって、前記トランジションは、前駆体イオンと、前記前駆体イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を用いて予め定義されたトランジションリストから読み取られ、前記一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化する工程、
ｅ）プロセッサを用いて、ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する工程、
ｆ）プロセッサを用いて、前記複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる工程、
ｇ）プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの各グループにおいて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程であって、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される工程、
ｈ）あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する工程、
ｉ）場合によっては、プロセッサを用いて、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する工程
を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、検出される前記ペプチドに従って微生物が同定される方法に関する。
ａ）微生物を溶解し、前記サンプル中に存在するタンパク質を切断してペプチド混合物を得る工程、
ｂ）質量分析計に接続した液体分離装置を用いて、前記ペプチド混合物を脱複合体化する工程、
ｃ）前記分離装置から溶出した液体を、イオン源を用いて霧化してイオン電流を発生させる工程、
ｄ）前記質量分析計を用いて、前記イオン源からの前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、前記イオン電流に対して、トランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行する工程であって、前記トランジションは、前駆体イオンと、前記前駆体イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を用いて予め定義されたトランジションリストから読み取られ、前記一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化する工程、
ｅ）プロセッサを用いて、ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信する工程、
ｆ）プロセッサを用いて、前記複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる工程、
ｇ）プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの各グループにおいて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程であって、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される工程、
ｈ）あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する工程、
ｉ）場合によっては、プロセッサを用いて、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成する工程
を含み、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションはペプチドに関連付けられ、検出される前記ペプチドに従って微生物が同定される方法に関する。
【0031】
以下、この同定方法の各工程をより詳細に示す。
【0032】
本発明の意味において、「微生物」という用語は、細菌または酵母を意味する。
【0033】
本発明の特定の実施形態では、微生物は、ヒトに疾患を引き起こす病原性微生物である。特に、微生物は、細菌感染症、敗血症、または尿路感染症を引き起こす最も一般的な微生物から選択される。
【0034】
本発明の方法によって同定することができる微生物は、病原性または非病原性の微生物の科、属または種に相当する微生物のグループであり得る。
【0035】
例えば、ＥＳＫＡＰＥグループに属す以下の細菌が同定される微生物の例である：
・エンテロコッカス・フェシウム、
・スタフィロコッカス・アウレウス、
・クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）(Klebsiella pneumoniae）、
・アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、
・シュードモナス・エルギノーザ、および
・エンテロバクター種。
・エンテロコッカス・フェシウム、
・スタフィロコッカス・アウレウス、
・クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎桿菌）(Klebsiella pneumoniae）、
・アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、
・シュードモナス・エルギノーザ、および
・エンテロバクター種。
【0036】
同定可能な微生物の他の例としては、以下のものが挙げられる：
・酵母、例えば、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、
・ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（肺炎レンサ球菌）(Streptococcus pneumoniae)、
・コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス。
・酵母、例えば、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、
・ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（肺炎レンサ球菌）(Streptococcus pneumoniae)、
・コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス。
【0037】
本発明の意味において、「サンプル」という用語は、
・血液、血清、リンパ、粘液、悪臭、唾液、気管気管支吸引液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、哺乳動物から得られる生物学的サンプル、または
・使用済みの水、食品、飲料、土壌サンプルおよび表面サンプルからなる群から選択されるサンプル
を意味する。
・血液、血清、リンパ、粘液、悪臭、唾液、気管気管支吸引液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、哺乳動物から得られる生物学的サンプル、または
・使用済みの水、食品、飲料、土壌サンプルおよび表面サンプルからなる群から選択されるサンプル
を意味する。
【0038】
サンプルは、１または複数の微生物を含んでもよい。本方法は、少なくとも１つの微生物の同定に適合しているため、複数の微生物の同定のために実施することができる。
【0039】
有利なことに、本発明の方法は短時間で、いずれの場合にも１０分未満で実現される。したがって、本方法は診断、特にヒトの敗血症の診断に適合している。
【0040】
好ましい実施形態では、サンプルは、血液、血清、リンパ、粘液、悪臭、唾液、気管気管支吸引液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、ヒトから得られる生物学的サンプルであり、特に、血液サンプルである。
【0041】
本方法の工程（ａ）
いずれの分析工程の前でも、サンプル中に存在する微生物は、好ましくは、遠心分離、濾過、音響泳動、浮遊または回転によってペレット化される。
いずれの分析工程の前でも、サンプル中に存在する微生物は、好ましくは、遠心分離、濾過、音響泳動、浮遊または回転によってペレット化される。
【0042】
本発明の特定の実施形態において、工程（ａ）は、リボゾームタンパク質の切断から生じないペプチドを除去する予備的下位工程を含む。これは、特に、アッセイされるサンプルへの界面活性剤の添加により達成される。
【0043】
ペプチド混合物を得るために、サンプル中に存在する微生物の溶解およびタンパク質の切断が行われる。特定の実施形態では、両操作が並行して実施される。
【0044】
微生物の特徴はタンパク質に由来するので、分析前に質量分析によりサンプルを処理する必要がある。サンプル中に存在するタンパク質からペプチドを生成するために、これらのタンパク質をタンパク質脱複合体化酵素（プロテアーゼ）、例えば、トリプシンもしくはペプシンで、または化学試薬の作用、例えば、臭化シアノゲン（ＣＮＢｒ）処理もしくはヒドロキシルラジカル（Ｈ２Ｏ２）処理によって消化することができる。
【0045】
