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特表2024-528649抗ＴＲＯＰ２抗体を含む薬物複合体の医薬組成物及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】抗ＴＲＯＰ２抗体を含む薬物複合体の医薬組成物及びその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240723BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240723BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240723BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240723BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240723BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240723BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240723BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20240723BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61P35/00 ZNA
A61P35/02
A61K47/22
A61K47/26
A61K47/18
A61K39/395 T
A61K31/4745
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502665
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-01-17
(86)【国際出願番号】 CN2022107134
(87)【国際公開番号】W WO2023001248
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】202110823295.2
(32)【優先日】2021-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519352757
【氏名又は名称】江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．７ ＫＵＮＬＵＮＳＨＡＮ ＲＯＡＤ， ＥＣＯＮＯＭＩＣ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＺＯＮＥ， ＬＩＡＮＹＵＮＧＡＮＧ， ＪＩＡＮＧＳＵ ２２２０４７， ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】莫 希叶▲楽▼
(72)【発明者】
【氏名】田 晨▲敏▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 洵
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076CC27
4C076DD09F
4C076DD51
4C076DD60Z
4C076DD67
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB22
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZB27
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
抗ＴＲＯＰ２抗体薬物複合体を含む医薬組成物及びその用途である。具体的に、緩衝液における抗体薬物複合体を含む医薬組成物に関する。本開示の医薬組成物は良好な安定性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体薬物複合体及び緩衝剤を含む医薬組成物であって、前記抗体薬物複合体は下記に示される構造を有し、即ち、【化1】
ＰＤ３は、配列番号１に示される重鎖と、配列番号２に示される軽鎖とを含む抗ＴＲＯＰ２抗体であり、
ｎは１～１０、好ましくは１～８であり、
前記医薬組成物の緩衝剤はヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤であり、ｐＨが約５．０～約６．５であり、好ましくはｐＨが約５．５～約６．５、より好ましくはｐＨが約５．９～約６．２である、
医薬組成物。
【請求項2】
前記緩衝剤の濃度は約１０～約５０ｍＭ、好ましくは約２０～約４０ｍＭ、より好ましくは約３０ｍＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記医薬組成物は、界面活性剤をさらに含み、前記界面活性剤は好ましくはポリソルベート、より好ましくはポリソルベート８０又はポリソルベート２０、最も好ましくはポリソルベート８０である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記界面活性剤の濃度は約０．０１～約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｍＬである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記医薬組成物は、糖をさらに含み、前記糖は、好ましくはスクロースとトレハロース二水和物から選ばれ、最も好ましくはスクロースである、請求項１～４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記糖の濃度は約２５～約８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約３０～約５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記医薬組成物は、アミノ酸又はアミノ酸塩をさらに含み、前記アミノ酸又はアミノ酸塩は、好ましくはグリシンとアルギニン塩酸塩から選ばれ、より好ましくはグリシンである、請求項１～６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記グリシンの濃度は約６～約１５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約７～約１１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約９ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記抗体薬物複合体の濃度はタンパク質の濃度で、約１～約１００ｍｇ／ｍＬ、約１０～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１８～約２２ｍｇ／ｍＬである、請求項１～８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
下記の成分、即ち、（ａ）タンパク質の濃度で、約１０～約３０ｍｇ／ｍＬの前記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約３０～約５０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約７～約１１ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約２０～約４０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、前記組成物のｐＨは約５．５～６．５であり、
好ましくは、前記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）タンパク質の濃度で、約１８～約２２ｍｇ／ｍＬの前記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、前記組成物のｐＨは約５．９～６．２である、
請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
再溶解した後、請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物を形成することができる、ことを特徴とする抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤。
【請求項12】
請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法。
【請求項13】
請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥して得られる、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤。
【請求項14】
請求項１１又は１３に記載の凍結乾燥製剤を再溶解して調製して得られる、ことを特徴とする抗体薬物複合体を含む再溶解溶液。
【請求項15】
請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１１又は１３に記載の凍結乾燥製剤或いは請求項１４に記載の再溶解溶液が入った容器を含む、製品。
【請求項16】
請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１１又は１３に記載の凍結乾燥製剤、請求項１４に記載の再溶解溶液或いは請求項１５に記載の製品のＴＲＯＰ－２仲介性の疾患又は病状を治療するための薬剤の調製における用途。
【請求項17】
請求項１～１０の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１１又は１３に記載の凍結乾燥製剤、請求項１４に記載の再溶解溶液或いは請求項１５に記載の製品の腫瘍とがんを治療及び／又は予防する薬剤の調製における用途であって、そのうち、前記腫瘍とがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、咽頭扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がんとメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病と骨髄細胞白血病から選ばれる、用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、薬物製剤分野に属し、具体的に、抗ＴＲＯＰ２抗体を含む薬物複合体の医薬組成物、及びその抗がん剤としての用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。
【0003】
抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を、安定した化学リンカー化合物により生物活性を有する細胞毒素に連結し、抗体の腫瘍細胞表面抗原への結合の特異性及び細胞毒素の高い有効性を活用すると共に、前者の治療効果が比較的低く、及び後者の毒性と副作用が大きすぎるといった欠陥を回避している。これはつまり、従来の化学療法薬と比べ、抗体薬物複合体が腫瘍細胞と正確に結合すると共に、正常な細胞への影響を低減することができることを意味する（Ｍｕｌｌａｒｄ Ａ，（２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １２：３２９-３３２； ＤｉＪｏｓｅｐｈ ＪＦ， Ａｒｍｅｌｌｉｎｏ ＤＣ，（２００４） Ｂｌｏｏｄ， １０３：１８０７－１８１４）。
【0004】
抗体薬物複合体に用いられる細胞毒性を有する低分子は、幾つかの種類があるが、そのうちの一つは、トポイソメラーゼＩを阻害することにより抗腫瘍作用を有するカンプトセシン誘導体である。カンプトセシン誘導体であるエキサテカン（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３，，４，：６，７］イミダゾ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオン）を抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に適用することを報告した文献には、ＷＯ２０１４０５７６８７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２２（２０）：５０９７－５１０８、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ（２０１６） １０７：１０３９－１０４６がある。ところが、依然として治療効果のより良いＡＤＣ薬剤をさらに開発しなければならない。
【0005】
しかし、ＡＤＣは、抗体よりも複雑なヘテロ構造を有するため、治療用のＡＤＣ製剤にさらに大きな挑戦をもたらしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、抗体薬物複合体及び緩衝剤を含む医薬組成物を提供し、そのうち、上記抗体薬物複合体は下記に示される構造を有し、即ち、
【0007】
【化1】
【0008】
上記のような抗体薬物複合体は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９の明細書の第４１ページの抗体複合体実施例３－１ ＡＤＣ－１を参照して調製され、
そのうち、
ＰＤ３は、抗ＴＲＯＰ２抗体であり、その供給源は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の第４１ページの抗体ＰＤ３を参照し、配列番号１に示される重鎖（ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の配列番号１３）と、配列番号２（ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の配列番号１４）に示される軽鎖とを含む、
ＰＤ３の重鎖アミノ酸配列：
そのうち、
ＰＤ３は、抗ＴＲＯＰ２抗体であり、その供給源は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の第４１ページの抗体ＰＤ３を参照し、配列番号１に示される重鎖（ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の配列番号１３）と、配列番号２（ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３２７９中の配列番号１４）に示される軽鎖とを含む、
ＰＤ３の重鎖アミノ酸配列：
【0009】
【数1】
【0010】
ＰＤ３の軽鎖アミノ酸配列：
【0011】
【数2】
【0012】
ｎは１～１０、好ましくは１～８、より好ましくは３～５、最も好ましくは約４であり、
上記医薬組成物の緩衝剤はヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤であり、ｐＨが約５．０～約６．５であり、好ましくはｐＨが約５．５～約６．５、より好ましくはｐＨが約５．９～約６．２である。
上記医薬組成物の緩衝剤はヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤であり、ｐＨが約５．０～約６．５であり、好ましくはｐＨが約５．５～約６．５、より好ましくはｐＨが約５．９～約６．２である。
【0013】
選択的な実施形態において、医薬組成物における上記緩衝剤のｐＨ値は約５．０～約６．５であり、非限定的な実施例は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含み、好ましくはｐＨが約５．５～約６．５、より好ましくはｐＨが約５．９～約６．２である。
【0014】
選択的な実施形態において、医薬組成物における緩衝剤の濃度は約５～約５０ｍＭであり、非限定的な実施例は、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含み、好ましくは約１０～約５０ｍＭ、より好ましくは約２０～約４０ｍＭ、最も好ましくは約３０ｍＭである。
【0015】
選択的な実施形態において、医薬組成物は界面活性剤をさらに含む。ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノール－スルホベタイン、ステアリン－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノール－サルコシン、ステアリン－サルコシン、リノール－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルミタミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、メチルオレイルタウリンナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びエチレンとプロピレングリコールの共重合体などから選ばれてもよい。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０又はポリソルベート２０、より好ましくはポリソルベート８０である。
