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特表2024-528956異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）コード配列による細胞の改変
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）コード配列による細胞の改変
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240725BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240725BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240725BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240725BHJP
A61K 47/68 20170101ALN20240725BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20240725BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20240725BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61P35/00
A61K35/17
A61K48/00
A61K35/76
C12N15/12
A61K47/68
A61K39/395 T
A61K35/545
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506476
(86)(22)【出願日】2022-08-03
(85)【翻訳文提出日】2024-02-01
(86)【国際出願番号】 GB2022052048
(87)【国際公開番号】W WO2023012478
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】2111214.9
(32)【優先日】2021-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517122578
【氏名又は名称】アダプティミューン・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハミルトン ガース
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB19
4B065BB34
4B065BB37
4B065BB40
4B065BC03
4B065BC06
4B065BC07
4B065BC11
4B065BC41
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB021
4C084ZB261
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB12
4C085BB50
4C085CC03
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB02
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、細胞ゲノム内、例えば真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子内に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞及びその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞の集団を生成する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をｉＰＳＣの集団の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、及び
（ｉｉｉ）前記ｉＰＳＣの集団をＴ細胞に分化させること、
を含み、
前記遺伝子座が、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子である、前記方法。
【請求項2】
前記ＴＣＲをコードする前記異種核酸が、発現ベクター中に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記発現ベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記レンチウイルスベクターが、ＶＳＶｇ－シュードタイプ化ウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｔ細胞が、前記異種核酸によりコードされる前記ＴＣＲを発現または提示し、好ましくは前記ＴＣＲが前記細胞表面に発現または提示される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記異種核酸が、前記導入の後に、前記細胞ゲノム内の前記遺伝子座の一方または両方のアレルにまたはその中に組み込まれている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記異種核酸が、前記導入の後に、前記ＥＥＦ１Ａ１遺伝子のイントロンまたはエクソン、任意選択的に３’エクソン内に組み込まれている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記ＥＥＦ１Ａ１遺伝子のＴＡＧ終止配列前の３’エクソン内に組み込まれている、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列の組み込みが、前記導入の後に内因性ＥＥＦ１Ａ１の生成を妨害するものではない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記異種核酸の前記導入が、前記異種ＴＣＲをコードする核酸とＥＥＦ１Ａ１をコードする核酸との間に融合配列を生じさせる、好ましくは、前記異種ＴＣＲをコードする核酸と前記内因性ＥＥＦ１Ａ１をコードする核酸との間に融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロン性融合遺伝子もしくは配列を生じさせる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列によってＥＥＦ１Ａ１をコードする前記核酸に接続される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＴＣＲが、親和性増強ＴＣＲである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＴＣＲが、αβ ＴＣＲまたはγδ ＴＣＲである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を、任意選択的に、酵素切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記リボソームスキッピングを媒介する核酸配列が、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列が、フューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＣＲが、細胞によって発現される標的抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＴＣＲが、がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記腫瘍抗原が、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、またはＭＡＧＥ－Ａ４である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を、前記ｉＰＳＣの集団を造血系統細胞に分化させること、及び
前記造血系統細胞をＴ細胞に分化させること
を含む方法によってＴ細胞に分化させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を、（ｉ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を中胚葉細胞に分化させること、
（ｉｉ）前記中胚葉細胞（ＭＣ）を分化させて造血内皮細胞（ＨＥＣ）の集団を生成すること、
（ｉｉｉ）前記ＨＥＣを造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団に分化させること、
（ｉｖ）前記ＨＰＣの集団を前駆Ｔ細胞に分化させること、及び
（ｖ）前記前駆Ｔ細胞を成熟させて二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生成すること、
を含む方法によってＴ細胞に分化させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
