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特表2024-528662医療施設に入院した患者の合併症のリスクを決定するためのマーカーとしてのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】医療施設に入院した患者の合併症のリスクを決定するためのマーカーとしてのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20240723BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/70
C12N15/38
C12N15/11 Z
C12N15/34
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503397
(86)(22)【出願日】2022-07-19
(85)【翻訳文提出日】2024-03-08
(86)【国際出願番号】 FR2022051436
(87)【国際公開番号】W WO2023002120
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】2107771
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304043936
【氏名又は名称】ビオメリュー
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ
(71)【出願人】
【識別番号】518294579
【氏名又は名称】ビオアステル
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＳＴＥＲ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】マレット，フランソワ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ10
4B063QQ42
(57)【要約】
本発明は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関し、当該方法は、前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、を含む、方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、以下の：ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を所定の参照値と比較すること、かつ、
ｃ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きいか又は小さい場合に合併症のリスクを確立すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記所定の参照値が１００００コピー／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きい場合、合併症のリスクの増大の存在が確立される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
さらに、ＤＮＡｅｍｉａを測定することによって、少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記生体試料について決定された少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量が１００００コピー／ｍｌよりも多く、かつ少なくとも１つのヘルペスウイルスが存在する場合に、合併症のリスクの増大の存在が確立される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）比較の結果から合併症のリスクに関する結論を確立すること、
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ΔＴＴＶ値が、－１．２５～＋１．２５、－１．２０～＋１．２０、又は、－１．１０～＋１．１０の範囲内である場合、合併症のリスクが増大しないという結論を導き出す、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
合併症のリスクが、医療関連感染（ＨＡＩ）が発生するリスクである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記生体試料が、病院、救急科、蘇生科、集中治療室又は高依存性施設に入院した患者に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記生体試料が、敗血症状態の患者、敗血症性ショックの患者、熱傷がある患者、重度の熱傷がある患者、外傷がある患者、重度の外傷がある患者、外科手術を受けた患者、又は大手術を受けた患者に由来する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記生体試料が、敗血症状態の患者、熱傷がある患者、外傷がある患者、又は外科手術を受けた患者、及び、集中治療室に入院した患者に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも１つのヘルペスウイルスが、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１からなる群から選択されるか、又はＥＢＶである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項13】
前記生体試料が、血液又は又はその派生物、血漿及び／若しくは血清、脳脊髄液、尿、並びに気管支肺胞洗浄液からなる群から選択される、患者由来の生体液である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療施設に入院した患者の合併症のリスクを決定するためのマーカーとしてのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
二次感染（又は医療関連感染、ＨＡＩ）は、特に病院等の医療施設における医療処置の主要な合併症であり、院内感染という。院内感染は、集中治療室に入院した患者の２０～４０％で起こり、しばしば侵襲的医療装置の使用及びより大量の抗生物質の投与と併用して、病院での治療が長引く結果となる。最終的に、罹患率及び死亡率もまたより高い。
医療関連感染の発生は、多剤耐性病原体の増加のために、ここ数年で特に悪化している。世界保健機関（ＷＨＯ）は、欧州の病院における院内感染の数は約５００万であり、約５００００人の死亡及び１３～２４０億ユーロの年間追加費用につながると推定している。特に、医療関連感染を予防及び低減することが最優先事項である米国保健福祉省、欧州疾病予防管理センター、ＷＨＯ及び国立機関によって、推奨が公表され、感染管理プログラムの設定が奨励されている。あるモデルでは、医療関連感染症に罹患するリスクが高い患者を特定するのに要する時間を短縮する試験により、これらの患者の死亡率が低減され、費用対効果も良好である。
したがって、特にリスクが検出されるとすぐに適当な治療応答を提供するために、ＨＡＩリスク、より一般的には医療処置中に合併症を発症するリスクに関連する早期マーカーを同定できることが重要である。
医療関連感染の発生は、多剤耐性病原体の増加のために、ここ数年で特に悪化している。世界保健機関（ＷＨＯ）は、欧州の病院における院内感染の数は約５００万であり、約５００００人の死亡及び１３～２４０億ユーロの年間追加費用につながると推定している。特に、医療関連感染を予防及び低減することが最優先事項である米国保健福祉省、欧州疾病予防管理センター、ＷＨＯ及び国立機関によって、推奨が公表され、感染管理プログラムの設定が奨励されている。あるモデルでは、医療関連感染症に罹患するリスクが高い患者を特定するのに要する時間を短縮する試験により、これらの患者の死亡率が低減され、費用対効果も良好である。
したがって、特にリスクが検出されるとすぐに適当な治療応答を提供するために、ＨＡＩリスク、より一般的には医療処置中に合併症を発症するリスクに関連する早期マーカーを同定できることが重要である。
【0003】
患者の治療に関連する要因だけでなく、患者の一般的な健康状態に関連する要因等の多数の要因が、医療関連感染の発生及び進行に影響を及ぼす。ある研究は、易感染性免疫系と二次感染の発生率の増加との間の関係の存在を実証している（非特許文献１）、これらの結果は議論の余地があり、より最近の研究は、関連性の存在に疑問を抱いている（非特許文献２）。
ある研究はまた、ウイルス再活性化の現象（特に、ヘルペスウイルス（ＨＰＶ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ））と、医療関連合併症の発生との間の関連を確立することを試みている。ウイルス再活性化の現象は、特に、免疫抑制されていない患者、重篤な病気（敗血症）又は創傷（外傷、火傷、手術）を負った患者、免疫麻痺（初期の過剰炎症状態に応答した適応免疫系及び先天性免疫系の機能不全によって特徴付けられる）を有する患者に存在する。
ある研究はまた、ウイルス再活性化の現象（特に、ヘルペスウイルス（ＨＰＶ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ））と、医療関連合併症の発生との間の関連を確立することを試みている。ウイルス再活性化の現象は、特に、免疫抑制されていない患者、重篤な病気（敗血症）又は創傷（外傷、火傷、手術）を負った患者、免疫麻痺（初期の過剰炎症状態に応答した適応免疫系及び先天性免疫系の機能不全によって特徴付けられる）を有する患者に存在する。
【0004】
現在、ウイルス再活性化の臨床的意味は、明確に確立されていない。特に、再活性化するウイルスが、免疫系の変化を反映する単純なマーカーとみなされるべきか、又は反対に二次感染を促進し、予防処置を実施する必要がある病原体とみなされるべきかは不明である（非特許文献３）。
最近、非特許文献４にて、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）とＴＴＶウイルスの共再活性化と死亡率の有意でない低下との間の関連の存在を示唆する研究の結果が公表された。
腎臓移植を受けた患者において行われた他の最近の研究は、ＴＴＶウイルス量を測定することにより、二次感染のリスクが低い患者を同定しうることを確立した。（非特許文献５）。それにもかかわらず、この研究の範囲は、限定されたままであり、関与する患者は全て免疫抑制治療を受けており、つまり、感染性疾患を発症するリスクがより高いため、なおさら限定されている。したがって、これでは、ＴＴＶウイルス量と二次感染（又は医療関連感染）のリスクとの間の信頼できる関連を確立することも、どの患者に二次感染を発症する高いリスクがあるかを同定することもできない。
最近、非特許文献４にて、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）とＴＴＶウイルスの共再活性化と死亡率の有意でない低下との間の関連の存在を示唆する研究の結果が公表された。
腎臓移植を受けた患者において行われた他の最近の研究は、ＴＴＶウイルス量を測定することにより、二次感染のリスクが低い患者を同定しうることを確立した。（非特許文献５）。それにもかかわらず、この研究の範囲は、限定されたままであり、関与する患者は全て免疫抑制治療を受けており、つまり、感染性疾患を発症するリスクがより高いため、なおさら限定されている。したがって、これでは、ＴＴＶウイルス量と二次感染（又は医療関連感染）のリスクとの間の信頼できる関連を確立することも、どの患者に二次感染を発症する高いリスクがあるかを同定することもできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｆｏｃｏｓｉ Ｄ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ Ｇ，Ｐｉｓｔｅｌｌｏ Ｍ，Ｍａｇｇｉ Ｆ．Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｏｍｅ ｆｒｏｍ ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｊｕｌｙ ２０１６；２２（７）：５８９－９３．
【非特許文献2】Ｊ．Ｖｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１
【非特許文献3】Ｊ．Ｌｉｍａｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０
【非特許文献4】Ｍａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９－Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｘｐ．７：２８
【非特許文献5】Ｓｔｒａｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１８；２１８：１１９１－９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、医療施設で医療処置を受けている際に、合併症、特に医療関連感染を発症するリスクのある患者を特定することができる、簡便かつ信頼できる診断方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の主題は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定することを含む方法に関する。
好ましい実施形態では、前記方法は、病院、好ましくは救急科、蘇生科、集中治療室又は高依存性施設に入院した患者である。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、前記患者が、敗血症状態、より具体的には敗血症性ショックの患者、火傷、より具体的には重度の火傷を患っている患者、外傷、より具体的には重度の外傷を患っている患者、又は外科手術、より具体的には大手術を受けた患者である。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、生体試料が、敗血症状態にある、火傷を患っている、外傷を患っている、又は外科手術を受けた、及び集中治療室に入院した患者に由来する。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、合併症が医療関連感染（ＨＡＩ）の発生である。
好ましい実施形態では、前記方法は、病院、好ましくは救急科、蘇生科、集中治療室又は高依存性施設に入院した患者である。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、前記患者が、敗血症状態、より具体的には敗血症性ショックの患者、火傷、より具体的には重度の火傷を患っている患者、外傷、より具体的には重度の外傷を患っている患者、又は外科手術、より具体的には大手術を受けた患者である。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、生体試料が、敗血症状態にある、火傷を患っている、外傷を患っている、又は外科手術を受けた、及び集中治療室に入院した患者に由来する。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、合併症が医療関連感染（ＨＡＩ）の発生である。
【0008】
他の好ましい実施形態では、前記方法は、以下の：
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を所定の参照値と比較すること、かつ、
ｃ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きいか又は小さい場合に合併症のリスクを確立すること、
を実行することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、所定の参照値が１００００コピー／ｍｌである。
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を所定の参照値と比較すること、かつ、
ｃ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きいか又は小さい場合に合併症のリスクを確立すること、
を実行することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、所定の参照値が１００００コピー／ｍｌである。
【0009】
他の好ましい実施形態では、前記方法は、以下の：
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）比較の結果から合併症のリスクに関する結論を導き出すこと、
を実行することを含む。
好ましい実施形態では、前記方法は、以下の：
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）ΔＴＴＶ値が、－１．２５～＋１．２５、－１．２０～＋１．２０、又は、－１．１０～＋１．１０の範囲内である場合、合併症のリスクが増大しないという結論を導き出すこと、
を実行することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、さらに、少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）のウイルス量を測定することも含む。
他の好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１からなる群から選択され、好ましくはＥＢＶである。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのＴＴＶ配列、及び適当な場合には少なくとも１つのヘルペスウイルスの増幅、配列決定又はハイブリダイゼーションによって、好ましくは増幅によって、より優先的にはリアルタイムＰＣＲによって、ウイルス量を測定する。
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）比較の結果から合併症のリスクに関する結論を導き出すこと、
を実行することを含む。
好ましい実施形態では、前記方法は、以下の：
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）ΔＴＴＶ値が、－１．２５～＋１．２５、－１．２０～＋１．２０、又は、－１．１０～＋１．１０の範囲内である場合、合併症のリスクが増大しないという結論を導き出すこと、
を実行することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、さらに、少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出することを含む。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）のウイルス量を測定することも含む。
他の好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１からなる群から選択され、好ましくはＥＢＶである。
他の好ましい実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのＴＴＶ配列、及び適当な場合には少なくとも１つのヘルペスウイルスの増幅、配列決定又はハイブリダイゼーションによって、好ましくは増幅によって、より優先的にはリアルタイムＰＣＲによって、ウイルス量を測定する。
【0010】
他の好ましい実施形態では、前記方法は、生体試料が患者由来の生体液であり、前記生体液は、血液又は又はその派生物、血漿及び／若しくは血清、脳脊髄液、尿、並びに気管支肺胞洗浄液からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＴＴＶ単離物のゲノムの構造の表示。
【図2】入院時のコホートからの患者の特徴、並びにＴＴＶウイルス力価、ウイルス血症の動態及びヘルペスウイルスによる随伴感染に基づく結果（図２Ａ及び２Ｂ）。カテゴリー変数はｎ（％）として表され、連続変数は中央値［Ｑ１－Ｑ３］として表される。力価又はウイルス血症動態又はヘルペスウイルスとの同時感染に関するＴＴＶ条件間の比較は、場合に応じて、定性変数についてはカイ二乗検定を、定量変数についてはウィルコクソン検定を用いて行った。星印付きの太字のＰ値は、ｐ＜０．０５で有意性を表す。ＩＣＵ＝集中治療室、ＨＡＩ＝ＩＣＵで獲得された感染、ＨＰＶ＝ヘルペスウイルス、ＳＯＦＡ＝連続臓器不全評価、ＳＡＰＳ＝簡易急性生理機能スコア。ａ １００００コピー／ｍｌ未満のＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａ、ｂ １００００コピー／ｍｌを超えるＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａ、ｃ－１．２５／＋１．２５の範囲内の勾配に対応するＴＴＶ力価の安定性（Ｄ１～Ｄ７）及び（Ｄ１４～Ｄ２８）におけるウイルス力価の中央値の間で測定）、ｄ勾配＞＋１．５に対応するＴＴＶ力価の増加、ｅ勾配＜－１．５に対応するＴＴＶ力価の減少、ｆ １００００コピー／ｍｌを超えるＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａ及び少なくとも１つのヘルペスウイルス、ｇ １００００コピー／ｍｌを超えるＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａのみ、ｈヘルペスウイルス（ＨＰＶ）のみ。
【図3】入院月中のＨＡＩの発生とウイルス血症の存在との間の関連。
【図4】入院時のコホートの患者の特徴、並びに入院後の最初の１ヶ月（Ｄ１～Ｄ２８）の間の１６７コピー（ｃｐ）／ｍｌ（ＬＯＤ）、７０００コピー／ｍｌ、１００００コピー／ｍｌ及び４００００コピー／ｍｌを超えるＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａに基づく結果。
【図5】バイナリー臨床結果とＴＴＶ発現の動態との間の関連。
【図6】ＨＰＶウイルス株についての参考文献。
【図7】ウイルスのＬＯＤを決定するためのＰＣＲ条件の参照表。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、詳細に説明する。
本発明の主題は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症、例えば医療関連感染（ＨＡＩ）のリスクを評価する方法である。
実際に、本発明者らは、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）ウイルス量が、免疫抑制治療を受けておらず、医療施設に入院している患者、より具体的には集中治療室で処置されている患者の合併症のリスクの指標であることを示した。
特に、驚くべきことに、集中治療に入った後の最初の１週間後のＴＴＶウイルス量の増加は、このユニットにおけるより長い滞在と有意に相関するようである。
さらに、ＴＴＶウイルス量の増加及び減少はともに、入院後の最初の１ヶ月間のＨＡＩの発生と有意に関連する。
最後に、患者の入院中、特に集中治療室での入院の第１週からの、少なくとも１種のヘルペスウイルスの存在に関連する高いＴＴＶウイルス量の同時検出は、医療関連感染（ＨＡＩ）の発生のリスクと相関する。したがって、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症の発生のリスク、特に医療関連感染（ＨＡＩ）の発生のリスクの早期評価を行うことができる。
本明細書では、各実施形態は、単独で実施されてよく、適宜組み合わせて実施されてよい。
本発明の主題は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症、例えば医療関連感染（ＨＡＩ）のリスクを評価する方法である。
実際に、本発明者らは、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）ウイルス量が、免疫抑制治療を受けておらず、医療施設に入院している患者、より具体的には集中治療室で処置されている患者の合併症のリスクの指標であることを示した。
