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▶ エーバイオケム バイオテクノロジー カンパニー，リミティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】スクロースシンターゼ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240723BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240723BHJP
C12P 19/44 20060101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
C12N15/54
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P19/44
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504849
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-01-25
(86)【国際出願番号】 CN2022106920
(87)【国際公開番号】W WO2023005779
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】202110853028.X
(32)【優先日】2021-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520385157
【氏名又は名称】エーバイオケム バイオテクノロジー（グループ）カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ウ，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ティアン，ゼンファ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，シュ
(72)【発明者】
【氏名】ジェン，シャオフー
(72)【発明者】
【氏名】シン，リトン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF41
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC24
4B064CD09
4B064CD30
4B064DA10
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA41
4B065CA60
(57)【要約】
スクロースシンターゼ及びその使用を開示する。ここで、前記スクロースシンターゼのアミノ酸配列は配列番号１１と比較して、下記から選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基の違いを含む：第３６位のアミノ酸がＶであり；第４３位のアミノ酸がＥであり；第１７９位のアミノ酸がＡであり；第３９５位のアミノ酸がＲであり；第４４７位のアミノ酸がＰであり：第４５５位のアミノ酸がＬであり；第６５４位のアミノ酸がＲである；且つ、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるスクロースシンターゼ以上の活性を有している。グルコシルトランスフェラーゼとスクロースシンターゼの組み合わせを使用して、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭの合成を触媒して、カスケード反応を実現し、原材料の選択に複数の可能性を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列は配列番号１１と比較して、下記から選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基の違いを含み：第３６位のアミノ酸がＶであり；
第４３位のアミノ酸がＥであり；
第１７９位のアミノ酸がＡであり；
第３９５位のアミノ酸がＲであり；
第４４７位のアミノ酸がＰであり：
第４５５位のアミノ酸がＬであり；
第６５４位のアミノ酸がＲであり；且つ、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるスクロースシンターゼ以上の活性を有していることを特徴とする、スクロースシンターゼ。
【請求項2】
前記スクロースシンターゼのアミノ酸配列を配列番号１１と比べたアミノ酸残基の違いは下記の通りであり：第３６位のアミノ酸がＶであるか；或いは、
第４３位のアミノ酸がＥであるか；或いは、
第１７９位のアミノ酸がＡであるか；或いは、
第３９５位のアミノ酸がＲであるか；或いは、
第４４７位のアミノ酸がＰであるか；或いは、
第４５５位のアミノ酸がＬであるか；或いは、
第６５４位のアミノ酸がＲであることを特徴とする、請求項１に記載のスクロースシンターゼ。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼをコードする、単離された核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の単離された核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項5】
請求項３に記載の核酸、又は請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞は、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である形質転換体。
【請求項6】
前記スクロースシンターゼの発現に適した条件下で請求項５に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼの製造方法。
【請求項7】
請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼの１つ又は複数を含み、好ましくは、配列番号９、１０及び／又は配列番号１１に示される配列を更に含む組成物。
【請求項8】
請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼの存在下で、スクロースとヌクレオシド二リン酸とを反応させて前記グリコシル供与体を得；前記ヌクレオシド二リン酸はＵＤＰ、ｄＴＤＰ、ＴＤＰ、ＣＤＰ、ＩＤＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰであり、好ましくは、
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、固定化酵素の形態で存在し；
前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
前記スクロースとヌクレオシド二リン酸の質量比は１００：０．５～３００：０．１であり、好ましくは２００：０．１であり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌである；
条件の１つ又は複数を満たすことを特徴とする、グリコシル供与体の製造。
【請求項9】
請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼ、配列番号９、１０及び配列番号１１の中の１つ又は複数の存在下でレバウジオシドＡ、グリコシルトランスフェラーゼ、スクロース、及びヌクレオシド二リン酸を反応させて、レバウジオシドＤを得るステップを含み；好ましくは、
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、又は固定化酵素の形態で存在し；
前記糖転移酵素は糖転移酵素菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、又は固定化酵素の形態で存在し；
前記レバウジオシドＡの濃度は１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌであり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは、５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば、２００ｇ／Ｌであり；
