特表 2024-528707 ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断のための参照材料としての血液マトリックス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-30

(54)【発明の名称】ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断のための参照材料としての血液マトリックス

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6804 20180101AFI20240723BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240723BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240723BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240723BHJP

   G01N 33/96 20060101ALI20240723BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240723BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6804 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/02

G01N33/96

G01N33/50 P

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024503924

(86)(22)【出願日】2022-07-21

(85)【翻訳文提出日】2024-03-18

(86)【国際出願番号】 EP2022070560

(87)【国際公開番号】W WO2023001991

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】21187066.2

(32)【優先日】2021-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522282689

【氏名又は名称】センスアイディー ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110002310

【氏名又は名称】弁理士法人あい特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ノヴァーク，ビョルン

(72)【発明者】

【氏名】ルーキン，アンジェリカ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA13

2G045BB31

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045CB21

2G045DA01

2G045DA13

2G045DA14

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2G045DA31

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2G045DA42

2G045DA53

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2G045DA64

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2G045DA70

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2G045DB04

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2G045DB07

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2G045DB09

2G045DB10

2G045DB11

2G045DB16

2G045FB02

4B063QA13

4B063QQ03

4B063QQ05

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS08

4B063QS10

4B063QS25

4B063QS36

(57)【要約】

【課題】診断、特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断を実施するための改善された方法を提供する。血液または他の実施の形態のうちの１つが、この問題を解決するための参照材料として使用される。
【解決手段】診断特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの核酸のシーケンシング方法を使用する診断における使用のための、血液マトリックスに基づく新しい参照材料と、検証（特に、非侵襲的液体生検）を含む、その製造のための方法と、それらの両方を提供する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血液を含む参照材料の使用であって、安定化剤が添加される、使用。

【請求項2】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、安定化剤が添加される、使用。

【請求項3】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の５種の成分または最大３０種の成分から構成される、使用。

【請求項4】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の最大７６種の成分から構成される、使用。

【請求項5】

前記血漿または前記血清が、ヒトからも動物からも提供されない、請求項３または請求項４に記載の、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における参照材料を調製するための方法であって、血漿または血清が血球に添加され、安定化剤が添加される、方法。

【請求項7】

前記血漿または前記血清が、規定値の成分および／または生物学的材料を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項8】

前記血漿または前記血清が、ｇＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡ 腫瘍関連および非腫瘍関連のメチル化または非メチル化ｃｆＤＮＡ、ヒストン結合ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化または非メチル化ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、腫瘍核酸、スパイク核酸、エクソソーム、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞、エクソソームからなる群から選択される少なくとも１つの成分を、特に、以下の範囲、１～１５００ｎｇのＤＮＡ／ｍｌ、特に、妊娠中の女性では胎児ｃｆＤＮＡが２～１５％であるｃｆＤＮＡの割合、１～１０００ｎｇのＲＮＡ／ｍｌで含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項9】

前記血漿または前記血清が、細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的材料を、特に、以下の範囲、１～１００，０００個のウイルス／ｍｌ、１～１００，０００個の細菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌胞子／ｍｌ、１～１００，０００個の寄生虫／ｍｌ、１～１，０００個の腫瘍細胞／ｍｌ、または１～１，０００個の内皮細胞／ｍｌで含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項10】

前記安定化剤が、架橋安定化剤、アルコール性安定化剤、および／または抗凝固剤、特に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、およびアクロレインからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項11】

少なくとも１つのさらなる化学物質および／または少なくとも１つの生物学的材料、特に、ｉ．）バイオマーカー、分析物、活性物質、抗体、抗原、もしくは医薬、またはｉｉ．）細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）、が添加される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項12】

検証曲線または校正曲線が、前記参照材料を使用して作成されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項13】

核酸の前記シーケンシング方法が、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）によって実施されることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項14】

前記参照材料が、特に、腫瘍診断、妊娠診断、遺伝性遺伝子診断、または感染症診断を実施するために患者の血液試料を模擬することを特徴とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、診断、特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの核酸のシーケンシング方法を使用する診断に使用するための、血液マトリックスに基づく新しい参照材料に関する。また検証（特に、非侵襲的液体生検）を含む、その製造のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年なされたすべての進歩にも関わらず、腫瘍を検出するための、体液試料および組織試料の臨床化学検査またはイメージング手順といった現在の方法は、悪性転化の検出が遅すぎることが多い。腫瘍患者における高い死亡率の主な原因は、原発腫瘍の発症ではなく、転移の発症である。転移の発症を防ぐためには、悪性転化を可能な限り早期に検出する必要がある。さらに、悪性細胞を正常細胞と正しく区別する方法が必要である。偽陽性所見および偽陰性所見は、いずれも、罹患した人間に致命的な結果をもたらす。腫瘍患者に、正確な予後判定を提供し、治療を個々の患者に合わせることを可能にする手順も必要である。