【0016】
選択的な実施形態において、医薬組成物における界面活性剤の濃度は約０．０１～約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０５～約０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬ又は約０．２～約０．６ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｍＬであり、非限定的な実施例は、約０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．３５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．４５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含む。
【0017】
選択的な実施形態において、上記医薬組成物は糖をさらに含む。本開示の「糖」は、通常の組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含み、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む。上記糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、ｓｙｌｉｔｏｌ、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルトースアルコール、ラクトースアルコール、イソ－マルツロースなどから選ばれてもよい。好ましい糖は非還元二糖であり、より好ましくはトレハロース二水和物又はスクロースであり、最も好ましくはスクロースである。
【0018】
選択的な実施形態において、上記医薬組成物における糖の濃度は約２５～約８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約３０～約５０ｍｇ／ｍＬ、非限定的な実施例は、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含み、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
【0019】
選択的な実施形態において、上記医薬組成物はアミノ酸及びその塩をさらに含み、上記アミノ酸及びその塩は、グリシンとアルギニン塩酸塩から選ばれることが好ましく、グリシンがより好ましい。
【0020】
選択的な実施形態において、上記医薬組成物における上記グリシンの濃度は約６～約１５ｍｇ／ｍＬ、約７～約１１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約７～約１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約７～約９ｍｇ／ｍＬ、約８～約９ｍｇ／ｍＬであり、非限定的な実施例は、約６ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、７．２ｍｇ／ｍＬ、７．６ｍｇ／ｍＬ、７．８ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１０．２ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含み、最も好ましくは約９ｍｇ／ｍＬである。
【0021】
選択的な実施形態において、医薬組成物における上記抗体薬物複合体の濃度はタンパク質の濃度で、約１～約１００ｍｇ／ｍＬであり、非限定的な実施例は、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含み、好ましくは約１０～約３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１８～約２２ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬである。具体的に、非限定的な実施例は、２０．１ｍｇ／ｍＬ、２０．２ｍｇ／ｍＬ、２０．３ｍｇ／ｍＬ、２０．４ｍｇ／ｍＬ、２０．５ｍｇ／ｍＬ、２０．６ｍｇ／ｍＬ、２０．７ｍｇ／ｍＬ、２０．８ｍｇ／ｍＬ、２０．８１ｍｇ／ｍＬ、２０．８２ｍｇ／ｍＬ、２０．８３ｍｇ／ｍＬ、２０．８４ｍｇ／ｍＬ、２０．８５ｍｇ／ｍＬ、２０．８６ｍｇ／ｍＬ、２０．８７ｍｇ／ｍＬ、２０．８８ｍｇ／ｍＬ、２０．８９ｍｇ／ｍＬ、２０．９ｍｇ／ｍＬ、２０．９ｍｇ／ｍＬ、２０．９１ｍｇ／ｍＬ、２０．９２ｍｇ／ｍＬ、２０．９３ｍｇ／ｍＬ、２０．９４ｍｇ／ｍＬ、２０．９５ｍｇ／ｍＬ、２０．９６ｍｇ／ｍＬ、２０．９７ｍｇ／ｍＬ、２０．９８ｍｇ／ｍＬ、２０．９９ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ及びこれらのポイント値の間の任意の範囲を含む。上記の「タンパク質の濃度で」とは、抗体薬物複合体中の抗体部分の濃度で計量することを意味する。
【0022】
選択的な実施形態において、薬剤担持量（ｎ）の範囲は、各抗Ｔｒｏｐ２抗体の結合する細胞毒性薬物の平均数であってもよく、非限定的な実施例は、各抗体の結合する細胞毒性薬物の平均個数が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及びこれらのポイント値の間の任意の範囲であることを含む。好ましくは、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～４、３～５、５～６、５～７、５～８及び６～８の範囲から選ばれる。例示的に、薬剤担持量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値であってもよい。ｎは小数又は整数である。
【0023】
選択的な実施形態において、薬剤担持量（ｎ）は約４である。
【0024】
選択的な実施形態において、上記医薬組成物は、
（ａ）タンパク質の濃度で、約１０～約３０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約３０～約５０ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約７～１１ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約２０～約４０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．５～６．５であり、
好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）タンパク質の濃度で、約１８～約２２ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．９～６．２であり、
より好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）タンパク質の濃度で、約２０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約６．０である。
（ａ）タンパク質の濃度で、約１０～約３０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約３０～約５０ｍｇ／ｍＬの糖と、（ｄ）約７～１１ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約２０～約４０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．５～６．５であり、
好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）タンパク質の濃度で、約１８～約２２ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．９～６．２であり、
より好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）タンパク質の濃度で、約２０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約６．０である。
【0025】
選択的な実施形態において、上記何れか一項の医薬組成物は液体製剤である。本発明の液体製剤又は再溶解した後の製剤は、比較的良い安定性を有し、冷蔵温度（４℃）で少なくとも３ヶ月間保存される。また、安定した液体製剤は、２５℃を含む温度で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月を含む期間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤を含む。さらに、安定した液体製剤は、４０℃を含む温度で１ヶ月間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤を含む。
【0026】
本開示は、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤であって、上記製剤を再溶解した後、上記のような医薬組成物を形成することができることを特徴とする凍結乾燥製剤をさらに提供する。
【0027】
本開示は、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、上記のような医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む方法をさらに提供する。
【0028】
選択的な実施形態において、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法における上記凍結乾燥は、順に予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥というステップを含む。製剤の凍結及びその後の一次乾燥に適する温度での水の昇華により、凍結乾燥を行う。この条件で、生成物の温度は製剤の低共融点又は崩壊温度よりも低い。通常、一次乾燥の温度範囲は、約－３０～２５℃である（生成物が一次乾燥過程中に凍結されたままと仮定する）。乾燥に必要な時間は、製剤、サンプルを収容する容器（例えば、ガラスバイアル）の大きさと種類及び液体の体積によって決められ、上記時間の範囲は、数時間から数日間（例えば、４０～６０時間）であってもよい。二次乾燥段階は約０～４０℃で行われてもよく、これは、主に容器の種類と大きさ及び使用されるタンパク質の種類によって決められる。二次乾燥の時間は、生成物における所望の残りの水分のレベルによって決められ、通常、少なくとも約５時間が必要である。通常、低圧で凍結乾燥された製剤の含水量は約５％よりも低く、好ましくは約３％よりも低い。圧力は、一次乾燥ステップに適用される圧力と同じであってもよく、好ましくは、二次乾燥の圧力が一次乾燥よりも低い。凍結乾燥の条件は、製剤及びバイアルの大きさによって変えてもよい。
【0029】
本開示の一選択的な実施例において、４．４ｍＬの組成物の原液を凍結乾燥し、凍結乾燥手順は、予備凍結の温度が順に５℃と－４５℃、一次乾燥の温度が－２０℃、真空度が１０Ｐａ、二次乾燥の温度が２５℃、真空度が順に１０Ｐａと１Ｐａである。
【0030】
幾つかの実施形態において、凍結乾燥製剤は、２～８℃で少なくとも１６日、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月又は少なくとも２４ヶ月間安定している。幾つかの実施形態において、当該凍結乾燥製剤は、４０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間又は少なくとも３０日間安定している。
【0031】
本開示は、抗体薬物複合体を含む凍結乾燥製剤であって、上記のような抗体薬物複合体の医薬組成物を凍結乾燥することで得られる凍結乾燥製剤をさらに提供する。
【0032】
本開示は、抗体薬物複合体を含む再溶解溶液であって、上記のような凍結乾燥製剤を再溶解することで調製して得られることを特徴とする再溶解溶液をさらに提供する。
【0033】
本開示は、上記再溶解溶液を調製する方法であって、上記凍結乾燥製剤を再溶解するステップを含む方法をさらに提供し、その再溶解に用いられる溶液は、注射用水、生理食塩水又はグルコース溶液を含むが、これらに限定されない。
【0034】
選択的な実施形態において、上記再溶解溶液は、下記の成分、即ち、
（ａ）約１０～約３０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約２５～約８０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約７～１１ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約１０～約４０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．５～６．５であり、
好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）約１８～約２２ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジンとを含み、上記組成物のｐＨは約５．９～６．２であり、
より好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）約２０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジンとを含み、上記組成物のｐＨは約６．０である。
（ａ）約１０～約３０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．１～約０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートと、（ｃ）約２５～約８０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約７～１１ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約１０～約４０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤とを含み、上記組成物のｐＨは約５．５～６．５であり、
好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）約１８～約２２ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジンとを含み、上記組成物のｐＨは約５．９～６．２であり、
より好ましくは、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）約２０ｍｇ／ｍＬの上記抗体薬物複合体と、（ｂ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）約４０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）約９ｍｇ／ｍＬのグリシンと、（ｅ）約３０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジンとを含み、上記組成物のｐＨは約６．０である。
【0035】
本開示は、上記のような医薬組成物、凍結乾燥製剤又は再溶解溶液が入った容器を含む製品をさらに提供する。幾つかの実施形態において、当該容器は、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤ボトルである。
【0036】
本開示は、上記の医薬組成物又は凍結乾燥製剤又は再溶解溶液又は製品の腫瘍を治療又は予防する薬剤の調製における応用をさらに提供する。
【0037】
本開示は、疾患を治療する方法であって、上記の医薬組成物又は凍結乾燥製剤又は再溶解溶液又は製品を提供することを含む方法をさらに提供する。
【0038】
本開示は、疾患を治療するための、薬剤としての上記の医薬組成物、又は凍結乾燥製剤、又は再溶解溶液、又は製品、の用途をさらに提供する。
【0039】
本開示は、薬剤としての上記の医薬組成物、又は凍結乾燥製剤、又は再溶解溶液、又は製品をさらに提供し、好ましくは、上記薬剤は、腫瘍疾患の治療又は予防に用いられる。
【0040】
選択的な実施形態において、上記の疾患又は腫瘍はＴＲＯＰ２仲介性の疾患又は病状である。
【0041】
本開示は、薬剤としての上記の医薬組成物、又は凍結乾燥製剤、又は再溶解溶液、又は製品の、腫瘍とがんを治療及び／又は予防する薬剤の調製における用途をさらに提供し、そのうち、上記腫瘍とがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、咽頭扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がんとメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、上記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、上記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病と骨髄細胞白血病から選ばれる。
【0042】
