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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】リコピン生合成を促進するための遺伝子の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240725BHJP
A01H 5/00 20180101ALN20240725BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
A01H5/00 A ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023576024
(86)(22)【出願日】2023-02-10
(85)【翻訳文提出日】2023-12-08
(86)【国際出願番号】 CN2023075528
(87)【国際公開番号】W WO2024011900
(87)【国際公開日】2024-01-18
(31)【優先権主張番号】202210835373.5
(32)【優先日】2022-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】陳 析豊
(72)【発明者】
【氏名】徐 瀟
(72)【発明者】
【氏名】許 以霊
(72)【発明者】
【氏名】鄭 舒躍
(72)【発明者】
【氏名】李 夢倩
(72)【発明者】
【氏名】陳 順麗
(72)【発明者】
【氏名】馬 伯軍
(57)【要約】
本発明は植物遺伝学の分野に属し、特にトマト果実におけるリコピン生合成を促進する遺伝子の使用に関する。本発明は、植物におけるリコピン生合成を促進する遺伝子の使用を開示するものであり、その遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるヌクレオチド配列を有するＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００であり、トマトにおいてＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトすることにより、植物果実におけるリコピン生合成を促進することができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物におけるリコピン生合成を促進するための遺伝子の使用であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すヌクレオチド配列を有するＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００であり、植物果実においてＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトすることにより植物果実におけるリコピンの生合成を促進する、使用。
【請求項2】
前記植物がトマトであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子内に設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集標的のｓｇＲＮＡ配列は、 ５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’であり、ｓｇＲＮＡ配列に基づいてプライマーを人工合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに構築することを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトして得られるホモ変異株のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示すことを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍと比較して、遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトした後のトマト果実のリコピン含有量は大幅に増加し、リコピン生合成経路の重要な酵素をコードする遺伝子ＰＳＹの発現レベルも大幅に増加することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は植物遺伝学の分野に属し、特にトマト果実におけるリコピンの生合成を促進するための遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
リコピンは、トマト、ニンジン、スイカ、パパイヤ、ザクロなどの成熟した赤い植物の果実に広く含まれる天然色素で、その含有量はトマトの果実の中で最も多く、トマトの果実の品質を測る重要な指標でもある。リコピンは、現在最も強力な抗酸化能力を持つと考えられている植物栄養素の１つであり、人間の細胞によって生成されるフリーラジカルを除去することで抗酸化効果を達成し、老化を遅らせることができ、神経疾患の予防や腫瘍の抑制にも効果がある。また、心血管疾患の予防、免疫力の向上、骨粗鬆症の遅延などの多くの側面に効果があり、健康食品や栄養食品の開発分野で幅広い応用が期待されている。
【0003】
現在、リコピンとその関連酵素の生合成経路は比較的明確に研究されている。植物では、リコピンは１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸（ＤＯＸＰ）経路を通じて優先的に生合成され、その直接の前駆体はイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）であり、色素体中で一連の酵素触媒作用によりＤＯＸＰから合成される。ＩＰＰはイソメラーゼの作用によりジメチルプロピレンピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する。ＩＰＰとＤＭＡＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）の作用によりゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を形成する。次に、重要な酵素であるフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）の触媒作用によってフィトエンが合成される。その後、フィトエンは、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＳ）およびζ－カロテンデヒドロゲナーゼ（ＺＤＳ）によって触媒される脱水素反応を受けてリコピンを形成する。
【0004】
研究により、リコピン合成経路における重要な酵素遺伝子ＰＳＹ、ＰＤＳ、およびＺＤＳの発現を促進すると、リコピンの生産が大幅に増加する可能性があることが判明した。サイトカイニンＣＫｓ合成遺伝子ＳｌＩＰＴ４は、ζ－カロテンイソメラーゼ遺伝子ＺＩＳＯおよびＺＤＳに直接影響を与えることにより、リコピン生合成を正に制御する。トマト果実の熟成正の制御因子ＮＯＲ－ｌｉｋｅ１はＳｌＡＣＳ２の発現を制御し、リコピンの蓄積を促進する。ＣＵＬ４遺伝子の抑制により色素体数が増加し、トマト果実にリコピンが蓄積する。ＳｌＮＡＣ１遺伝子の抑制により、ＡＣＣシンターゼ２遺伝子ＡＣＳ２、リコペンβ－シクラーゼ遺伝子ＬＣＹｂ、ＰＳＹ１およびその他の関連遺伝子の発現が制御され、トマト果実のリコピン含有量が増加する。したがって、リコピンの生合成を制御する新しい遺伝子を発見し、リコピンの生産を促進し育種利用を開発することには重要な理論的意義と生産価値がある。
【0005】
中国特許「トマト灰色かび病に対する抵抗性を高める遺伝子の利用」（出願番号：２０２１１００５８９４３．Ｘ）では、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がトマト灰色かび病に対する抵抗性機能を有することが発表された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明が解決すべき技術的課題は、植物におけるリコピンの生合成をいかに効果的に促進するかである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、植物におけるリコピン生合成を促進する遺伝子（植物におけるリコピン生合成を負に制御する遺伝子）の使用を提供する。当該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すヌクレオチド配列を有するＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００である。トマトのＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトすることによって、植物果実のリコピン生合成量が促進（効果的に促進）される。