特に、驚くべきことに、集中治療に入った後の最初の１週間後のＴＴＶウイルス量の増加は、このユニットにおけるより長い滞在と有意に相関するようである。
さらに、ＴＴＶウイルス量の増加及び減少はともに、入院後の最初の１ヶ月間のＨＡＩの発生と有意に関連する。
最後に、患者の入院中、特に集中治療室での入院の第１週からの、少なくとも１種のヘルペスウイルスの存在に関連する高いＴＴＶウイルス量の同時検出は、医療関連感染（ＨＡＩ）の発生のリスクと相関する。したがって、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症の発生のリスク、特に医療関連感染（ＨＡＩ）の発生のリスクの早期評価を行うことができる。
本明細書では、各実施形態は、単独で実施されてよく、適宜組み合わせて実施されてよい。
【0013】
患者の合併症のリスクを評価するための方法
本明細書の主題は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量に基づいて、当該患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法である。
第１の態様では、医療施設に入院した患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法が本明細書に記載され、当該患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定することを含み、当該患者が免疫抑制治療を受けていないことを特徴とする。
驚くべきことに、医療施設の患者におけるウイルス再活性化現象を研究することによって、本発明者らは、免疫抑制治療を受けていない患者の医療施設に滞在中のＴＴＶウイルス量の変化と合併症の発生、すなわち、患者の状態の好ましくない変化、すなわち、特に医療関連感染の発生との間の相関の存在を同定した。
好ましい実施形態では、医療施設への入院後の最初の１ヶ月間のＴＴＶウイルス量の変動は、ＨＡＩを発症するリスクを示す。
本明細書の主題は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量に基づいて、当該患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法である。
第１の態様では、医療施設に入院した患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法が本明細書に記載され、当該患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定することを含み、当該患者が免疫抑制治療を受けていないことを特徴とする。
驚くべきことに、医療施設の患者におけるウイルス再活性化現象を研究することによって、本発明者らは、免疫抑制治療を受けていない患者の医療施設に滞在中のＴＴＶウイルス量の変化と合併症の発生、すなわち、患者の状態の好ましくない変化、すなわち、特に医療関連感染の発生との間の相関の存在を同定した。
好ましい実施形態では、医療施設への入院後の最初の１ヶ月間のＴＴＶウイルス量の変動は、ＨＡＩを発症するリスクを示す。
【0014】
本明細書の用語「患者の合併症のリスクを評価する」又は「患者の合併症のリスクを決定する」は、被験体又は患者が、将来、以下に定義される合併症を発症する確率の決定を意味する。
本明細書に開示される方法は、当該リスクを評価するためのツールを表し、臨床検査、当該患者からの生体試料の採取、並びに１つ以上のバイオマーカー及び／又は１つ以上の感染因子、特に細菌、ウイルス、寄生虫、酵母若しくは糸状菌の検出等の他のプロセス、方法又は指標と組み合わせることができる。
本明細書の「合併症」は、疾患、健康状態又は医学的処置における好ましくない変化を意味する。ここで「合併症」は、特に、１つ以上の侵襲的医療装置の実施、例えば気管挿管、尿カテーテル、カテーテル又は中心線の挿入が必要となりうる疾患の好ましくない変化を意味する場合がある。
「合併症」はまた、当該医療施設、特に集中治療室における長期の治療をもたらしうる疾患の好ましくない変化を意味する。
「合併症」はまた、当該患者の死亡を意味する。
「合併症」は、好ましくは、実施される特定の医学的処置を必要とし得る疾患における好ましくない変化を意味する。そのような合併症の例として、二次感染又は日和見感染、特に、１つ以上の感染病原体、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、酵母又は糸状菌による感染等の「医療関連感染」又は「ＨＡＩ」の発症があげられる。
本明細書に開示される方法は、当該リスクを評価するためのツールを表し、臨床検査、当該患者からの生体試料の採取、並びに１つ以上のバイオマーカー及び／又は１つ以上の感染因子、特に細菌、ウイルス、寄生虫、酵母若しくは糸状菌の検出等の他のプロセス、方法又は指標と組み合わせることができる。
本明細書の「合併症」は、疾患、健康状態又は医学的処置における好ましくない変化を意味する。ここで「合併症」は、特に、１つ以上の侵襲的医療装置の実施、例えば気管挿管、尿カテーテル、カテーテル又は中心線の挿入が必要となりうる疾患の好ましくない変化を意味する場合がある。
「合併症」はまた、当該医療施設、特に集中治療室における長期の治療をもたらしうる疾患の好ましくない変化を意味する。
「合併症」はまた、当該患者の死亡を意味する。
「合併症」は、好ましくは、実施される特定の医学的処置を必要とし得る疾患における好ましくない変化を意味する。そのような合併症の例として、二次感染又は日和見感染、特に、１つ以上の感染病原体、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、酵母又は糸状菌による感染等の「医療関連感染」又は「ＨＡＩ」の発症があげられる。
【0015】
本明細書の文脈では、感染は、医療専門家による患者の処置（診断、治療、緩和、予防、教育又は外科的）中に発生した場合、及び処置の開始時に存在しなかった場合、「医療関連感染」であるという。医療関連感染は、医療施設で罹患した感染（院内感染という）だけでなく、この状況以外で受けたケアの間に罹患した感染も包含する。感染の状態が治療開始時に正確に知られていない場合、ＨＡＩを定義するために、少なくとも４８時間の遅延又は潜伏期間よりも長い遅延が一般に許容される。
手術部位の感染については、手術後３０日以内に起こる感染、又はインプラント、プロテーゼ若しくはプロテーゼ材料が適所に配置された場合には、手術後１年以内に起こる感染が、医療関連感染であると考えられる。医療関連感染としては、例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌又は緑膿菌等の細菌による細菌起源があげられる。感染としてはまた、真菌起源、特にカンジダ属の酵母、又はアスペルギルス属の糸状菌、特にアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）によるものがあげられる。感染はまた、ウイルス性、特にアデノウイルス、ヘルペスウイルス、エンテロウイルス、ロタウイルス又はＨＩＶ型のウイルスによるものであってよい。これはまた、ヘルペスウイルス、例えばウイルスＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１等の潜在的に病原性の潜伏性ウイルスの再活性化であってよい。
手術部位の感染については、手術後３０日以内に起こる感染、又はインプラント、プロテーゼ若しくはプロテーゼ材料が適所に配置された場合には、手術後１年以内に起こる感染が、医療関連感染であると考えられる。医療関連感染としては、例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌又は緑膿菌等の細菌による細菌起源があげられる。感染としてはまた、真菌起源、特にカンジダ属の酵母、又はアスペルギルス属の糸状菌、特にアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）によるものがあげられる。感染はまた、ウイルス性、特にアデノウイルス、ヘルペスウイルス、エンテロウイルス、ロタウイルス又はＨＩＶ型のウイルスによるものであってよい。これはまた、ヘルペスウイルス、例えばウイルスＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１等の潜在的に病原性の潜伏性ウイルスの再活性化であってよい。
【0016】
好ましい実施形態では、本明細書は、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関し、当該合併症は、医療関連感染（ＨＡＩ）の発生である。
特に、ＨＡＩは院内感染であり得る。この場合、本明細書に記載の方法により、当該患者における院内感染の発生のリスクを決定することができる。敗血症状態にある患者、したがって既に一次感染を患っている患者の場合、本明細書に記載の方法により、二次感染の発生のリスクを決定することができる。
特に、ＨＡＩは院内感染であり得る。この場合、本明細書に記載の方法により、当該患者における院内感染の発生のリスクを決定することができる。敗血症状態にある患者、したがって既に一次感染を患っている患者の場合、本明細書に記載の方法により、二次感染の発生のリスクを決定することができる。
【0017】
本明細書に記載の方法は、特に、当該患者からの生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量を測定することに基づく。
「生体試料」は、被験体から採取することができるいかなる試料をも意味する。
一般に、生体試料により、ＴＴＶ及び／又はヘルペスウイルス（ＨＰＶ）量を決定できなければならない。ここで、生体試料は、とりわけ、全血、血清、血漿、喀痰、鼻咽頭試料、尿、便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物、精子、精液、涙、脊髄組織又は流体、脳脊髄液、三叉神経節試料、仙骨神経節試料、脂肪組織、リンパ組織、胎盤組織、上部生殖管組織、胃腸管組織、生殖器組織及び神経系組織を意味するが、これらに限定されない。
特に、この試料は、血液試料又は血液由来試料等の生体液であってよく、特に、全血（静脈から採取されたもの、すなわち白血球及び赤血球、血小板及び血漿を含む）、血漿、血清、並びに血液から抽出された全てのタイプの細胞、例えば末梢血単核細胞（リンパ球（Ｂ、Ｔ及びＮＫ細胞）、樹状細胞及び単球を含むＰＢＭＣ）、Ｂ細胞亜集団、精製単球又は好中球から選択されてよい。試験試料は、生物学的供給源から直接、又は試料の性質を改変できる前処理後に用いることができる。例えば、当該前処理は、血液からの血漿の調製、粘性流体の希釈等を含み得る。
前処理方法はまた、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、破壊成分の不活性化、試薬の添加、溶解などを含み得る。さらに、固体試験試料を改変して液体媒体を形成するか、又は分析物を放出することが有益であり得る。
好ましくは－生体試料は、患者の生液であり、当該流体は、血液又はその派生物、例えば血漿及び／又は血清、脳脊髄液、尿及び気管支肺胞洗浄液からなる群から選択される。さらにより好ましくは、生体試料は、血液又はその誘導体、例えば血漿及び／又は血清の試料である。
「生体試料」は、被験体から採取することができるいかなる試料をも意味する。
一般に、生体試料により、ＴＴＶ及び／又はヘルペスウイルス（ＨＰＶ）量を決定できなければならない。ここで、生体試料は、とりわけ、全血、血清、血漿、喀痰、鼻咽頭試料、尿、便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物、精子、精液、涙、脊髄組織又は流体、脳脊髄液、三叉神経節試料、仙骨神経節試料、脂肪組織、リンパ組織、胎盤組織、上部生殖管組織、胃腸管組織、生殖器組織及び神経系組織を意味するが、これらに限定されない。
特に、この試料は、血液試料又は血液由来試料等の生体液であってよく、特に、全血（静脈から採取されたもの、すなわち白血球及び赤血球、血小板及び血漿を含む）、血漿、血清、並びに血液から抽出された全てのタイプの細胞、例えば末梢血単核細胞（リンパ球（Ｂ、Ｔ及びＮＫ細胞）、樹状細胞及び単球を含むＰＢＭＣ）、Ｂ細胞亜集団、精製単球又は好中球から選択されてよい。試験試料は、生物学的供給源から直接、又は試料の性質を改変できる前処理後に用いることができる。例えば、当該前処理は、血液からの血漿の調製、粘性流体の希釈等を含み得る。
前処理方法はまた、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、破壊成分の不活性化、試薬の添加、溶解などを含み得る。さらに、固体試験試料を改変して液体媒体を形成するか、又は分析物を放出することが有益であり得る。
好ましくは－生体試料は、患者の生液であり、当該流体は、血液又はその派生物、例えば血漿及び／又は血清、脳脊髄液、尿及び気管支肺胞洗浄液からなる群から選択される。さらにより好ましくは、生体試料は、血液又はその誘導体、例えば血漿及び／又は血清の試料である。
【0018】
ここで、用語「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは全てのヒトをいう。ヒト被験体は、「患者」であってよい。
「患者」は、より具体的には、本明細書では、医師（例えば、一般開業医）又は医療施設若しくは健康施設（例えば、病院、より具体的には、救急科、蘇生科、集中治療室若しくは高依存性施設、又は介護付き生活タイプの高齢者用医療施設）等の医療専門家と連絡を取ったヒト被験体をいう。ある実施形態では、患者は、ワクチン接種プロトコルの状況において（特に、介護施設又は一般医において）高齢者であってもよい。
本明細書に記載されるように、当該評価方法により、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクが決定される。
「免疫抑制治療を受けていない患者」とは、当該患者が、いかなる免疫抑制剤も、又は免疫抑制副作用がある薬剤も服用しておらず、免疫抑制を誘導し得るいかなる治療も受けていないことを意味する。
「免疫抑制治療」又は「免疫抑制を誘導すること」は、その効果が免疫系の活性を低減、阻害又は防止することである処置、特に医薬を意味する。非限定的な例として、「免疫抑制治療」は、特に、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、インターフェロン、抗増殖薬及び代謝拮抗剤（ラパマイシン、エベロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸）、カルシニューリン阻害剤、特にそれらの抗移植拒絶作用のためのもの（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、ボクロスポリン）、Ｓ１Ｐ－Ｒアゴニスト（ＦＴＹ７２０）、マロノニトリラミド（ＦＫ７７８）、抗体、例えば、抗胸腺細胞グロブリン、又はムロモナブ－ＣＤ３、ダクリズマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ等の特異的抗原に対するあるモノクローナル抗体を実施する処置であり得る。
「免疫抑制治療」はまた、放射線療法又は化学療法を意味する。
好ましい実施形態では、本明細書は、免疫抑制治療を受けておらず、医療施設、特に救急科、蘇生科、集中治療室又は高依存性施設に入院している患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関する。
患者の医療状況に応じて、病院内のある部門の間で区別がなされる。
「救急科」は、自力で到着したか、又は救急車若しくは緊急事態管理組織車両によって運ばれたかのいずれかの病気の人々及び負傷した人々を受け入れる部門を意味する。緊急事態管理組織の機能は、昼夜の全ての時間、及び一年中、精神医学上の緊急事態を含む緊急事態にあるあらゆる人を無差別に受け、特に苦痛及び生命を脅かす緊急事態の場合にその人を治療することである。
「蘇生部門」は、最も重篤な状態の患者が入院する専門部門を意味する。この部門では、患者は、換気、酸素付加、血圧、心臓及び腎臓の機能等の生体機能を絶えず監視することから利益を得る。必要であれば、可能であれば患者が生存しうるために、これらの生体機能を補助することができる。患者は、例えば、重篤な感染症（敗血症性ショック）、薬物中毒、多発外傷、昏睡、急性腎不全、急性呼吸不全の間、心停止後、又は心臓手術若しくは消化管の手術等の大手術後の術後期に、生命機能の不全を示す場合、蘇生部門に入院する。
「集中治療室」、「集中治療室部」又は「ＩＣＵ」は、危機的な状態にある患者、すなわち、少なくとも１つの生命機能の不全を示す患者、又は重篤な合併症を発症するリスクのある患者を治療する責任を負う部門を意味する。集中治療室は、高度に専門的な技術的手段を有する。これらの手段は、可逆的と考えられ、基礎障害（疾患、手術、外傷、中毒、火傷、敗血症）に関連する急性不均衡を検出、予防及び矯正するために、集学的チームによって継続的に使用されている。
「高依存性ユニット」又は「ＨＤＵ」は、綿密なモニタリングを必要とする病気の人々を受け入れ、治療するための病院部門を意味する。高依存性ユニットは、その状態及び治療が、生命機能の１つ以上の障害が発生する可能性があることを示唆する患者、及び生命機能の１つ以上の障害から回復した後（例えば、蘇生部門に滞在した後）のその状態が、従来の病院ユニットに戻ることを可能にするには深刻すぎるか又は不安定すぎる患者を治療する。高依存性ユニットは、蘇生部門と従来のケア部門との間の中間レベルである。
「患者」は、より具体的には、本明細書では、医師（例えば、一般開業医）又は医療施設若しくは健康施設（例えば、病院、より具体的には、救急科、蘇生科、集中治療室若しくは高依存性施設、又は介護付き生活タイプの高齢者用医療施設）等の医療専門家と連絡を取ったヒト被験体をいう。ある実施形態では、患者は、ワクチン接種プロトコルの状況において（特に、介護施設又は一般医において）高齢者であってもよい。
本明細書に記載されるように、当該評価方法により、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクが決定される。
「免疫抑制治療を受けていない患者」とは、当該患者が、いかなる免疫抑制剤も、又は免疫抑制副作用がある薬剤も服用しておらず、免疫抑制を誘導し得るいかなる治療も受けていないことを意味する。
「免疫抑制治療」又は「免疫抑制を誘導すること」は、その効果が免疫系の活性を低減、阻害又は防止することである処置、特に医薬を意味する。非限定的な例として、「免疫抑制治療」は、特に、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、インターフェロン、抗増殖薬及び代謝拮抗剤（ラパマイシン、エベロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸）、カルシニューリン阻害剤、特にそれらの抗移植拒絶作用のためのもの（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、ボクロスポリン）、Ｓ１Ｐ－Ｒアゴニスト（ＦＴＹ７２０）、マロノニトリラミド（ＦＫ７７８）、抗体、例えば、抗胸腺細胞グロブリン、又はムロモナブ－ＣＤ３、ダクリズマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ等の特異的抗原に対するあるモノクローナル抗体を実施する処置であり得る。
「免疫抑制治療」はまた、放射線療法又は化学療法を意味する。
好ましい実施形態では、本明細書は、免疫抑制治療を受けておらず、医療施設、特に救急科、蘇生科、集中治療室又は高依存性施設に入院している患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関する。
患者の医療状況に応じて、病院内のある部門の間で区別がなされる。
「救急科」は、自力で到着したか、又は救急車若しくは緊急事態管理組織車両によって運ばれたかのいずれかの病気の人々及び負傷した人々を受け入れる部門を意味する。緊急事態管理組織の機能は、昼夜の全ての時間、及び一年中、精神医学上の緊急事態を含む緊急事態にあるあらゆる人を無差別に受け、特に苦痛及び生命を脅かす緊急事態の場合にその人を治療することである。
「蘇生部門」は、最も重篤な状態の患者が入院する専門部門を意味する。この部門では、患者は、換気、酸素付加、血圧、心臓及び腎臓の機能等の生体機能を絶えず監視することから利益を得る。必要であれば、可能であれば患者が生存しうるために、これらの生体機能を補助することができる。患者は、例えば、重篤な感染症（敗血症性ショック）、薬物中毒、多発外傷、昏睡、急性腎不全、急性呼吸不全の間、心停止後、又は心臓手術若しくは消化管の手術等の大手術後の術後期に、生命機能の不全を示す場合、蘇生部門に入院する。
「集中治療室」、「集中治療室部」又は「ＩＣＵ」は、危機的な状態にある患者、すなわち、少なくとも１つの生命機能の不全を示す患者、又は重篤な合併症を発症するリスクのある患者を治療する責任を負う部門を意味する。集中治療室は、高度に専門的な技術的手段を有する。これらの手段は、可逆的と考えられ、基礎障害（疾患、手術、外傷、中毒、火傷、敗血症）に関連する急性不均衡を検出、予防及び矯正するために、集学的チームによって継続的に使用されている。
「高依存性ユニット」又は「ＨＤＵ」は、綿密なモニタリングを必要とする病気の人々を受け入れ、治療するための病院部門を意味する。高依存性ユニットは、その状態及び治療が、生命機能の１つ以上の障害が発生する可能性があることを示唆する患者、及び生命機能の１つ以上の障害から回復した後（例えば、蘇生部門に滞在した後）のその状態が、従来の病院ユニットに戻ることを可能にするには深刻すぎるか又は不安定すぎる患者を治療する。高依存性ユニットは、蘇生部門と従来のケア部門との間の中間レベルである。
【0019】
好ましい実施形態では、本発明のインビトロ又はエクスビボ評価方法により、集中治療室に入院した患者の合併症のリスクを評価することができる。
本評価方法は、免疫炎症性発作を患った患者の合併症のリスクを評価するのに特に適する。
「免疫炎症性発作」は、外傷又は創傷を意味し、その効果は、患者の体内で過剰炎症性応答を誘導することである。この過剰炎症反応の持続は、抗炎症プロファイルに関連する後天的免疫抑制をもたらし、最終的には感染が止められなくなる。この現象は、免疫麻痺としても知られており、単球の表面ではあるがＢ細胞の表面ではない主要組織適合性複合体クラスＩＩの分子の発現の下方制御を特徴とする。単球／マクロファージ機能の抑制により、免疫複合体の放出が減少し、抗原提示能力に悪影響が及ぼされ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能が低下する。このタイプの反応は、集中治療室の非免疫抑制患者に一般的である（Ｃ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
「免疫炎症性発作」は、特に、外傷、外傷に罹患している患者のための、火傷、火傷に罹患している患者のための、手術、手術を受けた患者のための、又は敗血症状態の患者のための敗血症を含む。
好ましい実施形態では、本明細書は、免疫抑制治療を受けていない患者、敗血症状態、より具体的には敗血症性ショックにある患者、及び／又は熱傷、より具体的には重度の熱傷に罹患している患者、及び／又は外傷、より具体的には重度の外傷に罹患している患者、及び／又は外科手術、より具体的には大手術を受けた患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関する。
「敗血症状態の患者」又は「敗血症に罹患している患者」は、感染に対する不適当な宿主応答によって惹起される少なくとも１つの生命を脅かす臓器不全を示す患者を意味する。
「敗血症性ショック」は、十分な血管充填にもかかわらず低血圧が持続する敗血症のサブタイプを意味する。
「火傷に罹患している患者」は、患者が、熱傷及び／又は電気熱傷及び／又は化学熱傷及び／又は放射線熱傷によって惹起される皮膚細胞及び下層組織が破壊されていることを意味する。熱傷は、表在性、部分的な厚さ又は完全な厚さであり得、一般的に又は具体的に、例えば、首、顔、目、手、足、関節又は身体の他の部分にありうる。