【0003】

これまで、いわゆる腫瘍マーカー（特に、がん遺伝子）は、血液、尿、喀痰、または組織試料などの体液において判定されてきた。これらは、増加または減少した量で産生される腫瘍細胞の成分であり、その変化は、血液、血漿、または血清などの体液において検出することができる。

【0004】

細胞内成分、特に、核酸（リボ核酸ＲＮＡおよびデオキシリボ核酸ＤＮＡ）の単離、特徴付け、および分析は、現代の分子生物学にとって極めて重要である。遅くとも１９８３年のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明以来、多数の核酸診断法が開発されており、それらは、たとえば、疾患および病原体の検出に使用されている。

【0005】

従来技術では、そのような細胞材料は、診断のために、下記のステップ、たとえば、試料調製、抽出、濃縮、単離、精製、必要に応じて逆転写、増幅、および検出において調製される。

【0006】

がんの遺伝子変異を分析することは、現在、患者の管理および治療決定において非常に重要となっている。がんに関連する変異プロファイルの評価は、通常、遺伝子試験を使用して行われる。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）もしくは無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、またはＲＮＡ、たとえば、エクソソームもしくは循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるものの分析に基づく、血液由来の液体生検の使用は、疾患過程にわたって、侵襲性が最小限である腫瘍ゲノムの継続的モニタリングを可能にするため、近年、臨床現場で大幅に増加している。液体生検に特化したそのような試験の普及および日常的な診断におけるそれらの使用、ならびに規制要件の増加に伴い、同等の基準で実行される検証済みのアッセイの必要性も増加している。

【0007】

試験の臨床的妥当性の文書化には、分析的妥当性の評価も含まれ、これは、試験の正確性、感度、特異度、および頑健性のパラメータによって記述される。直接的な疾患との関連性はない因子であるが、体液またはこの体液中に存在するバイオマーカー（分析物）の完全性に影響を与えるか、または分析中の結果に影響を及ぼす、技術的、生物学的、または環境的な起源のものである可能性のある、分析前の変数（または処理）は、これらのパラメータに大きな影響を与える。液体生検試験の分野において、これらは、たとえば、使用される抽出方法および定量方法、保管条件、ＰＣＲ阻害、ならびにフラグメントサイズの偏りである。これらの分析前の変数は、したがって、検査室間の偏差をもたらす可能性がある。

【0008】

核酸のシーケンシング方法、特に、ＰＣＲ、「ｑＰＣＲ」（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）、「デジタル液滴ＰＣＲ」（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ、もしくは「超並列シーケンシング」などの並列シーケンシング）を使用した腫瘍ＤＮＡの強力な増幅に起因して、いわゆる非侵襲的液体生検が、近年、腫瘍診断において確立されており、それによって、たとえば、試料中の循環遊離ＤＮＡが検査される。そのような循環遊離ＤＮＡ（略してｃｆＤＮＡ）は、たとえば、がん／腫瘍細胞を起源とする可能性がある（いわゆるｃｔＤＮＡ）。

【0009】

がん患者では、平均ｃｆＤＮＡ量が健常対象よりも高く、特に、ｃｆＤＮＡの血漿レベルは、進行期のがん患者において、軽症期／初期のがん患者よりも高い。たとえば、ｃｔＤＮＡは、ｃｆＤＮＡの１％を占める（腫瘍の病期および位置に応じて、正常なｃｆＤＮＡの０．０１～９０％）。

【0010】

しかしながら、相対的な診断ステートメントだけでなく絶対的な診断ステートメントを作成することができるような標準物の必要性は高い。そのような標準物の使用は、たとえば、特許文献１に記載されている。

【0011】

現在、たとえば腫瘍診断のために検出する必要がある変異については、市販検査および検査室開発検査（ＬＤＴ）の両方が利用可能である。プラスミドＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドなどの検査室内標準物は、検証および校正のための品質管理として使用されている。

【0012】

これらの検査室内標準物が、多くの場合、ヒトまたは動物から得られた試料に含まれるバイオマーカーまたは分析物を含め、試料の実際の特性を適切に反映していないという特定の欠点がある。そのような試料は、検査室で得られる試験材料、たとえば、血液、組織、髄液、粘膜スワブ、喀痰、尿、精液、唾液、または他の試料種に関するものである。

【0013】

もう１つの欠点は、ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断における機器または手順の検証または校正の目的で、これらの検査室内標準物を希釈する必要があり、これに利用可能な自動プロセスがないこと、すなわち、標準化には通常、誤差が発生しやすいことである。さらに、そのような希釈液の安定性は保証されておらず、供給源に応じて、たとえば、大腸菌由来のプラスミドＤＮＡでは、この非ヒトまたは非動物種によるＤＮＡ／ＲＮＡ汚染のリスクがあり、そのため、最小限の混入であっても致命的である。結果として、たとえばＰＣＲまたはＮＧＳを使用して判定されたコピー数は、十分な標準化の欠如に起因して、相対的にも絶対的にも不正確な場合がある。