好ましくは、前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は、１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
より好ましくは、前記スクロースシンターゼ菌と前記レバウジオシドＡの質量比は、（０．１～２）：１であり、例えば、０．２４：１、０．３：１であり；
前記反応の反応溶媒は水であり、ｐＨは５～８であり、好ましくは、６であり、前記ｐＨは緩衝液で制御し、好ましくは、リン酸緩衝液であり；前記反応時の回転速度は５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは６００ｒｐｍであり；
前記反応の反応系の温度は２０～９０℃であり、好ましくは６０℃である；
条件の１つ又は複数を満たすことを特徴とする、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭの製造方法。
【請求項10】
ステビオール配糖体の製造における請求項１又は２に記載のスクロースシンターゼ、配列番号９、１０及び／又は配列番号１１の中の１つ又は複数の使用であって、前記ステビオール配糖体は、好ましくは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、出願日が２０２１年７月２７日である中国特許出願２０２１１０８５３０２８．Ｘの優先権を主張する。本出願は上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
（技術分野）
本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、特にスクロースシンターゼ及びその使用に関する。
本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、特にスクロースシンターゼ及びその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ステビオール配糖体（Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ、ステビオールグリコサイドとも呼ばれる）は、キク科の草本植物であるステビアの葉から抽出された天然甘味料であり、複数の配糖体の混合物であり、異なるステビオール配糖体は、味と品質に大きな違いが存在する。ステビオール配糖体は純粋な天然物（純粋な天然植物ステビア由来）、高甘味度（スクロースの２５０～４５０倍）、低カロリー（白砂糖のわずか１／３００）、低使用コスト（コストはスクロースのわずか１／３）、優れた安定性（耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、分解しにくい）、高い安全性（毒性の副作用がない）等のメリット、並びに抗高血糖、抗高血圧、抗炎症、抗腫瘍、下痢止めなどの潜在的な治療効果を有している。
【0004】
ステビオール配糖体（ステビオール配糖体系化合物）の構造式は下記の通りである。
【0005】
【化1】
【0006】
【0007】
上記のステビオール配糖体は、共通のアグリコンであるステビオール（Ｓｔｅｖｉｏｌ）を有し、違いは、Ｃ－１３とＣ－１９の位置に結合されている糖基の数と種類にあり、主にステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ａ、Ｒｅｂ Ａ、ＲＡと略称する）、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｄ、Ｒｅｂ Ｄ、ＲＤと略称する）、レバウジオシドＥ、ダルコシド、ステビオールビオシドなどの８種の配糖体を含む。ステビアの葉は、最大１０～２０％（乾燥重量に基づく）のステビオール配糖体を蓄積することができる。ステビアの葉で発見された主な配糖体は、レバウジオシドＡ（２～１０％）、ステビオシド（２～１０％）、及びレバウジオシドＣ（１～２％）である。レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ及びＦ、ステビオールビオシド、ルブソシドなどの他の配糖体は、はるかに低いレベル（約０～０．２％）で検出されている。
【0008】
ステビオール配糖体は高強度甘味料ではあるが、苦味と渋みがあるという欠点があり、食品や飲料などの味覚が要求される分野での使用が著しく制限されている。ステビオール配糖体の苦味と渋みの本質的な原因はその内部分子構造にあり、ステビオール配糖体のＲ１基とＲ２基に連結されている糖基が多いほど味が良くなる。一般に、ステビオシドはスクロースの１１０～２７０倍甘く、レバウジオシドＡの１５０～３２０倍甘いことが知られているが、高度に精製された状態でも、ステビオール配糖体は依然として苦味、甘い後味、甘草の味などの望ましくない味の特性を持っている。
【0009】
レバウジオシドＤは、その中で最も有望なステビオール配糖体であり、他のステビオール配糖体と比較して、甘味が高く、スクロースの約３００～３５０倍であり、甘味は純粋で、味もスクロースに近く、苦味や甘草の味がなく、安定性も良好であり、理想的な天然高甘味度製品である。ステビア葉に含まれているレバウジオシドＤの含有量は非常に少なく（５％未満である）、抽出によるレバウジオシドＤの製造には、多量のステビア原料が必要となることに加え、レバウジオシドＤを濃縮する工程が煩雑であり、抽出後、複数回のカラムパス及び脱塩、脱色、再結晶化が必要であり、製造過程で大量の廃水が発生するため、製造コストが高く、産業的な大量生産には適していない。
【0010】
レバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ、Ｒｅｂ Ｍ、ＲＭと略称する）はより優れた味覚特性を持っているが、葉の乾燥重量中のその含有量は０．１％未満であるため、分離コストが高く、価格も高い。高濃度のレバウジオシドＭを得る生体触媒法は学者の注目を集めている。現在、ステビア由来の組換え酵素がレバウジオシドＤからレバウジオシドＭへの生成を触媒できることが報告されているが、収率は低い。レバウジオシドＤを基質として用い、微生物の酵素触媒作用によりレバウジオシドＭを得ることができ、従来の抽出法と比較して、製造プロセスが改善されるだけではなく、環境汚染が軽減され、標的製品レバウジオシドＭの収率を向上する。しかし、現在の生物学的酵素触媒法には主に次のような幾つかの問題がある。（１）生体酵素でレバウジオシドＤを触媒してレバウジオシドＭを製造するコストは高く、酵素触媒収率もさらに最適化する必要がある；（２）触媒に使用される糖転移酵素は生成物から分離してリサイクルすることが難しく、失活し易い；（３）天然植物中のレバウジオシドＡの含有量は非常に多いのに対し、レバウジオシドＤの含有量は非常に少なく、レバウジオシドＡを低コストでレバウジオシドＤに直接に転換することも緊急の課題である。
【0011】
グルコシルトランスフェラーゼは、酵素反応においてグルコシルのみを転移させる酵素であり、当該酵素の作用機序は、グリコシル供与体のグルコース残基の糖受容体分子への転移を触媒し、それによって受容体分子の活性を調節することである。
【0012】
「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」とは、核酸塩基（即ち、窒素含有塩基）及び五炭糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）を含むグリコシルアミン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｅｓ）を指す。ヌクレオチドの非限定的な実施例は、シチジン（ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、及びイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）を含む。
【0013】