（ｖｉ）前記Ｔ細胞を活性化及び増大させて、単一陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団または単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生成することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
中胚葉分化を促進する好適な条件下で前記ｉＰＳＣの集団を培養することにより、前記ｉＰＳＣを中胚葉細胞に分化させる、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記ｉＰＳＣが、中胚葉細胞への分化を誘導するために第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で連続的に培養される、請求項２１～２３に記載の方法。
【請求項25】
前記第１の中胚葉誘導培地が、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介シグナル伝達経路を刺激する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第１の中胚葉誘導培地が、アクチビンを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記第１の中胚葉誘導培地が、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、前記１つ以上の分化因子が、アクチビンからなる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記第２の中胚葉誘導培地が、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記第２の中胚葉誘導培地が、アクチビン、ＢＭＰ、及びＦＧＦを含む、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記第２の中胚葉誘導培地が、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、前記１つ以上の分化因子が、アクチビン、ＢＭＰ、及びＦＧＦからなる、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記第３の中胚葉誘導培地が、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害する、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記第３の中胚葉誘導培地が、アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記第３の中胚葉誘導培地が、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、前記１つ以上の分化因子が、アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤からなる、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。【請求項34】
前記中胚葉細胞が、Ｂｒａｃｈｕｒｙ＋、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ＋、Ｍｉｘｌ１＋、ＫＤＲ＋、ＦｏｘＡ２＋、ＧＡＴＡ６＋、及びＰＤＧＦαＲ＋のうちの１つ以上を示す、請求項２１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
造血内皮（ＨＥ）分化を促進する好適な条件下で前記中胚葉細胞の集団を培養することにより、前記中胚葉細胞をＨＥＣに分化させる、請求項２１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記中胚葉細胞が、ＨＥＣへの分化を誘導するためにＨＥ誘導培地で培養される、請求項２１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＨＥ誘導培地が、（ｉ）ＫＩＴ（ＫＩＴがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激する、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＨＥ誘導培地が、ＳＣＦ及びＶＥＧＦを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＨＥ誘導培地が、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、前記１つ以上の分化因子が、ＳＣＦ及びＶＥＧＦからなる、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ＨＰＣが、リンパ系分化を促進する好適な条件下で前駆Ｔ細胞に分化する、請求項２１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記ＨＰＣの集団をリンパ系増大培地で培養して前記前駆Ｔ細胞を生成することを含む方法により、前記ＨＰＣを分化させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記前駆Ｔ細胞が、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋表現型を有する、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記前駆Ｔ細胞を、Ｔ細胞の成熟を促進する好適な条件下でＴ細胞に成熟させる、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記前駆Ｔ細胞の集団をＴ細胞成熟培地で培養して前記二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することを含む方法により、前記前駆Ｔ細胞を成熟させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／または前記単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは前記単一陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離または精製することを更に含む、請求項２１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
Ｔ細胞の集団であって、Ｔ細胞受容体をコードする少なくとも１つの異種核酸を前記集団内の前記Ｔ細胞のゲノム内の遺伝子座にまたはその中に含み、前記遺伝子座が、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子である、前記集団。
【請求項47】
請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法により生成された、Ｔ細胞の集団。
【請求項48】
前記Ｔ細胞が、異種Ｔ細胞受容体を発現する、請求項４７に記載の集団。
【請求項49】
前記Ｔ細胞が、ＲＡＧ不活化されており、かつ内因性ＴＣＲを発現しない、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の集団。
【請求項50】
ｉＰＳＣの集団であって、Ｔ細胞受容体をコードする少なくとも１つの異種核酸を細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に含み、前記遺伝子座が、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子である、前記集団。
【請求項51】
請求項４６～５０のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項52】
治療方法に使用するための、請求項４６～５０のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団。
【請求項53】
がんの治療方法に使用するための、請求項４６～５０のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団。
【請求項54】
請求項４６～５０のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、がんの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞ゲノム内に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または造血系統細胞及びその使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
養子Ｔ細胞療法は、がん治療のための重要な治療的介入として広く認識されている。現在のアプローチの大部分は、自家由来または患者由来のＴ細胞を使用している。これらには、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）または親和性増強ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を発現するようにウイルスにより形質導入されたＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）またはＴ細胞が含まれる。