しかしながら、酵素消化によるタンパク質の切断の方が、制御が容易で、化学試薬による処理に比べてタンパク質構造の変性が少なく，特に特異的であるために好ましい。
【0046】
酵素消化は、特定の反応条件下で、タンパク質からペプチドの産生を可能とする１つ（または複数）の酵素の作用である。タンパク質を特定の場所で切断する、したがってタンパク質の脱複合体化を遂行する酵素をプロテアーゼと呼ぶ。各プロテアーゼは通常、アミノ酸配列内の特定の切断部位を認識できる。
【0047】
国際出願ＷＯ２００５／０９８０７１には、例として引用できるプロテアーゼが記載されている：
・芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）のアミン官能基のレベルでペプチド結合を加水分解するペプシン、これは酸性ｐＨで使用する、
・リジンのＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドリジン、
・ＬｙｓおよびＡｒｇ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を加水分解するトリプシン。
・芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）のアミン官能基のレベルでペプチド結合を加水分解するペプシン、これは酸性ｐＨで使用する、
・リジンのＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドリジン、
・ＬｙｓおよびＡｒｇ残基のカルボキシル基のレベルでペプチド結合を加水分解するトリプシン。
【0048】
本発明の方法において、タンパク質の切断は、好ましくは、トリプシン酵素による消化により実施される。
【0049】
有利には、工程（ａ）の溶解およびタンパク質の切断中のインキュベーション温度は約３７℃である。
【0050】
ペプチド混合物の生成は単純な溶解で行うことができる。また、加圧、電子レンジまたはさらには超音波装置など、様々な補助的プロセスを用いてスピードアップすることもできる。サンプル中に存在する細胞の溶解は、これらの３つの方法の１つを用いることでより効率的となり得る。
【0051】
工程（ｂ）
ペプチドの脱複合体化は、ペプチドを分離する部分的工程を意味する。この工程は、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動などの液体分離技術によって行われる。
ペプチドの脱複合体化は、ペプチドを分離する部分的工程を意味する。この工程は、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動などの液体分離技術によって行われる。
【0052】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、移動相が液体である分離技術である。これはカラムまたは平板のいずれかで行うことができる。これには特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）および逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）が含まれる。
【0053】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、サブミリメートル径のキャピラリーならびにマイクロチャネルおよびナノチャネルで行われる一連の分離法である。これには特にキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリーアイソタコフォレーシスおよびミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）が含まれる。
【0054】
本発明の好ましい実施形態では、脱複合体化工程は、逆相液体クロマトグラフィーにより行われる。
【0055】
本発明の一実施形態において、ペプチド混合物を脱複合体化する工程は、逆相カラムで、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて行われる。ペプチドはその配列長の関数として選択されるが、これは、この特徴が保持因子ｋ、したがって逆相カラムからの溶出に必要なアセトニトリルの割合と相関しているからである。
【0056】
アセトニトリル（シアン化メチル）は、極性非プロトン性溶媒である。
【0057】
工程（ｃ）
本方法は、液体分離装置に接続した質量分析計で実施される。質量分析による分析はターゲット様式で行われる。
本方法は、液体分離装置に接続した質量分析計で実施される。質量分析による分析はターゲット様式で行われる。
【0058】
一般に、質量分析（ＭＳ）は、イオン電流を発生させるためにイオン源を用いて、分析される液体をイオン化する分析方法である。ペプチド混合物を含有する液体の「霧化」は、当業者に周知である。
【0059】
好ましい実施形態では、質量分析は、タンデム型質量分析ＭＳ／ＭＳ、優先的には、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）または多重反応モニタリングＭＲＭである。
【0060】
この実施形態では、トランジションは、ＭＲＭトランジションである。
【0061】
工程（ｄ）
質量分析計は、イオン源から前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、イオン電流に対してトランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行し、前記トランジションは、前駆イオンと、前記前駆イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を使用して予め定義されたトランジションリストから読み取られ、一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆イオンを選択してフラグメント化する。
質量分析計は、イオン源から前記イオン電流を受信し、複数のサイクルの各サイクルについて、イオン電流に対してトランジションを検出するための一連のフィルタリングステップを実行し、前記トランジションは、前駆イオンと、前記前駆イオンの少なくとも１つのフラグメントイオンとを含み、前記トランジションは、質量分析計を使用して予め定義されたトランジションリストから読み取られ、一連のトランジションの各トランジションについて、質量分析計は、各トランジションの前駆イオンを選択してフラグメント化する。
【0062】
本発明の意味において、「予め定義されたトランジションリスト」とは、トランジションの、すなわち、前駆体イオンとフラグメントイオンに関連するｍ／ｚ値の特定のペアの有限リストを意味し、各トランジションは特定のペプチドに関連する。言い換えれば、質量分析計は、それぞれが特定のペプチドに関連し、分析前に定義されたこれらのトランジションを系統的にモニタリングする。
【0063】
このプロセスは、前駆体イオンのスペクトルをリアルタイムで分析するものではなく、リストに情報を追加するものでもない。このようなリアルタイム分析は、例えば国際出願ＷＯ２０１４／１１６７１１に記載されている。
【0064】
予め定義されたトランジションリストは、配列番号１～配列番号４２３の配列を有する以下に示す４２３のペプチドを再グループ化した表１に基づいて確立された。
【0065】
この予め定義されたリストは、分析されるペプチドの混合物中に存在し得る特異的ペプチドにそれぞれ関連し、したがってモニタリングされるトランジションを含む。
【0066】
本発明の特定の実施形態において、予め定義されたリストは、配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を示すペプチドに関連する少なくとも１つのトランジションを含む。
【0067】
有利には、予め定義されたリストは、配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００または４００の異なるペプチドに関連するトランジションを含む。
【0068】
特に、予め定義されたリストは、表１に挙げられるような４２３のペプチドに関連するトランジションを含む。
【0069】
別の実施形態では、予め定義されたリストは、以下のペプチド群の少なくとも１つにのみ関連するトランジションを含む：
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
【0070】
工程（ｅ）
生成された複数のトランジションは、プロセッサにより受信されるデータであり、前記プロセッサを用いてペプチド混合物をモニタリングするために使用することができる。
生成された複数のトランジションは、プロセッサにより受信されるデータであり、前記プロセッサを用いてペプチド混合物をモニタリングするために使用することができる。
【0071】
「プロセッサ」という用語は、本発明の意味において、何らかの外部データ源に対して演算を実行する任意のデジタル回路を意味する。特に、プロセッサはコンピュータである。この場合、外部データ源は質量分析計であり、送信されるデータは複数のトランジションである。
【0072】
古典的な方法では、コンピュータは、データ処理の一部を実施するコード命令を実行するように適合される。それはまた、データ記憶モジュール（メモリ、例えばフラッシュ）、有利にはユーザーインターフェース（典型的にはスクリーン）、およびバイオメトリック取得手段を含むことができる。