「ヌクレオチド二リン酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」は、核酸塩基（即ち、窒素含有塩基）、五炭糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）、及び二リン酸（即ち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。「ヌクレオチド二リン酸」を「ＮＤＰ」と略してもよい。ヌクレオチド二リン酸の非限定的な実施例は、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、及びイノシン二リン酸（ＩＤＰ）を含む。
【0014】
ＵＤＰ－グルコースはウリジン二リン酸グルコース（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ）の略称であり、ＵＤＰ－グルコース又はＵＤＰＧとも呼ばれ、ウリジン二リン酸とブドウ糖から構成されるビタミンであり、「活性ブドウ糖」とみなすことができ、植物、動物、及び微生物の細胞内に広く分布し、スクロース、デンプン、グリコーゲン、及びその他のオリゴ糖や多糖の合成における最も一般的なグリコシル供与体である。ＵＤＰ－グルコースに加えて、ＡＤＰ－グルコース、ＴＤＰ－グルコース、ｄＴＤＰ－グルコース（デオキシチミジン二リン酸グルコース：ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＣＤＰ－グルコース、ＩＤＰ－グルコース又はＧＤＰ－グルコース等もグリコシル供与体化合物として一般的に使用される。これらのグリコシル供与体は高価であり、産業生産には適していない。
【0015】
スクロースシンターゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＵＳ、ＳｕＳｙ／ＳＳ等でも略称、ＥＣ２．４．１．１３）は、ＮＤＰ－グルコース＋Ｄ－フルクトースからＮＤＰとスクロースへの化学反応を可逆的に触媒し、糖転移酵素－４サブファミリーに属し、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）胚芽で始めて同定された。各タンパク質は四量体として存在する。各サブユニットの分子量は約９０ｋＤａである。遺伝子のサイズは一般に５．９ｋｂであり、ｃＤＮＡのサイズは約２．７ｋｂである。コードされたアミノ酸配列の全長は約８００個のアミノ酸残基（Ｒｏｓｓ及びＤａｖｉｅｓ １９９２）である。スクロースシンターゼはＮＤＰに対して異なる親和性を持っており、親和性の大きさは順次にＵＤＰ＞ＡＤＰ＞ｄＴＤＰ＞ＣＤＰ＞ＧＤＰである。
【0016】
レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、又はレバウジオシドＭを生体酵素法で合成する現在の方法は、高価な原料ＵＤＰグルコースまたはＡＤＰグルコースを加え、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ、ＵＧＴと呼ばれる）の作用によりステビオシドを出発物質として使用してレバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭの生成を触媒するか、或いはレバウジオシドＡを出発物質として使用してレバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭの生成を触媒する必要がある。しかし、ＵＤＰ－グルコースの販売価格が非常に高いため、レバウジオシドＤの産業的調製の実現可能性はほぼ完全に制限されており、コストが高くなり、市場競争力が欠如している。
【0017】
現在、天然甘味料ステビアの広範な使用、及び生体触媒技術の発展に伴い、グリコシルトランスフェラーゼは、ステビオール配糖体の生体触媒製造の分野でますます使用されている。ステビオール配糖体の生産効益を向上させるためには、原料ＵＤＰＧの高価な問題を解決することが急務となっている。ＵＤＰＧはスクロースとＵＤＰを触媒するスクロースシンターゼによって再生可能であるため、ＵＤＰＧの再生をより適切に実現するためにスクロースシンターゼを改変して、より高い酵素活性とより優れた安定性を備えた修飾酵素を得る必要があり、それによりステビオール配糖体の産業化生産を実現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明が解決しようとする技術的課題は、既存のスクロースシンターゼが、ステビオール配糖体の生体触媒製造に使用される場合に酵素活性が低く、安定性が低いため、ステビオール配糖体の触媒として使用すると転換率が低い欠点であるり、従って、本発明は、スクロースシンターゼ及びステビオール配糖体の製造におけるその使用を提供する。本発明のスクロースシンターゼは、酵素活性が高く、安定性が良好であり；本発明は、ステビオシドを原料として使用し、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）及びスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を組み合わせてＲＤ又はＲＭの合成を触媒して、カスケード反応を実現し；スクロースとＵＤＰを使用してＵＤＰＧの再生を達成することも、スクロースとＡＤＰを使用してＡＤＰＧの再生を達成することもでき、グリコシル供与体ＵＤＰＧ、ＡＤＰＧのコストが高い問題を解決し、また、原材料の選択に複数の可能性を提供して、大規模な産業生産を実現するためにプロセス条件を最適化したより多くのオプションを提供し、産業生産に有利である。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明の第一態様はスクロースシンターゼを提供し、前記スクロースシンターゼのアミノ酸配列は配列番号１１と比較して、下記から選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基の違いを含む。
第３６位のアミノ酸がＶであり；
第４３位のアミノ酸がＥであり；
第１７９位のアミノ酸がＡであり；
第３９５位のアミノ酸がＲであり；
第４４７位のアミノ酸がＰであり：
第４５５位のアミノ酸がＬであり；
第６５４位のアミノ酸がＲであり；且つ、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるスクロースシンターゼ以上の活性を有している。
第３６位のアミノ酸がＶであり；
第４３位のアミノ酸がＥであり；
第１７９位のアミノ酸がＡであり；
第３９５位のアミノ酸がＲであり；
第４４７位のアミノ酸がＰであり：
第４５５位のアミノ酸がＬであり；
第６５４位のアミノ酸がＲであり；且つ、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるスクロースシンターゼ以上の活性を有している。
【0020】
最終結果がアミノ酸配列と配列番号１１との間に上述の違いがあることを反映できる限り、前記違いは、配列番号１１上で突然変異しても、他の配列上で突然変異してもよい。
【0021】
好ましくは、前記スクロースシンターゼのアミノ酸配列は配列番号１１と比べて、その違いは下記の通りである：
第３６位のアミノ酸がＶであるか；或いは、
第４３位のアミノ酸がＥであるか；或いは、
第１７９位のアミノ酸がＡであるか；或いは、
第３９５位のアミノ酸がＲであるか；或いは、
第４４７位のアミノ酸がＰであるか；或いは、
第４５５位のアミノ酸がＬであるか；或いは、
第６５４位のアミノ酸がＲである。
第３６位のアミノ酸がＶであるか；或いは、
第４３位のアミノ酸がＥであるか；或いは、
第１７９位のアミノ酸がＡであるか；或いは、
第３９５位のアミノ酸がＲであるか；或いは、
第４４７位のアミノ酸がＰであるか；或いは、
第４５５位のアミノ酸がＬであるか；或いは、
第６５４位のアミノ酸がＲである。
【0022】
本発明の第２態様は、本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼをコードする、単離された核酸を提供する。
【0023】
本発明の第３態様は、本発明の第２態様に記載の核酸を含む、組換え発現ベクターを提供する。
【0024】
本発明の第４態様は、本発明の第２態様に記載の核酸又は本発明の第３態様に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞である、形質転換体を提供する。
【0025】