【0003】
自己療法の欠点の１つは、その製造に伴う複雑さである。代替となる「既製」のアプローチは、健常ドナー由来のＴ細胞またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化したＴ細胞などの同種供給源から、操作されたＴ細胞を生成することである。更に、患者は、自身のリンパ球を収集するためのアフェレーシスのスロットと、Ｔ細胞生成物が作られるまでの製造時間とを待つ必要があり、更に、患者はまたＴ細胞機能障害に罹患するおそれがあるか、または複数ラインの従来の化学療法を受け、自身のリンパ球の数及び機能が損なわれているおそれがあり、その結果、製造に利用可能な細胞の数または機能性が最初は低くなる。
【0004】
同種アプローチは、応答の改善を伴う、より機能的かつ強力な抗がん能と関連付けられたＴ細胞の表現型についてスクリーニングすることができる、均一な細胞生成物のより容易に利用可能な供給源を提供し得ることから、特に有利である。手短に述べると、患者ごとに変動しない、より規定されたＴ細胞表現型を用いることで、患者はより迅速に治療を受けることになる。遺伝子編集は、最も侵襲性及び抵抗性の高い疾患を有するはるかに幅広い患者群に対し、標準化された高品質のＴ細胞生成物に関するＴ細胞療法への迅速なアクセスを低コストで提供し得ることが予想される。
【0005】
αβＴＣＲを使用するあらゆる同種Ｔ細胞生成物には、クローンＴ細胞集団の生成が必須となる。このことは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを軽減するために必要である。ｉＰＳＣ由来のＴ細胞は一般にｉＴ細胞と称される。規定のαβＴＣＲの発現が制限されたｉＴ細胞は、特定のＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたｈｉＰＳＣのクローンから成功裏に生成された［Ｍｉｎａｇａｗａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８．２３（６）：ｐ．８５０－８５８ ｅ４］。関連研究により、分化ｉＴ細胞におけるαβＴＣＲ発現の制限がＴＣＲのアレル排除によって駆動され、これが内因性ＴＣＲ遺伝子の誤った再編成を防止することが示唆されている。しかしながら、プロモーターサイレンシング現象に起因して、レンチウイルス形質導入は、ｈｉＰＳＣ及び分化細胞における安定した導入遺伝子発現を促進するには非効率的な方法である［Ｚｏｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｉｄａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｆｒｏｍ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ，２０１１．１１７（２１）：ｐ．５５６１－７２］。加えて、Ｔ細胞を発現する組換え異種Ｔ細胞受容体に由来するＴｉＰＳＣの開発には、当初のＴ細胞材料中に存在する天然ＴＣＲの発現を防止するための追加の介入が必要となる。
【0006】
代替的アプローチは、分化ｉＴ細胞における内因性ＴＣＲの発現を防止するようにｈｉＰＳＣを遺伝子操作することである。これは、異種Ｔ細胞受容体ノックインと併せて、両方のアレルの複数の遺伝子、例えば、ＴＣＲ定常ドメイン（ＴＲＢＣ１／２及びＴＲＡＣ）または場合によってはＴＣＲ遺伝子再編成に関与する遺伝子（例えばＲＡＧ１／２）の不活化を必要とするため、困難なアプローチである。しかしながら、分化ｉＴ細胞においてＴＣＲ発現を可能にするであろう標的とすべき遺伝子座を突き止めることは困難であり、予測不能である。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、組換え異種Ｔ細胞受容体配列の標的挿入により、分化ｉＴ細胞における発現が、最小限の編集戦略を使用して可能になることを実証した。本発明の態様は、番号を付した以下の記載に提供される。
【0008】
１．細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0009】
記載１の態様の好ましい実施形態では、ゲノム内の遺伝子座は、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）をコードする遺伝子である。
【0010】
２．異種ＴＣＲをコードする前記少なくとも１つの異種核酸配列が、発現可能な異種核酸配列である、記載１に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0011】
３．前記改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞が、異種ＴＣＲをコードする核酸配列によってコードされた少なくとも１つの異種ＴＣＲを発現または提示し、好ましくは前記異種ＴＣＲが前記細胞表面に発現または提示される、記載１または記載２のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0012】
４．前記改変造血系統細胞が、前記改変ｉＰＳＣに由来する、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0013】
５．前記造血系統細胞が、
（ａ）任意選択的に中胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（別称ＦＬＫ１もしくはＶＥＧＦＲ２）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、あるいは（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、あるいは（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）任意選択的に（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、あるいは（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋であり得る、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、
（ｆ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得る、単一陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、あるいは
（ｇ）任意選択的にアルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるヘルパーＴ細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）である、成熟Ｔ細胞のいずれか１つから選択される、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）任意選択的に中胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（別称ＦＬＫ１もしくはＶＥＧＦＲ２）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、あるいは（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、あるいは（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）任意選択的に（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、あるいは（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋であり得る、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、
（ｆ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得る、単一陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、あるいは
（ｇ）任意選択的にアルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるヘルパーＴ細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）である、成熟Ｔ細胞のいずれか１つから選択される、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0014】
６．異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記細胞ゲノム内の前記遺伝子座の一方または両方のアレルにまたはその中に組み込まれている、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0015】