【0008】
本発明の使用の改良として、植物はトマトである。
【0009】
本発明の使用のさらなる改良として、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集標的のｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計し、ｓｇＲＮＡ配列に基づいてプライマーを人工的に合成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに構築される。
【0010】
本発明の使用のさらなる改良として、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトした後に得られるホモ接合変異株のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示す。
【0011】
本発明の使用のさらなる改良として、野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍと比較して、遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をノックアウトした後のトマト果実のリコピン含有量が顕著に増加し、リコピン生合成経路の重要な酵素をコードする遺伝子であるＰＳＹの発現レベルも大幅に増加する。
【0012】
本発明は、トマトのＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を提供し、該遺伝子によってコードされるタンパク質のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す。
【0013】
本発明はまた、トマトのＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトする方法を提供し、これには以下の工程が含まれる。
１） ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集標的の配列を設計する： ５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’；
２） 工程１）で得られた配列を使用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ベクターを構築する。
３） 工程２）で得られたベクターを野生型トマトに遺伝子形質転換し、そのゲノム中のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を標的編集し、遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００がノックアウトされた変異体植物を取得し、その果実におけるリコピン生合成量は、野生型対照品種よりも有意に高い。
１） ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集標的の配列を設計する： ５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’；
２） 工程１）で得られた配列を使用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ベクターを構築する。
３） 工程２）で得られたベクターを野生型トマトに遺伝子形質転換し、そのゲノム中のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を標的編集し、遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００がノックアウトされた変異体植物を取得し、その果実におけるリコピン生合成量は、野生型対照品種よりも有意に高い。
【0014】
本発明の技術的解決策の詳細は以下のとおりである。
まず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を利用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をコードする遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、ノックアウトベクターを野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、遺伝子組換え植物が得られる。
まず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を利用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００をコードする遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、ノックアウトベクターを野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、遺伝子組換え植物が得られる。
【0015】
次に、ＰＣＲ技術を使用して遺伝子組換え植物のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を増幅および配列決定し、遺伝子をノックアウトした変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２を同定する。変異部位の配列決定結果を図１に示す。これらの２つの変異株は異なる形質転換カルスに由来し、それらにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２である。トマトの果実が成熟した後、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍおよび変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２の果実のリコピン含有量を検出したところ、変異株のリコピン含有量が野生型のＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍよりも顕著に高いことが分かった（図２）。
【0016】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がトマトにおけるリコピンの生合成を調節していることを証明するために、ＰＣＲ増幅を使用して遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を取得し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の過剰発現ベクターを構築し、その後、過剰発現ベクターを野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、対応する遺伝子組換え植物が得られる。次に、ｑＲＴ－ＰＣＲ技術を使用して、遺伝子組換え植物におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現レベルを検出し、この遺伝子の過剰発現系統ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２を同定し、図３に示している。トマト果実が成熟した後、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍおよび過剰発現系統ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２の植物果実のリコピン含有量を検出することにより、過剰発現系統ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２のリコピン含有量は、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍよりも大幅に低いことが分かった（図４）。
【0017】