好ましくは、前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0026】
本発明の第５態様は、前記スクロースシンターゼの発現に適した条件下で本発明の第４態様に記載の形質転換体を培養することを含む、本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼの製造方法を提供する。
【0027】
本発明の第６態様は、本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼの１つ又は複数を含む、組成物を提供する。
【0028】
好ましくは、前記組成物は、配列番号９、１０及び／又は１１に示される配列の酵素を含む。
【0029】
本発明の第７態様は、下記のステップを含む、グリコシル供与体の製造方法を提供する。
【0030】
本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼの存在下で、スクロースとヌクレオシド二リン酸とを反応させて前記グリコシル供与体を得；前記ヌクレオシド二リン酸はＵＤＰ、ｄＴＤＰ、ＴＤＰ、ＣＤＰ、ＩＤＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰであり、
好ましくは、前記グリコシル供与体の製造方法は下記の１つ又は複数の条件を満たす：
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、又は固定化酵素の形態で存在し；
前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
前記スクロースと前記ヌクレオシド二リン酸の質量比は１００：０．５～３００：０．１であり、好ましくは２００：０．１であり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌである。
好ましくは、前記グリコシル供与体の製造方法は下記の１つ又は複数の条件を満たす：
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、又は固定化酵素の形態で存在し；
前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
前記スクロースと前記ヌクレオシド二リン酸の質量比は１００：０．５～３００：０．１であり、好ましくは２００：０．１であり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌである。
【0031】
本発明の一つの好ましい実施形態において、上記スクロースシンターゼ菌の製造方法は下記の通りである：（１）点突然変異を含むスクロースシンターゼの遺伝子組換え菌をＯＤ６００が０．５～１．０、例えば約０．８に達するまで培養した場合、最終濃度が０．１～０．３ｍＭ、例えば０．１ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２０～２８℃、例えば２５℃で、１６～２６時間、例えば２０時間培養する。（２）培養終了後、培地を３０００～５０００ｒｐｍ、例えば４０００ｒｐｍで１０～３０分間、例えば２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌を収集する。さらに、収集した菌体をＰＢＳ（２０～１００ｍＭ、例えば５０ｍＭ、ｐＨ５～７、例えば６．０）で１：５～２０、例えば１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させた後、高圧ホモジナイザー（例えば、５５０Ｍｂａｒ、１．５分間のする）を使用し、ホモジナイズした酵素液を例えば１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を収集して前記スクロースシンターゼ菌を得る。
【0032】
本発明の第８態様は、本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼ、配列番号９、１０及び配列番号１１の中の１つ又は複数の存在下でレバウジオシドＡ、グリコシルトランスフェラーゼ、スクロース、及びヌクレオシド二リン酸を反応させてレバウジオシドＤを得るステップを含むレバウジオシドＤの製造方法を提供する。
【0033】
好ましくは：前記レバウジオシドＤの製造方法は下記１つ又は複数の条件を満たす。
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、固定化酵素の形態で存在し；
前記スクロースシンターゼはスクロースシンターゼ菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、固定化酵素の形態で存在し；
【0034】
前記糖転移酵素は糖転移酵素菌、粗酵素液、純酵素、純酵素液、固定化酵素の形態で存在し；
前記レバウジオシドＡの濃度は１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌであり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは、５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば、２００ｇ／Ｌであり；
前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は、１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
より好ましくは、前記スクロースシンターゼ菌と前記レバウジオシドＡの質量比は、（０．１～２）：１であり、例えば、０．２４：１、０．３：１であり；
前記反応の反応溶媒は水であり、ｐＨは５～８であり、好ましくは、６であり、前記ｐＨは緩衝液で制御し、好ましくは、リン酸緩衝液であり；
前記反応時の回転速度は５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは６００ｒｐｍであり；
前記反応の反応系の温度は２０～９０℃であり、好ましくは６０℃である。
前記レバウジオシドＡの濃度は１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌであり；
前記スクロースの濃度は、好ましくは、５０～３００ｇ／Ｌであり、例えば、２００ｇ／Ｌであり；
前記スクロースシンターゼ菌とスクロースの質量比は、１：（２０～２００）であり、好ましくは３：２００であり；
より好ましくは、前記スクロースシンターゼ菌と前記レバウジオシドＡの質量比は、（０．１～２）：１であり、例えば、０．２４：１、０．３：１であり；
前記反応の反応溶媒は水であり、ｐＨは５～８であり、好ましくは、６であり、前記ｐＨは緩衝液で制御し、好ましくは、リン酸緩衝液であり；
前記反応時の回転速度は５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは６００ｒｐｍであり；
前記反応の反応系の温度は２０～９０℃であり、好ましくは６０℃である。
【0035】
好ましくは、前記グリコシル供与体とレバウジオシドＡのモル比は１：１～５：１であり；
前記グリコシル供与体は本発明の第７態様に記載の製造方法で得られる。
前記グリコシル供与体は本発明の第７態様に記載の製造方法で得られる。
【0036】
本発明の第９態様は、本発明の第８態様に記載の製造方法でレバウジオシドＤを製造する工程を含むレバウジオシドＭの製造方法を提供する。
【0037】
本発明の第１０態様は、ステビオール配糖体の製造における、本発明の第１態様に記載のスクロースシンターゼ、配列番号９、１０及び／又は配列番号１１の１つ又は複数の使用を提供する。
【0038】
好ましくは、前記ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、又はレバウジオシドＭである。
【0039】
本発明の積極的な進歩効果は次の通りである。
【0040】
