特表 2024-528675 炎症性障害を処置するためのブチロフィリン様２作用物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-30

(54)【発明の名称】炎症性障害を処置するためのブチロフィリン様２作用物質

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240723BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240723BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240723BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240723BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240723BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240723BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240723BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240723BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P29/00 ZNA

A61P1/00

A61P37/06

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P21/00

A61P1/04

A61P3/10

A61P43/00 121

A61K45/06

A61K38/16

A61K39/395 N

A61K48/00

A61K31/7105

C07K14/47

C07K19/00

C07K16/18

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503554

(86)(22)【出願日】2022-07-20

(85)【翻訳文提出日】2024-02-26

(86)【国際出願番号】 US2022073936

(87)【国際公開番号】W WO2023004344

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/223,644

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

３．Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】カサンドラ・エム・パネア

(72)【発明者】

【氏名】ソコル・ハジナスト

(72)【発明者】

【氏名】ザルヒ・ホバニシャン

(72)【発明者】

【氏名】ジュリー・ホロヴィッツ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA17

4C084AA20

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4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本開示は、Ｔ細胞駆動型炎症障害を処置するための方法を提供する。本方法は、ブチロフィリン様２（Ｂｔｎｌ２）のレベルまたは活性を上昇させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与して、それによって対象におけるリンパ球の頻度または機能を変化させることを含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

炎症性障害を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）炎症性障害を有し、かつ所定の基準値と比較して上皮内リンパ球（ＩＥＬ）のレベルが上昇している対象を選択すること；および
（ｂ）対象におけるブチロフィリン様２（Ｂｔｎｌ２）のレベルまたは活性を上昇させることによって対象におけるＩＥＬの増殖を減少させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与して、それによって炎症性障害を処置すること
を含む方法。

【請求項2】

対象は、少なくとも１つの機能喪失型一塩基多型（ＳＮＰ）を、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

対象は、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらす少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、ｒｓ２８３６２６７５に有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＩＥＬはγδＴ細胞を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

炎症性障害は、腸の炎症性障害である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

炎症性障害は免疫媒介性疾患である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

炎症性障害は自己免疫疾患である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

炎症性障害は、腸管関連の免疫媒介性疾患である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

免疫媒介性疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、筋炎、炎症性腸疾患、胃腸炎、またはＩ型糖尿病を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤は、抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

対象はヒトである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、腫瘍内、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、坐薬として、または舌下に投与される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、徐放性、制御放出性、または遅延放出性の剤形で投与される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

第２の治療剤または療法を対象に投与することをさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

第２の治療剤は抗炎症剤を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）ＩＢＤを有し、かつ少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に含む対象を同定すること；および
（ｂ）対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与して、それによってＩＢＤを処置すること
を含む方法。

【請求項29】

対象は、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらす少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰをｒｓ２８３６２６７５に有する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む、請求項２８または２９に記載の方法。

【請求項31】

Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

選択の工程は、核酸を含む試料を対象から得ること、および試料に対して遺伝子型判定アッセイを行うことを含む、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

対象におけるＩＥＬの数を減少させる方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、Ｂｔｎｌ２作用物質は、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる、方法。

【請求項36】

ＩＥＬはγδＴ細胞を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む、請求項４１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤を含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤は、抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである、請求項４６または４７に記載の方法。

【請求項49】

対象において抗菌応答を誘発させる方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量を対象に投与することを含み、Ｂｔｎｌ２作用物質は、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる、方法。

【請求項50】

ＩＥＬはγδＴ細胞を含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

ＩＥＬは腸γδ上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を含む、請求項４９または５０に記載の方法。

【請求項52】

腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬを含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。

【請求項58】

組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤を含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤は、抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む、請求項４９～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、請求項４９～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項63】

対象におけるＩＥＬを減少させることができるＢｔｎｌ２作用物質を同定するための方法であって、
（ａ）Ｂｔｎｌ２のレベルもしくは活性を上昇させることができるかまたはＢｔｎｌ２アゴニスト活性を有するＢｔｎｌ２作用物質のある量を対象に投与すること；
（ｂ）対象から得られた試料に対してアッセイを行って、試料中のＩＥＬの数を決定すること；および
（ｃ）対象において所定の基準値と比較してＩＥＬの数が増加している場合に、Ｂｔｎｌ２作用物質を、対象におけるＩＥＬを減少させる能力があるものとして同定すること
を含む方法。

【請求項64】

ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

腸γδＩＥＬは、十二指腸γδＩＥＬ、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

炎症性障害の処置におけるブチロフィリン様２（Ｂｔｎｌ２）作用物質の使用であって、Ｂｔｎｌ２作用物質は、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることによって対象における上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の増殖を減少させることができ、対象は炎症性障害を有し、かつ所定の基準値と比較してＩＥＬのレベルが上昇している、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、Ｔ細胞の発生、維持、および機能のＢｔｎｌ２媒介性標的化を介して炎症性障害を処置するための方法および試薬を含む、炎症性障害を処置するための方法および試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

炎症は、病原体、アレルゲンまたは刺激物などの物理的、化学的または生物的因子によって引き起こされる損傷または異常刺激に応答して、冒された血管および隣接組織で生じる複雑な細胞的および生化学的プロセスである。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、年間５０，０００人以上の死亡を引き起こす、結腸および小腸の炎症性状態の一群である。ＩＢＤの原因は複雑であり、寄与因子には食事、遺伝、および個人の腸管細菌叢の組成が含まれる。医学的処置は、主として個人に特有の因子に基づく。

【0003】

組織常在性の上皮内リンパ球（ＩＥＬ）は、腸管ホメオスタシスの維持に関与する、腸上皮における抗原経験免疫細胞の不均一な集団を表す。特に、α－β（αβ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＩＥＬは、病原体特異的な記憶応答を開始する体勢を整えており、一方、γδ（γδ）ＴＣＲを保有するＩＥＬは、密着結合を強化し、ホメオスタシス、炎症および感染の際に自然免疫および適応免疫を調整する。腸上皮細胞（ＩＥＣ）とγδＩＥＬとの間の相互作用は、ＩＥＬの発生および機能に影響する。注目されることに、最近の研究により、解剖学的な分離が、化学的に誘導されるかまたは病原体によって誘導される上皮損傷に対する機能的に異なるγδＩＥＬ免疫応答を含む、腸管セグメント特異的な免疫を推進する可能性があることが強く示されている。しかし、局所的な抗原環境に応答してγδＩＥＬの発生および維持を調節する機序は、ほとんど解明されていない。

【0004】

最近の研究により、ＩＥＣ特異的なブチロフィリン様（Ｂｔｎｌ）分子は、異なる複数のＶγＴＣＲ^＋ ＩＥＬの周産期増大および成熟を誘導するといういくつかの証拠が得られている。実際、腸γδＩＥＬは主としてマウスではＶγ７を、ヒトではＶγ４を発現し、これは宿主の生涯を通じて持続する。γδＩＥＬは、局所環境から自己抗原および細菌抗原の両方を連続的に採取して、ＴＣＲの特異性を個別に調整する。さらに、γδＴＣＲレパートリーの多様性を形成し、腸区画にわたるγδＩＥＬサブセットの分布および機能を調節することへのＢｔｎｌ分子の寄与は、まだ解明されておらず、これは腸で観察される区画化された免疫応答の理解に役立つ可能性がある。

【0005】

Ｂｔｎ／Ｂｔｎｌタンパク質は、Ｂ７免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、他の共刺激分子および共阻害分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤＬ１、およびＰＤＬ２）と類似しており、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化、増殖およびサイトカイン産生の阻害、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の誘導、ならびに抗原特異的炎症応答の遮断を含むαβＴ細胞の免疫機能を調節することが示されている。ＢｔｎｌファミリーのメンバーであるＢｔｎｌ２は、インビトロでＴｒｅｇの分化を誘導すること、ならびにＴ細胞の活性化および増殖を抑制することが示されている。しかし、ホメオスタシスおよび炎症に際しての腸内免疫応答の調節、特に腸γδＩＥＬの誘導および維持におけるＢｔｎｌ２の役割については、まだ検討されていない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様では、本開示は、（ａ）炎症性障害を有し、かつ所定の基準値と比較して上皮内リンパ球（ＩＥＬ）のレベルが上昇している対象を選択すること；および（ｂ）対象におけるブチロフィリン様２（Ｂｔｎｌ２）のレベルまたは活性を上昇させることによって対象におけるＩＥＬの増殖を減少させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与して、それによって炎症性障害を処置することを含む方法を提供する。

【0007】

一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの機能喪失型一塩基多型（ＳＮＰ）を、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらす少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、ｒｓ２８３６２６７５に有する。

【0008】

一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0009】

一部の実施形態では、炎症性障害は、腸の炎症性障害である。一部の実施形態では、炎症性障害は免疫媒介性疾患である。一部の実施形態では、炎症性障害は自己免疫疾患である。一部の実施形態では、炎症性障害は、腸管関連の免疫媒介性疾患である。一部の実施形態では、免疫媒介性疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（腸の症状を伴うかまたは伴わない）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、筋炎、炎症性腸疾患、胃腸炎、またはＩ型糖尿病を含む。

【0010】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤または抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。

【0012】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0013】

一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、腫瘍内、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、または舌下に投与される。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、徐放性、制御放出性、または遅延放出性の剤形で投与される。

【0014】

一部の実施形態では、本方法は、さらに、第２の治療剤または療法を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は抗炎症剤を含む。

【0015】

別の態様では、本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法であって、（ａ）ＩＢＤを有し、かつ少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する対象を選択すること；および（ｂ）対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0016】

一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰをｒｓ２８３６２６７５に有し、その結果、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異が生じる。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0018】

一部の実施形態では、本方法は、核酸を含む試料を対象から得ること、および試料に対して遺伝子型判定アッセイを行うことを含む、選択の工程を含む。

【0019】

別の態様では、本開示はまた、対象におけるＩＥＬの数を減少させる方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、Ｂｔｎｌ２作用物質が、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる、方法も提供する。一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0020】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0021】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤または抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。

【0022】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0023】

別の態様では、本開示は、対象において抗細菌応答を誘発させる方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量を対象に投与することを含み、Ｂｔｎｌ２作用物質が、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる、方法をさらに提供する。

【0024】

一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδ上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0025】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0026】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤または抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。

【0027】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0028】

別の態様では、本開示は、対象におけるＩＥＬを減少させることができるＢｔｎｌ２作用物質を同定するための方法であって、（ａ）Ｂｔｎｌ２のレベルもしくは活性を上昇させることができるかまたはＢｔｎｌ２アゴニスト活性を有するＢｔｎｌ２作用物質のある量を対象に投与すること；（ｂ）対象から得られた試料に対してアッセイを行って、試料中のＩＥＬの数を決定すること；および（ｃ）対象において所定の基準値と比較してＩＥＬの数が増加している場合に、Ｂｔｎｌ２作用物質を、対象におけるＩＥＬを減少させる能力があるものとして同定することを含む方法を提供する。

【0029】

一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは十二指腸γδＩＥＬ、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。

【0030】

前述の概要は、本開示のすべての態様を定義することを意図したものではなく、さらなる態様が、他のセクション、例えば、以下の詳細な説明において記載される。本文書の全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載される構成のすべての組合せは、構成の組合せが本文書の同じ文、または段落、またはセクションにおいて一緒に見出されない場合であっても、想定されることが理解されるべきである。本発明の他の構成および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の例は、本開示の特定の実施形態を示してはいるが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきであり、これは、本開示の趣旨および範囲内のさまざまな変更および修正は、この詳細な説明から当業者には明らかになると考えられるからである。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、Ｂｔｎｌ２が小腸上皮細胞において選好的に発現されることを示す。図１Ａは、Ｂｔｎｌ２－／－マウスのＷＴおよび標的座位の概略図を示す。ｈＵｂ、ヒトユビキチンプロモーター。図１Ｂは、１５週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯマウスの小腸（十二指腸、空腸および回腸）および結腸のセグメントの凍結切片におけるβ－ガラクトシダーゼおよびニュートラルレッド対比染色の結果を示す。矢印は、Ｂｔｎｌ２－ＬａｃＺの発現が弱い十二指腸腺、ならびに十二指腸、空腸、回腸および結腸の陰窩および絨毛の領域を示す。倍率は２０倍である。図１Ｃは、同時飼育した７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯマウスおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝５）の小腸および結腸の異なるセグメントからの腸上皮細胞におけるＢｔｎｌ２のｍＲＮＡ発現を、β２ｍに対して正規化した上で示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する多重非対応ｔ検定を使用して測定され、ＷＴマウスとは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で有意に異なるとする。

【図2-1】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスが、回腸におけるγδＩＥＬの頻度の増加を示すことを示す。図２Ａは、同時飼育した７～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝３～８）から小腸の種々のセグメントを収集し、フローサイトメトリーのために処理したことを示す。左パネル：同時飼育した７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔の十二指腸、空腸および回腸におけるγδＩＥＬの代表的なフローサイトメトリープロット。表示されたプロットは、生きたＴＣＲαβ細胞に対してゲーティングされている。右パネル：７～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔からのγδＩＥＬおよびＣＤ８αα＋ γδＩＥＬの頻度。図２Ｂは、種々の齢数（ｎ＝６～２３匹／群）での回腸γδＩＥＬの頻度を示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。有意性は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって測定され、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５である。図２Ｃは、種々の齢数（ｎ＝６～２３マウス／群）における回腸αβＩＥＬの頻度を示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡによって測定される。図２Ｄは、同時飼育した種々の齢数のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔から回腸を収集して、腸上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を単離し、フローサイトメトリーのために処理したことを示す。左パネル：１２～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔の回腸におけるγδＩＥＬの代表的なフローサイトメトリープロット。右パネル：１２～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔からの回腸γδＩＥＬの頻度。データは、３～６匹／群のマウスを用いる３回の独立した実験からプールした。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する多重非対応ｔ検定を使用して測定され、ＷＴマウスとは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５で有意に異なるとする。図２Ｅは、７～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（ｎ＝３～６匹／群）の粘膜固有層（ＬＰ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓、およびパイエル板におけるγδＴ細胞の頻度を示す。

【図2-2】図２－１の続き。

【図2-3】図２－２の続き。

【図3-1】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、Ｂｔｎｌ２が空腸／回腸γδＩＥＬの増殖を抑制することを示す。ＩＥＬは、同時飼育した１２週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝４～５）の十二指腸および空腸／回腸から単離し、ＣＦＳＥで標識して、ｒｈ ＩＬ－２、ｒｍ ＩＬ７、ｒｍ ＩＬ１５の存在下で、α－ＣＤ３および種々のＦｃ融合物で８４時間刺激した。細胞培養物からの上清を回収し、細胞をフローサイトメトリーのために処理した。図３Ａは、等モル濃度のＢｔｎｌ２－Ｆｃおよび対照ｍＦｃ融合タンパク質の存在下で８４時間培養した後の十二指腸および空腸／回腸ＷＴ ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図３Ｂおよび３Ｃは、Ｆｃ融合物の非存在下での増殖と比較した、特定のＦｃ融合物の存在下とＦｃ融合物の非存在下との間の増殖の差のパーセントとして計算した増殖の抑制を示す。図３Ｂは、十二指腸および空腸／回腸ＷＴ ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬ、ならびにＣＤ８αβ＋αβＩＥＬの増殖の抑制を示す。図３Ｃは、十二指腸および空腸／回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬ、ならびにＣＤ８αβ＋ αβＩＥＬの増殖の抑制を示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して測定し、ｍＦｃ融合タンパク質対照とは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で有意に異なるとする。図３Ｄおよび３Ｅは、同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝４～５）に対して、飲用水中の０．８ｍｇ／ｍＬ ＢｒｄＵを３日間自由に摂取させたことを示す。ＢｒｄＵの取込みを、小腸の異なるセグメント由来のγδＩＥＬの核内染色によって経時的に測定した。図３Ｄは、回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬにおけるＢｒｄＵの取込みの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図３Ｅは、異なるセグメントにわたってのＣＤ８αα＋ γδＩＥＬおよびＣＤ８αβ＋ αβＩＥＬにおけるＢｒｄＵの取込みを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する非対応ｔ検定を使用して測定され、ＷＴとは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で有意に異なるとする。

【図3-2】図３－１の続き。

【図3-3】図３－２の続き。

【図4-1】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬが、回腸ＷＴ γδＩＥＬと比較して、変化した抗菌応答モジュールを示すことを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（ｎ＝３～４／遺伝子型、それぞれマウス２匹のプール）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬを、ＣＤ４５＋ＴＣＲＢ－ＴＣＲγδ＋細胞として選別精製した。ＲＮＡシークエンシングを行い、ＮｅｘｔＢｉｏを使用して遺伝子セットエンリッチメント解析を行った。遺伝子オントロジー（ＧＯ）を使用して、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおいて差次的にエンリッチされたＧＯ生物学的プロセスを同定した。図４Ａは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬ間で差次的に調節される遺伝子を示すｖｏｌｃａｎｏプロットを示す。横方向の破線はＦＤＲ＝０．０５を示し、縦方向の破線は変化倍数＝１．５を示す。図４Ｂは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯとＷＴ γδＩＥＬとの間で差次的に発現された上位５０種の遺伝子の階層的クラスタリングを示す；十二指腸および空腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬならびにＷＴ γδＩＥＬも比較として含めた。図４Ｃは、回腸ＷＴ γδＩＥＬと比較して、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬにおいて最も有意に障害された生物学的プロセスの遺伝子オントロジーエンリッチメント解析を示す。図４Ｄは、組み合わされた上位３種のＧＯプロセスの内部での回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおける上位の調節不全抗菌応答遺伝子の階層的クラスタリングを示し、十二指腸および空腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯならびにＷＴ γδＩＥＬも比較として含めた。

【図4-2】図４－１の続き。

【図4-3】図４－２の続き。

【図4-4】図４－３の続き。

【図5-1】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬが、回腸ＷＴ γδＩＥＬと比較して、より多様なＴＲＧＶレパートリーを呈することを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（ｎ＝３～４／遺伝子型、それぞれマウス２匹のプール）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬを、ＣＤ４５＋ＴＣＲβ－ＴＣＲγδ＋細胞として選別精製した。各試料の３分の２を、ディープバルクＲＮＡシークエンシングのために処理し、各試料の３分の１を、セグメント毎に遺伝子型毎にプールして、単細胞選別および単細胞ＴＣＲシークエンシングに使用した。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（それぞれマウスｎ＝８匹）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬを、単細胞選別し、ＴＣＲ ＶγおよびＴＣＲ Ｖδ鎖の使用ならびにＣＤＲ３アミノ酸配列の単細胞ＴＣＲシークエンシング分析を行った。図５Ａは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおけるＴＲＧＶ＊ＪおよびＴＲＤＶ＊Ｊ遺伝子の使用を示す。ＮＤ－検出されず。図５Ｂ（上パネル）は、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおけるＴＲＧのみのＣＤＲ３アミノ酸配列についての多様度の推定値を示す。網掛け領域は、５０回のブートストラップ反復試験による９５％信頼区間を示す。図５Ｂ（下パネル）は、補間点３５００におけるＴＲＧ多様度の推定値を示し、ｐ値は５０回のブートストラップ反復試験に基づくｔ検定から導出される。図５Ｃは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおける、それぞれＴＲＤのみ、および対になったＴＲＧおよびＴＲＤ ＣＤＲ３アミノ酸配列についての多様度の推定値を示す。網掛け領域は、５０回のブートストラップ反復試験による９５％信頼間隔を示す。図５Ｄは、十二指腸、空腸および回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬの固有のクローンの総数に対して正規化された、それぞれＴＲＧＶおよびＴＲＤＶレパートリーの５０％を構成する上位の固有クローンの数として表される多様度５０（Ｄ５０）指数を示す。

