特表 2024-528724 抗ＰＤ－１抗体医薬組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-30

(54)【発明の名称】抗ＰＤ－１抗体医薬組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240723BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240723BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240723BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240723BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240723BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 U ZNA

A61K9/08

A61K47/12

A61K47/18

A61K47/02

A61K47/26

A61K47/10

A61P35/00

A61P31/00

A61P29/00

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505015

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 CN2022108825

(87)【国際公開番号】W WO2023006055

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】202110863978.0

(32)【優先日】2021-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】320000850

【氏名又は名称】上海君▲実▼生物医▲薬▼科技股▲分▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＵＮＳＨＩ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｆｌｏｏｒ １３， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２， Ｎｏｓ． ３６ ａｎｄ ５８， Ｈａｉｑｕ Ｒｏａｄ， Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０ ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ホンチョアン

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ペイシアン

(72)【発明者】

【氏名】トゥー， シアオチエ

(72)【発明者】

【氏名】モン， チン

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ホイ

(72)【発明者】

【氏名】フォン， ホイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076BB16

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076DD09E

4C076DD23Q

4C076DD38Q

4C076DD41Z

4C076DD43Z

4C076DD51Q

4C076DD51Z

4C076DD67Q

4C076EE23E

4C076FF11

4C076FF36

4C076FF61

4C085AA14

4C085BB12

4C085BB31

4C085EE01

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

(57)【要約】

当該医薬組成物は、緩衝液及び抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を含み、そのうち上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は約１００～２５０ｍｇ／ｍＬ、且つアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そのうち、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～６．５である。本発明は、上記医薬組成物を含む注射剤、並びにＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する薬物の製造における上記医薬組成物及び注射剤の使用を更に提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

医薬組成物であって、
（１）緩衝液と、
（２）抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片と、を含み、
そのうち、前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は約１００～２５０ｍｇ／ｍＬ、
好ましくは約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５０～２００ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．２、より好ましくは５．９～６．１であり、好ましくは、前記医薬組成物の浸透圧は２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である、
医薬組成物。

【請求項2】

前記緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びヒスチジン緩衝液から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、前記緩衝液はヒスチジン緩衝液であり、前記ヒスチジン緩衝液は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液又はヒスチジン－ヒスチジン酢酸塩緩衝液から選ばれ、好ましくは、前記緩衝液の濃度は約１０～５０ｍＭであり、より好ましくは、前記緩衝液の濃度は約１０～３０ｍＭであり、好ましくは、前記緩衝液のｐＨは約５．０～６．５であり、より好ましくは約５．５～６．２である、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記医薬組成物は、アルギニン、アルギニン塩、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、グリシン及びトレハロースから選ばれる１つ又は複数である安定剤を更に含み、好ましくは、前記アルギニン塩は塩酸アルギニンであり、好ましくは、前記安定剤の濃度は約１００～２５０ｍＭ、好ましくは約１２０～２２０ｍＭ、好ましくは約１３０～１８０ｍＭである、
請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記安定剤は濃度が約１２０～２２０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは前記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは前記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、前記安定剤は濃度が約１３０～１８０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは前記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは前記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、前記アルギニン塩は濃度が約１３０～１８０ｍＭの塩酸アルギニンである、
請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記医薬組成物は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０及びポロキサマー１８８から選ばれる１つ又は複数である界面活性剤を更に含み、好ましくは、ｗ／ｖで計算すると、前記界面活性剤の濃度は約０．０１～０．１％、より好ましくは、前記界面活性剤の濃度は約０．０２～０．０８％である、
請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７に示される軽鎖可変領域及び配列番号８に示される重鎖可変領域を含み、好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む、
請求項１～５の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

それぞれ、以下の（１）～（８）：
（１）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１２０～２２０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩、及び（ｄ）約０．０１～０．１％のポリソルベート８０、或いは
（２）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０１～０．１％のポリソルベート８０、或いは
（３）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０１～０．１％のポリソルベート８０、或いは
（４）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）約１３０～１８０ｍＭのアルギニン又は塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％のポリソルベート８０、或いは
（５）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％のポリソルベート８０、或いは
（６）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％のポリソルベート８０、
（７）（ａ）配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む約１８０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体、（ｂ）約６．０のｐＨを有する約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１４０ｍＭの塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０２％のポリソルベート８０、或いは
（８）（ａ）配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む約１８０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体、（ｂ）約６．０のｐＨを有する約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１５０ｍＭの塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０４％のポリソルベート８０、の何れか１つに示される成分を含む、
請求項１～６の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

請求項１～７の何れか１項に記載の医薬組成物及び塩化ナトリウム溶液又はグルコース溶液を含む注射剤であって、
好ましくは、前記塩化ナトリウム溶液の濃度は約０．８５～０．９％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、前記グルコース溶液の濃度は約５～２５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、前記注射剤において、前記抗ＰＤ－１抗体の濃度は約０．５～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５～２０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記注射剤のｐＨは約５．０～６．５、より好ましくは約５．５～６．２である、注射剤。

【請求項9】

皮下注射により投与される、
請求項１～７の何れか１項に記載の医薬組成物又は請求項８に記載の注射剤。

【請求項10】

ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する薬物の製造における、請求項１～７の何れか１項に記載の医薬組成物又は請求項８に記載の注射剤の使用であって、好ましくは、前記疾患又は病状はがん、感染性疾患又は炎症性疾患から選ばれる、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、治療性医薬組成物の分野に関し、具体的には、抗ＰＤ－１抗体医薬組成物及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫回避は、がんの特徴の一つである。Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ、Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１４：１５３７－４４には、腫瘍特異的Ｔリンパ球が腫瘍微小環境、流入領域リンパ節と末梢血中によく存在するが、腫瘍微小環境にある免疫抑制機構ネットワークのため、それは通常、腫瘍の進行を制御することができないことが開示されている。ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）は通常、ＣＴＬＡ－４とＰＤ－１を含む活性化誘発性の抑制性受容体を発現するが、腫瘍細胞は、ＰＤ－１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１又はＣＤ２７４とも呼ばれる）を含む免疫抑制リガンドを常に発現し、当該リガンドは、Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能を抑制する。抑制機構において、ＰＤ－１及びそのリガンドは、腫瘍細胞がそれにより腫瘍微小環境で活性化されたＴ細胞を抑制する重要な経路となっている。

【0003】

プログラム死受容体１（ＰＤ－１）は、免疫調節及び末梢性免疫寛容の維持において重要な役割を果たしている。ＰＤ－１は主に、活性化されたＴ細胞とＢ細胞に発現され、リンパ球の活性化を抑制するように機能し、これは、免疫過剰反応を防止・治療する免疫系の正常な末梢組織寛容機構である。しかし、腫瘍微小環境で浸潤した活性化Ｔ細胞はＰＤ－１分子を高発現しており、活性化白血球により分泌された炎症性因子は、腫瘍細胞がＰＤ－１のリガンドＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２を高発現することを誘発し、それにより、腫瘍微小環境において活性化Ｔ細胞ＰＤ－１経路が活性化し続け、Ｔ細胞機能が抑制され、腫瘍細胞を殺傷することができなくなる。治療型抗ＰＤ－１抗体は、活性化Ｔ細胞が引き続き腫瘍細胞を殺傷できるように、この経路を遮断し、Ｔ細胞の機能の一部を回復させることができる。

【0004】

ここ十年来、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の遮断は、種々のがん適応症において持続的な抗腫瘍応答を誘導する有効な経路であることが既に証明されている。ＰＤ／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能を増強し、腫瘍負荷を低減し、生存率を向上させることができる。

【0005】

抗体医薬製剤は、長時間安定的で、安全且つ有効な用量が含まれる医薬製剤であり、抗体の特別な構造及び性質のため、抗体系薬物には、製造、保存、輸送の過程で安定した環境が必要である。タンパク質の種類や抗体の種類が異なる場合、その物理化学的性質及び分解反応なども異なるため、抗体系医薬製剤の緩衝液、補助剤などの配合も異なる。

【0006】

腫瘍患者のコンプライアンスと投与の利便性を向上させるために、皮下（ＳＣ）注射が好ましい実施形態であるが、その効果を発揮するために必要な投与量が比較的高いため、高濃度の製剤を製造する必要がある。しかし、高濃度の抗体製剤は多くの困難が伴っている。例えば、このような製剤は粘度が非常に高いため、注射器で薬剤を吸引・注入することが困難であり、容器と注射器内に薬剤が多く残留するため、投与量の偏差が大きくなり、且つ注射部位に痛みが生じるなど、また、製剤の粘度が高いと、濃縮及びろ過プロセスで非常に高い圧力が必要になり、又はろ過膜を通過できなくなるなどの、製造プロセスにおいて重大な問題をもたらす。また、例えば、製剤中の高濃度抗体タンパク質は極めて凝集しやすいため、製剤が不安定になったり、不溶性微粒子を形成しやすくなったり、薬物の免疫原性を増加させたり、薬物の副作用を増加させたりする。

【0007】

従って、この分野では、高抗体濃度且つ長時間安定的で、凝集なし、低粘度などの製造及び臨床応用の要件を満たすために、ヒトプログラム死受容体１を標的とする高濃度抗体製剤の開発が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明に記載の医薬組成物は、ＰＤ－１と特異的に結合する抗体を含む高安定性医薬組成物である。特に、本発明が適切な緩衝系及びｐＨを選択し、安定剤及び界面活性剤を最適化し、そして薬物動態学的及び薬効的研究を行うことによって開発した高濃度抗体製剤は、皮下投与に使用でき、且つ長時間安定的で、凝集なし、超低粘度である。

【0009】

本発明は、（１）緩衝液と、（２）抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0010】

幾つかの形態において、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。

【0011】

幾つかの形態において、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗体又はその抗原結合断片、ヒト化抗体又はその抗原結合断片から選ばれ、好ましくはヒト化抗体又はその抗原結合断片である。

【0012】

幾つかの形態において、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７に示される軽鎖可変領域及び配列番号８に示される重鎖可変領域を含む。

【0013】

幾つかの形態において、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む。

【0014】

幾つかの形態において、上記医薬組成物における抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は約１００～２５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５０～２００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は約１００ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１８５ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、１９５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２１０ｍｇ／ｍＬ、２２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１８０ｍｇ／ｍＬ、１８５ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ又は１９５ｍｇ／ｍＬである。

【0015】

幾つかの形態において、上記医薬組成物のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．２、より好ましくは５．９～６．１、更に好ましくは約６．０である。

【0016】

幾つかの形態において、上記医薬組成物の浸透圧は２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であり、好ましくは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。

【0017】

幾つかの形態において、上記医薬組成物は、約２５℃で測定された粘度が８．０ｃＰ以下である。

【0018】

幾つかの形態において、上記緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びヒスチジン緩衝液から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、上記緩衝液はヒスチジン緩衝液である。

【0019】

幾つかの形態において、上記ヒスチジン緩衝液は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液又はヒスチジン－ヒスチジン酢酸塩緩衝液から選ばれ、好ましくはヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液である。