【0073】
工程（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）
前記複数のトランジションは、プロセッサを用いて、２つ以上の連続するトランジショングループを前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる。
前記複数のトランジションは、プロセッサを用いて、２つ以上の連続するトランジショングループを前記予め定義されたトランジションリストに割り当てる。
【0074】
ある実施形態によれば、２つ以上の連続するトランジショングループは、ペプチドグループに関連し，各ペプチドは、微生物の属および／または種に特異的である。
【0075】
次に、２つ以上の連続するグループの各グループにおいてセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングする工程が実施され、前記少なくとも１つのセンチネルトランジションは、プロセッサを用いて、そのグループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される。
【0076】
センチネル化合物は、それを扱った章でより詳細に示す。
【0077】
次の工程で、あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する。
【0078】
任意選択の工程（ｉ）
クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムは、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、プロセッサを用いて作成することができる。
クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムは、前記質量分析計で予め定義されたリストから読み取られたトランジションの検出から、プロセッサを用いて作成することができる。
【0079】
このクロマトグラムまたはエレクトロフェログラムでは、各ペプチドは、質量分析計で得られたデータから「再構成」されたピークによって表される。
【0080】
この工程は必須ではないが、結果を視覚的に解釈するのに有用である。
【0081】
検出されたペプチド
微生物の同定のための方法は、前記微生物に属すリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づく。リボゾームタンパク質は、豊富にあり、時間が経っても安定であり、すなわち変異しにくいことが知られている。これらのタンパク質はリボソームの一部であり、特にメッセンジャーＲＮＡにコードされた遺伝子を翻訳する。リボソームタンパク質には、それが属するリボソームサブユニットによって２つのタイプがある。文字Ｌ（ラージ）は大サブユニット、文字Ｓ（スモール）は小サブユニットを表す。
微生物の同定のための方法は、前記微生物に属すリボゾームタンパク質の切断から生じるペプチドの検出に基づく。リボゾームタンパク質は、豊富にあり、時間が経っても安定であり、すなわち変異しにくいことが知られている。これらのタンパク質はリボソームの一部であり、特にメッセンジャーＲＮＡにコードされた遺伝子を翻訳する。リボソームタンパク質には、それが属するリボソームサブユニットによって２つのタイプがある。文字Ｌ（ラージ）は大サブユニット、文字Ｓ（スモール）は小サブユニットを表す。
【0082】
本発明の方法において、予め定義されたリストから読み取られた各トランジションは、ペプチドに関連し、これはさらに編集されたクロマトグラムまたはエレクトロフェログラム上のピークにより表される。
【0083】
実施例のセクションに示されるように、前記クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムに存在するピークに基づいて、微生物が同定できる。
【0084】
本発明の一実施形態では、このような微生物を同定するには、微生物の属および／または種に特異的な１つのペプチドの検出で十分である。
【0085】
本発明の別の実施形態では、前記微生物を同定するために、微生物の属および／または種に特異的な少なくとも２つのペプチドの検出が用いられる。
【0086】
有利には、本発明のプロセスで、同じサンプル中に存在し、それぞれ１つが属および／または種に特異的である２つ以上のペプチドの検出で、２つ以上の異なる種が同定できる。
【0087】
各トランジションは、以下に示す特徴に従って徹底的に選択された微生物由来のリボゾームタンパク質から生じたペプチド、以下、「バイオマーカーペプチド」に関連している。
【0088】
第一に、これらのバイオマーカーペプチドは、同定される微生物の属および／または種に特異的である必要がある。
【0089】
第二に、バイオマーカーペプチドは、液体分離工程のために設定された仕様、すなわち数分の短い勾配時間中に最適なピークキャパシティを満たすことを可能にする物理化学的特性を備えている必要がある。
【0090】
ピークキャパシティは、下式で定義される。
式中、
・Ｎは、無勾配モードで計算したカラム効率であり；
・Ｂは、移動相中の有機溶媒のパーセンテージに対するｌｎ ｋの線形依存性の傾きである
・Δｃは、勾配時間（ｔｇ）中の移動相の組成の違いであり、ｔ０はボイド保持時間に相当する。
【数1】
・Ｎは、無勾配モードで計算したカラム効率であり；
・Ｂは、移動相中の有機溶媒のパーセンテージに対するｌｎ ｋの線形依存性の傾きである
【数2】
【0091】
例えば、カラム長１００ｍｍ、内径１ｍｍ、粒径３．５μｍ、流量１００μＬ／分、迅速なターンアラウンドタイムを実現するための短縮勾配時間（４．１２分）を用いる実験設定では、勾配溶媒中のアセトニトリルが３０～３５％になるとすぐにピークキャパシティが最適値に達する。このパーセンテージを超えると、同じピークキャパシティでより多くのペプチドが溶出されることになり、対象とするターゲットに関連するシグナルにおける干渉確率が高くなる。
【0092】
第三に、バイオマーカーペプチドは、配列の長さの関数としても選択されるが、これはこの特徴が保持係数ｋ、したがって、逆相カラムからの溶出に、特にオクタデシル逆相カラムからの溶出に必要なアセトニトリルのパーセンテージと相関しているからである。よって、勾配溶媒中のアセトニトリルを４０％以下に保持するために、種の特異的バイオマーカーとして同定された全てのペプチド候補のうち６～２０のアミノ酸を含むものだけが最終的に同定アッセイに残された。
【0093】
本発明の好ましい実施形態では、予め定義されたリストは、６～２０のアミノ酸を含むペプチドに関連し、工程（ｂ）中、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相で脱複合体化される少なくとも１つのトランジションを含む。
【0094】
より具体的には、予め定義されたリストは、下表１に示されるように配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を示すペプチドに関連する少なくとも１つのトランジションを含む。
【0095】
有利には、予め定義されたリストの各トランジションは、配列番号１～配列番号４２３に示されるような配列を有するペプチドを含む、またはからなるペプチドの群から選択されるペプチドに関連する。
【0096】
このプロセスの特定の実施では、予め定義されたリストにおいて、少なくとも１つのトランジションは、配列番号１～配列番号４２３から選択される配列を示す少なくとも１つのペプチドに関連する。
【0097】
別の実施形態では、予め定義されたリストは、以下のペプチドグループのうち少なくとも１つにのみ関連するトランジションを含む：
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
【0098】
【表1】
【0099】
本発明の方法は、特に、以下の群に属す微生物の同定を可能とする：
・腸内細菌目
・アシネトバクター
・エンテロコッカス
・カンジダ
・ブドウ状球菌、および
・ストレプトコッカス属。
・腸内細菌目
・アシネトバクター
・エンテロコッカス
・カンジダ
・ブドウ状球菌、および
・ストレプトコッカス属。
【0100】
エンテロバクテリウム＿コモンと呼ばれる腸内細菌目のグループには、３２種が含まれる：シトロバクター・フロインディ、シトロバクター・ブラキー(Citrobacter
braakii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter
koseri)、シトロバクター・ヨンエ(Citrobacter
youngae)、シトロバクター・ワークスマニー(Citrobacter
werkmanii)、シトロバクター・ポルトゥカレンシス(Citrobacter
portucalensis)、シトロバクター・クロナエ(Citrobacter
cronae)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter
amalonaticus)、シトロバクター・ファーメリ(Citrobacter
farmer)、シトロバクター・セドラキー(Citrobacter