【図5-2】図５－１の続き。

【図5-3】図５－２の続き。

【図5-4】図５－３の続き。

【図5-5】図５－４の続き。

【図5-6】図５－５の続き。

【図6-1】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄおよび６Ｅは、共有されたＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ ＣＤＲ３γクローンの回腸γδＩＥＬトランスクリプトームが、ＣＤＲ３δとの対形成によって形作られることを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（それぞれマウス８匹のプール）由来の回腸γδＩＥＬを単細胞選別し、単細胞ＴＣＲシークエンシングおよび単細胞ＲＮＡシークエンシングを行った。図６Ａは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬ由来であり、回腸ＷＴ γδＩＥＬにおいて差次的にエンリッチされた上位２０種のＴＲＧクローンを示す（ＣＤＲ３γアミノ酸配列を順位の順に右側に列挙し、以下の通りに提供される：ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９）；ＣＳＹＧＬＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３０）；ＣＡＳＷＡＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３１）；ＣＡＳＷＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３２）；ＣＡＶＷＭＲＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３３）；ＣＡＶＷＩＧＴＳＷＶＫＩＦ（配列番号３４）；ＣＡＳＷＡＧＲＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３５）；ＣＡＳＷＡＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３６）；ＣＡＳＷＡＰＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３７）；ＣＡＳＷＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３８）；ＣＡＳＷＡＧＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３９）；ＣＡＳＷＡＤＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４０）；ＣＡＳＷＡＧＧＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４１）；ＣＡＳＷＡＧＫＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４２）；ＣＡＳＷＡＥＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４３）；ＣＡＶＷＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４４）；ＣＡＶＷＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４５）；ＣＡＶＷＮＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４６）；ＣＡＳＷＡＧＤＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４７）；ＣＡＳＷＡＬＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４８））。図６Ｂは、ｓｃＴＣＲｓｅｑ間で同定された上位の最大のＣＤＲ３γクローンが、個々の回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ（ｎ＝３）および回腸ＷＴ（ｎ＝４）試料に見出されることを示しており、その中のＴＣＲ配列がバルクＲＮＡｓｅｑから再構築され、以下のように提供される：ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９）；ＣＡＳＷＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３２）；ＣＡＳＷＡＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３１）；ＣＡＳＷＥＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４９）；ＣＡＳＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号５０）；ＣＡＳＷＡＧＲＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３５）；ＣＡＳＷＡＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３６）；ＣＡＳＷＡＧＨＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号５１）；ＣＡＶＷＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４４）；ＣＡＳＷＡＧＤＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号４７）；ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９）；ＣＳＹＧＬＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３０）；ＣＡＳＷＡＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３１）；ＣＡＳＷＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３２）；ＣＡＶＷＭＲＹＳＧＦＨＫＶＦＦ（配列番号５２）；ＣＡＳＷＡＧＲＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３５）；ＣＡＳＷＡＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３６）；ＣＡＳＷＡＰＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３７）；ＣＡＳＷＶＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号３８）。共有されるクローンは太字で強調表示している。各切片は異なる試料を表し、白の切片は個々の試料にＣＤＲ３γクローンが存在しないことを表す。図６Ｃは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよび回腸ＷＴ γδＩＥＬの両方において、複数のＶγ７－Ｊ１組換えイベントが同じ最上位のＣＤＲ３γアミノ酸配列（ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９））に収束することを示す。図６Ｄは、異なるＵＭＡＰクラスター間で回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよび回腸ＷＴ γδＩＥＬによって共有される最上位のＣＤＲ３γ鎖（ＴＲＧＶ７＊０２／ＴＲＧ１１＊０１、ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９）；全クローンの約１０％）の分布を示す。図６Ｅは、最上位のＣＤＲ３γ（ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９））と、ＵＭＡＰプロットの上に列挙され、γδＩＥＬのトランスクリプトームを形作る、以下の通りに提供される種々のＣＤＲ３δ配列との対形成を示す：ＣＡＬＭＥＲＧＩＳＥＧＹＳＴＤＫＬＶＦ（配列番号５３）；ＣＡＬＷＥＰＩＷＨＩＧＧＩＲＡＴＤＫＬＶＦ（配列番号５４）；ＣＡＬＭＥＲＩＧＬＴＴＤＫＬＶＦ（配列番号５５）；ＡＭＧＴＬＳＥＧＹＥＬＧＤＫＬＶＦ（配列番号５６）；ＣＡＳＧＦＬＷＨＬＹＲＲＤＴＳＰＴＤＫＬＶＦ（配列番号５７）；ＣＡＬＭＥＬＳＥＧＰＡＴＤＫＬＶＦ（配列番号５８）；ＣＡＳＧＹＴＶＷＱＩＧＧＩＲＡＴＤＫＬＶＦ（配列番号５９）；ＣＡＬＳＥＰＳＡＶＤＲＲＤＴＫＴＤＫＬＶＦ（配列番号６０）。対当たりのクローンの数は、ＣＤＲ３γ配列の下に示される。

【図6-2】図６－１の続き。

【図6-3】図６－２の続き。

【図6-4】図６－３の続き。

【図6-5】図６－４の続き。

【図7-1】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆおよび７Ｇは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスが、慢性ＤＳＳ誘発大腸炎においてより重篤な腸炎を示すことを示す。同時飼育した１５週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯ（ｎ＝１１）およびＷＴ（ｎ＝８）同腹仔を、３％ ＤＳＳ誘発大腸炎に７日間供し、その後は水を８日間与えた。対照マウス（ｎ＝２～４）には水を与えた。図７Ａは、上記の日付の初期体重と実際の体重との間の差のパーセントとして計算した、同時飼育したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔における体重減少を示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する非対応ｔ検定を使用して測定され、ＤＳＳ処置ＷＴマウスとは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５で有意に異なるとする。図７Ｂは、第１５日に、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの結腸の長さを示す。図７Ｃは、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス由来の結腸のＨ＆Ｅ組織切片および病理学的スコアを示す。図７Ｄは、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの結腸ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を示す。図７Ｅは、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの結腸ホモジネート中の炎症誘発性サイトカインのレベルを示す。図７Ｆは、β２ｍに対して正規化した、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの結腸ホモジネート中のグランザイムＡ ｍＲＮＡレベルを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する非対応ｔ検定を使用して測定され、＊ｐ＜０．０５とする。図７Ｇは、β２ｍに対して正規化した、水およびＤＳＳで処置したＷＴマウスの結腸におけるＢｔｎｌ１／２／６ ｍＲＮＡレベルを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して測定され、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５とする。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8-1】図８は、Ｂｔｎｌ２隣接遺伝子の発現がＢｔｎｌ２－ＬａｃＺ欠失カセットによって有意には影響されないことを示す。上のパネル－ＵＳＣＳゲノムブラウザに基づくマウスＣｈｒ．１７ｑＢ１座位の概略図であり、Ｂｔｎｌ２座位付近の遺伝子の向きおよび位置を示す。下のパネル：同時飼育した７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝２～４）の小腸の異なるセグメントから単離した腸上皮細胞におけるＢｔｎｌ２座位周辺のＲＮＡｓｅｑリード値（ＴＰＭ）。エラーバーは平均±ＳＥＭを示す。

【図8-2】図８－１の続き。

【図9-1】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、定常状態にあるＢｔｎｌ２－ＫＯマウスが自発的な腸炎を発症しないことを示す。十二指腸、空腸および回腸を、７週齢および１７週齢の同時飼育したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス（それぞれｎ＝４～７）から採取し、ＲＮＡｓｅｑおよび組織学検査のために処理した。図９Ａは、１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔の十二指腸、空腸および回腸の代表的なＨ＆Ｅ染色および組織学的分析を示す。図９Ｂは、１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔の回腸における炎症誘発性サイトカイン（ＴＰＭ）を示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。図９Ｃは、同時飼育した７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの空腸／回腸由来の腸上皮細胞（ＩＥＣ）をＲＮＡｓｅｑのために処理したことを示す。プロットは、腸上皮細胞の分化および成熟に関連する遺伝子において、ＷＴリードと比較したＢｔｎｌ２－ＫＯリードの変化倍数（グレーのバー）およびそれらの対応するｐ値（黒線）を表す。

【図9-2】図９－１の続き。

【図9-3】図９－２の続き。

【図10-1】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、定常状態にあるＢｔｎｌ２－ＫＯマウスが、小腸において同等の免疫表現型を呈することを示す。回腸、パイエル板および腸間膜リンパ節を、同時飼育した７～１７週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯマウスおよびＷＴマウス（各ｎ＝３～１３、１～３回の別々の実験のプール）から採取し、フローサイトメトリーのために処理した。図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、回腸粘膜固有層（図１０Ａ）、腸間膜リンパ節（図１０Ｂ）およびパイエル板（図１０Ｃ）の内部での主要なリンパ球サブセットの頻度を示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、同程度のＳＤを仮定する非対応ｔ検定を使用して測定され、ＷＴとは＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５で有意に異なるとする。Ｔｒｅｇ、制御性Ｔ細胞。ＤＣ、樹状細胞。ＩＬＣ３、自然リンパ球系細胞３型。樹状細胞は、系列（ＴＣＲβ、Ｂ２２０およびＬｙ６ｃ）陰性細胞に対してゲーティングされる。ＩＬＣ３細胞は、系列（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ１、Ｂ２２０、ＴＣＲβおよびＮＫ１．１）陰性細胞に対してもゲーティングされる。

【図10-2】図１０－１の続き。

【図10-3】図１０－２の続き。

【図11-1】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、Ｂｔｎｌ２がインビトロで、Ｐｄｌ１およびＰｄｌ２と同程度にＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制することを示す。１０～１２週齢のＷＴマウス（各ｎ＝５）の脾臓およびリンパ節から全ＣＤ４＋ Ｔ細胞をエンリッチして、ＣＦＳＥで標識し、種々のＦｃ融合物の存在下でα－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８により７２時間刺激した。７２時間後に培養上清を回収し、細胞をフローサイトメトリーのために処理した。図１１Ａは、インビトロＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖アッセイの概略図を示す。図１１Ｂは、７２時間の培養後のＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖の活性化および抑制を示す一連のグラフを示す。活性化は、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度として表される。増殖の抑制は、Ｆｃ融合物の非存在下での増殖と比較した、特定のＦｃ融合物の存在下とＦｃ融合物の非存在下との間の増殖の差のパーセントとして計算される。図１１Ｃは、α－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８および等モル濃度のＦｃ融合タンパク質との７２時間のＣＤ４＋ Ｔ細胞培養物に由来する上清中の炎症誘発性サイトカインのレベルを示す。図１１Ｄは、α－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８刺激から７２時間後の活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＢｔｎｌ２受容体と推定されるものの染色および蛍光強度の中央値を示すヒストグラムを示す。右パネル－Ｆｃ融合物について染色したＣＤ４＋ Ｔ細胞の蛍光強度の中央値。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。多重比較用のＴｕｋｅｙの検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図11-2】図１１－１の続き。

【図11-3】図１１－２の続き。

【図12-1】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、空腸／回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬが、共阻害受容体ならびに成熟および活性化のマーカーについて同等の発現レベルを呈することを示す。ＩＥＬを同時飼育した１２～１３週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ（それぞれマウス６匹のプール）の空腸／回腸から単離し、ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎマウス細胞抗体パネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ）で染色することによってフローサイトメトリーのために処理した。細胞はＣＤ４５＋ＴＣＲＢ－ＴＣＲγδ＋ＣＤ８αα＋に対してゲーティングされる。図１２Ａは、インビトロＩＥＬ増殖アッセイの概略図を示す。図１２Ｂは、等モル濃度のＢｔｎｌ２－Ｆｃおよび対照ｍＦｃ融合タンパク質の存在下で８４時間培養した後の十二指腸および空腸／回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１２Ｃは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬに対する成熟、活性化および共阻害受容体のヒストグラムを示す。ＭＦＩ、平均蛍光強度。

【図12-2】図１２－１の続き。

【図12-3】図１２－２の続き。

【図12-4】図１２－３の続き。

【図13-1】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬが、小腸セグメントにわたって多様なＴＲＧＶおよびＴＲＤＶレパートリーを有することを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（ｎ＝３～４／遺伝子型、それぞれマウス２匹のプール）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬを、ＣＤ４５＋ＴＣＲＢ－ＴＣＲγδ＋細胞として選別精製した。各試料の３分の２を、ディープバルクＲＮＡシークエンシングのために処置し、各試料の３分の１を、セグメント毎に遺伝子型毎にプールして、単細胞選別および単細胞ＲＮＡシークエンシングに使用した。図１３Ａおよび１３Ｂは、すべての固有のＣＤＲ３γ（図１３Ａ）またはＣＤＲ３δ（図１３Ｂ）アミノ酸配列／組合せ試料のツリーマップレンダリングを示し、ここでボックスのサイズはＣＤＲ３γまたはＣＤＲ３δクローンのサイズに対応し、ＴＲＧＶ１＿ＴＲＧＪ４、ＴＲＧＶ２＿ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＶ３＿ＴＲＧＪ３、ＴＲＧＶ４＿ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＶ５＿ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＶ６＿ＴＲＧＪ１、およびＴＲＧＶ７＿ＴＲＧＪ１（図１３Ａ）；ならびにＴＲＡＶ１３／ＤＶ７＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＡＶ１３／ＤＶ３＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＡＶ１５／ＤＶ５＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＡＶ５／ＤＶ３＿ＴＲＤＪ２、ＴＲＡＶ１６／ＤＶ１１＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＡＶ２１／ＤＶ１２＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＡＶ２１／ＤＶ１２＿ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＶ１＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＶ１＿ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＶ２＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＶ２＿ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＶ４＿ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＶ４＿ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＶ５＿ＴＲＤＪ１、およびＴＲＤＶ５＿ＴＲＤＪ２を含む、使用したＴＲＧＶ／ＴＲＧＪまたはＴＲＤＶ／ＴＲＤＪ遺伝子が示されている。図１３Ｃは、セグメント毎の重複するＣＤＲ３γおよびＣＤＲ３δクローンの数を示すベン図を示す。図１３Ｄは、遺伝子型毎の重複するＣＤＲ３γおよびＣＤＲ３δクローンの数を示すベン図を示す。

【図13-2】図１３－１の続き。

【図13-3】図１３－２の続き。

【図14-1】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ＣＤＲ３γ／ＣＤＲ３δクローンレパートリーが、各小腸セグメントおよび遺伝子型に固有であることを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（ｎ＝３～４／遺伝子型、それぞれマウス２匹のプール）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬを、ＣＤ４５＋ＴＣＲ８－ＴＣＲγδ＋細胞として選別精製した。各試料の３分の２を、ディープバルクＲＮＡシークエンシングのために処理し、各試料の３分の１を、セグメント毎に遺伝子型毎にプールして、単細胞選別および単細胞ＲＮＡシークエンシングに使用した。図１４Ａは、ＣＤＲ３γおよびＣＤＲ３δアミノ酸配列／組合せ試料のすべての固有の対のツリーマップレンダリングを示し、ここでボックスのサイズは、対になったＣＤＲ３γ／ＣＤＲ３δクローンのサイズに対応し、ＴＲＧＶ１＿ＴＲＧＪ４、ＴＲＧＶ２＿ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＶ３＿ＴＲＧＪ３、ＴＲＧＶ４＿ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＶ５＿ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＶ６＿ＴＲＧＪ１およびＴＲＧＶ７＿ＴＲＧＪ１を含む、使用したＴＲＧＶ／ＴＲＧＪ遺伝子が示されている。図１４Ｂは、セグメント毎の重複する対になったＣＤＲ３γ／ＣＤＲ３δクローンの数を示すベン図を示す。図１４Ｃは、遺伝子型毎の重複する対になったＣＤＲ３γ／ＣＤＲ３δクローンの数を示すベン図を示す。

【図14-2】図１４－１の続き。

【図15-1】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、γδＩＥＬを、発生上の起源、分化段階およびエフェクタープロファイルに基づいて、異なるクラスターに細分し得ることを示す。同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔（それぞれマウス８匹のプール）の十二指腸、空腸および回腸由来のγδＩＥＬ（ＣＤ４５＋ＴＣＲβ－ＴＣＲγδ＋）を単細胞選別して、単細胞ＲＮＡシークエンシングおよび単細胞ＴＣＲシークエンシングを行った。図１５Ａは、細胞４４００個／セグメント／遺伝子型を上回る遺伝子発現の差に基づいて９つの異なるクラスターを表すクラスターを有する組合せＵＭＡＰプロットを示す。右パネル－各クラスターに分離される選別されたＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬ単細胞の割合。図１５Ｂは、単細胞ＲＮＡシークエンシングを行った十二指腸、空腸および回腸のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬの個々のＵＭＡＰクラスター化を示す。図１５Ｃは、全単細胞集団における発現と比較した、クラスター０～７における上位２０種の遺伝子およびそれらの平均エンリッチメント変化倍数（ＦＣ）を示す。図１５Ｄは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおける種々のクラスター中でのＴＲＧＶ遺伝子使用頻度を示す。

【図15-2】図１５－１の続き。

【図15-3】図１５－２の続き。

【図15-4】図１５－３の続き。

【図16-1】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスが、慢性ＤＳＳ誘発大腸炎においてＷＴマウスと同等の回腸免疫応答を呈することを示す。同時飼育した１５週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯ（ｎ＝１１）およびＷＴ（ｎ＝８）同腹仔を、３％ ＤＳＳ誘発大腸炎に７日間供し、その後は水を８日間与えた。対照マウス（ｎ＝２～４）には水を与えた。図１６Ａは、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの回腸ホモジネート中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を示す。図１６Ｂは、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの回腸ホモジネート中の炎症誘発性サイトカインの転写レベルを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して測定され、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５とする。図１６Ｃは、β２ｍに対して正規化した、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの回腸ホモジネート中のグランザイムＡ ｍＲＮＡレベルを示す。図１６Ｄは、β２ｍに対して正規化した、水およびＤＳＳで処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの回腸ホモジネート中のＢｔｎｌ１／２／６ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図16-2】図１６－１の続き。

【図17-1】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｄは、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞活性化のＢｔｎｌ２媒介性阻害が、α－ＣＤ３／α－ＣＤ２８置換えとは無関係であることを示す。全ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、１０～１２週齢のＷＴマウス（各ｎ＝５）の脾臓およびリンパ節からエンリッチし、ＣＦＳＥで標識して、種々のＦｃ融合物の存在下で、α－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８により７２時間刺激した。７２時間後に培養上清を回収し、細胞をフローサイトメトリーのために処理した。図１７Ａは、Ｆｃ融合タンパク質によるα－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８の同時または連続的コーティングを用いたインビトロＣＤ４^＋ Ｔ細胞増殖アッセイの概略図を描写している。図１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｄは、７２時間の培養後のＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖の活性化および抑制を示すグラフを示す。活性化は、ＣＤ４４^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の頻度として表される。増殖の抑制は、最大の増殖と比較した、特定のＦｃ融合物の存在下とＦｃ融合物の非存在下との間の増殖の差のパーセントとして計算される。図１７Ｂは、等モル数のＦｃ融合タンパク質による同時コーティングを示す。図１７Ｃは、等モル数のＦｃ融合タンパク質による逐次コーティングを示す。図１７Ｄは、最大質量のＦｃ融合タンパク質による同時コーティングを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。多重比較用のＴｕｋｅｙ検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対照群はＦｃ（ＩｇＧ２ａ）である。

【図17-2】図１７－１の続き。

【図18-1】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＢＴＮＬ２がインビトロで、ＰＤＬ１と同等にデノボＣＤ１０３^＋ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の分化を誘導することを示す。ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、１０～１２週齢のＷＴマウス（各ｎ＝３～４）の脾臓およびリンパ節からエンリッチし、種々のＦｃ融合物および系列スキューイングサイトカインの存在下で、α－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８により５日間刺激した。５日後に培養上清を回収し、細胞をフローサイトメトリーのために処理した。図１８Ａは、インビトロＣＤ４^＋ Ｔヘルパー細胞分化アッセイの概略図を示す。図１８Ｂは、ＩＬ－２、ＴＧＦβ１および種々のＦｃ融合タンパク質の存在下での５日間の分化後のＣＤ１０３^＋およびＣＤ１０３^－ＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞の頻度を示すグラフを示す。図１８Ｃは、ＩＬ－２およびＴＧＦβ１、ならびに種々のＦｃ融合タンパク質の存在下における１５時間時点での刺激されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路キナーゼ染色および蛍光強度の中央値を示すヒストグラムを示す。図１８Ｄは、ＩＬ－２および種々の濃度のＴＧＦβ１の存在下における２０分時点での分化した制御性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のＳＴＡＴ１／５リン酸化および蛍光強度の中央値を示すヒストグラムを示す。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。多重比較用のＴｕｋｅｙ検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対照群はＦｃ（ＩｇＧ２ａ）である。

【図18-2】図１８－１の続き。

【図18-3】図１８－２の続き。

【図19-1】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅおよび１９Ｆは、Ｂｔｎｌ２がインビトロで、ＰＤＬ１と同様にＴｈ１７細胞の分化をＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞の分化にスキューイングすることを示す。１０～１２週齢のＷＴマウス（各ｎ＝３～４）の脾臓およびリンパ節からナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞をエンリッチし、種々のＦｃ融合物および系列スキューイングサイトカインの存在下で、α－ＣＤ３またはα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８により５日間刺激した。５日後に培養上清を回収し、細胞をフローサイトメトリーのために処理した。図１９Ａおよび１９Ｅは、（図１９Ａ）ＩＬ－２、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－２３、または（図１９Ｅ）ＩＬ－２、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６、ＩＬ－１βおよびＩＬ－２３、ならびに種々のＦｃ融合タンパク質の存在下における５日時点での分化後のＴｈ１７細胞およびＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞サブセットの頻度を示すグラフを示す。図１９Ｂおよび１９Ｆは、（図１９Ｂ）ＩＬ－２、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－２３、または（図１９Ｆ）ＩＬ－２、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６、ＩＬ－１βおよびＩＬ－２３、ならびに種々のＦｃ融合タンパク質の存在下における１５時間時点での刺激されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路キナーゼ染色および蛍光強度の中央値を示すヒストグラムを示す。図１９Ｃは、示されたサイトカインの存在下における２０分時点での分化したＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のＳＴＡＴ１／５リン酸化および蛍光強度の中央値を示すヒストグラムを示す。図１９Ｄは、ＩＬ－２、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－２３、ならびに種々のＦｃ融合タンパク質の存在下での５日間のＴｈ１７細胞分化後の炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルを示す。エラーバーは平均^＋／－ＳＥＭを表す。多重比較用のＴｕｋｅｙの検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対照群はＦｃ（ＩｇＧ２ａ）である。