７．前記遺伝子座が、前記細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子である、記載６に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0016】
８．異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子に隣接してまたはその中に組み込まれている、記載７に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0017】
９．異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子のイントロンまたはエクソン、任意選択的に３’エクソン内に組み込まれている、記載７または８のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0018】
１０．異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列が、前記内因性タンパク質をコードする前記遺伝子または核酸配列のＴＡＧ終止配列前の３’エクソン内に組み込まれている、記載９に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0019】
１１．異種ＴＣＲをコードする前記異種核酸配列の組み込みが、前記内因性タンパク質の生成を妨害するものではない、記載７～１０のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0020】
１２．前記異種ＴＣＲをコードする核酸と前記内因性遺伝子をコードする核酸との間に融合配列を含む、好ましくは、前記異種ＴＣＲをコードする核酸と前記内因性タンパク質をコードする核酸との間に融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロン性融合遺伝子もしくは配列を含む、記載７～１１のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0021】
１３．前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列によって前記内因性タンパク質をコードする前記核酸に接続される、記載１２に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0022】
１４．前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を、任意選択的に、酵素切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含む、記載１２または１３のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0023】
１５．前記リボソームスキッピングを媒介する前記核酸配列が、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列である、記載１３または１４のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0024】
１６．前記酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列が、フューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲをコードする、記載１３～１５のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0025】
１７．前記異種ＴＣＲ及び前記内因性タンパク質の転写及び発現が、同じプロモーターに由来する、記載７～１６のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0026】
１８．前記異種ＴＣＲが、任意選択的に酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ、及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２ＡもしくはＰ２Ａスキップ配列を含むペプチドによって接続された、前記内因性タンパク質との融合タンパク質として発現される、記載７～１７のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0027】
１９．前記異種ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む新生異種ＴＣＲとして前記細胞内で発現及び／または提示され、好ましくは前記細胞表面で発現及び／または提示される、記載１～１８のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0028】
２０．前記内因性タンパク質が、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１である、記載７～１９のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0029】
２１．前記内因性タンパク質が、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１である、記載３～２０のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0030】
２２．前記遺伝子座が、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１をコードする遺伝子であるかまたはその中にあり、任意選択的に、前記遺伝子座が、前記真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいは前記ＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／または前記ＴＡＧ終止コドンの前にある、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0031】
２３．前記遺伝子座が、第６染色体上のＥＥＦ１Ａ遺伝子であるかまたはその中にある、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0032】
２４．前記組み込みが、前記ＥＥＦ１Ａ１遺伝子のエクソン８におけるもの、任意選択的に、前記ＴＡＧ終止コドンの前におけるもの、あるいは前記ＴＡＧ終止コドンに直接隣接したもの及び／または前記ＴＡＧ終止コドンの前におけるものである、記載２３に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0033】
２５．前記融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロン性融合遺伝子もしくは配列が、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸及びＥＥＦ１Ａ１をコードする核酸を、酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含み、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸配列が、前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を、酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び好ましくはＴ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含む、記載１２～２４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0034】
２６．前記異種ＴＣＲが、
（ａ）がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは
（ｂ）がん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原
から選択される抗原またはそのペプチド抗原に結合するかまたは特異的に結合する、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは
（ｂ）がん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原
から選択される抗原またはそのペプチド抗原に結合するかまたは特異的に結合する、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0035】
２７．前記がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原が、
（ａ）がん精巣抗原、
（ｂ）ＭＡＧＥ抗原、
（ｃ）ＭＡＧＥ Ａ４もしくはそのペプチド抗原、任意選択的に配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号２）を含むペプチド抗原、または
（ｄ）ＡＦＰもしくはそのペプチド抗原、任意選択的に配列ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むペプチド抗原