当業者によく知られているように、本開示に記載される各実施形態の１つ、幾つか又は全ての特性は、さらに組み合わせて本開示の他の実施形態を形成することができる。本開示の上記の実施形態及び組み合わせることで得られた他の実施形態は、以下の詳細な記載によってさらに説明する。
【0043】
［発明の詳細な説明］
本開示は、製造及び投与により有利で、性能が安定した医薬組成物を提供する。ここで、望ましくない不安定性は、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、毒素の解離などの何れか１つ又は複数を含んでもよい。具体的に、本開示に記載される医薬組成物は、抗体薬物複合体及び緩衝剤を含む。
用語
本開示は、製造及び投与により有利で、性能が安定した医薬組成物を提供する。ここで、望ましくない不安定性は、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、毒素の解離などの何れか１つ又は複数を含んでもよい。具体的に、本開示に記載される医薬組成物は、抗体薬物複合体及び緩衝剤を含む。
用語
【0044】
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本願で特に明確な定義のない限り、本願に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に一般的に理解されている意味を持っている。
【0045】
本開示は、出願ＷＯ２０２００６３６７３における内容を全て本発明に組み込んでいる。
【0046】
「抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）」は、リンカーユニットを介して抗体を、生物活性を有する細胞毒素又は細胞殺傷活性を有する低分子薬物に連結するものである。
【0047】
「薬剤担持量」は、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）とも呼ばれ、即ち、ＡＤＣ中のそれぞれの抗体に複合された薬物の平均数量である。それは、例えば、それぞれの抗体が約１～約１０個の薬物に複合される範囲内であってもよく、また、ある実施例において、それぞれの抗体が約１～約８個の薬物に複合される範囲内であり、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～４、３～５、５～６、５～７、５～８と６～８の範囲から選ばれる。例示的に、薬剤担持量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の平均値であってもよい。本開示に係るＡＤＣの一般式は、上記一定の範囲内での薬物複合体抗体の集合を含む。本開示の実施形態において、薬剤担持量はｎで表されてもよい。薬剤担持量は、ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡ試験及びＨＰＬＣなどの通常の方法により測定することができる。
【0048】
「リンカーユニット」又は「連結断片」又は「連結ユニット」という用語は、一端が抗体又はその抗原結合断片に連結され、他端が薬物に連結された化学構造断片又は結合を指し、他のリンカーに連結された後、薬物に連結されてもよい。
【0049】
リンカーは、伸長体、スペーサー及びアミノ酸ユニットを含み、例えば、ＵＳ２００５－０２３８６４９Ａ１に記載された方法のようなこの分野での既知の方法により合成することができる。リンカーは、細胞において薬物を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許Ｎｏ．５，２０８，０２０）を使用してもよい。
【0050】
細胞毒性薬物の負荷量は、
（１）連結試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（２）反応時間と温度を制御することと、
（３）異なる反応試薬を選択することと、を含む非限定的な方法で制御することができる。
（１）連結試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（２）反応時間と温度を制御することと、
（３）異なる反応試薬を選択することと、を含む非限定的な方法で制御することができる。
【0051】
本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0052】
本開示に記載される「抗体」は、所望の抗原結合活性を示せば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、全長抗体と抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むが、これらに限定されない。通常、天然の完全抗体は、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で連結してなるテトラペプチド鎖構造である。
【0053】
本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。さらに好ましい従来技術の一つとして、哺乳類発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製が行われる。非特異的に結合した成分を洗い流す。さらに、ｐＨ勾配法により、結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに－７０℃などで冷凍し、又は凍結乾燥する。
【0054】
「緩衝剤」は、その酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に耐える緩衝剤を指す。ｐＨを適当な範囲に制御する緩衝剤の例は、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グリシルグリシン及び他の有機酸緩衝剤を含む。
【0055】
「ヒスチジン緩衝剤」は、ヒスチジンを含む緩衝剤である。ヒスチジン緩衝剤の実例としては、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、ヒスチジン－酢酸ヒスチジン、ヒスチジン－リン酸ヒスチジン、ヒスチジン－硫酸ヒスチジンなどの緩衝剤を含み、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤である。ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤は、ヒスチジンと塩酸により調製されるか、又はヒスチジンと塩酸ヒスチジンにより調製されてもよい。
【0056】
「クエン酸塩緩衝剤」は、クエン酸イオンを含む緩衝剤である。クエン酸塩緩衝剤の実例は、クエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸カリウム、クエン酸－クエン酸カルシウム、クエン酸－クエン酸マグネシウムなどを含む。好ましいクエン酸塩緩衝剤は、クエン酸－クエン酸ナトリウムである。
【0057】
「コハク酸塩緩衝剤」は、コハク酸イオンを含む緩衝剤である。コハク酸塩緩衝剤の実例は、コハク酸－コハク酸ナトリウム塩、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウム塩などを含む。好ましいコハク酸塩緩衝剤は、コハク酸－コハク酸ナトリウム塩である。例示的に、上記コハク酸－コハク酸ナトリウムは、コハク酸と水酸化ナトリウムにより調製されるか、又はコハク酸とコハク酸ナトリウム塩により調製されてもよい。
【0058】
「リン酸塩緩衝剤」は、リン酸イオンを含む緩衝剤である。リン酸塩緩衝剤の実例は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム－クエン酸などを含む。好ましいリン酸塩緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。
【0059】
「酢酸塩緩衝剤」は、酢酸イオンを含む緩衝剤である。酢酸塩緩衝剤の実例は、酢酸－酢酸ナトリウム、ヒスチジン－酢酸ヒスチジン、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。好ましい酢酸塩緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウムである。
【0060】
「医薬組成物」は、１種又は複数種の本明細書に記載される抗体薬物複合体又はその生理学的／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと、生理学的／薬学的に許容されるベクターや賦形剤などの他の化学成分とを含む混合物を示す。医薬組成物は、抗体の活性成分の安定性を保持し、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮するためのものである。
【0061】
本開示において、「医薬組成物」と「製剤」は相互に排他的ではない。
【0062】
本開示に記載される医薬組成物の溶液形態は、特に説明のない限り、その中の溶媒は何れも水である。
【0063】
「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液形態の医薬組成物、又は液体若しくは溶液製剤に対して真空凍結乾燥ステップを行った後に得られた製剤又は医薬組成物を示す。
【0064】
本明細書に使用される「約」、「ほぼ」という用語は、数値が当業者により測定された具体値の許容可能な誤差範囲にあることを意味し、上記数値部分が如何に計測又は測定するか（即ち、計測システムの限度）に依存する。例えば、この分野での各回の実行において「約」は、１以内又は１を超えた標準差を意味してもよい。或いは、「約」又は「基本的に含む」は、多くとも２０％の範囲を意味してもよい。さらに、特に生物学的システム又は過程について、当該用語は、多くとも１桁又は数値の多くとも５倍を意味してもよい。特に説明のない限り、具体値が本願及び特許請求の範囲に現れる場合、「約」又は「基本的に含む」の意味は、当該具体値の許容可能な誤差範囲内にあると仮定すべきである。
【0065】
本開示に記載される医薬組成物は、安定的な効果を達成することができ、即ち、そのうちの抗体薬物複合体は貯蔵された後、基本的にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を保持しており、好ましくは、医薬組成物は貯蔵された後、基本的にその物理的・化学的安定性及びその生物学的活性を保持している。貯蔵期間は、一般的に医薬組成物の所定の保存期間によって選択される。現在、タンパク質の安定性を測定する分析技術は複数種あり、所定温度で、所定期間貯蔵した後の安定性を測定することができる。
【0066】
安定した製剤は、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１年間保存された場合に顕著な変化が認められない製剤である。また、安定した液体製剤は、２５℃を含む温度で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月を含む期間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤を含む。さらに、安定した液体製剤は、４０℃を含む温度で１０日、２０日、１ヶ月を含む期間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤を含む。安定性の典型的な例としては、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集又は分解を発生した抗体モノマーが通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えないことが測定される。視覚的分析により、製剤は、淡黄色でほぼ無色透明な液体、又は無色、又は清澄からやや乳白色である。上記製剤の濃度、ｐＨ及び重量モル浸透圧濃度は、変化が±１０％を超えない。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない減少が見られる。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない凝集が形成される。
【0067】
目視で色及び／又は清澄度が検出され、又はＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）により測定されたところ、抗体薬物複合体が顕著な凝集増加、沈殿及び／又は変性を示さないと、上記抗体薬物複合体は、薬物製剤において「その物理的安定性を保持している」とする。タンパク質の配座の変化は、蛍光分光法（タンパク質の三次構造を確定するもの）により、及びＦＴＩＲ分光法（タンパク質の二次構造を確定するもの）により評価することができる。
【0068】
抗体薬物複合体が顕著な化学的変化を示さないと、上記抗体は、薬物製剤において「その化学的安定性を保持している」とする。化学的に形態が変化されたタンパク質を検出・定量することにより、化学的安定性を評価することができる。タンパク質の化学構造を常に変化させる分解過程は、加水分解又は切断（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーやＣＥ－ＳＤＳなどの方法で評価される）、酸化（例えば、質量分析法又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと結合するペプチドマッピング法などの方法で評価される）、脱アミド作用（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング法、イソアスパラギン酸の測定などの方法で評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含有量の測定、ペプチドマッピング法などで評価される）を含む。
【0069】
抗体薬物複合体は、既定の時間での生物活性が薬物製剤の調製時に示される生物活性の所定範囲にある場合、上記抗体薬物複合体は、薬物製剤において「その生物活性を保持している」とする。
【0070】
「任意選択的」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、必ずしも生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。
【0071】
「置換される」とは、基の中の１つ又は複数の水素原子、好ましくは５個以下、より好ましくは１～３個の水素原子が互いに独立的に対応する数の置換基で置換されることを指す。無論、置換基は、それらの化学的に可能な部位にしか位置せず、当業者はそれほど努力せずに（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基は、不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子に結合する場合、不安定になる可能性がある。
【0072】
通常の医薬組成物の調製は、中国薬典に示されている。
【0073】
「ベクター」という用語は、本開示の薬物に利用されるものとして、薬物の人体への入り方と体内での分布を変更し、薬物の放出速度を制御し、薬物を標的器官に輸送することができる系を指す。薬物ベクターの放出と標的系により、薬物の分解と損失を低減し、副作用を低下させ、生物学的利用能を向上させることができる。例えば、ベクターとしての高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため、自己集合して様々な形態の凝集体を形成することができ、好ましい実例は、例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、ゲル、液晶、ベシクルなどである。これらの凝集体は、薬物分子を封入する能力を有すると共に、膜に対して良好な透過性を有し、良い薬物ベクターとすることができる。
【0074】
「投与」及び「処理」は、動物、ヒト、実験被験者、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、臓器や生物流体との接触を意味する。「投与」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
【0075】
「治療」は、例えば、本開示の何れか１つの結合化合物の組成物を含む経口又は外用治療剤を患者に与えることを意味し、上記患者は１種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。通常、治療を受ける患者又はグループには、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導したり、これらの症状を臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないように抑制したりする。何れかの具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者において必要な治療効果を発生させる能力など、種々の要因によって変化することができる。当該症状の重症度や進行状況の評価に医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各標的疾患症状の緩和において無効である可能性があるが、この分野で既知の任意の統計学的検定方法、例えばＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を低減するはずであることが確認された。