【図19-2】図１９－１の続き。

【図19-3】図１９－２の続き。

【図20A】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＤＳＳ誘発大腸炎を有するＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおけるＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合タンパク質による処置の効果を示す、例示的な実施形態を説明している。Ｂｔｎｌ２ ＫＯマウスおよび同時飼育したＷＴ同腹仔を、３％ ＤＳＳを６日間投与することによって慢性ＤＳＳ誘発大腸炎に供し、その後は水を６日間与えた。対照マウス（ｎ＝３）には通常の水を与えた。ｍＢＴＮＬ２－ＦｃおよびｍＦｃを、第－１日、第１日、第４日、第７日および第１１日に２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおける体重減少を示す。データは１回の実験の代表値である。処置群当たりマウスｎ＝８～１０匹。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによる決定で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対照群はＦｃである。

【図20B】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＤＳＳ誘発大腸炎を有するＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおけるＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合タンパク質による処置の効果を示す、例示的な実施形態を説明している。Ｂｔｎｌ２ ＫＯマウスおよび同時飼育したＷＴ同腹仔を、３％ ＤＳＳを６日間投与することによって慢性ＤＳＳ誘発大腸炎に供し、その後は水を６日間与えた。対照マウス（ｎ＝３）には通常の水を与えた。ｍＢＴＮＬ２－ＦｃおよびｍＦｃを、第－１日、第１日、第４日、第７日および第１１日に２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおける体重減少を示す。データは１回の実験の代表値である。処置群当たりマウスｎ＝８～１０匹。エラーバーは平均＋／－ＳＥＭを表す。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによる決定で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対照群はＦｃである。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本開示は、炎症性障害を処置するための方法および試薬を提供し、これは一部には、ブチロフィリン様２（Ｂｔｎｌ２）が、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）、例えば、腸γδＩＥＬの発生および維持を調節するという予想外の発見に基づく。組織常在性のγδＩＥＬは、自然免疫応答および適応免疫応答の両方を調整して、腸上皮バリアの完全性を維持する。上皮特異的なブチロフィリン様（Ｂｔｎｌ）分子は、異なる複数のＶγＴＣＲ^＋ ＩＥＬの周産期発生を誘導する。しかし、個別の腸セグメントの内部でγδＩＥＬの維持を制御する機構は不明である。本開示は、Ｂｔｎｌ２が、回腸などの小腸セグメントにおいて、γδＩＥＬの恒常的な増殖を選好的に抑制することを実証する。小腸の種々のセグメントから単離されたＢｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬのハイスループット・トランスクリプトーム特徴付けにより、Ｂｔｎｌ２が回腸γδＩＥＬの抗菌応答モジュールを調節することが明らかになった。Ｂｔｎｌ２欠損により、回腸γδＩＥＬのＴＣＲ特異性およびＴＣＲγ／δレパートリーの多様性が、それらの局所抗原環境に同調するように再形成された。慢性ＤＳＳ誘発大腸炎の間、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは、結腸における炎症の増加および粘膜修復の遅延を示した。以上をまとめると、これらのデータにより、Ｂｔｎｌ２が、部位特異的なホメオスタシスおよび炎症の手がかりに応答して、γδＩＥＬの頻度および機能、ならびにＴＣＲの特異性を微調整することが示された。したがって、ＩＥＬ（例えば、γδＩＥＬ）の発生および維持のＢｔｎｌ媒介性標的化は、腸管セグメント特異的な症状を伴う腸疾患におけるそれらの免疫機能を分析するのに役立つと考えられる。

【0033】

ａ．炎症性障害を処置する方法
一態様では、本開示は、炎症性障害を処置する方法であって、炎症性障害を有し、かつ所定の基準値と比較して上皮内リンパ球（ＩＥＬ）のレベルが上昇している対象を選択すること；および対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることによって対象におけるＩＥＬの増殖を減少させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0034】

一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの機能喪失型一塩基多型（ＳＮＰ）を、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、機能喪失型ＳＮＰを、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する。ｒｓ２８３６２６７５は、位置ｃｈｒ６：３２３９４７４４（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）にＳＮＰを含む。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらすｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、機能喪失型ＳＮＰを、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらすｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらすｒｓ２８３６２６７５に有する。

【0035】

一部の実施形態では、本方法は、（ａ）ＩＥＬを含む試料を得ること；（ｂ）試料に対してアッセイを行って、試料中のＩＥＬの数を決定すること；（ｃ）所定の基準値と比較してＩＥＬの数が増加している対象を同定すること；および（ｄ）対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることによって対象におけるＩＥＬの数を調節する（例えば、減少させる）ことができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与することを含む。

【0036】

一部の実施形態では、リンパ球は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または組織特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0037】

一部の実施形態では、炎症性障害は、腸の炎症性障害である。一部の実施形態では、炎症性障害は、免疫媒介性疾患、例えば、免疫媒介性炎症性障害である。一部の実施形態では、炎症性障害は自己免疫疾患である。一部の実施形態では、炎症性障害は、腸管関連の免疫媒介性疾患または腸管関連の自己免疫疾患である。一部の実施形態では、免疫媒介性疾患または腸管関連の自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、腸症状を伴うかまたは伴わないＧＶＨＤ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、筋炎、炎症性腸疾患、胃腸炎、またはＩ型糖尿病を含む。腸症状の非限定的な例には、悪心、食欲不振、膨満感、消化不良、ガス、腹部膨満、下痢、疼痛、体重減少、および／または腸の苦痛の他の考えられる徴候が含まれる。

【0038】

一部の実施形態では、上記の方法は、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルもしくは活性、または腸γδＩＥＬの数を決定することを含む。決定されたＢｔｎｌ２のレベルもしくは活性、または決定された腸γδＩＥＬの数を、Ｂｔｎｌ２作用物質もしくはその組成物を対象に投与する前のＢｔｎｌ２のレベルもしくは活性もしくは腸γδＩＥＬの数、または所定の基準値と比較することができる。

【0039】

Ｂｔｎｌ２のレベルまたは活性は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定するかまたは推定することによって測定することができる。タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定するかまたは推定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｂｔｎｌ２のタンパク質レベル（例えば、タンパク質発現レベル）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、または免疫アッセイ（例えば、免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ）によって決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ－ＰＣＲによって決定することができる。

【0040】

本明細書で使用される場合、「所定の基準値」という用語は、以下のいずれかであってよい基準値を指す：（ａ）Ｂｔｎｌ２もしくはその組成物のレベルもしくは活性を上昇させるための作用物質の投与前に対象から得られるもの；（ｂ）炎症性障害（例えば、腸管関連の炎症性障害、例えば、ＩＢＤ）を有しないか、もしくは炎症性障害と診断されていない対照対象もしくは個人のグループ（この場合、平均値が基準値として使用される）から得られるもの；（ｃ）対照集団、例えば、炎症性障害に罹患していない集団におけるＢｔｎｌ２のレベルもしくは活性の平均レベルもしくはＩＥＬ（例えば、γδＩＥＬ、例えば、腸γδＩＥＬ）の数に基づいて得られるもの；または（ｄ）炎症性障害を有する患者が含まれる個人のセットの中央値または中央値レベルに基づいて得られるもの。

【0041】

一部の実施形態では、所定の基準値を、Ｂｔｎｌ２またはその組成物のレベルまたは活性を上昇させるための作用物質の投与に先立って、対象から得ることができる。一部の実施形態では、所定の基準値を、炎症性障害（例えば、腸管関連の炎症性障害、例えば、ＩＢＤ）を有しないか、または炎症性障害と診断されていない対照対象または個人のグループから得ることができる。一部の実施形態では、所定の値は、対照集団、例えば、炎症性障害に罹患していない集団におけるＢｔｎｌ２のレベルもしくは活性またはＩＥＬ（例えば、γδＩＥＬ、例えば、腸γδＩＥＬ）の数の平均レベルに基づいて得られる。一部の実施形態では、所定の値は、炎症性障害を有する患者が含まれる個人のセットの中央値または中央値レベルに基づいて得られる。

【0042】

一部の実施形態では、所定の基準値は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１３０７７１８６Ａ１に記載されているように、フローサイトメトリー（例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ））、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＩＥＬの数を分析することによって決定することができる。一部の実施形態では、ＩＥＬ（例えば、空腸ＩＥＬ、回腸ＩＥＬ、結腸ＩＥＬ）の数は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、ＤｅＰａｏｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｍａｒ １０；４７１（７３３７）：２２０～２４に記載されているように、腸上皮細胞１００個当たりのＩＥＬの数（「ＩＥＬ／１００」）として計数して表現することができる。一部の実施形態では、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｏｓｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ ２０１７；６６：２０８０～８６に記載されているように、腸上皮細胞１００個当たりのＩＥＬの数（「ＩＥＬ／１００」）として計数して表現される、ＩＥＬの数の所定の参照値。

【0043】

本明細書で使用される場合、「増加させる」、「上昇させる」、「上昇した」、「強化する」、および「活性化する」という用語はすべて、一般に、参照レベルと比較した、静的に有意な量での増加を指す。

【0044】

不確かさを避けるために、これらの用語は、参照レベルと比較して、少なくとも５％（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％）の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の増加を意味する。一部の実施形態では、これらの用語は、参照レベルと比較して、１０～２０％、１０～３０％、１０～４０％、１０～５０％、１０～６０％、１０～７０％、１０～８０％、１０～９０％、１０～１００％、１０～１１０％、１０～１２０％、１０～１３０％、１０～１４０％、１０～１５０％、１０～１６０％、１０～１７０％、１０～１８０％、１０～１９０％、１０～２００％、１０～２１０％、１０～２２０％、１０～２３０％、１０～２４０％、１０～２５０％、１０～２６０％、１０～２７０％、１０～２８０％、１０～２９０％、または１０～３００％の増加を指すことができる。一部の実施形態では、これらの用語は、参照レベルと比較して、１０～３００％、２０～３００％、３０～３００％、４０～３００％、５０～３００％、６０～３００％、７０～３００％、８０～３００％、９０～３００％、１００～３００％、１１０～３００％、１２０～３００％、１３０～３００％、１４０～３００％、１５０～３００％、１６０～３００％、１７０～３００％、１８０～３００％、１９０～３００％、２００～３００％、２１０～３００％、２２０～３００％、２３０～３００％、２４０～３００％、２５０～３００％、２６０～３００％、２７０～３００％、２８０～３００％、または２９０～３００％の増加を指すことができる。一部の実施形態では、これらの用語は、参照レベルと比較して、少なくとも２倍への、少なくとも３倍への、少なくとも４倍への、少なくとも５倍への、少なくとも１０倍への、またはそれ以上の増加を指すことができる。

【0045】

一部の実施形態では、本方法は、所定の基準値と比較して上昇したレベルのＩＥＬを有する対象を同定または選択することを含み得る。「所定の値」および「所定のレベル」という用語は、本明細書で互換的に使用される。同様に、「基準値」および「基準レベル」という用語は、本明細書で互換的に使用される。所定の基準値と比較したＩＥＬの上昇したレベルは、所定の基準値と比較して、少なくとも５％（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％）の増加、例えば、所定の基準値と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％の増加、もしくは１０％～１００％の任意の増加；または所定の基準値と比較して、少なくとも２倍への、少なくとも３倍への、少なくとも４倍への、少なくとも５倍への、もしくは少なくとも１０倍への増加、もしくは２倍～１０倍もしくはそれ以上への任意の増加であり得る。

【0046】

一部の実施形態では、所定の基準値と比較したＩＥＬの「上昇した」レベルは、所定の基準値と比較して、１０～２０％、１０～３０％、１０～４０％、１０～５０％、１０～６０％、１０～７０％、１０～８０％、１０～９０％、１０～１００％、１０～１１０％、１０～１２０％、１０～１３０％、１０～１４０％、１０～１５０％、１０～１６０％、１０～１７０％、１０～１８０％、１０～１９０％、１０～２００％、１０～２１０％、１０～２２０％、１０～２３０％、１０～２４０％、１０～２５０％、１０～２６０％、１０～２７０％、１０～２８０％、１０～２９０％、または１０～３００％の増加であり得る。一部の実施形態では、所定の基準値と比較したＩＥＬの上昇したレベルは、所定の基準値と比較して、１０～３００％、２０～３００％、３０～３００％、４０～３００％、５０～３００％、６０～３００％、７０～３００％、８０～３００％、９０～３００％、１００～３００％、１１０～３００％、１２０～３００％、１３０～３００％、１４０～３００％、１５０～３００％、１６０～３００％、１７０～３００％、１８０～３００％、１９０～３００％、２００～３００％、２１０～３００％、２２０～３００％、２３０～３００％、２４０～３００％、２５０～３００％、２６０～３００％、２７０～３００％、２８０～３００％、または２９０～３００％の増加であり得る。一部の実施形態では、所定の基準値と比較したＩＥＬの上昇したレベルは、所定の基準値と比較して、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、１００～１１０％、１１０～１２０％、１２０～１３０％、１３０～１４０％、１４０～１５０％、１５０～１６０％、１６０～１７０％、１７０～１８０％、１８０～１９０％、１９０～２００％、２００～２１０％、２１０～２２０％、２２０～２３０％、２３０～２４０％、２４０～２５０％、２５０～２６０％、２６０～２７０％、２７０～２８０％、２８０～２９０％、または２９０～３００％の増加であり得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「減少させる」、「低下させる」、および「阻害する」という用語はすべて、一般に、統計的に有意な量での減少を指す。しかし、不確かさを避けるために、「低下した」、「減少させる」、「低下させる」、または「阻害する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも５％（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％）の減少、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約１０％の減少、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または最大で１００％（例えば、参照試料と比較して存在しないレベル）を含む減少、または１０～１００％の任意の減少を意味する。一部の実施形態では、これらの用語は、参照レベルと比較して、１０～２０％、１０～３０％、１０～４０％、１０～５０％、１０～６０％、１０～７０％、１０～８０％、１０～９０％、１０～１００％、１０～１１０％、１０～１２０％、１０～１３０％、１０～１４０％、１０～１５０％、１０～１６０％、１０～１７０％、１０～１８０％、１０～１９０％、１０～２００％、１０～２１０％、１０～２２０％、１０～２３０％、１０～２４０％、１０～２５０％、１０～２６０％、１０～２７０％、１０～２８０％、１０～２９０％、または１０～３００％の減少を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、１０～３００％、２０～３００％、３０～３００％、４０～３００％、５０～３００％、６０～３００％、７０～３００％、８０～３００％、９０～３００％、１００～３００％、１１０～３００％、１２０～３００％、１３０～３００％、１４０～３００％、１５０～３００％、１６０～３００％、１７０～３００％、１８０～３００％、１９０～３００％、２００～３００％、２１０～３００％、２２０～３００％、２３０～３００％、２４０～３００％、２５０～３００％、２６０～３００％、２７０～３００％、２８０～３００％、または２９０～３００％の減少を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、参照レベルと比較して、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、１００～１１０％、１１０～１２０％、１２０～１３０％、１３０～１４０％、１４０～１５０％、１５０～１６０％、１６０～１７０％、１７０～１８０％、１８０～１９０％、１９０～２００％、２００～２１０％、２１０～２２０％、２２０～２３０％、２３０～２４０％、２４０～２５０％、２５０～２６０％、２６０～２７０％、２７０～２８０％、２８０～２９０％、または２９０～３００％の減少を指す。

【0048】

「対象」および「患者」という用語は、対象が何らかの形態の処置を受けたことがあるか、または現在受けているかにかかわらず、本明細書で互換的に使用することができる。これらの用語は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス）、非ヒト霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル、チンパンジーなど）、およびヒトを含むが、これらに限定されない任意の脊椎動物を指すことができる。対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。より例示的な態様では、哺乳動物はヒトである。

【0049】

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」または「それを必要とする患者」という表現は、炎症性障害（例えば、腸管関連の炎症性障害）の１つまたはそれ以上の症状または徴候を呈する、および／または炎症性障害と診断されたヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0050】

「処置」、「処置する」、「緩和する」、または「改善する」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。これらの用語は、限定されるものではないが、治療上の利益および／または予防上の利益を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置下にある１つまたはそれ以上の疾患（例えば、炎症性疾患）、状態、または症状における処置に関連する改善または効果を意味する。予防上の利益について、作用物質またはその組成物は、特定の疾患、状態、もしくは症状を発症するリスクのある対象に、または疾患、状態、もしくは症状がまだ発現していない場合であっても、疾患の１つもしくはそれ以上の生理学的症状を報告している対象に投与することができる。

【0051】

「試料」、「試験試料」、および「患者試料」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。試料は、血清、尿血漿、羊水、脳脊髄液、細胞、または組織の試料であり得る。そのような試料は、患者から得られたまま直接使用することもでき、または、本明細書で考察されるような何らかの様式で、もしくは当技術分野で公知の他の方法で試料の特性を改変するために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などによって前処理することもできる。本明細書で使用される「試料」および「生物学的試料」という用語は、一般に、目的の分析物、例えば、抗体を含むことについて試験される、および／またはその疑いのある生物学的材料を指す。試料は、対象からの任意の組織試料であってもよい。試料は、対象由来のタンパク質を含んでもよい。

【0052】

別の態様では、本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法であって、（ａ）ＩＢＤを有し、かつ少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に有する対象を選択すること；および（ｂ）対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0053】

一部の実施形態では、対象は、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらす少なくとも１つの機能喪失型ＳＮＰをｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、機能喪失型ＳＮＰを、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらすｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、対象は、１つの機能喪失型ＳＮＰを、Ｇｌｕ４５４Ｔｅｒ（終止コドン）突然変異をもたらすｒｓ２８３６２６７５に有する。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。

【0054】

一部の実施形態では、本方法は、（ｉ）核酸を含む試料を対象から得ること；（ｉｉ）試料を分析して、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つの）機能喪失型ＳＮＰの存在を検出すること；（ｉｉｉ）Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つの）機能喪失型ＳＮＰを有する対象を、炎症性腸疾患を有するかまたは発症するリスクが高いものとして同定すること；および（ｉｖ）対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができるＢｔｎｌ２作用物質の治療有効量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、試料を分析する工程は、試料に対して遺伝子型判定アッセイを行うことを含む。

【0055】

別の態様では、本開示は、ＩＢＤを有するかまたは発症するリスクが高い対象を同定する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本方法は、（ｉ）核酸を含む試料を対象から得ること；（ｉｉ）試料を分析して、Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つの）機能喪失型ＳＮＰの存在を検出すること；および（ｉｉｉ）Ｂｔｎｌ２遺伝子におけるｒｓ２８３６２６７５に少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つの）機能喪失型ＳＮＰを有する対象を、ＩＢＤを有するかまたは発症するリスクが高いものとして同定することを含む。

【0056】

一部の実施形態では、試料を分析する工程は、試料に対して遺伝子型判定アッセイを行うことを含む。

【0057】

別の態様では、本開示はまた、対象におけるＩＥＬの数を減少させる方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、Ｂｔｎｌ２作用物質が、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる、方法も提供する。

【0058】

一部の実施形態では、リンパ球は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または組織特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0059】

ｂ．炎症性障害を処置するためのＢｔｎｌ２作用物質
一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。

【0060】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２－Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来し得る免疫グロブリンＦｃ断片である。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインは、ドメインのハイブリッドであることができ、各ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有し得る。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片は、同じ起源を有するドメインを含む一本鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体であり得る。ＩｇＧは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスに分けることができ、それらの組合せまたはハイブリッドを含むことができる。

【0061】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0062】

【表1-1】

【表1-2】

【0063】

本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、第２の分子（「親」分子とも呼ばれる）に関連する第１の分子を指す。変異体分子は、親分子に由来すること、親分子から単離されること、親分子に基づくこと、または親分子と相同であることができる。変異体分子は、親分子の断片を含むことができる。例えば、システイン置換を有するＢｔｎｌ２突然変異体を含むＢｔｎｌ２の変異体形態は、野生型Ｂｔｎｌ２の変異体である。変異体という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかを記述するために使用することができる。

【0064】

タンパク質に適用される場合、変異体ポリペプチドは、元の親ポリペプチドと完全なアミノ酸配列同一性を有することもでき、または親タンパク質に対して１００％未満のアミノ酸同一性を有することもできる。例えば、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。ポリペプチド変異体には、親ポリペプチド全体を含み、追加の融合アミノ酸配列をさらに含むポリペプチドが含まれる。また、ポリペプチド変異体には、親ポリペプチドの部分または部分配列であるポリペプチド、例えば、本明細書に開示されるポリペプチドの特有の部分配列（例えば、標準的な配列比較およびアラインメント手法によって決定されるもの）も、本開示の範囲に含まれる。

【0065】

一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも５０％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも６０％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも７０％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも８０％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも９０％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも９５％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも９８％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列の変異体は、元のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が少なくとも９９％またはそれ以上同一である第２のアミノ酸配列であり得る。

【0066】

別の態様では、ポリペプチド変異体は、親アミノ酸配列に対して軽微な、些細な、または重要でない変化を含むポリペプチドを含む。例えば、軽微な、些細な、または重要でない変化には、ポリペプチドの生物学的活性にほとんどまたは全く影響を及ぼさず、非機能性ペプチド配列の付加を含む、機能的に同一なポリペプチドを生じるアミノ酸変化（置換、欠失、および挿入を含む）が含まれる。他の態様では、本開示の変異体ポリペプチドは、親分子の生物学的活性を変化させる。当業者は、開示されたポリペプチドの多くの変異体が本開示の範囲に含まれることを理解するであろう。

【0067】

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置のわずかな比率、例えば、典型的には約１０％未満、約５％未満、４％未満、２％未満または１％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。

【0068】

一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の約１０％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の約５％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の約４％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の約２％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の約１％未満を変化、付加または欠失させる変異体分子を含むことができる。

