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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】マルチウェルプレート親油性アッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 21/78 20060101AFI20240725BHJP
G01N 21/03 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
G01N21/78 C
G01N21/03 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504870
(86)(22)【出願日】2022-08-02
(85)【翻訳文提出日】2024-01-25
(86)【国際出願番号】 EP2022071609
(87)【国際公開番号】W WO2023012131
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21189155.1
(32)【優先日】2021-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ルフェーブル アポリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァーグナー ビョルン
【テーマコード（参考）】
2G057
【Ｆターム（参考）】
2G057AA01
2G057AB03
2G057AC01
2G057BA03
2G057CB01
(57)【要約】
本発明は、試験化合物の親油性を決定するための方法であって、ａ）マルチウェルプレートを提供する工程であって、ウェルは底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部は、前記マルチウェルプレートの液密の底部を生成するための液密バリアを含む、工程、ｂ）工程ａ）の前記ウェル中の親油性膜に非極性溶媒を添加する工程、ｃ）前記試験化合物を含む水溶液を工程ｂ）の前記ウェルに添加する工程、およびｄ）分配平衡に達した後に前記水溶液中の前記試験化合物の量を決定する工程を含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試験化合物の親油性を決定するための方法であって、ａ）マルチウェルプレートを提供する工程であって、ウェルは底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部は、前記マルチウェルプレートの液密の底部を生成するための液密バリアを含む、工程、
ｂ）工程ａ）の前記ウェル中の親油性膜に非極性溶媒を添加する工程、
ｃ）前記試験化合物を含む水溶液を工程ｂ）の前記ウェルに添加する工程、および
ｄ）分配平衡に達した後に前記水溶液中の前記試験化合物の量を決定する工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記非極性溶媒がオクタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記親油性膜が、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択され、好ましくはＰＶＤＦ膜である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記マルチウェルプレートが９６マルチウェルプレートであり、好ましくは、前記底部で液密ホイルと、好ましくはヒートシーリングホイルと溶接されたマルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記試験化合物の親油性値ｌｏｇＤを計算する追加の工程ｅ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートであって、ウェルが前記ウェルの底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部が液密バリアを含む、マルチウェルプレート。
【請求項7】
前記親油性膜が、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択される、請求項６に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項8】
前記液密バリアが、液密ホイル、好ましくはヒートシーリングホイルである、請求項６または７に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項9】
前記親油性膜がＰＶＤＦ膜である、請求項６～８のいずれか一項に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項10】
前記マルチウェルプレートが９６ウェルプレートである、請求項６～９のいずれか一項に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項11】