【0014】

分析性能の判定、評価、および追跡、ならびに検査室の品質モニタリングに、参照材料の形態の内部対照および外部対照が必要であることは明らかである。参照材料は、使用される試料または出発材料と比較可能な物理的特性および生物学的特性を有する必要がある。これは、バイオマーカーの特性だけでなく、たとえば検出しようとするバイオマーカー／分析物を見出すことができる試料マトリックスにも焦点が当てられていることを意味する。液体生検試験の標的分子、たとえば、ｃｔ／ｃｆＤＮＡ（環状腫瘍／無細胞）は、血液中に無細胞ＤＮＡとして見出され、採血、その後の血漿生成、およびＤＮＡ抽出後に血液から単離される。しかしながら、血液そのもの、すなわち全血には、通常、凝固および溶血に起因する不確定性が多すぎるため、これまでの参照材料または対照材料は、必要に応じて「目的のバイオマーカー／分析物」を補充した、ＤＮＡを含まない血漿またはＤＮＡを含まない血漿様溶液を基礎として使用している。そのような不確定性は、試料の取り扱い（たとえば、熱への曝露、汚染、完全性など）によっても生じる可能性がある。しかしながら、結果として、試料の取り扱い（保管）および血漿生成またはその他の調製方法のプロセスを、検証または評価することはできない。したがって、もともとの血液試料にほぼ対応する参照材料としての、またはそのような参照材料を患者の血液（血漿、血清）試料と比較することができるようにそれを十分に模擬する参照材料としての血液試料を提供することが必要とされている。患者の血液試料は、何らかの方法で処理されていてもよい。

【0015】

患者の血液試料の場合、保管または輸送（温度、期間）により、凝固、溶血、および細胞溶解、ならびに結果として生じる望ましくない成分、特に、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ、およびプロテアーゼの放出に起因して、試料が正しいものではなくなる可能性がある。したがって、そのような試料が、特に、ｃｆＤＮＡまたは他の核酸の含有量または濃度に関して、偽陽性または偽陰性の分析結果をもたらす可能性があるというリスクが存在する。

【0016】

また、人員、設備などによっては患者の血液試料を抽出してｃｆＤＮＡまたは他の核酸を得ることも問題となる。これは、低濃度のｃｆＤＮＡまたは他の核酸をもたらす可能性がある。抽出効率が不足すると、ｃｆＤＮＡまたは他の核酸の濃度が低くなる可能性があり、その結果、液体生検を実行するために必要とされるｃｆＤＮＡまたは他の核酸の濃度に達しないことになる。一方で、患者の血液試料の大部分を（すなわち血漿または血清に限定せずに）保存することが、分析上必要である。

【0017】

したがって、ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断、特に、核酸シーケンシング方法を使用する診断における標準化を改善することが、重要かつ必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】国際公開第２０１８／０９４１８３（Ａ１）号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

驚くべきことに、本発明者らは、安定化剤を有していてもよい血液試料を、診断特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断において参照材料として使用することにより、診断品質が大幅に改善されることを立証することができた。（測定は、測定すべきものを実際に測定し、信頼できる結果が得られる場合に有効である）、所与の試験システムの
・信頼性（信頼性とは、繰り返し実行した場合に試験システムが信頼できる結果を提供するかどうかを指す）、および
・客観性（試験システムは、関与する人物による望ましくない影響がなければ、客観的である）。これは、測定の性能パラメータをチェックする特に有利な手段である。特に、ヒトまたは動物、特に、哺乳動物、特に、ウシ、ブタ、またはヒツジに由来する場合、比較可能な血液試料が利用可能である。

【0020】

この問題は、少なくとも１つの特許請求によって与えられる技術的教示によって解決される。

【0021】

したがって、本発明の目的は、診断特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断を実施するための改善された方法を提供することであり、血液または以下の実施の形態のうちの１つが、この問題を解決するための参照材料として使用される。

【課題を解決するための手段】

【0022】

本発明は、核酸のシーケンシング方法を含む診断特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断での試料における参照材料としてのｉ．）血液、またはｉｉ．）血球および血漿もしくは血清の使用であって、安定化剤が添加されてもよい、使用に関する。

【0023】

本発明の好ましい実施の形態では、安定化剤は、判定しようとするバイオマーカーまたは分析物に対して影響を及ぼさない様式で選択されるべきである。

【0024】

本発明は、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断での試料における血液を含む参照材料の使用であって、血漿または血清が血球に添加される、使用に関する。

【0025】

加えて、本発明は、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断での試料における参照材料としての血液の調製のための方法であって、血漿または血清が血球に添加され、好ましくは、１つまたは複数の安定化剤が添加される、方法に関する。

【0026】

本発明による好適なそのような安定化剤は、好ましくは、架橋安定化剤、アルコール安定化剤、および／または抗凝固剤などの群から選択される。特に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、およびアクロレイン、またはそれらの混合物が好ましい。