【0069】

本明細書で使用されるタンパク質の「機能的変異体」は、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持する、そのようなタンパク質の変異体を指す。機能的変異体には、多型を含む突然変異体（それは挿入、欠失、または置換突然変異体であり得る）などが含まれる。また、機能的変異体には、そのようなタンパク質と、別の、通常は無関係な核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物も含まれる。機能的変異体は、天然に存在するものでもよく、または人工的なものであってもよい。

【0070】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２変異体は、１つまたはそれ以上の保存的改変を含むことができる。１つまたはそれ以上の保存的改変を有するＢｔｎｌ２変異体は、所望の機能的特性を保持し得る可能性があり、これは当技術分野で公知の機能的アッセイを使用して試験することができる。本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸改変であって、そのアミノ酸配列を含むタンパク質の結合特性に重大な影響を及ぼさないかまたは変化させないものを指す。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、当技術分野で公知の標準的な手法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するもの（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するもの（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）；非極性側鎖を有するもの（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）；β分枝側鎖を有するもの（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）；および芳香族側鎖を有するもの（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。１つまたはそれ以上の保存的改変を有するＢｔｎｌ２タンパク質は、所望の機能的特性を保持し得る可能性があり、これは当技術分野で公知の機能的アッセイを使用して試験することができる。

【0071】

本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸改変であって、そのアミノ酸配列を含むタンパク質の結合特性に重大な影響を及ぼさないかまたは変化させないものを指す。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、当技術分野で公知の標準的な手法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するもの（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するもの（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）；非極性側鎖を有するもの（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）；β分枝側鎖を有するもの（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）；および芳香族側鎖を有するもの（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。

【0072】

本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性と等価である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0073】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１～１７（１９８８）、これは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）を使用し、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４～４５３（１９７０）、これは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用して決定することができる。

【0074】

追加的または代替的に、本開示のタンパク質配列は、例えば、関連する配列を同定するために、公開データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、スコア＝５０、ワード長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行って、本開示の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップありでのアラインメントを得るために、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９～３４０２に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。

【0075】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２変異体を、検出タグまたは検出マーカー（例えば、放射性核種、蛍光色素）にコンジュゲートまたは連結させることができる。一部の実施形態では、検出タグは、アフィニティータグであり得る。本明細書で使用される「アフィニティータグ」という用語は、ポリペプチドに結合した部分に関し、これはポリペプチドを生化学的混合物から精製することを可能にする。アフィニティータグは、アミノ酸配列からなることもでき、または翻訳後改変によって化学基が結び付いたアミノ酸配列を含むこともできる。アフィニティータグの非限定的な例としては、Ｈｉｓ－タグ、ＣＢＰ－タグ（ＣＢＰ：カルモジュリン結合タンパク質）、ＣＹＤ－タグ（ＣＹＤ：共有結合的であるが解離可能なＮｏｒｐＤペプチド）、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＰＣ－タグ（ＨＰＣ：プロテインＣの重鎖）、ＧＳＴ－タグ（ＧＳＴ：グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、Ａｖｉ－タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ－タグ、３ｘＦＬＡＧタグ、ＳＵＭＯタグ、およびＭＢＰ－タグ（ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質）が挙げられる。アフィニティータグのさらなる例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｋｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；７３：Ｕｎｉｔ ９．９に見出すことができる。

【0076】

一部の実施形態では、検出タグは、Ｂｔｎｌ２変異体のＮ末端および／またはＣ末端にコンジュゲートまたは連結させることができる。検出タグおよびアフィニティータグを、１つまたはそれ以上のアミノ酸によって隔てることもできる。一部の実施形態では、検出タグを、切断可能な要素を介してＢｔｎｌ２変異体にコンジュゲートまたは連結させることができる。本開示の文脈において、「切断可能な要素」という用語は、化学薬品または酵素手段、例えば、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプチド配列に関する。プロテアーゼは、配列特異的であってもよく（例えば、トロンビン）、または限定的な配列特異性を有してもよい（例えば、トリプシン）。また、切断可能な要素ＩおよびＩＩを、検出タグまたはポリペプチドのアミノ酸配列に含めることもでき、特に検出タグまたはポリペプチドの最後のアミノ酸がＫまたはＲである場合にはそうである。

【0077】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」または「コンジュゲーション」または「連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれ以上の実体が結び付いて１つの実体を形成することを指す。コンジュゲートは、ペプチド－小分子コンジュゲート、ならびにペプチド－タンパク質／ペプチドコンジュゲートの両方を範囲に含む。

【0078】

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列を共に連結することによって作成されるタンパク質を意味する。本開示の範囲に含まれる融合ポリペプチドには、第１のポリペプチドをコードする核酸配列を第２のポリペプチドをコードする核酸配列と連結させて単一のオープンリーディングフレームを形成するキメラ遺伝子構築物の翻訳産物が含まれる。換言すると、「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して連結された２つまたはそれ以上のタンパク質による組換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、２つのドメイン間にペプチドリンカーを含んでもよい。

【0079】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む。本明細書で使用される場合、「組織特異的シグナル」という用語は、Ｂｔｎｌ２作用物質を、特定の組織に標的化することができる分子を指す。例えば、組織特異的シグナルは、特定の組織（例えば、腸）において発現されるタンパク質（例えば、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１））に結合する分子であり得る。組織特異的シグナルは、特定の組織（例えば、腸）において発現される（例えば、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１））に特異的に結合するシグナルペプチドまたは抗体であり得る。

【0080】

一部の実施形態では、組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤または抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその断片を含む融合タンパク質、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体、例えば、抗ＭＡｄＣＡＭ－１ｍＡｂであるＭＥＣＡ－３６７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ－９４７８、定期的なＧｅｎＢａｎｋ配列アップデートを含む）、またはその関連部分はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２０１８０１４０６０１（Ａ１）号に記載されたＭＥＣＡ－３６７を含む。

【0081】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0082】

「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞において動作可能に関連する特定の遺伝子を導入して、その発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語には、自己複製性核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。本開示の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、安定なｍＲＮＡの大量の転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞の転写および／または翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本開示の発現ベクターは、Ｂｔｎｌ２またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

【0083】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、アゴニスト活性を有するＢｔｎｌ２作用物質である。「アゴニスト」という用語は、Ｂｔｎｌ２経路のアゴニズムを引き起こして、細胞における応答、例えば、ＢＴＮＬ２受容体を発現する免疫細胞の抑制を引き起こす化合物を指す。Ｂｔｎｌ２アゴニストは、内因性リガンド（Ｂｔｎｌ２）の作用を模倣し、その結果、内因性リガンドによってもたらされるものに類似する生理学的応答を生じさせる。この用語は、それを必要とする対象に投与された場合に、Ｂｔｎｌ２媒介性シグナル伝達経路の活性のアップレギュレーションおよび／または上昇を引き起こすＢｔｎｌ２作用物質（例えば、Ｂｔｎｌ２変異体／断片、Ｂｔｎｌ２を含む融合タンパク質、またはＢｔｎｌ２模倣物）を含む。一部の実施形態では、この用語は、対象に投与された場合にＴ細胞の数または活性の減少を導くＢｔｎｌ２作用物質を含む。

【0084】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質を、組成物、例えば、医薬組成物として提供することができる。組成物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体の１つまたは組合せを含むことができる。一部の実施形態では、そのような組成物は、１つのＢｔｎｌ２変異体または（例えば、２つまたはそれ以上の異なる）Ｂｔｎｌ２変異体の組合せを含むことができる。例えば、組成物は、異なる遺伝子改変を有するＢｔｎｌ２変異体の組合せを含むことができる。

【0085】

本明細書で使用される場合、「組成物」または「医薬組成物」という用語は、本開示において有用な少なくとも１つの構成成分と、他の構成成分、例えば、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤との混合物を指す。医薬組成物は、本開示の１つまたはそれ以上の構成成分の生物への投与を容易にする。

【0086】

Ｂｔｎｌ２（例えば、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、Ｂｔｎｌ２アゴニスト）のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質の医薬組成物または治療用製剤は、所望の純度を有するＢｔｎｌ２作用物質を、適宜、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して毒性がないものであり、これには、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメソニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジングルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む；単糖類、二糖類、および他の糖質；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。

【0087】

製剤はまた、処置される特定の適応症に対して必要な２つまたはそれ以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分を含んでもよい。例えば、製剤は、別の抗炎症剤をさらに含んでもよい。そのような分子は、意図される目的に対して有効な量で組み合わされて好適に存在する。

【0088】

活性成分はまた、例えば、コアセルベーション手法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの中に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中で封入することができる。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0089】

徐放性製剤を調製することもできる。徐放性製剤の好適な例には、Ｂｔｎｌ２（例えば、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体）のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、マトリックスは成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγ－エチル－Ｌ－グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドで構成される注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ－ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸のようなポリマーは、１００日間以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された場合、Ｂｔｎｌ２作用物質は体内に長期間留まり、３７℃で水分に曝露される結果として変性または凝集し、生物学的活性の喪失および免疫原性の変化が生じる可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機序がチオール－ジスルフィド交換による分子間Ｓ－Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変する、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。

【0090】

インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならず、これは滅菌濾過膜を通しての濾過によって容易に達成することができる。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み入れて、その後に滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）であり、これにより、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液から、活性成分に任意のさらなる所望の成分が加わった粉末が生成される。

【0091】

単一の剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象および特定の投与の様式に応じて異なると考えられる。単一の剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、この量は、１００％のうち、薬学的に許容される担体と組み合わされた上で、活性成分の約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％の範囲である。

【0092】

ｃ．投与および投薬レジメン
Ｂｔｎｌ２（例えば、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体）のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質は、単回用量として投与することができ、またはより一般的には複数回投与することができる。単回投薬間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月毎または毎年であり得る。また、患者におけるＢｔｎｌ２タンパク質またはその変異体の血中濃度を測定することによって指定される通りに間隔が不規則であることもあり得る。

【0093】

Ｂｔｎｌ２作用物質またはその医薬組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の１つまたはそれ以上を使用して、１つまたはそれ以上の投与の経路を介して投与することができる。当業者には理解されるであろうが、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。例えば、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体の投与には、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口的な投与の経路、例えば、注射または注入によるものが含まれる。本明細書で使用される場合、「非経口的投与」という語句は、通常は注射による、腸内および局所への投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体を、非経口的でない経路、例えば、局所的、表皮的または粘膜的な投与の経路、例えば、鼻腔内、経口的、膣内、直腸内、舌下的または局所的に投与することもできる。

【0094】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２（例えば、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体）のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質または医薬組成物は、腫瘍内、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮に、徐放性に、制御放出性に、遅延放出性に、坐薬として、または舌下に投与することができる。

【0095】

投薬レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）が得られるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与することができ、数回に分割した用量を経時的に投与することができ、または、治療状況の緊急性によって指示される通りに用量を相応に減少もしくは増加させることができる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口的組成物を単位剤形として製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する単位用量として好適な物理的に別個の単位を指す；各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性成分を、必要な医薬担体と共に含む。本開示の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特性および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における過敏性の処置のためにそのような活性成分を配合する技術に固有の制限によって規定され、それらに直接依存する。

【0096】

Ｂｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させるためのＢｔｎｌ２作用物質の投与について、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重（例えば、０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍｇ／ｋｇ）、より一般的には０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るか、または１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、週に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１か月毎に１回、３か月毎に１回、または３～６か月毎に１回の投与を伴う。本開示のＢｔｎｌ２タンパク質またはその変異体の好ましい投薬レジメンには、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体は、以下の投薬スケジュールのうちの１つを使用して投与される：（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後は３か月毎；（ｉｉ）３週間毎；および（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後は３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。

【0097】

あるいは、Ｂｔｎｌ２作用物質を徐放性製剤として投与することもでき、その場合には、より低頻度の投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者におけるＢｔｎｌ２作用物質の半減期に応じて異なる。投与量および投与の頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて異なり得る。予防用途では、比較的低い用量が、比較的まばらな間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、残りの生涯にわたって処置を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が軽減するかまたは停止するまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされることがある。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。

【0098】

組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与の様式に関して所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量が得られるように変化させることができる。選択される投与量レベルは、使用される本開示の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の活性成分の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および以前の治療歴、ならびに医学分野で周知である同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存する。

【0099】

本明細書で使用される場合、「有効量」、「有効用量」、および「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。薬剤または治療剤の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて使用された場合に、疾患の症状の重篤度の低下、疾患の無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による障害もしくは身体障害の予防によって立証される疾患の消退を促進する、薬剤の任意の量である。薬剤／作用物質の「予防有効量」または「予防有効投与量」は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、疾患を発症するリスクまたは疾患の再発を起こすリスクのある対象に投与された場合に、疾患の発症または再発を阻害する薬剤の量である。疾患の消退を促進するか、または疾患の発症もしくは再発を阻害する治療剤または予防剤の能力は、当業者に公知の種々の方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける効能を予測するための動物モデル系において、またはインビトロアッセイで作用物質の活性をアッセイすることによって、評価することができる。

【0100】

本明細書に開示される医薬組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、本開示の治療用医薬組成物は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５３９９１６３号、同第５３８３８５１号、同第５３１２３３５号、同第５０６４４１３号、同第４９４１８８０号、同第４７９０８２４号、および同第４５９６５５６号に開示されているデバイスのような無針皮下注射デバイスを使用して投与することができる。本開示に関連して有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、米国特許第４４８７６０３号、同第４４８６１９４号、同第４４４７２３３号、同第４４４７２２４号、同第４４３９１９６号、および同第４４７５１９６号に記載されているものが含まれ、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。他の多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが、本開示と共に使用するのに好適であり、当業者に公知である。

【0101】

一部の実施形態では、対象における炎症性障害を処置する方法は、本明細書に記載されるように、第２の治療剤または療法を対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、抗炎症剤である。

【0102】

本明細書で使用される場合、「同時投与」および「同時投与される」という用語は、少なくとも２つの作用物質または療法を対象に投与することを指す。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の作用物質／療法の同時投与は同時である。他の実施形態では、第１の作用物質／療法は、第２の作用物質／療法の前に施される。当業者は、使用されるさまざまな作用物質／療法の製剤化および／または投与の経路が変化し得ることを理解している。

【0103】

一部の実施形態では、第２の治療剤、例えば、抗炎症剤は、第２の治療剤の前、後、または同時に対象に投与される。

【0104】

ｄ．抗菌反応を誘発する方法
別の態様では、本開示は、対象において抗菌反応を誘発する方法であって、Ｂｔｎｌ２作用物質の有効量を対象に投与することを含む方法をさらに提供し、Ｂｔｎｌ２作用物質は、対象におけるＢｔｎｌ２のレベルまたは活性を上昇させることができる。抗菌反応は、細菌、ウイルス、原生動物、および真菌のような微生物を死滅させること、または増殖を遅らせることができる。

【0105】

一部の実施形態では、ＩＥＬはγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδ上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、結腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは回腸ＣＤ８αα＋ γδＩＥＬを含む。

【0106】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体、またはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２タンパク質は、配列番号１～３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１～３のアミノ酸配列を含む。

【0107】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、組織特異的シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、組織特異的シグナルは、ＭＡＤＣＡＭ１阻害剤または抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質またはその変異体、および抗ＭＡＤＣＡＭ１抗体を含む。

【0108】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含む。

【0109】

一部の実施形態では、Ｂｔｎｌ２作用物質は、Ｂｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体をコードするかまたはＢｔｎｌ２タンパク質もしくはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。

【0110】

ｅ．Ｂｔｎｌ２アゴニストを同定する方法
さらに別の態様では、本開示は、対象におけるＩＥＬを低下させることができるＢｔｎｌ２作用物質を同定するための方法であって、（ａ）Ｂｔｎｌ２のレベルもしくは活性を上昇させることができるかまたはＢｔｎｌ２アゴニスト活性を有するＢｔｎｌ２作用物質のある量を対象に投与すること；（ｂ）対象から得られた試料に対してアッセイを行って、試料中のＩＥＬの数を決定すること；および（ｃ）対象において所定の基準値と比較してＩＥＬの数が増加している場合に、Ｂｔｎｌ２作用物質を、対象におけるＩＥＬを減少させる能力があるものとして同定することを含む方法を提供する。

【0111】

一部の実施形態では、リンパ球は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または組織特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、ＩＥＬは腸γδＩＥＬを含む。一部の実施形態では、腸γδＩＥＬは十二指腸γδＩＥＬ、空腸γδＩＥＬ、回腸γδＩＥＬ、またはそれらの組合せを含む。

【0112】

Ｂｔｎｌ２のレベルまたは活性は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定するかまたは推定することによって測定することができる。タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定するかまたは推定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｂｔｎｌ２のタンパク質レベル（例えば、タンパク質発現レベル）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、または免疫アッセイ（例えば、免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ）によって決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ－ＰＣＲによって決定することができる。

【0113】

Ｂｔｎｌ２のレベルを測定することは、タンパク質自体をアッセイすることによって（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および当業者に公知の他の手法などによって）、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡをアッセイすることによって（定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＮＡドットブロット、および当業者に公知の他の手法などによって）、またはＢｔｎｌ２の遺伝子の調節エレメントの活性をアッセイすることによって行うことができる。例えば、調節エレメントの活性は、レポーターをコードするｃＤＮＡ（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、または容易にアッセイすることができる他のレポーター遺伝子など）に結合されたプロモーター、エンハンサー、および／またはイントロンエレメント由来のＤＮＡセグメントからなるレポーター構築物によって評価することができる。これらのレポーター構築物は、安定にまたは一過性に細胞にトランスフェクトすることができる。

【0114】

一部の実施形態では、本方法は、試験細胞および／または対照細胞を培養するかまたは増大させることを含み得る。「培養すること」または「増大させること」という用語は、細胞が増殖し、老化を回避することができる条件下で細胞を維持または培養することを指す。例えば、細胞を、場合により１つまたはそれ以上の増殖因子を含む培地、すなわち、増殖因子カクテル中で培養することができる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、規定された細胞培養培地である。細胞培養培地は、ネオ抗原ペプチドを含むことができる。安定な細胞株を、細胞の継続的な増殖を可能にするように樹立することができる。

【0115】

本開示による組成物および方法の詳細な説明を理解するのを助けるために、本開示のさまざまな態様の明白な開示を容易にする目的で、いくつかの明確な定義が提供される。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0116】

「作用物質」という用語は、本明細書において、生物学的材料、例えば、細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織から作製される、化合物、化合物の混合物、生体高分子（例えば、核酸、抗体、タンパク質またはその一部、例えば、ペプチド）、または抽出物を表すために使用される。そのような作用物質の活性は、それを「治療剤」として好適なものにすることができ、それは対象において局所的または全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質（または複数の物質）である。

【0117】

「治療剤」、「治療能力のある作用物質」または「処置剤」という用語は、本明細書で互換的に使用することができ、対象に投与した場合に何らかの有益な効果を与える分子または化合物を指す。有益な効果には、診断決定を可能にすること；疾患、症状、障害または病的状態の改善；疾患、症状、障害または状態の発症の低下または予防；および疾患、症状、障害または病的状態に全体的に対抗することが含まれる。

【0118】

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用することができ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖状または分枝状であってよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が介在してもよい。この用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、または任意の他の操作、例えば、標識構成成分とのコンジュゲーションを範囲に含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／もしくは非天然のアミノ酸または合成アミノ酸を含む。

【0119】

「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えば、限定されないが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ分子（例えば、限定されないが、ｍＲＮＡ）を指し、ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体を含む。ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、天然には存在しない部分、例えば、改変塩基、改変骨格、ＲＮＡ中のデオキシリボヌクレオチドなどを含むことができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。

【0120】

「動作可能に連結された」という用語は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって後者の発現をもたらすものを指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と動作可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に動作可能に連結されている。一般に、動作可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要な場合には、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接合する。

【0121】

「リンカー」という用語は、２つまたはそれ以上の実体を接合するために使用される任意の手段、実体、または部分を指す。リンカーは、共有結合リンカーまたは非共有結合リンカーであり得る。共有結合リンカーの例には、共有結合、または連結されるタンパク質もしくはドメインの１つもしくはそれ以上に共有結合性に結び付いたリンカー部分が含まれる。リンカーはまた、非共有結合、例えば、プラチナ原子などの金属中心を介した有機金属結合でもあり得る。共有結合については、炭酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機エステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素などのさまざまな官能基を使用することができる。連結をもたらすために、ドメインを酸化、ヒドロキシル化、置換、還元などによって改変して、カップリングのための部位を得ることができる。コンジュゲーションのための方法は当業者に周知であり、本開示における使用のための範囲に含まれる。リンカー部分には、化学的リンカー部分、または例えば、ペプチドリンカー部分（リンカー配列）が含まれるが、これらに限定されない。

【0122】

「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれる治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドには、通常はそのポリヌクレオチドを含む細胞内に含まれるポリヌクレオチド分子が含まれるが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子には、本開示のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物、ならびにプラスおよびマイナスの鎖形態ならびに二本鎖形態が含まれる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、本開示によれば、合成的に生成されたそのような分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、もしくは転写ターミネーターであってもよく、または調節エレメントを含んでもよい。

【0123】

核酸またはその断片に言及する場合の「実質的同一性」または「実質的に同一な」という用語は、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適にアラインメントされた場合に、以下に考察するように、配列同一性の任意の周知のアルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰによる測定で、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対して実質的同一性を有する核酸分子は、特定の例において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同一であるかまたは実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。