「重度の熱傷」又は「重度の熱傷に罹患している患者」は、身体の総表面積の１５％超、好ましくは２０％超、好ましくは２５％超、最も具体的には身体の総表面積の３０％超の体表面積にわたる熱傷に罹患している患者を意味する。
「外傷に罹患している患者」は、集中治療室に直接入院した患者を意味する。「重度の外傷に罹患している患者」は、傷害重症度スコア（ＩＳＳ、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７４）１５超、好ましくは２０超、より好ましくは２５超である患者を意味する。
「外科手術を受けた患者」は、身体機能、外見を補助若しくは改善するために、又は創傷領域を修復するために、疾患又は創傷等の疾患状態を治療する目的で侵襲的外科手術を受けた患者を意味する。
「大手術」又は「大手術を受けた患者」は、技術的に困難であり、及び／又は出血のリスクがあり、及び／又は死亡のリスクがあり、及び／又は長期にわたり（例えば３時間超、好ましくは４時間超、例えば５時間若しくは６時間、又はさらに長い）、及び／又は著しい術後ケアが必要な外科的処置を意味する。非限定的な例として、大手術は、以下の：食道胃切除術、ブリックヤー膀胱切除術（小腸粘膜からの再建を伴う膀胱全摘）、頭部膵十二指腸切除（ウィップル手技）及び／又は開腹術による腹部大動脈瘤手術の適応症の少なくとも１つを意図した手術を意味する。
本評価方法は、免疫炎症性発作を患った患者の合併症のリスクを評価するのに特に適する。
「免疫炎症性発作」は、外傷又は創傷を意味し、その効果は、患者の体内で過剰炎症性応答を誘導することである。この過剰炎症反応の持続は、抗炎症プロファイルに関連する後天的免疫抑制をもたらし、最終的には感染が止められなくなる。この現象は、免疫麻痺としても知られており、単球の表面ではあるがＢ細胞の表面ではない主要組織適合性複合体クラスＩＩの分子の発現の下方制御を特徴とする。単球／マクロファージ機能の抑制により、免疫複合体の放出が減少し、抗原提示能力に悪影響が及ぼされ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能が低下する。このタイプの反応は、集中治療室の非免疫抑制患者に一般的である（Ｃ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
「免疫炎症性発作」は、特に、外傷、外傷に罹患している患者のための、火傷、火傷に罹患している患者のための、手術、手術を受けた患者のための、又は敗血症状態の患者のための敗血症を含む。
好ましい実施形態では、本明細書は、免疫抑制治療を受けていない患者、敗血症状態、より具体的には敗血症性ショックにある患者、及び／又は熱傷、より具体的には重度の熱傷に罹患している患者、及び／又は外傷、より具体的には重度の外傷に罹患している患者、及び／又は外科手術、より具体的には大手術を受けた患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法に関する。
「敗血症状態の患者」又は「敗血症に罹患している患者」は、感染に対する不適当な宿主応答によって惹起される少なくとも１つの生命を脅かす臓器不全を示す患者を意味する。
「敗血症性ショック」は、十分な血管充填にもかかわらず低血圧が持続する敗血症のサブタイプを意味する。
「火傷に罹患している患者」は、患者が、熱傷及び／又は電気熱傷及び／又は化学熱傷及び／又は放射線熱傷によって惹起される皮膚細胞及び下層組織が破壊されていることを意味する。熱傷は、表在性、部分的な厚さ又は完全な厚さであり得、一般的に又は具体的に、例えば、首、顔、目、手、足、関節又は身体の他の部分にありうる。
「重度の熱傷」又は「重度の熱傷に罹患している患者」は、身体の総表面積の１５％超、好ましくは２０％超、好ましくは２５％超、最も具体的には身体の総表面積の３０％超の体表面積にわたる熱傷に罹患している患者を意味する。
「外傷に罹患している患者」は、集中治療室に直接入院した患者を意味する。「重度の外傷に罹患している患者」は、傷害重症度スコア（ＩＳＳ、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７４）１５超、好ましくは２０超、より好ましくは２５超である患者を意味する。
「外科手術を受けた患者」は、身体機能、外見を補助若しくは改善するために、又は創傷領域を修復するために、疾患又は創傷等の疾患状態を治療する目的で侵襲的外科手術を受けた患者を意味する。
「大手術」又は「大手術を受けた患者」は、技術的に困難であり、及び／又は出血のリスクがあり、及び／又は死亡のリスクがあり、及び／又は長期にわたり（例えば３時間超、好ましくは４時間超、例えば５時間若しくは６時間、又はさらに長い）、及び／又は著しい術後ケアが必要な外科的処置を意味する。非限定的な例として、大手術は、以下の：食道胃切除術、ブリックヤー膀胱切除術（小腸粘膜からの再建を伴う膀胱全摘）、頭部膵十二指腸切除（ウィップル手技）及び／又は開腹術による腹部大動脈瘤手術の適応症の少なくとも１つを意図した手術を意味する。
【0020】
ある好ましい実施形態を以下に記載する。本明細書は、これらの実施形態に限定されず、上述の特徴のうちの１つ以上を組み合わせることで、他の特定の実施形態を実施することができる。
したがって、本発明者らは、医療施設における患者のウイルス再活性化の現象を研究した。より具体的には、彼らは、医療施設における彼らの治療の異なる時点で、当該患者からの生体試料中のＴＴＶウイルス量の存在及び／又は変動を測定した。
本発明者らは、特に、患者に応じて、ウイルス量が経時的に変化する場合があることを観察した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、この変化が、医療関連感染の発生のリスク及び／又は処置の期間を延長するリスクを示すことを観察した。したがって、本発明者らは、医療施設に入院した患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法を開発した。
本明細書に記載される方法は、ＴＴＶウイルス量の測定に基づく。「トルクテノウイルス」又は「ＴＴＶ」は、本明細書では、アネロウイルス科のウイルスを意味する。本明細書で意図されるＴＴＶは、負の極性の環状一本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである。
「ＴＴＶゲノム」は、本明細書では、すべてのアネロウイルス科のすべてのゲノム、特に、ヒトに見出されるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ベータトルクウイルス（ＴＴＭＶ）、及びガンマトルクウイルス（ＴＴＭＤＶ）属のゲノムをいう。例として、ここでは、トルクテノウイルス原型株ＴＴＶ－１ａのゲノムを参照する。より具体的には、ＴＴＶゲノムの例は、例えば配列番号１によって表され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号がＡＢ０１７６１０であるような配列である。
１９９７年に、遺伝子サブトラクション法を用いて、病因が不確定な輸血後肝炎を呈する日本人患者の血清中に、約５００塩基対（ｂｐ）のウイルス配列断片が発見された（１－７）。このクローンは、最初にＮ２２と命名され、その時点ではウイルス配列データベースに列挙されていないが、それが発見された患者の頭文字にちなんでＴＴウイルス（ＴＴＶ）と改名された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、１９９７）。その後のさらなる研究により、ＴＴＶゲノムが負の極性の環状一本鎖ＤＮＡからなることが示された。これは、ヒトにおいて単離された環状一本鎖ＤＮＡの最初のウイルスであった。この非コード領域中の配列を増幅することができるプライマーを用いて、世界人口におけるＴＴＶの高い有病率（約９０％）が実証された。
ＴＴＶは、明らかに関連する臨床徴候を伴わずに慢性感染症を惹起する。これは、非病原性又はオーファンウイルスという。したがって、多くの研究が、ヒト疾患、特に特定の肝疾患におけるＴＴＶの関与に焦点を当てているが、このウイルスの機能は明確には同定されていない。
優先的に、ＴＴＶのゲノムサイズは、約３．８ｋｂである。ＴＴＶのゲノム構造及び構成は、当業者に周知であり（例えば、Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３１：２１－３３，２００９を参照されたい）、図１に例示されている。
つまり、ＴＴＶゲノムは、約１～１．２ｋｂの非翻訳領域（ＵＴＲ）と約２．６～２．８ｋｂの潜在的コード領域に分割することができる。コード領域は、特に、２つの大きなオープンリーディングフレーム：ＯＲＦ１及びＯＲＦ２を含み、各々７７０残基及び２０２残基の２つのタンパク質をコードする。配列番号１で表されるＴＴＶゲノムでは、オープンリーディングフレームＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、各々ヌクレオチド５８９～２９０１及び１０７～７１５の間にある。ＴＴＶゲノムには、他のオープンリーディングフレームがあってよい。例えば、ＴＴＶのゲノムは、２つのさらなるオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ３及びＯＲＦ４を含んでよい（図１）。
非翻訳領域ＵＴＲは高度に保存されている。それは、特に、二次構造を形成しやすいＧＣリッチ配列を含む。ＵＴＲ－５’非翻訳領域で選択された配列の増幅により、ウイルスの蔓延が全世界の集団全体にわたって非常に高いことを実証された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（８）：３７４７－３７５４，２００５）。この領域は、特に１２８ｂｐの配列を含み、当業者に公知の方法、例えばＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いて増幅することができる。
したがって、本発明者らは、医療施設における患者のウイルス再活性化の現象を研究した。より具体的には、彼らは、医療施設における彼らの治療の異なる時点で、当該患者からの生体試料中のＴＴＶウイルス量の存在及び／又は変動を測定した。
本発明者らは、特に、患者に応じて、ウイルス量が経時的に変化する場合があることを観察した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、この変化が、医療関連感染の発生のリスク及び／又は処置の期間を延長するリスクを示すことを観察した。したがって、本発明者らは、医療施設に入院した患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法を開発した。
本明細書に記載される方法は、ＴＴＶウイルス量の測定に基づく。「トルクテノウイルス」又は「ＴＴＶ」は、本明細書では、アネロウイルス科のウイルスを意味する。本明細書で意図されるＴＴＶは、負の極性の環状一本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである。
「ＴＴＶゲノム」は、本明細書では、すべてのアネロウイルス科のすべてのゲノム、特に、ヒトに見出されるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ベータトルクウイルス（ＴＴＭＶ）、及びガンマトルクウイルス（ＴＴＭＤＶ）属のゲノムをいう。例として、ここでは、トルクテノウイルス原型株ＴＴＶ－１ａのゲノムを参照する。より具体的には、ＴＴＶゲノムの例は、例えば配列番号１によって表され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号がＡＢ０１７６１０であるような配列である。
１９９７年に、遺伝子サブトラクション法を用いて、病因が不確定な輸血後肝炎を呈する日本人患者の血清中に、約５００塩基対（ｂｐ）のウイルス配列断片が発見された（１－７）。このクローンは、最初にＮ２２と命名され、その時点ではウイルス配列データベースに列挙されていないが、それが発見された患者の頭文字にちなんでＴＴウイルス（ＴＴＶ）と改名された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、１９９７）。その後のさらなる研究により、ＴＴＶゲノムが負の極性の環状一本鎖ＤＮＡからなることが示された。これは、ヒトにおいて単離された環状一本鎖ＤＮＡの最初のウイルスであった。この非コード領域中の配列を増幅することができるプライマーを用いて、世界人口におけるＴＴＶの高い有病率（約９０％）が実証された。
ＴＴＶは、明らかに関連する臨床徴候を伴わずに慢性感染症を惹起する。これは、非病原性又はオーファンウイルスという。したがって、多くの研究が、ヒト疾患、特に特定の肝疾患におけるＴＴＶの関与に焦点を当てているが、このウイルスの機能は明確には同定されていない。
優先的に、ＴＴＶのゲノムサイズは、約３．８ｋｂである。ＴＴＶのゲノム構造及び構成は、当業者に周知であり（例えば、Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３１：２１－３３，２００９を参照されたい）、図１に例示されている。
つまり、ＴＴＶゲノムは、約１～１．２ｋｂの非翻訳領域（ＵＴＲ）と約２．６～２．８ｋｂの潜在的コード領域に分割することができる。コード領域は、特に、２つの大きなオープンリーディングフレーム：ＯＲＦ１及びＯＲＦ２を含み、各々７７０残基及び２０２残基の２つのタンパク質をコードする。配列番号１で表されるＴＴＶゲノムでは、オープンリーディングフレームＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、各々ヌクレオチド５８９～２９０１及び１０７～７１５の間にある。ＴＴＶゲノムには、他のオープンリーディングフレームがあってよい。例えば、ＴＴＶのゲノムは、２つのさらなるオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ３及びＯＲＦ４を含んでよい（図１）。
非翻訳領域ＵＴＲは高度に保存されている。それは、特に、二次構造を形成しやすいＧＣリッチ配列を含む。ＵＴＲ－５’非翻訳領域で選択された配列の増幅により、ウイルスの蔓延が全世界の集団全体にわたって非常に高いことを実証された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（８）：３７４７－３７５４，２００５）。この領域は、特に１２８ｂｐの配列を含み、当業者に公知の方法、例えばＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いて増幅することができる。
【0021】
「ウイルス量」は、生体試料中に存在するウイルス粒子の数を意味する。ウイルス量は、ウイルス感染の重篤度を反映する。ウイルス量は、生体試料中のウイルスの成分（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質など）の１つの量を測定することによって決定され得る。
したがって、好ましくは、ウイルス量は、生体試料中の当該ウイルスに属する核酸配列の比率をいう。より優先的には、ウイルス量は、生体試料中の当該ウイルスのゲノムのコピー数を表す。
この場合、ウイルス量はＴＴＶ量を表す。「ＴＴＶ量」は、本明細書では、より具体的には、ＴＴＶウイルス量、すなわち、生体試料中に存在するＴＴＶウイルスの粒子の数に対応する。患者のＴＴＶ量は、当該患者が宿すいかなるＴＴＶのウイルス量を意味する。ＴＴＶ量は、この生体試料中のＴＴＶの成分の量を測定することによって決定することができる。
好ましくは、ＴＴＶ量は、生体試料中に存在するＴＴＶ核酸配列の量に対応する。したがって、本発明のプロトコルによる患者のＴＴＶ量の決定は、当該患者の生体試料中のすべてのＴＴＶの配列の数を推定することを含む。特に、本発明の方法では、当該生体試料中で測定される特定のＴＴＶ株は選択しない。実際、高いＴＴＶウイルス量の検出、特にＴＴＶ量の変動の検出は、検出される１つ以上のアネロウイルス科株とは無関係に、合併症、特に医療関連感染の発生のリスクの増大と関連する。
好ましくは、ＴＴＶ量の決定は、活性及び／又は不活性ウイルスコピーの量の決定を含む。それは、循環する、組み込まれた、又は潜伏しているウイルスコピーの量を決定することである。
特に、ＴＴＶウイルスコピー数は、ＴＴＶ検出限界を予め決定することで決定することができる。
したがって、好ましくは、ウイルス量は、生体試料中の当該ウイルスに属する核酸配列の比率をいう。より優先的には、ウイルス量は、生体試料中の当該ウイルスのゲノムのコピー数を表す。
この場合、ウイルス量はＴＴＶ量を表す。「ＴＴＶ量」は、本明細書では、より具体的には、ＴＴＶウイルス量、すなわち、生体試料中に存在するＴＴＶウイルスの粒子の数に対応する。患者のＴＴＶ量は、当該患者が宿すいかなるＴＴＶのウイルス量を意味する。ＴＴＶ量は、この生体試料中のＴＴＶの成分の量を測定することによって決定することができる。
好ましくは、ＴＴＶ量は、生体試料中に存在するＴＴＶ核酸配列の量に対応する。したがって、本発明のプロトコルによる患者のＴＴＶ量の決定は、当該患者の生体試料中のすべてのＴＴＶの配列の数を推定することを含む。特に、本発明の方法では、当該生体試料中で測定される特定のＴＴＶ株は選択しない。実際、高いＴＴＶウイルス量の検出、特にＴＴＶ量の変動の検出は、検出される１つ以上のアネロウイルス科株とは無関係に、合併症、特に医療関連感染の発生のリスクの増大と関連する。
好ましくは、ＴＴＶ量の決定は、活性及び／又は不活性ウイルスコピーの量の決定を含む。それは、循環する、組み込まれた、又は潜伏しているウイルスコピーの量を決定することである。
特に、ＴＴＶウイルスコピー数は、ＴＴＶ検出限界を予め決定することで決定することができる。
【0022】
「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、ウイルス標準を用いて検出の不在（ブランク値）と区別することができるゲノムのコピーの最小量を意味する。次に、標準曲線からの外挿によって、反応チューブ中の１μｌあたりのウイルスＤＮＡのコピーに関し、次いで、当該試料中の１ｍｌあたりのウイルスＤＮＡのコピーに関し、ウイルス量を決定することができる。
本明細書の文脈では、生体試料、例えば血液又は血漿及び／又は血清等のその誘導体１ｍｌ当たり７０００コピーを超える、好ましくは血漿１ｍｌ当たり１００００コピーを超える、好ましくは生体試料１ｍｌ当たり２００００コピーを超える、より好ましくは生体試料１ｍｌ当たり４００００コピーを超える生体試料中のウイルス量は、高いＴＴＶウイルス量であると考えられる。
ＴＴＶレベル、したがってＴＴＶ量は、当業者に周知の方法を用いて、ＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質のレベルを測定することによって決定することができる。したがって、本発明による方法は、患者からの試料の採取と以下に定義される工程ａ）との間に、生体試料を二本鎖ＤＮＡ試料、又はｍＲＮＡ（若しくは対応するｃＤＮＡ）試料、又はタンパク質試料に変換することに対応する他の予備工程を含んでよく、次いで、以下に定義される工程ａ）にてＴＴＶウイルス量のインビトロ測定に用いる準備が整う。
細胞試料からのウイルス二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡを得るためのその逆転写）又はタンパク質の調製又は抽出は、当業者に公知の単なる常套手順である。
本明細書の文脈では、生体試料、例えば血液又は血漿及び／又は血清等のその誘導体１ｍｌ当たり７０００コピーを超える、好ましくは血漿１ｍｌ当たり１００００コピーを超える、好ましくは生体試料１ｍｌ当たり２００００コピーを超える、より好ましくは生体試料１ｍｌ当たり４００００コピーを超える生体試料中のウイルス量は、高いＴＴＶウイルス量であると考えられる。
ＴＴＶレベル、したがってＴＴＶ量は、当業者に周知の方法を用いて、ＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質のレベルを測定することによって決定することができる。したがって、本発明による方法は、患者からの試料の採取と以下に定義される工程ａ）との間に、生体試料を二本鎖ＤＮＡ試料、又はｍＲＮＡ（若しくは対応するｃＤＮＡ）試料、又はタンパク質試料に変換することに対応する他の予備工程を含んでよく、次いで、以下に定義される工程ａ）にてＴＴＶウイルス量のインビトロ測定に用いる準備が整う。
細胞試料からのウイルス二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡを得るためのその逆転写）又はタンパク質の調製又は抽出は、当業者に公知の単なる常套手順である。
【0023】
二本鎖ＤＮＡは、ＴＴＶのゲノム全体に対応するか、又は単にその一部に対応することができる。二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）又はすぐに使えるタンパク質試料が利用可能になったら、試料のタイプ又は変換に応じて、ゲノムＤＮＡを用いて（すなわち、ＴＴＶゲノムの少なくとも一部からなる少なくとも１つの配列の存在に基づいて）、又はｍＲＮＡを用いて（すなわち、試料中のＴＴＶ ｍＲＮＡの含有量に基づいて）、又はタンパク質を用いて（すなわち、試料中のＴＴＶタンパク質の含有量に基づいて）、ＴＴＶの検出を行うことができる。
ＴＴＶレベルは、好ましくはＴＴＶ核酸、より好ましくはＴＴＶ ＤＮＡのレベルを測定して決定される。
生体試料中の核酸を検出する方法は、当業者に周知であり、とりわけ、増幅、好ましくはＰＣＲによる増幅、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによる増幅、配列決定、及び標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む。
したがって、有利には、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、当該患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定することを含み、当該ウイルス量が、少なくとも１つのＴＴＶ配列の増幅、配列決定又はハイブリダイゼーションによって、好ましくは増幅によって、より優先的にはリアルタイムＰＣＲによって測定される方法に関する。
ＴＴＶレベルは、好ましくはＴＴＶ核酸、より好ましくはＴＴＶ ＤＮＡのレベルを測定して決定される。
生体試料中の核酸を検出する方法は、当業者に周知であり、とりわけ、増幅、好ましくはＰＣＲによる増幅、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによる増幅、配列決定、及び標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む。
したがって、有利には、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、当該患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定することを含み、当該ウイルス量が、少なくとも１つのＴＴＶ配列の増幅、配列決定又はハイブリダイゼーションによって、好ましくは増幅によって、より優先的にはリアルタイムＰＣＲによって測定される方法に関する。
【0024】
第１の実施形態では、ＴＴＶ量は、ＴＴＶ配列の増幅によって決定される。
この実施形態では、好ましいアプローチは、ＴＴＶのゲノムに特異的であることが公知の配列、特に好ましくは、先に定義されたＴＴＶの非翻訳領域（ＵＴＲ）由来の少なくとも１つの配列を増幅することにある。
「ＴＴＶのゲノムに特異的な配列」は、本明細書では、公知のＴＴＶの大部分に存在するが、他のウイルスの大部分、特に他のアネロウイルスの大部分には存在しない配列を意味する。好ましくは、ＴＴＶ特異的配列は、既知のＴＴＶゲノムの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％に存在する。より好ましくは、それは、既知のＴＴＶゲノムの１００％に存在する。あるいは、ＴＴＶ特異的配列は、ＴＴＶ以外のアネロウイルスの公知のゲノムの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満に存在する。好ましくは、ＴＴＶ特異的配列は、ＴＴＶ以外のアネロウイルスのすべての公知のゲノムに存在しない。特に好ましくは、そのような配列は、例えば、あるＴＴＶから他のＴＴＶに高度に保存されている非翻訳領域（ＵＴＲ）に含まれる配列である。より具体的には、そのような配列は、５’－ＵＴＲ非翻訳領域の１２８ｂｐ配列に対応し得、これは、当業者に公知の方法により、例えば、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いて増幅しうる。