本発明のスクロースシンターゼは、酵素活性が高く、安定性が良好であり；ステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭ）の製造に使用すると、親スクロースシンターゼと比較して触媒活性が大幅に向上し、転換率が大幅に向上し；本発明はステビオシドを原料として使用し、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）とスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を組み合わせてＲＤ又はＲＭの合成を触媒し、カスケード反応を実現し；本発明のスクロースシンターゼはＡＤＰ及びＵＤＰを基質とすることができる、基質としてＡＤＰを用いた場合に最も活性が高く、即ち、本発明は、スクロースとＵＤＰを用いてＵＤＰＧの再生を実現することができ、また、スクロースとＡＤＰを用いてＡＤＰＧの再生を実現することもでき、グリコシル供与体ＵＤＰＧ、ＡＤＰＧの価格が高い問題を解決し、原材料の選択に複数の可能性も提供し、大規模な産業生産を実現するためにプロセス条件を最適化したより多くのオプションを提供し、産業生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】本発明の１つの実施形態におけるステビオシドからレバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭを製造する経路の模式図である。
【図2】基質レバウジオシドＡ対照品のスペクトルであり、保持時間は１４．１８６分である。
【図3】生成物レバウジオシドＤ対照品のスペクトルであり、保持時間は１１．８２１分である。
【図4】生成物レバウジオシドＭ対照品のスペクトルであり、保持時間は１２．３１６分である。
【図5】表７の第二ラウンドのスクリーニングにおけるＲＤ（基質：ＡＤＰ、反応時間：３０分）の合成を触媒する親酵素Ｅｎｚ．８の活性のＨＰＬＣチャートである。
【図6】表７の第二ラウンドのスクリーニングにおけるＲＤ（基質：ＡＤＰ、反応時間：３０分）の合成を触媒する親酵素Ｅｎｚ．１１の活性のＨＰＬＣチャートである。
【図7】表８のＲＭの合成（反応時間：７Ｈ）を触媒する親酵素Ｅｎｚ．８の活性のＨＰＬＣチャートである。
【図8】表８のＲＭの合成（反応時間：７Ｈ）を触媒するＥｎｚ．１１の活性のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0042】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明に不利な制限を意味するものではない。下記の実施例において具体的な条件を示していない実験方法は、一般的方法及び条件、又は商品の説明書に従って選択されるべきである。
【0043】
本発明における実験方法は、特に説明されていない限り、いずれも一般的な方法であり、具体的な遺伝子クローニング操作については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編「分子クローニング実験ガイド」を参照されたい。
【0044】
本発明におけるアミノ酸の略号は、特に説明されていない限りいずれも本技術分野における一般的なものであり、具体的に略号に対応するアミノ酸は表１に示された通りである。
【0045】
【表1】
【0046】
前記アミノ酸の対応するコドンも本技術分野における一般的なものであり、具体的なアミノ酸とコドンとの対応関係は表２に示された通りである。
【0047】
【表2】
【0048】
ＫＯＤ Ｍｉｘ酵素はＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，ＬＴＤ．，から購入し、ＤｐｎＩ酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（上海）から購入し；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ１０コンピテントセルとＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルはＧｅｎｖｉｅｗから購入した。ｐＧｒｏ７プラスミドは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｔｈ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＣＯ，ＬＴＤから購入した。スクロースはＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）から購入した。ＲｅｂＡ対照品はＭｃＬｅａｎから購入した。ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ対照品はＱｉｎｇＤａｏ Ｓｉｙｕａｎ Ｓｔｅｖｉａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｄｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入した。
【0049】
転換率のＨＰＬＣ検出法：クロマトグラフィーカラム：ＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５ｕｍ）。移動相：０．１％のＴＦＡ水溶液を移動相Ａとし、０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液を移動相Ｂとし、下記の表３に従って勾配溶出を実行した。検出波長：２１０ｎｍ、流速：１ｍｌ／分、注入量：２０μｌ、カラム温度：３５℃。図２に示されるように、ＲｅｂＡのピーク時間：１４．１８６分であり、図３に示されるように、ＲｅｂＤのピーク時間：１１．８２１分である。図４に示されるように、ＲｅｂＭのピーク時間：１２．３１６分である。
【0050】
【表3】
【実施例】
【0051】
実施例１：第一ラウンドのスクロースシンターゼの製造
表４の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８に示される、番号がＥｎｚ．１、Ｅｎｚ．２、Ｅｎｚ．３、Ｅｎｚ．４、Ｅｎｚ．５、Ｅｎｚ．６、Ｅｎｚ．７、Ｅｎｚ．８のスクロースシンターゼ酵素遺伝子の完全な遺伝子を合成し、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクター（酵素切断部位：ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）をそれぞれ挿入して、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．２、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．３、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．４、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．５、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．６、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．７、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．８を得、配列決定により、遺伝子が対応するベクターに正常にライゲーションされたことが確認された。遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ．６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ，Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）であった。