【0076】
「有効量」は、医学的疾患の症状又は病状の改善又は予防に十分な量を含む。有効量は、さらに、診断の許容又は促進に十分な量を指す。特定の患者又は獣医対象に用いられる有効量は、例えば、治療すべき病状、患者の全体的な健康状況、投与の方法経路と用量及び副作用の重症度などの要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与計画であってもよい。
【0077】
「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶剤系の置換を指し、例えば、抗体タンパク質が安定な製剤に存在するように、製剤を安定化する緩衝系で物理的な操作方式により抗体タンパク質を含む高塩又は高浸透圧の溶剤系を置換する。上記物理的な操作方式は、限外ろ過、透析又は遠心分離後の再溶解を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0078】
【図1】ＢｘＰＣ３細胞及びＭｉａＰａＣａ２混合細胞に対するＡＤＣのバイスタンダー殺傷活性の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0079】
以下、実施例と合わせて本開示をさらに説明するが、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は一般的に、冷泉港実験室に出版された『抗体技術実験マニュアル』、『分子クローンマニュアル』のような通常の条件に従い、或いは原料又は商品メーカーにより勧められた条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
調製例１
Ｉ． 抗体の調製
本開示に使用される対照分子ｈＲＳ７は特許ＷＯ０３０７４５６６を参照して構築され、ＴＩＮＡ抗体は特許ＷＯ２０１５０９８０９９Ａ１を参照して構築され、その配列はそれぞれ下記の通りであり、即ち、
ｈＲＳ７重鎖：
調製例１
Ｉ． 抗体の調製
本開示に使用される対照分子ｈＲＳ７は特許ＷＯ０３０７４５６６を参照して構築され、ＴＩＮＡ抗体は特許ＷＯ２０１５０９８０９９Ａ１を参照して構築され、その配列はそれぞれ下記の通りであり、即ち、
ｈＲＳ７重鎖：
【0080】
【数3】
【0081】
ｈＲＳ７軽鎖：
【0082】
【数4】
【0083】
ＴＩＮＡ重鎖：
【0084】
【数5】
【0085】
ＴＩＮＡ軽鎖：
【0086】
【数6】
【0087】
ＩＩ． ＡＤＣの調製
ＡＤＣ原液の薬剤担持量の分析
ＡＤＣは抗体架橋体類薬剤であり、その疾患を治療するメカニズムは、抗体の標的指向性により毒素分子を細胞に輸送することで、細胞を死滅させることである。薬物の負荷量は、薬効に決定的な役割を果たしている。
ＡＤＣ原液の薬剤担持量の分析
ＡＤＣは抗体架橋体類薬剤であり、その疾患を治療するメカニズムは、抗体の標的指向性により毒素分子を細胞に輸送することで、細胞を死滅させることである。薬物の負荷量は、薬効に決定的な役割を果たしている。
【0088】
一、ＵＶ－Ｖｉｓによる算出方法
紫外線法によりＡＤＣ原液の薬剤担持量を測定した。
紫外線法によりＡＤＣ原液の薬剤担持量を測定した。
【0089】
実験の方法
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及びサンプル測定吸収セルにそれぞれ置いてから、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットをサンプル測定吸収セルに置き、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍでの吸光度を測定した。
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及びサンプル測定吸収セルにそれぞれ置いてから、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットをサンプル測定吸収セルに置き、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍでの吸光度を測定した。
【0090】
結果の算出
紫外線分光光度法（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００紫外線分光光度計）によりＡＤＣ原液負荷量を測定し、その原理は、ある波長でのＡＤＣ原液の全吸光値が、細胞毒性薬剤とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことであり、即ち、
（１）Ａ２８０ｎｍ＝εｍａｂ－２８０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－２８０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－２８０：薬物の２８０ｎｍでの平均モル吸光係数が５１００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度であり、
εｍａｂ－２８０：モノクローナル抗体原液の２８０ｎｍでの平均モル吸光係数は２１４６００であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体原液の濃度であり、
ｂ：光路長は１ｃｍである。
紫外線分光光度法（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００紫外線分光光度計）によりＡＤＣ原液負荷量を測定し、その原理は、ある波長でのＡＤＣ原液の全吸光値が、細胞毒性薬剤とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことであり、即ち、
（１）Ａ２８０ｎｍ＝εｍａｂ－２８０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－２８０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－２８０：薬物の２８０ｎｍでの平均モル吸光係数が５１００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度であり、
εｍａｂ－２８０：モノクローナル抗体原液の２８０ｎｍでの平均モル吸光係数は２１４６００であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体原液の濃度であり、
ｂ：光路長は１ｃｍである。
【0091】
同様に、サンプルの３７０ｎｍでの全吸光値方程式を得ることができる：
（２）Ａ３７０ｎｍ＝εｍａｂ－３７０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－３７０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－３７０：薬物の３７０ｎｍでの平均モル吸光係数が１９０００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度であり、
εｍａｂ－３７０：モノクローナル抗体の３７０ｎｍでの吸光係数は０であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体原液の濃度であり、
ｂ：光路長は１ｃｍである。
（２）Ａ３７０ｎｍ＝εｍａｂ－３７０ｂＣｍａｂ＋εＤｒｕｇ－３７０ｂＣＤｒｕｇ
εＤｒｕｇ－３７０：薬物の３７０ｎｍでの平均モル吸光係数が１９０００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度であり、
εｍａｂ－３７０：モノクローナル抗体の３７０ｎｍでの吸光係数は０であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体原液の濃度であり、
ｂ：光路長は１ｃｍである。
【0092】
（１）と（２）の方程式により、モノクローナル抗体及び薬剤の２つの検出波長での吸光係数と濃度データに合わせて、薬剤の負荷量を算出することができる。
【0093】
薬剤担持量＝ＣＤｒｕｇ／Ｃｍａｂ。
【0094】
二、ＣＥ－ＳＤＳによる算出方法
試薬及び機器
ＳＤＳ－Ｍｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ：Ｂｅｃｋｍａｎ製、製品番号３９０９５３で、当該試薬キットには、ＳＤＳ－ＭＷ分離ゲル用緩衝液、ＳＤＳ－ＭＷサンプル緩衝液、酸性洗浄液（０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液）、塩基性洗浄液（０．１ｍｏｌの水酸化ナトリウム溶液）、内部標準物質（１０ｋＤａ）が含まれる。北京博思雅生化技術研究院製のＳＤＳ試薬キット（製品番号ＢＳＹＫ０１８）を採用してもよく、当該試薬キットには、ＣＥ－ＳＤＳゲル緩衝液、ＣＥ－ＳＤＳサンプル緩衝液が含まれる。
試薬及び機器
ＳＤＳ－Ｍｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ：Ｂｅｃｋｍａｎ製、製品番号３９０９５３で、当該試薬キットには、ＳＤＳ－ＭＷ分離ゲル用緩衝液、ＳＤＳ－ＭＷサンプル緩衝液、酸性洗浄液（０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液）、塩基性洗浄液（０．１ｍｏｌの水酸化ナトリウム溶液）、内部標準物質（１０ｋＤａ）が含まれる。北京博思雅生化技術研究院製のＳＤＳ試薬キット（製品番号ＢＳＹＫ０１８）を採用してもよく、当該試薬キットには、ＣＥ－ＳＤＳゲル緩衝液、ＣＥ－ＳＤＳサンプル緩衝液が含まれる。
【0095】
アルキル化溶液（０．２５ｍｏｌのヨードアセトアミド溶液）：約０．０４６ｇのヨードアセトアミドを秤量し、１ｍＬの超純水を加えて溶解して均一に混合し、２～８℃、遮光で７日間保存してもよい。
【0096】
キャピラリー電気泳動装置：ＳＣＩＥＸ社ＰＡ８００ｐｌｕｓ。
【0097】
キャピラリー：コーティング無しの溶融石英キャピラリー（内径５０μｍ）を全長が３０．２ｃｍになるように切断し、高分解能方法の有効分離長さが２０ｃｍである。
【0098】
供試品溶液の調製
ＳＤＳサンプル緩衝液で供試品を１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。供試品溶液（１ｍｇ／ｍＬ）９５μＬを取り、０．８ｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド水溶液５μＬを加え、旋回により均一に混合した。ブランク対照９５μＬを取り、０．８ｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド水溶液５μＬを加え、旋回により均一に混合してから、サンプル管からそれぞれ７５μＬ取り出してサンプル瓶に入れ、直ちに分析を行った。
ＳＤＳサンプル緩衝液で供試品を１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。供試品溶液（１ｍｇ／ｍＬ）９５μＬを取り、０．８ｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド水溶液５μＬを加え、旋回により均一に混合した。ブランク対照９５μＬを取り、０．８ｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド水溶液５μＬを加え、旋回により均一に混合してから、サンプル管からそれぞれ７５μＬ取り出してサンプル瓶に入れ、直ちに分析を行った。
【0099】
測定方法
１）キャピラリーの前処理：０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液により６０ｐｓｉの圧力で３分間洗浄してから、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液により６０ｐｓｉの圧力で２分間洗浄し、最後に純水により７０ｐｓｉの圧力で１分間洗浄した。毎回稼動する前に行うべきである。
１）キャピラリーの前処理：０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液により６０ｐｓｉの圧力で３分間洗浄してから、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液により６０ｐｓｉの圧力で２分間洗浄し、最後に純水により７０ｐｓｉの圧力で１分間洗浄した。毎回稼動する前に行うべきである。
【0100】
２）キャピラリーのプレ充填：ＳＤＳ分離ゲル用緩衝液により５０ｐｓｉの圧力で１５分間洗浄した。毎回稼動する前に行うべきである。
【0101】
サンプル注入：１０ｋＶの逆極性で電動注入し、サンプルを還元して、２０秒注入した。
【0102】
分離：逆極性で、１５ｋＶで４０分間作動した。
【0103】
サンプル室温度：１８～２５℃。
【0104】
キャピラリー温度：１８～２５℃。
結果の分析
抗体における解放されたジスルフィド結合から遊離されたメルカプト基が全て対応する薬剤に複合したことから、Ｂｅｃｋｍａｎソフトウェアによりデータを分析し、重鎖、非グリコシル化重鎖及び軽鎖などの補正ピーク面積のそれぞれの、全補正ピーク面積に占める比率から算出した。式：ＤＡＲ＝［４×重鎖（Ｈ）ピーク面積＋２×ハプテン（Ｈ－Ｌ）ピーク面積＋４×二重鎖（Ｈ－Ｈ）ピーク面積＋２×重重軽鎖（Ｈ－Ｈ－Ｌ）ピーク面積］／［重鎖（Ｈ）ピーク面積／２＋ハプテン（Ｈ－Ｌ）ピーク面積／２＋二重鎖（Ｈ－Ｈ）ピーク面積＋重重軽鎖（Ｈ－Ｈ－Ｌ）ピーク面積＋完全抗体ピーク面積］により、最終的に当該ＡＤＣの加重平均値を算出した。
結果の分析
抗体における解放されたジスルフィド結合から遊離されたメルカプト基が全て対応する薬剤に複合したことから、Ｂｅｃｋｍａｎソフトウェアによりデータを分析し、重鎖、非グリコシル化重鎖及び軽鎖などの補正ピーク面積のそれぞれの、全補正ピーク面積に占める比率から算出した。式：ＤＡＲ＝［４×重鎖（Ｈ）ピーク面積＋２×ハプテン（Ｈ－Ｌ）ピーク面積＋４×二重鎖（Ｈ－Ｈ）ピーク面積＋２×重重軽鎖（Ｈ－Ｈ－Ｌ）ピーク面積］／［重鎖（Ｈ）ピーク面積／２＋ハプテン（Ｈ－Ｌ）ピーク面積／２＋二重鎖（Ｈ－Ｈ）ピーク面積＋重重軽鎖（Ｈ－Ｈ－Ｌ）ピーク面積＋完全抗体ピーク面積］により、最終的に当該ＡＤＣの加重平均値を算出した。
【0105】
三、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）
１、試薬及び機器：
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ超高速液体クロマトグラフＵＰＬＣシステム
検出器：ＴＵＶ検出器（測定波長：２８０ｎｍ）
ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ（２．７μｍ ４．６×１５０ｍＭ）
２、検出条件：
カラム温度：８０℃
流速：１．０ｍＬ／分
１、試薬及び機器：
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ超高速液体クロマトグラフＵＰＬＣシステム
検出器：ＴＵＶ検出器（測定波長：２８０ｎｍ）
ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ（２．７μｍ ４．６×１５０ｍＭ）
２、検出条件：
カラム温度：８０℃
流速：１．０ｍＬ／分
【0106】
移動相Ａ：０．１％ギ酸＋０．０２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液。
【0107】
移動相Ｂ：０．１％ＦＡ＋０．０２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）アセトニトリル溶液。
勾配手順：２７．０％Ｂ～４５．０％Ｂ（０．００～１２．００分間）、４５．０％Ｂ～８０．０％Ｂ（１２．００～１３．００分間）、８０．０％Ｂ～８０．０％Ｂ（１３．００～１５．００分間）、２７．０％Ｂ～２７．０％Ｂ（１５．０４～２０．００分間）、
注入サンプル量：５．０μＬ
３、データの分析
薬物に結合しない抗体軽鎖（Ｌ０）及び抗体重鎖（Ｈ０）と比較して、薬物に結合する軽鎖（１つの薬物に結合する軽鎖：Ｌ１）及び薬物に結合する重鎖（１つの薬物に結合する重鎖：Ｈ１、２つの薬物に結合する重鎖：Ｈ２、３つの薬物に結合する重鎖：Ｈ３、４つの薬物に結合する重鎖：Ｈ４）は、疎水性がその薬物結合数に比例して増加したと共に、保持時間が長くなった。従って、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＨ４という順にそれぞれ溶離することができる。Ｌ０とＨ０の保持時間を比較した結果、検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＨ４のうちの何れか１つに割り当てた。
勾配手順：２７．０％Ｂ～４５．０％Ｂ（０．００～１２．００分間）、４５．０％Ｂ～８０．０％Ｂ（１２．００～１３．００分間）、８０．０％Ｂ～８０．０％Ｂ（１３．００～１５．００分間）、２７．０％Ｂ～２７．０％Ｂ（１５．０４～２０．００分間）、
注入サンプル量：５．０μＬ
３、データの分析