前記マルチウェルプレートが、底部で液密ホイルと溶接されたマルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートである、請求項６～１０のいずれか一項に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項12】
化合物の親油性を決定するための前記方法が、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレート。
【請求項13】
マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートであって、前記プレートの底部が液密ホイル、好ましくはヒートシーリングホイルで溶接されている、マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物の親油性値の高、中および低を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
親油性は、創薬において重要な分子特性である。薬物の親油性を正確に知ることは、膜透過、溶解度、分布容積、代謝安定性およびタンパク質結合などの医薬プロセスとの相関に有用である。親油性は、ｌｏｇＰ（中性種のオクタノール－水分配係数）またはｌｏｇＤ（荷電分子のオクタノール－水分配係数）のいずれかによって表される。
【0003】
通常、親油性は、従来の振盪フラスコ法（Ｍ．Ｍ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｈ．Ｓ．Ｃｈａｄｈａ，Ｊ．Ｐ．Ｄｉｘｏｎ，およびＡ．Ｊ．Ｌｅｏ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ．Ｐａｒｔ ９．Ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ａｌｃｏｈｏｌｓ．Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７：７１２－７１６（１９９４）（非特許文献１））により決定される。手動で行う場合、この方法は非常に時間がかかる（１日当たり２～５個の化合物のみ）。しかし、迅速な類似体合成およびコンビナトリアルケミストリーのために、創薬で生成される化合物の数は劇的に増加した。この状況により、化合物の親油性を決定するための迅速かつ効率的な方法が要求されている。
【0004】
欧州特許第１７０５４７４号（特許文献１）は、２つのマルチウォールプレートからなる化合物の親油性を決定するためのアッセイ系を開示している。アッセイの完了後、溶媒中の化合物の濃度を測定し得るように、溶媒をプレートから除去しなければならない。さらに、分配平衡に達するまでアッセイ系を１２時間インキュベートしなければならない。
【0005】
したがって、迅速で実行が容易であり、低可溶性化合物の親油性の決定を可能にする方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】欧州特許第１７０５４７４号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍ．Ｍ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｈ．Ｓ．Ｃｈａｄｈａ，Ｊ．Ｐ．Ｄｉｘｏｎ，およびＡ．Ｊ．Ｌｅｏ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ．Ｐａｒｔ ９．Ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ａｌｃｏｈｏｌｓ．Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７：７１２－７１６（１９９４）
【発明の概要】
【0008】
第１の態様では、本発明は、試験化合物の親油性を決定するための方法であって、
ａ）マルチウェルプレートを提供する工程であって、ウェルは底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部は、前記マルチウェルプレートの液密の底部を生成するための液密バリアを含む、工程、
ｂ）工程ａ）の前記ウェル中の親油性膜に非極性溶媒を添加する工程、
ｃ）前記試験化合物を含む水溶液を工程ｂ）の前記ウェルに添加する工程、および
ｄ）分配平衡に達した後に前記水溶液中の前記試験化合物の量を決定する工程
を含む、方法を提供する。
ａ）マルチウェルプレートを提供する工程であって、ウェルは底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部は、前記マルチウェルプレートの液密の底部を生成するための液密バリアを含む、工程、
ｂ）工程ａ）の前記ウェル中の親油性膜に非極性溶媒を添加する工程、
ｃ）前記試験化合物を含む水溶液を工程ｂ）の前記ウェルに添加する工程、および