sedlakii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter
koseri)、エンテロバクター・アズブリエ(Enterobacter
asburiae)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter
cloacae)、エンテロバクター・ホルマケイ(Enterobacter
hormachei)、エシェリヒア・コリ、ハフニア・アルベイ(Hafnia
alvei)、クレブシエラ・エアロゲネス(Klebsiella
aerogenes)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella
oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ、モルガネラ・モルガニイ(Morganella _ morganii)、パントエア・アグロメランス(Pantoea
agglomerans)、プロテウス・ミラビリス(Proteus
mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus
vulgaris)、プロテウス・コランバエ(Proteus
columbae)、プロテウス・ペンネリ(Proteus
penneri)、プロテウス・テラエ(Proteus
terrae)、ラウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella
ornithinolytica)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella
enterica)、セラチア・マルセッセンス(Serratia
marcescens)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia
rettgeri)およびプロビデンシア・スチュアルティ(Providencia
stuartii)。
【0101】
この腸内細菌目のグループのペプチドは，このグループの全種に共通する。
【0102】
アシネトバクター＿コモンと呼ばれるアシネトバクターグループには、４つのアシネトバクターが含まれる：アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ルオフィイ(Acinetobacter
Iwoffii)、アシネトバクター・ウルシンギ(Acinetobacter
ursingii)およびアシネトバクター・ピッティー(Acinetobacter
pittii)。
【0103】
このアシネトバクター＿コモングループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0104】
エンテロコッカス＿コモンと呼ばれるエンテロコッカスグループには、２つのエンテロコッカスが含まれる：エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus
faecalis)。
【0105】
このエンテロコッカス＿コモングループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0106】
カンジダ＿コモンと呼ばれるカンジダのグループには、７つのカンジダが含まれる：カンジダ・アルビカンス(Candida
albicans)、カンジダ・アウリス(Candida
auris)、カンジダ・グラブラータ(Candida
glabrata)、カンジダ・ケフィール(Candida
kefyr)、カンジダ・クルセイ(Candida
krusei)、カンジダ・トロピカリス(Candida
tropicalis)およびカンジダ・パラシローシス(Candida
parapsilosis)。
【0107】
このカンジダ＿コモングループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0108】
スタフィロコッカス＿コアグラーゼ＿ネガティブグループには、１０のコアグラーゼ陰性スタフィロコッカスが含まれる：スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus
capitis)、スタフィロコッカス・カプラエ(Staphylococcus
caprae)、スタフィロコッカス・コーニー(Stapylococcus
cohnii)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus
epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリティカス(Staphylococcus
haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus
hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus
lugdunensis)、スタフィロコッカス・ペッテンコルフェリ(Staphylococcus
pettenkorferi)、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus
saprophyticus)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus
warneri)。
【0109】
このブドウ球菌＿コアグラーゼ＿陰性グループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0110】
ストレプトコッカス＿コモングループには、１７のストレプトコッカス属が含まれる：ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus
agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ(Streptococcus
dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿レンサ球菌）(Streptococcus
pyogenes)、ストレプトコッカス・ガロリティカス亜種ガロリティカス(Streptococcus
gallolyticus subsp. Gallolyticus)、ストレプトコッカス・パスツリアヌス(Streptococcus
pasteurianus)（ストレプトコッカス・ガロリティカス亜種パスツリアヌス）、ストレプトコッカス・インファンタリウス亜種コリ(Streptococcus
infantarius spp. Coli)（またはストレプトコッカス・ルテチエンシス(Streptococcus
lutetiensis)）、ストレプトコッカス・インファンタリウス亜種インファンタリウス、ストレプトコッカス・ミチス(Streptococcus
mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus
oralis)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus
salivarius)、ストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus
anginosus)、ストレプトコッカス・パラサンギニス(Streptococcus
parasanguinis)、ストレプトコッカス・コンステラタス(Streptococcus
constellatus)、ストレプトコッカス・サンギニス(Streptococcus
sanguinis)、ストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus
gordonii)、ストレプトコッカス・インターメジウス(Streptococcus
intermedius)。
【0111】
このストレプトコッカス＿コモングループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0112】
ストレプトコッカス＿ボビス＿および＿関連グループには、４つのストレプトコッカス属が含まれる：ストレプトコッカス・ガロリティカス亜種ガロリティカス、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（ストレプトコッカス・ガロリティカス亜種パスツリアヌス）、ストレプトコッカス・インファンタリウス亜種コリ（またはストレプトコッカス・ルテチエンシ）、ストレプトコッカス・インファンタリウス亜種インファンタリウス。
【0113】
ストレプトコッカス＿ボビス＿および＿関連グループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0114】
ストレプトコッカス＿その他＿ストレプトコッカスグループには、９つのストレプトコッカス属が含まれる：ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・アンギノサス、ストレプトコッカス・パラサンギニス、ストレプトコッカス・コンステラタス、ストレプトコッカス・サンギニス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・インターメジウス。
【0115】