薬物に結合しない抗体軽鎖（Ｌ０）及び抗体重鎖（Ｈ０）と比較して、薬物に結合する軽鎖（１つの薬物に結合する軽鎖：Ｌ１）及び薬物に結合する重鎖（１つの薬物に結合する重鎖：Ｈ１、２つの薬物に結合する重鎖：Ｈ２、３つの薬物に結合する重鎖：Ｈ３、４つの薬物に結合する重鎖：Ｈ４）は、疎水性がその薬物結合数に比例して増加したと共に、保持時間が長くなった。従って、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＨ４という順にそれぞれ溶離することができる。Ｌ０とＨ０の保持時間を比較した結果、検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＨ４のうちの何れか１つに割り当てた。
【0108】
薬物リンカーがＵＶを吸収するので、次の式に従って、軽鎖、重鎖と薬物リンカーのモル吸光係数を利用し、結合する薬物の数によって、得られたピーク面積を補正した。計算式は、次の通りである：
軽鎖（εＬＣ－２８０）／（εＬＣ－２８０＋連結薬物数＊εｄｒｕｇ－２８０）
重鎖（εＨＣ－２８０）／（εＨＣ－２８０＋連結薬物数＊εｄｒｕｇ－２８０）
備考：εＬＣ－２８０：軽鎖の２８０ｎｍでのモル吸光係数、
εＨＣ－２８：重鎖の２８０ｎｍでのモル吸光係数、
εｄｒｕｇ－２８０：毒素の２８０ｎｍでのモル吸光係数
軽鎖（εＬＣ－２８０）／（εＬＣ－２８０＋連結薬物数＊εｄｒｕｇ－２８０）
重鎖（εＨＣ－２８０）／（εＨＣ－２８０＋連結薬物数＊εｄｒｕｇ－２８０）
備考：εＬＣ－２８０：軽鎖の２８０ｎｍでのモル吸光係数、
εＨＣ－２８：重鎖の２８０ｎｍでのモル吸光係数、
εｄｒｕｇ－２８０：毒素の２８０ｎｍでのモル吸光係数
【0109】
【表1】
【0110】
調製例２－１ ＡＤＣ－１
【0111】
【化2】
【0112】
３７℃の条件で、抗体ＰＤ３のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍＬ、２７０ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、６７．５μＬ、６７５ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0113】
化合物９－Ａ（ＷＯ２０２００６３６７６Ａ１の明細書における実施例９の９－Ａを参照して調製、２．９ｍｇ、２７００ｎｍｏｌ）を１８０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＤ３－９－Ａに示される例示的な生成物ＡＤＣ－１のＰＢＳ緩衝液（１．９３ｍｇ／ｍＬ、１８．４ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0114】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．７７。
【0115】
調製例２－２ ＡＤＣ－２
３７℃の条件で、抗体ＰＤ３のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍＬ、２７０ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、１４３．１μＬ、１４３１ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
３７℃の条件で、抗体ＰＤ３のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍＬ、２７０ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、１４３．１μＬ、１４３１ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0116】
化合物９－Ａ（４．３５ｍｇ、４０５０ｎｍｏｌ）を２７０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＰＤ３－９－Ａに示される例示的な生成物ＡＤＣ－２のＰＢＳ緩衝液（１．６９ｍｇ／ｍＬ、１７．８ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0117】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝６．５９。
【0118】
調製例２－３ ＡＤＣ－３
１２℃の条件で、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのヒスチジン－酢酸－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に、１４５．２４ｇのＰＤ３抗体原液（１．００ｍＭｏｌ、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸で抗体濃度１７．５ｍｇ／ｍＬに希釈）と０．６３０８ｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、２．２０ｍＭｏｌ）を恒温水浴で１００分間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。２Ｍの酢酸を滴下して反応液のｐＨを５．０に調整した。
１２℃の条件で、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのヒスチジン－酢酸－Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に、１４５．２４ｇのＰＤ３抗体原液（１．００ｍＭｏｌ、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸で抗体濃度１７．５ｍｇ／ｍＬに希釈）と０．６３０８ｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、２．２０ｍＭｏｌ）を恒温水浴で１００分間撹拌しながら反応させ、中間体Ｉ溶液を生成した。２Ｍの酢酸を滴下して反応液のｐＨを５．０に調整した。
【0119】
化合物９－Ａ（４．８３４ｇ、４．５０ｍＭｏｌ）を０．４５６ＬのＤＭＳＯに溶け、化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液を生成した。上記中間体Ｉ溶液に０．３７３ＬのＤＭＳＯを予め加え、さらに上記化合物９－ＡのＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯが予め加えられた中間体Ｉ溶液に加え、水浴で１２℃で９０分間撹拌しながら反応させ、反応を止めた。
【0120】
上記反応液を０．２２μｍのフィルターでろ過した後、まず１５倍の体積と等体積の限外ろ過（３０ｋｄの限外ろ過膜パッケージ）を行って１０％のＤＭＳＯ－３０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に交換し、次に１８倍の体積と等体積の限外ろ過を行って３０ｍＭのヒスチジン－塩酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）に交換し、スクロースを４０ｇ／Ｌ、グリシンを９ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ－８０を０．２ｇ／Ｌに加え、式ＰＤ３－９－Ａに示される例示的な生成物ＡＤＣ－３（２０ｇ／Ｌ、１３２．２０ｇ、収率９１．０％、逆相クロマトグラフィーにより平均値を算出した：ｎ＝４．０）を得て、最後に８０ｍｇ／瓶で入った凍結乾燥粉を調製した。
【0121】
調製例２－４ ＡＤＣ－４
【0122】
【化3】
【0123】
その合成過程はＷＯ２０１５０９８０９９の実施例１９を参照する。
【0124】
３７℃の条件で、抗体ＴＩＮＡのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍＬ、１３５．４ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、３３．８μＬ、３３８ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0125】
化合物５８（１．４ｍｇ、１３５４ｎｍｏｌ）を７０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ＭのＥＤＴＡ含有）、式ＴＩＮＡ－５８に示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－４のＰＢＳ緩衝液（１．１３ｍｇ／ｍＬ、１５．１ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0126】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．９９。
【0127】
調製例２－５ ＡＤＣ－５
【0128】
【化4】
【0129】
３７℃の条件で、抗体ＰＤ３のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ、１０１．４ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、２５．３μＬ、２５３ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0130】
化合物５８（１．０５ｍｇ、１０１４ｎｍｏｌ、特許「ＣＮ１０４７５５４９４Ａ」における第１６３ページでの実施例５８を参照）を６０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、式ＰＤ３－５８に示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－５のＰＢＳ緩衝液（０．８２ｍｇ／ｍＬ、１３．５ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0131】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．８８。
【0132】
調製例２－６ ＡＤＣ－６
【0133】
【化5】
【0134】
３７℃の条件で、抗体ｈＲＳ７のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍＬ、９４．６０ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、５０．１μＬ、５０１ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0135】
化合物ＳＮ３８（特許ＣＮ１０５４０７８９１Ａの第５９ページでの実施例１を参照して合成、２．１ｍｇ、１４１９ｎｍｏｌ）を５０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、式ｈＲＳ７－ＳＮ３８に示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－６のＰＢＳ緩衝液（１．０３ｍｇ／ｍＬ、１１．５ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0136】
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝７．５６。
【0137】
調製例２－７ ＡＤＣ－７
【0138】
【化6】
【0139】
３７℃の条件で、抗体ｈＲＳ７のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、２．１８ｍＬ、１４７．３ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、３６．８μＬ、３６８ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0140】
化合物９－Ａ（１．５８ｍｇ、１４７１ｎｍｏｌ）を１００μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、式ｈＲＳ７－９－Ａに示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－７のＰＢＳ緩衝液（１．１０ｍｇ／ｍＬ、１６．４ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0141】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．７２。
【0142】
調製例２－８ ＡＤＣ－８
【0143】
【化7】
【0144】
３７℃の条件で、抗体ｈＲＳ７のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、２．１８ｍＬ、１４７．３ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、３６．８μＬ、３６８ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0145】
化合物５８（１．５２ｍｇ、１４７３ｎｍｏｌ、特許「ＣＮ１０４７５５４９４Ａ」における第１６３ページでの実施例５８を参照）を１００μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、式ｈＲＳ７－５８に示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－８のＰＢＳ緩衝液（１．０２ｍｇ／ｍＬ、１６．８ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0146】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．９３。
【0147】
調製例２－９ ＡＤＣ－９
【0148】
【化8】
【0149】
３７℃の条件で、抗体ＴＩＮＡのＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．９５ｍＬ、６４．２ｎｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ｍＭ、１６．０μＬ、１６０ｎｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
【0150】
化合物９－Ａ（０．６９ｍｇ、６４２ｎｍｏｌ）を３０μＬのＤＭＳＯに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ＭのＰＢＳ緩衝水溶液）、式ＴＩＮＡ－９－Ａに示される例示的な表題生成物ＡＤＣ－９のＰＢＳ緩衝液（０．９９ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
【0151】
ＵＶ－Ｖｉｓにより平均値を算出した：ｎ＝３．９９。
【0152】
以下、生化学試験方法により本開示の抗体及び複合体の活性を検証した。
【0153】
試験例１：抗体タンパク質レベル結合実験
ｐＨ７．４のＰＢＳ（源培生物、Ｂ３２０）緩衝液でｈＴＲＯＰ－２タンパク質を１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。液体を捨てた後、ＰＢＳで希釈した５％の脱脂乳（ＢＤ、２３２１００）３００μＬを各ウェルに加えてブロッキングし、３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４ ＰＢＳに０．１％のｔｗｅｅｎ－２０が含まれた）でプレートを３回洗った後、各ウェルに勾配希釈された抗体溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗い、各ウェルに１００μＬのマウス抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、２０９－０３５－０８８、１：８０００で希釈）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗った後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ顕色基質（ＫＰＬ、５１２０－００７７）を加え、室温で１０～１５分間インキュベートし、各ウェルに５０μＬの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を止め、プレートリーダーで４５０ｎｍでの吸収値を読み取り、ソフトウェアで抗体と抗原との結合曲線をフィッティングし、ＥＣ５０値を算出した。抗体のタンパク質への結合活性は表２に示されている。