ｄ）分配平衡に達した後に前記水溶液中の前記試験化合物の量を決定する工程
を含む、方法を提供する。
【0009】
試験化合物の親油性を決定する方法の一実施形態では、非極性溶媒はオクタノールである。
【0010】
試験化合物の親油性を決定する方法の一実施形態では、親油性膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択され、好ましくはＰＶＤＦ膜である。
【0011】
試験化合物の親油性を決定する方法の一実施形態では、マルチウェルプレートは９６マルチウェルプレートであり、好ましくは、底部で液密ホイルと、好ましくはヒートシーリングホイルと溶接されたマルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートである。
【0012】
試験化合物の親油性を決定するための方法の一実施形態では、この方法は、試験化合物の親油性値ｌｏｇＤを計算する追加の工程ｅ）を含む。
【0013】
第２の態様では、本発明は、試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートであって、ウェルが前記ウェルの底部において親油性膜を含み、かつ前記マルチウェルプレートの底部が液密バリアを含む、マルチウェルプレートを提供する。
【0014】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、親油性膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択される。
【0015】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、液密バリアは、液密ホイル、好ましくはヒートシーリングホイルである。
【0016】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、親油性膜はＰＶＤＦ膜である。
【0017】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、マルチウェルプレートは９６ウェルプレートである。
【0018】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、マルチウェルプレートは、マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートであって、前記プレートの底部が液密ホイル、好ましくはヒートシーリングホイルで溶接されている、マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートである。
【0019】
試験化合物の親油性を決定するための方法で使用するためのマルチウェルプレートの一実施形態では、化合物の親油性を決定するための方法は、本発明の方法による方法である。
【0020】
第３の態様では、本発明は、マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートであって、前記プレートの底部がヒートシーリングホイルで溶接されている、マルチスクリーン疎水性イモビロンＰ ＰＶＤＦ膜プレートを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の詳細な説明
試験化合物は、あらゆる化学的または生物学的化合物であり得る。試験化合物は、例えば、有機化合物、タンパク質、ペプチドまたは核酸であり得る。有機化合物は、有機－無機分子も含み得る。本明細書で使用される有機－無機分子という用語は、少なくとも１つの無機原子が炭素原子に結合している有機分子を指す。無機原子は、すなわち、金属原子、例えば、ケイ素（Ｓｉ）またはゲルマニウム（有機金属、すなわち有機分子のＳｉまたはＧｅバイオイソエステル）であり得る。
試験化合物は、あらゆる化学的または生物学的化合物であり得る。試験化合物は、例えば、有機化合物、タンパク質、ペプチドまたは核酸であり得る。有機化合物は、有機－無機分子も含み得る。本明細書で使用される有機－無機分子という用語は、少なくとも１つの無機原子が炭素原子に結合している有機分子を指す。無機原子は、すなわち、金属原子、例えば、ケイ素（Ｓｉ）またはゲルマニウム（有機金属、すなわち有機分子のＳｉまたはＧｅバイオイソエステル）であり得る。
【0022】
試験化合物は、固体であっても液体であってもよい。試験化合物を水溶液に溶解する。試験化合物は、親油性化合物であっても親水性化合物であってもよい。
【0023】
本明細書で使用される場合、「マルチウェルプレート」という用語は、小さな試験管として使用される複数のウェルを有するプレートを指す。マルチウェルプレートは、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルおよび３８４ウェルプレートとして市販されている。マルチウェルプレートは、例えばポリスチレン、ポリプロピレンおよびアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）などの様々な材料で製造し得る。