【0027】

さらに、そのような安定化剤、たとえば、共有結合による化学結合をタンパク質間に生成する架橋安定化剤、たとえば網羅的ではないが、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、イミドエステル架橋剤、たとえば、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、アクロレイン、グリオキサール、カルボジイミドからなる群から選択されるもの、またはアルコール性安定化剤、たとえば決定的ではないが、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、２‐フェノキシエタノール、ジエチルエーテルの群から選択されるもの、または抗凝固剤／キレート剤、たとえば網羅的ではないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ヘパリンおよびヘパリノイド、クエン酸塩、ジメルカプトコハク酸、ジメルカプトプロパンスルホン酸、酸性クエン酸デキストロース、アセチルアセトン、エチレンジアミン、２‐（２‐アミノエチルアミノ）エタノール、ジエチレントリアミン、イミノ二酢酸、トリエチレンテトラミン、トリアミノトリエチルアミン、ニトリロトリアセテート、ビス（サリチリデン）エチレンジアミン、エチレンジアミノトリアセテート、ジエチレントリアミンペンタアセテート、トリエチレンテトラミンヘキサアセテート、１，４，７，１０‐テトラアザシクロドデカン‐１，４，７，１０‐テトラアセテート、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ジメチルグリオキシム、８‐ヒドロキシキノリン、２，２’‐ビピリジン、１，１０‐フェナントロリン、１，２‐ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、ヒルジンおよびヒルジン類似体、アピキサバン、エドキサバン、リバーロキサバン、クマリン、フェンプロクモン、ワルファリン、ジクマロール、五糖、抗血小板剤、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、クロピドグレル、チカグレロル、プラスグレル、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、チロフィバン、エプチフィバチド、ビバリルジン、リバーロキサバン、ダビガトランエテキシレート、アピキサバン、ＰＰＳＢ（プロトロンビン複合体）、アンチトロンビン（ＡＴ ＩＩＩ）、プロテインＣ、デスモプレシン、ＤＤＡＶＰ、塩化プロタミン、ビタミンＫ、アルガトロバン、ダナパロイド、ダナパリン、ロモパランからなる群から選択されるもの、または酸化剤、水銀系安定化剤、Ｂ‐５（水溶液中の塩化第二水銀および酢酸ナトリウム）、ゼンカー固定剤（塩化第二水銀、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、酢酸、水）、ピクリン酸ベースの安定化剤、たとえばブアン溶液：ピクリン酸、酢酸、ホルムアルデヒドの水溶液、硫酸アンモニウム水溶液、ＣＡＲＮＯＹ固定溶液（必要に応じてクロロホルム、塩化鉄（ＩＩＩ）またはホルムアルデヒド‐アルコール‐酢酸を含む）、クロム酸、クロム酢酸、亜鉛塩溶液の群から選択されるもの、を使用することができる。

【0028】

本発明によるこのような安定化剤は、主として、血液凝固および／または溶血および／または血球の細胞溶解を防止する。

【0029】

さらに好ましい実施の形態では、本発明は、ヒトまたは動物から提供されるものではないが、血液成分の組成にほぼ対応する、そのような血漿または血清に関し、個々の血液成分が、それぞれの事例で添加されている。

【0030】

したがって、本発明による参照材料は、表１に示されるように、血清または血漿について以下の組成を有する可能性があり、血清または血漿タンパク質（特にアルブミン）に加えて、１つまたは複数の血液成分、特に、表１から最大５種の成分、または１０種の成分、または２０種の成分、または３０種の成分が添加される。特に、アルブミンに加えて、表１から最大７６種の成分が添加される可能性がある。選択された成分の濃度は、それぞれの事例において変動する可能性があるか、またはそれぞれの事例において表１から選択される可能性がある。

【0031】

【表1-1】

【0032】

【表1-2】

【0033】

【表1-3】

【0034】

すべて水溶液中。言及されたすべてのタンパク質は、血清タンパク質または血漿タンパク質とも称される。

【0035】

好ましい実施の形態では、組成は、抗体を含まず、特に、免疫グロブリンを含まない、および／またはＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは細胞外小胞を含まない。

【0036】

提供されるそのような血液試料は、以降、本発明による参照材料と称される。

【0037】

さらに好ましい実施の形態では、添加される血漿または血清は、ｇＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡ、腫瘍関連および非腫瘍関連のメチル化または非メチル化ｃｆＤＮＡ、ヒストン結合型ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化または非メチル化ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、腫瘍核酸、スパイク核酸、エクソソーム、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞、エクソソームからなる群から選択される、規定のレベルの少なくとも１つの成分を、特に、以下の範囲、１～１５００ｎｇのＤＮＡ／ｍｌ、特に、妊娠中の女性では胎児ｃｆＤＮＡが２～１５％であるｃｆＤＮＡの割合、１～１０００ｎｇのＲＮＡ／ｍｌで有する。