したがって、この実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＴＴＶのゲノムに特異的であることが公知の配列の増幅用のプライマー及びプローブの使用を含む。この技術分野では通例であるように、当該プライマーは、好ましくはオリゴヌクレオチドである。例えば、当該プライマーは、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、又は１２ヌクレオチド未満を含み得る。あるいは、これらのプライマーは、少なくとも１２、１５、２０、２５又は３０ヌクレオチドを含む。好ましくは、用いられるプライマーは、１２～２０ヌクレオチド、１２～２５ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、又は１５～２５ヌクレオチドを含む。当業者には、ＴＴＶ特異的配列の増幅用プライマーの長さ及び配列を決定する方法は公知である。それらは、例えば、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（参照番号４２３４１４及び６９－０３０Ｂ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）において提供されるものと同じプライマーを用いてよい。
この実施形態では、好ましいアプローチは、ＴＴＶのゲノムに特異的であることが公知の配列、特に好ましくは、先に定義されたＴＴＶの非翻訳領域（ＵＴＲ）由来の少なくとも１つの配列を増幅することにある。
「ＴＴＶのゲノムに特異的な配列」は、本明細書では、公知のＴＴＶの大部分に存在するが、他のウイルスの大部分、特に他のアネロウイルスの大部分には存在しない配列を意味する。好ましくは、ＴＴＶ特異的配列は、既知のＴＴＶゲノムの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％に存在する。より好ましくは、それは、既知のＴＴＶゲノムの１００％に存在する。あるいは、ＴＴＶ特異的配列は、ＴＴＶ以外のアネロウイルスの公知のゲノムの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満に存在する。好ましくは、ＴＴＶ特異的配列は、ＴＴＶ以外のアネロウイルスのすべての公知のゲノムに存在しない。特に好ましくは、そのような配列は、例えば、あるＴＴＶから他のＴＴＶに高度に保存されている非翻訳領域（ＵＴＲ）に含まれる配列である。より具体的には、そのような配列は、５’－ＵＴＲ非翻訳領域の１２８ｂｐ配列に対応し得、これは、当業者に公知の方法により、例えば、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いて増幅しうる。
したがって、この実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＴＴＶのゲノムに特異的であることが公知の配列の増幅用のプライマー及びプローブの使用を含む。この技術分野では通例であるように、当該プライマーは、好ましくはオリゴヌクレオチドである。例えば、当該プライマーは、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、又は１２ヌクレオチド未満を含み得る。あるいは、これらのプライマーは、少なくとも１２、１５、２０、２５又は３０ヌクレオチドを含む。好ましくは、用いられるプライマーは、１２～２０ヌクレオチド、１２～２５ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、又は１５～２５ヌクレオチドを含む。当業者には、ＴＴＶ特異的配列の増幅用プライマーの長さ及び配列を決定する方法は公知である。それらは、例えば、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（参照番号４２３４１４及び６９－０３０Ｂ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）において提供されるものと同じプライマーを用いてよい。
【0025】
増幅技術としては、特に、等温技術及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく技術があげられる。等温増幅法には多数の方法が含まれる。病原体の検出に最も汎用されるのは、ＬＡＭＰ（ループ媒介増幅）及びＲＰＡ（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅）法である。等温増幅法としてはまた、例えば、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＨＤＡ（ヘリカーゼ依存性増幅）、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）及びＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＥＸＰＡＲ（指数関数的増幅反応）、ＩＣＡＮ（核酸の等温及びキメラプライマー開始増幅）、ＳＭＡＲＴ（ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅）等の方法があげられる（例えばＡｓｉｅｌｌｏ ｅｔ Ｂａｅｕｍｎｅｒ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １１（８）：１４２０－１４３０，２０１１）。
好ましくは、用いられるＰＣＲ技術は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡの初期量を定量的に測定する。本明細書に記載される方法において使用され得るＰＣＲに基づく技術の例は、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、多重逆転写ＰＣＲ、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＱＲＴ－ＰＣＲ）及びデジタルＰＣＲ等の技術を含む。これらの技術は、当業者に周知であり、容易に利用可能な技術である。
好ましくは、ＴＴＶ量は、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて決定される。ＴＴＶを検出及び定量するための多数の方法が、当業界で報告されている（例えば、Ｍａｇｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（４）：２４１８－２４２５，２００３）。
特に、以下の文献に記載されている方法を参照する。Ｋｕｌｉｆａｊら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．１０５：１１８－１２７，２０１８）。この方法は、その簡便性及びロバスト性のために特に有利である。これは、非コードＵＴＲ領域に含まれる配列の増幅に基づく。この配列は、全ての既知のＴＴＶに存在し、それによって、この方法は非常に高い程度の特異性を備える。さらに、それは特に多用途であり、いかなるタイプのＰＣＲプラットフォームを用いて実施することができる。この方法を実施するために、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（参照番号４２３４１４及び６９－０３０Ｂ ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いることが特に有利である。
好ましくは、用いられるＰＣＲ技術は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡの初期量を定量的に測定する。本明細書に記載される方法において使用され得るＰＣＲに基づく技術の例は、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、多重逆転写ＰＣＲ、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＱＲＴ－ＰＣＲ）及びデジタルＰＣＲ等の技術を含む。これらの技術は、当業者に周知であり、容易に利用可能な技術である。
好ましくは、ＴＴＶ量は、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて決定される。ＴＴＶを検出及び定量するための多数の方法が、当業界で報告されている（例えば、Ｍａｇｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（４）：２４１８－２４２５，２００３）。
特に、以下の文献に記載されている方法を参照する。Ｋｕｌｉｆａｊら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．１０５：１１８－１２７，２０１８）。この方法は、その簡便性及びロバスト性のために特に有利である。これは、非コードＵＴＲ領域に含まれる配列の増幅に基づく。この配列は、全ての既知のＴＴＶに存在し、それによって、この方法は非常に高い程度の特異性を備える。さらに、それは特に多用途であり、いかなるタイプのＰＣＲプラットフォームを用いて実施することができる。この方法を実施するために、ＴＴＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（参照番号４２３４１４及び６９－０３０Ｂ ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いることが特に有利である。
【0026】
あるいは、ウイルス量は、デジタルＰＣＲを用いて決定される。デジタルＰＣＲは、陽性増幅の大部分が単一の鋳型分子からのシグナルを反映するように、極度に希釈された核酸に対するあるＰＣＲ分析を含む。したがって、デジタルＰＣＲにより、個々のモデル分子を計数することができる。分析されたＰＣＲの総数のうちの陽性増幅の比率により、元の、又は希釈されていない試料中の鋳型の濃度が推定されうる。この技術は、種々の遺伝的現象を検出させるために提案された（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９２３６－９２４，１９９９）。デジタルＰＣＲにより、リアルタイムＰＣＲと同様に、潜在的に試料間の標的配列の非常に小さな量的差異を区別することができる。
【0027】
他の実施形態では、ＴＴＶ ＤＮＡレベルは、配列決定によって測定される。本明細書で用いられる用語「配列決定」は、その最も広い許容される意味であり、ポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の配列を決定すること、すなわち、この分子を構成するヌクレオチドの配列を決定することができる、当業者に公知のいかなる技術をいう。
したがって、ＴＴＶ ＤＮＡは、当技術分野で公知のいかなる技術による配列であり得る。本明細書で意味する配列決定としては、とりわけ、サンガー配列決定、全ゲノム配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、パイロ配列決定（特に４５４配列決定、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ配列決定）、キャピラリー電気泳動を用いる配列決定、サイクル配列決定、一塩基伸長配列決定、固相配列決定、ハイスループット配列決定、超並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）、可逆的色素ターミネーターによる配列決定、メイトペア配列決定、ショートリード配列決定、エキソヌクレアーゼを用いる配列決定、ライゲーションによる配列決定、単一分子配列決定、合成による配列決定、電子顕微鏡による配列決定、リアルタイム配列決定、反転停止配列決定、ナノポア配列決定、可逆的ターミネーター配列決定、半導体による配列決定、ＳＯＬｉＤ（Ｒ）配列決定、ＳＭＲＴ（単一分子リアルタイム分析）配列決定、ＭＳ－ＰＥＴ配列決定、質量分析、及びそれらの組合せがあげられる。特定の実施形態は、例えば、プラットフォームＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，５８：５８６－５９７，２０１５；Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；４５６：５３－５９，２００８）、４５４ゲノムシーケンサー及びＲｏｃｈｅ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；４３７：３７６－３８０，２００５）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｃＫｅｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ；１９：１５２７－１５４１，２００９）、Ｐｏｌａｎａｔｏｒプラットフォーム（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１７２８－１７３２）、又はＨｅｌｉｃｏｓ単一分子配列決定プラットフォーム（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；３２０：１０６－１０９，２００８）。ハイスループット配列決定はまた、ＳＭＲＴリアルタイム配列決定（Ｒｏａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３（５）：２７８－２８９，２０１５）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定（ＷＯ２０１０／００８４８０）；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３４８－３５２，２０１１）及びナノポア配列決定（Ｃｌａｒｋｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ：４：２６５－２７０，２００９）があげられる。
配列決定は、生体試料に含まれるＤＮＡの全てに対して、又は生体試料に含まれるＤＮＡの一部に対して行われる。当該試料に少なくともＴＴＶ ＤＮＡと宿主被験体ＤＮＡとの混合物が含まれることは、当業者には直ちに明らかである。さらに、ＴＴＶ ＤＮＡは、おそらく、試料中に存在する全ＤＮＡのうちのわずかな画分を表すにすぎない。有利には、ＤＮＡは、配列決定の前に、一般に物理的方法を用いて無作為に断片化される。
第１のアプローチは、ＴＴＶ種のゲノムの特定の配列を配列決定することにある。他のアプローチは、生体試料から得られた核酸の定量的遺伝子型決定を高い精度で行うことができる方法を用いることにある。特定の実施形態では、精度は、標的配列（すなわち、この場合、ＴＴＶ配列）の事前知識に基づくプロトコルを用いて、増幅をせずに多数（例えば、数百万又は数十億）の核酸分子を分析することによって得られる。
したがって、ＴＴＶ ＤＮＡは、当技術分野で公知のいかなる技術による配列であり得る。本明細書で意味する配列決定としては、とりわけ、サンガー配列決定、全ゲノム配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、パイロ配列決定（特に４５４配列決定、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ配列決定）、キャピラリー電気泳動を用いる配列決定、サイクル配列決定、一塩基伸長配列決定、固相配列決定、ハイスループット配列決定、超並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）、可逆的色素ターミネーターによる配列決定、メイトペア配列決定、ショートリード配列決定、エキソヌクレアーゼを用いる配列決定、ライゲーションによる配列決定、単一分子配列決定、合成による配列決定、電子顕微鏡による配列決定、リアルタイム配列決定、反転停止配列決定、ナノポア配列決定、可逆的ターミネーター配列決定、半導体による配列決定、ＳＯＬｉＤ（Ｒ）配列決定、ＳＭＲＴ（単一分子リアルタイム分析）配列決定、ＭＳ－ＰＥＴ配列決定、質量分析、及びそれらの組合せがあげられる。特定の実施形態は、例えば、プラットフォームＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，５８：５８６－５９７，２０１５；Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；４５６：５３－５９，２００８）、４５４ゲノムシーケンサー及びＲｏｃｈｅ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ；４３７：３７６－３８０，２００５）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｃＫｅｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ；１９：１５２７－１５４１，２００９）、Ｐｏｌａｎａｔｏｒプラットフォーム（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１７２８－１７３２）、又はＨｅｌｉｃｏｓ単一分子配列決定プラットフォーム（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；３２０：１０６－１０９，２００８）。ハイスループット配列決定はまた、ＳＭＲＴリアルタイム配列決定（Ｒｏａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３（５）：２７８－２８９，２０１５）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定（ＷＯ２０１０／００８４８０）；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３４８－３５２，２０１１）及びナノポア配列決定（Ｃｌａｒｋｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ：４：２６５－２７０，２００９）があげられる。
配列決定は、生体試料に含まれるＤＮＡの全てに対して、又は生体試料に含まれるＤＮＡの一部に対して行われる。当該試料に少なくともＴＴＶ ＤＮＡと宿主被験体ＤＮＡとの混合物が含まれることは、当業者には直ちに明らかである。さらに、ＴＴＶ ＤＮＡは、おそらく、試料中に存在する全ＤＮＡのうちのわずかな画分を表すにすぎない。有利には、ＤＮＡは、配列決定の前に、一般に物理的方法を用いて無作為に断片化される。
第１のアプローチは、ＴＴＶ種のゲノムの特定の配列を配列決定することにある。他のアプローチは、生体試料から得られた核酸の定量的遺伝子型決定を高い精度で行うことができる方法を用いることにある。特定の実施形態では、精度は、標的配列（すなわち、この場合、ＴＴＶ配列）の事前知識に基づくプロトコルを用いて、増幅をせずに多数（例えば、数百万又は数十億）の核酸分子を分析することによって得られる。
【0028】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、リードの数を定量することを含む。
特定の実施形態では、生体試料からの核酸分子のランダムサブセットをハイスループット配列決定に供する。好ましくは、ＴＴＶ配列は、公的に寄託されたＴＴＶ配列との比較によって、全体的な配列決定データで同定される。この比較は、有利には、既知のＴＴＶ配列との配列同一性のレベルに基づき、はるかに離れた変異体でさえ検出することができる。ＢＬＡＳＴ等の現在利用可能なソフトウェアを用いて、配列間の同一性のレベルを決定することができる。
したがって、既知のＴＴＶ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性がある配列は、ＴＴＶ配列であると同定される。この実施形態では、ＴＴＶ量の決定は、したがって、被験体からの生体試料中の配列決定によって同定されたＴＴＶ配列に番号付けをすることを含む。
特定の実施形態では、生体試料からの核酸分子のランダムサブセットをハイスループット配列決定に供する。好ましくは、ＴＴＶ配列は、公的に寄託されたＴＴＶ配列との比較によって、全体的な配列決定データで同定される。この比較は、有利には、既知のＴＴＶ配列との配列同一性のレベルに基づき、はるかに離れた変異体でさえ検出することができる。ＢＬＡＳＴ等の現在利用可能なソフトウェアを用いて、配列間の同一性のレベルを決定することができる。
したがって、既知のＴＴＶ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性がある配列は、ＴＴＶ配列であると同定される。この実施形態では、ＴＴＶ量の決定は、したがって、被験体からの生体試料中の配列決定によって同定されたＴＴＶ配列に番号付けをすることを含む。
【0029】
他の実施形態では、ＴＴＶ量は、生体試料中のウイルスタンパク質の量を測定することによって決定される。したがって、特に、免疫沈降、免疫組織学、ウェスタンブロット、ドット・ブロット、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＲ、電気化学発光（ＥＣＬＩＡ）、プロテイン・チップ、抗体チップ、又は免疫組織化学と組み合わせた組織チップ等の周知の技術において、特異的抗体を用いることができる。用いられうる他の技術としては、ＦＲＥＴ又はＢＲＥＴ技術、特に共焦点顕微鏡法及び電子顕微鏡法を含む顕微鏡法又は組織化学法、１つ以上の励起波長及び適当な光学的方法の使用に基づく方法（例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び高周波法（例えば、多極共鳴分光法、共焦点及び非共焦点）、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率及び複屈折又は屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法など）、フローサイトメトリー、放射性同位体又は磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析、質量分析及び質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析が挙げられる。これらの技術はすべて当業者には周知であり、ここで詳細に説明する必要はない。さらに、ＴＴＶタンパク質特異的抗体はすでに利用可能である。
【0030】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は、測定されるウイルス核酸又はタンパク質の量を標準化するさらなる工程を包含する。
好ましい実施形態では、ＴＴＶレベル、すなわち、生体試料中に存在するＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を、この試料に特異的なパラメータに標準化することが有利であり得る。
測定されたＴＴＶ量を特定のパラメータに標準化することで、２つの異なる生体試料のウイルス量間の比較の際のエラー率を低減することができる。この標準化に有用であり得るパラメータの例は、試料の内容物、例えば当該試料の体積とは無関係の物理的パラメータであり得る。また、ＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を、試料中に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の総量に対して標準化することもできる。あるいは、標準化ツールとして特定のＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列又は特定のタンパク質を用いることができる。例えば、この配列又はこのタンパク質は、ヒト配列又はタンパク質であり得る。
あるいは、所与の試料中のＴＴＶ ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を内部対照と比較する。