このストレプトコッカス＿その他＿ストレプトコッカスグループのペプチドは、このグループの全種に共通する。
【0116】
質量分析計
本方法は、液体分離装置およびプロセッシング手段に接続した質量分析計を使用する。
本方法は、液体分離装置およびプロセッシング手段に接続した質量分析計を使用する。
【0117】
本発明の特定の実施形態において、質量分析計は、タンデム質量分析計である。
【0118】
タンデム質量分析計は、通常、何らかの形の分子フラグメンテーションによって分離された、複数回の質量分析が可能である。タンデムＭＳは、四重極イオントラップのように、単一の質量分析計で経時的に行うこともできる。タンデムＭＳ用の分子のフラグメンテーションには、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子離脱解離（ＥＤＤ）、および表面誘起解離（ＳＩＤ）を含む様々な方法がある。
【0119】
本発明の別の実施形態では、質量分析計は、以下の技術：ＰＲＭ（並列反応モニタリング）、ＭＲＭ（多重反応モニタリング）、ＤＩＡ（データ非依存的取得）またはＳＷＡＴＨ（全理論的フラグメントイオンスペクトル質量分析の逐次枠取得）のうちの１つを使用する。
【0120】
これらの技術は当業者に周知である。
【0121】
本発明はまた、液体分離装置に接続した質量分析計を含み、かつ、工程工程ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）の実施に適合した、特に、
・ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信すること、
・複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てること、
・前記２つ以上の連続したグループの各グループにおいて少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングすること、
・あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計によって検出された場合に、次の連続するグループの少なくとも１つのトランジションのモニタリングを開始すること、および
・場合によっては、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成すること
に適合したプロセッシング手段を含む、上記の方法の実施のためのシステムに関する。
・ペプチド混合物をモニタリングするために、使用される複数のトランジションに関するデータを受信すること、
・複数のトランジションを、２つ以上の連続するトランジショングループに割り当て、前記予め定義されたトランジションリストに割り当てること、
・前記２つ以上の連続したグループの各グループにおいて少なくとも１つのセンチネルトランジションをモニタリングすること、
・あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計によって検出された場合に、次の連続するグループの少なくとも１つのトランジションのモニタリングを開始すること、および
・場合によっては、クロマトグラムまたはエレクトロフェログラムを作成すること
に適合したプロセッシング手段を含む、上記の方法の実施のためのシステムに関する。
【0122】
古典的な方法では、システムはデータ処理モジュール、すなわちプロセッサ、マイクロプロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、ＦＰＧＡなどのコンピュータを含む。このコンピュータは、必要に応じて、上記に示したデータ処理の一部を実施するためのコード命令を実行するように適合されている。このコンピュータは、上記に示したデータ処理の一部を実施するためのコード命令を実行するように適合されている。
【0123】
システムはまた、データ記憶モジュール（メモリ、例えばフラッシュ）、有利にはユーザーインターフェース（典型的には、スクリーン）、およびバイオメトリック取得手段も含む。
【0124】
センチネル化合物
本発明は、特許ＥＰ３３８４５１７に記載の、本明細書では「センチネル」取得モードと呼ばれる、大きな多重化能を可能とする技術を使用する。
本発明は、特許ＥＰ３３８４５１７に記載の、本明細書では「センチネル」取得モードと呼ばれる、大きな多重化能を可能とする技術を使用する。
【0125】
この方法論は、タンデム質量分析計による「センチネル化合物」の検出を含み、より正確には、グループの少なくとも１つのセンチネルトランジションが前のグループの一部として検出された場合に、一連の連続するグループから多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションのグループをトリガーする方法であり、
・分離装置を用いてサンプルから１以上の化合物を分離する工程；
・分離装置から受け取った分離された１以上の化合物を、イオン源を用いてイオン化し、１以上の前駆体イオンのイオンビームを生成する工程；
・タンデム質量分析計を使用して、イオン源からイオンビームを受け取り、複数のサイクルの各サイクルについて、タンデム質量分析計を使用して、リストから読み取られた一連のＭＲＭ前駆体イオンから生成物イオンへのトランジションをイオンビーム上で実行する工程であって、一連の各トランジションについて、タンデム質量分析計が、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化し、各トランジションの生成物イオンが検出されるかどうかを決定するために、各トランジションの生成物イオンのｍ／ｚの周辺の小さな質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲を質量分析する工程；
・プロセッサを用いて、サンプルをモニタリングするために使用される複数のＭＲＭトランジションを受信する工程
を含み、この方法は、
・プロセッサを用いて複数のサイクル中に異なるグループを別々にモニタリングできるように、複数のＭＲＭトランジションを２つ以上の連続するＭＲＭトランジショングループに分割する工程；
・プロセッサを用いて、モニタリングされる２つ以上の連続するグループの次のグループを識別する、２つ以上の連続するグループの各グループ内の少なくとも１つのセンチネルトランジションを選択する工程；
・プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの第１のグループをタンデム質量分析計のリストに入れる工程；および
・第１のグループの少なくとも１つのセンチネル遷移がタンデム質量分析計によって検出された場合、プロセッサを用いて、センチネルトランジションによって識別された２つ以上の連続するグループの次のグループをリストに工程
をさらに含むことを特徴とする。
・分離装置を用いてサンプルから１以上の化合物を分離する工程；
・分離装置から受け取った分離された１以上の化合物を、イオン源を用いてイオン化し、１以上の前駆体イオンのイオンビームを生成する工程；
・タンデム質量分析計を使用して、イオン源からイオンビームを受け取り、複数のサイクルの各サイクルについて、タンデム質量分析計を使用して、リストから読み取られた一連のＭＲＭ前駆体イオンから生成物イオンへのトランジションをイオンビーム上で実行する工程であって、一連の各トランジションについて、タンデム質量分析計が、各トランジションの前駆体イオンを選択してフラグメント化し、各トランジションの生成物イオンが検出されるかどうかを決定するために、各トランジションの生成物イオンのｍ／ｚの周辺の小さな質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲を質量分析する工程；
・プロセッサを用いて、サンプルをモニタリングするために使用される複数のＭＲＭトランジションを受信する工程
を含み、この方法は、
・プロセッサを用いて複数のサイクル中に異なるグループを別々にモニタリングできるように、複数のＭＲＭトランジションを２つ以上の連続するＭＲＭトランジショングループに分割する工程；
・プロセッサを用いて、モニタリングされる２つ以上の連続するグループの次のグループを識別する、２つ以上の連続するグループの各グループ内の少なくとも１つのセンチネルトランジションを選択する工程；
・プロセッサを用いて、２つ以上の連続するグループの第１のグループをタンデム質量分析計のリストに入れる工程；および
・第１のグループの少なくとも１つのセンチネル遷移がタンデム質量分析計によって検出された場合、プロセッサを用いて、センチネルトランジションによって識別された２つ以上の連続するグループの次のグループをリストに工程
をさらに含むことを特徴とする。
【0126】
この方法の微生物検出への応用が、本明細書に記載される。
【0127】
本方法で使用するセンチネル化合物は、以下の化合物から選択することができる：
・工程（ａ）の微生物タンパク質の切断から生じるペプチド、「内因性ペプチド」とも呼ばれる、この場合、本方法は以下、「センチネル－内因性」法と呼ぶ；
・トリプシン酵素の自己切断（自己消化）から生じるペプチド、またはサンプルに導入されたタンパク質もしくはペプチドの切断から生じるペプチド、または外因性導入ペプチド、「外因性ペプチド」とも呼ばれる、この場合、本方法は以下、「センチネル－外内因性」法と呼ぶ；
・他の化合物。