【0124】

ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされた場合に、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、この用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされた場合に、少なくとも９５％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、この用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされた場合に、少なくとも９８％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、この用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされた場合に、少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換による違いである。

【0125】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは度合いを、置換の保存的性質を補正するために上方に調整することができる。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１を参照されたい。

【0126】

本明細書で使用される場合、「相同性」は、位置的同一性（すなわち、配列類似性または同一性）のパーセントの点からの、２つまたはそれ以上の核酸および／またはアミノ酸配列間の類似性のレベルを指す。相同性はまた、異なる核酸またはタンパク質間の類似した機能的特性という考え方も指す。本明細書で開示されるヌクレオチド配列またはポリペプチドの相同体は、本明細書で開示されるヌクレオチド配列またはポリペプチドに対して実質的な配列同一性（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）を有し得る。

【0127】

本明細書で使用される場合、「遺伝子型判定」は、ゲノム内部の１つまたはそれ以上の位置での細胞および／または対象の特定のアレル組成を、例えば、その位置での核酸配列を決定することによって決定するプロセスを指す。遺伝子型判定は、核酸分析および／または核酸レベルでの分析、例えば、シークエンシングを指す。

【0128】

本明細書で使用される場合、「シークエンシング」は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）もしくはＲＮＡ（リボ核酸）の鎖におけるヌクレオチド塩基の正確な順序、またはタンパク質におけるアミノ酸残基もしくはペプチドの正確な順序の決定を指す。核酸シークエンシングは、サンガーシークエンシングまたは次世代ハイスループットシークエンシングを使用して行うことができる。

【0129】

本明細書で使用される場合、「次世代シークエンシング」は、数千から数百万のシークエンシング反応を並行して行って読み取ることから、従来のシークエンシング方法（例えば、サンガーシークエンシング）で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシークエンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシークエンシング技術を指す。次世代シークエンシング方法／プラットフォームの非限定的な例には、超並列シグネチャーシークエンシング（Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；４５４パイロシークエンシング（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）：ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｉｏｎ半導体シークエンシング（ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシークエンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な技術が含まれる。次世代シークエンシング技術および関連するシークエンシングプライマーの制約および設計パラメーターは、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ，２００８，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１０，１１３５～１１４５；Ｍａｒｄｉｓ，“Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，２４（３）：１３３～４１；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ，２０１１，１１（３）：３３３～４３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ，”Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，３８（３）：９５～１０９；（Ｎｙｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８：１７１７５（１９９３）；Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ，１６：５４５～５２（２００６）；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｔｏｄａｙ，１３：５６９～７７（２００８）；米国特許第７，２８２，３３７号；同第７，２７９，５６３号；同第７，２２６，７２０号；同第７，２２０，５４９号；同第７，１６９，５６０号；同第６，８１８，３９５号；同第６，９１１，３４５号；米国特許出願第２００６／０２５２０７７号；同第２００７／００７０３４９号；同第２００７００７０３４９号を参照されたい）。言及されたすべての参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0130】

「疾患」、「障害」、および「状態」（医学的状態におけるような）という用語は、本明細書で互換的に使用することができ、正常な機能を損ない、典型的には特徴的な徴候および症状によって顕在化し、ヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させる、ヒトまたは動物の身体またはその一部の異常な状態（例えば、炎症性障害）を指す。

【0131】

本明細書で使用される場合、「炎症性腸疾患」は、腸における炎症の異常に関連する状態を指す。本発明に従って処置することができる炎症性腸疾患には、腸炎、全腸炎、クローン病、肉芽腫性大腸炎、回腸炎または結腸クローン病であり得るクローン病、ならびに潰瘍性大腸炎、Ｓ状結腸炎、汎大腸炎、および潰瘍性直腸炎であり得る潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0132】

本明細書で使用される場合、「調節する」は、生物学的状態の任意の変化、すなわち、増加、減少などを指す。

【0133】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、組成物の生物学的活性または特性を阻害せず、比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができる。

【0134】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本開示の化合物を、その意図された機能を遂行することができるように対象内部または対象に運ぶかまたは輸送することに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を含む。典型的には、そのような化合物は、１つの臓器または身体の一部分から、別の臓器または身体の一部に運ばれるかまたは輸送される。各塩または担体は、製剤の他の成分と適合性であって対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；トラガカントゴム粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤ワックス；油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンを含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；潤滑剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；香料；芳香剤；保存料；抗酸化剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤；凝結剤；懸濁剤；界面活性剤；湿潤剤；担体；安定剤；ならびに医薬製剤中に使用される他の非毒性適合性物質、またはそれらの任意の組合せが含まれる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本開示の１つまたはそれ以上の構成成分の活性と適合し、対象に生理学的に許容される、任意およびすべてのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み入れることができる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、多細胞生物の内部ではなく、人工的環境、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養下などにおいて起こる事象を指す。

【0136】

本明細書で使用される場合、「インビボ」は、多細胞生物、例えば、非ヒト動物の内部で起こる事象を指す。

【0137】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。

【0138】

本明細書で使用される場合、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「有すること」およびそれらの変形物は、特に記載されない限り、その後に列挙される項目およびそれらの均等物、ならびに追加の主題を範囲に含むことを意味する。

【0139】

本明細書で使用される場合、「一実施形態では」、「さまざまな実施形態では」、「一部の実施形態では」などの語句は、必ずしも同じ実施形態を指すものではないが、文脈が他のことを指示しない限り、同じ実施形態を指すことができる。

【0140】

本明細書で使用される場合、「および／または」または「／」という用語は、この用語に関連する項目のいずれか１つ、項目のいずれかの組合せ、または項目のすべてを意味する。

【0141】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであってもよい。必要な場合には、「実質的に」という語を、本開示の定義から省略することができる。

【0142】

本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、記載された基準値に類似する値を指す。一部の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された基準値のいずれかの方向（より大きいかまたはより小さい）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を指す。本明細書で特に指示されない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成、または実施形態の機能性の点で同等である、列挙された範囲に近い値、例えば、重量％を含むことを意図する。

【0143】

本明細書で使用される場合、「各」という用語は、項目の集合に関して使用される場合、集合内の個々の項目を識別することを意図しているが、必ずしも集合内のすべての項目を指すわけではない。明示的な開示または文脈により、そうでないことが明確に示される場合には、例外が発生する可能性がある。

【0144】

本明細書で開示される場合、値のいくつかの範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値も、文脈が明らかに他のことを示さない限り、具体的に開示されることが理解される。記載された任意の値または記載された範囲内の中間値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または中間値との間のより小さな各範囲は、本開示の範囲内に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立にその範囲に含まれるかまたは除外されてもよく、また、限界のいずれか一方、いずれでもない、または両方がより小さな範囲に含まれる各範囲も、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界を条件として、本開示の範囲内に含まれる。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか一方または両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。

【0145】

本明細書で提供される任意およびすべての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図したものであり、特に主張されない限り、本開示の範囲を制限するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本開示の実施に不可欠なものとして、請求されていない要素を指示するものとは解釈されるべきではない。

【0146】

本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われる。提供される方法の任意のものに関して、本方法の工程は、同時にまたは逐次的に起こり得る。本方法の工程が逐次的に起こる場合、工程は、特に記載されない限り、任意の順序で起こり得る。方法が工程の組合せを含む場合、工程のそれぞれおよびすべての組合せまたは部分組合せは、本明細書中に特に記載されない限り、本開示の範囲内に含まれる。

【0147】

本明細書に引用される各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照によって組み込まれる。本明細書に開示される刊行物は、本開示の出願日以前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいずれのものも、本開示が事前の開示によってそのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行物の日付とは異なる場合があり、それは独立に確認される必要がある場合がある。

【0148】

本明細書に記載された例および実施形態は、例示のみを目的としていること、およびそれらを考慮してさまざまな修正または変更が当業者に示唆され、それらも本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。

【実施例】

【0149】

以下の実施例は、本開示の方法および組成物をどのように作製して使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を制限することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

【実施例1】

【0150】

本実施例は、実施例２～１２に使用される材料および方法について記載する。

【0151】

マウス
８～１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．において、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ技術（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，２５（１）：９１～９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，２１（６）：６５２～５９）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＢｔｎｌ２－ＫＯマウスを作製し、維持した。ＬａｃＺカセットを、開始コドンにインフレームに挿入し、その後ろにＢｔｎｌ２遺伝子の転写を破壊してヌルアレルをもたらす選択カセットが続いた。ヘテロ接合マウスを交配して、ホモ接合型ＫＯおよびＷＴ同腹仔を作製した。Ｂｔｎｌ２発現パターンをβ－ガラクトシダーゼ染色によって確認し、Ｂｔｎｌ２標的化欠失を小腸の定量的ＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシングによって測定した。Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ雌性マウスを、特に指定のない限り、すべての実験に１０～１７週齢で使用した。雌の同腹仔を離乳後数週間にわたり同時飼育し、疾患の設定でランダムに実験群に割り付けた。すべての動物を病原体を含まない条件下で維持し、実験はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．の施設内実験動物委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。

【0152】

腸上皮細胞（ＩＥＣ）、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）、および粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）の単離
小腸を３つの均等なセグメントに分け、リンパ球の単離を以前に記載された通りに進めた（Ｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６．１２６（６）：１１２１～３３）。ＩＥＣおよびＩＥＬ画分を単離するために、小腸を切断して２ｃｍの小片にし、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＨＢＳＳ中で、３７℃で１５分間、１５０ｒｐｍで振盪しながら２回インキュベートした。激しくボルテックス処理した後、腸小片を１００μｍの細胞濾過器に通して洗浄し、４０％／８０％ Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２０℃、２５００ｒｐｍで２０分間遠心単離した。ＩＥＣを含む上部層を回収して洗浄し、ＲＮＡ抽出のためにＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させた。ＩＥＬ画分を界面から回収して洗浄し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ＩＥＬ単離後、５０Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０Ｕ／ｍＬディスパーゼ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および５％ ＦＣＳを添加したＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋を含まないＨＢＳＳ中で、３７℃で２５分間、１５０ｒｐｍで振盪しながら２回インキュベートすることにより、腸小片からＬＰＬを単離した。細胞を４０％／８０％ Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で遠心単離し、ＬＰＬを界面から回収して洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、直ちに表面細胞染色を行った。

【0153】

腸間膜リンパ節およびパイエル板の免疫表現型判定
パイエル板を全小腸から採取して、氷冷ＤＰＢＳで洗浄し、５０Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０Ｕ／ｍＬディスパーゼ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および５％ ＦＣＳと共に、３７℃で２５分間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。腸間膜リンパ節を、１５Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）および５０μｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋を有するＨＢＳＳ中で細断し、振盪せずに３７℃で２０分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、直ちに表面染色した。

【0154】

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー用抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＵＳ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳ）、ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳ）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ（ＵＳ）から購入した。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ２３１０５）を使用して除外した。Ｆｃ受容体は、精製抗マウスＣＤ１６／３２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、クローン２．４Ｇ２、カタログ番号５５３１４２）ならびに各２％の正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１５－０００－１２０）、ラット血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１２－０００－１２０）およびハムスター血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号００７－０００－１２０）を使用してブロックした。以下の抗体を、製造元の指示に従って染色に使用した：ＣＤ４５－ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号３０－Ｆ１１、カタログ番号１０３１３８）、ＣＤ８α－ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号５３－６．７、カタログ番号１００７３０）、ＣＤ８β－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＹＴＳ１５６．７．７、カタログ番号１２６６１０）、ＴＣＲβ－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｈ５７－５９７、カタログ番号１０９２４３）、ＴＣＲβ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｈ５７－５９７、カタログ番号１０９２２０）、ＴＣＲγ／δ－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＧＬ３、カタログ番号１１８１２４）、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｍ１／７０、カタログ番号１０１２２６）、ＣＤ１１ｃ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｎ４１８、カタログ番号１１７３２４）、ＣＤ１１ｃ－ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｎ４１８、カタログ番号１１７３２０）、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｎ４１８、カタログ番号１１７３１８）、Ｇｒ１－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＲＢ６－８Ｃ５、カタログ番号１０８４２４）、Ｂ２２０－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＲＡ３－６Ｂ２、カタログ番号１０３２２４）、Ｂ２２０－ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＲＡ３－６Ｂ２、カタログ番号１０３２３２）、Ｂ２２０－ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＲＡ３－６Ｂ２、カタログ番号１０３２４１）、ＮＫ１．１－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＰＫ１３６、カタログ番号１０８７２４）、ＭＨＣＩＩ－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｍ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６３２）、Ｌｙ６Ｃ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＨＫ１．４、カタログ番号１２８０１２）、ＣＤ６４－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号Ｘ５４－５／７．１、カタログ番号１３９３０４）、ＣＤ１０３－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号２Ｅ７、カタログ番号１２１４２０）、ＣＸ３ＣＲ１－ビオチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＳＡ０１１Ｆ１１、カタログ番号１４９０１８）、ストレプトアビジン－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５２４８）、ＮＫｐ４６－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号２９Ａ１．４、カタログ番号１３７６３０）、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＧＫ１．５、カタログ番号１００４３４）、ＣＤ４－ＶＦ４５０（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン番号ＧＫ１．５、カタログ番号７５－００４１－Ｕ１００）、ｃ－ＫＩＴ－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＡＣＫ２、カタログ番号１３５１１２）、ＣＤ４４－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＩＭ７、カタログ番号１０３０２８）、ＣＤ４４－ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン番号ＩＭ７、カタログ番号１０３０４９）、ＲＯＲγｔ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン番号ＡＦＫＪＳ－９、カタログ番号１７－６９８８－８２）、ＦｏｘＰ３－ＡＦ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン番号ＦＪＫ－１６ｓ、カタログ番号５６－５７７３－８２）、ＦｏｘＰ３－ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン番号ＦＪＫ－１６ｓ、カタログ番号４８－５７７３－８２）、ＬｅｇｅｎｄＳｃｒｅｅｎマウスＰＥキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号７００００５）。核内染色のためには、細胞をｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅおよび表面マーカーと共にインキュベートした後に、ＦｏｘＰ３／転写因子固定および透過化キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造元の指示に従って固定および透過化を行った。

【0155】

ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の取込みは、３％スクロース中に０．８ｍｇ ｍＬ^－１で溶解させた飲用水による連続投与の３日後に評価した。手短に述べると、ＩＥＬをＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍａにより２０℃で２０分間かけて固定して洗浄し、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋、１０％ ＦＣＳ、および１０％ ＤＭＳＯを添加した１×ＤＰＢＳと共に２０℃で１０分間インキュベートした。細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍａにより２０℃で５分間かけて再固定して洗浄し、０．５ｍｇ ｍＬ^－１のＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＢｒｄＵ－ＡＦ６４７（ＭｏＢＵ－１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローン番号ＭｏＢＵ－１、カタログ番号Ｂ３５１３３）により２０℃で染色して洗浄し、取得のために再懸濁させた。

【0156】

フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用してプロットした。

【0157】

インビトロＩＥＬ増殖アッセイ
９６ウェル平底プレートを、１ｍｇ ｍＬ^－１の精製抗マウスＣＤ３ｅ（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１４５－２Ｃ１１、カタログ番号７０－００３１－Ｍ００１）および６０ｐｍｏｌｅのマウスＢｔｎｌ２－Ｆｃ、ＰＤＬ１－ＦｃまたはｍＦｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して４℃で一晩コーティングし、ＤＰＢＳで２回洗浄した後に、培養物にＩＥＬを添加した。新たに単離したＩＥＬを、製造元（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ３４５５４）の指示に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素で標識した。ＣＦＳＥ標識ＩＥＬを、１０％ ＦＣＳ、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２％ ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、０．１％ ｂ－メルカプト－エタノール（Ｇｉｂｃｏ）、組換えマウスＩＬ－７（１０ｎｇ ｍＬ^－１、Ｒ＆Ｄ）、組換えマウスＩＬ－１５（１０ｎｇ ｍＬ^－１、Ｒ＆Ｄ）および組換えヒトＩＬ－２（１０ｎｇ ｍＬ^－１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ １６４０中で、ウェル当たり細胞２００，０００個にて平板培養した。分析前に細胞を５％ ＣＯ_２中にて、３７℃で７２～９６時間インキュベートした。

【0158】

インビトロＣＤ４^＋ Ｔ細胞増殖アッセイ
９６ウェル平底プレートを、１ｍｇ ｍＬ^－１の精製抗マウスＣＤ３ｅ（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１４５－２Ｃ１１、カタログ番号７０－００３１－Ｍ００１）、１ｍｇ ｍＬ^－１の精製抗マウスＣＤ２８（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３７．５１、カタログ番号７０－０２８１－Ｕ５００）および６０ｐｍｏｌｅのマウスＢｔｎｌ２－Ｆｃ、ＰＤＬ１－Ｆｃ、ＰＤＬ２－ＦｃまたはｍＦｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により４℃で一晩コーティングし、ＤＰＢＳで２回洗浄した後に、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を培養物に添加した。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、プールした脾臓およびリンパ節から、マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してエンリッチし、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識した。ＣＦＳＥ標識したＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、１０％ ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２％ ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウムおよび０．１％ ｂ－メルカプト－エタノール（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ １６４０中で、ウェル当たり細胞８０，０００～１００，０００にて平板培養した。分析前に細胞を５％ ＣＯ_２中にて、３７℃で７２時間インキュベートした。

【0159】

インビトロＣＤ４^＋ Ｔヘルパー細胞分化アッセイ
９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍＬの精製抗マウスＣＤ３ε（１４５－２Ｃ１１、ＴＯＮＢＯ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、１μｇ／ｍＬの精製抗マウスＣＤ２８（３７．５１、ＴＯＮＢＯ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）および６０ｐｍｏｌｅのマウスＢｔｎｌ２－Ｆｃ、ＰＤＬ１－Ｆｃ、ＣＤ８６－Ｆｃ、ＣＴＬＡ４－ＦｃまたはｍＦｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により４℃で一晩コーティングし、ＤＰＢＳで２回洗浄した後、培養物にナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞を添加した。ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、プールした脾臓およびリンパ節から、マウスナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞単離キット（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）を使用してエンリッチした。エンリッチされたナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、３０Ｕ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、１０％ ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２％ ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、および０．１％ β－メルカプト－エタノール（ＧＩＢＣＯ）を添加したＲＰＭＩ １６４０中で、ウェル当たり細胞８０，０００～１００，０００個にて平板培養した。制御性Ｔ細胞の分化のためには、ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞培養物に、１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＴＧＦβ１（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ－４（１１Ｂ１１、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、および１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）をさらに添加した。Ｔｈ１７細胞の分化のためには、ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞培養物に、０．５ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＴＧＦβ１（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、５０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－６（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－２３（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ－４（１１Ｂ１１、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、および場合によっては２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ）をさらに添加した。細胞を分析前に５％ ＣＯ_２中にて、３７℃で５日間インキュベートした。

【0160】

ホスホフローサイトメトリー
リン酸化された細胞シグナル伝達分子を染色するためのフローサイトメトリー用抗体は、ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＵＳ）およびＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（ＵＳ）から購入した。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＣＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用して除外した。Ｆｃ受容体は、精製抗マウスＣＤ１６／３２（９３）ならびに各２％の正常マウス、ラットおよびハムスターの各血清（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ）を使用してブロックした。以下の抗体を、製造元の指示に従って染色に使用した：ホスホ－Ａｋｔ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７（Ｓｅｒ４７３、Ｄ９Ｅ）、ホスホ－Ｓ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｓｅｒ２３５／２３６、Ｄ５７．２．２Ｅ）、ホスホ－ＦｏｘＯ１（Ｔｈｒ２４）／ＦｏｘＯ３ａ（Ｔｈｒ３２）／ＦｏｘＯ４（Ｔｈ２８）（４Ｇ６）、ＦｏｘＯ１－ＰＥ（Ｃ２９Ｈ４）、ＳＴＡＴ５－ＰＥ－Ｃｙ７（ｐＹ６９４、４７）、ＳＴＡＴ１－ＢＶ４２１（ｐＹ７０１、４ａ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）_２断片－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７。

【0161】

Ａｋｔ／Ｓ６／ＦｏｘＯ染色のためには、Ｆｃ融合タンパク質の存在下でＴｈ１７および制御性Ｔ細胞の分化条件下で１５時間培養した後、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞をｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅと共に室温で１０分間インキュベートし、２％パラホルムアルデヒド（ＥＬＥＣＴＲＯＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）中で２０分間かけて氷上で固定し、続いて９０％メタノール中にて－２０℃で一晩かけて透過処理した。氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦｃ受容体遮断薬と共に１０分間インキュベートし、Ａｋｔ／Ｓ６／ＦｏｘＯ抗体により４℃で５時間かけて染色して洗浄し、取得のために再懸濁させた。

【0162】

ＳＴＡＴ染色のためには、Ｆｃ融合タンパク質の存在下で制御性Ｔ細胞の分化条件下で５日間培養した後、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を数回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＶＷＲ）を添加したＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁させて、３時間氷上でインキュベートした。次に、ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅおよび系列スキューイングサイトカインを含む等容量の培地を添加して、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。直ちに細胞を氷上に置き、等容量の氷冷４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。続いて細胞を氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄し、９０％メタノール中にて－２０℃で一晩かけて透過処理した。氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦｃ受容体遮断薬と共に１０分間インキュベートし、４℃で一晩かけてＳＴＡＴ１／５抗体で染色して洗浄し、取得のために再懸濁させた。