同時に、リコピン生合成経路（フィトエン合成酵素）の重要な酵素であるＰＳＹをコードする遺伝子を選択し、ｑＲＴ－ＰＣＲ技術を使用して野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ、変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２、過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２の果実におけるＰＳＹ遺伝子の発現レベルを分析し、変異体植物におけるＰＳＹ遺伝子の発現が野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍよりも有意に高く、一方、過剰発現植物におけるＰＳＹ遺伝子の発現が野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍよりも大幅に低いことが示している（図５）。
【発明の効果】
【0018】
これらの結果はさらに、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がトマトのリコピンの生合成を負に制御していることを示しているため、トマトのＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をノックアウトするとリコピンの生合成が促進され、果実のリコピン含有量が増加する可能性がある。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子とその使用には重要な応用価値がある。
【0019】
強調すべき点は、中国特許「トマト灰色かび病に対する抵抗性を増強する遺伝子の使用」（出願番号：２０２１１００５８９４３．Ｘ）は、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子がトマト灰色かび病に対する抵抗性機能を有することを発表しただけのことであって、それは、本発明に含まれるリコピン生合成を促進する使用とは無関係である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
以下の図において、図中の ＊＊ は、野生型対照品種との非常に有意な差異を示している。
【図1】Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウト系ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２の編集部位配列決定の結果を示している。
【図2】Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００ノックアウト系ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２の果実のリコピン含有量を示している。
【図3】Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現系ＯＥー＃１およびＯＥー＃２の同定である。
【図4】Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現系ＯＥー＃１およびＯＥー＃２の果実のリコピン含量を示している。
【図5】リコピン合成の重要な酵素遺伝子ＰＳＹの発現分析である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
（ステップ１． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００ 遺伝子ノックアウト用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ベクターの構築）（中国特許 ２０２１１００５８９４３．Ｘ「トマト灰色かび病に対する抵抗性を高めるための遺伝子の使用」を参照）
【0022】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に基づいて、Ｇｕｉｄｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ オンライン ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を使用して、ｓｇＲＮＡ配列： ５’－ＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’を設計する。この配列に基づいて対応するプライマーを合成する。
上流 ５’－ＴＧＡＴＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’、
下流 ５’－ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡ－３’。
対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ）を使用し、構築方法は製品の説明書に従って行う。
上流 ５’－ＴＧＡＴＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＧ－３’、
下流 ５’－ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡ－３’。
対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ）を使用し、構築方法は製品の説明書に従って行う。
【0023】
（ステップ２． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを使用したトマトの遺伝子形質転換）
ステップ１で構築したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをトマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、ゲノム内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の標的編集を実行できるようにする。遺伝子組換え法は、Ｋｉｍｕｒａらの方法を採用し（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ、ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ、２００８）、対応する遺伝子組換えトマト植物を得る。
ステップ１で構築したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをトマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、ゲノム内のＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の標的編集を実行できるようにする。遺伝子組換え法は、Ｋｉｍｕｒａらの方法を採用し（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ、ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ、２００８）、対応する遺伝子組換えトマト植物を得る。
【0024】
（ステップ３． 遺伝子組換えトマトにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子編集部位の同定）
ＳＤＳ法を使用して、遺伝子組換えトマト植物とその野生型Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍのゲノムＤＮＡを抽出する。トマトの葉０．１ｇを採取し、液体窒素で粉砕し、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇ Ｔｒｉｓ－ｃｌ、２９．２２ｇ Ｎａｃｌ、１５．０ｇ ＳＤＳ粉末に、超純水を加えて１Ｌの定容量にし、ｐＨ８．０に調整する。）を加え、６５°Ｃ６０分間インキュベート。２００μｌ ＫＡＣ（５ｍｏｌ／Ｌ）を加え、混合し、氷浴で１０分間実施する。さらに５００μｌ クロロホルムを加え、混合し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取しイソプロパノール ５００μｌを加え、よく混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。沈殿を７５％エタノールで洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。ＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌの純水を加えてＤＮＡを溶解する