この目的のために、生体試料中で測定されたＴＴＶ核酸又はタンパク質の量を、同定及び定量することができる適当な核酸又はタンパク質、例えば宿主又は外因性核酸又はタンパク質の規定量と相関させることができる。好ましくは、この同定可能で定量可能な核酸又はタンパク質は、標的核酸又はタンパク質と同様に処理される（例えば、増幅される、配列決定されるなど）。
したがって、開始時から、この識別可能かつ定量可能な核酸又はタンパク質の既知量を試料に添加することができ、これを、その後、標的核酸又はタンパク質のように処理し、当該ウイルス核酸又はタンパク質の量が測定される前に、全ての試料調製工程を通過させる。調製工程は、ウイルス核酸を保護し、例えば、異なるヌクレアーゼを用いて宿主核酸を破壊する手段を含んでよい。
あるいは、これらの工程は、例えば、異なるプロテアーゼを用いて、ウイルスタンパク質を保護し、宿主タンパク質を破壊する手段を含み得る。内部対照により、試料中の問題の分子（核酸又はタンパク質）の処理（例えば、増幅又は配列決定）の質及び程度を評価することができる。好ましくは、当該内部対照は、既知の配列がある核酸分子であり、この核酸分子は、既知の濃度で試料中に存在する。より好ましくは、この核酸分子は、試料中の既知の配列及び濃度のウイルスの環状一本鎖ゲノムＤＮＡ分子である。このような既知のウイルスは、例えば、サーコウイルス科のウイルスであり得る。対照に対する試料中の配列の数の比から既知の配列及び濃度のＴＴＶゲノムの絶対数を推定することができる。あるいは、この内部対照は、既知の濃度で試料中に存在する既知の配列のタンパク質である。
好ましい実施形態では、ＴＴＶレベル、すなわち、生体試料中に存在するＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を、この試料に特異的なパラメータに標準化することが有利であり得る。
測定されたＴＴＶ量を特定のパラメータに標準化することで、２つの異なる生体試料のウイルス量間の比較の際のエラー率を低減することができる。この標準化に有用であり得るパラメータの例は、試料の内容物、例えば当該試料の体積とは無関係の物理的パラメータであり得る。また、ＴＴＶ ＤＮＡ、ＴＴＶ ＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を、試料中に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の総量に対して標準化することもできる。あるいは、標準化ツールとして特定のＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列又は特定のタンパク質を用いることができる。例えば、この配列又はこのタンパク質は、ヒト配列又はタンパク質であり得る。
あるいは、所与の試料中のＴＴＶ ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はＴＴＶタンパク質の量を内部対照と比較する。
この目的のために、生体試料中で測定されたＴＴＶ核酸又はタンパク質の量を、同定及び定量することができる適当な核酸又はタンパク質、例えば宿主又は外因性核酸又はタンパク質の規定量と相関させることができる。好ましくは、この同定可能で定量可能な核酸又はタンパク質は、標的核酸又はタンパク質と同様に処理される（例えば、増幅される、配列決定されるなど）。
したがって、開始時から、この識別可能かつ定量可能な核酸又はタンパク質の既知量を試料に添加することができ、これを、その後、標的核酸又はタンパク質のように処理し、当該ウイルス核酸又はタンパク質の量が測定される前に、全ての試料調製工程を通過させる。調製工程は、ウイルス核酸を保護し、例えば、異なるヌクレアーゼを用いて宿主核酸を破壊する手段を含んでよい。
あるいは、これらの工程は、例えば、異なるプロテアーゼを用いて、ウイルスタンパク質を保護し、宿主タンパク質を破壊する手段を含み得る。内部対照により、試料中の問題の分子（核酸又はタンパク質）の処理（例えば、増幅又は配列決定）の質及び程度を評価することができる。好ましくは、当該内部対照は、既知の配列がある核酸分子であり、この核酸分子は、既知の濃度で試料中に存在する。より好ましくは、この核酸分子は、試料中の既知の配列及び濃度のウイルスの環状一本鎖ゲノムＤＮＡ分子である。このような既知のウイルスは、例えば、サーコウイルス科のウイルスであり得る。対照に対する試料中の配列の数の比から既知の配列及び濃度のＴＴＶゲノムの絶対数を推定することができる。あるいは、この内部対照は、既知の濃度で試料中に存在する既知の配列のタンパク質である。
【0031】
決定されたＴＴＶ核酸又はタンパク質の量を測定することによってＴＴＶ量が決定されたら（後者は場合によっては標準化されている）、それを所定の基準ＴＴＶ量と比較することが有利であり得る。
この好ましい実施形態では、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、以下の：
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を所定の参照値と比較すること、かつ、
ｃ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きいか又は小さい場合に合併症のリスクを確立すること、
を含む。
本出願の目的のために、「参照ＴＴＶ量」又は「参照ウイルス量」は、参照として用いられるいかなるＴＴＶ量を意味する。
これは、参照ＴＴＶ量が、「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照レベル」又は「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の対照レベル」、すなわち、基準として用いられるＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度に対応することを意味する。
「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度」は、本明細書では、試験試料と比較でき、特定の外傷及び／又は感染状態を示す被験体又は被験体群から得られる対照試料において測定される基準レベルを意味することが意図される。これは、例えば、健康であるか、又は特定の外傷及び／若しくは感染を示さない被験体又は被験体群であり得る。これはまた、医療施設、特に集中治療室に入院した患者又は患者群、特に免疫炎症性発作を患った患者又は患者群、例えば敗血症を患っている、熱傷（複数可）、外傷に罹患した、及び／又は手術を受けた患者又は患者群であってもよい。最後に、これは、例えば、当該手術の前又は直後に、手術を受けた同じ個体であってもよい。基準レベルは、複数の方法によって決定されてよい。例えば、制御は、様々な形態であり得る所定の値であり得る。それは、中央値又は平均値等の単一の閾値であってもよい。「参照レベル」は、各患者に個々に適用可能な単一の値であってよい。あるいは、参照レベルは、患者の特定の亜集団に基づいて変動してよい。したがって、例えば、高齢の男性のＴＴＶ量は、より若い男性の基準レベルとは異なる基準レベルであってよく、女性のウイルス量は、男性の参照レベルとは異なる参照レベルであってよい。さらに、「参照レベル」は、高レベルのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）がない群及び高レベルのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）がある群等の比較群に基づいて確立することができる。比較群の他の例は、特定の疾患、状態又は症状に罹患している群及び疾患がない群である。所定の値は、例えば、試験集団が、低リスク群、中リスク群、及び高リスク群等の群に均等に（又は不均等に）分割される場合に定義され得る。
参照レベルはまた、疾患に罹患しているか、又は免疫抑制状態をもたらす治療を受けている患者の集団におけるＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを比較することで決定することもできる。これは、例えば、ヒストグラムによる分析によって達成することができ、ここで、被験体のコホート全体がグラフの形態で提示され、第１の軸は、当該ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを表し、第２の軸は、所与のレベルでＴＴＶ核酸（又はタンパク質）を発現する患者群における患者の数を表す。２つ以上の別個の被験体群は、同一又は類似のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）レベルを有するコホートの亜集団を同定することによって決定することができる。次いで、これらの別個の群を最もよく区別するレベルに基づいて、参照レベルを決定することができる。参照レベルはまた、存在する２つ以上のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを表すこともできる。２つ以上のマーカーは、例えば、各マーカーのレベルの値の比によって表され得る。
この好ましい実施形態では、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、以下の：
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を所定の参照値と比較すること、かつ、
ｃ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きいか又は小さい場合に合併症のリスクを確立すること、
を含む。
本出願の目的のために、「参照ＴＴＶ量」又は「参照ウイルス量」は、参照として用いられるいかなるＴＴＶ量を意味する。
これは、参照ＴＴＶ量が、「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照レベル」又は「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の対照レベル」、すなわち、基準として用いられるＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度に対応することを意味する。
「ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度」は、本明細書では、試験試料と比較でき、特定の外傷及び／又は感染状態を示す被験体又は被験体群から得られる対照試料において測定される基準レベルを意味することが意図される。これは、例えば、健康であるか、又は特定の外傷及び／若しくは感染を示さない被験体又は被験体群であり得る。これはまた、医療施設、特に集中治療室に入院した患者又は患者群、特に免疫炎症性発作を患った患者又は患者群、例えば敗血症を患っている、熱傷（複数可）、外傷に罹患した、及び／又は手術を受けた患者又は患者群であってもよい。最後に、これは、例えば、当該手術の前又は直後に、手術を受けた同じ個体であってもよい。基準レベルは、複数の方法によって決定されてよい。例えば、制御は、様々な形態であり得る所定の値であり得る。それは、中央値又は平均値等の単一の閾値であってもよい。「参照レベル」は、各患者に個々に適用可能な単一の値であってよい。あるいは、参照レベルは、患者の特定の亜集団に基づいて変動してよい。したがって、例えば、高齢の男性のＴＴＶ量は、より若い男性の基準レベルとは異なる基準レベルであってよく、女性のウイルス量は、男性の参照レベルとは異なる参照レベルであってよい。さらに、「参照レベル」は、高レベルのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）がない群及び高レベルのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）がある群等の比較群に基づいて確立することができる。比較群の他の例は、特定の疾患、状態又は症状に罹患している群及び疾患がない群である。所定の値は、例えば、試験集団が、低リスク群、中リスク群、及び高リスク群等の群に均等に（又は不均等に）分割される場合に定義され得る。
参照レベルはまた、疾患に罹患しているか、又は免疫抑制状態をもたらす治療を受けている患者の集団におけるＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを比較することで決定することもできる。これは、例えば、ヒストグラムによる分析によって達成することができ、ここで、被験体のコホート全体がグラフの形態で提示され、第１の軸は、当該ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを表し、第２の軸は、所与のレベルでＴＴＶ核酸（又はタンパク質）を発現する患者群における患者の数を表す。２つ以上の別個の被験体群は、同一又は類似のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）レベルを有するコホートの亜集団を同定することによって決定することができる。次いで、これらの別個の群を最もよく区別するレベルに基づいて、参照レベルを決定することができる。参照レベルはまた、存在する２つ以上のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルを表すこともできる。２つ以上のマーカーは、例えば、各マーカーのレベルの値の比によって表され得る。
【0032】
同様に、健康状態が良好であると思われる集団は、当該ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の高濃度に関連する状態であることが知られている集団の範囲とは異なる「正常な」範囲であろう。したがって、選択される所定の値は、個人が属するカテゴリーを考慮に入れることができる。適当な範囲及びカテゴリーは、当業者による常套実験によって簡単に選択され得る。「高い」及び「増加した」は、選択された対照よりも高いことを意味する。一般に、対照は、健康状態が良好であり、適当な年齢範囲内にあるように見える正常な個体に基づく。
好ましい実施形態では、参照濃度は、一般集団におけるＴＴＶ核酸（若しくはタンパク質）又はＴＴＶ核酸（若しくはタンパク質）の組合せの濃度に対応する。
本明細書に記載される方法における対照は、所定の値とは別に、試験される試料と並行して測定される生体試料であり得ることも理解されるであろう。この実施形態では、参照レベルは、健康状態が良好である被験体からの試料中のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルである。
好ましくは、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、健康状態が良好である被験体又は健康状態が良好である被験体の集団におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、免疫炎症性発作に罹患した患者又は免疫炎症性発作に罹患した患者群でのこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、敗血症に罹患した患者又は敗血症に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、熱傷に罹患した患者又は熱傷に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、外傷に罹患した患者又は外傷に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、手術を受けた患者又は手術を受けた患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、特定の時点、例えば、当該手術の前又は直後に手術を受けた同じ個体通中のこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
当該患者からの生体試料中のＴＴＶウイルス量を所定の参照値と比較することで、当該患者の合併症のリスクを確立することができる。
好ましい実施形態では、参照濃度は、一般集団におけるＴＴＶ核酸（若しくはタンパク質）又はＴＴＶ核酸（若しくはタンパク質）の組合せの濃度に対応する。
本明細書に記載される方法における対照は、所定の値とは別に、試験される試料と並行して測定される生体試料であり得ることも理解されるであろう。この実施形態では、参照レベルは、健康状態が良好である被験体からの試料中のＴＴＶ核酸（又はタンパク質）のレベルである。
好ましくは、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、健康状態が良好である被験体又は健康状態が良好である被験体の集団におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、免疫炎症性発作に罹患した患者又は免疫炎症性発作に罹患した患者群でのこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、敗血症に罹患した患者又は敗血症に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、熱傷に罹患した患者又は熱傷に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、外傷に罹患した患者又は外傷に罹患している患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、手術を受けた患者又は手術を受けた患者群におけるこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
他の好ましい実施形態では、ＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の参照濃度は、特定の時点、例えば、当該手術の前又は直後に手術を受けた同じ個体通中のこのＴＴＶ核酸（又はタンパク質）の濃度である。
当該患者からの生体試料中のＴＴＶウイルス量を所定の参照値と比較することで、当該患者の合併症のリスクを確立することができる。
【0033】
特定の実施形態では、所定の参照値は、患者からの生体試料、例えば血液又は血漿及び／若しくは血清等のその誘導体中の、生体試料１ｍｌ当たり７０００コピー超、例えば生体試料１ｍｌ当たり１００００コピー超、２００００コピー超、又は４００００コピー超のウイルス量に対応する。この特定の実施形態では、所定の参照値よりも大きい患者のＴＴＶウイルス量は、患者の状態の重症度と相関し、合併症、特に医療関連感染の発生のリスクの増加とも相関し得る。
この特定の実施形態の変形によれば、所定の参照値は、生体試料１ｍｌ当たり１００００コピーのＴＴＶウイルス量に対応する。したがって、この変形形態によれば、患者からの生体試料において決定されたＴＴＶウイルス量が当該所定の参照値よりも大きい場合に、合併症のリスクの増大の存在が確立される。逆に、患者からの生体試料において決定されたＴＴＶウイルス量が当該所定の参照値未満である場合、合併症のリスクの増大がないことが確立される。
健康状態が良好である個体又は個体群のＴＴＶ量と比較して、患者のＴＴＶ量がより大きい場合は、当該患者の合併症のリスクが増大していることの指標であり得る。
この特定の実施形態の変形によれば、所定の参照値は、生体試料１ｍｌ当たり１００００コピーのＴＴＶウイルス量に対応する。したがって、この変形形態によれば、患者からの生体試料において決定されたＴＴＶウイルス量が当該所定の参照値よりも大きい場合に、合併症のリスクの増大の存在が確立される。逆に、患者からの生体試料において決定されたＴＴＶウイルス量が当該所定の参照値未満である場合、合併症のリスクの増大がないことが確立される。
健康状態が良好である個体又は個体群のＴＴＶ量と比較して、患者のＴＴＶ量がより大きい場合は、当該患者の合併症のリスクが増大していることの指標であり得る。
【0034】
本明細書で用いられる用語「より大きい」は、ある実施形態では、より大きい量、例えば、元の量若しくは基準量よりわずかに大きい量、又は例えば、元の量若しくは基準量を大幅に超える量、特に、範囲内の全ての量を意味する。変形として、「増加する」は、増加した量又は活性が比較される量又は活性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％多い量又は活性であってよい。
【0035】
本明細書で用いられる用語「未満」という用語は、ある実施形態では、より少ない量、例えば、元の量若しくは基準量よりもわずかに少ない量、又は例えば、元の量若しくは基準量よりも非常に少ない量、特に、範囲内の全ての量を意味する。変形として、「減少させる」は、減少した量又は活性が比較される量又は活性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％少ない量又は活性を指し得る。
有利には、参照ＴＴＶウイルス量として、第２の時点での同じ患者における少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量を用いてよい。
有利には、参照ＴＴＶウイルス量として、第２の時点での同じ患者における少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量を用いてよい。
【0036】
好ましい実施形態では、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、以下の：
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算して、ΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）比較の結果から合併症のリスクに関する結論を確立すること、
を含む。
驚くべきことに、本発明者らは、医療施設に滞在中の患者におけるＴＴＶウイルス量の変動、すなわち、以下に定義される値に従ったＴＴＶウイルス量の増加又は減少が、当該患者の合併症のリスクの増加、特に医療関連感染を発症するリスクの増加と相関することを決定した。
したがって、この方法は、医療施設に入院した患者の合併症のリスクを経時的に評価及び監視するのに特に有用である。好ましい実施形態では、工程ａ）における第１の試料は、入院日、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目及び７日目から選択される時間Ｔ１に採取され、第１日は、入院の翌日及び／又は当該患者が免疫炎症性発作を患った日の翌日に対応することが理解される。
特定の実施形態では、当該患者が、手術、より具体的には大手術のために医療施設に入院した患者である場合、工程ａ）における第１の試料は、手術時に、すなわち、外科的処置の直前、直後及び／又は最中に採取することができる。
好ましい実施形態では、工程ｂ）の第２の試料は、時間Ｔ２で採取され、この第２の時間は、工程ａ）の第１の時間Ｔ１よりも後である。好ましくは、第２の試料は、８日目と３１日目との間、より好ましくは１４日目と３１日目との間に採取される。したがって、時間Ｔ２は、好ましくは、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、２５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、及び３１日目から選択される。
他の実施形態では、第２の試料は、当該患者の医療施設への入院の３１日後、例えば、少なくとも４０日後、６０日後、９０日後、１００日後、１２０日後、１５０日後、１８０日後、２１０日後、２４０日後、２７０日後、３００日後、３３０日後、３６０日後に採取される。
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算して、ΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）比較の結果から合併症のリスクに関する結論を確立すること、
を含む。
驚くべきことに、本発明者らは、医療施設に滞在中の患者におけるＴＴＶウイルス量の変動、すなわち、以下に定義される値に従ったＴＴＶウイルス量の増加又は減少が、当該患者の合併症のリスクの増加、特に医療関連感染を発症するリスクの増加と相関することを決定した。