【0038】

さらに、添加される血漿または血清は、細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）からなる群から選択される、規定の値の少なくとも１つの生物学的材料を、特に、以下の範囲、１～１００，０００個のウイルス／ｍｌ、１～１００，０００個の細菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌胞子／ｍｌ、１～１００，０００個の寄生虫／ｍｌ、１～１，０００個の腫瘍細胞／ｍｌ、または１～１，０００個の内皮細胞／ｍｌで有する。

【0039】

本発明による参照材料の前述の実施の形態は、有利なことに、たとえば体調不良の患者および他の状態から得られた血液試料の模擬を可能にする。

【0040】

さらに、様々なサイズで存在する可能性のあるフラグメント化（無細胞）ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が、好ましくは、１４０～１８０塩基対（ｂｐ）、３１０～３５０ｂｐ、４８０～５２０ｂｐのサイズ範囲で使用されることが好ましい。本発明者らは、参照材料中のそのようなｃｆＤＮＡのサイズおよびサイズ分布が、特に核酸シーケンシング方法にとって重要であることを立証することができた。

【0041】

本発明のさらなる実施の形態では、４０～３００ｂｐのミトコンドリアＤＮＡが使用される一方で、好ましくは２，０００～１５，０００ｂｐの範囲の大きなｃｆＤＮＡフラグメントを使用することができる。染色体外環状ＤＮＡは、３０～２０，０００ｂｐのサイズである。

【0042】

さらに、異なるサイズで存在する可能性のあるＲＮＡ（特に、ｍｉＲＮＡ）が、好ましくは、１０～２５０ｂｐ、特に１０～５００ｂｐのサイズ範囲で使用されることが好ましい。本発明者らは、参照材料中のそのようなＲＮＡ（特に、ｍｉＲＮＡ）のサイズおよびサイズ分布が、特に核酸シーケンシング方法にとって重要であることを立証することができた。

【0043】

本発明の意味における「血液」は、血球および血清を含む全血である可能性がある。特に、血液は、ヒトまたは動物から採取することができる。

【0044】

本発明の意味における「血球」は、血清の分離後、たとえば、遠心分離後の残渣に残るものであり、赤血球、白血球、血小板などを含む。

【0045】

本発明の好ましい実施の形態では、血球の割合は、本発明による参照材料の１５～７０重量％、好ましくは、３７～５４重量％である。

【0046】

本発明による参照材料のさらに好ましい特性は、９９重量％が赤血球であることである（４．５～５．９×１０＾６個の細胞／血液μｌ、最低値は女性に適用され、最高値は男性に適用される）。

【0047】

本発明による参照材料の別の好ましい特性は、白血球が１％未満であり（成人については約４，０００～１０，０００個の細胞／血液μｌ、小児については最大１７，０００個の細胞／血液μｌ、乳児については最大３０，０００個の細胞／血液μｌ）、血小板が１％未満であることである（約１５０，０００～４００，０００個の細胞／血液μｌ）。

【0048】

本発明の意味における「血漿」は、血液を遠心分離し、上清を分離することによって得ることができ、これにより、血液は、抗凝固剤、たとえばクエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡと事前に混合されている。血漿は、通常、活性形態のすべての凝固因子および線維素溶解因子、ならびにｃｆＤＮＡを含み、これは、特に、液体生検試験を使用する場合にさらに分析される。

【0049】

本発明の意味における「血清」は、血液を遠心分離し、上清を分離することによって得られる。血漿とは対照的に、これは、いずれの抗凝固剤も含まない。

【0050】

本発明の目的で、血清または血漿、特に、以下の構成要素を本質的に含むものも使用される可能性がある：

【0051】

【表2】

【0052】

【表3】

【0053】

【表4】

【0054】

【表5】

【0055】

さらなる実施の形態では、したがって、１つまたは複数の化学物質が、本発明による参照材料に添加される可能性がある。そのような化学物質は、すべてを網羅するものではなく、特に、炭素（Ｃ）および水素（Ｈ）に加えて、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、またはリン（Ｐ）などのヘテロ原子を含む可能性がある少なくとも１つの有機分子である可能性がある。化学物質は、ヘテロ原子を含む直鎖状および／または環状の炭素鎖を有する可能性がある。１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機分子が好ましい。そのような化学物質は、バイオマーカー、分析物、活性成分、抗体、抗原、または薬物である可能性がある。特に、ｇＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡ、腫瘍関連および非腫瘍関連のメチル化または非メチル化ｃｆＤＮＡ、ヒストン結合ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡからなる群から選択される成分を、添加することができ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化または非メチル化ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、腫瘍核酸、スパイク核酸、エクソソーム、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞、エクソソーム。

【0056】

さらなる実施の形態では、１つまたは複数の生物学的材料、たとえば、生存能力があるかまたは機能性である可能性のある、細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）を、本発明による参照材料に添加してもよい。