【0163】

慢性大腸炎のＤＳＳ誘発モデル
平均体重が２３ｇを上回る１４～２０週齢の雌性Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスに、３％ ＤＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を６～７日間飲用水にて投与した後、最大１０日間にわたり蒸留水を投与した。対照群には試験期間中、蒸留水のみを投与した。マウスの体重を測定し、大腸炎の臨床徴候（例えば、便の硬さ、糞便中の血液）について毎日モニターした。第１５日にマウスを安楽死させて、結腸の長さを測定した。

【0164】

結腸ホモジネートの作製ならびにサイトカインおよびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定
遠位結腸または回腸終末部の６ｍｍ小片を、１×Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および３ｍｍタングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）２個を含むＴ－ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に入れた。組織をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）中にて２７．５Ｈｚの発振周波数で１０分間かけて破壊した。生成された組織ホモジネートを、４℃にて１５０００ｒｃｆで１０分間遠心単離して、上清をディープ９６ウェルプレート中に回収した。タンパク質アッセイ色素（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを製造元の指示に従って使用して、総タンパク質含有量を定量した。サイトカイン濃度は、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １マウスキットを、製造元の指示（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って使用して測定した。吸光度は、Ｍｅｓｏ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、マウスＭＰＯ ＥＬＩＳＡキットを、製造元の指示（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って使用して測定した。吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。サイトカインおよびＭＰＯレベルを、総タンパク質含有量に対して正規化した。

【0165】

組織学検査
十二指腸、空腸、回腸、および結腸の３ｃｍ小片をスイスロール状に調製し、１０％緩衝ホルマリンで固定してパラフィンに包埋し、５ｍｍ切片を作製して、Ｈ＆Ｅ染色した。組織学検査は、ＨｉｓｔｏＷｉｚ Ｉｎｃ．（ｈｉｓｔｏｗｉｚ．ｃｏｍ）により、標準操作手順および完全に自動化されたワークフローを使用して行われた。染色後に切片を脱水し、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ－ＰｒｉｓｍａおよびＣｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ（Ｓａｋｕｒａ）を使用してカバーグラスフィルムにした。全スライドスキャン（４０倍）をＡｐｅｒｉｏ ＡＴ２（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。病理組織学的スコア化は、遺伝子型、群の割り付け、および実験結果を知らされていない評価者によって行われた。以下の構成をＤＳＳ誘発損傷について評価し、以前に刊行された基準（Ｉｚｃｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００８．２８（４）：ｐ．５５９～７０）に基づいてスコア化した：粘膜固有層における炎症の度合い、杯細胞の喪失、異常な陰窩、陰窩膿瘍の存在、粘膜のびらんおよび潰瘍形成、粘膜下から経壁性病変への進展、好中球数。各パラメーターは０から４までのスコアとされ、最大累積スコアは１７であった。未処置マウスの粘膜病変を、以前に記載された通りにスコア化した（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７．７：ｐ．４０３１７）：０、正常；１、上皮細胞の軽度の脱落；２、上皮細胞の中等度の脱落；３、重度の粘膜浮腫；４、広範な粘膜損傷。データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）を使用して行った。

【0166】

定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、同時飼育した未処置Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの十二指腸、空腸、回腸、および結腸に由来するＩＥＣから単離した。ＲＮＡを、同時飼育し、水およびＤＳＳにより処置したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの遠位結腸および回腸終末部から抽出した。ＲＮＡを、ＭａｇＭＡＸ－９６ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で精製し、１回目と２回目の洗浄の間に追加のＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）工程を加えた。ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元の指示に従って使用して行った。ｑＰＣＲは、ＭｙＴａｑ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびアッセイミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＬＧＣ ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）を使用して行った。ｑＰＣＲは、３８４ウェルブロックモジュールおよび自動化アクセサリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行った。遺伝子発現をβ２ｍに対して正規化し、２ΔＣ（ｔ）計算を使用して差を決定した。

【0167】

【表2】

【0168】

γδＩＥＬの単細胞ＲＮＡシークエンシング
ＩＥＬを単離した後に、細胞を、製造元（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）の指示に従って、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎで染色した。精製抗マウスＣＤ１６／３２（９３）ならびに各２％の正常マウス血清、ラット血清、およびハムスター血清（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を使用してＦｃ受容体をブロックし、以下の抗体を使用して細胞を染色した：ＣＤ４５－ＢＶ５１０（３０－Ｆ１１）、ＣＤ８α－ＡＦ７００（５３－６．７）、ＣＤ８β－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＹＴＳ１５６．７．７）、ＴＣＲβ－ＢＶ７１１（Ｈ５７－５９７）、ＴＣＲγδ－ＰＥ／Ｃｙ７（ＧＬ３）。各試料についてマウス２匹をプールした。

【0169】

γδＩＥＬを、ＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓ ＥＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を使用して各試料から選別した。各試料の３分の２を、ＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）中に再懸濁させて、バルクＲＮＡシークエンシングのために処理した。各試料の３分の１は、遺伝子型毎に小腸のセグメント毎にプールし、０．０４％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中に再懸濁させて、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にローディングした。ＲＮＡｓｅｑおよびＶ（Ｄ）Ｊライブラリーを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ＆Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。増幅後、ｃＤＮＡをＲＮＡｓｅｑおよびＶ（Ｄ）Ｊライブラリーのアリコートに分割した。Ｖ（Ｄ）ＪライブラリーのアリコートをγδＴＣＲに関してエンリッチするために、ｃＤＮＡを２つの１０ｎｇアリコートに分割し、施設内で設計されたプライマーを使用して２回のラウンドで増幅した。特に、以下のプライマーを増幅の第１ラウンドに使用した：ｓｈｏｒｔ Ｒ１にはＭＰ１４７（ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ）（配列番号２２）、マウスＴＲＧＣ１－３にはＭＰ３７１（／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＲＧＴＡＴＴＧ）（配列番号２３）、マウスＴＲＧＣ４にはＭＰ３７２（／５Ｂｉｏｓｇ／ＣＡＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴ）（配列番号２４）およびマウスＴＲＤＣにはＭＰ３６９（／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧ）（配列番号２５）。第２ラウンドの増幅のためには、第１ラウンドからの２０ｎｇアリコートを、ｓｈｏｒｔ Ｒ１にはＭＰ１４７（ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣ）（配列番号２６）、ｎｅｓｔｅｄ Ｒ２＋マウスＴＲＧＣにはＭＰ３７３（ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＹＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴ）（配列番号２７）、およびｎｅｓｔｅｄ Ｒ２＋マウスＴＲＤＣにはＭＰ３７０（ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＴ）（配列番号２８）を使用して、さらに増幅した。

【0170】

Ｖ（Ｄ）Ｊライブラリーを、２５ｎｇのそれぞれｍＴＲＧＣおよびｍＴＲＤＣ増幅ｃＤＮＡから調製した。ＲＮＡｓｅｑライブラリー（リード１：ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）および細胞バーコード用の２６ｂｐ、８ｂｐ ｉ７試料インデックス、０ｂｐ ｉ５、ならびにリード２：５５ｂｐ転写物リード）およびＶ（Ｄ）Ｊライブラリー（リード１：１５０ｂｐ、８ｂｐ ｉ７試料インデックス、０ｂｐ ｉ５、およびリード２：１５０ｂｐリード）について、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００でペアエンドシークエンシングを行った。ＲＮＡｓｅｑライブラリーについては、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ｖ２．２．０）を使用して、試料の多重分離、アラインメント、フィルタリング、およびＵＭＩ計数を行った。アラインメントには、マウスｍｍ １０ゲノムアセンブリおよびマウスのＲｅｆＳｅｑ遺伝子モデルを使用した。Ｖ（Ｄ）Ｊライブラリーについては、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ｖ２．２．０）を使用して、試料の多重分離、リードペアのコンティグへのデノボアセンブリ、ＩＭＧＴからのすべての生殖系列セグメントＶ（Ｄ）Ｊ参照配列に対するコンティグのアラインメントおよびアノテーション、ＣＤＲ３領域の標識および位置決定、クローン型のグループ分けを行った。

【0171】

単細胞ＲＮＡシークエンシングデータ解析
ｓｃＲＮＡｓｅｑデータを、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８．３６：４１１）を使用して解析した。５００個未満の遺伝子を有するかまたはミトコンドリアＲＮＡ含有量の１０％超を有する細胞は、品質管理（ＱＣ）工程において除外した。残りの細胞は、高度に可変的な遺伝子に対してＰＣＡによる次元削減を受けた。データをさらに、一様多様体近似および射影（ＵＭＡＰ）を使用して、最初の２０個のＰＣ上の２Ｄ空間に削減した。細胞クラスターは、Ｓｅｕｒａｔに実装されたグラフベースの不偏クラスタリングアプローチを使用して決定された。各クラスターを規定する陽性マーカーは、ウィルコクソン順位和検定を使用して同定した。各クラスターに対して６つの代表的マーカーを選択し、ヒートマップで可視化した。

【0172】

単細胞ＴＣＲシークエンシングデータ解析
Ｖ（Ｄ）Ｊ配列をアセンブリしてアノテーションを行った後、有効なγおよびδＴＣＲ配列のみを保った。ｉＮＥＸＴ Ｒパッケージ（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１６．７（１２）：１４５１～５６；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，２０１４．８４（１）：４５～６７）を使用して、各試料について２つのＴＣＲ多様度指標（すなわち、種の豊富さおよびシャノンエントロピー指数）を推定した。種の豊富さは固有クローンの総数を測定し、シャノン指数はデータセットからランダムに抽出された配列の同一性を予測する際に不確定度を計算した。補間および外挿された多様度の両方を推定し、９５％信頼間隔は５０回のブートストラップに基づいた。ＴＣＲレパートリーを、Ｔｒｅｅｍａｐ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｔｒｅｅｍａｐ）を使用して可視化した。下流ＴＣＲ解析、例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊの使用、共通のＴＣＲ、およびＴＣＲとＲＮＡ－ｓｅｑとの統合は、カスタマイズされたＲスクリプトを使用して行った。

【0173】

バルクＲＮＡシークエンシングおよびデータ解析
ｃＤＮＡを合成し、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して５ｎｇの全ＲＮＡから増幅させた（１６サイクルのＰＣＲ）。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、１ｎｇのｃＤＮＡを入力として使用して、最終的なシークエンシングライブラリーを作製した（ライブラリーを増幅するために１２回のＰＣＲサイクルを実施）。増幅されたライブラリーを４００～６００ｂｐでサイズ選択した。シークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、２×１００サイクルでの多重化ペアリードランによって行った。シークエンシングリードを、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ（ＯｍｉｃＳｏｆｔ）を使用して、カスタマイズされたマウスゲノムに対してマッピングした。センス鎖エクソンリードを使用して、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏに実装されたＲＳＥＭアルゴリズムによって遺伝子の発現レベルを定量した。遺伝子には、最小限で１０個のリードで検出できるものとしてフラグを付した。Ｄｅｓｅｑ２（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４．１５（１２）：５５０）を使用して、差次的発現遺伝子解析を行った。変化倍数の絶対値が１．５を上回り、かつＦＤＲが０．０５未満である遺伝子を、有意に差次的に発現しているとみなした。差次的発現遺伝子を、ＮｅｘｔＢｉｏ（ｗｗｗ．ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍ）のＲｕｎｎｉｎｇ Ｆｉｓｈ直接検定を使用する経路エンリッチメント解析に供した。ＴＣＲ超可変領域配列を、ＴＲＵＳＴ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１７．４９（４）：４８２～８３）を使用して再構成した。

【0174】

統計
群内の統計的有意性（ｐ値）は、以下の統計検定のうちのいずれか１つを使用して決定した：同程度のＳＤを仮定した非対応ｔ検定；Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ；またはＳｉｄａｋの多重比較事後検定による通常の二元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して行った。試料は生物学的反復試験として定義され、グラフを作成するために技術的反復試験は使用されなかった。各実験を少なくとも３回繰り返した。試料のサイズおよび数、ならびに使用した統計検定は、それぞれの図の凡例に示されている。

【実施例2】

【0175】

Ｂｔｎｌ２は小腸上皮細胞において選好的に発現される
ホメオスタシスの際に腸におけるＢｔｎｌ２の発現パターンを決定するために、Ｂｔｎｌ２－ＬａｃＺノックインマウスを作製し、これを以下ではＢｔｎｌ２－ＫＯマウスと称する（図１Ａ）。図１Ｂに示されるように、Ｂｔｎｌ２は主に小腸の最終分化したＩＥＣにおいて発現された。重要なことに、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４、およびＢｔｎｌ６（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６．１６７（１）：２０３～２１８）とは異なり、Ｂｔｎｌ２発現は十二指腸ブルンネル腺ならびに十二指腸、空腸、回腸および結腸の腺窩で検出され、これにより、それらの領域特異的発現パターンによって規定される異なるＢｔｎｌについて考えられる多様な役割が示された（図１Ｂ）。この観察をさらに検証するために、十二指腸、空腸、回腸および遠位結腸から単離された最終分化した腸細胞に由来するＩＥＣにおけるＢｔｎｌ２ ｍＲＮＡレベルを測定した。Ｂｔｎｌ２は十二指腸ＩＥＣにおいて高度にエンリッチしており、近位から遠位に向かうにつれて減少する勾配を有し、その結果、ＷＴマウスの結腸から単離されたＩＥＣにおけるＢｔｎｌ２発現は、回腸における発現よりも約５分の１の低さであった（図１Ｃ）。同様に、ＢＴＮＬ２転写物は小腸では検出されたが、健康なヒト組織からプールされた結腸試料では検出されなかった。

【0176】

Ｂｔｎｌ２遺伝子がＨ２座位および他のＢｔｎｌに近接していることを考慮して、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの十二指腸、空腸および回腸から単離したＩＥＣ画分におけるいくつかの隣接遺伝子の発現レベルを、バルクＲＮＡシークエンシングによって調べた。Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ａｂ１、Ｈ２－Ｅｂ１、Ｔａｐ１／２、ＢＣ０５１１４２、Ｂｔｎｌ４、Ｂｔｎｌ５、Ｂｔｎｌ６、Ｎｏｔｃｈ４およびＰｐｔ２遺伝子の発現レベルについて、小腸の異なるセグメントにわたっての有意な変化は観察されなかったが、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスはＢｔｎｌ１のレベルが低い傾向を示し（図８）、これにより、Ｂｔｎｌ２とＨ２座位付近の隣接遺伝子との有意な共調節がないことが示された。以上を総合すると、このデータにより、小腸の異なるセグメントにわたっての最終分化した腸細胞におけるＢｔｎｌ２の選好的な発現が確認され、これにより、Ｂｔｎｌ２の区画特異的な機能が示された。

【実施例3】

【0177】

Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは回腸において選好的にγδＩＥＬの頻度の増加を示す
ホメオスタシス条件下において、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは、体重減少、上皮脱落の増加、および炎症誘発性サイトカインによって決定されるようないかなる有害な腸病変も示さなかった（図９Ａ～Ｂ）。加えて、ＩＥＣの分化および成熟に関連する遺伝子の有意な変化は観察されず、これにより、ＩＥＣの発生および維持が未処置Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスにおいて変化しないことが示された（図９Ｃ）。

【0178】

Ｂｔｎｌ／ＢＴＮ／ＢＴＮＬファミリーのメンバーがγδＴ細胞区画の形成に関与しているという進展中のパラダイムを考慮し、小腸の異なるセグメントにおけるＢｔｎｌ２の選択的発現パターンへの関心を受けて、Ｂｔｎｌ２の欠損は小腸の異なるセグメントにおけるγδＩＥＬサブセットの維持に影響を及ぼす可能性があるとの仮説を立てた。これを目的として、成体Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの十二指腸、空腸および回腸からＩＥＬを単離した。γδＩＥＬは、ＷＴマウスの回腸と比較して十二指腸において約３倍の高さの頻度で見出された（全細胞中の３０．７％対８．６２％、図２Ａの右パネル）。しかし、ＷＴ同腹仔と比較して、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは空腸（２７．１％対２０．１％）および回腸（１２．８％対８．６％）においてγδＩＥＬの頻度の３０～４０％の増加を示すが、十二指腸（２９．４％対３０．７％）では示さないことが観察された（図２Ａ）。注目すべきことに、この増加は主に回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬで観察され、これにより、Ｂｔｎｌ２がインサイチューでそれらの増殖能力を抑制する可能性が示された（図２Ａ）。Ｖγ７^＋ ＩＥＬの数は１１～１６週齢の若年成体においてプラトーに達することが報告されているため（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６．１６７（１）：２０３～２１８）、回腸γδＩＥＬのパーセンテージに対するＢｔｎｌ２の観察された効果が、マウスが成体中期に近づくにつれて変化するか否かを調べた。以前の研究で、ＷＴマウスでは、ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬを含む回腸γδＩＥＬの頻度が、生後６か月を過ぎても一定に保たれることが示唆されている。これに対して、γδＩＥＬの頻度は施設内のＷＴマウスでは生後６か月で５０％減少することが観察された（全γδＩＥＬ中の３９．５％対１７．１％）（図２Ｂ）。その反対に、αβＩＥＬの頻度は６か月齢では比較的変化しないままに保たれ、これにより、αβＩＥＬがおそらくはインサイチュー増大を通してそのレベルを能動的に維持することが示された（図２Ｃ）。γδＩＥＬはＷＴマウスと比較して若年成体（４か月齢までの）Ｂｔｎｌ２－ＫＯの回腸において有意に増加するが（ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬ中の３６．９％対２２．３％）、成熟成体マウスは同程度のレベルのγδＩＥＬを示すことが見出された（図２Ｂおよび２Ｄ）。Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスでは、この期間中にαβＩＥＬは有意に変化しなかった（図２Ｃ）。このため、若年成体マウスにおけるＢｔｎｌ２の効果から、これがホメオスタシス条件下でのγδＩＥＬの維持に役割を果たすことが示された。注目すべきことに、γδＴ細胞は、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの十二指腸、空腸および回腸の粘膜固有層（ＬＰ）、腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）ならびにパイエル板（ＰＰ）において同程度の頻度で観察され、これにより、Ｂｔｎｌ２がγδＣＤ８αα^＋ＩＥＬに対して特異的にその機能を発揮することが示された（図２Ｅ）。

【0179】

以前の研究で、組換えＢｔｎｌ２が、インビトロで特定の活性化条件下でｍＬＮ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖を阻害し、Ｔｒｅｇ細胞の分化を促進することが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６．１７６（１２）：７３５４～６０）。ところが、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスの回腸ＬＰ、ｍＬＮ、およびＰＰにおいて、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３^＋ Ｔｒｅｇの同程度の頻度が観察された。さらに、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは、異なる組織にわたって同等の免疫細胞プロファイルを示し、これにより、空腸および回腸のγδＩＥＬに対する腸におけるＢｔｎｌ２の効果の特異性および局在的効果が強く示された（図１０Ａ～Ｃ）。

【実施例4】

【0180】

Ｂｔｎｌ２は空腸／回腸γδＩＥＬの増殖を抑制する
Ｂｔｎｌ２が空腸および回腸γδＩＥＬに及ぼす効果を調べるために、Ｔ細胞増殖の抑制するその能力を調べた。Ｂｔｎｌ２の阻害機能は、インビトロでは、同時に起きるＴＣＲ刺激、およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のＢｔｎｌ２受容体と推定されるものとのライゲーションに依存することから、ＣＦＳＥで標識したＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、等モル濃度のプレート結合Ｂｔｎｌ２－ｍＦｃ、Ｐｄｌ１－ｍＦｃ、Ｐｄｌ２－ｍＦｃまたはｍＦｃの存在下で活性化させた（図１１Ａ）。７２時間の培養後に、組換えＢｔｎｌ２は、ＣＦＳＥ希釈およびサイトカイン産生の４０％を上回る減少によって立証されるように、Ｐｄｌ１およびＰｄｌ２と同様にＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖および活性化を強力に抑制することが見出された（図１１Ｂ～Ｃ）。ＣＤ２８共刺激により、ＴＮＦａおよびＩＦＮｇの産生がレスキューされたが、ＩＬ－２の産生はレスキューされず（図１１Ｃ）、これは、活性化されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のその受容体と推定されるものへのＢｔｎｌ２結合の約５０％の減少とも一致した（図１１Ｄ）。

【0181】

次に、Ｂｔｎｌ２がインビトロでγδＩＥＬの増殖を抑制するか否かを調べた（図１２Ａ）。十二指腸由来のものと同等の数を得るために、ＩＥＬを空腸および回腸からプールした。図３Ａに示されるように、十二指腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬはそれらの空腸／回腸対応物と比較してより大きな増殖能力を示し、これにより、十二指腸および空腸／回腸γδＩＥＬが異なるＴＣＲおよび／またはサイトカイン刺激を必要とする可能性が示された。組換えＢｔｎｌ２およびＰｄｌ１は、十二指腸および空腸／回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬの両方の増殖を強力に阻害した（図３Ａ～Ｂ）。しかし、Ｂｔｎｌ２の抑制効果は、十二指腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬで観察されたものと比較して、空腸／回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬ増殖に対して２倍の高さであった（図３Ｂ）。重要なことに、組換えＢｔｎｌ２は、十二指腸または空腸／回腸ＣＤ８ａｂ^＋およびＣＤ８αα^＋αβＩＥＬの増殖を阻害することができず、これにより、Ｂｔｎｌ２受容体と推定されるものがこれらの細胞上には存在しない可能性が示された（図３Ｂ）。α－ＣＤ３刺激に対するＢｔｎｌ１－ＫＯ γδＩＥＬのより強い反応性を示す以前の報告（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６．１６７（１）：２０３～２１８）に反して、十二指腸および空腸／回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδおよびαβＩＥＬは、それらのＷＴ対応物と比較して等しい増殖能力を示すことが見出され、これにより、Ｂｔｎｌ２欠損は、ＴＣＲおよびサイトカイン刺激に反応するＩＥＬの能力を損なわないことが示された（図１２Ｂ）。さらに、組換えＢｔｎｌ２は、インビトロでのＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ空腸／回腸γδＩＥＬの増殖を同程度に阻害した（図３Ｃ）。Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ空腸／回腸γδＩＥＬはまた、共阻害受容体（例えば、ＰＤ１）ならびに組織常在、成熟および活性化に関連するマーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２７、ＣＤ１２２）についても同等の発現プロファイルを示した（図１２Ｃ）。以上を総合すると、これらのデータは、Ｂｔｎｌ２が空腸／回腸ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬ増殖を選好的に抑制することを示す。