・工程（ａ）の微生物タンパク質の切断から生じるペプチド、「内因性ペプチド」とも呼ばれる、この場合、本方法は以下、「センチネル－内因性」法と呼ぶ；
・トリプシン酵素の自己切断（自己消化）から生じるペプチド、またはサンプルに導入されたタンパク質もしくはペプチドの切断から生じるペプチド、または外因性導入ペプチド、「外因性ペプチド」とも呼ばれる、この場合、本方法は以下、「センチネル－外内因性」法と呼ぶ；
・他の化合物。
【0128】
本方法の各実施は、実施例のセクションにより詳細に示す。
【0129】
本発明のプロセスで、工程（ｇ）および（ｈ）において、プロセッサを用いて、１つのセンチネル化合物に関連する少なくとも１つのセンチネルトランジションがモニタリングされ；あるグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのシグナルが質量分析計で検出された場合、プロセッサを用いて、前のグループのトランジションのモニタリングを停止する一方で、次の連続するグループの少なくとも１つのセンチネルトランジションのモニタリングを開始する。
【0130】
センチネル化合物は、それらのトランジショングループにおいて最も遅い予想保持時間を有するものとして選択される。言い換えれば、センチネル化合物は、プロセッサを用いて、センチネルよりも保持時間が早いペプチドグループに関連するトランジションのモニタリングを停止し、センチネルよりも保持時間が遅いペプチドグループに関連するトランジションのモニタリングを介するように適合されている。
【0131】
ペプチドグループ
別の側面において、本発明は、上記のような方法の実施に適合されたペプチドグループに関し、前記ペプチドは、微生物のリボゾームタンパク質から生じ、６～２０のアミノ酸を含み、逆相カラムで、優先的には、オクタデシル逆相カラムで、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて脱複合体化される。
別の側面において、本発明は、上記のような方法の実施に適合されたペプチドグループに関し、前記ペプチドは、微生物のリボゾームタンパク質から生じ、６～２０のアミノ酸を含み、逆相カラムで、優先的には、オクタデシル逆相カラムで、４０％未満のアセトニトリルを含む移動相を用いて脱複合体化される。
【0132】
さらに、これらのペプチドは微生物の属および／または種に特異的であり、したがって、その同定に有用である。
【0133】
このペプチドグループは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００または４００の異なるペプチドを含み得る。
【0134】
本発明の特定の実施形態において、ペプチドグループは、配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を示す少なくとも１つのペプチドを含む。
【0135】
有利には、このペプチドグループは、配列番号１～配列番号４２３から選択されるペプチド配列を有するペプチド群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００または４００の異なるペプチドを含む。
【0136】
本発明による特定のペプチドグループは次の通りである：
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すスタフィロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
・特に配列番号１５５～１５８、配列番号１６８～１８０、配列番号２００～２０１、配列番号２２３～２２９、配列番号２４５～２６４、配列番号２７４～２７７、配列番号２８２～２８９、配列番号３０６～３０７、配列番号３２０～３２７、配列番号３９３～３９５、配列番号３９８～４０９および配列番号４２２～４２３から選択される配列を示す腸内細菌目に特異的なペプチド；
・特に配列番号１３～配列番号４２から選択される配列を示すアシネトバクターに特異的なペプチド：
・特に配列番号１８１～配列番号１９９から選択される配列を示すエンテロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号８１～配列番号１５０から選択される配列を示すカンジダに特異的なペプチド；
・特に配列番号３２８～配列番号３４５および配列番号４１０～配列番号４２１から選択される配列を示すスタフィロコッカスに特異的なペプチド；
・特に配列番号３４９～配列番号３９２から選択される配列を示すストレプトコッカス属に特異的なペプチド；
・特に配列番号２９０～配列番号３００から選択される配列を示すシュードモナス・エルギノーザに特異的なペプチド：または
・特に配列番号１～配列番号１２、配列番号４３～８０、配列番号１５１～１５４、配列番号１５９～１６７、配列番号２０２～２２２、配列番号２３０～２４４、配列番号２６５～２７３、配列番号２７８～２８１、配列番号３０１～３０５、配列番号３０８～３１９、配列番号３４６～３４８、および配列番号３９６～３９７から選択される配列を示すその他の属／種に特異的なペプチド。
【0137】
特定の実施形態では、ペプチドグループは、表１に挙げられるペプチドを全て含む。
【0138】
別の実施形態では、ペプチドグループは、表１に挙げられているような４２３のペプチドからなる。
【0139】
本発明によるこれらのペプチドグループは、サンプル中の少なくとも１つの微生物の同定のためのいずれの方法またはプロセスにも使用可能である。
【0140】
本発明はまた、サンプル中、特に、生物学的サンプル中、より詳しくは、ヒト血液サンプル中の少なくとも１つの微生物の同定のための、上記で定義されたようなこのペプチドグループの１つの使用に関する。
【実施例】
【0141】
本明細書では、特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、これらの実施形態は、本発明の原理および応用を単に例示するものであることを理解されたい。したがって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に多数の変更を加えることができ、他の配置を考案することができることを理解されたい。
【0142】
実施例１： 内因性ペプチドをグループトリガーとして用いるセンチネル－ＭＲＭ法の構築
微生物を同定するために、例えば、グループトリガーとして内因性ペプチド、すなわちセンチネル化合物を使用することができる。
微生物を同定するために、例えば、グループトリガーとして内因性ペプチド、すなわちセンチネル化合物を使用することができる。
【0143】
例えば、下記のようなセンチネル－ＭＲＭ法を構築することができる。
【0144】
各微生物の特異的ペプチドは以下の８つのグループに分けられる：
ａ）３２の腸内細菌目を同定するための腸内細菌目グループ；
ｂ）シュードモナス・エルギノーザを同定するためのシュードモナス・エルギノーザグループ；
ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスまたはスタフィロコッカス・アルゲンテウスを同定するためのスタフィロコッカス・アウレウス－スタフィロコッカス・アルゲンテウスグループ；
ｄ）４つのアシネトバクターを同定するためのアシネトバクターグループ；
ｅ）２つのエンテロコッカスを同定するためのエンテロコッカスグループ；
ｆ）７つのカンジダを同定するためのカンジダグループ；
ｇ）１７のストレプトコッカス属と４つのその他の種を同定するためのストレプトコッカス属その他のグループ；
ｈ）１０のコアグラーゼ陰性スタフィロコッカスを含む３４種を同定するための「その他の種」グループ。
ａ）３２の腸内細菌目を同定するための腸内細菌目グループ；
ｂ）シュードモナス・エルギノーザを同定するためのシュードモナス・エルギノーザグループ；
ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスまたはスタフィロコッカス・アルゲンテウスを同定するためのスタフィロコッカス・アウレウス－スタフィロコッカス・アルゲンテウスグループ；
ｄ）４つのアシネトバクターを同定するためのアシネトバクターグループ；
ｅ）２つのエンテロコッカスを同定するためのエンテロコッカスグループ；
ｆ）７つのカンジダを同定するためのカンジダグループ；
ｇ）１７のストレプトコッカス属と４つのその他の種を同定するためのストレプトコッカス属その他のグループ；
ｈ）１０のコアグラーゼ陰性スタフィロコッカスを含む３４種を同定するための「その他の種」グループ。
【0145】
各グループ（グループｈを除く）は、グループの各種に特異的なペプチドとグループの全種に共通するペプチドを含む。
【0146】
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆのグループでは、２つのセンチネルペプチドがグループのトリガーとなり得る。これらの２つのセンチネルペプチドは、所望の属に厳密に特異的であり、そのグループの全種に共通である。
【0147】
例えば、グループａ）腸内細菌目では、センチネルペプチドは、全ての腸内細菌目に共通であり、腸内細菌目種にのみ存在する２つのペプチドであり、これはそれらが他のいずれのグループにも見られないことを意味する。
【0148】