【0024】
液密バリアは、好ましくは液密ホイル、好ましくはヒートシーリングホイルである。ヒートシーリングホイルするとき、シーリング材は最初にプレート上の所定位置に配置される。熱が数秒間均一に加えられ、その結果、シーリング材がプレートに結合して完全なシールが達成される。ヒートシーリングホイルは、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されている。
【0025】
本明細書で使用される場合、「非極性溶媒」という用語は、疎水性溶媒を指す。非極性溶媒は、例えば水などの極性溶媒と混和しないか、ほとんど混和しない。親油性化合物は、通常、極性溶媒よりも非極性溶媒に可溶性である傾向がある。非極性溶媒の誘電率は、通常、水よりも低い。疎水性溶媒の例は、有機溶媒、例えばオクタノールまたは脂肪族炭化水素（ドデカン、ヘキサデカンまたはハロゲン化炭化水素）である。
【0026】
水溶液は、例えば、目的のｐＨ範囲内の高い緩衝能を有する水中の緩衝塩（すなわち、ｐＨ７．４で緩衝したリン酸塩またはＴＡＰＳＯ塩の水溶液）からなり得る親水性緩衝溶液であり得る。目的のｐＨは、ｐＨ０～１４の範囲であり得、好ましくはｐＨは約７．４である。
【0027】
本明細書で使用される場合、「分配平衡」という用語は、試験化合物を含む水溶液と親油性膜に含浸させるために使用される非極性溶媒との間の分配の平衡を指す。好ましくは、分配平衡は０．１～２４時間の間に達成され、より好ましくは２時間以内に達成される。
【0028】
本明細書で使用される場合、「親油性膜」という用語は、非極性溶媒用の膜を指す。そのような膜は、親油性材料をメッシュアウトするか、または細孔を有する層として形成されてもよい。好ましくは、細孔サイズまたはメッシュサイズは、０．０１～１００μｍの範囲内である。親油性膜材料は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）またはポリカーボネート（ＰＣ）を含むが、これらに限定されない。
【0029】
親油性膜、好ましくはＰＶＤＦ膜は、膜に非極性溶媒を塗布することによって含浸させ得、それによって膜は溶媒を完全に吸収し得る。溶媒は、すなわちディスペンサーによって塗布され得る。膜の表面に０．１μｌ－５０μｌ／ｃｍ２の有機修飾剤を分注することを可能にする、例えばロボット液体処理システムなどのさらなる方法が当技術分野で知られている。
【0030】
水溶液中の試験化合物の量は、ＵＶおよび／または質量分析、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）からなる群からなるがこれらに限定されない方法によって決定し得る。
【0031】
親油性試験化合物は、例えば、多環式芳香族または脂肪族炭化水素、脂溶性ビタミン、防かび剤のような疎水性薬物、ハロゲン含有芳香族または脂肪族炭化水素、窒素および酸素含有芳香族または脂肪族炭化水素であり得る。
【0032】
非極性溶媒は、試験化合物を含む水溶液と混和しないか、またはほとんど混和しない。好ましい非極性溶媒はオクタノール（オクタン－１－オール）である。好ましい水溶液は、水であっても緩衝液であってもよい。
【0033】
試験化合物は、固体であっても液体であってもよい。試験化合物は、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの適切な溶媒に溶解し得る。親水性化合物に適した溶媒は、好ましくは極性溶媒である。親油性化合物に適した溶媒は、好ましくは非極性溶媒である。
【0034】
本発明の方法は、欧州特許第１７０５４７４号に開示された方法と比較して、以下の利点を提供する：溶媒Ｂ中の試験化合物の濃度を測定し得るようにするために、溶媒ＡおよびＢの分離は必要ない。試験化合物を含む水溶液を含むマルチウェルプレートを適切な装置に直接挿入して、分配平衡に達した後の試験化合物の濃度を測定し得る。さらに、分配平衡に達するためのインキュベーション時間は、欧州特許第１７０５４７４号の方法における１２時間と比較して約１．５時間である。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】図１：以前のＣＡＭＤＩＳ（欧州特許第１７０５４７４号明細書参照）および新規なＣＡＭＤＩＳ フィルターボトムプレート（ＦＢＰ）に使用された様々な種類のウェルのスキーム。先のＣＡＭＤＩＳでは、オクタノール（赤色）が、水溶液と接触するＤＩＦＩチューブに注がれる。ＣＡＭＤＩＳ ＦＢＰでは、フィルタはオクタノールで直接コーティングされている。
【図2】図２は、底部のウェルを密封するＰＶＤＦ膜（赤色）を有する例示的な９６－マルチウェルプレートを示す。そのようなプレートの底部は、液密ウェルを有するようにホイルと溶接されている。好ましいホイルはヒートシーリングホイルである。得られた液密９６マルチウェルプレートは、本発明の親油性方法で使用し得る。
【実施例】
【0036】