表４の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８に示される、番号がＥｎｚ．１、Ｅｎｚ．２、Ｅｎｚ．３、Ｅｎｚ．４、Ｅｎｚ．５、Ｅｎｚ．６、Ｅｎｚ．７、Ｅｎｚ．８のスクロースシンターゼ酵素遺伝子の完全な遺伝子を合成し、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクター（酵素切断部位：ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）をそれぞれ挿入して、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．２、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．３、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．４、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．５、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．６、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．７、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．８を得、配列決定により、遺伝子が対応するベクターに正常にライゲーションされたことが確認された。遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ．６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ，Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）であった。
【0052】
それぞれの組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．２、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．３、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．４、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．５、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．６、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．７、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．８とｐＧｒｏ７プラスミド（当該プラスミドは、シャペロンタンパク質を発現し、標的タンパク質の溶解度を高めることができる）とを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに同時形質転換させて、各スクロースシンターゼ遺伝子を含む改変株を得た。スクロースシンターゼ遺伝子を含む改変株をそれぞれプレート上に画線して活性化させた後、シングルコロニーを選択して５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とうしながら培養した。同じように５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む新鮮なＴＢ液体培地５０ｍｌに２％（ｖ／ｖ）の接種量で移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで振とうしながら３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．１ｍＭになるまで加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌を収集した。後で使用するために－２０℃で保管した。
【0053】
収集した菌をＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズさせ（５５０Ｍｂａｒで１．５分間）、ホモジナイズさせた酵素溶液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を採取してスクロースシンターゼ反応酵素溶液を得た。
【0054】
【表4】
【0055】
実施例２：β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの製造
ヌクレオチド配列番号１２に示されるβ－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ（酵素番号：Ｅｎｚ．９、当業者であれば配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に基づいて当該酵素のアミノ酸配列を得ることができる）遺伝子に従って、完全なβ－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子セットを合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターとライゲーションさせて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－１，２ＧＴを得た。遺伝子合成会社：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）。
ヌクレオチド配列番号１２に示されるβ－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ（酵素番号：Ｅｎｚ．９、当業者であれば配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に基づいて当該酵素のアミノ酸配列を得ることができる）遺伝子に従って、完全なβ－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子セットを合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターとライゲーションさせて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－１，２ＧＴを得た。遺伝子合成会社：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）。
【0056】
プラスミドｐＥＴ２８ａ－１，２ＧＴを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む改変株を得た。
【0057】
β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む改変株をプレート上に画線により活性化させた後、シングルコロニーを選択して５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で１２時間振とうしながら培養した。同じように５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む新鮮なＬＢ液体培地５０ｍｌに２％（ｖ／ｖ）の接種量で移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで振とうしながら３７℃で培養し、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．１ｍＭになるまで加え、２４℃で２２時間誘導培養した。培養終了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌を収集し、使用するまで－２０℃の超低温冷蔵庫で保管した。
【0058】
５０ｍＭ、ｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を製造し、収集した菌を１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させ、次に、高圧ホモジナイズさせ（５５０～６００Ｍｂａｒ、１分間）、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を採取してβ－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの粗酵素液を得た。
【0059】
実施例３：第一ラウンドのスクロースシンターゼのスクリーニング