【0057】

本発明の目的で、「腫瘍核酸」は、任意の公知のヒト野生型配列を意味する。そのような腫瘍核酸は、ＣＯＳＭＩＣ：ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｒｅ：ｈｔｔｐ：／／ｔａｒｇｅｔｅｄｃａｎｃｅｒｃａｒｅ．ｍａｓｓｇｅｎｅｒａｌ．ｏｒｇ／Ｍｙ‐Ｔｒｉａｌ‐Ｇｕｉｄｅ／Ｄｉｓｅａｓｅｓ／Ｌｕｎｇ‐Ｃａｎｃｅｒ／ＫＲＡＳ／Ｇ１２Ｃ‐（ｃ‐３４Ｇ‐Ｔ）．ａｓｐｘ、またはＯｎｃｏＫＢ：ｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｃｏｋｂ．ｏｒｇ／、Ｍｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｙｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／などのデータベースに保管されていてもよい。

【0058】

好ましい実施の形態では、腫瘍核酸の含有量は、好ましくは、血清または血漿中で５～１０００ｎｇ、特に４００ｎｇのＤＮＡであり、たとえば、血清または血漿中で４００ｎｇ／５ｍｌのＤＮＡは、８０ｎｇ／ｍｌのＤＮＡに相当し、０．０８ｎｇ／μｌのＤＮＡに相当する。

【0059】

さらに、腫瘍核酸は、３０ｂｐ～５００ｂｐのサイズを有することが好ましい。

【0060】

本発明の目的で、「スパイク核酸」は、核酸のヒト野生型配列と比較して、１つまたは複数の変異を有する配列を意味する。公知の変異配列が使用されてもよく、または人工的な変異をヒト野生型配列に対して導入してもよい。さらに、スパイク核酸が、少なくとも１つの腫瘍マーカー、たとえば、公知の変異を有するがん遺伝子、特に、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＳＬ３、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＤＮ、ＡＦＦ１、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＡＭＥＲ１、ＡＰＣ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ９Ｌ、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ３、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ２７４、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＤ４、ＣＨＥＫ２、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＮＢＰ、ＣＮＯＴ３、ＣＮＴＲＬ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＸ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＲ２、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲＯＳＨＡ、ＥＢＦ１、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＬ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＡＳ１、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＮＫ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＡＴ１、ＦＡＴ４、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＲＬ４、ＦＥＳ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＬＣＮ、ＦＬＩ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＨＮ、ＧＲＩＮ２Ａ、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ‐Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ４、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＤＳＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ６、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＮＬ１、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＳＰ１、ＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２、ＬＣＫ、ＬＥＦ１、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＹＬ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ６、ＭＮ１、ＭＰＬ、ＭＲＴＦＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯＤ１、ＮＡＢ２、ＮＢＮ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＩＮ、ＮＫＸ２‐１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ１、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＮＵＴＭ２Ｄ、ＯＬＩＧ２、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＴＺ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＭ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＱ、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＥＸ２、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＲＸ１、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ１３、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＴ、ＱＫＩ、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＣ１、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ２、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＨ、ＲＭＩ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＡＬＬ４、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＰ４、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＩＸ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＯ、ＳＮＤ１、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＲＳＦ２、ＳＲＳＦ３、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１１、ＳＴＲＮ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ６、ＵＳＰ８、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＷＤＣＰ、ＷＩＦ１、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＢＴＢ１６、ＺＦＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ５２１、ＺＲＳＲ２、Ａ１ＣＦ、ＡＣＳＬ６、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ２、ＡＮＫ１、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＳＸＬ２、ＢＡＺ１Ａ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬＡＦ１、ＢＩＲＣ６、ＢＭＰ５、Ｃ１５ｏｒｆ６５、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＣ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９、ＣＤ２８、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＥＰ８９、ＣＨＤ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＬＰ１、ＣＮＢＤ１、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＮＫＬ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＮＮＡ２、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＵＬ３、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＣＡＦ１２Ｌ２、ＤＣＣ、ＤＧＣＲ８、ＤＵＸ４Ｌ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＥＤ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＬＦ３、ＥＬＮ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ７、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４７Ｃ、ＦＡＴ３、ＦＢＬＮ２、ＦＥＮ１、ＦＫＢＰ９、ＦＬＮＡ、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＲ１、ＧＬＩ１、ＧＭＰＳ、ＧＰＣ５、ＧＲＭ３、ＨＭＧＮ２Ｐ４６、ＩＤ３、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＳＸ、ＩＴＧＡＶ、ＪＡＺＦ１、ＫＡＴ７、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＮＳＴＲＮ、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＣＰ１、ＬＥＰＲＯＴＬ１、ＬＨＦＰＬ６、ＬＳＭ１４Ａ、ＭＡＣＣ１、ＭＡＬＡＴ１、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＤＳ２、ＭＧＭＴ、ＭＮＸ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ４、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＥＡ、ＮＣＫＩＰＳＤ、ＮＴＨＬ１、ＯＭＤ、ＰＡＢＰＣ１、ＰＣＢＰ１、ＰＭＳ１、ＰＯＬＧ、ＰＲＤＭ２、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＤ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＲＡＤ１７、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＦＷＤ３、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ７、ＲＯＢＯ２、Ｓ１００Ａ７、ＳＥＰＴ５、ＳＥＰＴ６、ＳＥＰＴ９、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤＢ１、ＳＧＫ１、ＳＨＴＮ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＸ２、ＳＫＩ、ＳＭＣ１Ａ、ＳＮＸ２９、ＳＯＸ２１、ＳＰＥＣＣ１、ＳＲＧＡＰ３、ＳＴＡＧ１、ＴＥＣ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＨＲＡＰ３、ＴＮＣ、ＵＳＰ４４、ＶＡＶ１、ＶＴＩ１Ａ、ＷＮＫ２、ＺＣＣＨＣ８、ＺＥＢ１、ＺＭＹＭ３、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７９、ＺＮＲＦ３の群から選択されるがん遺伝子を有することが好ましい。