病原体アシネトバクター・バウマニを含有するサンプルの例を考えてみると、このサンプルのセンチネル－ＭＲＭ分析に、グループｄ）、グループｄ）のみがトリガーされ、アシネトバクターペプチドのトランジションがモニタリングされる。グループはまた、アシネトバクター・バウマニに特異的なペプチドも含み、同定が成功する。
【0149】
図１は、内因性センチネル－ＭＲＭ法の一例として得られたクロマトグラムを示す。ペプチド強度は任意の単位で表す。
【0150】
１つだけではなく２つのペプチドをセンチネル化合物として使用するのは、トランジショングループのトリガーに確実を期すためである。例えば、ペプチドが変異しているか、または分析サンプル中に存在しない場合、第２のペプチドがトランジショングループのトリガーとなり得る。
【0151】
実施例２： 外因性ペプチド（トリプシン）をグループトリガーとして用いる外因性センチネル－ＭＲＭ法の構築
サンプル調製において、トリプシンを消化酵素として使用する。したがって、トリプシンは全てのサンプルに過剰に存在し、トリプシン自体の自己消化から生じたペプチドを、トランジショングループのセンチネル化合物として使用することができる。原理は、トリプシンの自己消化から生じる４つのペプチドをトリガーとして、各細菌種（表1参照）の特異的ペプチドを４つのグループに分配することである。
サンプル調製において、トリプシンを消化酵素として使用する。したがって、トリプシンは全てのサンプルに過剰に存在し、トリプシン自体の自己消化から生じたペプチドを、トランジショングループのセンチネル化合物として使用することができる。原理は、トリプシンの自己消化から生じる４つのペプチドをトリガーとして、各細菌種（表1参照）の特異的ペプチドを４つのグループに分配することである。
【0152】
トリプシンのＦＡＳＴＡ配列（受託番号Ｐ００７６１）（以下、配列番号４２８として参照）は次の通りである。
【化1】
【0153】
センチネルトリガー（センチネル化合物）として選択された４つのペプチドは次の通りである：
・ＮＫＰＧＶＹＴＫ（配列番号４２４）
・ＶＡＴＶＳＬＰＲ（配列番号４２５）
・ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ（配列番号４２６）
・ＩＩＴＨＰＮＦＮＧＮＴＬＤＮＤＩＭＬＩＫ（配列番号４２７）
・ＮＫＰＧＶＹＴＫ（配列番号４２４）
・ＶＡＴＶＳＬＰＲ（配列番号４２５）
・ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ（配列番号４２６）
・ＩＩＴＨＰＮＦＮＧＮＴＬＤＮＤＩＭＬＩＫ（配列番号４２７）
【0154】
図２はクロマトグラム上のこれらの４つのペプチドの分布を示す。
【0155】
トリプシン由来のペプチドを使用する利点の一つは、選択されたペプチドの全てのトランジションを追跡できることであり、強度が低い（例えばサンプル中に存在する細菌の量が少ない）ためにグループがトリガーされないリスク、またはサンプル中の干渉によってグループがトリガーされるリスクがない。
【0156】
この実施のもう一つの利点は、例えば、多感染の場合に複数の細菌を同定できることである。
【0157】
この方法の実施は、新しい種または本発明に関して選択されたパネルとは異なる種に由来するペプチドを用いて、「内因性」の方法よりも容易に増加させることもできる。例えば、「新しい」ペプチドでＭＲＭ法を作成し、それらの保持時間を知り、トリプシン性ペプチドの溶出順序に対応するトランジショングループに入れることで十分である。
【0158】
実施例３： センチネル－ＭＲＭモードの取得による陽性血液培養からの微生物の同定
１．陽性血液培養からの微生物の単離
陽性、すなわち少なくとも１つの微生物を含むとして検出された血液培養フラスコ中に存在する細菌／酵母を分離するため、手順は、溶解バッファー（ここでは、１２％ＳＤＳ）を用いて血球を溶解させ、次いで遠心分離により細菌を回収することからなる。
・シリンジと２１Ｇの針を用い、１ｍＬの血液培養培地を取り、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移す。
・２００μＬの１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、次いで、１０秒間ボルテックスで撹拌する。
・１６１００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを１ｍＬの生理学的血清に再懸濁させる。
・１６１００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。
・ペレットを１ｍＬの生理学的血清に再懸濁させる。
１．陽性血液培養からの微生物の単離
陽性、すなわち少なくとも１つの微生物を含むとして検出された血液培養フラスコ中に存在する細菌／酵母を分離するため、手順は、溶解バッファー（ここでは、１２％ＳＤＳ）を用いて血球を溶解させ、次いで遠心分離により細菌を回収することからなる。
・シリンジと２１Ｇの針を用い、１ｍＬの血液培養培地を取り、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移す。
・２００μＬの１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、次いで、１０秒間ボルテックスで撹拌する。
・１６１００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを１ｍＬの生理学的血清に再懸濁させる。
・１６１００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。
・ペレットを１ｍＬの生理学的血清に再懸濁させる。
【0159】
２．酵素消化および細胞溶解によるペプチドの生成
・１．５ｍＬのエッペンドルフＬｏｗＢｉｎｄチューブに、一さじのガラスビーズ（ガラスビーズ、酸洗浄、１５０～２１２μｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ Ｇ１１４５）を高さ約３～４ｍｍ（終容量の３分の１）になるように加える。
・段落１に従って調製したサンプルを１０分間ボルテックスで撹拌した後、２００μＬを取り、ガラスビーズを含むチューブに入れる。
・凍結乾燥トリプシンから１５０ ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーで１ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液を調製する。
・新しく調製した５０μＬのトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、ビーズと細菌／酵母を含むチューブに加え、３秒間ボルテックスで撹拌する。
・５０℃に設定した超音波発生装置、例えば、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅの水浴にサンプルを入れる。
・すぐに１分１０サイクルの超音波処理を開始する。
・３０秒超音波オン
・３０秒超音波オフ 超音波出力：低
・消化の後、５μＬのギ酸を加え、３秒間ボルテックスで撹拌して反応を停止させる。
・チューブを９６００ｇ（１０，０００ｒｐｍ Ａｃｃｕｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ １７ベンチチップ遠心機）で5分間遠心分離する。
・１５０μＬの上清を、インサートを備えたアンバーバイアルに移す。
・１．５ｍＬのエッペンドルフＬｏｗＢｉｎｄチューブに、一さじのガラスビーズ（ガラスビーズ、酸洗浄、１５０～２１２μｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ Ｇ１１４５）を高さ約３～４ｍｍ（終容量の３分の１）になるように加える。
・段落１に従って調製したサンプルを１０分間ボルテックスで撹拌した後、２００μＬを取り、ガラスビーズを含むチューブに入れる。
・凍結乾燥トリプシンから１５０ ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーで１ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液を調製する。
・新しく調製した５０μＬのトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、ビーズと細菌／酵母を含むチューブに加え、３秒間ボルテックスで撹拌する。
・５０℃に設定した超音波発生装置、例えば、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅの水浴にサンプルを入れる。
・すぐに１分１０サイクルの超音波処理を開始する。
・３０秒超音波オン
・３０秒超音波オフ 超音波出力：低
・消化の後、５μＬのギ酸を加え、３秒間ボルテックスで撹拌して反応を停止させる。
・チューブを９６００ｇ（１０，０００ｒｐｍ Ａｃｃｕｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ １７ベンチチップ遠心機）で5分間遠心分離する。
・１５０μＬの上清を、インサートを備えたアンバーバイアルに移す。
【0160】
３．分析条件：クロマトグラフィーおよび質量分析条件
各サンプルを段落１および２のプロトコールに従って処理した後、５μＬ容量の消化タンパク質を注入し、以下の条件で分析する。