Ｒｅｂ Ａ（含有量：９６％）を基質（Ｂｉｄｅｐｈａｒｍから購入）として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１５０μＬを１ｍＬ反応系に加え、Ｒｅｂ Ａの最終濃度は５０ｇ／Ｌであり、ＡＤＰ又はＵＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ反応酵素溶液は３０μＬであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで１時間反応させ、次に、反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬを加えてボルテックスした後、更に８００μＬの脱イオン水を加えて混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂ Ｄの濃度を分析した（詳細については、表５のＲＤ％を参照できる）。
Ｒｅｂ Ａ（含有量：９６％）を基質（Ｂｉｄｅｐｈａｒｍから購入）として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１５０μＬを１ｍＬ反応系に加え、Ｒｅｂ Ａの最終濃度は５０ｇ／Ｌであり、ＡＤＰ又はＵＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ反応酵素溶液は３０μＬであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで１時間反応させ、次に、反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬを加えてボルテックスした後、更に８００μＬの脱イオン水を加えて混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂ Ｄの濃度を分析した（詳細については、表５のＲＤ％を参照できる）。
【0060】
【表5】
【0061】
表５の結果は下記のことを示している：ＡＤＰをスクロースシンターゼの触媒基質として使用した場合、Ｅｎｚ．８の酵素活性が最も高く、次はＥｎｚ．５、Ｅｎｚ．３であり；ＵＤＰをスクロースシンターゼの触媒基質として使用した場合、Ｅｎｚ．３の酵素活性が最も高く、次はＥｎｚ．５、Ｅｎｚ．８であり、且つ、ＡＤＰを使用したＥｎｚ．３、Ｅｎｚ．５、Ｅｎｚ．８の活性はいずれもＵＤＰを使用したものより高く、ＡＤＰを使用した場合のＥｎｚ．８が最も効果的であった。従って、次のラウンドでは、ＡＤＰをスクロースシンターゼの基質として使用し、Ｅｎｚ．８に基づいて突然変異とスクリーニングを実行した。
【0062】
実施例４：第二ラウンドのスクロースシンターゼ突然変異体の製造
組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．８を鋳型として使用し、表６に示されるプライマー配列を使用し、Ｅｎｚ．Ｘ－Ｆ／Ｋｍ－Ｒ及びＫｍ－Ｆ／Ｅｎｚ．Ｘ－Ｒをそれぞれプライマー（ここで、Ｅｎｚ．Ｘは：Ｅｎｚ．１０、Ｅｎｚ．１１、Ｅｎｚ．１２、Ｅｎｚ．１３、Ｅｎｚ．１４、Ｅｎｚ．１５、Ｅｎｚ．１６である）として使用し、ＫＯＤ酵素を使用してＰＣＲを実行し、標的ＤＮＡフラグメントとベクターフラグメントを増幅させた。
組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．８を鋳型として使用し、表６に示されるプライマー配列を使用し、Ｅｎｚ．Ｘ－Ｆ／Ｋｍ－Ｒ及びＫｍ－Ｆ／Ｅｎｚ．Ｘ－Ｒをそれぞれプライマー（ここで、Ｅｎｚ．Ｘは：Ｅｎｚ．１０、Ｅｎｚ．１１、Ｅｎｚ．１２、Ｅｎｚ．１３、Ｅｎｚ．１４、Ｅｎｚ．１５、Ｅｎｚ．１６である）として使用し、ＫＯＤ酵素を使用してＰＣＲを実行し、標的ＤＮＡフラグメントとベクターフラグメントを増幅させた。
【0063】
【表6】
【0064】
ＰＣＲ増幅反応系は下記の通りである：
ＫＯＤ Ｍｉｘ：２５μＬ
ｄｄＨ２Ｏ：２０μＬ
プライマー：２μＬ×２
鋳型：１μＬ。
ＰＣＲプログラム：
（１）９８℃で３分
（２）９８℃で１０ｓ
（３）５５℃で５ｓ
（４）６８℃で５ｓ／ｋｂｐ
（５）６８℃で５分
（６）１２℃で保温
（２）～（４）を３４回繰り返した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ：２５μＬ
ｄｄＨ２Ｏ：２０μＬ
プライマー：２μＬ×２
鋳型：１μＬ。
ＰＣＲプログラム：
（１）９８℃で３分
（２）９８℃で１０ｓ
（３）５５℃で５ｓ
（４）６８℃で５ｓ／ｋｂｐ
（５）６８℃で５分
（６）１２℃で保温
（２）～（４）を３４回繰り返した。
【0065】
ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化させ、ゲル電気泳動とゲル回収を実行して標的ＤＮＡフラグメントを得た。ヴァザイムから購入した２つのフラグメント相同リコンビナーゼ（Ｅｘｎａｓｅ ＩＩ）を介して組み換えライゲーションを実行し、ライゲーション後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ１０コンピテントセルに形質転換させ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に散布し、３７℃で一晩培養し；シングルコロニーをＬＢ試験管（Ｋｍ耐性）に採取し、８～１０時間培養し、プラスミドを抽出して配列決定及び同定を実行して、突然変異遺伝子を含む組換えプラスミドを得た。
【0066】
配列決定が正確な組換えプラスミドを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、点突然変異を含むスクロースシンターゼ遺伝子改変株を得た。スクロースシンターゼ遺伝子改変株をプレート上に画線活性化させた後、シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに植菌し、３７℃で４時間振とうしながら培養した。同じように５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む新鮮なＴＢ液体培地５０ｍｌに２％（ｖ／ｖ）の接種量で移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで振とうしながら３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．１ｍＭになるまで加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌を収集した。使用するまで－２０℃で保管した。
【0067】
収集した菌をＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を使用して１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させた後、高圧ホモジナイザーを用いて高圧ホモジナイズさせ（５５０Ｍｂａｒ、１．５分間）、ホモジナイズさせた酵素液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を採取して反応酵素液を得た。
【0068】
実施例５：第二ラウンドのスクロースシンターゼ突然変異体のスクリーニング
Ｒｅｂ Ａ（含有量：９６％）を基質として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１５０μＬを１ｍＬの反応系に加え、Ｒｅｂ Ａの最終濃度は５０ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ反応酵素溶液は３０μＬであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで３０分間反応させた後、それぞれ反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬに加えてボルテックスし、更に８００μＬの脱イオン水を加え、均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂＤの濃度（ＲＤ％）を分析した；分析結果は表７に示された通りである。