【0020】

幾つかの形態において、上記ヒスチジン緩衝液はヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液である。幾つかの形態において、上記ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液は、ヒスチジン及びヒスチジン塩酸塩、好ましくはＬ－ヒスチジン及びＬ－ヒスチジン一塩酸塩により製造される。幾つかの形態において、ヒスチジン緩衝液は、１～３０ｍＭのＬ－ヒスチジン及び１～３０ｍＭのＬ－ヒスチジン一塩酸塩により製造される。幾つかの形態において、ヒスチジン緩衝液は、モル比が１：１～１：４のヒスチジン及びヒスチジン塩酸塩により製造される。幾つかの形態において、ヒスチジン緩衝液は、モル比が約１：１のヒスチジン及びヒスチジン塩酸塩により製造される。幾つかの形態において、ヒスチジン緩衝液は、モル比が約１：３のヒスチジン及びヒスチジン塩酸塩により製造される。幾つかの形態において、ヒスチジン製剤は、約４．５ｍＭのＬ－ヒスチジン及び約１５．５ｍＭのＬ－ヒスチジン一塩酸塩により製造されたｐＨが約５．５のヒスチジン緩衝剤である。幾つかの形態において、ヒスチジン製剤は、約７．５ｍＭのＬ－ヒスチジン及び約２２．５ｍＭのＬ－ヒスチジン一塩酸塩により製造されたｐＨが約５．５のヒスチジン緩衝剤である。幾つかの形態において、ヒスチジン製剤は、約１０ｍＭのヒスチジン及び約１０ｍＭのヒスチジン塩酸塩により製造されたｐＨが約６．０のヒスチジン緩衝液である。

【0021】

幾つかの形態において、上記ヒスチジン緩衝液はヒスチジン－ヒスチジン酢酸塩緩衝液であり、好ましくは、両者のモル比は１：１～１．５：１であり、好ましくは、このような緩衝液のｐＨは６．０±０．３、好ましくは約６．０であり、好ましくは、このような緩衝液は、１０～１５ｍＭのヒスチジン及び１０～１５ｍＭのヒスチジン酢酸塩を含む。

【0022】

幾つかの形態において、上記緩衝液は酢酸緩衝液であり、好ましくは、上記酢酸緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液又は酢酸－酢酸カリウム緩衝液であり、好ましくは酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液である。幾つかの形態において、酢酸緩衝液は、１～３０ｍＭの酢酸及び１～３０ｍＭの酢酸ナトリウムにより製造される。幾つかの形態において、酢酸緩衝液は、モル比が約１：２．１の酢酸及び酢酸ナトリウムにより製造される。幾つかの形態において、酢酸緩衝液は、モル比が約１：５．７の酢酸及び酢酸ナトリウムにより製造される。幾つかの形態において、酢酸緩衝液は、約６．５ｍＭの酢酸及び約１３．５ｍＭの酢酸ナトリウムにより製造されたｐＨが約５．０の酢酸緩衝液である。幾つかの形態において、酢酸緩衝液は、約３ｍＭの酢酸及び約１７ｍＭの酢酸ナトリウムにより製造されたｐＨが約５．５の酢酸緩衝液である。

【0023】

幾つかの形態において、上記緩衝液はクエン酸緩衝液であり、好ましくは、上記クエン酸緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。幾つかの形態において、クエン酸緩衝液は、１～３０ｍＭのクエン酸及び１～３０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより製造される。幾つかの形態において、クエン酸緩衝液は、モル比が約１：１～１：４のクエン酸及びクエン酸ナトリウムにより製造される。幾つかの形態において、クエン酸緩衝液は、約５．０ｍＭのクエン酸及び約１５．０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより製造されたｐＨが約６．０のクエン酸緩衝液である。幾つかの形態において、クエン酸緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸及び約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより製造されたｐＨが約６．０のクエン酸緩衝液である。

【0024】

幾つかの形態において、上記緩衝液の濃度は約５～１００ｍＭ、好ましくは約１０～５０ｍＭ、より好ましくは約１０～３０ｍＭ、更に好ましくは約１５～２５ｍＭであり、上記緩衝液濃度の非限定的な実施例は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ又はこれらの範囲内の任意の２つの数値を端点として形成される範囲であり、好ましくは約１５ｍＭ、２０ｍＭ又は２５ｍＭである。

【0025】

幾つかの形態において、上記緩衝液のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．５、より好ましくは約５．５～６．２、更に好ましくは約５．９～６．１であり、上記緩衝液のｐＨの非限定的な実施例は、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、好ましくは約５．９、６．０又は６．１である。

【0026】

幾つかの形態において、上記医薬組成物は、アルギニン、アルギニン塩、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、グリシン及びトレハロースから選ばれる１つ又は複数である安定剤を更に含み、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。

【0027】

幾つかの形態において、上記安定剤の濃度は約１０～４００ｍＭ、好ましくは約１００～２５０ｍＭ、より好ましくは約１２０～２２０ｍＭ、更に好ましくは約１３０～１８０ｍＭであり、上記安定剤の濃度の非限定的な実施例は、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ又はこれらの範囲内の任意の２つの数値を端点として形成される範囲であり、好ましくは約１４０ｍＭ、１５０ｍＭ又は１６０ｍＭである。

【0028】

幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約１２０～２２０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、上記安定剤は濃度が約１３０～１８０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。

【0029】

幾つかの形態において、上記安定剤はアルギニン又はアルギニン塩である。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約３０～２５０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、上記アルギニン又はアルギニン塩の濃度は、好ましくは約１００～２５０ｍＭ、より好ましくは約１２０～２２０ｍＭ、更に好ましくは約１３０～１８０ｍＭ、最も好ましくは約１４０～１６０ｍＭであり、上記アルギニン又はアルギニン塩濃度の非限定的な実施例は、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、好ましくは約１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ又は１５５ｍＭであり、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。

【0030】

幾つかの形態において、上記安定剤はスクロースである。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約１００～３００ｍＭのスクロースであり、上記スクロースの濃度は、好ましくは約１５０～３００ｍＭ、より好ましくは約２００～２８０ｍＭであり、上記スクロース濃度の非限定的な実施例は、約２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、好ましくは約２２０ｍＭである。

【0031】

幾つかの形態において、上記安定剤はトレハロースである。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約１００～３００ｍＭのトレハロースであり、上記トレハロースの濃度は、好ましくは約１５０～３００ｍＭ、より好ましくは約２００～２８０ｍＭであり、上記トレハロース濃度の非限定的な実施例は、約１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、好ましくは約２２０ｍＭである。

【0032】

幾つかの形態において、上記安定剤は塩化ナトリウムである。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約３０～２００ｍＭの塩化ナトリウムであり、上記塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは約５０～１９０ｍＭ、より好ましくは約１００～１８０ｍＭ、更に好ましくは約１２０～１７０ｍＭ、最も好ましくは約１３０～１５０ｍＭであり、上記塩化ナトリウム濃度の非限定的な実施例は、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、好ましくは約１３５ｍＭ又は１４０ｍＭである。

【0033】

幾つかの形態において、上記安定剤はマンニトールである。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約１００～３００ｍＭのマンニトールであり、上記マンニトールの濃度は、好ましくは約１５０～３００ｍＭ、より好ましくは約２００～２８０ｍＭであり、上記マンニトール濃度の非限定的な実施例は、約２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、好ましくは約２４０ｍＭである。

【0034】

幾つかの形態において、上記安定剤はソルビトールである。幾つかの形態において、上記安定剤は濃度が約１００～３００ｍＭのソルビトールであり、上記ソルビトールの濃度は、好ましくは約１５０～３００ｍＭ、より好ましくは約２００～２８０ｍＭであり、上記ソルビトール濃度の非限定的な実施例は、約２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、好ましくは約２４０ｍＭである。

【0035】

幾つかの形態において、上記安定剤は、塩化ナトリウムとマンニトールとの組み合わせである。幾つかの形態において、上記安定剤は、約３０～２００ｍＭの塩化ナトリウムと約３０～２００ｍＭのマンニトールとの組み合わせ、好ましくは約３０～１００ｍＭの塩化ナトリウムと約１００～１８０ｍＭのマンニトールとの組み合わせ、より好ましくは約３０～７０ｍＭの塩化ナトリウムと約１２０～１８０ｍＭのマンニトールとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１４０ｍＭのマンニトールとの組み合わせ、又は約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１５０ｍＭのマンニトールとの組み合わせである。

【0036】

幾つかの形態において、上記安定剤は、塩酸アルギニンとスクロースとの組み合わせである。幾つかの形態において、上記安定剤は、約３０～２００ｍＭの塩酸アルギニンと約３０～２００ｍＭのスクロースとの組み合わせ、好ましくは約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせ、より好ましくは約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩酸アルギニンと約１３０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩酸アルギニンと約１４０ｍＭのスクロースとの組み合わせ、又は約５０ｍＭの塩酸アルギニンと約１５０ｍＭのスクロースとの組み合わせである。

【0037】

幾つかの形態において、上記安定剤は、塩酸アルギニンとグリシンとの組み合わせである。幾つかの形態において、上記安定剤は、約３０～２００ｍＭの塩酸アルギニンと約３０～２００ｍＭのグリシンとの組み合わせ、好ましくは約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせ、より好ましくは約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩酸アルギニンと約１００ｍＭのグリシンとの組み合わせ、又は約５０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０ｍＭのグリシンとの組み合わせである。

【0038】

幾つかの形態において、上記安定剤は、塩化ナトリウムとスクロースとの組み合わせである。幾つかの形態において、上記安定剤は、約３０～２００ｍＭの塩化ナトリウムと約３０～２００ｍＭのスクロースとの組み合わせ、好ましくは約３０～１００ｍＭの塩化ナトリウムと約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせ、より好ましくは約３０～７０ｍＭの塩化ナトリウムと約１００～１５０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１２０ｍＭのスクロースとの組み合わせ、又は約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１３０ｍＭのスクロースとの組み合わせである。

【0039】

幾つかの形態において、上記安定剤は、塩化ナトリウムとトレハロースとの組み合わせである。幾つかの形態において、上記安定剤は、約３０～２００ｍＭの塩化ナトリウムと約３０～２００ｍＭのトレハロースとの組み合わせ、好ましくは約４０～１５０ｍＭの塩化ナトリウムと約４０～１８０ｍＭのトレハロースとの組み合わせ、より好ましくは約４０～１００ｍＭの塩化ナトリウムと約８０～１６０ｍＭのトレハロースとの組み合わせであり、上記安定剤の非限定的な実施例は、約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１２０ｍＭのトレハロースとの組み合わせ、又は約５０ｍＭの塩化ナトリウムと約１４０ｍＭのトレハロースとの組み合わせである。

【0040】

幾つかの形態において、上記医薬組成物は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０及びポロキサマー１８８から選ばれる１つ又は複数である界面活性剤を更に含む。

【0041】

幾つかの形態において、上記界面活性剤はポリソルベート８０から選ばれる。

【0042】

幾つかの形態において、上記界面活性剤はポリソルベート２０から選ばれる。

【0043】

幾つかの形態において、ｗ／ｖで計算すると、上記界面活性剤の濃度は約０．００１～０．１％、好ましくは約０．０１～０．１％、より好ましくは約０．０２～０．０８％、更に好ましくは約０．０２～０．０６％であり、非限定的な実施例として、上記界面活性剤の濃度は約０．０２％、０．０４％又は０．０８％、好ましくは約０．０４％である。