【0061】

さらに、そのような腫瘍マーカー配列またはがん遺伝子は、他の人工的な変異を有してもよい。

【0062】

本発明の目的で、「検証」とは、本発明による参照材料を、特に、機器パラメータを考慮して校正を実行するためのまたは校正曲線を作成するための参照試料として使用して、意図された診断特にｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断を実施することを意味する。

【0063】

本発明の好ましい実施の形態では、ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断は、液体生検であり、好ましくは、血液試料からのＰＣＲは、本発明による血液試料に対して測定されるか、または本発明による血液試料が校正、検証、診断、もしくはｉｎ‐ｖｉｔｒｏ診断のために使用される。

【0064】

驚くべきことに、（たとえば血液試料に由来する）少量の試料核酸であっても、本発明による参照材料に対して十分な特異度および感度で、定性的および定量的に検出することができる。液体生検の事例では、これにより、腫瘍活動性（特に、転移の可能性）に関して、特に有利な早期のステートメントの作製が可能となる。好ましい試料核酸は、患者または試験者に由来するｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡである。

【0065】

したがって、本発明は、対立遺伝子頻度および／もしくは変異率を判定するための、ならびに／または核酸用のシーケンシング方法を用いた少なくとも１つの試料核酸のコピー数判定による絶対的定量のための方法における、参照材料の有利な使用にも関する。試料核酸の定量的判定は、校正または検証に基づいて特に有利に実施することができる。

【0066】

さらに、本発明は、分析前評価（輸送、血液試料の処理、保存／反復使用、たとえば凍結／解凍サイクル、抽出手順）、分析評価（正確度／精度、反復可能性／再現性、分析の特異度／感度、検出限界、定量限界、ブランク限界、直線性、干渉、頑健性）のための方法における参照材料の有利な使用に関する。

【0067】

本発明による参照材料の提供は、試料核酸の検出限界を検証するために特に有利である。特に有利な用途は、したがって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実施するための機器の検証に関する。

【0068】

このようにして、予め正確に定められた量のＤＮＡ物質または濃度を本発明による参照材料に導入することが特に有利であり、それによってこの参照材料は、患者の血液試料を模擬し、特に、腫瘍診断、妊娠診断、遺伝性遺伝子診断、または感染症診断の実施において高度に好適である。

【0069】

本発明の意味における「ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断」とは、好適なアッセイおよび機器を用いた、ヒトまたは動物の体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）での任意の診断を意味する。患者の疾患または状態に関するステートメントが好ましい。

【0070】

本発明の文脈において、「患者」は、任意の試験対象者を意味すると理解される。

【実施例】

【0071】

本発明を、実施例および図を用いて以下に説明する。しかしながら、本発明は、実施例および図に限定されるものではなく、原則として普遍的に適用可能である。

【0072】

実施例１：
表１の個々の成分を血球と混合して、好適な参照材料を得ることができる。

【0073】

実施例２：
参照材料に添加されるＤＮＡは、人間の生物学的状況を可能な限り忠実に再現することを可能にするために、以下のようにフラグメント化できる（図１および図２を参照されたい）。

【図面の簡単な説明】

【0074】

【図1】図１は、例として、使用することができるフラグメント化ＤＮＡのサイズ分布を示す（Ｍ＝マーカー）。

【図2】図２は、例として、使用することができるフラグメント化ＤＮＡのサイズ分布を示す（Ｍ＝マーカー）。

【図3】図３は、患者の血液試料と比較した参照材料の使用の例を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血液を含む参照材料の使用であって、安定化剤が添加され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、使用。

【請求項2】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、安定化剤が添加され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、使用。

【請求項3】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の５種の成分または最大３０種の成分から構成され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、使用。

【請求項4】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の最大７６種の成分から構成され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、使用。

【請求項5】

前記血漿または前記血清が、ヒトからも動物からも提供されない、請求項３または請求項４に記載の、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における参照材料を調製するための方法であって、血漿または血清が血球に添加され、安定化剤が添加される、方法。