ｐＨ７．４のＰＢＳ（源培生物、Ｂ３２０）緩衝液でｈＴＲＯＰ－２タンパク質を１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。液体を捨てた後、ＰＢＳで希釈した５％の脱脂乳（ＢＤ、２３２１００）３００μＬを各ウェルに加えてブロッキングし、３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４ ＰＢＳに０．１％のｔｗｅｅｎ－２０が含まれた）でプレートを３回洗った後、各ウェルに勾配希釈された抗体溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗い、各ウェルに１００μＬのマウス抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、２０９－０３５－０８８、１：８０００で希釈）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗った後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ顕色基質（ＫＰＬ、５１２０－００７７）を加え、室温で１０～１５分間インキュベートし、各ウェルに５０μＬの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を止め、プレートリーダーで４５０ｎｍでの吸収値を読み取り、ソフトウェアで抗体と抗原との結合曲線をフィッティングし、ＥＣ５０値を算出した。抗体のタンパク質への結合活性は表２に示されている。
【0154】
【表2】
【0155】
その結果、本願におけるＰＤ３抗体は、ｈＴＲＯＰ－２タンパク質に対して比較的高い結合活性を有することが示されている。
【0156】
試験例２：抗体の細胞レベル結合実験
ＴＲＯＰ－２を安定トランスフェクションしたＣＨＯＫ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）ｐＨ７．４ ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００ＴＡＢ））で１×１０６／ｍＬの細胞懸濁液に調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル円底プレートに加えた。上清を遠心分離して除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈された異なる濃度の測定待ちの抗体を５０μＬ／ウェルで加え、４℃の冷蔵庫に置いて遮光で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ ｇで３回遠心分離して洗浄した後、作業濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヒツジ抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫に置いて遮光で４０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ｇで３回遠心分離して洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出し、ＴＲＯＰ－２を安定トランスフェクションして発現した細胞に対する抗体の結合ＥＣ５０値を算出した。抗体の細胞への結合活性は表３に示されている。
ＴＲＯＰ－２を安定トランスフェクションしたＣＨＯＫ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）ｐＨ７．４ ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００ＴＡＢ））で１×１０６／ｍＬの細胞懸濁液に調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル円底プレートに加えた。上清を遠心分離して除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈された異なる濃度の測定待ちの抗体を５０μＬ／ウェルで加え、４℃の冷蔵庫に置いて遮光で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ ｇで３回遠心分離して洗浄した後、作業濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヒツジ抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫に置いて遮光で４０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ｇで３回遠心分離して洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出し、ＴＲＯＰ－２を安定トランスフェクションして発現した細胞に対する抗体の結合ＥＣ５０値を算出した。抗体の細胞への結合活性は表３に示されている。
【0157】
【表3】
【0158】
その結果、本願におけるＰＤ３抗体は、ＴＲＯＰ－２タンパク質を発現した細胞に対して比較的高い結合活性を有することが示されている。
【0159】
試験例３：抗体のエンドサイトーシス実験
本実験の目的は、ＤＴ３Ｃタンパク質が細胞に侵入した後、活性化されたＤＴが細胞を殺傷することによって、抗ＴＲＯＰ－２抗体のエンドサイトーシス状況を間接的に反映することである。ＥＣ５０及びＥｍａｘによって抗体の体外エンドサイトーシス活性を評価した。
本実験の目的は、ＤＴ３Ｃタンパク質が細胞に侵入した後、活性化されたＤＴが細胞を殺傷することによって、抗ＴＲＯＰ－２抗体のエンドサイトーシス状況を間接的に反映することである。ＥＣ５０及びＥｍａｘによって抗体の体外エンドサイトーシス活性を評価した。
【0160】
ＤＴ３Ｃは組換え発現の融合タンパク質であり、ジフテリア毒素の断片Ａ（毒素部分のみ）とＧ群連鎖球菌の３Ｃ断片（ＩｇＧ結合部分）が融合してなるものであり、当該タンパク質は抗体のＩｇＧ部分によく親和することができ、抗体においてエンドサイトーシスが生じた場合に一緒に細胞に侵入し、細胞内フーリンの作用下で、毒性を有するＤＴを放出し、ＤＴはＥＦ２－ＡＤＰリボース化の活性を抑制し、タンパク質の翻訳過程を遮断して、最終的に細胞の死亡を引き起こすことができる。細胞に侵入していないＤＴ３Ｃは、細胞を殺傷する活性を有しない。細胞殺傷状況によって抗体のエンドサイトーシス活性を評価した。
【0161】
２０％の低ＩｇＧ ＦＢＳを含む新鮮な細胞培地で細胞懸濁液を調製し、細胞密度が２×１０４細胞／ｍＬであり、５０μＬ／ウェルで細胞培養プレートに加え、５％の二酸化炭素及び３７℃で１６時間培養した。無血清培地で４×濃度のＤＴ３Ｃを調製し、０．２２μｍの小型フィルターでろ過して滅菌溶液にした。無血清培地で４×濃度の抗体を調製し、８０μＬのＤＴ３Ｃ及び８０μＬの抗体を１：１の体積で均一に混合し、室温で静置して３０分間インキュベートした。５０μＬの希釈された抗体－ＤＴ３Ｃ混合物を取って５０μＬの細胞に加え、インキュベーターで３日間インキュベートした。各ウェルに５０μＬのＣＴＧを加え、室温で遮光で１０分間インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ３で化学発光を読み取った。抗体のエンドサイトーシス活性は表４に示されている。
【0162】
【表4】
【0163】
その結果、本願におけるＰＤ３抗体は、比較的高いエンドサイトーシス効率を有することが示されている。
【0164】
試験例４：抗体の親和性の測定
ＴＲＯＰ－２に対する抗体の親和性の検出は、キャプチャー抗体の形態を採用した。抗－ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｔ．＃ＢＲ－１００８－３９、Ｌｏｔ．＃１０２６０４１６、ＧＥ）が複合されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃａｔ．＃２９１２７５５６、Ｇｅ）バイオセンサチップでキャプチャー抗体と親和させてから、チップの表面で抗原ｈＴＲＯＰ－２を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、再生緩衝液Ｇｌｙｃｉｎｅ１．５（Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５４、ＧＥ）又は３ＭのＭｇＣｌ２（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、Ｃａｔ．＃ＢＲ１００８３９、ＧＥに由来）でチップを洗浄して再生した。実験終了後、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでデータをフィッティングし、親和性の数値を得た。抗体のタンパク質への親和性は表５に示されている。
ＴＲＯＰ－２に対する抗体の親和性の検出は、キャプチャー抗体の形態を採用した。抗－ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｔ．＃ＢＲ－１００８－３９、Ｌｏｔ．＃１０２６０４１６、ＧＥ）が複合されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃａｔ．＃２９１２７５５６、Ｇｅ）バイオセンサチップでキャプチャー抗体と親和させてから、チップの表面で抗原ｈＴＲＯＰ－２を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、再生緩衝液Ｇｌｙｃｉｎｅ１．５（Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５４、ＧＥ）又は３ＭのＭｇＣｌ２（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、Ｃａｔ．＃ＢＲ１００８３９、ＧＥに由来）でチップを洗浄して再生した。実験終了後、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでデータをフィッティングし、親和性の数値を得た。抗体のタンパク質への親和性は表５に示されている。
【0165】
【表5】
【0166】
その結果、本願におけるＰＤ３抗体は、ｈＴＲＯＰ－２への親和性が比較的高い。
【0167】
試験例５：ＡＤＣ分子の細胞活性実験
当該実験に使用された細胞は下記の通りである、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＨＴＢ－４３(TM)のＦａＤｕ（＋＋＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＣＲＬ－２８６８のＨＣＣ８２７（＋＋＋）、中科院細胞バンクから購入され、製品番号ＴＣＨｕ１０２のＣｏｌｏ２０５（＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＣＲＬ－２０６２(TM)のＤＭＳ５３（＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＨＴＢ－７７のＳＫ－ＯＶ－３（＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号：ＣＣＬ－６１(TM)のＣＨＯ－Ｋ１（－）。そのうち、「＋」は細胞における全ＴＲＯＰ－２の発現量を示し、「＋」が多いほど、ＴＲＯＰ－２の発現量が高くなり、「－」はＴＲＯＰ－２未発現を示す。
当該実験に使用された細胞は下記の通りである、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＨＴＢ－４３(TM)のＦａＤｕ（＋＋＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＣＲＬ－２８６８のＨＣＣ８２７（＋＋＋）、中科院細胞バンクから購入され、製品番号ＴＣＨｕ１０２のＣｏｌｏ２０５（＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＣＲＬ－２０６２(TM)のＤＭＳ５３（＋＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号ＨＴＢ－７７のＳＫ－ＯＶ－３（＋）、ＡＴＣＣから購入され、製品番号：ＣＣＬ－６１(TM)のＣＨＯ－Ｋ１（－）。そのうち、「＋」は細胞における全ＴＲＯＰ－２の発現量を示し、「＋」が多いほど、ＴＲＯＰ－２の発現量が高くなり、「－」はＴＲＯＰ－２未発現を示す。
【0168】
１０％のＦＢＳを含む新鮮な細胞培地で細胞懸濁液を調製し、密度が３７０３細胞／ｍＬであり、１３５μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに加え、５％の二酸化炭素及び３７℃で１６時間培養した。ＡＤＣサンプルをＰＢＳにより５μｍに調製した。これを初期濃度として、ＰＢＳで５倍希釈し、合計８つの濃度にした。各ウェルに１５μＬの上記ＡＤＣ溶液を加えた。５％の二酸化炭素及び３７℃で６日間培養した。各ウェルに７０μＬのＣＴＧを加え、室温で遮光で１０分間インキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ３で化学発光を読み取ってＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりデータの分析を行った。
【0169】
その結果、ＡＤＣ－１は比較的強い細胞殺傷効果を有し、且つ殺傷効果が腫瘍細胞表面のＴＲＯＰ－２発現レベルと正相関を有することが示されている。
【0170】
【表6】
【0171】
上記方法により２回目の並行比較実験を行って、下記の結果を得た。
【0172】
【表7】
【0173】
試験例６：バイスタンダー殺傷活性実験
ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓がん細胞、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６８７）及びＭｉａＰａＣａ２細胞（ヒト膵臓がん細胞、ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、Ｂ－ＨＣＬ－０１４）をそれぞれＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ及びＤＭＥＭ／高グルコース＋１０％のＦＢＳで培養し、細胞をパンクレアチンで消化し、新鮮な培地で中和し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳで再懸濁した。細胞を計数してから、ＢｘＰＣ３の細胞密度を６×１０４個／ｍＬに調整し、ＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃの細胞密度を１．５×１０４個／ｍＬに調整した。１２ウェルプレートのプレート１において各ウェルに５００μＬのＢｘＰＣ３細胞及び５００μＬのＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃ細胞を加えた。１２ウェルプレートのプレート２に５００μＬのＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃ細胞及び５００μＬの１０％ＦＢＳ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液を加えた。５％の二酸化炭素及び３７℃で２４時間培養した。
ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓がん細胞、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６８７）及びＭｉａＰａＣａ２細胞（ヒト膵臓がん細胞、ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、Ｂ－ＨＣＬ－０１４）をそれぞれＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ及びＤＭＥＭ／高グルコース＋１０％のＦＢＳで培養し、細胞をパンクレアチンで消化し、新鮮な培地で中和し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳで再懸濁した。細胞を計数してから、ＢｘＰＣ３の細胞密度を６×１０４個／ｍＬに調整し、ＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃの細胞密度を１．５×１０４個／ｍＬに調整した。１２ウェルプレートのプレート１において各ウェルに５００μＬのＢｘＰＣ３細胞及び５００μＬのＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃ細胞を加えた。１２ウェルプレートのプレート２に５００μＬのＭｉａＰａＣａ２－ｌｕｃ細胞及び５００μＬの１０％ＦＢＳ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液を加えた。５％の二酸化炭素及び３７℃で２４時間培養した。
【0174】
ＡＤＣサンプルを４０×濃度の中間溶液（０．２μｍ）に調製した。それぞれ２５μＬの上記サンプルを取って１２ウェルプレートの対応するウェルに加えた。溶剤対照群を設けた。５％の二酸化炭素及び３７℃で６日間培養した。１２ウェルプレートにおける細胞をパンクレアチンで消化し、新鮮な培地で中和し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２．５％のＦＢＳ）で再懸濁し、２０μＬの細胞を取り、２０μＬのトリパンブルーを加え、計数した。プレート１の細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、１００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し、２μＬのＴＲＯＰ－２（ＥＧＰ－１）モノクローナル抗体（ＭＲ５４）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。４℃、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅにより検出した。Ｆｌｏｗｊｏ ７．６によりデータを分析した。バイスタンダー殺傷活性実験の結果は図１に示されている。