したがって、この方法は、医療施設に入院した患者の合併症のリスクを経時的に評価及び監視するのに特に有用である。好ましい実施形態では、工程ａ）における第１の試料は、入院日、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目及び７日目から選択される時間Ｔ１に採取され、第１日は、入院の翌日及び／又は当該患者が免疫炎症性発作を患った日の翌日に対応することが理解される。
特定の実施形態では、当該患者が、手術、より具体的には大手術のために医療施設に入院した患者である場合、工程ａ）における第１の試料は、手術時に、すなわち、外科的処置の直前、直後及び／又は最中に採取することができる。
好ましい実施形態では、工程ｂ）の第２の試料は、時間Ｔ２で採取され、この第２の時間は、工程ａ）の第１の時間Ｔ１よりも後である。好ましくは、第２の試料は、８日目と３１日目との間、より好ましくは１４日目と３１日目との間に採取される。したがって、時間Ｔ２は、好ましくは、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、２５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、及び３１日目から選択される。
他の実施形態では、第２の試料は、当該患者の医療施設への入院の３１日後、例えば、少なくとも４０日後、６０日後、９０日後、１００日後、１２０日後、１５０日後、１８０日後、２１０日後、２４０日後、２７０日後、３００日後、３３０日後、３６０日後に採取される。
【0037】
ある実施形態では、ＴＴＶウイルス量はまた、時間Ｔ１とＴ２との間の異なる時間に採取された複数の試料について測定される。特に、ＴＴＶウイルス量はまた、少なくとも１つの試料、好ましくは少なくとも２つの試料、好ましくは少なくとも３つの試料、好ましくは少なくとも４つの試料、好ましくは少なくとも５つの試料、例えば６、７又は８つの試料について、時間Ｔ１とＴ２との間の異なる時間で測定される。
ある実施形態では、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、入院日及び／又は免疫炎症性発作の日と７日目との間に採取された当該患者からの複数の生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。好ましくは、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、入院日及び／又は免疫炎症性発作の日と７日目との間に採取された当該患者からの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。非限定的な例として、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、１日目又は２日目、３日目又は４日目、及び５日目、６日目又は７日目に採取された当該患者からの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当し得る。
ある実施形態では、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、入院後及び／又は免疫炎症性攻撃後８日目と３１日目との間に採取された当該患者からの複数の生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。好ましくは、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、入院後及び／又は免疫炎症性攻撃後８日目と３１日目との間に採取された当該患者からの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。非限定的な例として、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、１４日目、又は１３日目～１８日目の間のいかなる日、及び２８日目、又は２６日目～３６日目の間のいかなる日に採取された当該患者からの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に対応し得る。
ある実施形態では、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、入院日及び／又は免疫炎症性発作の日と７日目との間に採取された当該患者からの複数の生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。好ましくは、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、入院日及び／又は免疫炎症性発作の日と７日目との間に採取された当該患者からの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。非限定的な例として、時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量は、１日目又は２日目、３日目又は４日目、及び５日目、６日目又は７日目に採取された当該患者からの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当し得る。
ある実施形態では、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、入院後及び／又は免疫炎症性攻撃後８日目と３１日目との間に採取された当該患者からの複数の生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。好ましくは、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、入院後及び／又は免疫炎症性攻撃後８日目と３１日目との間に採取された当該患者からの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に相当する。非限定的な例として、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量は、１４日目、又は１３日目～１８日目の間のいかなる日、及び２８日目、又は２６日目～３６日目の間のいかなる日に採取された当該患者からの生体試料において測定されたウイルス量の平均又は中央値に対応し得る。
【0038】
有利には、工程ｃ）においてΔＴＴＶ値は、時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量と時間Ｔ１におけるウイルス量との間の変動：
ΔＴＴＶ＝（時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量）－（時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量）
に対応する。
時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量及び時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量に基づいて、当業者は、これらの２つの測定によって定義される線の勾配を計算することができる。したがって、ΔＴＴＶは、時間Ｔ１とＴ２との間の勾配の値に対応する。
本明細書によれば、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくは、以下の場合、すなわち、ΔＴＴＶ値が、－１．２５～＋１．２５の範囲内、好ましくは－１．２０～＋１．２０の範囲内、好ましくは－１．１５～＋１．１５の範囲内、好ましくは－１．１０～＋１．１０の範囲内、で安定であると考えられる。例えば、ウイルス量の安定性は、Ｔ１及びＴ２における複数の試料についてのウイルス量の中央値の間で測定される、－１．２５～＋１．２５の範囲内の勾配に対応し得る。
さらに、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくはΔＴＴＶ値が、＋１．２５より大きく、好ましくは＋１．３５より大きく、好ましくは＋１．４０より大きく、好ましくは＋１．４５より大きく、より好ましくは＋１．５０より大きい。
さらに、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくは、以下の場合：DＴＴＶ値が、－１．２５未満、好ましくは－１．３５未満、好ましくは－１．４０未満、好ましくは－１．４５未満、より好ましくは－１．５０未満である場合に減少したと考えられる。
したがって、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量の変動（DＴＴＶ）が－１．２５～＋１．２５の範囲内にある場合、工程ｄ）において、患者が医療関連感染の発生のリスクが増大していないと結論付けることができる。
その一方で、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量の変動（DＴＴＶ）が－１．２５～＋１．２５の範囲内にない場合、工程ｄ）において、患者が医療関連感染の発生のリスクが高いと結論付けることができる。
ΔＴＴＶ＝（時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量）－（時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量）
に対応する。
時間Ｔ１におけるＴＴＶウイルス量及び時間Ｔ２におけるＴＴＶウイルス量に基づいて、当業者は、これらの２つの測定によって定義される線の勾配を計算することができる。したがって、ΔＴＴＶは、時間Ｔ１とＴ２との間の勾配の値に対応する。
本明細書によれば、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくは、以下の場合、すなわち、ΔＴＴＶ値が、－１．２５～＋１．２５の範囲内、好ましくは－１．２０～＋１．２０の範囲内、好ましくは－１．１５～＋１．１５の範囲内、好ましくは－１．１０～＋１．１０の範囲内、で安定であると考えられる。例えば、ウイルス量の安定性は、Ｔ１及びＴ２における複数の試料についてのウイルス量の中央値の間で測定される、－１．２５～＋１．２５の範囲内の勾配に対応し得る。
さらに、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくはΔＴＴＶ値が、＋１．２５より大きく、好ましくは＋１．３５より大きく、好ましくは＋１．４０より大きく、好ましくは＋１．４５より大きく、より好ましくは＋１．５０より大きい。
さらに、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量は、好ましくは、以下の場合：DＴＴＶ値が、－１．２５未満、好ましくは－１．３５未満、好ましくは－１．４０未満、好ましくは－１．４５未満、より好ましくは－１．５０未満である場合に減少したと考えられる。
したがって、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量の変動（DＴＴＶ）が－１．２５～＋１．２５の範囲内にある場合、工程ｄ）において、患者が医療関連感染の発生のリスクが増大していないと結論付けることができる。
その一方で、時間Ｔ１とＴ２との間のＴＴＶウイルス量の変動（DＴＴＶ）が－１．２５～＋１．２５の範囲内にない場合、工程ｄ）において、患者が医療関連感染の発生のリスクが高いと結論付けることができる。
【0039】
したがって、好ましい実施形態では、本明細書による方法は、以下の：
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）DＴＴＶが－１．２５～＋１．２５、好ましくは－１．２０～＋１．２０、より好ましくは－１．１０～＋１．１０の範囲内にある場合、合併症のリスクが増大していないと結論付けること；
を実行することを含む。
ａ）時間Ｔ１に採取された第１の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第１のウイルス量を測定すること、
ｂ）前記時間Ｔ２に採取された第２の試料に由来する前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶの第２のウイルス量を測定すること、
ｃ）Ｔ２でのウイルス量とＴ１でのウイルス量との間の変動を計算してΔＴＴＶ値を得ること、かつ、
ｄ）DＴＴＶが－１．２５～＋１．２５、好ましくは－１．２０～＋１．２０、より好ましくは－１．１０～＋１．１０の範囲内にある場合、合併症のリスクが増大していないと結論付けること；
を実行することを含む。
【0040】
特に有利な実施形態では、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、当該患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、さらに、当該患者の当該生体試料中の少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出することを含む、方法に関する。
【0041】
実際、本発明者らが、特に集中治療室に入院した後の最初の１週間の間に、患者の生体試料中のＴＴＶ及び少なくとも１つのＨＰＶの高ウイルス量の同時検出が、当該患者の合併症のリスクの増加、特に医療関連感染を発症するリスクの増加を示すことを決定したことは、本発明者らの功績である。特に驚くべきことは、ＴＴＶ／ＨＰＶの早期ウイルス血症（入院後の最初の１週間という早期）と最初の１ヶ月間にＨＡＩを発症するリスクの増加の存在との間に関連があることである。
【0042】
本明細書で用いられる用語「少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出する」又は「少なくとも１つのヘルペスウイルスを検出する」には、定性的及び／又は定量的検出が含まれる。様々な実施形態では、ＨＰＶは、ＨＰＶ核酸、より好ましくはＨＰＶ ＤＮＡのレベルを検出することで検出される。
本明細書によれば、少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つのタンパク質、より好ましくは少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つの抗原が、当該患者由来の少なくとも１つの生体試料中で検出される場合、ヘルペスウイルスが存在するか又は検出されると決定される。
好ましくは、少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つの核酸、より好ましくは少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つのＤＮＡが、当該患者由来の少なくとも１つの生体試料中で検出される場合、ヘルペスウイルスが存在すると決定されるか、又は検出される。この場合、陽性ウイルス血症又は陽性ＤＮＡｅｍｉａという。
本明細書によれば、少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つのタンパク質、より好ましくは少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つの抗原が、当該患者由来の少なくとも１つの生体試料中で検出される場合、ヘルペスウイルスが存在するか又は検出されると決定される。
好ましくは、少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つの核酸、より好ましくは少なくとも１つのＨＰＶ株由来の少なくとも１つのＤＮＡが、当該患者由来の少なくとも１つの生体試料中で検出される場合、ヘルペスウイルスが存在すると決定されるか、又は検出される。この場合、陽性ウイルス血症又は陽性ＤＮＡｅｍｉａという。
【0043】
本明細書では「ウイルス血症」は、所与のウイルスについての生体試料中のウイルス粒子の含有量、又はウイルス量を意味する。ウイルス血症は、検出されたウイルス粒子の数が、所与のウイルスについての当該生体試料中の所定の閾値（ＬＯＤ）よりも大きい場合に陽性である。逆に、当該ウイルス粒子が当該生体試料中で検出されない場合、ウイルス血症は陰性である。
【0044】
「ＤＮＡｅｍｉａ」とは、生体試料、特に血漿、全血及び／又は末梢血から単離された白血球の試料及び／又はバフィーコート試料（白血球及び血小板のほとんどを含む、遠心分離後に凝固していない血液試料の画分）中のウイルスＤＮＡの検出を意味する。ＤＮＡ血症を検出するためにある技術、特にＰＣＲ、ハイブリッド捕捉及び分枝鎖ＤＮＡの分析に基づく技術が利用できる。試験されるウイルス由来のＤＮＡが当該生体試料中で検出された場合、ＤＮＡｅｍｉａは陽性である。逆に、当該ウイルスＤＮＡが当該生体試料中で検出されない場合、ＤＮＡ血症は陰性である。「ウイルス血症事象」は、所与のウイルスが試験中に少なくとも１回検出されたこと、特に、所与のウイルスについての陽性ＤＮＡｅｍｉａが試験中に患者からの少なくとも１つの生体試料中で検出されたことを意味する。
この好ましい実施形態では、免疫抑制治療を受けていない患者は、当該患者からの生体試料、例えば血液又は血漿及び／若しくは血清等のその派生物中のＴＴＶウイルス量が生体試料１ｍｌ当たり７０００コピー超、好ましくは生体試料１ｍｌ当たり１００００コピー超であり、ヘルペスウイルスの存在も検出される場合、合併症のリスクが増大している。
この好ましい実施形態では、免疫抑制治療を受けていない患者は、当該患者からの生体試料、例えば血液又は血漿及び／若しくは血清等のその派生物中のＴＴＶウイルス量が生体試料１ｍｌ当たり７０００コピー超、好ましくは生体試料１ｍｌ当たり１００００コピー超であり、ヘルペスウイルスの存在も検出される場合、合併症のリスクが増大している。
【0045】
この好ましい実施形態では、本方法は、以下の：
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を１００００コピー／ｍｌの所定の参照値と比較すること、
ｃ）好ましくはＤＮＡｅｍｉａを測定することによって、少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出すること、かつ、
ｄ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きい場合、及び少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在する場合、合併症のリスクの増大の存在を確立すること、
を実行することを含んでよい。
ａ）前記患者の生体試料中の少なくとも１つのＴＴＶのウイルス量を測定すること、
ｂ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量を１００００コピー／ｍｌの所定の参照値と比較すること、
ｃ）好ましくはＤＮＡｅｍｉａを測定することによって、少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出すること、かつ、
ｄ）前記生体試料について決定された前記ウイルス量が前記所定の参照値よりも大きい場合、及び少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在する場合、合併症のリスクの増大の存在を確立すること、
を実行することを含んでよい。
【0046】
他の好ましい実施形態では、本明細書は、医療施設に入院し、免疫抑制治療を受けていない患者の合併症のリスクをインビトロ又はエクスビボで評価するための方法であって、前記患者の生体試料中の少なくとも１つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のウイルス量を測定すること、かつ、さらに、前記患者の生体試料中の少なくとも１つのヘルペスウイルスの存在を検出すること、を含む方法に関する。
本発明の場合、「少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）のウイルス量」又は「少なくとも１つのＨＰＶの量」は、少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス量、すなわち、生体試料中に存在する少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス粒子の数に対応する。
患者における少なくとも１つのＨＰＶの量は、当該患者における少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス量を意味する。ＨＰＶ量は、この生体試料中の少なくとも１つのＨＰＶ株の成分、例えば核酸又はタンパク質の量を測定することによって決定することができる。好ましくは、ＨＰＶ量は、生体試料中に存在する所与のＨＰＶ株の核酸配列の量に対応する。
したがって、本発明によれば、当該生体試料中の測定される異なる特異的ＨＰＶ株間を区別することができる。好ましくは、ＨＰＶ量の決定は、活性及び／又は不活性ウイルスコピーの量の決定を含む。それは、循環する、組み込まれた、又は潜伏しているウイルスコピーの量を決定することにある。
生体試料中のＨＰＶ核酸のウイルス量を検出及び／又は測定するための方法は、ＴＴＶについて以前に記載されたものと同じであり、とりわけ、増幅、好ましくはＰＣＲによる増幅、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによる増幅、配列決定、標識プローブとのハイブリダイゼーション、及び当業者に公知の他のすべての方法を含む。
本発明の場合、「少なくとも１つのヘルペスウイルス（ＨＰＶ）のウイルス量」又は「少なくとも１つのＨＰＶの量」は、少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス量、すなわち、生体試料中に存在する少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス粒子の数に対応する。
患者における少なくとも１つのＨＰＶの量は、当該患者における少なくとも１つのＨＰＶ株のウイルス量を意味する。ＨＰＶ量は、この生体試料中の少なくとも１つのＨＰＶ株の成分、例えば核酸又はタンパク質の量を測定することによって決定することができる。好ましくは、ＨＰＶ量は、生体試料中に存在する所与のＨＰＶ株の核酸配列の量に対応する。
したがって、本発明によれば、当該生体試料中の測定される異なる特異的ＨＰＶ株間を区別することができる。好ましくは、ＨＰＶ量の決定は、活性及び／又は不活性ウイルスコピーの量の決定を含む。それは、循環する、組み込まれた、又は潜伏しているウイルスコピーの量を決定することにある。
生体試料中のＨＰＶ核酸のウイルス量を検出及び／又は測定するための方法は、ＴＴＶについて以前に記載されたものと同じであり、とりわけ、増幅、好ましくはＰＣＲによる増幅、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによる増幅、配列決定、標識プローブとのハイブリダイゼーション、及び当業者に公知の他のすべての方法を含む。
【0047】
ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ又はＨＰＶ）は、当業者に周知である。それらは、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、及びヒトを含む哺乳動物を含む様々な動物種に影響を及ぼすＤＮＡウイルスのファミリーである。ＨＰＶファミリーの全てのメンバーは、共通の構造を共有する：カプシドという正二十面体のタンパク質ケージ内に包まれた１００～２００個の遺伝子をコードする比較的大きな、一分節の、二本鎖の、直鎖状のＤＮＡであり、これは、それ自体、ウイルスタンパク質及びウイルスｍＲＮＡの両方を含む外被というタンパク質層、並びにエンベロープという脂質二重層膜に包まれている。全てのＨＰＶは核複製性であり、ウイルスＤＮＡは感染細胞の核内でｍＲＮＡに転写され、そこではウイルスＤＮＡは無期限に潜伏形態のままであり得る。