キャリア媒介分配システム（ＣＡＭＤＩＳ）フィルターボトムプレート
本発明の方法は、従来のＣＡＭＤＩＳ（Ｗａｇｎｅｒら：Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１５ Ｆｅｂ ２０；６８：６８－７７を参照されたい）のような古典的な振盪フラスコ法で使用される原理、すなわち２つの相（水性緩衝液および有機溶媒、典型的にはオクタノール）に分配する薬物の濃度比を分析する原理を保持している。本発明のＣＡＭＤＩＳ方法の設定および欧州特許第１７０５４７４号に開示されたＣＡＭＤＩＳ方法の間の主な違いは、以前に使用された２つのプレートの代わりにフィルターボトムプレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート、ＭＳＩＰＮ４５）を使用することである。この新規プレートのフィルタは、ＤＩＦＩチューブと同じ材料、すなわち疎水性ＰＶＤＦで製造されている。この疎水性材料は、オクタノール相が水相と混合するのを防ぐために使用された。膜をオクタノールでコーティングし、次いで２つの相を混合することなく水溶液で覆い得る。
本発明の方法は、従来のＣＡＭＤＩＳ（Ｗａｇｎｅｒら：Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１５ Ｆｅｂ ２０；６８：６８－７７を参照されたい）のような古典的な振盪フラスコ法で使用される原理、すなわち２つの相（水性緩衝液および有機溶媒、典型的にはオクタノール）に分配する薬物の濃度比を分析する原理を保持している。本発明のＣＡＭＤＩＳ方法の設定および欧州特許第１７０５４７４号に開示されたＣＡＭＤＩＳ方法の間の主な違いは、以前に使用された２つのプレートの代わりにフィルターボトムプレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート、ＭＳＩＰＮ４５）を使用することである。この新規プレートのフィルタは、ＤＩＦＩチューブと同じ材料、すなわち疎水性ＰＶＤＦで製造されている。この疎水性材料は、オクタノール相が水相と混合するのを防ぐために使用された。膜をオクタノールでコーティングし、次いで２つの相を混合することなく水溶液で覆い得る。
【0037】
インキュベーション時間
本発明の方法の主な利点は、新規プレートの使用により、２つの相間の交換面が以前の設定よりも大きくなることである。実際、最後のＣＡＭＤＩＳバージョンで使用されたＤＩＦＩチューブは２．３ｍｍの直径を有し、一方、新規フィルターボトムプレートは６．６ｍｍの直径を有する。したがって、２つの相間の交換に利用可能な表面がより広いため、分配の平衡に達するのに必要なインキュベーション時間は、ＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートではより短くなると予想される。
本発明の方法の主な利点は、新規プレートの使用により、２つの相間の交換面が以前の設定よりも大きくなることである。実際、最後のＣＡＭＤＩＳバージョンで使用されたＤＩＦＩチューブは２．３ｍｍの直径を有し、一方、新規フィルターボトムプレートは６．６ｍｍの直径を有する。したがって、２つの相間の交換に利用可能な表面がより広いため、分配の平衡に達するのに必要なインキュベーション時間は、ＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートではより短くなると予想される。
【0038】
ＬＣ－ＭＳ／ＵＶを使用して、広範囲のｌｏｇＤ値をカバーする３種の標準化合物のＵＶ吸収を測定した。全ての化合物を、Ｒｏｃｈｅ内部ライブラリーから貯蔵液（１０ｍＭ）として直接注文し、使用前に品質管理を無事に通過させた。種々の時点（種々のインキュベーション時間）で分析を行い、以前のＣＡＭＤＩＳ法によって決定されたｌｏｇＤ値と比較した。実験は、添付のセクション５．１．３に詳細に記載されている。図３に示される結果に基づいて、両方の相体積比について最も正確なｌｏｇＤ値を得るために、１０００ｒｐｍで振盪しながら９０分間のインキュベーション時間が推奨された。特に親水性条件下で、化合物の濃度に対する蒸発効果を測定するために、さらなる実験を行うべきである。
【0039】
ＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートプロトコル（ＣＡＭＤＩＳ ＦＢＰ）