【0044】

幾つかの形態において、医薬組成物は、以下の（１）～（８）の何れか１つに示される成分を含むか、又はそれぞれ（１）～（８）の何れか１つに示される成分で構成される。

【0045】

（１）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１２０～２２０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩、及び（ｄ）約０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（２）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（３）（ａ）約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．５のｐＨを有する約１０～３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（４）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）約１３０～１８０ｍＭのアルギニン又は塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（５）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（６）（ａ）約１５０～２００ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）約５．５～６．０のｐＨを有する約１０～３０ｍＭの酢酸緩衝液、（ｃ）濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせである安定剤、及び（ｄ）約０．０２～０．０８％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、
（７）（ａ）配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む約１８０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体、（ｂ）約６．０のｐＨを有する約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１４０ｍＭの塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、或いは
（８）（ａ）配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む約１８０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体、（ｂ）約６．０のｐＨを有する約２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）約１５０ｍＭの塩酸アルギニン、及び（ｄ）約０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０。幾つかの形態において、本発明は、緩衝液、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、安定剤及び界面活性剤を含む医薬組成物を提供し、そのうち、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含み、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は１５０～２００ｍｇ／ｍＬであり、上記医薬組成物のｐＨは５．９～６．１であり、浸透圧は２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。好ましくは、上記医薬組成物において、緩衝液はヒスチジン緩衝液であり、その濃度は１５～２５ｍＭであり、ｐＨは約５．９～６．１、好ましくは約６．０である。好ましくは、上記医薬組成物において、安定剤は約１４０～１６０ｍＭ、好ましくは約１５０ｍＭの塩酸アルギニンである。好ましくは、上記医薬組成物において、界面活性剤はポリソルベート８０であり、その濃度は、好ましくは０．０２～０．０６％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．０４％（ｗ／ｖ）である。好ましくは、上記医薬組成物は、約２５℃で測定された粘度が８．０ｃＰ以下、より好ましくは７．０ｃＰ以下である。

【0046】

幾つかの形態において、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の医薬組成物は液体製剤又は凍結乾燥製剤である。

【0047】

幾つかの形態において、上記医薬組成物は液体製剤である。

【0048】

幾つかの形態において、上記液体製剤又は凍結乾燥製剤は、２～８℃で、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間又は少なくとも２４ヶ月間安定している。

【0049】

幾つかの形態において、上記液体製剤又は凍結乾燥製剤は、４０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間又は少なくとも２８日間安定している。

【0050】

本発明は、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物及び塩化ナトリウム溶液又はグルコース溶液を含む注射剤を更に提供し、好ましくは、上記塩化ナトリウム溶液の濃度は約０．８５～０．９％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、上記グルコース溶液の濃度は約５～２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約５～１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは、上記注射剤において、上記抗ＰＤ－１抗体の濃度は約０．５～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５～２０ｍｇ／ｍＬであり、上記注射剤のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．２である。

【0051】

幾つかの形態において、上記医薬組成物又は注射剤は、皮下注射により投与される。

【0052】

本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する薬物の製造における、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤の使用を更に提供する。

【0053】

本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療するための、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤を更に提供する。

【0054】

本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する方法であって、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤を、それを必要とする受検者に投与することを含む、方法を更に提供する。

【0055】

幾つかの形態において、上記疾患又は病状は、がん又は感染性疾患又は炎症性疾患から選ばれる。

【0056】

本発明は、高濃度抗体医薬製剤の粘度を低減する方法を更に提供し、そのうち、上記抗体医薬製剤における抗体濃度は１５０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であり、上記方法は、塩酸アルギニン、塩化ナトリウム、又はスクロース及び塩酸アルギニンを安定剤として使用し、並びにヒスチジン緩衝液を緩衝液として使用することによって当該高濃度抗体医薬製剤を製造することを含む。好ましくは、塩酸アルギニンは、製造された抗体医薬製剤中の濃度が約１００～２００ｍＭ、好ましくは約１４０～１６０ｍＭとなる用量で使用される。好ましくは、塩化ナトリウムは、製造された抗体医薬製剤中の濃度が約１００～２００ｍＭ、好ましくは約１４０～１６０ｍＭとなる用量で使用される。好ましくは、スクロースと塩酸アルギニンとの混合物を安定剤として使用する場合、スクロースは、製造された抗体医薬製剤中の濃度が約１００～１８０ｍＭ、好ましくは約１１０～１５０ｍＭとなる用量で使用され、塩酸アルギニンは、製造された抗体医薬製剤中の濃度が約３０～８０ｍＭ、好ましくは約３０～６０ｍＭとなる用量で使用される。好ましくは、使用されるヒスチジン緩衝液のｐＨ値は５．０～６．５、好ましくは５．５～６．２、より好ましくは５．９～６．１である。好ましくは、使用されるヒスチジン緩衝液は、製造された抗体医薬製剤中の濃度が１５～２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭとなる量で使用される。好ましくは、上記抗体は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の抗ＰＤ－１抗体である。好ましくは、上記の高濃度抗体医薬製剤の粘度を低減する方法は、製造された抗体医薬製剤の粘度を約８．０ｃＰ以下（約２５℃で測定）に低減することができる。幾つかの形態において、上記方法は、上記抗体医薬製剤に本明細書の何れか１つの実施形態に記載の界面活性剤、好ましくは０．０２～０．０６％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を添加することを更に含む。

【0057】

幾つかの形態において、本発明は、安定剤としての塩酸アルギニン、塩化ナトリウム、又はスクロース並びに塩酸アルギニン及びヒスチジン緩衝液の、高濃度抗体医薬製剤の粘度の低減における応用、或いは、低減した粘度を有する高濃度抗体医薬製剤の製造における応用を更に提供する。好ましくは、上記安定剤及びヒスチジン緩衝液、抗体及び抗体濃度は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載される通りである。好ましくは、上記応用は、高濃度抗体医薬製剤の粘度を約８．０ｃＰ以下（約２５℃で測定）に低減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】処方スクリーニング１回目－高温試験でのＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図2】処方スクリーニング１回目－高温試験でのＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図3】処方スクリーニング２回目－高温試験でのＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図4】処方スクリーニング２回目－高温試験でのＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図5】処方スクリーニング３回目－高温試験でのＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図6】処方スクリーニング３回目－高温試験でのＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャートである。

【図7】Ａ、Ｂの２群の平均血中薬物濃度－時間変化曲線である。

【図8】皮下注射製剤によるｈＰＤ－１ヒト化マウス移植ＭＣ３８腫瘍成長への阻害作用曲線である。

【発明を実施するための形態】

【0059】

定義及び説明
本発明をより容易に理解できるように、技術と科学用語を以下のように定義する。本明細書で明確に別途定義しない限り、本明細書で使用されるその他の全ての技術と科学用語は、本発明の当業者が通常理解する意味を有する。本発明は具体的な方法、試薬、化合物、組成物又は生体系に限らず、当然、上記に対して変化を行うことができる。本願で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を加えるためのものではない。本明細書に引用される特許、特許出願、論文、教科書などの全ての参考文献、並びにそれらに引用される参考文献が、まだ引用されていない範囲において、それらを全体として引用により組み込まれる。組み込まれた文献及び類似する材料のうちの１つ又は複数が、本願と異なるか又は矛盾する場合、定義された用語、用語の使用方法、記載された技術などを含むが、これらに限定されず、本願を優先とする。

【0060】

その内容は別途で明確な説明がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「１つ」、「１種」及び「当該」の単数表現は複数の意味を含む。従って、例えば、「１種のポリペプチド」は、２種又はそれ以上のポリペプチドなどの組み合わせを含む。

【0061】

「医薬組成物」又は「製剤」という用語は、本明細書に記載される抗体の１つ又は複数、及び生理学的に薬用可能なベクター及び賦形剤などの他の成分を含有する混合物を意味する。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収を高め、更に生理活性を発揮することを目的とする。

【0062】

「液体製剤」という用語は、液体状態の製剤を指し、再懸濁される凍結乾燥製剤を指すためのものではない。本発明に係る液体製剤は安定的に保存できるとともに、その安定性が凍結乾燥（又はその他の状態変換方法、例えば、噴霧乾燥）によるものではない。

【0063】

「水性液体製剤」という用語は、水を溶媒とする液体製剤を指す。幾つかの実施形態において、水性液体製剤とは、凍結乾燥、噴霧乾燥及び／又は冷凍を必要とせず、安定性（例えば、化学的及び／又は物理的安定性及び／又は生理活性）が維持できる製剤である。

【0064】

「賦形剤」という用語は、必要な特性（例えば、稠度、高安定性）の提供、及び／又は浸透圧の調整のために製剤に添加できる試薬を指す。一般的に使われる賦形剤の実例は、糖類、ポリオール、アミノ酸、界面活性剤及びポリマーを含むが、これらに限定されない。

【0065】

本願で使用される「約」は、測定可能な数値（例えば、数量、持続時間など）を表す場合、開示された方法に適用できる変化であって、具体的な数値に対する±２０％又は±１０％の変化、例えば、±５％、±１％及び±０．１％の変化を含むことを意味する。

【0066】

「緩衝液のｐＨ値が約５．０～６．５である」という用語は、その酸／塩基共役成分の作用により当該試薬を含む溶液がｐＨ値の変化に耐性のある試薬を指す。本発明に係る製剤で使用される緩衝液は、ｐＨ値が約５．０～約６．５の範囲内、又は約５．５～約６．５の範囲内、又は約５．０～約６．０の範囲内であってもよい。

【0067】

本明細書において、ｐＨをこの範囲内に制御する「緩衝液」の実例としては、酢酸、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸、ヒスチジン、ヒスチジン塩（例えば、ヒスチジン塩酸塩）、メチオニン、クエン酸（枸櫞酸）、クエン酸塩（枸櫞酸塩）、リン酸塩、クエン酸塩／リン酸塩、イミダゾール、これらの組み合わせ及び他の有機酸緩衝剤を含む。

【0068】

「ヒスチジン緩衝液」はヒスチジンイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン緩衝液の実例は、ヒスチジン及びヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン酢酸塩、ヒスチジンリン酸塩、ヒスチジン硫酸塩などのヒスチジンの塩を含み、例えば、ヒスチジンとヒスチジン塩酸塩を含むヒスチジン緩衝液であり、また、本発明のヒスチジン緩衝液はヒスチジンと酢酸塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）を含むヒスチジン緩衝液を含む。

【0069】

「クエン酸緩衝液」は「枸櫞酸緩衝液」とも呼ばれ、クエン酸イオンを含む緩衝液である。クエン酸塩緩衝液の実例は、クエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸カリウム、クエン酸－クエン酸カルシウム、クエン酸－クエン酸マグネシウムなどを含む。好ましいクエン酸塩緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。

【0070】

「酢酸塩緩衝液」は酢酸イオンを含む緩衝液である。酢酸塩緩衝液の実例は、酢酸－酢酸ナトリウム、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。好ましい酢酸塩緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液である。

【0071】

「コハク酸緩衝液」はコハク酸イオンを含む緩衝液である。コハク酸塩緩衝液の実例は、コハク酸－コハク酸ナトリウム、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウム、コハク酸－コハク酸マグネシウムなどを含む。好ましいコハク酸塩緩衝液はコハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液である。

【0072】

「安定剤」という用語は薬学的に許容される賦形剤を意味し、製造、保存及び適用の過程において活性薬物成分及び／又は製剤が化学的及び／又は物理的に分解されないように保護する。安定剤は、下記に定義される糖、アミノ酸、塩、ポリオール及びこれらの代謝産物、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、アルギニン又はその塩（塩酸アルギニンなど）、グリシン、アラニン（α－アラニン、β－アラニン）、ベタイン、ロイシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、サルコシン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）、アラノピン、オクトピン、ストロンビン（ｓｔｒｏｍｂｉｎｅ）及びトリメチルアミンのＮ－酸化物（ＴＭＡＯ）、ヒト血清アルブミン（ｈｓａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、α－カゼイン、グロブリン、α－ラクトアルブミン、ＬＤＨ、リゾチーム、ミオグロビン、オボアルブミン及びＲＮＡａｓｅ Ａを含むが、これらに限定されない。塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、スクロースなどの一部の安定剤は、浸透圧の制御効果を果たすことができる。本発明で具体的に使用される安定剤はポリオール、アミノ酸、塩、糖のうちの１種又は１種以上から選ばれる。好ましい塩は塩化ナトリウムであり、好ましい糖はスクロース及びトレハロースであり、好ましいポリオールはソルビトール及びマンニトールである。好ましいアミノ酸はアルギニン、グリシン、プロリンであり、アミノ酸は、そのＤ－型及び／又はＬ－型で存在し得るが、典型的にはＬ－型であり、アミノ酸は、任意の適切な塩、例えば、塩酸塩、例えば、塩酸アルギニンとして存在し得る。好ましい安定剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、塩酸アルギニン、グリシン、プロリン、塩化ナトリウム－ソルビトール、塩化ナトリウム－マンニトール、塩化ナトリウム－スクロース、塩化ナトリウム－トレハロース、塩酸アルギニン－マンニトール、塩酸アルギニン－スクロースである。