【0182】

インビボでのＢｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬの増殖能力を決定するために、γδＩＥＬへのＢｒｄＵの取込みを測定した。図３Ｄ～Ｅに示されるように、高度のＢｒｄＵ取込みが、第３日までにＷＴ ＣＤ８αα^＋ γδＩＥＬにおいて観察された。注目すべきことに、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬはそれらのＷＴ対応物よりも約２倍の多さでＢｒｄＵを取込み（９．８６±１．５２対５．８７±１．１８）、これにより、Ｂｔｎｌ２の非存在下でのγδＩＥＬの増殖能力の強化が強く示された（図３Ｄ、Ｅ）。以上を総合すると、これらの観察は、Ｂｔｎｌ２が、回腸における成熟γδＩＥＬの増殖を制限することによってγδ免疫チェックポイント分子として働き、可能性としては、正常な上皮寿命の間にそれらのエフェクター応答を調節することを示している。

【実施例5】

【0183】

回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬは抗菌応答モジュールの抑制を示す
Ｂｔｎｌ２欠損がγδＩＥＬの細胞溶解能に及ぼす影響について洞察を得るために、定常状態にある同時飼育した１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの十二指腸、空腸および回腸からエンリッチされたγδＩＥＬのトランスクリプトーム解析を行った。回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬではＷＴ対応物と比較して、２００種を上回る遺伝子が有意にダウンレギュレートされており（ＦＤＲ＜０．０５および変化倍数＞１．５）（図４Ａ）、一方、十二指腸および空腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬではＢｔｎｌ２のみが有意に減少した（図４Ｂ）。ダウンレギュレートされた上位５０種の遺伝子には、シグナル伝達分子（例えば、Ｒａｐｈ１、Ｃｙｒ６１、Ｔｓｐａｎ８）、細胞増殖およびアポトーシスの転写調節因子（例えば、Ｉｄ１、Ｐｂｘ１、Ｎｕｐｒ１、Ｈｏｘｂ７）、増殖因子（例えば、Ｋｉｔｌ、Ｗｎｔ３、Ｆｇｆｂｐ１）、抗菌分子（例えば、Ｉｆｉ２７ｌ２ｂ、Ｃｃｌ２５、Ｇｓｄｍｃ３／４）、ならびに種々のクラスの代謝分子（例えば、アミノ酸－Ｍｇｓｔ１、脂質－Ｆａｂｐ６、Ｐｎｌｉｐｒｐ２、イオウ－Ｓｕｌｔ１ｃ２、Ｃｔｈ、炭酸脱水酵素－Ｃａｒ８）（図４Ａ～Ｂ）が含まれた。まとめると、これらの観察は、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬの代謝機能が、回腸ＷＴ γδＩＥＬと比較してある程度低下していることを示唆する。

【0184】

これらの知見と一致して、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析から、最も有意に調節不全となる生物学的プロセスは細菌耐性および排除を中心とすることが明らかになり、これにより、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬは、定常状態で抗菌分子を分泌する能力の障害を示すことが強く示された（図４Ｃ）。インターフェロン誘導型分子、およびα－ディフェンシン抗菌ペプチドファミリーのいくつかのメンバーは、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬにおいて、それらのＷＴ対応物と比較して有意にダウンレギュレートされている遺伝子の中に見出された（図４Ｄ）。それ故に、これらの知見は、回腸におけるγδＩＥＬは、十二指腸または空腸におけるものとは異なり、局所微生物抗原に反応して抗菌分子を分泌することに特化している可能性を示す。

【実施例6】

【0185】

単細胞ＴＣＲシークエンシングにより、Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬにおいてレパートリー多様度がより大きいことが強く示される
回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬで観察された抗菌応答モジュールのダウンレギュレーションが、γ／δＴＣＲレパートリーの変化に関連するか否かを明らかにするために、Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウス由来の十二指腸、空腸、および回腸γδＩＥＬに対して、偏りのない単細胞ＴＣＲシークエンシングを行った。合計２８，６７９個の細胞をシークエンシングし、２４，９６１種の有効なγ鎖および２４，５１５種の有効なδ鎖を再構成した。シークエンシングを行ったすべての細胞のうち、１７，２６０個の細胞（６０．２％）は対になったγ鎖とδ鎖を有した。ＴＲＧＶおよびＴＲＤＶ遺伝子の使用は、十二指腸、空腸および回腸においてＢｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬとＷＴ γδＩＥＬとの間で同等であることが見出された（図５Ａ）。ＴＲＧＶ７遺伝子の使用はＴＣＲγ鎖の平均５０％であったが、一方、ＴＲＤＶ２－２、ＴＲＤＶ５、ＴＲＤＶ６Ｄ－１およびＴＲＤＶ６Ｄ－２遺伝子は等しく表しており、それらを合わせた遺伝子使用はＴＣＲδ鎖の８０％を上回った。回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬは、ＷＴ対応物よりもＴＲＧＶ７遺伝子の使用頻度が低かった（５１．０％対５３．２％）。しかし、それらはより頻度の低いＴＲＧＶ４遺伝子の使用頻度が高かった（１１．５％対８．６％、Ｐｅａｒｓｏｎカイ二乗検定、ｐ＝１．７８×１０^－７）。同様に、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬでは、ＷＴ対応物と比較して、ＴＲＤＶ２－２およびＴＲＤＶ６Ｄ－２遺伝子の使用が減少しており（それぞれ２３．２％対２５．３％、２１．９％対２６．２％）、一方、ＴＲＤＶ６Ｄ－１遺伝子（１８．６％対１３．４％）および使用頻度の低いＴＲＤＶ１２遺伝子（１．５２％対０．８７％）の使用は増加していることが示された。

【0186】

ＴＣＲγ鎖およびδ鎖のクローン型を確立するために、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）において同一のアミノ酸配列を有する同一のＶ遺伝子およびＪ遺伝子セグメントによってコードされるＴＣＲγおよびδ配列を同定した。Ｒ ｉＮｅｘｔパッケージ（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１６．７（１２）：１４５１～５６）を使用して、２つの測定基準（種の豊富さおよびシャノン多様度）を計算し、各試料のＴＣＲ多様度を推定した。全体として、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬは、補間および外挿データの両方の測定で、ＷＴ γδＩＥＬよりも一貫して高いＴＣＲγ鎖の多様度を有した。例えば、５０回のブートストラップ反復試験によって各試料から３５００種のγ鎖をランダムにサンプリングしたところ、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯγ鎖の平均シャノン多様度は２５５．６であり、ＷＴにおける２２６．８よりも有意に高いことが観察された（ｐ＝０．００１９、Ｔ検定）（図５Ｂ）。十二指腸および空腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬもまた、ＷＴ γδＩＥＬと比較してＴＣＲγ鎖において多様度がより高い傾向を示したが、それらの回腸対応物と比較した場合、その差はわずかであった（３５００種のγ鎖をサンプリングした場合、シャノン多様度についてそれぞれｐ＝０．０６１６および０．２４２９、図５Ｂ）。回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬでは、ＴＣＲδ鎖の多様度が増加していたが（図５Ｃ）、３つのセグメントすべてから単離したＢｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬは、ＴＲＤＶレパートリーの５０％を構成する固有のクローン型の頻度の増加を示した（十二指腸：１９．０％対１７．６％；空腸：２０．２％対１８．６％；および回腸：１８．５％対１８％）（図５Ｄ）。対照的に、対になったγ／δ鎖の全体的なレパートリーの多様度は、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬ（図５Ｃ）ではわずかに変化した。まとめると、これらの結果から、回腸ＴＣＲγδレパートリーの多様度が、宿主および微生物の抗原および代謝産物の両方によって連続的に形作られ、その結果、回腸γδＩＥＬの頻度の変動、ならびに抗菌応答モジュールの摂動が、有意なクローン修正を導いた可能性があることが示された。

【実施例7】

【0187】

共有されるＴＣＲクローン型は回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬにおいて異なる頻度を示す
固有のＢｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤＲ３γクローンに加えて、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤＲ３γクローンの上位２０種のうち１９種は、縮小または増大クローンとして回腸ＷＴ γδＩＥＬによって共有されており、これはＷＴ γδＩＥＬと比較してＢｔｎｌ２－ＫＯにおけるＴＲＧＶレパートリーの多様度に寄与する可能性がある（図６Ａ）。全体として、ＣＤＲ３γクローンの約４０％は、各セグメントにおいてＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬによって共有された（図１３Ａ～Ｃ）。ＴＣＲδ鎖において、各セグメントは、多数の固有のＣＤＲ３δクローン、およびＢｔｎｌ２－ＫＯマウスとＷＴマウスとの間で共有される３％未満のクローンによって特徴付けられた（図１３Ｂ～Ｃ）。Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、より多くのＣＤＲ３δおよびＣＤＲ３γクローンが空腸および回腸γδＩＥＬによって共有され（それぞれ１３１対７２および２７０対１７９）、これにより、小腸における移行セグメントとしての空腸が強く示された（図１３Ｄ）。１つのＣＤＲ３γ／δ対を有するＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ γδＩＥＬは、それらのＣＤＲ３γ／δクローンレパートリーの重複を事実上示さず（０．４％未満）、これにより、個々のマウスが固有のγ鎖－δ鎖対形成を有することが強く示された（図１４Ａ～Ｂ）。それにもかかわらず、ＣＤＲ３γ／δ対クローンの最大１３％は、２つのセグメントまたは３つのセグメントすべての間で重複しており、これにより、個々のマウスにおいてすべてのセグメントに存在する優性ＣＤＲ３γ／δ対の存在が示された（図１３Ｃ）。

【0188】

次に、ＣＤＲ３γ配列を、個々の各マウスからのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して再構築した。単細胞ＴＣＲシークエンシングデータによって明らかになった最も頻度の高い回腸ＣＤＲ３γクローンは、異なる個々のマウスでも見出され、これにより、単細胞ＴＣＲレパートリーが個々のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ ＣＤＲ３γの多様度の正確な表現であることが示された（図６Ｂ）。上位の回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤＲ３γクローンは、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ１およびＴＲＧＶ７遺伝子も含んでおり、一方、回腸ＷＴ ＣＤＲ３γクローンはほぼ例外なくＴＲＧＶ７を保有していた（図６Ｃ）。最も頻度の高いＣＤＲ３γ鎖（Ｖγ７－Ｊ１、ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９））については、このＣＤＲ３γアミノ酸配列を有するＩＥＬの約７０％が同じＤＮＡ配列から翻訳されており、これは１つの前駆体のクローン増大、または各クローンにおいて別個のＶδ配列と対をなす反復的で独立した組換えに起因しており、一方、ＩＥＬの残りは、異なるＤＮＡ配列を有するより小さなクローンに由来した可能性がある（図６Ｄ）。同様の収束性Ｖγ組換えは、頻度の高いヒトＶγ９^＋クローン型で観察されており、それらの豊富さは出生時からあらかじめ設定されていると提唱されている。同様に、最も頻度の高いＶγ７^＋クローン型は、１つの主要な収束性組換えイベントおよびいくつかの少数の独立した収束性組換えイベントに由来していた。これらの知見により、γδＩＥＬの一般的なＴＲＧＶクローン型の存在が強く示され、対になったＴＲＧＶ／ＴＲＤＶレパートリーの多様度がＣＤＲ３δ配列によって推進される可能性が示された。

【実施例8】

【0189】

共有されるＣＤＲ３γのγδＩＥＬトランスクリプトームはＣＤＲ３δとの対形成によって形成される
ＴＣＲとγδＩＥＬトランスクリプトームとの間の関係をさらに調べるために、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを、ＴＣＲシークエンシングのためにプロファイリングしたのと同じ十二指腸、空腸および回腸のγδＩＥＬに対して行った。各試料中に９つのクラスターが同定され（図１５Ａ）、クラスター０、１および３における単一のγδＩＥＬのトランスクリプトームは十二指腸起源と回腸起源との間で区別され、空腸γδＩＥＬは中間のトランスクリプトームプロファイルを示した（図１５Ａ～Ｂ）。

【0190】

各単細胞クラスターで検出された上位２０種のマーカーを、最近のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびバルクＲＮＡｓｅｑの報告（Ｍａｙａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１９．１７６（５）：９６７～９８１．ｅ１９；Ｃｒｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１８．４９（５）：９７１～９８６．ｅ５．）に記載された分子シグネチャーと共に使用したところ、γδＩＥＬクラスターを識別するためのγδＩＥＬ属性、例えば、分化段階、成熟、およびエフェクタープロファイルが提唱された（図１５Ｃ）。クラスター０および１は、成熟した細胞溶解性の高いＩＥＬを含み、クラスター２および３は未熟ＩＥＬを含み、一方、クラスター４は、抗原媒介性分化などの転写変化を受ける新たに活性化されたＩＥＬからなる（図１５Ｃ）。残りのＩＥＬは、クラスター５（Ｉｓｇ１５、Ｉｒｆ７、Ｓｔａｔ１）におけるＩ／ＩＩＩ型インターフェロン応答などの特化したエフェクタープロファイルを有するより小さなクラスターと、クラスター６（Ｋｌｆ２、Ｔｈｙ１、Ｓ１ｐｒ１、ＣＤ８ｂ１、Ｓｅｌｌ）における最近遊出したＣＤ８β^＋ＩＥＬ前駆体などのサブセット特異的分化段階に細分された（図１５Ｃ）。ＴＲＧＶ分布に関しては、ＴＲＧＶ７遺伝子の使用はクラスター０～４で優勢であったが、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬでは、ＷＴの対応物と比較してクラスター１におけるＴＲＧＶ７の頻度が低下しており、ＴＲＧＶ１およびＴＲＧＶ４の頻度が高かった（それぞれ４０．４％対４５．９％、１５．２％対１０．３％、および１３．１％対９．５％；図１５Ｄ）。

【0191】

次に、最も一般的な回腸ＣＤＲ３γを使用して、異なるセグメントおよび遺伝子型（Ｖγ７－Ｊ１、ＣＡＳＷＡＧＹＳＳＧＦＨＫＶＦ（配列番号２９））にわたる全ＣＤＲ３γクローンの約１０％を範囲に含む、ＣＤＲ３γ／δ対形成の分布を検討した。最上位のＣＤＲ３γ鎖は、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬのクラスター０において選好的にエンリッチされており（５１．３％対３７．２％）、これは最大数の成熟および細胞溶解性分子によって規定され（図１４Ｃ）、ＷＴ γδＩＥＬのクラスター１において優勢であることが見出された（４７．４％対３１．５％）（図６Ｃ）。同じヌクレオチド配列を有する上位のγ鎖と異なるＣＤＲ３δ配列との対形成により、対のトランスクリプトームが形成されたが、これはそれらが特定のクラスターと選好的に関連するためである（図６Ｄ）。

【0192】

まとめると、これらのＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｃＴＣＲ－ｓｅｑの観察は、Ｂｔｎｌ２欠損が回腸γδＩＥＬのトランスクリプトームならびにＴＲＧＶ／ＴＲＤＶレパートリーを変化させ、その結果、それらの抗原特異的および抗菌応答が変化することを示す。本開示は、腸γδＩＥＬトランスクリプトームおよびＴＣＲレパートリーの多様度を単細胞分解能で同時に記述した最初のものであり、免疫調節性分子の組織特異的発現によって推進される区画特異的免疫応答の説明となり得る、十二指腸、空腸および回腸γδＩＥＬにおけるこれまで特徴付けられていなかった不均一性を明らかにした。

【実施例9】

【0193】

Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは慢性ＤＳＳ誘発大腸炎においてより重篤な腸炎を呈する
Ｂｔｎｌ２発現は、小腸と比較して結腸で減少している（図１Ｃ）。しかし、結腸Ｂｔｎｌ２レベルの顕著なアップレギュレーションが、大腸炎のＷＴマウスで観察された。次に、その欠損の影響を、ＤＳＳ誘発上皮傷害の状況における粘膜免疫応答について評価した。同時飼育したＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴ同腹仔を、ＤＳＳを７日間投与した後に水を８日間与えることによって、ＤＳＳ誘発大腸炎に供した。Ｂｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスは、同等の体重減少、ならびに腸傷害および好中球増加のバイオマーカーであるミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）レベルの上昇によって示されるように、疾患の初期相（第７日）において同等の腸損傷を示したが（図７Ａ～Ｄ）、Ｂｔｎｌ２－ＫＯマウスは、腸炎の修復相において、ＷＴ同腹仔と比較して体重回復の有意な遅延を示すことが観察された（図７Ａ）。観察された回復遅延は、ＷＴ同腹仔と比較して、有意に短い結腸、グランザイムＡレベルの上昇、ならびに結腸におけるより大きな病理組織学的損傷およびＭＰＯ活性を伴った（図７Ｂ～Ｄおよび７Ｆ）。注目すべきことに、ＤＳＳ処置したＢｔｎｌ２－ＫＯマウスでは、結腸において炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－６、ＫＣ－ＧＲＯ、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βのレベルが約２倍の高さであった（図７Ｅ）。対照的に、ＭＰＯ活性、炎症誘発性サイトカインおよびグランザイムＡのレベルは、ＤＳＳ処置したＢｔｎｌ２－ＫＯマウスの回腸において、ＷＴ同腹仔と比較して有意に変化しなかった（図１６Ａ～Ｃ）。これらの結果を裏付けるように、Ｂｔｎｌ２転写物は、ＤＳＳ処置したＷＴマウスの結腸では増加したが、他のファミリーメンバー、例えば、Ｂｔｎｌ１およびＢｔｎｌ６のレベルは、ＤＳＳ処理によって低下した（図７Ｇ）。Ｂｔｎｌ２転写物はＤＳＳ処置した回腸では変化せず、これにより、結腸におけるＢｔｎｌ２発現は、損傷部位でのフィードバック調節機構として誘導されて、ＤＳＳ誘発炎症を減弱させて回復プロセスを促進する可能性が示された（図１６Ｄ）。

【実施例10】

【0194】

進展しつつある研究では、Ｂｔｎ／Ｂｔｎｌファミリーの分子を、γδＴ細胞の開発の中心に位置付けている。本開示は、回腸γδＩＥＬ維持の調節因子としてのＢｔｎｌ２に光を当てる。特に、Ｂｔｎｌ２は、γδＩＥＬ上の未同定の受容体に対する共阻害リガンドとして作用し、ホメオスタシス条件下で回腸γδＩＥＬの増殖およびセグメント特異的エフェクタープロファイルの両方を調節する。

【0195】

セグメントに焦点を当てたアプローチにより、時間的および空間的ウィンドウが観察され、その間、Ｂｔｎｌ２は腸γδＩＥＬに対してその機能を発揮した。ＳｃＴＣＲｓｅｑにより、Ｖγ７^＋ ＩＥＬが１１週齢のＢｔｎｌ２－ＫＯおよびＷＴマウスの小腸で優勢であることが明らかになり、これにより、それらの発生が影響を受けないことが示された。Ｂｔｎｌ２は回腸においてγδＩＥＬの増殖に選好的に影響したが、その欠損は小腸の異なるセグメントに影響を及ぼした。特に、Ｂｔｎｌ２はインビトロでは十二指腸および空腸／回腸の両方でγδＩＥＬ増殖を抑制する能力があったにもかかわらず、インビボでは回腸γδＩＥＬの増大のみに限られた。しかし、分子レベルでは、Ｂｔｎｌ２欠損はＶγ７^－ ＩＥＬの中でのＶγ使用の変化を導き、小腸の３つのセグメントすべてでＶδ使用を同様に変化させたことから、これにより、小腸の異なるセグメントにわたってのＢｔｎｌ２の重複的であると共に特有の役割が示された。これは続いて回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬにおける調節不全の抗菌モジュールを伴い、このことは粘膜修復およびセグメント指向性病原微生物の排除に関連する可能性がある。