【0175】
その結果、本開示におけるＡＤＣ－１は明確なバイスタンダー殺傷効果を有し、ＡＤＣはＴＲＯＰ－２陰性のＭｉａＰａＣａ２細胞を殺傷しないが、ＴＲＯＰ－２を発現したＢｘＰＣ３細胞と陰性細胞ＭｉａＰａＣａ２とを混合した後、ＡＤＣ－１はＴＲＯＰ－２陰性の細胞に対しても殺傷効果を有することが示されている。
【0176】
体内活性の生物学的評価
試験例７：Ｆａｄｕ細胞のＣＤＸマウスモデル体内薬効評価
Ｆａｄｕ細胞（３×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種１０日後、腫瘍体積が～２４５ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで５群に分け、１群に８匹であった。
試験例７：Ｆａｄｕ細胞のＣＤＸマウスモデル体内薬効評価
Ｆａｄｕ細胞（３×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種１０日後、腫瘍体積が～２４５ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで５群に分け、１群に８匹であった。
【0177】
ＡＤＣを腹腔内に注射し、０日目及び８日目に計２回投与し、各匹に体重に応じて１０ｇ／０．１ｍＬで注射し、投与量が１ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の体積と体重を週２回計測し、データを計２１日記録した。
【0178】
平均値がａｖｇで算出され、ＳＤ値がＳＴＤＥＶで算出され、ＳＥＭ値がＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（各群の動物数）で算出されるように、Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアによりデータを記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ又はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによりデータの統計的分析を行った。
【0179】
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ長×Ｌ短
２
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0180】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0181】
その結果、表８に示されるように、１ｍｐｋの用量では、ＡＤＣ－１はＦａＤｕ移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有することが明らかになった。
【0182】
【表8】
【0183】
試験例８：ＳＫＯＶ３細胞のＣＤＸマウスモデル体内薬効評価
ＳＫＯＶ３細胞（５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種２３日後、腫瘍体積が約１８０ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで５群に分け、１群に８匹であった。
ＳＫＯＶ３細胞（５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種２３日後、腫瘍体積が約１８０ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで５群に分け、１群に８匹であった。
【0184】
ＡＤＣを腹腔内に注射し、計２回投与し、各匹に体重に応じて１０ｇ／０．１ｍＬで注射し、投与量が下表に示されている。腫瘍の体積と体重を週２回測定し、データを記録した。平均値がａｖｇで算出され、ＳＤ値がＳＴＤＥＶで算出され、ＳＥＭ値がＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（各群の動物数）で算出されるように、Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアによりデータを記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、二元配置ＡＮＯＶＡ又は一元配置ＡＮＯＶＡによりデータの統計的分析を行った。
【0185】
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ長×Ｌ短
２
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0186】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0187】
その結果、表９に示されるように、異なる用量では、ＡＤＣ－１はＳＫＯＶ３移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有すると共に、腫瘍阻害効果が用量依存効果を有する。
【0188】
効果は用量依存効果を有する。
【0189】
【表9】
【0190】
試験例９：Ｃｏｌｏ２０５細胞のＣＤＸマウスモデル体内薬効評価
Ｃｏｌｏ２０５細胞（５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種１０日後、腫瘍体積が～２４５ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで６群に分け、１群に８匹であった。
Ｃｏｌｏ２０５細胞（５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇部皮下に接種し、接種１０日後、腫瘍体積が～２４５ｍＭ３に達した後、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで６群に分け、１群に８匹であった。
【0191】
ＡＤＣを腹腔内に注射し、０日目（Ｄ０）及び１０日目に計２回投与し、各匹に体重に応じて１０ｇ／０．１ｍＬで注射し、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の体積と体重を週２回計測し、データを計２８日（Ｄ２８）記録した。
【0192】
平均値がａｖｇで算出され、ＳＤ値がＳＴＤＥＶで算出され、ＳＥＭ値がＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（各群の動物数）で算出されるように、Ｅｘｃｅｌ統計ソフトウェアによりデータを記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、二元配置ＡＮＯＶＡや一元配置ＡＮＯＶＡによりデータの統計的分析を行った。
【0193】
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ長×Ｌ短
２
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。
【0194】
腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0195】
その結果、表１０に示されるように、１ｍｐｋの用量では、化合物９－Ａが複合されたＡＤＣ－９及びＡＤＣ－７は、Ｃｏｌｏ２０５移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有することが明らかになった。
【0196】
【表10】
【0197】
製剤
製剤の調製と検出中に使用された機器及び結果の算出方法は、以下の通りである、
１）ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー：
ゲル空孔の孔径の大きさと高分子サンプル分子のコイル寸法との相関関係によって溶質を分離する分析方法である。
製剤の調製と検出中に使用された機器及び結果の算出方法は、以下の通りである、
１）ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー：
ゲル空孔の孔径の大きさと高分子サンプル分子のコイル寸法との相関関係によって溶質を分離する分析方法である。
【0198】
ＳＥＣ％（ＳＥＣモノマーの含有量百分率）＝Ａモノマー／Ａ全×１００％（Ａモノマーはサンプル中のメインピークモノマーのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である）。
【0199】
ＳＥＣ測定用機器：アジレント１２６０、カラム：ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｇｅ ＢＥＨ２００Å ＳＥＣ（３００×７．８ｍＭ ３．５μｍ）
２）Ｒ－ＣＥキャピラリーゲル電気泳動：
ゲルをキャピラリーに支持媒体として移動して行われる電気泳動であり、一定の電圧でサンプルの分子量の大きさによって分離する方法である。
２）Ｒ－ＣＥキャピラリーゲル電気泳動：
ゲルをキャピラリーに支持媒体として移動して行われる電気泳動であり、一定の電圧でサンプルの分子量の大きさによって分離する方法である。
【0200】
Ｒ－ＣＥの純度百分率＝Ａメインピーク／Ａ全×１００％（Ａメインピークはサンプル中の軽鎖メインピーク＋重鎖メインピークのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である）。
【0201】
Ｒ－ＣＥ測定用機器：Ｂｅｃｋｍａｎ型番ｐｌｕｓ８００
３）濁度の測定：
光線が水層を透過する時に妨げられる程度であり、水層による光線への散乱と吸収の能力を示し、懸濁物質の含有量に関連するだけでなく、粒子の成分、サイズ、形状及びその表面の反射特性にも繋がっている。同一のタンパク質サンプルの同じ濃度及び同じ波長（近紫外・可視光波長領域）での吸収値を比較することにより、吸収値が大きいほど、濁度が大きくなり、サンプル中のタンパク質分子の凝集傾向が明らかになることが示された。測定機器は、多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５）であり、同じ体積のサンプルを９６ウェルプレートに入れて吸光度値を読み取った。
３）濁度の測定：
光線が水層を透過する時に妨げられる程度であり、水層による光線への散乱と吸収の能力を示し、懸濁物質の含有量に関連するだけでなく、粒子の成分、サイズ、形状及びその表面の反射特性にも繋がっている。同一のタンパク質サンプルの同じ濃度及び同じ波長（近紫外・可視光波長領域）での吸収値を比較することにより、吸収値が大きいほど、濁度が大きくなり、サンプル中のタンパク質分子の凝集傾向が明らかになることが示された。測定機器は、多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５）であり、同じ体積のサンプルを９６ウェルプレートに入れて吸光度値を読み取った。
【0202】
４）浸透圧の測定：
凝固点法で浸透圧を測定し、凝固点降下値が溶液のモル濃度に正比例することを基にして、高感度測温素子を使用し、溶液の凝固点を測定し、電気量で浸透圧に変換した。機器メーカー：ルーザーＬｏｓｅｒ、型番ＯＭ８１５。
凝固点法で浸透圧を測定し、凝固点降下値が溶液のモル濃度に正比例することを基にして、高感度測温素子を使用し、溶液の凝固点を測定し、電気量で浸透圧に変換した。機器メーカー：ルーザーＬｏｓｅｒ、型番ＯＭ８１５。
【0203】
５）タンパク質濃度の測定：
本開示における抗体薬物複合体の濃度は、タンパク質の濃度、即ち、抗体薬物複合体中の抗体部分の濃度で計量される。
本開示における抗体薬物複合体の濃度は、タンパク質の濃度、即ち、抗体薬物複合体中の抗体部分の濃度で計量される。
【0204】
抗体薬物複合体中の毒素はタンパク質特性吸収波長２８０ｎｍで吸収があると共に、当該毒素は３７０ｎｍでも吸収があるので、下記の式で上記タンパク質濃度を算出した、
【0205】
【数7】
【0206】
【数8】
【0207】
を取り
即ち、
即ち、
【0208】
【数9】
【0209】
式中、Ａ２８０ｎｍ：光路長が１ｃｍである場合、供試品溶液の単一サンプルの波長２８０ｎｍでの吸光度の平均値であり、
Ａ３７０ｎｍ：光路長が１ｃｍである場合、供試品溶液の単一サンプルの波長３７０ｎｍでの吸光度の平均値であり、
ＥｍＡｂ－２８０：タンパク質の波長２８０ｎｍでの質量吸光係数は１．５３２ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｅｄｒｕｇ－２８０：毒素の波長２８０ｎｍでの質量吸光係数は５．１７ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｅｄｒｕｇ－３７０：毒素の波長３７０ｎｍでの質量吸光係数は１７．８９ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｒ：毒素吸光係数の３７０ｎｍと２８０ｎｍでの比率は３．４６であり、
ＣｍＡｂ：タンパク質の濃度、ｍｇ／ｍＬであり、
ｌ：光路長、ｃｍ（ここでは光路長は１ｃｍ）である。
Ａ３７０ｎｍ：光路長が１ｃｍである場合、供試品溶液の単一サンプルの波長３７０ｎｍでの吸光度の平均値であり、
ＥｍＡｂ－２８０：タンパク質の波長２８０ｎｍでの質量吸光係数は１．５３２ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｅｄｒｕｇ－２８０：毒素の波長２８０ｎｍでの質量吸光係数は５．１７ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｅｄｒｕｇ－３７０：毒素の波長３７０ｎｍでの質量吸光係数は１７．８９ｇ－１ｃｍ－１Ｌであり、
Ｒ：毒素吸光係数の３７０ｎｍと２８０ｎｍでの比率は３．４６であり、
ＣｍＡｂ：タンパク質の濃度、ｍｇ／ｍＬであり、
ｌ：光路長、ｃｍ（ここでは光路長は１ｃｍ）である。
【0210】
供試液を希釈すると、タンパク質濃度は
【0211】
【数10】
【0212】
であり、Ｎは希釈倍数である。
【0213】
タンパク質濃度測定機器：紫外可視分光光度計、型番：Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ Ｏｎｅ。
実施例１：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤緩衝系及びｐＨスクリーニング
下記の緩衝液を用いて、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が１０～３０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）１０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム塩（略称：ＣＡ）、ｐＨ５．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
２）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
３）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
４）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ６．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
５）１０ｍＭのコハク酸－コハク酸ナトリウム塩（略称：ＳＡ）、ｐＨ５．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
６）１０ｍＭのＳＡ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
７）１０ｍＭのＳＡ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
８）１０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン（略称：Ｈｉｓ－ＨＣｌ）、ｐＨ５．５、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
９）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１０）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ５．５、３０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１１）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１２）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルは強制分解の４０℃高温条件で、外観、ＳＥＣとＲ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表１１に示されている。
実施例１：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤緩衝系及びｐＨスクリーニング