【0073】

「界面活性剤」という用語は、一般的に、抗体凝集の低減又は製剤における粒状物の形成の最小化を図るために、空気／溶液界面により誘導される応力、溶液／表面により誘導される応力の影響から抗体などのタンパク質を保護する試薬を含む。例示された界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ポリエチレン－ポリプロピレン共重合体、ポリエチレン－ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン－ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体（ポロキサマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの、非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書において、特に明記しない限り、「ポリソルベート２０の濃度」及び「ポリソルベート８０の濃度」という用語は両方とも、「質量体積濃度（ｗ／ｖ）」を意味し、例えば、「約０．０４％のポリソルベート８０」における「０．０４％」は、「１００ｍＬの液体に０．０４ｇのポリソルベート８０が含まれる」ことを意味する。

【0074】

本明細書で使用される用語「粘度」は「動粘度」又は「絶対粘度」であってもよい。「動粘度」とは、流体が重力の影響で発生した流動抵抗を測定するための指標である。「絶対粘度」とは、粘性係数や粘性率とも呼ばれ、動粘度と流体密度の積（絶対粘度＝動粘度×密度）である。動粘度のディメンションはＬ²／Ｔであり、そのうち、Ｌは長さで、Ｔは時間である。通常、動粘度はセンチストークス（ｃＳｔ）で表す。動粘度の国際単位系単位はｍｍ²／ｓであり、即ちｌｃＳｔである。絶対粘度はセンチポアズ（ｃＰ）で表す。絶対粘度の国際単位系単位はミリパスカル・秒（ｍＰａ・ｓ）であり、そのうち１ｃＰ＝ｌｍＰａ・ｓである。

【0075】

本発明に係る液体型製剤について、本明細書で使用される用語「低レベル粘度」とは約１５センチポアズ（ｃＰ）より低い絶対粘度である。例えば、標準粘度測定技術で測定する場合、当該製剤の絶対粘度が約１５ｃＰ、約１４ｃＰ、約１３ｃＰ、約１２ｃＰ、約１１ｃＰ、約１０ｃＰ、約９ｃＰ、約８ｃＰ、又は更に低い粘度であれば、本発明に係る液体型製剤は「低粘度」と見なされる。本発明に係る液体型製剤について、本明細書で使用される用語「中レベル粘度」とは約３５ｃＰ～約１５ｃＰの絶対粘度である。例えば、標準粘度測定技術で測定する場合、当該製剤の絶対粘度が約３４ｃＰ、約３３ｃＰ、約３２ｃＰ、約３１ｃＰ、約３０ｃＰ、約２９ｃＰ、約２８ｃＰ、約２７ｃＰ、約２６ｃＰ、約２５ｃＰ、約２４ｃＰ、約２３ｃＰ、約２２ｃＰ、約２１ｃＰ、約２０ｃＰ、約１９ｃＰ、約１８ｃＰ、約１７ｃＰ、約１６ｃＰ、又は約１５ｃＰであれば、本発明に係る液体型製剤は「中粘度」と見なされる。本発明の医薬組成物は、幾つかの実施形態において、約７ｃＰ又はそれ以下の超低レベル粘度を示すことができる。幾つかの実施形態において、異なる補助剤の粘度の比較から、アルギニン又はその塩は、他の補助剤よりも明らかに優れた粘度、安定性及び薬効を達成できることを見出した。幾つかの実施形態において、緩衝系の比較から、ヒスチジン緩衝系は、他の緩衝系よりも明らかに優れた粘度、安定性及び薬効を達成できることを見出した。

【0076】

「等張」という用語は、当該製剤がヒト血液と基本的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、一般的に約２５０～３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。蒸気圧式又は氷点降下方式の浸透圧計で等張性を測定することができる。

【0077】

「安定的な」製剤という用語は、製造期間及び／又は保存期間において、その中の抗体の物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生理活性が基本的に保持される製剤である。たとえ、一定の期間で保存した後、含まれる抗体の化学構造又は生理機能が１００％保持できなくても、医薬製剤も安定し得る。一定の期間で保存した後、抗体構造又は機能が約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％保持できると、「安定的」と見なされる場合がある。タンパク質安定性を測定するための各解析技術が本技術分野において利用可能であり、「ペプチド及びタンパク質の薬物送達」（Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）２４７～３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編集，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）、及びＪｏｎｅｓ，Ａ．（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９～９０に記載されている（両者を参考として引用）。

【0078】

製剤は、一定の温度及び一定の期間で保存した後、その中に残された天然抗体のパーセンテージを測定すること（及びその他の方法）により、その安定性を測定することができる。その他の方法以外に、天然抗体のパーセンテージはサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥＣ－ＨＰＬＣ］）により測定できるが、「天然の」とは凝集されていない、及び分解されていないものを指す。幾つかの形態において、タンパク質の安定性は、分解した（例えば、断片化）及び／又は凝集したタンパク質を低いパーセンテージで有する溶液における、タンパク質単体のパーセンテージにより決められる。幾つかの形態において、製剤は、室温、約２５～３０℃又は４０℃で、少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、又は更に長期間で、多くとも約６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．１％を超えない範囲で凝集された抗体を、安定的に保存できる。

【0079】

イオン交換期間における、この抗体の主要留分（「主要荷電形態」）のやや酸性である留分で遷移する抗体（「酸性形態」）のパーセンテージを測定すること（及びその他の方法）により、安定性を測定することができ、そのうち、安定性は酸性形態の抗体のパーセンテージに反比例する。その他の方法以外に、「酸性化」抗体のパーセンテージは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー［ＣＥＸ－ＨＰＬＣ］）により測定できる。幾つかの実施形態において、許容可能な安定性とは、製剤を一定の温度及び一定の期間で保存した後、検出可能な酸性形態の抗体が多くとも約４９％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％を超えないことを意味する。安定性を測定する前に保存された一定の期間は、少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、又は更に長期間であってもよい。安定性を評価する際に、医薬製剤を保存できる一定の温度は、約－８０℃～約４５℃範囲内の任意の温度であってもよく、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約２～８℃、約５℃、約２５℃、又は約４０℃で保存される。

【0080】

抗体に対して色及び／又は清澄度の肉眼観察、又はＵＶ光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーによる測定を行う場合、例えば、凝集、沈殿及び／又は変性の兆候が基本的に現れなければ、上記抗体は当該医薬組成物において「その物理的安定性を保持する」。凝集とは、単一の分子又は複合体が共有結合又は非共有結合により結合して凝集体を形成する過程である。凝集は沈殿物が見られるまで行われてもよい。

【0081】

製剤の安定性、例えば、物理的安定性は、サンプルの表面消衰係数（吸光度又は光学濃度）の測定など、本技術分野における周知の方法により評価することができる。この消衰の測定は製剤の濁度と関わる。製剤の濁度の一部は溶液に溶解されるタンパク質の固有性質によるものであり、通常、比濁法により測定され、比濁法の濁度単位（ＮＴＵ）で測定する。

【0082】

例えば、溶液における１種又は複数種の成分の濃度（例えば、タンパク質及び／又は塩の濃度）に応じて変化する濁度レベルは、製剤の「混濁」又は「混濁外観」とも呼ばれる。濁度レベルは濁度が既知の懸濁液を用いて作成された検量線を参照して計算することができる。医薬組成物の濁度レベルを測定するための参照標準品は「欧州薬局方」基準に従ってもよい（「欧州薬局方」（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、第四版、「欧州薬品品質委員会指令」（Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ）（ＥＤＱＭ）、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）。「欧州薬局方」基準によれば、清澄溶液は「欧州薬局方」基準に基づく約３の参照懸濁液より低い又は同じ濁度を有する溶液と定義される。比濁法による濁度測定は、結合が発生しない又は非理想効果の場合におけるレイリー散乱を測定することができ、レイリー散乱は通常、濃度に従って線形に変化する。物理的安定性を評価するためのその他の方法は本技術分野において周知である。

【0083】

所定の時点における抗体の化学的安定性により、抗体が下記に定義されるその生理活性を依然として保持すると考えられると、上記抗体は医薬組成物において「その化学的安定性を保持する」。例えば、抗体の化学的変化を検出又は定量化することで、化学的安定性を評価することができる。サイズ変化（例えば、短く切断）を含む化学的変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス補助レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）により評価することができる。電荷変化（例えば、脱アミド又は酸化の結果として発生）を含むその他の化学的変化は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる。

【0084】

医薬組成物における抗体がその予期目的に対して生理活性を有すると、上記抗体は医薬組成物において「その生理活性を保持する」。例えば、製剤を、例えば、５℃、２５℃、４５℃などの温度で一定の期間（例えば、１～１２ヶ月）保存した後、当該製剤に含まれる抗ＰＤ－１抗体のＰＤ－１への結合の親和力が上記保存前の抗体の結合親和力の少なくとも９０％、９５％又はそれ以上であれば、本発明に係る製剤は安定的であると見なされてもよい。結合親和力は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はプラズマ共鳴技術により測定することができる。

【0085】

本発明の実施形態において、薬理学の観点から、抗体の「治療有効量」又は「有効量」とは、抗体が効果的に治療できる障害の症状の予防、治療又は軽減において有効な量である。本発明において、薬物の「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、単独で使用するか又はその他の治療剤とを組み合わせて使用する場合、受検者を疾患発作から保護するか又は疾患退行を促進する薬物の任意の量であり、上記疾患退行は、疾患症状の重症度低下、疾患無症候期の頻度及び持続期間の増加、又は疾患苦痛による損傷又は機能障害の予防によって証明される。薬物の疾患退行促進効果は当業者に既知の複数の方法により評価することができ、例えば、臨床試験期間におけるヒト受検者において、ヒトに対する効果を予測するための動物モデル系において、又はインビトロ測定法により上記薬剤の活性を測定する。薬物治療有効量は「予防有効量」を含み、即ち、単独で又はその他の治療薬物との組合せで疾患罹患リスクに曝される受検者又は疾患再発の受検者に投与する場合、疾患の進行又は再発を阻害する薬物の任意の量である。

【0086】

「受検者」又は「患者」という用語は、哺乳類動物の生体を含むことを意味する。受検者／患者の実例は、ヒト及び非ヒト哺乳類動物、例えば、非ヒト霊長類動物、イヌ、乳牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及び非ヒト遺伝子組換え動物を含む。本発明の特定の実施形態において、受検者はヒトである。

【0087】

「施用」、「投与」及び「処理」という用語は、当業者に既知の様々な方法又は送達システムの何れか１種により、治療剤を含む組成物を受検者に導入することを指す。抗ＰＤ－１抗体の投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は他の非経口投与経路、例えば注射や輸注を含む。「非経口投与」とは、経腸又は局所投与以外の、一般的に注射による投与方法であり、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊椎内、硬膜内及び胸骨内の注射と輸注、及びインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。

【0088】

抗ＰＤ－１抗体
本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全な抗体分子及びその抗原結合断片を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（或いはその略称「抗体部分」又は「抗体断片」）という用語は、ヒトＰＤ－１又はそのエピトープと特異的に結合する能力が保持されている、抗体における１つ又は複数の断片を指す。従って、最も広義に使用される場合、それは、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、及びラクダ化単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。