ＳＤＳ法を使用して、遺伝子組換えトマト植物とその野生型Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍのゲノムＤＮＡを抽出する。トマトの葉０．１ｇを採取し、液体窒素で粉砕し、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇ Ｔｒｉｓ－ｃｌ、２９．２２ｇ Ｎａｃｌ、１５．０ｇ ＳＤＳ粉末に、超純水を加えて１Ｌの定容量にし、ｐＨ８．０に調整する。）を加え、６５°Ｃ６０分間インキュベート。２００μｌ ＫＡＣ（５ｍｏｌ／Ｌ）を加え、混合し、氷浴で１０分間実施する。さらに５００μｌ クロロホルムを加え、混合し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取しイソプロパノール ５００μｌを加え、よく混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。沈殿を７５％エタノールで洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。ＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌの純水を加えてＤＮＡを溶解する
【0025】
上記で抽出したトマトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲプライマーはＦ１： ５’－ＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＡＴ－３’、Ｒ１： ５’－ＴＴＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴ－３’を使用する。ＰＣＲ増幅系は次のとおりである。２５μｌ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ （Ｐｒｅｍｉｘ）、各１μｌのＦ１およびＲ１プライマー（１０μＭ）、２μｌのテンプレートＤＮＡ（＜２００ｎｇ）、および２１μｌの滅菌水。ＰＣＲ増幅プロセスは次のとおりである。９５℃で５分間の予備変性、９８℃で１０秒間の変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で５分間の伸長。
【0026】
ＰＣＲ産物はバイオテクノロジー企業に配列決定分析を依頼し、配列決定プライマーはＦ１である。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２つのホモ接合性変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２が同定される。
【0027】
これら２つの変異株は、異なる形質転換カルスに由来し、異なる形質転換イベントの遺伝子組換え産物であり、２つの独立した遺伝子組換え植物である。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のコード領域には塩基Ａが挿入されており、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に記載の通りであり、遺伝子にフレームシフト突然変異を起こし、その結果、両系統とも遺伝子はノックアウトされる。
【0028】
（ステップ４． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子ノックアウト植物の果実におけるリコピン含有量の測定）
上記で同定したＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２つの変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２とその野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍを、２５℃、１６時間明所、８時間暗所の温室に植えた。トマトの果実が成熟すると、各品種から３つの植物がランダムに選択され、各植物から３つの成熟した果実が採取される。果実組織０．２ｇの重さを量り、液体窒素で粉砕し、ヘキサン：エタノール：アセトン（２：１：１、Ｖ：Ｖ：Ｖ）混合物８ｍＬを加え、室温で一晩シェーカー（１００ｒｐｍ）に置く。１ｍＬのＨ２Ｏを加え、ボルテックスし、分光光度計を使用し、対照としてヘキサンを使用し、溶媒層（上層の液体）を取り出し、５０３ｎｍでの吸光度を測定し、測定を３回繰り返す。トマト果実に含まれるリコピン含有量は以下の計算式で求められる。リコピン成分（μｇ／ｇ）＝（ｘ／ｙ）×Ａ５０３×３．１２、ここで、ｘはヘキサンの量（ｍｌ）、ｙは果実組織の重量（ｇ）、Ａ５０３は５０３ｎｍの吸光度であり、消衰係数は３．１２である。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析する。
上記で同定したＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の２つの変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２とその野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍを、２５℃、１６時間明所、８時間暗所の温室に植えた。トマトの果実が成熟すると、各品種から３つの植物がランダムに選択され、各植物から３つの成熟した果実が採取される。果実組織０．２ｇの重さを量り、液体窒素で粉砕し、ヘキサン：エタノール：アセトン（２：１：１、Ｖ：Ｖ：Ｖ）混合物８ｍＬを加え、室温で一晩シェーカー（１００ｒｐｍ）に置く。１ｍＬのＨ２Ｏを加え、ボルテックスし、分光光度計を使用し、対照としてヘキサンを使用し、溶媒層（上層の液体）を取り出し、５０３ｎｍでの吸光度を測定し、測定を３回繰り返す。トマト果実に含まれるリコピン含有量は以下の計算式で求められる。リコピン成分（μｇ／ｇ）＝（ｘ／ｙ）×Ａ５０３×３．１２、ここで、ｘはヘキサンの量（ｍｌ）、ｙは果実組織の重量（ｇ）、Ａ５０３は５０３ｎｍの吸光度であり、消衰係数は３．１２である。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析する。
【0029】
得られた結果は、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２のリコピン含有量が、対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのリコピン含有量よりも有意に高いということであった（図２）。
【0030】
（ステップ５． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子を過剰発現するトマト植物の構築）
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、製品の説明書に従って、野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの葉から全ＲＮＡを抽出する。そして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ）を使用してｃＤＮＡに逆転写する。操作方法は、製品の説明書に従う。上記で得られたｃＤＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ社製）を用いてＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をＰＣＲ増幅する。反応系の構成は製品の説明書に従って行う。ＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ２： ５’－ｃｇｇｇｇｔａｃｃＡＡＧＴＡＴＡＣＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣ－３’、Ｒ２： ５’－ａａａａｃｔｇｃａｇＧＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧＧ－３’である（下線文字は制限エンドヌクレアーゼ認識配列）。ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の予備変性、９８℃で１０秒間の変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で５分間の伸長である。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、製品の説明書に従って、野生型トマト品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの葉から全ＲＮＡを抽出する。そして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ）を使用してｃＤＮＡに逆転写する。操作方法は、製品の説明書に従う。上記で得られたｃＤＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ社製）を用いてＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子をＰＣＲ増幅する。反応系の構成は製品の説明書に従って行う。ＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ２： ５’－ｃｇｇｇｇｔａｃｃＡＡＧＴＡＴＡＣＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣ－３’、Ｒ２： ５’－ａａａａｃｔｇｃａｇＧＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧＧ－３’である（下線文字は制限エンドヌクレアーゼ認識配列）。ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の予備変性、９８℃で１０秒間の変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で５分間の伸長である。
【0031】
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５Ｓベクターを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ（ＴａＫａＲａ）で二重消化する。反応系は、Ｋｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ各１μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ（製品に付属）４μｌ、１５μｌ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５ＳベクタープラスミドおよびｄｄＨ２Ｏを４０μｌに加え、３７℃で４時間消化する。ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａｘｙｇｅｎ）を製品の説明書に従って使用して消化産物を精製する。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の増幅産物も同様の方法で精製する。Ｔ４ リガーゼ キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、上記で消化および精製したベクターとＰＣＲ産物をライゲーションする。ライゲーションシステムは次のとおりである。１μｌ消化したベクタープラスミド、２μｌ標的遺伝子フラグメント、０．５μｌ Ｔ４ リガーゼ、１μｌバッファー、およびｄｄＨ２Ｏを加え１０μｌにし、４℃で一晩（１２時間）インキュベートする。反応産物をヒートショック法によりＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、陽性クローンを得た後、バイオテクノロジー企業にシークエンスを依頼し、ベクター内の挿入断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を確認し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現ベクターを取得する。ステップ２の方法に従って、当該ベクターをトマトの野生型品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍに遺伝的に形質転換し、対応する遺伝子組換えトマト植物を取得する。
【0032】
（ステップ６． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現植物の同定）
ステップ５で得られた形質転換トマト植物の全ＲＮＡをステップ５に記載の方法に従って抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する。次に、ＴＢ ＧｒｅｅｎＴＭ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ キット（ＴａＫａＲａ）を使用してｑＰＣＲを行う。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ３： ５’－ＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＡ－３’およびＲ３： ５’－ＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧ－３’である。トマトのハウスキーピング遺伝子アクチンを内部参照として使用し、そのＰＣＲプライマーの配列はＦ４： ５’－ＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡ－３’およびＲ４： ５’－ＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣ－３’である。
ＰＣＲ反応系は次のとおりである。２μＬ ｃＤＮＡ、１０μＬ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｆ３およびＲ３プライマー（またはＦ４およびＲ４、両方の濃度は１０μＭ）それぞれμＬ、５．６ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、および０．４μＬ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ。ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＴＭ リアルタイム ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行される。実行プログラムは次のとおりである。９５°Ｃで３０秒間の予備変性；９５°で５秒間、６０°Ｃで３０秒間、４０サイクルであり、２－ΔΔＣｔ法を使用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現レベルを分析する。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析する。
ステップ５で得られた形質転換トマト植物の全ＲＮＡをステップ５に記載の方法に従って抽出し、ｃＤＮＡに逆転写する。次に、ＴＢ ＧｒｅｅｎＴＭ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ キット（ＴａＫａＲａ）を使用してｑＰＣＲを行う。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子のＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ３： ５’－ＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＡ－３’およびＲ３： ５’－ＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧ－３’である。トマトのハウスキーピング遺伝子アクチンを内部参照として使用し、そのＰＣＲプライマーの配列はＦ４： ５’－ＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡ－３’およびＲ４： ５’－ＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣ－３’である。