・ＡＧＩＬＥＮＴ社（ＡＧＩＬＥＮＴ、サンタクララ、米国）のＨＰＬＣ装置Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｍｐ １２９０
・ＷＡＴＥＲＳクロマトグラフィーカラム（ＷＡＴＥＲＳ、サン・カンタン・アン・イブリーヌ、フランス）ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、内径１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径３．５μｍ、孔径１３０Å）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ９９．９％＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：アセトニトリル９９．９％＋０．１％ギ酸
・カラムオーブン温度：６０℃
・ＨＰＬＣ勾配は、以下に示される表２に従って定義される。
各サンプルを段落１および２のプロトコールに従って処理した後、５μＬ容量の消化タンパク質を注入し、以下の条件で分析する。
・ＡＧＩＬＥＮＴ社（ＡＧＩＬＥＮＴ、サンタクララ、米国）のＨＰＬＣ装置Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｍｐ １２９０
・ＷＡＴＥＲＳクロマトグラフィーカラム（ＷＡＴＥＲＳ、サン・カンタン・アン・イブリーヌ、フランス）ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、内径１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径３．５μｍ、孔径１３０Å）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ９９．９％＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：アセトニトリル９９．９％＋０．１％ギ酸
・カラムオーブン温度：６０℃
・ＨＰＬＣ勾配は、以下に示される表２に従って定義される。
【0161】
【表2】
【0162】
ペプチドの脱複合体化工程（すなわち、部分的分離）は、主として極性溶媒アセトニトリルから構成される４０％未満の溶媒Ｂを用いる条件下で行う。
【0163】
クロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液をＱＴＲＡＰ（登録商標）６５００＋ＡＢ ＳＣＩＥＸ（フレーミングハム、マサチューセッツ州、米国）からの質量分析計のイオン化源に直接注入する。
【0164】
機器の他の設定を下表３にまとめる。
【0165】
【表3】
【0166】
細菌のタンパク質のトリプシンによる消化から得られたペプチドを、質量分析計により、センチネル－ＭＲＭモードで分析する。追跡・検出したペプチドは、微生物に特異的であるため、微生物の同定が可能となる。
【0167】
４．センチネル－ＭＲＭ取得モードによる微生物の同定、センチネルなどの内因性ペプチドの使用、血液培養サンプルへの適用（盲検同定）
実施例１に示すセンチネル－ＭＲＭ法を血液培養サンプルに適用する。
実施例１に示すセンチネル－ＭＲＭ法を血液培養サンプルに適用する。
【0168】
センチネル－ＭＲＭ取得法は、各ペプチドにつき３以上のトランジションを使用し（表４の取得法参照）、これは１５００を超えるトランジションを含む方法から構成される。トリガーセンチネルの特異性を高め、ひいてはサンプル中に存在する干渉によりグループのトリガーを避けるために、グループのトリガーには３つのトランジションのアラインメントが必要であると判断された。
【0169】
得られたクロマトグラムを図３に示す。エンテロコッカスグループはうまくトリガーされ、エンテロコッカス属およびエンテロコッカス・フェシウム種に特異的なペプチドだけが検出された。この結果をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより確認した。
【0170】
５．センチネル－ＭＲＭ取得モードによる微生物の同定、トリプシンにより生成されたペプチドのセンチネル化合物としての使用
上記実施例と同じサンプルを、センチネル－ＭＲＭ取得法をセンチネルトリガートランジショングループとしてのトリプシンペプチドとともに適用することで分析した。
上記実施例と同じサンプルを、センチネル－ＭＲＭ取得法をセンチネルトリガートランジショングループとしてのトリプシンペプチドとともに適用することで分析した。
【0171】
結果を図４に示す。エンテロコッカス属およびエンテロコッカス・フェシウム種に特異的なペプチドだけが検出された。この結果をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより確認した。
【0172】
実施例４：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによる分析との比較における２つの取得方法の分析バリデーション
２つの取得方法のバリデーションを行うために、４２のサンプルを分析した。結果を表４に示す。
２つの取得方法のバリデーションを行うために、４２のサンプルを分析した。結果を表４に示す。
【0173】
【表4】
【0174】
患者から採取した２６４の血液培養（細菌または酵母）陽性サンプルに対する他の検査も実施されている。
【0175】
本発明のプロセスで得られた結果を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ同定技術で得られた結果と比較したところ、結果の１００％の相関が認められた。
【0176】
同定率に関しては、本発明のプロセスにより、アッセイしたサンプルの９３％で、少なくとも１種の細菌または酵母の同定が可能であった。サンプルの７％では同定が得られなかったが、これはおそらくサンプル中の微生物の量が不十分であったか、サンプルが実際には微生物を含んでいなかったためであると思われる。
【0177】
実施例５．トリプシン法によるサンプル中に存在する２種類の細菌種の同定
陽性血液サンプルを、センチネル－ＭＲＭ取得法をセンチネルトリガートランジショングループとしてのトリプシンペプチドとともに適用することで分析した。
陽性血液サンプルを、センチネル－ＭＲＭ取得法をセンチネルトリガートランジショングループとしてのトリプシンペプチドとともに適用することで分析した。
【0178】
結果を図５に示す。グループストレプトコッカス・ボビス群に特異的なペプチド（配列番号３６５、３６７）およびエシェリヒア・コリ種（配列番号２００、２０１）に特異的なペプチドが検出された。
【0179】
この結果を、血液サンプルの一晩の継代培養工程の翌日にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで確認した。
【0180】
有利なことに、本発明のプロセスは、同一サンプル中の少なくとも２つの異なる種の同定を可能にする。
【0181】
参考文献：本文中の引用順
特許文献
・WO 2011/045544
・WO 2012/143535
・WO 2012/143534
・EP 3384517
・WO 2005/098071
・WO 2014/116711
参考文献
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・Lasch P, Schneider A, Blumenscheit C, Doellinger J. Identification of Microorganisms by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS1) and in Silico Peptide Mass Libraries. Mol Cell Proteomics. 2020 Dec;19(12):2125-2139. doi: 10.1074/mcp.TIR120.002061. Epub 2020 Sep 30. PMID: 32998977; PMCID: PMC7710138.
・Boulund F, Karlsson R, Gonzales-Siles L, Johnning A, Karami N, Al-Bayati O, Ahren C, Moore ERB, Kristiansson E. Typing and Characterization of Bacteria Using Bottom-up Tandem Mass Spectrometry Proteomics. Mol Cell Proteomics. 2017 Jun;16(6):1052-1063.
・Christian Blumenscheit, Yvonne Pfeifer, Guido Werner, Charlyn John, Andy Schneider, Peter Lasch, Joerg Doellinger. Unbiased antimicrobial resistance detection from clinical bacterial isolates using proteomics. bioRxiv 2020.11.17.386540; doi:
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】