【0089】

「単離抗体」という用語は、結合化合物の精製状態を指し、且つこのような場合、当該分子が基本的にその他の生物分子、例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖、細胞破片と成長培地などのその他の物質を含まないことを意味する。「単離（した）」という用語は、本明細書の上記結合化合物の実験又は治療への使用を明らかに干渉する量で存在しない限り、このような物質が完全に存在しない、或いは水、緩衝液又は塩が存在しないことを意味するものではない。

【0090】

「モノクローナル抗体」という用語は、基本的に均質な抗体群から得る抗体であり、即ち、天然に存在し得る少量の変異以外、この群を構成する各抗体は同じである。モノクローナル抗体は高い特異性を持ち、単一の抗原エピトープに対するものである。それと比べて、一般的な（ポリクローナル）抗体製造物は、通常、異なるエピトープに対する大量の（又は異なるエピトープに対して特異性を有する）抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、基本的に均質な抗体群から得る抗体の特徴を示し、且つ任意の特定の方法により抗体を産生する必要があると解釈されない。

【0091】

「マウス抗体」又は「ハイブリドーマ抗体」という用語は、本開示において、この分野の知識とスキルに基づいて製造された抗ヒトＰＤ－１のモノクローナル抗体である。製造する場合、ＰＤ－１抗原を試験対象に注射してから、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。

【0092】

「キメラ抗体」という用語は、第１の抗体の可変ドメインと第２の抗体の定常ドメインとを有する抗体であり、そのうち、第１の抗体と第２の抗体は異なる種に由来する。通常、可変ドメインは齧歯動物などの抗体（「親抗体」）から得られ、定常ドメイン配列はヒト抗体から得られ、それにより、親齧歯動物抗体に比べて、得られたキメラ抗体は、ヒト受検者において不良免疫応答を誘導する可能性が比較的低い。

【0093】

「ヒト化抗体」という用語は、ヒトと非ヒト（例えばマウス、ラット）抗体に由来する配列を含む抗体の形態である。一般には、ヒト化抗体は、基本的に全ての少なくとも１個、通常２個の可変ドメインを含み、そのうち、全て又は基本的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、全て又は基本的に全てのフレームワーク（ＦＲ）領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、任意に少なくとも一部のヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含んでもよい。

【0094】

「全長抗体」又は「完全な抗体分子」という用語は、４本のペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を指し、２本の重（Ｈ）鎖（全長の場合は約５０～７０ｋＤａ）と２本の軽（Ｌ）鎖（全長の場合は約２５ｋＤａ）は、ジスルフィド結合により互いに連結される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）と重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略される）からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域は、高可変性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、その間に保存され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と、更に細かく区分され得る。各ＶＨ領域又はＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ基末端からカルボキシル基末端まで配列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが宿主組織又は因子（免疫系の各細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む）に対する結合を仲介することができる。

【0095】

「ＣＤＲ」という用語は、抗体の可変配列内の相補性決定領域を指す。各重鎖と軽鎖の可変領域に３つのＣＤＲが存在し、各重鎖と軽鎖の可変領域に対して、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と名づけられる。これらのＣＤＲの精確な境界は、異なる系によって異なる定義を有する。

【0096】

本発明に記載の抗体の可変領域ＣＤＲにおける精確なアミノ酸配列の境界は、多くの周知の方法の任意の形態により決定することができ、抗体の立体構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３，Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７～９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９～２１２）、及び大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。本発明に係る抗体のＣＤＲは、当業者がこの分野の任意形態（例えば、異なる割り当てシステム又は組み合わせ）により境界を決定することができる。

【0097】

本明細書で使用される「抗原結合断片」は、抗体の断片又はその誘導体を含み、通常、親抗体の抗原結合領域又は可変領域（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ）の少なくとも１つの断片を含み、親抗体の少なくとも一部の結合特異性を保持している。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、二重抗体、線形抗体、ｓｃ－Ｆｖなどの一本鎖抗体分子、抗体断片から形成されるナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）及び多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。抗体の結合活性がモル濃度に基づいて示される場合、結合断片又はその誘導体は、通常、親抗体の抗原結合活性の少なくとも１０％を保持する。結合断片又はその誘導体が親抗体の抗原結合親和力の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上を保持することが好ましい。抗体の抗原結合断片は、その生理活性を明らかに変えない保存又は非保存アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」又は「機能保存的変異体」をいう）を含むことが期待される。

【0098】

本発明に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、出願番号ＣＮ２０１３１０２５８２８９．２に説明された何れか１つの抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を含み、その開示された全ての内容は引用により本明細書に組み込まれる。幾つかの形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗体のＣＤＲ配列は、ＣＮ２０１３１０２５８２８９．２に説明されたヒト化抗体クローン３８に由来するものを含む。

【0099】

幾つかの形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。

【0100】

幾つかの形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗体又はその抗原結合断片、ヒト化抗体又はその抗原結合断片から選ばれ、好ましくはヒト化抗体又はその抗原結合断片である。

【0101】

幾つかの形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７に示される軽鎖可変領域及び配列番号８に示される重鎖可変領域を含む。

【0102】

幾つかの形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む。

【0103】

幾つかの形態において、本明細書の実施例で使用される非限定的、例示的な抗体は、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｖｏｌ．３２，ｎｏ．２，ｐｐ．３７２～３７３（２０１８））に記載される構造を有し、且つ配列番号９及び１０に示される重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂを含む。

【0104】

本明細書で言及される配列番号１～１０のアミノ酸配列は、下記の表に示される通りである。

【0105】

【表1】

【0106】

【表2】

【0107】

幾つかの実施形態において、本発明の方法及び組成物で使用される抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり、且つヒト定常領域を含んでもよい。幾つかの実施形態において、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４定常領域からなる群より選ばれ、好ましくは、本発明に記載される方法及び組成物に適用される抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ４定常領域を含む。幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片のＩｇＧ４重鎖定常領域の配列は、Ｓ２２８Ｐ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の対応する位置で通常に存在するプロリン残基により、ヒンジ領域におけるセリン残基を置換する。

【0108】

幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を製造するための方法であって、上記抗体又はその抗原結合断片の発現に適する条件で、本明細書に記載の宿主細胞に上記抗体又はその抗原結合断片を発現すると共に、発現する抗体又はその抗原結合断片を上記宿主細胞から回収することを含む、方法を提供する。

【0109】

本発明は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）により得られる大量の不死化細胞系を含む、本発明の組換え抗体を発現するための哺乳類動物宿主細胞を提供する。これらは、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞、Ａ５４９細胞、２９３Ｔ細胞及び大量のその他の細胞系を含む。哺乳類動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、及びハムスターの細胞を含む。どの細胞系が高発現レベルを有するかについて測定することで、特に好ましい細胞系を選択する。

【0110】

一実施形態において、本発明は、抗ＰＤ－１抗体の製造方法であって、発現ベクターを哺乳類動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を一定の時間で十分に培養することで、抗体が宿主細胞に発現すること、或いは更に好ましくは抗体が宿主細胞の成長培地に分泌することを許可するように、抗体を産生することを含む、方法を提供する。標準タンパク質精製方法により培地から抗体を回収することができる。

【0111】

異なる細胞系で発現される、又は遺伝子組換え動物で発現される抗体同士が異なるグリコシル化を示す可能性がある。しかしながら、抗体のグリコシル化にも関わらず、本明細書に係る核酸分子によりコードされる、又は本明細書に係るアミノ酸配列を含む、全ての抗体が本発明の構成部分である。同様に、幾つかの実施形態において、非フコシル化抗体の糖構造が天然ヒト血清ＩｇＧの一般的な成分であるため、通常、インビトロ及びインビボにおいてそのフコシル化対応物より更に強力な効果を持つとともに、免疫原性である可能性がないことから、非フコシル化抗体が優位性を持つ。

【0112】

医薬製剤
本発明に記載の医薬組成物は、ＰＤ－１と特異的に結合する抗体を含む、高濃度、高安定性、超低粘度の医薬組成物である。１００ｍｇ／ｍＬを超える高用量のタンパク質薬物の皮下（ＳＣ）投与に対する臨床需要は通常、製造、分析試験、安定性及び送達に関する追加の技術開発課題をもたらす。高濃度のタンパク質製剤の一般的な特性は、タンパク質の可逆的な自己会合に直接起因する高粘度である。高い注射力（注射部位の疼痛の増加）のため、高粘度は追加の臨床開発課題を引き起こすことができ、また薬物の薬物動態性質を変化させることができる。従って、製品開発の取り組みの重要な要因は、低粘度を有する製剤の同定を求めることである。本発明が適切な緩衝系及びｐＨを選択し、安定剤及び界面活性剤を最適化し、そして薬物動態及び薬効の研究を行うことによって開発した高濃度抗体製剤は、皮下投与剤形に使用でき、且つ長時間安定的で、凝集なし、超低粘度である。

【0113】

本発明は、（１）緩衝液と、（２）抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0114】

本発明に記載の医薬組成物における抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、本願の「抗ＰＤ－１抗体」部分の何れか１つの実施形態に記載される通りである。

【0115】

例えば、本発明に記載の医薬組成物における抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。好ましくは、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗体又はその抗原結合断片、ヒト化抗体又はその抗原結合断片から選ばれ、好ましくはヒト化抗体又はその抗原結合断片である。好ましくは、上記抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７に示される軽鎖可変領域及び配列番号８に示される重鎖可変領域を含む。より好ましくは、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９に示される軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１０に示される重鎖アミノ酸配列を含む。

【0116】

本発明に記載の医薬組成物における抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片の濃度は約１００～２５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５０～２００ｍｇ／ｍＬである。

【0117】

本発明に記載の医薬組成物のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．２、より好ましくは約６．０である。

【0118】

本発明に記載の医薬組成物における緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びヒスチジン緩衝液から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、上記緩衝液はヒスチジン緩衝液である。好ましくは、ヒスチジン緩衝液は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液又はヒスチジン－ヒスチジン酢酸塩緩衝液から選ばれ、好ましくはヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液である。好ましくは、緩衝液の濃度は約５～１００ｍＭ、好ましくは約１０～５０ｍＭ、より好ましくは約１０～３０ｍＭ、更に好ましくは約１５～２５ｍＭである。好ましくは、緩衝液のｐＨは約５．０～６．５、好ましくは約５．５～６．５、より好ましくは約５．５～６．２である。

【0119】

従って、本発明の医薬組成物は、ｐＨが約５．５～６．５であり、医薬組成物における濃度が約１０～３０ｍＭであるヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液、及び前述した何れか１つの実施形態に記載の約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、特に本明細書に記載のヒト化抗体クローン３８又はその抗原結合断片を含んでもよい。

【0120】

幾つかの形態において、本発明に記載の医薬組成物は、アルギニン、アルギニン塩、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、グリシン及びトレハロースから選ばれる１つ又は複数である安定剤を更に含み、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。好ましくは、上記安定剤の濃度は約１０～４００ｍＭ、好ましくは約１００～２５０ｍＭ、より好ましくは約１２０～２２０ｍＭ、更に好ましくは約１３０～１８０ｍＭである。好ましくは、上記安定剤は濃度が約１２０～２２０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、上記安定剤は濃度が約１３０～１８０ｍＭのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約１１０～１７０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～７０ｍＭの塩酸アルギニンと約８０～１２０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。