実験の前に、オクタノール相の漏れまたは蒸発を防止するために、フィルターボトムプレートの底部をヒートシーリングホイルと溶接した。以前のＣＡＭＤＩＳバージョンと同様に、オクタノールおよびリン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）は室温で相互に飽和していた。ＤＭＳＯ貯蔵液（１０ｍＭ）として１４μＬの薬物を１２００μＬの水性緩衝液に導入した。溶液を以前のＣＡＭＤＩＳと同じ様式でフィルタにかけ、１４００μＬの最終体積に達するように２回目の希釈を行った。図４に示すプレートレイアウトに従って自動液体ディスペンサーを使用して、フィルターボトムプレートを４μＬのオクタノールでコーティングした。５０または２００μＬの濾液のアリコートをプレコートプレートに移した。基準Ｒｂは、オクタノールでコーティングされていないウェル中の１５０μＬの水性緩衝液から構成されていた。Ｒｂ基準のＲａと呼ばれる１：５希釈も行った。プレートを密封し、１０００ｒｐｍ、２１℃で９０分間振盪した。平衡水性薬物濃度をＬＣＭＳ／ＵＶによって分析した。４種の注入量（１、２、３および４μＬ）でＲｂへの数回の注入を行った。これらを使用して、ＭＳによる分析に必要な注入体積の関数のピーク面積の検量線を作成した。実際、ＵＶデータを使用する場合、ランベルト・ベールの法則は、濃度をＵＶピーク面積で置き換えることによって式２を直接使用し得るが、これがＭＳには当てはまらないように、吸収は化合物の濃度に正比例することを示している。また、ＵＶ検出は広範囲の直線性を有し、これは化合物特性とは無関係である。対照的に、使用したＭＳ法は、化合物特性に強く依存して、その読み出しに関して限られた線形性範囲を有していた。したがって、ＭＳデータを使用する場合、各化合物についてピーク面積対濃度の較正が必要であった。二次多項式関数に適合させるために、Ｒｂの４回の注入およびＲａ基準を使用して較正を行った。この式により、ＭＳピーク面積（薬物の量に比例する）の関数として注入体積を決定し得、次いで、以下のようにｌｏｇＤを計算するために物質の量の代わりに注入体積を使用した。
実験の前に、オクタノール相の漏れまたは蒸発を防止するために、フィルターボトムプレートの底部をヒートシーリングホイルと溶接した。以前のＣＡＭＤＩＳバージョンと同様に、オクタノールおよびリン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）は室温で相互に飽和していた。ＤＭＳＯ貯蔵液（１０ｍＭ）として１４μＬの薬物を１２００μＬの水性緩衝液に導入した。溶液を以前のＣＡＭＤＩＳと同じ様式でフィルタにかけ、１４００μＬの最終体積に達するように２回目の希釈を行った。図４に示すプレートレイアウトに従って自動液体ディスペンサーを使用して、フィルターボトムプレートを４μＬのオクタノールでコーティングした。５０または２００μＬの濾液のアリコートをプレコートプレートに移した。基準Ｒｂは、オクタノールでコーティングされていないウェル中の１５０μＬの水性緩衝液から構成されていた。Ｒｂ基準のＲａと呼ばれる１：５希釈も行った。プレートを密封し、１０００ｒｐｍ、２１℃で９０分間振盪した。平衡水性薬物濃度をＬＣＭＳ／ＵＶによって分析した。４種の注入量（１、２、３および４μＬ）でＲｂへの数回の注入を行った。これらを使用して、ＭＳによる分析に必要な注入体積の関数のピーク面積の検量線を作成した。実際、ＵＶデータを使用する場合、ランベルト・ベールの法則は、濃度をＵＶピーク面積で置き換えることによって式２を直接使用し得るが、これがＭＳには当てはまらないように、吸収は化合物の濃度に正比例することを示している。また、ＵＶ検出は広範囲の直線性を有し、これは化合物特性とは無関係である。対照的に、使用したＭＳ法は、化合物特性に強く依存して、その読み出しに関して限られた線形性範囲を有していた。したがって、ＭＳデータを使用する場合、各化合物についてピーク面積対濃度の較正が必要であった。二次多項式関数に適合させるために、Ｒｂの４回の注入およびＲａ基準を使用して較正を行った。この式により、ＭＳピーク面積（薬物の量に比例する）の関数として注入体積を決定し得、次いで、以下のようにｌｏｇＤを計算するために物質の量の代わりに注入体積を使用した。
【0040】
アッセイ検証
ＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートの新規な実験装置を検証するために、ＣＡＭＤＩＳの最新のバージョンで使用されたのと同じ薬物セット（Ｗａｇｎｅｒら．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，６８：６８－７７，２０１５）を使用した（表１参照）。セットは、ｐＨ７．４で振盪フラスコ法または小型振盪フラスコ法で決定した既知のｌｏｇＤ値を有する５２種の薬物でまとめた。文献平均値を取得し、各化合物について新しいＣＡＭＤＩＳ設定から得られた平均ｌｏｇＤ値と比較した。文献全体の標準偏差も追加の品質パラメータとして計算され、いくつかの化合物ではかなりのものであった。
ＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートの新規な実験装置を検証するために、ＣＡＭＤＩＳの最新のバージョンで使用されたのと同じ薬物セット（Ｗａｇｎｅｒら．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，６８：６８－７７，２０１５）を使用した（表１参照）。セットは、ｐＨ７．４で振盪フラスコ法または小型振盪フラスコ法で決定した既知のｌｏｇＤ値を有する５２種の薬物でまとめた。文献平均値を取得し、各化合物について新しいＣＡＭＤＩＳ設定から得られた平均ｌｏｇＤ値と比較した。文献全体の標準偏差も追加の品質パラメータとして計算され、いくつかの化合物ではかなりのものであった。