ＰＣＲ反応系は次のとおりである。２μＬ ｃＤＮＡ、１０μＬ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｆ３およびＲ３プライマー（またはＦ４およびＲ４、両方の濃度は１０μＭ）それぞれμＬ、５．６ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、および０．４μＬ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ。ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＴＭ リアルタイム ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行される。実行プログラムは次のとおりである。９５°Ｃで３０秒間の予備変性；９５°で５秒間、６０°Ｃで３０秒間、４０サイクルであり、２－ΔΔＣｔ法を使用して、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現レベルを分析する。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析する。
【0033】
結果を図３に示している。過剰発現系統ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２植物におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現レベルは、野生型品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの発現レベルよりもはるかに高い。
【0034】
注：常識として、内部参照の役割は次のとおりである。標的遺伝子の発現を検出する場合、異なるサンプル間のＲＮＡ収量、品質、逆転写効率の差異を排除し、標的遺伝子の特異的な発現における真の差異を取得するために、特定の内部参照遺伝子を使用する。通常、校正と標準化のために選択される。
【0035】
（ステップ７． Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現植物のリコピン含有量の決定）
ステップ４に記載の方法に従って、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２植物およびそれらの野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ果実のリコピンを測定した結果を図４に示す。過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２のリコピン含有量は、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのリコピン含有量よりも大幅に低い。
ステップ４に記載の方法に従って、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２植物およびそれらの野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ果実のリコピンを測定した結果を図４に示す。過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２のリコピン含有量は、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのリコピン含有量よりも大幅に低い。
【0036】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子の発現レベルは、リコピン含有量とその合成遺伝子の発現レベルに反比例している。
【0037】
（ステップ８． リコピン合成の重要な酵素遺伝子ＰＳＹの発現解析）
ステップ６に記載の方法に従って、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異系ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２、過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２、およびその野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの果実におけるＰＳＹ遺伝子の発現量を検出する。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析される。ＰＳＹ遺伝子のＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ５： ５’－ＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣ－３’、Ｒ５： ５’－ＣＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧ－３’である。結果を図５に示している。変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２の果実におけるＰＳＹ遺伝子発現レベルは、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのそれよりも有意に高かったのに対し、過剰発現株ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２ 植物の果実におけるＰＳＹ遺伝子の発現レベルは、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの発現レベルよりも有意に低かったことを示している。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子は、リコピン合成の重要な酵素遺伝子ＰＳＹの発現制御に関与し、それによってリコピンの生合成に影響を与えることが証明されている。
ステップ６に記載の方法に従って、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子変異系ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２、過剰発現系ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２、およびその野生型対照品種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの果実におけるＰＳＹ遺伝子の発現量を検出する。測定結果は、変異体と野生型対照間の有意差についてｔ検定を使用して分析される。ＰＳＹ遺伝子のＰＣＲプライマーの配列は、Ｆ５： ５’－ＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣ－３’、Ｒ５： ５’－ＣＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧ－３’である。結果を図５に示している。変異株ＫＯ－＃１およびＫＯ－＃２の果実におけるＰＳＹ遺伝子発現レベルは、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのそれよりも有意に高かったのに対し、過剰発現株ＯＥ－＃１およびＯＥ－＃２ 植物の果実におけるＰＳＹ遺伝子の発現レベルは、野生型Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍの発現レベルよりも有意に低かったことを示している。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００４６００遺伝子は、リコピン合成の重要な酵素遺伝子ＰＳＹの発現制御に関与し、それによってリコピンの生合成に影響を与えることが証明されている。
【0038】
最後に、上記の列挙は本発明のいくつかの特定の実施形態にすぎないことにも留意されたい。本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能であることは言うまでもない。当業者が本発明の開示から直接導出または連想できるすべての変更は、本発明の保護範囲内にあるとみなされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】