９つのタイプのＨＰＶが、主にヒトに感染することが知られている。少なくとも以下の５つ：単純ヘルペス１及び２（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２、ＨＨＶ－１及びＨＨＶ－２としても知られる）（これらはともに、口唇及び陰部ヘルペスを惹起しうる）；水痘及び帯状疱疹の原因である水痘帯状疱疹（又はＨＨＶ－３）；単核球症及びある癌を含むある疾患に関与するエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ又はＨＨＶ－４）；並びにヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ又はＣＭＶ又はＨＨＶ－５）はヒトにおいて極めて広範に存在する。
成人の９０％以上がこれらのウイルスの少なくとも１つに感染しており、感染したほとんどすべてのヒトには潜伏性のウイルスが残存する。あまり一般的でないヒトヘルペスウイルスは、ヒトヘルペスウイルス６Ａ及び６Ｂ（ＨＨＶ－６Ａ及びＨＨＶ－６Ｂ、ともにＨＨＶ－６という）、ヒトヘルペスウイルス－７（ＨＨＶ－７）、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ－８としても知られる）である。
本明細書の「ヘルペスウイルス」又は「ＨＰＶ」又は「ＨＨＶ」（ヒトヘルペスウイルス）は、ヘルペスウイルス科のウイルスを意味する。本明細書の「ＨＰＶゲノム」は、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＨＨＶ－３、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ－６、ＨＨＶ－７及びＫＳＨＶ型のもの、より具体的にはＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１型のものを含む、すべてのヘルペスウイルス科のゲノムをいう。
好ましい実施形態では、当該少なくとも１つのヘルペスウイルスは、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１からなる群から選択される。好ましくは、ヘルペスウイルスはＥＢＶである。例として、ここでは、ＣＭＶ ＡＤ１６９、ＥＢＶ Ｂ－９５、ＨＳＶ１ ９５及びＨＨＶ６ Ｚ２９型のヘルペスウイルス株のゲノムを参照する。非限定的な例として、ＣＭＶ ＡＤ１６９のゲノムは、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１７４０３．１で参照されるものであり得る。同様に、ＥＢＶ Ｂ－９５のゲノムは、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｖ０１５５５．２で参照されるものであり得る。の例示的ゲノム。ＨＨＶ６ Ｚ２９は、配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８３４１３．２で参照されるものであり得る。
９つのタイプのＨＰＶが、主にヒトに感染することが知られている。少なくとも以下の５つ：単純ヘルペス１及び２（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２、ＨＨＶ－１及びＨＨＶ－２としても知られる）（これらはともに、口唇及び陰部ヘルペスを惹起しうる）；水痘及び帯状疱疹の原因である水痘帯状疱疹（又はＨＨＶ－３）；単核球症及びある癌を含むある疾患に関与するエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ又はＨＨＶ－４）；並びにヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ又はＣＭＶ又はＨＨＶ－５）はヒトにおいて極めて広範に存在する。
成人の９０％以上がこれらのウイルスの少なくとも１つに感染しており、感染したほとんどすべてのヒトには潜伏性のウイルスが残存する。あまり一般的でないヒトヘルペスウイルスは、ヒトヘルペスウイルス６Ａ及び６Ｂ（ＨＨＶ－６Ａ及びＨＨＶ－６Ｂ、ともにＨＨＶ－６という）、ヒトヘルペスウイルス－７（ＨＨＶ－７）、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ－８としても知られる）である。
本明細書の「ヘルペスウイルス」又は「ＨＰＶ」又は「ＨＨＶ」（ヒトヘルペスウイルス）は、ヘルペスウイルス科のウイルスを意味する。本明細書の「ＨＰＶゲノム」は、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＨＨＶ－３、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ－６、ＨＨＶ－７及びＫＳＨＶ型のもの、より具体的にはＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１型のものを含む、すべてのヘルペスウイルス科のゲノムをいう。
好ましい実施形態では、当該少なくとも１つのヘルペスウイルスは、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６及びＨＳＶ－１からなる群から選択される。好ましくは、ヘルペスウイルスはＥＢＶである。例として、ここでは、ＣＭＶ ＡＤ１６９、ＥＢＶ Ｂ－９５、ＨＳＶ１ ９５及びＨＨＶ６ Ｚ２９型のヘルペスウイルス株のゲノムを参照する。非限定的な例として、ＣＭＶ ＡＤ１６９のゲノムは、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１７４０３．１で参照されるものであり得る。同様に、ＥＢＶ Ｂ－９５のゲノムは、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｖ０１５５５．２で参照されるものであり得る。の例示的ゲノム。ＨＨＶ６ Ｚ２９は、配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８３４１３．２で参照されるものであり得る。
【0048】
優先的には、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて、少なくとも１つのＨＰＶの存在が決定され、及び／又はＨＰＶウイルス量が測定される。ＨＰＶを検出及び定量するための多数の方法が、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ ＯＮＥ ９（６）：ｅ９８８１９、２０１４）。特に、以下の文献に記載されている方法を参照する。より具体的には、非特許文献４の表Ｓ１に記載されており、ここでは図６及び図７に再現されている。この方法は、その単純性及び頑健性のために特に有利であり；それはまた、いかなるタイプのＰＣＲプラットフォームを用いて実行され得る。これは、これらのヘルペスウイルス各々に特異的な遺伝子、すなわちＣＭＶの構造タンパク質をコードするｐｐＵＬ８３、ＥＢＶのチミジンキナーゼをコードする遺伝子ＢＸＬＦ１、ＨＳＶ－１の糖タンパク質をコードする遺伝子ＵＳ７、及びＨＨＶ６のカプシドタンパク質をコードする遺伝子Ｕ５７の増幅に基づく。この方法を実施するために、Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）診断キット（ＣＭＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）参照番号６９－００３Ｂ、ＥＢＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）参照番号６９－００２Ｂ、ＨＳＶ１ ＨＳＶ２ ＶＺＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）参照番号６９－００４Ｂ及びＨＶＶ６ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）参照番号６９－１００Ｂ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いることが特に有利である。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は、測定されたＨＰＶ核酸の量を標準化するさらなる工程を含む。この目的のために、当業者は、ＴＴＶレベルの標準化に関して上述した方法及び実施形態を参照することができる。これらの方法は、ＨＰＶ核酸の量の標準化に容易に適合させることができる。
ＨＰＶ核酸の量を測定することで少なくとも１つのＨＰＶの量が決定された場合（後者は場合によっては標準化されている）、それを参照ＨＰＶ量と比較することが有利であり得る。この目的のために、当業者は、ＴＴＶ参照レベルとの比較に関して、上記の方法及び実施形態を参照することができる。これらの方法は、参照ＨＰＶレベルとの比較に容易に適合させることができる。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は、測定されたＨＰＶ核酸の量を標準化するさらなる工程を含む。この目的のために、当業者は、ＴＴＶレベルの標準化に関して上述した方法及び実施形態を参照することができる。これらの方法は、ＨＰＶ核酸の量の標準化に容易に適合させることができる。
ＨＰＶ核酸の量を測定することで少なくとも１つのＨＰＶの量が決定された場合（後者は場合によっては標準化されている）、それを参照ＨＰＶ量と比較することが有利であり得る。この目的のために、当業者は、ＴＴＶ参照レベルとの比較に関して、上記の方法及び実施形態を参照することができる。これらの方法は、参照ＨＰＶレベルとの比較に容易に適合させることができる。
【0049】
合併症のリスクを有する疑いのある患者を治療する方法
したがって、合併症、特に感染症のリスクに対する患者の感受性は、本明細書に記載の方法を用いて決定することができ、これにより、患者の必要性に特異的な治療を開発し、適合させることができる。
したがって、有利には、上記方法は、そのすべての実施形態では、特に合併症のリスク、特に医療関連感染の発生のリスクを低減するために、医療を管理することを含んでよい。
医療関連感染の発生のリスクが高いと同定された患者は、当該医療関連感染の発生のリスクを低減することを目的として、例えば、敗血症、敗血症性ショックを発症するリスク、又は死亡のリスクを低減するために、適当な管理医療を受けていてよい。
したがって、他の態様では、本発明はまた、合併症のリスクを有する疑いのある患者を治療するための方法であって
―上記の実施形態のいずれか１つを実施することによって合併症のリスクがある患者を特定すること、かつ、
―悪化のリスクを低減するために、先行することにおいて識別された当該患者のヘルスケアの管理を適合させること、を含む。
ヘルスケアを管理する例として、患者に適合させた免疫調節治療、又は予防的抗生物質治療を挙げることができ、両治療の併用、及び／又はバイオマーカーの発現の測定後の日に、ヘルスケア関連感染の発生のリスクを低減するために、例えば敗血症、敗血症性ショックを発症するリスク又はさらには死亡のリスクを低減するために、高依存性ユニット又は蘇生部門を指向してよい。好ましくは、免疫調節処置は、個体が免疫抑制状態であると決定された場合、免疫刺激治療であり、又は個体が炎症状態であると決定された場合は、抗炎症治療である。
選択され得る免疫刺激性治療中、例として、インターロイキン群、特にＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３、増殖因子、特にＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、特にＩＦＮ－γが言及され得る。g抗体、例えば、抗ＰＤ １抗体、抗ＰＤＬ １抗体、抗ＬＡＧ ３抗体、抗ＴＩＭ ３抗体、抗ＩＬ－１０抗体、又は抗ＣＴ ＬＡ ４抗体）、トランスフェリン及びアポトーシス阻害分子、ＦＬＴ３Ｌ、チモシンα１、並びにアドレナリン作動性アンタゴニストが挙げられる。
抗炎症治療中、グルココルチコイド群、細胞増殖抑制剤、イムノフィリン及びサイトカインに作用する分子、ＩＬ－１受容体を遮断する分子、並びに抗ＴＮＦ治療を特に挙げることができる。肺炎を予防するための適当な予防的抗生物質治療の例は、特にＡｎｎａｌｅｓ Ｆｒａｎｃａｉｓｅｓ ｄ’Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｅ ｅｔ ｄｅ Ｒｅａｎｉｍａｔｉｏｎ（３０；２０１１；１６８－１９０）に記載される。換言すれば、患者に必要ない綿密なモニタリングがある部門にいるよりもむしろ、外来患者部門、例えば感染症部門に、医療関連感染の発生のリスクなしに患者を迅速に送ることができる。
本発明は、以下の実施例によってより正確に記載される。
したがって、合併症、特に感染症のリスクに対する患者の感受性は、本明細書に記載の方法を用いて決定することができ、これにより、患者の必要性に特異的な治療を開発し、適合させることができる。
したがって、有利には、上記方法は、そのすべての実施形態では、特に合併症のリスク、特に医療関連感染の発生のリスクを低減するために、医療を管理することを含んでよい。
医療関連感染の発生のリスクが高いと同定された患者は、当該医療関連感染の発生のリスクを低減することを目的として、例えば、敗血症、敗血症性ショックを発症するリスク、又は死亡のリスクを低減するために、適当な管理医療を受けていてよい。
したがって、他の態様では、本発明はまた、合併症のリスクを有する疑いのある患者を治療するための方法であって
―上記の実施形態のいずれか１つを実施することによって合併症のリスクがある患者を特定すること、かつ、
―悪化のリスクを低減するために、先行することにおいて識別された当該患者のヘルスケアの管理を適合させること、を含む。
ヘルスケアを管理する例として、患者に適合させた免疫調節治療、又は予防的抗生物質治療を挙げることができ、両治療の併用、及び／又はバイオマーカーの発現の測定後の日に、ヘルスケア関連感染の発生のリスクを低減するために、例えば敗血症、敗血症性ショックを発症するリスク又はさらには死亡のリスクを低減するために、高依存性ユニット又は蘇生部門を指向してよい。好ましくは、免疫調節処置は、個体が免疫抑制状態であると決定された場合、免疫刺激治療であり、又は個体が炎症状態であると決定された場合は、抗炎症治療である。
選択され得る免疫刺激性治療中、例として、インターロイキン群、特にＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３、増殖因子、特にＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、特にＩＦＮ－γが言及され得る。g抗体、例えば、抗ＰＤ １抗体、抗ＰＤＬ １抗体、抗ＬＡＧ ３抗体、抗ＴＩＭ ３抗体、抗ＩＬ－１０抗体、又は抗ＣＴ ＬＡ ４抗体）、トランスフェリン及びアポトーシス阻害分子、ＦＬＴ３Ｌ、チモシンα１、並びにアドレナリン作動性アンタゴニストが挙げられる。
抗炎症治療中、グルココルチコイド群、細胞増殖抑制剤、イムノフィリン及びサイトカインに作用する分子、ＩＬ－１受容体を遮断する分子、並びに抗ＴＮＦ治療を特に挙げることができる。肺炎を予防するための適当な予防的抗生物質治療の例は、特にＡｎｎａｌｅｓ Ｆｒａｎｃａｉｓｅｓ ｄ’Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｅ ｅｔ ｄｅ Ｒｅａｎｉｍａｔｉｏｎ（３０；２０１１；１６８－１９０）に記載される。換言すれば、患者に必要ない綿密なモニタリングがある部門にいるよりもむしろ、外来患者部門、例えば感染症部門に、医療関連感染の発生のリスクなしに患者を迅速に送ることができる。
本発明は、以下の実施例によってより正確に記載される。
【実施例】
【0050】
集中治療室に入院した患者におけるウイルス再活性化現象の根底にある生理病理をよりよく理解するために、ＲＥＡＬＩＳＭ臨床試験（ＮＣＴ０１９３１９５６）に関与する患者のコホートにおいて試験を行った。当該患者各々の、ＴＴＶアネロウイルス及びヘルペスウイルスＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６、ＨＳＶ－１の血中ＤＮＡ血症を、集中治療に入ってから１ヶ月間にわたって測定した。予想された結果の目的は、これらの患者におけるウイルス再活性化現象に関連する一般的な合併症を同定すること、及び１つ以上のウイルスが特定の合併症の発生に関連し得るかどうかを同定できるようにすることであった。
【0051】
材料及び方法
試験集団
観察試験は、セプシス、重度のトラウマ、重度の火傷を示すか、又はエドゥアール・エリオ病院（Ｈｏｓｐｉｔｓ Ｃｉａｌｓ ｄｅ Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）の麻酔及び集中医学部門において計画された手術を受けた重篤な病気の患者の予想されるコホートに対して実施された。包含期間は２８ヶ月（２０１５年１２月～２０１８年３月）であった。試験プロトコルは、施設倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ Ｓｕｄ－Ｅｓｔ ＩＩ）によって番号２０１５－４２－２の下で承認された。この臨床試験はｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２６３８７７９）にも登録された。組み入れ時に、書面によるインフォームドコンセントを各健常ボランティア及び各患者から得た。患者が直接同意できなかった場合、患者の法定代理人からインフォームドコンセントを得て、可能な限り早い機会に患者に再確認した。
包含基準は以下の通りであった。・１８歳以上の患者、２０１６年のＳＥＰＳＩＳ－３コンセンサス定義によって定義される敗血症の臨床診断（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、損傷重篤度スコア（ＩＳＳ）＞１５の重度の外傷、３０％を超える総火傷表面積の重度の火傷、又は、食道胃切除術、ブリックヤー膀胱切除術、頭部膵十二指腸切除術及び／又は開腹術による腹部大動脈瘤手術等の大手術を受けなければならない手術患者が挙げられる。
除外基準は以下の通りである。・患者の免疫状態に影響を及ぼし得る既存の障害又は処置の存在；特に、免疫抑制治療下の患者、妊娠患者、施設収容患者及びインフォームドコンセントを得ることができなかった患者を除外した。
並行して、１８歳から８２歳までの１７５人の健康なボランティア（８１人の男性及び９４人の女性）のコホートを前向きに募集した。免疫パラメータに対する年齢及び性他の影響の可能性を考慮するために、健康なボランティアの分布は、２０１６年のフランスの人口の年齢及び性別に関する人口統計データに基づいた。
試験集団
観察試験は、セプシス、重度のトラウマ、重度の火傷を示すか、又はエドゥアール・エリオ病院（Ｈｏｓｐｉｔｓ Ｃｉａｌｓ ｄｅ Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）の麻酔及び集中医学部門において計画された手術を受けた重篤な病気の患者の予想されるコホートに対して実施された。包含期間は２８ヶ月（２０１５年１２月～２０１８年３月）であった。試験プロトコルは、施設倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ Ｓｕｄ－Ｅｓｔ ＩＩ）によって番号２０１５－４２－２の下で承認された。この臨床試験はｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２６３８７７９）にも登録された。組み入れ時に、書面によるインフォームドコンセントを各健常ボランティア及び各患者から得た。患者が直接同意できなかった場合、患者の法定代理人からインフォームドコンセントを得て、可能な限り早い機会に患者に再確認した。
包含基準は以下の通りであった。・１８歳以上の患者、２０１６年のＳＥＰＳＩＳ－３コンセンサス定義によって定義される敗血症の臨床診断（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、損傷重篤度スコア（ＩＳＳ）＞１５の重度の外傷、３０％を超える総火傷表面積の重度の火傷、又は、食道胃切除術、ブリックヤー膀胱切除術、頭部膵十二指腸切除術及び／又は開腹術による腹部大動脈瘤手術等の大手術を受けなければならない手術患者が挙げられる。
除外基準は以下の通りである。・患者の免疫状態に影響を及ぼし得る既存の障害又は処置の存在；特に、免疫抑制治療下の患者、妊娠患者、施設収容患者及びインフォームドコンセントを得ることができなかった患者を除外した。
並行して、１８歳から８２歳までの１７５人の健康なボランティア（８１人の男性及び９４人の女性）のコホートを前向きに募集した。免疫パラメータに対する年齢及び性他の影響の可能性を考慮するために、健康なボランティアの分布は、２０１６年のフランスの人口の年齢及び性別に関する人口統計データに基づいた。
【0052】
サンプリング及びデータ収集
各患者について、試料及び臨床データを、入院後の最初の週の間に３回収集した：（１）１日目又は２日目（Ｄ１～２）、（２）Ｄ３又は４日目（Ｄ３～４）及び（３）Ｄ５、Ｄ６又はＤ７（Ｄ５～７）、次いで、入院後の月の間にさらに２回、（４）Ｄ１４及び（５）Ｄ２８。健康なボランティアについては、試験来院中に試料を採取し、臨床データを記録した。データ収集は、他の箇所（Ｖｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
患者の人口統計データ、併存疾患、診断、重症度及び臨床結果を、手動で前向きに記録した。長期的なモニタリングを３０日間実施した。各場合において、各患者及び各健康なボランティアから採取した全末梢血を、試料を採取した後３時間以内に処理した。
血液は、血漿ウイルスＤＮＡ血症、フローサイトメトリーによる免疫表現型決定及び血漿サイトカインレベルの測定のためにＥＤＴＡチューブに、機能試験（増殖、サイトカイン産生実験）のために２つのヘパリンチューブに、そして最後に、ＥｖａＧｒｅｅｎ又はＴａｑＭａｎプローブ方法論を用いるリアルタイムＰＣＲによる全血中のバイオマーカーｍＲＮＡ濃度の測定のために血液ＲＮＡ ＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に収集した。
ＰＡＸｇｅｎｅ試料を、試料採取後に周囲温度で少なくとも２時間安定化させ、次いで、製造業者の推奨に従って－８０℃で凍結させた。
各患者について、試料及び臨床データを、入院後の最初の週の間に３回収集した：（１）１日目又は２日目（Ｄ１～２）、（２）Ｄ３又は４日目（Ｄ３～４）及び（３）Ｄ５、Ｄ６又はＤ７（Ｄ５～７）、次いで、入院後の月の間にさらに２回、（４）Ｄ１４及び（５）Ｄ２８。健康なボランティアについては、試験来院中に試料を採取し、臨床データを記録した。データ収集は、他の箇所（Ｖｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
患者の人口統計データ、併存疾患、診断、重症度及び臨床結果を、手動で前向きに記録した。長期的なモニタリングを３０日間実施した。各場合において、各患者及び各健康なボランティアから採取した全末梢血を、試料を採取した後３時間以内に処理した。
血液は、血漿ウイルスＤＮＡ血症、フローサイトメトリーによる免疫表現型決定及び血漿サイトカインレベルの測定のためにＥＤＴＡチューブに、機能試験（増殖、サイトカイン産生実験）のために２つのヘパリンチューブに、そして最後に、ＥｖａＧｒｅｅｎ又はＴａｑＭａｎプローブ方法論を用いるリアルタイムＰＣＲによる全血中のバイオマーカーｍＲＮＡ濃度の測定のために血液ＲＮＡ ＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に収集した。
ＰＡＸｇｅｎｅ試料を、試料採取後に周囲温度で少なくとも２時間安定化させ、次いで、製造業者の推奨に従って－８０℃で凍結させた。
【0053】
合併症の定義
この試験の文脈において評価された主な合併症は、２８日目（Ｄ２８）の二次感染（医療関連感染－ＨＡＩ）及びＤ２８の死亡率であった。評価した他の合併症には、集中治療室（ＩＣＵ）での滞在期間及び入院期間の合計、侵襲的医療装置（気管挿管、留置尿道カテーテル及び中心静脈ライン）の毎日の使用が含まれた。感染に関して収集された情報は、試験において患者の募集又はケアに関与していない３人の臨床医からなる独立した意思決定委員会によって調べられた。
この委員会による二次感染（医療関連感染、ＨＡＩ）の診断の確認は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ及びＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＤｉｓｅａｓｅＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのガイドラインに基づく。二次感染の最初のエピソードのみを分析に考慮した。