Ｒｅｂ Ａ（含有量：９６％）を基質として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１５０μＬを１ｍＬの反応系に加え、Ｒｅｂ Ａの最終濃度は５０ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ反応酵素溶液は３０μＬであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで３０分間反応させた後、それぞれ反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬに加えてボルテックスし、更に８００μＬの脱イオン水を加え、均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂＤの濃度（ＲＤ％）を分析した；分析結果は表７に示された通りである。
【0069】
【表7】
【0070】
結果は下記のことを示している：反応の最初の３０分以内では、Ｅｎｚ．１１の反応性が最も高く、それは親酵素Ｅｎｚ．８より１０％高く、次はＥｎｚ．１６、Ｅｎｚ．１４、Ｅｎｚ．１３であり、それらの反応活性は親酵素Ｅｎｚ．８より５％～１０％増加した。
【0071】
【0072】
【0073】
実施例６：β－１，３－グリコシルトランスフェラーゼＥｎｚ．１７の製造
ヌクレオチド配列番号２９に示されるβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ（酵素番号：Ｅｎｚ．１７、当業者であれば配列番号２９に示されるヌクレオチド配列に基づいて当該酵素のアミノ酸配列を得ることができる）の遺伝子に従って、完全なβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子セットを合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターとライゲーションさせて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１７を得た。遺伝子合成会社：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）
ヌクレオチド配列番号２９に示されるβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ（酵素番号：Ｅｎｚ．１７、当業者であれば配列番号２９に示されるヌクレオチド配列に基づいて当該酵素のアミノ酸配列を得ることができる）の遺伝子に従って、完全なβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子セットを合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターとライゲーションさせて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１７を得た。遺伝子合成会社：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）
【0074】
プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１７を宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、１，３－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む改変株を得た。
【0075】
１，３－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む改変株をプレート上に画線により活性化させた後、シングルコロニーを選択して５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で１２時間振とうしながら培養した。同じように５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む新鮮なＬＢ液体培地５０ｍｌに２ｖ／ｖ％の接種量で移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで振とうしながら３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．１ｍＭになるまで加え、２４℃で２２時間誘導培養した。培養終了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌を収集し、使用するまで－２０℃の超低温冷蔵庫で保管した。
【0076】
５０ｍＭ、ｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を製造し、収集した菌を１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させた後、高圧ホモジナイズさせ（５５０Ｍｂａｒ、１分間）、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を採取して１，３－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液を得た。
【0077】
実施例７：ＲＭ合成反応
Ｒｅｂ Ａ６０（Ｒｅｂ Ａ含有量：９６％、ステビオシド含有量：約３０％、Ｃｈｅｎｇｕａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品仕様：ＴＳＧ９０／ＲＡ６０）を基質として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１２０μＬ、スクロースシンターゼ反応酵素液３０μＬ、１，３－グリコシルトランスフェラーゼ１５０μＬを１ｍＬ反応系に加え、ＲＡ６０の最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで反応させた後、それぞれ４ｈ、７ｈ、一晩後反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬを加えてボルテックスし、更に８００μＬの脱イオン水を加え、均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂ Ａ、中間生成物Ｒｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの濃度（ＲＡ％、ＲＤ％、ＲＭ％）を分析し、分析結果は表８に示された通りであり（ここで、ＲＡ％、ＲＤ％、ＲＭ％はそれぞれ反応後の反応液における基質、中間体及び生成物の濃度を表す）、当該実施例の反応ルートは図１に示された通りである。
Ｒｅｂ Ａ６０（Ｒｅｂ Ａ含有量：９６％、ステビオシド含有量：約３０％、Ｃｈｅｎｇｕａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品仕様：ＴＳＧ９０／ＲＡ６０）を基質として使用し、β－１，２－グリコシルトランスフェラーゼの反応酵素液１２０μＬ、スクロースシンターゼ反応酵素液３０μＬ、１，３－グリコシルトランスフェラーゼ１５０μＬを１ｍＬ反応系に加え、ＲＡ６０の最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、最後に最終の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで反応させた後、それぞれ４ｈ、７ｈ、一晩後反応液１０μＬを取って、ｐＨ２．０の塩酸１９０μＬを加えてボルテックスし、更に８００μＬの脱イオン水を加え、均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、ＨＰＬＣでＲｅｂ Ａ、中間生成物Ｒｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの濃度（ＲＡ％、ＲＤ％、ＲＭ％）を分析し、分析結果は表８に示された通りであり（ここで、ＲＡ％、ＲＤ％、ＲＭ％はそれぞれ反応後の反応液における基質、中間体及び生成物の濃度を表す）、当該実施例の反応ルートは図１に示された通りである。
【0078】
【表8】
【0079】
結果：４時間、７時間、及び一晩反応して：Ｅｎｚ．１４の反応効果（ＲＭ％）が最も優れ、次はＥｎｚ．１１であり、すべてＥｎｚ．８より優れていることが分かった。
【0080】
【0081】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】