【0196】

領域特異的な効果と一致して、十二指腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ ＣＤＲ３γおよびＣＤＲ３γ／δクローンレパートリーは、同時飼育したＷＴ同腹仔で同定されたものと著しい違いはなく、これは回腸が定常状態でのＢｔｎｌ２媒介性調節の主要部位であることを強く示す。重要なこととして、個々のＢｔｎｌ２－ＫＯマウスの回腸区画に最も豊富に存在するＶγクローンには、ＷＴマウスにのみ豊富に存在するＶγ７^＋クローンとは対照的に、Ｖγ１^＋およびＶγ４^＋クローンが含まれた。Ｂｔｎｌ２は、成体初期におけるＶγ７^＋ＴＣＲのリガンド（すなわち、Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ６）の共調節に重要であると考えられる。γδＴＣＲのこの動的リモデリングを裏付けるように、Ｂｔｎｌ２の欠損は、種々の収束性組換えイベントを導き、その結果、最も頻度の高いＶγ７^＋クローン型と別個のＶδ配列との対形成が、回腸γδＩＥＬのトランスクリプトームプロファイルを規定した。部位特異的な代謝産物レベルおよび／または抗原圧が、複数の独立したインサイチュー組換えイベントを導いた可能性があり、これはγδＩＥＬの局所環境抗原に対する適応挙動を示す。絨毛－陰窩軸方向に沿った回腸γδＩＥＬの運動性は微生物叢の存在に厳密に依存するため、抗菌プロファイルの障害は、回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬの不適切な局在または無効なサーベイランスの結果である可能性もある。その反対に、上皮で発現されるＢｔｎｌ２の喪失は、局所微生物叢の変化を招き、それが続いて回腸Ｂｔｎｌ２－ＫＯ γδＩＥＬのＴＣＲレパートリーおよび抗菌応答モジュールの再形成を推進する可能性もある。抗菌応答モジュールの欠損を伴う再形成されたＶγ－Ｖδレパートリーが、小腸感染病原体に対するＢｔｎｌ２－ＫＯマウスの感受性にどのように影響するかを理解するためには、さらなる研究が必要である。

【0197】

マウスＶγ７^＋ ＩＥＬの発生およびヒトＶγ４^＋／Ｖδ１^＋ ＩＥＬ維持の両方について、所定の時点でのＢｔｎｌ発現への急性依存が提唱されている。特に、成体Ｂｔｎｌ１－ＫＯマウスにおけるＢｔｎｌ１発現は、Ｖγ７^＋発生をレスキューすることができず（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ Ｂａｒｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６．１６７（１）：２０３～２１８）、一方、グルテンフリー食を遵守した後の粘膜修復およびＢｔｎｌ８発現回復は、セリアック病患者におけるＶγ４^＋／Ｖδ１^＋ ＩＥＬサブセットを再構成することができなかった。これらの観察を考慮することにより、Ｂｔｎｌ分子は、新生仔における組織特異的Ｖγ鎖の選好的増大だけでなく、若年成体における異なる組織区画にわたってのＴＣＲ特異性も調節している可能性があることが推測された。このため、セグメントに偏りのあるγδＴＣＲの特異性は、Ｂｔｎｌ分子間の二量体化パートナーの選択、ならびに腸におけるそれらの微妙な空間的および時間的発現によって決定される可能性がある。Ｂｔｎｌ１およびＢｔｎｌ６は共同してＶγ７の選択および成熟に影響するが、Ｂｔｎｌ２の結合パートナーは不明である。加えて、Ｂｔｎｌ２の喪失を補うために腸で誘導された他のＢｔｎｌ分子はなく、このことは、それらは同じ座位にコードされているにもかかわらず、それらの発現パターンが共調節されないことを示す。

【0198】

さまざまなファミリーメンバーのうち、構造的には、Ｂｔｎｌ２は、Ｂｔｎ／Ｂｔｎｌスーパーファミリーメンバーのほとんどが共有する抗原結合性Ｂ３０．２ドメインを欠く点で独特であり、このことは、Ｂｔｎｌ２の阻害効果が、γδＩＥＬに対するその受容体と推定されるものの関与の下流で誘発されるシグナル伝達経路に依存する可能性を示す。Ｂｔｎｌ２は、Ｂ３０．２ドメインとは独立したＩｇＣ相互作用を介して、他の腸特異的Ｂｔｎｌとホモ二量体化またはヘテロ二量体化することが可能であった。ヘテロ二量体として、Ｂｔｎｌ２と相互作用するパートナーは、Ｂ３０．２により推進されるヘテロ二量体の活性化および受容体と推定されるものへの結合に寄与し、それによってＢｔｎｌ２のライゲーションは下流で増殖阻害を誘導すると考えられる。Ｂｔｎｌ１、Ｂｔｎｌ４およびＢｔｎｌ６は、それらの類似した腸発現のために、Ｂｔｎｌ２の結合パートナーの候補となり得る。したがって、十二指腸ＩＥＣ上でのより高い発現にもかかわらず、Ｂｔｎｌ２は、ＩＥＣ上のその結合パートナーおよびγδＩＥＬ上の受容体と推定されるものの局所的発現の増加により、回腸γδＩＥＬに対してより顕著な阻害を発揮する可能性がある。このため、この領域特異的な相互作用は、細菌代謝産物のような局所の可溶性抗原によって促進される可能性がある。Ｂｔｎｌ２はまた、別のＢｔｎｌヘテロ二量体のγδＴＣＲへの結合を阻害してγδＩＥＬの増殖を抑制する受容体アンタゴニストとしても機能する可能性がある。あるいは、この抑制は部分的なものにすぎないことから、Ｂｔｎｌ２は、Ｖγリガンド（すなわち、Ｖγ７ ＴＣＲに対するＢｔｎｌ６）の表面発現の調節を介して、特定のＶγＴＣＲまたはＴＣＲ特異性を間接的に標的とする可能性もある。Ｂｔｎｌ２がセグメント特異的炎症の際にすべての腸区画にわたってγδＩＥＬに対する阻害効果を発揮し得るか否かに取り組むためには、さらなる研究が必要である。

【0199】

以前の研究により、γδＴ細胞の枯渇は、ＤＳＳ誘発大腸炎の際により大きな結腸損傷を誘導し、ＫＧＦ分泌を減少させ、γδＴ細胞によるＩＦＮγ産生を増加させ、ＩＥＣ増殖を低下させることが示されており、これはγδＩＥＬが上皮傷害後の粘膜修復を促進し得ることを示す。その反対に、ＴｒｅｇによるＩＬ－１０産生の障害は、Ｐｄｋ１^ｆ／ｆ；ＣＤ４^ｃｒｅマウスにおいて、制御されないγδＩＥＬ増殖および自然発生的な腸炎を引き起こし、このことは結腸におけるγδＩＥＬの炎症誘発性の役割を裏付ける。Ｂｔｎｌ２の発現は、ＤＳＳ誘発大腸炎の際に遠位結腸でアップレギュレートされており、Ｂｔｎｌ２－ＫＯ大腸炎マウスは、疾患の粘膜修復相において回復の遅延を示すが、これはおそらくは上皮傷害によって引き起こされる損傷を制御するγδＩＥＬ依存性および非依存性（すなわち、Ｔｒｅｇ、炎症性ヘルパーＴ細胞）の機序による。興味深いことに、Ｂｔｎｌ１およびＢｔｎｌ６の転写物はＢｔｎｌ２－ＫＯ大腸炎マウスではダウンレギュレートされており、これは、Ｂｔｎｌ１／６の転写物がＭｕｃ２－ＫＯマウスの遠位結腸で有意に減少し、ＢＴＮＬ８の発現が潰瘍性大腸炎患者およびセリアック病患者の結腸および十二指腸の生検試料でそれぞれ減少しているかまたは消失しているという以前の報告を裏付けるものである。したがって、ＩＥＣは環境ストレス因子に応答してＢｔｎｌ２の発現をアップレギュレートして、γδＩＥＬの損傷誘導性増大を制限し、抗菌分子の放出を誘導する。このため、これらの知見は、小腸および大腸全体にわたるγδＩＥＬと上皮特異的Ｂｔｎｌ分子との間の密接な相互作用が、ホメオスタシスおよび炎症状態においてそれらの増殖および機能を推進するという考えを支持する。

【0200】

結論として、本開示は、回腸γδＩＥＬの増大の調節、それらのＶγおよびＶγ－Ｖδ ＴＣＲ特異性の形成、ならびにそれらの抗菌応答モジュールの変化におけるＢｔｎｌ２の新規な役割を実証する。ｓｃＲＮＡｓｅｑおよびｓｃＴＣＲｓｅｑの調査から、高度に動的なγδＩＥＬ区画は、成体期における小腸の各セグメントの環境的手がかりに細かく適応していることが明らかになった。

【実施例11】

【0201】

ホメオスタシスおよび疾患の際の免疫機能におけるＢｔｎｌ２の役割
Ｂｔｎｌ２がＣＤ４^＋ Ｔ細胞の機能をどのように調節するかを理解するために、上記のインビトロ増殖アッセイを行った。組換えＢｔｎｌ２は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の活性化、増殖およびサイトカイン分泌の両方を阻害することが確認された（図１１Ａ～Ｃ）。ＣＤ２８シグナルの添加により、Ｂｔｎｌ２媒介性の増殖阻害は部分的にレスキューされ、これはまたサイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－６、およびＩＦＮγ）の部分的なレスキューにもつながったが、ＩＬ－２は組換えＢｔｎｌ２の存在下でも依然として有意に低いレベルであった（図１１Ｂ～Ｃ）。組換えＢｔｎｌ２は、ＰＤＬ１と同様に、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖を、α－ＣＤ３、α－ＣＤ２８、およびＦｃ融合タンパク質の逐次コーティング中に、またはＦｃ融合物の等モルではなく等質量での同時コーティング中に阻害した（図１７Ａ～Ｄ）。これらの結果は、Ｂｔｎｌ２による増殖阻害が、プレートに結合したα－ＣＤ３／α－ＣＤ２８の置換えではなく、Ｂｔｎｌ２と活性化ＣＤ４^＋ Ｔ細胞上のその受容体と推定されるものとのライゲーションの結果であることを示す（図６Ｄ）。

【0202】

次に、Ｂｔｎｌ２が系統特異的サイトカインの存在下でＴヘルパーの分化に影響するか否かを検討した（図１８Ａ）。組換えＢｔｎｌ２は、インビトロでＩＬ－２およびＴＧＦβ１の存在下で、ＰＤＬ１と同様に、組織常在様のＣＤ１０３^＋制御性Ｔ細胞のデノボ分化を支え、ＣＤ１０３^－／ＣＤ１０３^＋の比をほぼ１にすることが見出された（図１８Ｂ）。ＦｏｘＯ１の発現レベルが低いことから、活性化された（リンパ組織に常在しない）制御性Ｔ細胞と休止中の（脾、リンパ節）制御性Ｔ細胞が区別される。組換えＢｔｎｌ２の存在下で、制御性Ｔ細胞はＡｋｔおよびＳ６のリン酸化ならびにＦｏｘＯ１の発現低下を示し、これにより、Ｂｔｎｌ２が活性化された制御性Ｔ細胞の分化を促進することができることが示された（図１８Ｃ）。加えて、組換えＢｔｎｌ２は、ＳＴＡＴ５のリン酸化を、ＴＧＦβ１用量依存的な様式で推進した（図１８Ｄ）。全体として、これらの結果から、Ｂｔｎｌ２がインビトロで、ＰＤＬ１と同様に組織常在様の制御性Ｔ細胞を選好的に誘導することが示された。

【0203】

非リンパ組織の内部では、炎症誘発性Ｔヘルパー系列、例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞と、免疫寛容原性制御性Ｔ細胞との間の微妙なバランスが、状況に適した免疫応答を確実に行わせる。Ｔｈ１７および制御性Ｔ細胞系列の可塑性とそれらの相互に関連する発生経路を考慮して、Ｂｔｎｌ２がＴｈ１７細胞の分化に影響するか否かを検討した。図１９Ａに示されるように、組換えＢｔｎｌ２は、インビトロでＴｈ１７スキューイングサイトカインが存在する場合でも、ＰＤＬ１と同様に、Ｔｈ１７細胞のＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞誘導への分化を有意に推進した。注目すべきことに、組換えＢｔｎｌ２は、制御性Ｔ細胞スキューイング条件下で使用されるのと同様の機序、例えば、ＡｋｔおよびＳ６リン酸化のダウンレギュレーション、ＦｏｘＯ１発現レベルの低下（図１９Ｂ）、ならびにＳＴＡＴ５リン酸化のアップレギュレーション（図１９Ｃ）を介して、ＣＤ１０３^＋ＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞の分化を促進した（図１９Ａ）。

【0204】

加えて、ＩＬ１７ＡおよびＶＥＧＦなどの炎症性サイトカインのレベルは低下したが、ＣＣＬ３およびＩＬ３のレベルは、Ｔｈ１７細胞誘導条件下でのＢｔｎｌ２およびＰＤＬ１の存在下で有意に上昇し、これにより、制御性Ｔ細胞表現型への推移が示された（図１９Ｄ）。Ｔｈ１７細胞誘導性サイトカインカクテル中の１つのサイトカインを一度に変化させることにより、Ｂｔｎｌ２媒介性のＣＤ１０３^＋ＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞へのスキューイングは、ＴＧＦβ１レベルに厳密に依存し、ＩＬ－６シグナル伝達の遮断によって強化され、ＩＬ－２３とは独立して起こり、ＩＬ－１βによって強く阻害されることが示された（図１９Ｅ）。特に、ＩＬ１７Ａ^＋ＲＯＲγｔ^＋ Ｔｈ１７細胞の頻度は、すべてのＦｃ融合条件を通じて同等であり、Ｂｔｎｌ２により推進されるＣＤ１０３^＋ＦｏｘＰ３^＋ 制御性Ｔ細胞の誘導は、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－２３のＴｈ１７系統スキューイングカクテルにＩＬ－１βを添加すると１０分の１に低下した（図１９Ｅ）。さらに、ＩＬ－１βは、ＡｋｔおよびＳ６のリン酸化ならびにＦｏｘＯ１の発現をレスキューしなかったことから（図１９Ｆ）、Ｂｔｎｌ２により推進される制御性Ｔ細胞誘導の後期段階を阻害することができる。これらの結果を裏付けるように、Ｂｔｎｌ２は、インビトロでＰＤＬ１と同様に、組織常在様の制御性Ｔ細胞に対する従来のＴｈ１７プログラム（例えば、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－２３）を無効にすることができる。

【実施例12】

【0205】

ＢＴＮＬ２の機能喪失型（ｐＬｏＦ）変異体と推定されるものは炎症性腸疾患のオッズ増加と関連する
症例１４，２７４人および対照４３９，８０９人を含むゲノムシークエンシングコホートに対してゲノムワイド関連研究を実施したところ、稀なｐＬｏＦ変異体（ｐ．Ｇｌｕ４５４＊／ｒｓ２８３６２６７５）とＩＢＤリスク増加との有意な関連が同定された。Ｂｔｎｌ２座位に近接するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ領域における既知の一般的リスク変異体のデータについて対照を設定したところ、Ｂｔｎｌ２ Ｇｌｕ４５４＊とＩＢＤとの関連は、Ｂｔｎｌ２における近接するＩＢＤ関連ＨＬＡ変異体とは独立していることが明らかになった（表３）。ＧＷＡＳのＦｉｎｅＭａｐ解析により、ｐ．Ｇｌｕ４５４＊／ｒｓ２８３６２６７５はこの領域の他のＨＬＡシグナルとは独立していることが確認された。

【0206】

【表3】

【実施例13】

【0207】

ＤＳＳ誘発大腸炎を有するＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおけるＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合タンパク質による処置の効果
慢性ＤＳＳ誘発大腸炎を誘導するために、平均で２３ｇを上回る１５週齢の雌性Ｂｔｎｌ２ ＫＯおよびＷＴマウスに、３％ ＤＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む飲用水を６日間与えた後、さらに６日間水を与えた。対照群には試験期間中に蒸留水を投与した。ｍＢＴＮＬ２－Ｆｃおよび対照としてのｍＦｃを、第－１日から２５ｍｇ／ｋｇの用量で隔週で腹腔内投与した。マウスの体重を測定し、大腸炎の臨床徴候（例えば、便の硬さおよび糞便中の血液）について毎日モニターした。体重減少は、元の体重と任意の特定の日の実際の体重との間の差のパーセントとして計算した。すべての棒グラフは平均値±ＳＥＭを表す。ｍＢＴＮＬ２－Ｆｃ処置群とｍＦｃ処置群との間の統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を用いた二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。その結果、ｍＢＴＮＬ２－Ｆｃによる予防的処置は、ｍＦｃ対照処置群と比較した体重増加に反映されるように、ＷＴおよびＢｔｎｌ２ ＫＯマウスにおいてＤＳＳ誘発粘膜損傷からの上皮障壁修復を促進し、疾患の重篤度を低下させた。重要なことに、ｍＢｔｎｌ２－Ｆｃ処置は、マウスにおけるＢｔｎｌ２欠損に関連する発生上の変化を強力に無効化することができ、これにより、Ｂｔｎｌ２作用物質の投与がＢｔｎｌ２遺伝子突然変異を保有する患者の大腸炎の改善に有益である可能性があることが示された。

【実施例14】

【0208】

多発性硬化症のマウスモデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のマウスモデルにおけるＢｔｎｌ２作用物質の効果
本研究の目的は、Ｂｔｎｌ２作用物質による処置が、アミノ酸３５～５５を含むミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドによって誘導されるＥＡＥのような多発性硬化症のＴ細胞推進性マウスモデルにおいて、症状を緩和し、疾患の進行を停止させることができるか否かを確立することである。本開示（例えば、実施例４を参照）で実証されているように、Ｂｔｎｌ２－Ｆｃは、インビトロでＴ細胞の増殖および活性化を阻害する。ＥＡＥは、中枢神経系組織、例えば、脳および脊髄における活性化Ｔ細胞の高度の浸潤に依存するため、ＭＯＧ３５－５５誘導性ＥＡＥは、ＥＡＥ重症度の調節におけるこの遺伝子の役割について検証するための優れた疾患モデルである可能性が高い。

【0209】

１０～１２週齢のＷＴマウスに対して、系を飽和させることなくＥＡＥを誘導するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中にある至適用量以下のＭＯＧ３５－５５で免疫処置する（通常の投薬での２００ｕｇ／匹に対して５０ｕｇ／匹）。至適用量以下のＭＯＧ３５－５５を使用することにより、ＢＴＮＬ２－Ｆｃの有無におけるＥＡＥの誘導および進行の比較が可能となる。ＷＴマウス１０匹の４つの群に対して、それぞれＣＦＡのみ（１群）またはＣＦＡ中にあるＭＯＧ３５－５５（３群）による免疫処置を行う。

【0210】

免疫処置から７～８日後のＭＯＧ３５－５５群における麻痺の発症前に、１つの群（Ｆｃ融合物なし）にはＰＢＳを投与し、１つの群（アイソタイプ対照）には陰性対照－Ｆｃ融合物を投与し、１つの群（実験的Ｆｃ）にはＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合物を週２回、３週間にわたり投与する。本発明者らの予想では、ＣＦＡのみの群ではＥＡＥが観察されず、Ｆｃ融合物のないＭＯＧ３５－５５群またはアイソタイプ対照を用いるＭＯＧ３５－５５群では、ＥＡＥの定型的な発症および疾患の進行が観察されるはずである。本発明者らの予想では、ＢＴＮＬ２－Ｆｃを用いたＭＯＧ３５－５５群において、ＥＡＥ発症の遅延、より軽度の疾患経過、およびより迅速な回復が観察されるはずである。

【0211】

次に、免疫処置から１０～１４日後のＭＯＧ３５－５５群における麻痺の発症時点で、１つの群（Ｆｃ融合物なし）にはＰＢＳを投与し、１つの群（アイソタイプ対照）には陰性対照－Ｆｃ融合物を投与し、１つの群（実験的Ｆｃ）にはＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合物を週２回、３週間にわたり投与する。本発明者らの予想では、ＣＦＡのみの群ではＥＡＥが観察されず、Ｆｃ融合物のないＭＯＧ３５－５５群またはアイソタイプ対照を用いるＭＯＧ３５－５５群では、ＥＡＥの定型的な発症および疾患の進行が観察されるはずである。本発明者らの予想では、ＢＴＮＬ２－Ｆｃを用いたＭＯＧ３５－５５群において、疾患のＥＡＥのピークの遅延、より軽度の疾患経過、およびより迅速な回復が観察されるはずである。

【0212】

別の例は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のマウスモデルであり、これは、Ｂｔｎｌ２作用物質のインビボ投与が、Ｔ細胞の増殖、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞の活性化を阻害し、インビボで制御性Ｔ細胞の産生を増加させ、それ故にＧｖＨＤの発症を予防するか否かを明らかにすることを目的とする。手短に述べると、大腿骨および脛骨からの骨髄のフラッシングによってＣ５７ＢＬ／６マウスから骨髄（ＢＭ）懸濁液を採取し、致死量の照射を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスに移植する。ｍＢｔｎｌ２－Ｆｃ融合タンパク質を第０日に静脈内投与し、第２日に腹腔内投与する。対照群はｍＦｃ注射を受ける。ＧｖＨＤの重篤度は、臨床的ＧｖＨＤスコア化システムで評価する。マウスを移植１４日後に安楽死させ、ＧｖＨＤ標的臓器、例えば、肝臓および腸を、病理組織学的、サイトカインおよびフローサイトメトリー分析のために採取する。本発明者らの予想では、Ｂｔｎｌ２－Ｆｃ処置によるＴ細胞の増殖、Ｔｈ１／Ｔｈ１７サイトカインの減少、および制御性Ｔ細胞の頻度の増加に関連する、生存の増加および腸管ＧｖＨＤの軽減が観察されるはずである。

【0213】

本開示は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって、その範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて、本発明のさまざまな変更が、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図している。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図20A】

【図20B】

【配列表】

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【国際調査報告】