【0121】

従って、本発明の医薬組成物は、ｐＨが約５．５～６．５であり、医薬組成物における濃度が約１０～３０ｍＭであるヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液、前述した何れか１つの実施形態に記載の約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、特に本明細書に記載のヒト化抗体クローン３８又はその抗原結合断片、及び約１００～２５０ｍＭの安定剤を含んでもよく、好ましくは、上記安定剤は、アルギニン、アルギニン塩、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、スクロース、グリシン及びトレハロースから選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、上記アルギニン塩は塩酸アルギニンである。好ましくは、上記安定剤は濃度が約１２０～２２０Ｍｍのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせである。

【0122】

幾つかの形態において、上記医薬組成物は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０及びポロキサマー１８８から選ばれる１つ又は複数である界面活性剤を更に含む。好ましくは、ｗ／ｖで計算すると、上記界面活性剤の濃度は約０．００１～０．１％、好ましくは約０．０１～０．１％、より好ましくは約０．０２～０．０８％である。

【0123】

従って、本発明の医薬組成物は、ｐＨが約５．５～６．５であり、医薬組成物における濃度が約１０～３０ｍＭであるヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝液、前述した何れか１つの実施形態に記載の約１５０～２５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片、特に本明細書に記載のヒト化抗体クローン３８又はその抗原結合断片、約１００～２５０ｍＭの安定剤、好ましくは、上記安定剤は濃度が約１２０～２２０Ｍｍのアルギニン又はアルギニン塩であり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約１００～１８０ｍＭのスクロースとの組み合わせであり、或いは上記安定剤は濃度が約３０～１００ｍＭの塩酸アルギニンと濃度が約５０～１５０ｍＭのグリシンとの組み合わせであり、及びｗ／ｖで計算すると、約０．０１～０．１％のポリソルベート８０を含んでもよい。

【0124】

本発明の医薬組成物は液体製剤又は凍結乾燥製剤である。

【0125】

本発明の医薬組成物の浸透圧は２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であり、好ましくは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。本発明の医薬組成物は、約２５℃で測定された粘度が８．０ｃＰ以下である。

【0126】

医薬的使用及び方法
本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する薬物の製造における、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤の使用を更に提供する。

【0127】

本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療するための、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤を更に提供する。本発明は、ＰＤ－１活性を除去、阻害又は低減することによって疾患又は病状を治療する方法であって、本明細書の何れか１つの形態に記載の医薬組成物又は注射剤を、それを必要とする受検者に投与することを含む、方法を更に提供する。幾つかの形態において、上記疾患又は病状は、がん又は感染性疾患又は炎症性疾患から選ばれ、上記がんは、好ましくは結腸癌、神経内分泌腫瘍、食道がん、鼻咽頭がん、肉腫、黒色腫、尿路上皮がん及び非小細胞肺がんから選ばれる。

【実施例】

【0128】

以下、具体的な実施例により本発明を説明する。なお、これらの実施例は、説明するためのものであり、本発明の範囲を意図的に制限するものではない。本明細書は、既に本発明について詳しく説明し、そのうち、その具体的な実施形態も開示した。当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の具体的な実施形態に対する様々な変更や改善が明らかである任意の修正、同等置換、改善などは、何れも本発明の請求範囲内に含まれる。特に断りのない限り、実施例で使用される方法及び材料は、この分野における従来の方法及び材料である。

【0129】

実施例で用いた検出方法は以下を含む。
（１）外観目視検査法を用いて外観検査を行った。清澄度検出器の照度を１０００ｌｘ～１５００ｌｘの間にすることを確保した。サンプルを目の同一水平面に保持し、軽く揺らしたり、ひっくり返したりして、気泡の発生を防いだ。黒色の背景と白色の背景の前にそれぞれ目視検査を行った。色、乳白光、可視異物の３つの方面から結果を記録した。

【0130】

（２）タンパク質含有量タンパク質濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ及びＳｏｌｏＶＰＥを用いて検出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用する場合、パーセンテージ消衰係数（Ｅ１％）を１．４１６（ｍｇ／ｍＬ）^-1ｃｍ^-1に設定した。超純水で検出器を３回洗浄し、更に検出ウェルに３μＬの超純水を加え、校正をクリックし、超純水をブランクとして校正した。ブランク校正後にサンプルを測定し、検出ウェルに３μＬのサンプルを加え、「検出」ボタンをクリックし、そして機器の検出データを記録した。各サンプルについて３部の溶液を平行して測定し、各部の溶液を１回測定した。ＳｏｌｏＶＰＥを使用して検出する場合、パーセンテージ消衰係数（Ｅ１％）を１．４１６（ｍｇ／ｍＬ）^-1ｃｍ^-1に設定した。超純水をブランクとして校正した後にサンプルを測定し、キュベットに１２０μＬのサンプルを加え、「検出」ボタンをクリックし、そして機器の検出データを記録した。

【0131】

（３）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度は、ＳＥＣクロマトグラフィーカラム（ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μｍ）を装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５機器）を用いて検出した。移動相の組成は、５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａ₂ＳＯ₄であり、ｐＨが７．０±０．２であった。ピーク面積正規化を用いて結果を定量的に分析した。モノマー、ポリマー及び断片のピーク面積パーセンテージをそれぞれ計算し、モノマーのピーク面積パーセンテージをサンプルの純度として、ポリマー及び断片のピーク面積パーセンテージをポリマー及び断片の含有量とした。クロマトグラフィーパラメータは下記の表１に示された。

【0132】

【表3】

【0133】

（４）Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度抗体製剤還元ＣＥ－ＳＤＳ電気泳動法純度検出は、高圧直流電界を駆動力とし、キャピラリーを分離チャネルとした。予め充填されたゲルは、キャピラリー内で分子篩を形成し、ドデシル硫酸ナトリウムは、異なるタンパク質分子の電荷効果を除去し、還元剤β－メルカプトエタノールは、サンプル中のジスルフィド結合を切断し、分子の大きさが異なるサンプルは、キャピラリー内での移動速度が異なるため、分離することができる。サンプル緩衝液（ＳＤＳ－ＭＷ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）でサンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル緩衝液（ＳＤＳ－ＭＷ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）９５μＬを取り、β－メルカプトエタノール５μＬを加え、ボルテックスして均一に混合した後にブランク対照とした。供試品（１ｍｇ／ｍＬ）９５μＬを取り、β－メルカプトエタノール５μＬを加え、３０００ｒｐｍで室温で３０ｓｅｃ遠心分離し、７０±２℃で１５±２ｍｉｎインキュベートし、室温に冷却し、６０００ｒｐｍで室温で１ｍｉｎ遠心分離し、分離時間を４０ｍｉｎとし、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて検出した。重鎖（ＨＣ）、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の純度を計算し、３つの合計はサンプルの純度であった。

【0134】

（５）ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度抗体製剤非還元ＣＥ－ＳＤＳ電気泳動法純度検出は、高圧直流電界を駆動力とし、キャピラリーを分離チャネルとした。予め充填されたゲルは、キャピラリー内で分子篩を形成し、ドデシル硫酸ナトリウムでサンプルを処理して異なるタンパク質分子の電荷効果を除去し、分子の大きさが異なるため、キャピラリー内での移動速度が異なるサンプルを分離した。供試品溶液にアルキル化試薬を加えることにより、成分の拡散を効果的に減少させ、得られたピークの形を鋭くにし、分離効率が高く、且つサンプルが非還元状態を保持することを保証できる。サンプル緩衝液（ＳＤＳ－ＭＷ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）でサンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル緩衝液（ＳＤＳ－ＭＷ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）９５μＬを取り、０．８Ｍのヨードアセトアミド溶液５μＬを加え、ボルテックスして均一に混合した後にブランク対照とし、供試品（１ｍｇ／ｍＬ）９５μＬを取り、０．８Ｍのヨードアセトアミド溶液５μＬを加え、３０００ｒｐｍで室温で３０ｓｅｃ遠心分離し、７０±２℃で５±１ｍｉｎインキュベートし、室温に冷却し、６０００ｒｐｍで室温で１ｍｉｎ遠心分離し、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて検出した。

【0135】

（６）ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度は、クロマトグラフィーカラム（ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ－１０、４×２５０ｍｍ）を装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５機器）を用いて検出した。移動相の組成は、Ａ相が１０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム二水和物溶液（ｐＨ４．７±０．２）、Ｂ相が１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム十二水和物溶液（ｐＨ９．２±０．２）であった。ピーク面積正規化法を用いてメインピーク、酸性ピーク、塩基性ピークのパーセンテージを計算し、自動積分では合理的な積分結果が得られない場合、手動積分を用いた。詳細なクロマトグラフィーパラメータは下記の表２に示された。

【0136】

【表4】

【0137】

（７）細胞活性この方法において、ＰＤ－１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ改変細胞を標的細胞とした。Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞上のＴ細胞抗原受容体は、ＣＨＯ標的細胞上の抗原に結合することができ、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻害することができる。ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合することができ、それによりＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＰＤ－１とＣＨＯ標的細胞上のＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断してＴ細胞の活性化を促進し、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化させる。Ｌｕｅｉｆｅｒａｓｅ検出試薬を加え、マイクロプレートリーダー化学発光法を用いてＴ細胞－Ｊｕｒｋａｔ細胞内のＮＦＡＴ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅによるルシフェラーゼの発現によって生成されるシグナルの強さを検出することで、ＰＤ－１モノクローナル抗体によるＰＤ－１分子への結合能力を調べた。

【0138】

（８）結合活性この方法は間接法を用い、ヒトＰＤ－１を抗原として９６ウェルプレートにコーティングし、ＰＤ－１モノクローナル抗体はヒトＰＤ－１に結合することができ、ビオチン標識抗体（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４）は、固相抗原（ヒトＰＤ－１）に結合したＰＤ－１モノクローナル抗体と特異的に結合することができ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）は、ビオチン標識抗体（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４）に結合することができ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンは、過酸化水素の作用下でＴＭＢの青色の発色を触媒し、青色の濃淡はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの結合量と正の相関があり、２Ｍの塩酸で停止させた後に黄色に変化した。マイクロプレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定し、検量線の有効結合活性（ＥＣ５０）によりＰＤ－１モノクローナル抗体によるＰＤ－１への結合能力を調べた。

【0139】

（９）ＭＦＩサブ可視粒子検出ＭＦＩサブ可視粒子検出は微粒子検出器（ＭＦＩ５１００）を用いて検出した。サンプルは高濃度サンプルであるため、サンプル注入前に所定の希釈を行う必要があり、希釈後に気泡を避けるように軽く十分且つ均一に混合した後、スーパークリーンベンチにおいて発熱物質を含まないピペットチップでサンプル１．３ｍＬをサンプルプレートに入れ、サンプルプレートを清潔なアルミホイル紙で緊密に覆い、スーパークリーンベンチから機器の対応する作業プレートに移した後、サンプル位置を機器に入力し、検出配列を実行し、サンプルがフローセルを流れる時、その中のサブ可視粒子をマイクロカメラで撮影してカウントした。

【0140】

（１０）ＨＩＡＣサブ可視粒子検出サブ可視粒子検出はＨＩＡＣを用いて検出した。気泡を避けるようにサンプルを軽く十分且つ均一に混合した後、サンプルセルに配置し、機器のロボットアームが自動的にサンプリングし、サンプルがセンサーを流れる時、その中のサブ可視粒子をフォトレジスト法によりカウントした。

【0141】

（１１）粘度粘度検出は粘度計（メーカー：ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ、型番：ＭｉｃｒｏＶｉｓｃ）を用い、試験温度は約２５℃、せん断速度は約１０００～２０００ｓ^-1であった。

【0142】

以下の実施例における略語について、「ｈｒ」が時間、「Ｗ」が週、「Ｍ」が月、「Ｃ」が凍結融解サイクルの回数、「ＦＴ」が凍結融解サイクル、「ＲＴ」が室温、「Ｔ０」が処方サンプルの分注前の初期テストを表す。