【請求項7】

前記血漿または前記血清が、規定値の成分および／または生物学的材料を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項8】

前記血漿または前記血清が、ｇＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡ 腫瘍関連および非腫瘍関連のメチル化または非メチル化ｃｆＤＮＡ、ヒストン結合ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化または非メチル化ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、腫瘍核酸、スパイク核酸、エクソソーム、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞、エクソソームからなる群から選択される少なくとも１つの成分を、特に、以下の範囲、１～１５００ｎｇのＤＮＡ／ｍｌ、特に、妊娠中の女性では胎児ｃｆＤＮＡが２～１５％であるｃｆＤＮＡの割合、１～１０００ｎｇのＲＮＡ／ｍｌで含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項9】

前記血漿または前記血清が、細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的材料を、特に、以下の範囲、１～１００，０００個のウイルス／ｍｌ、１～１００，０００個の細菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌胞子／ｍｌ、１～１００，０００個の寄生虫／ｍｌ、１～１，０００個の腫瘍細胞／ｍｌ、または１～１，０００個の内皮細胞／ｍｌで含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項10】

前記安定化剤が、架橋安定化剤、アルコール性安定化剤、および／または抗凝固剤、特に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、およびアクロレインからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項11】

少なくとも１つのさらなる化学物質および／または少なくとも１つの生物学的材料、特に、ｉ．）バイオマーカー、分析物、活性物質、抗体、抗原、もしくは医薬、またはｉｉ．）細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）、が添加される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項12】

検証曲線または校正曲線が、前記参照材料を使用して作成されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項13】

核酸の前記シーケンシング方法が、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）によって実施されることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用または方法。

【請求項14】

前記参照材料が、特に、腫瘍診断、妊娠診断、遺伝性遺伝子診断、または感染症診断を実施するために患者の血液試料を模擬することを特徴とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の使用または方法。

【手続補正書】

【提出日】2024-06-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血液を含む参照材料の使用方法であって、安定化剤が添加され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、参照材料の使用方法。

【請求項2】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用方法であって、安定化剤が添加され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、参照材料の使用方法。

【請求項3】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用方法であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の５種の成分または最大３０種の成分から構成され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、参照材料の使用方法。

【請求項4】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用方法であって、前記血漿または前記血清が、アルブミンおよび表１の最大７６種の成分から構成され、前記参照材料が患者の血液試料を模擬する、参照材料の使用方法。

【請求項5】

前記血漿または前記血清が、ヒトからも動物からも提供されない、請求項３または請求項４に記載の、核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における血球および血漿または血清を含む参照材料の使用方法。

【請求項6】

核酸のシーケンシング方法を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断での試料における参照材料を調製するための方法であって、血漿または血清が血球に添加され、安定化剤が添加される、参照材料の調整方法。

【請求項7】

前記血漿または前記血清が、規定値の成分および／または生物学的材料を有する、請求項２～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記血漿または前記血清が、ｇＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡ 腫瘍関連および非腫瘍関連のメチル化または非メチル化ｃｆＤＮＡ、ヒストン結合ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化または非メチル化ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、腫瘍核酸、スパイク核酸、エクソソーム、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞、エクソソームからなる群から選択される少なくとも１つの成分を、特に、以下の範囲、１～１５００ｎｇのＤＮＡ／ｍｌ、特に、妊娠中の女性では胎児ｃｆＤＮＡが２～１５％であるｃｆＤＮＡの割合、１～１０００ｎｇのＲＮＡ／ｍｌで含む、請求項２～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記血漿または前記血清が、細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的材料を、特に、以下の範囲、１～１００，０００個のウイルス／ｍｌ、１～１００，０００個の細菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌／ｍｌ、１～１００，０００個の真菌胞子／ｍｌ、１～１００，０００個の寄生虫／ｍｌ、１～１，０００個の腫瘍細胞／ｍｌ、または１～１，０００個の内皮細胞／ｍｌで含む、請求項２～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記安定化剤が、架橋安定化剤、アルコール性安定化剤、および／または抗凝固剤、特に、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、およびアクロレインからなる群から選択される、請求項１～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項11】

少なくとも１つのさらなる化学物質および／または少なくとも１つの生物学的材料、特に、ｉ．）バイオマーカー、分析物、活性物質、抗体、抗原、もしくは医薬、またはｉｉ．）細胞、真核細胞、ウイルス、真菌、真菌胞子、プリオン、細菌、寄生虫、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＴＥＣ）、が添加される、請求項１～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項12】

検証曲線または校正曲線が、前記参照材料を使用して作成されることを特徴とする、請求項１～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項13】

核酸の前記シーケンシング方法が、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、または「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）によって実施されることを特徴とする、請求項１～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【請求項14】

前記参照材料が、特に、腫瘍診断、妊娠診断、遺伝性遺伝子診断、または感染症診断を実施するために患者の血液試料を模擬することを特徴とする、請求項１～請求項４のいずれか１項または請求項６に記載の方法。

【国際調査報告】