この試験の文脈において評価された主な合併症は、２８日目（Ｄ２８）の二次感染（医療関連感染－ＨＡＩ）及びＤ２８の死亡率であった。評価した他の合併症には、集中治療室（ＩＣＵ）での滞在期間及び入院期間の合計、侵襲的医療装置（気管挿管、留置尿道カテーテル及び中心静脈ライン）の毎日の使用が含まれた。感染に関して収集された情報は、試験において患者の募集又はケアに関与していない３人の臨床医からなる独立した意思決定委員会によって調べられた。
この委員会による二次感染（医療関連感染、ＨＡＩ）の診断の確認は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ及びＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＤｉｓｅａｓｅＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのガイドラインに基づく。二次感染の最初のエピソードのみを分析に考慮した。
【0054】
ウイルス性ＤＮＡｅｍｉａの決定
ＴＴＶ及び４つのヘルペスウイルスのウイルスＤＮＡ血症を決定するための半自動プロセスは、試料の処理及びリアルタイム定量的ＰＣＲのための標準化された手順を統合しており、以前に詳細に記載されている（非特許文献４）。
簡潔には、常磁性シリカ粒子から構成されるＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＨＴ Ｖｉｒａｌ ＴＮＡ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｒｏｂｏｔ（ＴＥＣＡＮ）を用いて、製造業者の指示に従って、血漿試料からウイルスＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ対照を抽出前に各血漿試料に添加した。半自動プロセスの検出限界（ＬＯＤ）は、ウイルス標準を用いて検出の欠如（ブランク値）と区別することができる最小量であると予め決定された（非特許文献４）。
ＴＴＶの検出限界は、所定量のＴＴＶを含む血漿試料を用いて決定した。まず、対照血漿試料を１０－１から１０－４まで段階希釈し、各希釈試料を独立して３回抽出し、次いで、定量的ＰＣＲを用いて増幅して、およその検出限界を決定する。第２に、陽性シグナルを与える最大希釈を再び１／２及び１／４に希釈し、次いで、各希釈試料を独立して２０回抽出し、増幅する。１００％検出を有する最も希釈された陽性複製物を検出限界として用いる。
血漿１ｍｌあたりのコピー数として表されるＬＯＤは、ＴＴＶについて１６７、ＣＭＶについて１００、ＥＢＶについて３３、ＨＨＶ６について１６６、及びＨＳＶ１について３３である。ウイルスＤＮＡを、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ１、ＨＨＶ６及びＴＴＶ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ）のためのＴａｑＭａｎプローブを用いるＲ－ＧＥＮＥ（登録商標）アッセイキットによって、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）上でリアルタイムＰＣＲを用いて増幅した。
プレートにランダムに分配された全ての核酸試料を、製造業者の指示に従って、定量標準、感度コントロール及びネガティブコントロールと同時に増幅した。
最後に、標準曲線を用いて、各試料のＣｔ（「サイクル閾値」）値をＰＣＲ反応チューブ中のウイルスＤＮＡのコピー／μｌに変換し、次いで血漿試料中のウイルスＤＮＡのコピー／ｍｌに変換した。
ＴＴＶ及び４つのヘルペスウイルスのウイルスＤＮＡ血症を決定するための半自動プロセスは、試料の処理及びリアルタイム定量的ＰＣＲのための標準化された手順を統合しており、以前に詳細に記載されている（非特許文献４）。
簡潔には、常磁性シリカ粒子から構成されるＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＨＴ Ｖｉｒａｌ ＴＮＡ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｒｏｂｏｔ（ＴＥＣＡＮ）を用いて、製造業者の指示に従って、血漿試料からウイルスＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ対照を抽出前に各血漿試料に添加した。半自動プロセスの検出限界（ＬＯＤ）は、ウイルス標準を用いて検出の欠如（ブランク値）と区別することができる最小量であると予め決定された（非特許文献４）。
ＴＴＶの検出限界は、所定量のＴＴＶを含む血漿試料を用いて決定した。まず、対照血漿試料を１０－１から１０－４まで段階希釈し、各希釈試料を独立して３回抽出し、次いで、定量的ＰＣＲを用いて増幅して、およその検出限界を決定する。第２に、陽性シグナルを与える最大希釈を再び１／２及び１／４に希釈し、次いで、各希釈試料を独立して２０回抽出し、増幅する。１００％検出を有する最も希釈された陽性複製物を検出限界として用いる。
血漿１ｍｌあたりのコピー数として表されるＬＯＤは、ＴＴＶについて１６７、ＣＭＶについて１００、ＥＢＶについて３３、ＨＨＶ６について１６６、及びＨＳＶ１について３３である。ウイルスＤＮＡを、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ１、ＨＨＶ６及びＴＴＶ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ）のためのＴａｑＭａｎプローブを用いるＲ－ＧＥＮＥ（登録商標）アッセイキットによって、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）上でリアルタイムＰＣＲを用いて増幅した。
プレートにランダムに分配された全ての核酸試料を、製造業者の指示に従って、定量標準、感度コントロール及びネガティブコントロールと同時に増幅した。
最後に、標準曲線を用いて、各試料のＣｔ（「サイクル閾値」）値をＰＣＲ反応チューブ中のウイルスＤＮＡのコピー／μｌに変換し、次いで血漿試料中のウイルスＤＮＡのコピー／ｍｌに変換した。
【0055】
統計分析
ウイルス血症は、各ウイルスについてＤＮＡｅｍｉａを測定することによって測定し、ウイルス血症事象、すなわち陽性ＤＮＡｅｍｉａは、所定の閾値より大きい（ＬＯＤより大きい）マイクロリットル当たりのウイルスのコピー数によって特徴付けられる。患者が集中治療に入院した後の最初の週（１／２日目、３／４日目又は５／７日目）の間に患者からの試料の少なくとも１つについて陽性ＤＮＡｅｍｉａが検出された場合、陽性ＤＮＡｅｍｉａは早期であると考えられる。ＤＮＡ血症はまた、Ｄ１４及びＤ２８に評価した。データは、数及び比率（定性変数）、並びに中央値及び２５／７５パーセンタイル（定量変数）の形態で提示される。
ウイルス血症は、各ウイルスについてＤＮＡｅｍｉａを測定することによって測定し、ウイルス血症事象、すなわち陽性ＤＮＡｅｍｉａは、所定の閾値より大きい（ＬＯＤより大きい）マイクロリットル当たりのウイルスのコピー数によって特徴付けられる。患者が集中治療に入院した後の最初の週（１／２日目、３／４日目又は５／７日目）の間に患者からの試料の少なくとも１つについて陽性ＤＮＡｅｍｉａが検出された場合、陽性ＤＮＡｅｍｉａは早期であると考えられる。ＤＮＡ血症はまた、Ｄ１４及びＤ２８に評価した。データは、数及び比率（定性変数）、並びに中央値及び２５／７５パーセンタイル（定量変数）の形態で提示される。
【0056】
ウイルス血症事象と臨床的合併症（上記（非特許文献４）、集中的なケアにおいて獲得された生存又は細菌の感染）との間の関連を、適当な場合には、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定を用いて評価した（非特許文献４）。
ＤＮＡ血症／ウイルス血症事象と定量的免疫マーカー（細胞、サイトカイン、ｍＲＮＡ）との間の二元的関連をウィルコクソン符号順位検定最後に、Ｒソフトウェア、バージョン３．４．４を用いて分析を実施し、５％の帰無仮説を不正確に棄却するアルファリスクとして統計的有意性を定義した（ｐ＜０．０５は有意な関連を示す）。
ＤＮＡ血症／ウイルス血症事象と定量的免疫マーカー（細胞、サイトカイン、ｍＲＮＡ）との間の二元的関連をウィルコクソン符号順位検定最後に、Ｒソフトウェア、バージョン３．４．４を用いて分析を実施し、５％の帰無仮説を不正確に棄却するアルファリスクとして統計的有意性を定義した（ｐ＜０．０５は有意な関連を示す）。
【0057】
結果
コホートの説明
３７７人の重篤な病気の患者のＲＥＡＬＩＳＭコホートは、１０７症例の敗血症、１３７症例の重篤な外傷、２４症例の重篤な火傷及び１０９症例の大手術から構成される。
定性的データ（ＤＮＡｅｍｉａ）よりもむしろ定量的データ（ウイルス量）の方が、（１）有意でないウイルス量、（２）免疫抑制の推定マーカーとしてのウイルス「再活性化」、及び（３）処置を必要とする実際のウイルス感染の存在を支持する高いウイルス量（＜１％）をより良好に区別しうる（Ｔｅｘｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
高ＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａ（ウイルス量が１００００コピー／ｍｌより大きい）である患者は、より重篤な疾患であり、重症度スコアがより高く、治療の必要性が高かった（図３）。
ＴＴＶウイルス量の増加（ｐ＝０．０２５）は、集中治療におけるより長い滞在と有意に相関したが、ＴＴＶウイルス量の増加（ｐ＝０．０４８）及び減少（ｐ＝０．０４８）の両方、換言すれば、ＴＴＶウイルス量の変動は、最初の１ヶ月間に集中治療で獲得された医療関連感染の発生と有意に関連していた（図２Ａ及び２Ｂ）。
コホートの説明
３７７人の重篤な病気の患者のＲＥＡＬＩＳＭコホートは、１０７症例の敗血症、１３７症例の重篤な外傷、２４症例の重篤な火傷及び１０９症例の大手術から構成される。
定性的データ（ＤＮＡｅｍｉａ）よりもむしろ定量的データ（ウイルス量）の方が、（１）有意でないウイルス量、（２）免疫抑制の推定マーカーとしてのウイルス「再活性化」、及び（３）処置を必要とする実際のウイルス感染の存在を支持する高いウイルス量（＜１％）をより良好に区別しうる（Ｔｅｘｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
高ＴＴＶ ＤＮＡｅｍｉａ（ウイルス量が１００００コピー／ｍｌより大きい）である患者は、より重篤な疾患であり、重症度スコアがより高く、治療の必要性が高かった（図３）。
ＴＴＶウイルス量の増加（ｐ＝０．０２５）は、集中治療におけるより長い滞在と有意に相関したが、ＴＴＶウイルス量の増加（ｐ＝０．０４８）及び減少（ｐ＝０．０４８）の両方、換言すれば、ＴＴＶウイルス量の変動は、最初の１ヶ月間に集中治療で獲得された医療関連感染の発生と有意に関連していた（図２Ａ及び２Ｂ）。
【0058】
さらに、驚くべきことに、ＨＡＩｓの症例が、陽性ヘルペスＤＮＡ血症のみである患者よりも、ＴＴＶ及び少なくとも１つのヘルペスウイルスについて陽性ＤＮＡ血症である患者においてより一般的である傾向があることを見出した（図２Ａ及び２Ｂ）。
【0059】
入院の第１週及び第１月の間の集中治療室の患者におけるＤＮＡｅｍｉａ
第１週
ＴＴＶは、コホートの患者の２１７人（５８％）において検出され（陽性ＤＮＡｅｍｉａ）、すなわち、健常対照（５１％）よりもわずかに多かった。ＴＴＶは、１６０人（４２％）の患者において単独で検出され、患者においては、１人（ｎ＝４８、１３％）又は２人（ｎ＝６、２％）、又は３人以上（ｎ＝３、１％）のヘルペスウイルスと同時に検出された。
ＴＴＶと同時に検出された最も一般的なヘルペスウイルスはＥＢＶ（ｎ＝２９、８％）であり、ＨＨＶ６（ｎ＝１８、５％）、ＨＳＶ１（ｎ＝１２、３％）及びＣＭＶ（ｎ＝１２、３％）が続いた。
全体として、単一のウイルス（ヘルペスウイルス又はＴＴＶのいずれであっても）について陽性のＤＮＡ血症である患者の数（ｎ＝１８９）は、少なくとも２つのウイルスの存在について陽性のＤＮＡ血症である患者の数（ｎ＝１８８）と同様であった。
第１週
ＴＴＶは、コホートの患者の２１７人（５８％）において検出され（陽性ＤＮＡｅｍｉａ）、すなわち、健常対照（５１％）よりもわずかに多かった。ＴＴＶは、１６０人（４２％）の患者において単独で検出され、患者においては、１人（ｎ＝４８、１３％）又は２人（ｎ＝６、２％）、又は３人以上（ｎ＝３、１％）のヘルペスウイルスと同時に検出された。
ＴＴＶと同時に検出された最も一般的なヘルペスウイルスはＥＢＶ（ｎ＝２９、８％）であり、ＨＨＶ６（ｎ＝１８、５％）、ＨＳＶ１（ｎ＝１２、３％）及びＣＭＶ（ｎ＝１２、３％）が続いた。
全体として、単一のウイルス（ヘルペスウイルス又はＴＴＶのいずれであっても）について陽性のＤＮＡ血症である患者の数（ｎ＝１８９）は、少なくとも２つのウイルスの存在について陽性のＤＮＡ血症である患者の数（ｎ＝１８８）と同様であった。
【0060】
最初の月
ＴＴＶは、コホートの２２８人（６０％）の患者において検出された。１５１人（４０％）の患者がＴＴＶのみの陽性ＤＮＡ血症であったが、ＴＴＶは、１人（ｎ＝５９、１６％）、２人（ｎ＝１１、３％）又は３人以上（ｎ＝７、２％）のヘルペスウイルスがある患者において同時に検出された（陽性ＤＮＡ血症）。全てのヘルペスウイルスはＴＴＶと同時に検出され、最も一般的な同時検出はＥＢＶ（ｎ＝３６、１０％）、次いでＨＳＶ１（ｎ＝２８、７％）、ＣＭＶ（ｎ＝２３、６％）及びＨＨＶ６（ｎ＝１９、５％）であった。全体として、コホートは、単一ウイルス感染（陽性ＤＮＡｅｍｉａ）の患者（ｎ＝１８７）を、随伴感染がある患者（ｎ＝１９０）と同数含んだ。
ＴＴＶは、コホートの２２８人（６０％）の患者において検出された。１５１人（４０％）の患者がＴＴＶのみの陽性ＤＮＡ血症であったが、ＴＴＶは、１人（ｎ＝５９、１６％）、２人（ｎ＝１１、３％）又は３人以上（ｎ＝７、２％）のヘルペスウイルスがある患者において同時に検出された（陽性ＤＮＡ血症）。全てのヘルペスウイルスはＴＴＶと同時に検出され、最も一般的な同時検出はＥＢＶ（ｎ＝３６、１０％）、次いでＨＳＶ１（ｎ＝２８、７％）、ＣＭＶ（ｎ＝２３、６％）及びＨＨＶ６（ｎ＝１９、５％）であった。全体として、コホートは、単一ウイルス感染（陽性ＤＮＡｅｍｉａ）の患者（ｎ＝１８７）を、随伴感染がある患者（ｎ＝１９０）と同数含んだ。
【0061】
ＴＴＶがある患者の比率は、健康なボランティアで観察された５１％と比較して、敗血症、重度の外傷及び大手術を患っている患者では同様であり（５６～６４％）、火傷被害者ではわずかに低かった（４６％）。
傾向として、ＴＴＶ力価が高い患者の比率は、手術を受けた患者群でより大きいようであり、重症度基準は、高いＴＴＶウイルス量（特に、７０００コピー／ｍｌ超）と相関する（図４）。
傾向として、ＴＴＶ力価が高い患者の比率は、手術を受けた患者群でより大きいようであり、重症度基準は、高いＴＴＶウイルス量（特に、７０００コピー／ｍｌ超）と相関する（図４）。
【0062】
ＤＮＡ血症と臨床的合併症との関連
２８日の観察期間の終期に、二次的な医療関連感染の少なくとも１つのエピソードの発生を考慮する。
入院の第１週での各ヘルペスウイルスの個々の検出は、最初の１ヶ月とは異なり、医療関連感染（ＨＡＩ）のリスクと有意に関連しない。ＴＴＶについての陽性ＤＮＡ血症の非存在下で、個々に考慮されるいかなるヘルペスウイルスについて、最初の１ヶ月間に少なくとも１回のウイルス血症エピソード（陽性ＤＮＡ血症）があった患者では、ＨＡＩの比率の有意な増加が観察される。
さらに、ＴＴＶ単独（ヘルペスウイルスの検出なし）についての陽性ＤＮＡｅｍｉａは、ＨＡＩの発生の減少と関連する（図３）。
最初の１ヶ月でＴＴＶウイルス量が安定している場合は、ＨＡＩの発生の減少と関連することも観察された（図５）。
最初の１ヶ月でのコホートからの患者のウイルスＤＮＡ血症を考慮する場合、あるウイルス血症事象（２つ以上のヘルペスウイルスについて、又はＴＴＶ及び少なくとも１つのヘルペスウイルスについて陽性ＤＮＡ血症）があった患者では、単一のウイルスの陽性ＤＮＡ血症があった患者（２２％）又は検出されたＤＮＡ血症がない患者（１９％）よりも高いＨＡＩの比率（４４％）が観察される（カイ二乗検定、ｐ＜０．００１）。
第１週での陽性ウイルスＤＮＡ血症の事象を考慮すると、あるウイルス血症事象があった患者は、単一ウイルスの陽性ＤＮＡ血症があった患者（９％）又はいかなる検出されたＤＮＡ血症もない患者（９％）と同様のＨＡＩ率（１１％）であった（カイ二乗検定、Ｐ＝０．８）。
驚くべきことに、結果は、早期に、患者の入院後の最初の１週間という早期において、高いＴＴＶウイルス量（特に、試料１ｍｌ当たりのコピー数が１０ ０００超）及びヘルペスウイルスについての陽性ＤＮＡ血症の同時検出が、医療関連感染の発生のリスクと有意に関連することを示す（図３）。
２８日の観察期間の終期に、二次的な医療関連感染の少なくとも１つのエピソードの発生を考慮する。
入院の第１週での各ヘルペスウイルスの個々の検出は、最初の１ヶ月とは異なり、医療関連感染（ＨＡＩ）のリスクと有意に関連しない。ＴＴＶについての陽性ＤＮＡ血症の非存在下で、個々に考慮されるいかなるヘルペスウイルスについて、最初の１ヶ月間に少なくとも１回のウイルス血症エピソード（陽性ＤＮＡ血症）があった患者では、ＨＡＩの比率の有意な増加が観察される。
さらに、ＴＴＶ単独（ヘルペスウイルスの検出なし）についての陽性ＤＮＡｅｍｉａは、ＨＡＩの発生の減少と関連する（図３）。
最初の１ヶ月でＴＴＶウイルス量が安定している場合は、ＨＡＩの発生の減少と関連することも観察された（図５）。
最初の１ヶ月でのコホートからの患者のウイルスＤＮＡ血症を考慮する場合、あるウイルス血症事象（２つ以上のヘルペスウイルスについて、又はＴＴＶ及び少なくとも１つのヘルペスウイルスについて陽性ＤＮＡ血症）があった患者では、単一のウイルスの陽性ＤＮＡ血症があった患者（２２％）又は検出されたＤＮＡ血症がない患者（１９％）よりも高いＨＡＩの比率（４４％）が観察される（カイ二乗検定、ｐ＜０．００１）。
第１週での陽性ウイルスＤＮＡ血症の事象を考慮すると、あるウイルス血症事象があった患者は、単一ウイルスの陽性ＤＮＡ血症があった患者（９％）又はいかなる検出されたＤＮＡ血症もない患者（９％）と同様のＨＡＩ率（１１％）であった（カイ二乗検定、Ｐ＝０．８）。
驚くべきことに、結果は、早期に、患者の入院後の最初の１週間という早期において、高いＴＴＶウイルス量（特に、試料１ｍｌ当たりのコピー数が１０ ０００超）及びヘルペスウイルスについての陽性ＤＮＡ血症の同時検出が、医療関連感染の発生のリスクと有意に関連することを示す（図３）。
【0063】
要約すると、ウイルス血症、疾患群及び入院基準に関して、（ｉ）変動する（増加又は減少する）患者の比率は、以下のように定義される。経時的なＴＴＶウイルス量は、敗血症に罹患している患者では他の群よりも高い傾向があり、（ｉｉ）ヘルペスについての陽性ＤＮＡ血症並びに高いＴＴＶウイルス量は、入院時の患者の状態の重症度と関連するようである。
ＨＡＩに関して、（ｉ）好ましくは入院の第１週という早期における、高ＴＴＶウイルス量及びヘルペスについての陽性ＤＮＡ血症の同時検出は、ＨＡＩのより頻繁な発生のリスクと相関し、（ｉｉ）安定なＴＴＶウイルス量は、患者におけるＨＡＩの発生のリスクとも相関するＴＴＶウイルス量の変動とは異なり、ＨＡＩの比較的低い発生と関連する。
ＨＡＩに関して、（ｉ）好ましくは入院の第１週という早期における、高ＴＴＶウイルス量及びヘルペスについての陽性ＤＮＡ血症の同時検出は、ＨＡＩのより頻繁な発生のリスクと相関し、（ｉｉ）安定なＴＴＶウイルス量は、患者におけるＨＡＩの発生のリスクとも相関するＴＴＶウイルス量の変動とは異なり、ＨＡＩの比較的低い発生と関連する。
【0064】
考察
結果は、有意でないＴＴＶ量を高いＴＴＶ量から区別することができることを実証する。したがって、集中治療中の患者における生理病理学的特徴に関連するＴＴＶ発現閾値を同定したことは、特に本発明者らの功績である。
要するに、上記で示された結果は、（ｉ）集中治療への入院の第１週という早期における、ヘルペスウイルス再活性化に関連する高いＴＴＶ量の患者における検出が、ＨＡＩのリスクの増加に関連していたこと、及び（ｉｉ）早期及び高いＴＴＶウイルス血症が、免疫系の障害に関連していたことを実証した。
結果は、有意でないＴＴＶ量を高いＴＴＶ量から区別することができることを実証する。したがって、集中治療中の患者における生理病理学的特徴に関連するＴＴＶ発現閾値を同定したことは、特に本発明者らの功績である。
要するに、上記で示された結果は、（ｉ）集中治療への入院の第１週という早期における、ヘルペスウイルス再活性化に関連する高いＴＴＶ量の患者における検出が、ＨＡＩのリスクの増加に関連していたこと、及び（ｉｉ）早期及び高いＴＴＶウイルス血症が、免疫系の障害に関連していたことを実証した。
【0065】
経時的なウイルス血症の変化は、ＴＴＶについてはあまり認識できず（最初の週の５８％から１ヶ月間で６０％）、ＴＴＶについての陽性ウイルス血症は、ＴＴＶ及びヘルペスウイルスの同時検出よりもＴＴＶ単独についてより頻繁であった（最初の週の間に測定された４２％対１５％、最初の１ヶ月間に測定された４０％対２０％）。
ＴＴＶの有病率は、本明細書では状態の個体のコホートの男性においてより高い（Ｆｏｃｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）及び移植レシピエント（Ｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、この試験の集団では、性他の偏りは観察されなかったが、ＴＴＶウイルス量が１００００コピー／ｍｌを超えるサブグループでは男性が優勢であった。
ＴＴＶ及びＥＢＶは各々、最初の週及び最初の月の間に８％～１０％、同時に最も頻繁に検出されたウイルスであった。
ＴＴＶの有病率は、本明細書では状態の個体のコホートの男性においてより高い（Ｆｏｃｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）及び移植レシピエント（Ｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、この試験の集団では、性他の偏りは観察されなかったが、ＴＴＶウイルス量が１００００コピー／ｍｌを超えるサブグループでは男性が優勢であった。
ＴＴＶ及びＥＢＶは各々、最初の週及び最初の月の間に８％～１０％、同時に最も頻繁に検出されたウイルスであった。
【0066】
同期間中、ＴＴＶ量の変動のみが、ＨＡＩ発生のリスクの増加と有意に関連している。実際、ＴＴＶの存在だけでは、高量であっても、ＨＡＩのリスクの増加を判定するには不十分である。
それにもかかわらず、入院後の最初の１ヶ月の間、ＴＴＶの陽性のＤＮＡ血症がある患者を含む、複数のウイルス血症事象がある患者には、単一ウイルスの血症事象があったか、又はウイルス血症事象がなかった患者（各々２２％及び１９％）よりも高い頻度のＨＡＩ（４４％）がある。したがって、全く驚くべきことに、かつ予想外に、入院第１週目のにおける高いＴＴＶ量及びヘルペスウイルスの同時検出は、最初の１ヶ月の間のＨＡＩ事象の発生と有意に関連する。
結論として、結果は、集中治療室に入院した患者において、ＨＰＶと組み合わされた、又は組み合わされていないウイルス再活性化、特にＴＴＶと、医療関連感染を発症するリスクとの間に相関関係が存在することを実証する。
それにもかかわらず、入院後の最初の１ヶ月の間、ＴＴＶの陽性のＤＮＡ血症がある患者を含む、複数のウイルス血症事象がある患者には、単一ウイルスの血症事象があったか、又はウイルス血症事象がなかった患者（各々２２％及び１９％）よりも高い頻度のＨＡＩ（４４％）がある。したがって、全く驚くべきことに、かつ予想外に、入院第１週目のにおける高いＴＴＶ量及びヘルペスウイルスの同時検出は、最初の１ヶ月の間のＨＡＩ事象の発生と有意に関連する。
結論として、結果は、集中治療室に入院した患者において、ＨＰＶと組み合わされた、又は組み合わされていないウイルス再活性化、特にＴＴＶと、医療関連感染を発症するリスクとの間に相関関係が存在することを実証する。
【0067】
参考文献
【0068】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】