【0143】

実施例１：緩衝液系及び安定剤の初期スクリーニング実験
液体型医薬組成物において、緩衝液系及びｐＨが抗体の安定性に密接に影響しており、特別な物理化学的性質を有する各抗体は、それぞれ最適な緩衝液の種類及びｐＨを有する。本実施例は、臨床応用に適用できるために本発明に開示された抗ＰＤ－１抗体が最適な安定性を持つように、最適な緩衝液系及び安定剤を初期スクリーニングすることを目的とする。

【0144】

１．１ 実験手順
本実施例は抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂで行った。サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３ ０．１１ｍ²膜を用いてＵＦ／ＤＦ限外ろ過により約１８０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し、そしてサンプルを、表３に示される対応する処方に透析し、最終濃度を約１８０ｍｇ／ｍＬに調整し、更に対応する濃度のポリソルベート８０（ＩＩ）を加えた。スーパークリーンベンチにおいて２Ｒバイアルに２．０ｍＬ／ボトルで無菌充填し、安定性分注及び検出を行った。

【0145】

【表5】

【0146】

１．２ 実験結果
１．２．１ 外観及び粘度の結果
表４の結果により、全ての処方においても、Ｔ０時点で明らかな可視異物は認められず、明らかな乳白光がなかった。３回及び５回凍結融解後のサンプルは、外観に何れも顕著な変化が発生せず、高温及び長期条件で１ヶ月間放置しても、外観に何れも顕著な変化が発生せず、ＦＳ１－１、ＦＳ１－３及びＦＳ１－６処方の粘度が比較的大きかった。

【0147】

【表6】

【0148】

１．２．２ ＳＥＣ純度の結果
図１のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表５のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果により、全ての処方を高温条件で１ヶ月間（１Ｍ）放置すると、ＦＳ１－４処方の純度が明らかに低下し、ポリマーが何れも明らかに増加し、他の処方の純度は顕著な変化が認められなかった。長期条件での放置で、１Ｍを放置し、及び５回凍結融解を繰り返すと、全ての処方のＳＥＣ純度は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0149】

【表7】

【0150】

１．２．３ Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果
表６のＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、高温条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度は何れも低下した。全てのサンプルは、１Ｍ長期放置及び５回凍結融解後、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0151】

【表8】

【0152】

１．２．４ ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果
表７のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、高温条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度は何れも顕著に低下し、そのうちＦＳ１－４及びＦＳ１－５処方の純度の低下は相対的に速く、全てのサンプルは、１Ｍ長期放置及び５回凍結融解後、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0153】

【表9】

【0154】

１．２．５ ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果
図２のＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表８のＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果により、高温条件で１Ｍ放置すると、全ての処方の純度は何れも顕著に低下し、何れも顕著な酸性ピーク増加が認められた。ＦＳ１－３処方の純度が最も速く低下し、全てのサンプルは、１Ｍ長期放置及び５回凍結融解後、全ての処方のＣＥＸ純度は何れも顕著な低下が認められなかった。

【0155】

【表10】

【0156】

１．２．６ 結合活性の結果
表９の結合活性の結果により、高温又は長期条件での１Ｍ放置及び５回凍結融解後、結合活性は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0157】

【表11】

【0158】

１．２．７ 細胞活性の結果
表１０の細胞活性の結果により、全てのサンプルは、高温又は長期条件での１Ｍ放置及び５回凍結融解後、細胞活性は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0159】

【表12】

【0160】

１．２．８ サブ可視粒子結果
表１１のサブ可視粒子検出結果により、高温条件で１Ｍ放置した後、全ての処方のサブ可視粒子は何れも顕著な増加が認められず、長期条件で１Ｍ放置し、及び５回凍結融解を繰り返すと、全ての処方のサブ可視粒子の数は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0161】

【表13】

【0162】

１．３ 処方スクリーニング１回目の結論
外観の結果から、各処方に顕著な差異が認められなかった。粘度の結果から、ＦＳ１－１、ＦＳ１－３及びＦＳ１－６処方の粘度は比較的大きかった。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果から、処方ＦＳ１－４は比較的多いポリマーを生成した。ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果から、処方ＦＳ１－４及びＦＳ１－５純度の結果は比較的低かった。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果から、ＦＳ１－３処方のＣＥＸ純度は比較的速く低下した。Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、結合活性及び細胞活性の結果において、何れも処方の差異が示されず、サブ可視粒子の結果から、処方ＦＳ１－４の結果は比較的多いサブ可視微粒子が見られ、他の処方に顕著な差異がなかった。

【0163】

以上のように、処方ＦＳ１－２及びＦＳ１－５は全体的に優れているため、安定剤としてスクロース及び塩酸アルギニンを選択して次のスクリーニング実験に進んだ。

【0164】

実施例２：ｐＨ、補助剤のスクリーニングと低濃度処方の比較研究
異なる補助剤の抗体安定性に対する影響を更に研究するために、塩化ナトリウム、スクロース、塩酸アルギニン、グリシン又はマンニトールのうちの１つの補助剤を選択して比較試験を行った。ｐＨ６．０、２０ｍＭのヒスチジン緩衝系、ｐＨ５．５、２０ｍＭのヒスチジン緩衝系及びｐＨ６．０、２０ｍＭのクエン酸緩衝系について、抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂの濃度が１８０ｍｇ／ｍＬの条件で、上記異なる補助剤の安定性に対する影響を調べた。

【0165】

２．１ 実験手順
本実施例は抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂで行った。サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３ ０．１１ｍ²膜を用いてＵＦ／ＤＦ限外ろ過により約１８０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し、そしてサンプルを、表１２に示される対応する処方に透析し、最終濃度を約１８０ｍｇ／ｍＬに調整し、更に対応する濃度のポリソルベート８０（ＩＩ）を加えた。スーパークリーンベンチにおいて２Ｒバイアルに２．０ｍＬ／ボトルで無菌充填し、安定性分注及び検出を行った。

【0166】

【表14】

【0167】

２．２ 実験結果
２．２．１ 外観及び濃度の結果
表１３の結果により、高温条件及び長期条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのタンパク質含有量は何れも顕著な変化が認められず、高温、加速又は長期条件で１Ｍ放置すると、サンプルは何れも明らかな可視異物が認められず、何れも明らかな乳白光がなく、ＦＳ２－２及びＦＳ２－６処方の粘度の結果はより優れた。

【0168】

【表15】

【0169】

２．２．２ ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果
図３のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表１４のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果により、全てのサンプルは高温条件で１Ｍ放置すると、ＳＥＣ純度は何れも低下し、ＦＳ２－４、ＦＳ２－５及びＦＳ２－７処方のＳＥＣ純度の低下は比較的速く、全てのサンプルは加速条件又は長期条件で１Ｍ放置すると、何れもＳＥＣ純度の顕著な変化が認められなかった。

【0170】

【表16】

【0171】

２．２．３ Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果
表１５のＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、高温４０℃の条件で１Ｍ放置すると、サンプルの純度は何れも低下し、加速２５℃の条件又は長期条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルの純度は何れも顕著な変化が認められなかった。サンプルは群間の差異がなかった。

【0172】

【表17】

【0173】

２．２．４ ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果
表１６のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、高温４０℃の条件、加速２５℃の条件又は長期条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルの純度は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0174】

【表18】

【0175】

２．２．５ ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果
図４のＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表１７のＣＥＸ－ＨＰＬＣ結果により、高温条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度は何れも低下し、ＦＳ２－４処方の純度の低下は比較的速く、加速及び長期条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度は何れも顕著な変化がなかった。

【0176】

【表19】

【0177】

２．２．６ 細胞活性の結果
表１８の細胞活性の結果により、高温、加速条件及び長期条件で１Ｍ放置し、更に３回及び５回凍結融解サイクルを行うと、全てのサンプルは何れも細胞活性の顕著な変化が認められなかった。

【0178】

【表20】

【0179】

２．２．７ 結合活性の結果
表１９の結合活性の結果により、高温、加速条件及び長期条件で１Ｍ放置し、更に３回及び５回凍結融解サイクルを行うと、全てのサンプルの結合活性は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0180】

【表21】

【0181】

２．２．８
サブ可視粒子結果表２０のサブ可視粒子の結果により、加速条件又は長期条件で１Ｍ放置すると、全てのサンプルのサブ可視粒子は何れも顕著な変化が認められなかった。

【0182】

【表22】

【0183】

２．３ 処方スクリーニング２回目の結論
タンパク質の含有量、外観、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果、細胞活性、結合活性の結果及びサブ可視粒子の結果から、各処方間に顕著な差異が認められなかった。粘度の結果から、ＦＳ２－２及びＦＳ２－６処方は比較的優れ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果から、ＦＳ２－４、ＦＳ２－５及びＦＳ２－７処方の純度の低下は比較的速く、そのうちＦＳ２－４は原静脈注射製剤（ＣＮ出願番号２０１６１０６２８０４８．６）によって決定された低濃度処方であり、実験によって高濃度抗体製剤に適しないことを見出した。以上のように、最終的にＦＳ２－２（２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０、１４０ｍＭの塩酸アルギニン含有）処方を選択し、浸透圧を３００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度となって皮下注射剤により良く適するために、塩酸アルギニンの含有量を１５０ｍＭに増加させるように処方を更に調整し、そしてこの処方のツイーン濃度を更に調べた。

【0184】

実施例３：界面活性剤のスクリーニング実験
液体製剤に添加される界面活性剤は、一般的に、抗体凝集の低減又は製剤における粒状物の形成の最小化を図るために、保存中に空気／溶液界面により誘導される応力、溶液／表面により誘導される応力の影響から抗体などのタンパク質を保護するための試薬であり、抗体の物理化学的性質の安定化に有利である。２０ｍＭのヒスチジン緩衝液及び１８０ｍｇ／ｍＬの抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂを含む製剤において、それぞれ異なる濃度のポリソルベート８０を加え、上記異なる濃度の界面活性剤の安定性に対する影響を調べた。

【0185】

３．１ 実験手順本実施例は抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂで行った。サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３ ０．１１ｍ²膜を用いてＵＦ／ＤＦ限外ろ過により約１８０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し、そしてサンプルを、表２１に示される対応する処方に透析し、最終濃度を約１８０ｍｇ／ｍＬに調整し、更に対応する濃度のポリソルベート８０（ＩＩ）を加えた。スーパークリーンベンチにおいて１ｍＬの予備充填シリンジに１．１ｍＬ／ボトルで無菌充填し、安定性分注及び検出を行った。

【0186】

【表23】

【0187】

３．２ 実験結果
３．２．１ 外観及び濃度の結果表２２の結果より、全てのサンプルのタンパク質含有量は何れも顕著な変化が認められず、全てのサンプルの外観は何れも明らかな可視異物が認められず、明らかな乳白光がなかった。

【0188】

【表24】

【0189】

３．２．２ ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果
図５のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表２３のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度の結果より、全てのサンプルは何れも純度の顕著な変化が認められなかった。

【0190】

【表25】

【0191】

３．２．３ Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ結果
表２４のＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、全てのサンプルは何れも顕著な変化が認められなかった。

【0192】

【表26】

【0193】

３．２．４ ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ結果
表２５のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度の結果により、全てのサンプルは何れも顕著な変化が認められなかった。

【0194】

【表27】

【0195】

３．２．５ ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果
図６のＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度トレンドチャート及び表２６のＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度の結果により、全てのサンプルは何れも純度の顕著な変化が認められなかった。