下記の緩衝液を用いて、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が１０～３０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）１０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム塩（略称：ＣＡ）、ｐＨ５．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
２）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
３）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
４）１０ｍＭのＣＡ、ｐＨ６．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
５）１０ｍＭのコハク酸－コハク酸ナトリウム塩（略称：ＳＡ）、ｐＨ５．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
６）１０ｍＭのＳＡ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
７）１０ｍＭのＳＡ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
８）１０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン（略称：Ｈｉｓ－ＨＣｌ）、ｐＨ５．５、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
９）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ５．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１０）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ５．５、３０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１１）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．０、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
１２）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．５、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルは強制分解の４０℃高温条件で、外観、ＳＥＣとＲ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表１１に示されている。
【0214】
４０℃ Ｍ１である場合、Ｈｉｓ－ＨＣｌ系はＣＡ及びＳＡ系に比べて外観上の粒子数が少なく、同じｐＨ値及び同じタンパク質濃度である場合、Ｈｉｓ系はＣＡ及びＳＡ系に比べて純度項が高く、同じ緩衝系では、ｐＨの増加につれて、ＳＥＣモノマーピーク及びＲ－ＣＥメインピークの低下値が小さくなる。１０ｍＭのｐＨ５．５のＨｉｓ系では、タンパク質濃度の増加につれて、ＳＥＣポリマーはやや増加し、Ｒ－ＣＥ純度項に顕著な変化がない。上述したように、緩衝系は好ましくＨｉｓ－ＨＣｌであり、ｐＨ範囲は好ましく５．５～６．５であり、タンパク質濃度は好ましく１０～３０ｍｇ／ｍＬである。
【0215】
【表11-1】
【0216】
【表11-2】
【0217】
実施例２：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤中の界面活性剤スクリーニング
１０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、８０ｍｇ／ｍＬのスクロースを含み、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬで、異なる濃度のポリソルベート８０（略称：ＰＳ８０）を含む抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）ＰＳ８０フリー、
２）０．２ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
３）０．４ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
４）０．６ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルを振とう（２５℃、３００ｒｐｍ、３日間）及び高温（４０℃ Ｍ１）の条件で置き、外観、ＳＥＣ、Ｒ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表１２に示されている。
１０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、８０ｍｇ／ｍＬのスクロースを含み、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬで、異なる濃度のポリソルベート８０（略称：ＰＳ８０）を含む抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）ＰＳ８０フリー、
２）０．２ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
３）０．４ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
４）０．６ｍｇ／ｍＬ ＰＳ８０、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルを振とう（２５℃、３００ｒｐｍ、３日間）及び高温（４０℃ Ｍ１）の条件で置き、外観、ＳＥＣ、Ｒ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表１２に示されている。
【0218】
実験の結果は、全ての考察条件で、０．２～０．６ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０群の外観が何れもＰＳ８０フリー群より優れ、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０群は、１ヶ月高温後のＲ－ＣＥ純度項のメインピークの低下が０．４ｍｇ／ｍＬ及び０．６ｍｇ／ｍＬ群よりも低かったことを示している。上述したように、ＰＳ８０濃度は好ましく０．２ｍｇ／ｍＬである。
【0219】
【表12】
【0220】
実施例３：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤の糖類スクリーニング
１０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、異なる糖類を含み、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。そのうち、異なる糖は以下の通りであり、糖の含有量は、溶液浸透圧が等張である場合の濃度である：
１）８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
２）８８ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルを振とう（２５℃、３００ｒｐｍ、３日間）、ＦＴ５Ｃ（－３５℃と２～８℃の間で５サイクルの凍結融解）及び高温（４０℃ Ｍ１）の条件で置き、外観、ＳＥＣ、Ｒ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は表１３に示されている。
１０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、異なる糖類を含み、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。そのうち、異なる糖は以下の通りであり、糖の含有量は、溶液浸透圧が等張である場合の濃度である：
１）８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
２）８８ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。サンプルを振とう（２５℃、３００ｒｐｍ、３日間）、ＦＴ５Ｃ（－３５℃と２～８℃の間で５サイクルの凍結融解）及び高温（４０℃ Ｍ１）の条件で置き、外観、ＳＥＣ、Ｒ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は表１３に示されている。
【0221】
実験の結果は、異なる条件で、スクロースとトレハロース二水和物は、外観及び純度項に顕著な差がなかったことを示している。
【0222】
【表13】
【0223】
実施例４：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤処方の最適化
ｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含み、異なるスクロース濃度とグリシン濃度を有し、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
２）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、１０．２ｍｇ／ｍＬのグリシン、
３）３０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
４）３０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、７．６ｍｇ／ｍＬのグリシン、
溶液剤と凍結乾燥剤という２つの方法で考察した。
ｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を用いて、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含み、異なるスクロース濃度とグリシン濃度を有し、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製した。具体的には、以下の通りである、
１）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、８０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
２）１０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、１０．２ｍｇ／ｍＬのグリシン、
３）３０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
４）３０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、７．６ｍｇ／ｍＬのグリシン、
溶液剤と凍結乾燥剤という２つの方法で考察した。
【0224】
溶液剤：調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。溶液剤を高温（４０℃ Ｄ１０）条件で置き、ＳＥＣ、Ｒ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は表１４に示されている。全ての群も、４０℃ Ｄ１０後に純度項に顕著な差がなかった。
【0225】
【表14】
【0226】
備考：表中、「Ｄ」は日間を示し、例えば、Ｄ１０は１０日間を示す。
【0227】
凍結乾燥剤：調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを半分入れ、凍結乾燥し、プラグを押して、蓋をした。凍結乾燥した製品の外観及び製品の再溶解状況を調べた。凍結乾燥手順は以下の通りである、
【0228】
【表15】
【0229】
結果：
凍結乾燥した固形粉末の外観から、高スクロース濃度群は底部が僅かに縮んだが、スクロース濃度が４０ｍｇ／ｍＬに低減され、グリシンが加えた後、同じ凍結乾燥条件で、得られた固形粉末は凹むことなく均質で充実するようになった。スクロース濃度を低減させ、グリシンを加えた後に必要な一次乾燥時間は、高スクロース濃度処方を用いる場合に必要な時間よりも短いことが示される。
凍結乾燥した固形粉末の外観から、高スクロース濃度群は底部が僅かに縮んだが、スクロース濃度が４０ｍｇ／ｍＬに低減され、グリシンが加えた後、同じ凍結乾燥条件で、得られた固形粉末は凹むことなく均質で充実するようになった。スクロース濃度を低減させ、グリシンを加えた後に必要な一次乾燥時間は、高スクロース濃度処方を用いる場合に必要な時間よりも短いことが示される。
【0230】
スクロース濃度が４０ｍｇ／ｍＬである場合、異なる緩衝液濃度で調製したサンプルは、凍結乾燥手順を経た後、外観が何れも凹むことなく均質で充実している。
【0231】
【表16】
【0232】
実施例５：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤の安定性実験
３０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を使用し、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、９．０ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ製剤を調製した。
３０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌ緩衝系を使用し、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、９．０ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬである抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ製剤を調製した。
【0233】
調製された製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。振とう（２５℃、３００ｒｐｍ、１０日間）、ＦＴ５Ｃ（－３５℃と２～８℃の間で５サイクルの凍結融解）と高温（４０℃ Ｍ１）強制分解、２５℃加速（２５℃ Ｍ３）及び２～８℃長期（４℃ Ｍ３）条件で置き、外観、ＳＥＣ及びＲ－ＣＥを評価指標として、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表１７に示されている。
【0234】
実験の結果は、最終的な処方製剤は、外観が各強制分解条件で何れも透明を維持し、比較的良い安定性を有することを示している。
【0235】
【表17】
【0236】
実施例６：抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤の凍結乾燥
３０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌの緩衝液において、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬで、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、９ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製し、製剤サンプルを凍結乾燥し、凍結乾燥手順は予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥であり、凍結乾燥手順は表１８に示されている。凍結乾燥手順が終了した後、真空引きしてプラグを入れた。凍結乾燥後したサンプルは、外観が白い均質なケーキ状で、水分が標準を満たし、再溶解しやすく、再溶解した後、ＳＥＣ、ＮＲ－ＣＥ純度項が標準を満たし、結果が表１９に示されている。再溶解後のｐＨは６．１である。
３０ｍＭのｐＨ６．０のＨｉｓ－ＨＣｌの緩衝液において、ＡＤＣ－３のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬで、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、９ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む抗Ｔｒｏｐ２－ＡＤＣ抗体製剤を調製し、製剤サンプルを凍結乾燥し、凍結乾燥手順は予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥であり、凍結乾燥手順は表１８に示されている。凍結乾燥手順が終了した後、真空引きしてプラグを入れた。凍結乾燥後したサンプルは、外観が白い均質なケーキ状で、水分が標準を満たし、再溶解しやすく、再溶解した後、ＳＥＣ、ＮＲ－ＣＥ純度項が標準を満たし、結果が表１９に示されている。再溶解後のｐＨは６．１である。
【0237】
【表18】
【0238】
【表19】
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】