【0041】
測定した化合物をその文献、ならびにＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレートのｌｏｇＤ値および標準偏差と共に表１に示す。標準としてデキサメタゾンを使用して、自動液体ディスペンサーの誤差を補償するためにオクタノールの体積を調整した。次いで、全ての化合物に同じ補正体積を適用した。データ品質が不十分であるため、３種の化合物（シメチジン、ジソピラミドおよびエリスロマイシン）についてＬｏｇＤ値を計算し得なかった。以前のＣＡＭＤＩＳ法は、それらのｌｏｇＤを測定し得ず、それらの化合物の文献標準偏差は非常に高かった。
【0042】
結論
このセクションの結果は、新規なＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレート法がｌｏｇＤ値の測定のための有望な新しい方法であることを実証している。以前のＣＡＭＤＩＳ法と比較して、サンドイッチプレートの代わりに１つのフィルターボトムプレートのみを使用することにより、取り扱いが単純化されている。新規なＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレート法は、ＣＡＭＤＩＳプール法と比較してｌｏｇＤ値の８倍速い決定を可能にし、文献の振盪フラスコ値および以前のＣＡＭＤＩＳ値と非常に一致する値がもたらされる。この方法により、創薬範囲内の分子の典型的な範囲である各化合物の読み出しに応じて、－０．２～４の広い範囲のｌｏｇＤ値を測定することが可能になる。振盪フラスコ法と比較して、以前のＣＡＭＤＩＳバージョンと同様に、この方法により、相分離プロセスを削除することによってｌｏｇＤ値を得るのに必要な時間が短縮される。実際、ＣＡＭＤＩＳでは、振盪フラスコ法とは対照的に、２つの相、オクタノールおよび水性緩衝液を分離して薬物濃度を決定する必要がない。以前のＣＡＭＤＩＳプールバージョンと比較して、この方法、二相間での化合物の交換に利用可能な表面が増加するためにさらに速く、これによりインキュベーション時間が１２時間から９０分に短縮される。
このセクションの結果は、新規なＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレート法がｌｏｇＤ値の測定のための有望な新しい方法であることを実証している。以前のＣＡＭＤＩＳ法と比較して、サンドイッチプレートの代わりに１つのフィルターボトムプレートのみを使用することにより、取り扱いが単純化されている。新規なＣＡＭＤＩＳフィルターボトムプレート法は、ＣＡＭＤＩＳプール法と比較してｌｏｇＤ値の８倍速い決定を可能にし、文献の振盪フラスコ値および以前のＣＡＭＤＩＳ値と非常に一致する値がもたらされる。この方法により、創薬範囲内の分子の典型的な範囲である各化合物の読み出しに応じて、－０．２～４の広い範囲のｌｏｇＤ値を測定することが可能になる。振盪フラスコ法と比較して、以前のＣＡＭＤＩＳバージョンと同様に、この方法により、相分離プロセスを削除することによってｌｏｇＤ値を得るのに必要な時間が短縮される。実際、ＣＡＭＤＩＳでは、振盪フラスコ法とは対照的に、２つの相、オクタノールおよび水性緩衝液を分離して薬物濃度を決定する必要がない。以前のＣＡＭＤＩＳプールバージョンと比較して、この方法、二相間での化合物の交換に利用可能な表面が増加するためにさらに速く、これによりインキュベーション時間が１２時間から９０分に短縮される。
【0043】
（表１） ＣＡＭＤＩＳ ＦＢＰ ｌｏｇＤ（ｐＨ７．４）と文献の振盪フラスコｌｏｇＤ値（ｐＨ７．４）との比較。
＊２つのｌｏｇＤ値のみが利用可能である場合、標準偏差は計算されない
［１］Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．ら：Ｃａｒｒｉｅｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＡＭＤＩＳ）：Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｃｔａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６８（２０１５）６８-７７”
［１］Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．ら：Ｃａｒｒｉｅｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＡＭＤＩＳ）：Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｃｔａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６８（２０１５）６８-７７”
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】