【0196】

【表28】

【0197】

３．２．６ 結合活性の結果
表２７の結合活性の結果により、全てのサンプルは何れも活性の顕著な変化が認められなかった。

【0198】

【表29】

【0199】

３．２．７ 細胞活性の結果
表２８の細胞活性の結果により、全てのサンプルは何れも活性の顕著な変化が認められなかった。

【0200】

【表30】

【0201】

３．２．８ サブ可視粒子の結果
表２９のサブ可視粒子の結果により、全てのサンプルは何れも顕著な変化が認められなかった。

【0202】

【表31】

【0203】

３．３ 処方スクリーニング３回目の結論
サンプルの外観、濃度、純度、活性及びサブ可視粒子は何れも顕著な差異が認められず、処方は比較的良好な安定性を示した。ツイーンは溶解度を促進することができ、高濃度製剤に対して、ツイーン濃度の向上はサブ可視粒子の数の増加を効果的に緩和することができるため、最終的に０．０４％の処方を選択した。

【0204】

実施例４：影響因子実験
４．１ 実験手順
本実施例は抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂで行った。サンプルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３ ０．１１ｍ²膜を用いて限外ろ過により約１８０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し、そしてサンプルを、表２１に示される対応する処方２に透析し、最終濃度を約１８０ｍｇ／ｍＬに調整し、更に対応する濃度のポリソルベート８０（ＩＩ）を加えた。スーパークリーンベンチにおいて１ｍＬの予備充填シリンジに１．１ｍＬ／ボトルで無菌充填し、影響因子実験を行い、具体的な計画は表３０に示された。

【0205】

【表32】

【0206】

４．２ 実験結果
４．２．１ 水平振とう実験結果のまとめ
表３１の結果により、全てのサンプルのタンパク質濃度、外観、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度、結合活性及び細胞活性は、何れも顕著な変化が認められなかった。

【0207】

【表33】

【0208】

４．２．２ 凍結融解実験の結果
表３２の結果により、全てのサンプルのタンパク質濃度、外観、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度、結合活性及び細胞活性は、何れも顕著な変化が認められなかった。

【0209】

【表34】

【0210】

４．２．３ 光照射実験の結果
表３３の結果により、全てのサンプルのタンパク質濃度、外観、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ純度、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ純度、結合活性及び細胞活性は、何れも顕著な変化が認められなかった。

【0211】

【表35】

【0212】

以上のように、発明者らは、異なる緩衝系、異なるｐＨ条件、異なる抗体濃度及び異なる補助剤の組成を検討し、目標のｐＨ範囲を５．９～６．１とし、浸透圧範囲を２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇとするように制御することよって、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭの塩酸アルギニン及び０．０４％のポリソルベート８０（ＩＩ）といった最適な製剤配合を決定した。

【0213】

実施例５：製剤の長時間安定性の研究
通常、治療性抗体が含まれる液体薬物製品を２～８℃の条件で保存する必要があるため、製剤が長時間保存において高安定性を保持できることは、非常に重要である。上記スクリーニング結果により、抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂの濃度が約１８０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭの塩酸アルギニン及び０．０４％のポリソルベート８０（ＩＩ）であった。発明者らは、この処方で後続の生産及び長時間安定性の調査を行った。

【0214】

２ロットの完成品を選用し、２～８℃の条件で６ヶ月間放置した後、各サンプルに対して分析試験を行った。安定性は、（ａ）目視外観、（ｂ）ｐＨ、（ｃ）ＣＥ－ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動）法により検出された抗体の分子量、（ｄ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより測定された抗体モノマー、ポリマー、（ｅ）ＣＥＸ－ＨＰＬＣにより測定された抗体の主要電荷、酸性電荷又は塩基性電荷の含有量、（ｆ）ＥＬＩＳＡ法により検出された抗体結合活性、（ｇ）タンパク質含有量といったパラメータでによって評価された。

【0215】

結果は、２ロットの完成品が外観、ｐＨ値、タンパク質含有量、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ（弱カチオン交換高速液体クロマトグラフィー）、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ（還元電気泳動法）、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ（非還元電気泳動法）及び生理活性において何れも顕著な変化がなかったことを示し、具体的には表３４に示された。結果は、上記２ロットの完成品を２～８℃の条件で保存する場合、０～６ヶ月の保存過程において非常に良好な安定性を有することを示した。

【0216】

【表36】

【0217】

実施例６：製剤の加速安定性の研究
２ロットの完成品を選用し、２５±２℃、６０±５％の相対湿度（ＲＨ）の条件で０～６ヶ月間放置した後、各サンプルに対して分析試験を行った。製剤処方は、抗体ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ濃度が約１８０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭの塩酸アルギニン及び０．０４％のポリソルベート８０（ＩＩ）であった。

【0218】

表３５に示すように、当該完成品製剤はタンパク質分解に対して比較的高い安定性を有し、２５±２℃で測定された分解動力学パラメータは室温環境における６ヶ月保存の要件を満たした。

【0219】

【表37】

【0220】

実施例７：カニクイザルインビボでの皮下及び静脈製剤の薬物動態比較研究
７．１ 実験目的
カニクイザルに異なる用量でＪＳ００１（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）皮下製剤を皮下注射し、血清中の薬物濃度を検出することにより、ＪＳ００１皮下製剤（処方が実施例２におけるＦＳ２－２）の初期薬物動態特性を評価し、同時に、約４０ｍｇ／ｍＬのＪＳ００１、約２０ｍＭの枸櫞酸塩緩衝液（ｐＨ約６．０）、約１５０ｍＭのマンニトール、約５０ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０２％のポリソルベート８０をＪＳ００１静脈製剤の処方として、静脈投与群を設定し、ＪＳ００１の異なる投与経路の薬物動態特性を評価し、及び生物学的利用能を初期調査した。

【0221】

７．２ 試験品の調製方法
カニクイザルの最近の体重、投与量及び薬物含有量により必要な供試品の量を計算し、静脈製剤を、０．９％の塩化ナトリウム注射液で無菌で０．８ｍｇ／ｍＬに希釈した。この実験では、試験動物に３０分間の輸注時間で直ちに静脈輸注を必要とし、定速輸液ポンプを使用することが推奨された。皮下製剤を、プラセボ（君盟自製）で必要な濃度に希釈し、０．５ｍＬ／ｋｇの投与体積で後肢大腿外側に注射した。

【0222】

７．３ 動物の選択、投与量の設計及び群分け
この実験では、各群３匹でランダムに群分けした、動物体重が２．５～５ｋｇのカニクイザルを選用した。カニクイザル実験の群分けと投与状況は表３６に示された。そのうち、群Ｂは４ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与され、そのうち、群Ｂの投与製剤はＪＳ００１皮下製剤であり、一方では、群Ａの投与製剤はＪＳ００１静脈製剤、投与量は４ｍｇ／ｋｇであった。

【0223】

【表38】

【0224】

７．４ 血液サンプルの採取及び結果
全血サンプル（ＰＫ採血約１ｍＬ）をカニクイザルの非投与肢の静脈から取り出し、血液サンプルを採取した後に標識サンプルチューブに入れ、アイスボックスに置いて、血液を自然凝固させた後、２～８℃の遠心分離機に入れて１５００×ｇで１０分間遠心分離し、サンプル番号が標識されたＥＰチューブ内に血清を分離し、１本を検出サンプルとし、もう１本をバックアップサンプルとするように、全てのＰＫサンプルを２チューブに分注した。サンプル処理後、－６０～－９０℃の冷蔵庫に保存した。サンプル採取後、コールドチェーン物流を利用して生体サンプル分析部門に輸送し、関連する輸送記録及び温度制御記録を添付し、輸送中にサンプルが解凍されないことを確保した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ．）ソフトウェアのノンコンパートメントモデルを用いて薬物動態パラメータを計算した。ＡＵＣ_(0-t)の計算方法はＬｉｎｅａｒ Ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ Ｌｉｎｅａｒ Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎであった。排除速度定数Ｋ_el、半減期ｔ_1/2、ピーク到達時間Ｔ_max、ピーク濃度Ｃ_max、薬物曝露量ＡＵＣ_(0-t)、見かけの分布容積Ｖ_d、システムクリア率ＣＬｓ、平均滞留時間ＭＲＴなどのパラメータを報告した。２群の平均血清薬物濃度は表３７、２群の平均血中薬物濃度－時間変化曲線は図７、２群の平均血清薬物動態結果は表３８に示された。

【0225】

【表39】

【0226】

【表40】

【0227】

結果により、カニクイザルに４ｍｇ／ｋｇの投与量で試験薬物ＪＳ００１を単回皮下注射する場合、ＡＵＣ_(0-t)は１１８００±７００ｈｒ×μｇ／ｍＬであり、４ｍｇ／ｋｇの投与量で試験薬物ＪＳ００１を単回静脈注射する場合、ＡＵＣ_(0-t)は１２３００±１９１０ｈｒ×μｇ／ｍＬであり、ＪＳ００１皮下注射の生物学的利用能は９５．９％であり、試験薬物ＪＳ００１の皮下注射及び静脈注射の２群の平均血中薬物濃度－時間変化曲線の傾向も基本的に一致することが示され、そのため、ＪＳ００１静脈製剤を皮下注射製剤に開発することで、同等の薬物動態効果が得られ、また、皮下注射製剤は腫瘍患者のコンプライアンス及び投与利便性を向上させることがでる。

【0228】

実施例８：皮下注射製剤によるｈＰＤ－１ヒト化マウス移植ＭＣ３８腫瘍成長への阻害作用
８．１ 試験目的
マウス結腸がんＭＣ３８皮下移植モデルにおける本発明のＪＳ００１（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）皮下注射製剤（処方は実施例２におけるＦＳ２－２）の抗腫瘍作用を評価した。

【0229】

８．２ 試験過程
６～７週齢の雌ｈＰＤ－１ヒト化マウス（百奥賽図江蘇遺伝子生物技術有限公司）を取り、右側背部に１×１０⁶のＭＣ３８細胞（０．１ｍＬ／匹）を皮下接種した。平均腫瘍体積が約１３４ｍｍ³となる場合、２４匹の動物を選択し、腫瘍体積に応じて各群６匹の動物で４群にランダムに群分けした。各群はそれぞれ、生理食塩水を投与する陰性対照群、及び１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＦＳ２－２製剤をそれぞれ投与するＪＳ００１－ＦＳ２－２治療群であった。

【0230】

群分けの当日に投与し、全ての群の投与経路は頸部皮下注射であり、週に２回、連続６回投与し、最後投与から３日後に実験を終了した。腫瘍の体積及び体重を週に２回測定し、マウスの体重と腫瘍の体積を記録した。実験終了時、マウスを安楽死させ、腫瘍阻害率ＴＧＩ％（ＴＧＩ％＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％）を計算した。（Ｔｉ：投与ｉ日目の治療群の腫瘍体積平均値、Ｔ０：投与０日目の治療群の腫瘍体積平均値、Ｖｉ：投与ｉ日目の陰性対照群の腫瘍体積平均値、Ｖ０：投与０日目の陰性対照群の腫瘍体積平均値）。

【0231】

結果は図８に示された。その結果、投与開始後の２１日目、陰性対照群の平均腫瘍体積は１５０１±１２２ｍｍ³であった。ＪＳ００１－ＦＳ２－２は、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、平均腫瘍体積がそれぞれ、６６１±１０８ｍｍ³、５７８±７５ｍｍ³、５３１±１８４ｍｍ³であり、ＴＧＩ％がそれぞれ６１．５％、６７．５％及び７１．０％であった。ＪＳ００１－ＦＳ２－２は、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｈＰＤ－１ヒト化マウス移植ＭＣ３８腫瘍体積の増加を顕著に阻害し、良好な用量効果を有することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】