から選択される、記載２６に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）がん精巣抗原、
（ｂ）ＭＡＧＥ抗原、
（ｃ）ＭＡＧＥ Ａ４もしくはそのペプチド抗原、任意選択的に配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号２）を含むペプチド抗原、または
（ｄ）ＡＦＰもしくはそのペプチド抗原、任意選択的に配列ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むペプチド抗原
から選択される、記載２６に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0036】
２８．前記がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原が、ペプチド提示分子、任意選択的に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、任意選択的にクラスＩまたはクラスＩＩ、任意選択的にＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体を形成している、記載２６または２７のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0037】
２９．前記異種ＴＣＲが、
（ａ）配列番号９もしくは配列番号６のアミノ酸残基１～１３６の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号１０もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン、あるいは
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン
を有するＴＣＲを含む、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）配列番号９もしくは配列番号６のアミノ酸残基１～１３６の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号１０もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン、あるいは
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファ鎖可変ドメイン、及び／または配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２の配列に対する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むベータ鎖可変ドメイン
を有するＴＣＲを含む、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0038】
３０．前記ｉＰＳＣまたは造血系統細胞が、更に、異種補助受容体をコードする核酸を含み、及び／または前記異種補助受容体を発現もしくは提示し、任意選択的に、前記補助受容体がＣＤ８補助受容体である、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0039】
３１．前記異種ＣＤ８補助受容体が、ヘテロ二量体またはホモ二量体、ＣＤ８αｂヘテロ二量体またはＣＤ８ααホモ二量体である、記載３０に記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0040】
３２．前記異種ＣＤ８補助受容体が、
（ａ）アミノ酸配列ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＬＳＱＮＫＰＫ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＮＳＩＭ（配列番号１９）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ３、または
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸番号２２～２３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、記載３０または３１のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）アミノ酸配列ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＬＳＱＮＫＰＫ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＮＳＩＭ（配列番号１９）に対して少なくとも８０％の配列同一性であるＣＤＲ３、または
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸番号２２～２３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、記載３０または３１のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0041】
３３．前記ｉＰＳＣまたは造血系統細胞が、更に、異種共刺激リガンド（任意選択的に４－１ＢＢＬもしくはＣＤ８０）をコードする核酸を含み、及び／または異種共刺激リガンド（任意選択的に４－１ＢＢＬもしくはＣＤ８０）を発現もしくは提示する、先行する記載のいずれかに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0042】
３４．前記ｉＰＳＣまたは造血系統細胞及び／または前記異種ＴＣＲの、前記がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは記載２６～２８のいずれかに記載のがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原を発現または提示するがん及び／または腫瘍細胞または組織への結合が、任意選択的に、
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、またはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上のアップレギュレーション、
（ｃ）前記抗原または抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性の誘導、あるいは
（ｄ）前記抗原または抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を殺傷する能力、
のうちのいずれか１つ以上によって決定される前記ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の活性化を誘導する、記載１～３３のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、またはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上のアップレギュレーション、
（ｃ）前記抗原または抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性の誘導、あるいは
（ｄ）前記抗原または抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を殺傷する能力、
のうちのいずれか１つ以上によって決定される前記ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の活性化を誘導する、記載１～３３のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞。
【0043】
３５．先行する記載のいずれかに記載の異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、前記異種ＴＣＲをコードする前記核酸領域を組み込むための前記細胞ゲノム内の前記遺伝子座にある核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む、核酸コンストラクトまたはベクター。
【0044】
３６．前記遺伝子座が、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１をコードする遺伝子であるかまたはその中にあり、任意選択的に、前記遺伝子座が、前記真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいは前記ＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／または前記ＴＡＧ終止コドンの前にある、記載３５に記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0045】
３７．前記遺伝子座が、第６染色体上の前記ＥＥＦ１Ａ１遺伝子であるかまたはその中にある、記載３５または３６のいずれかに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0046】
３８．前記遺伝子座が、前記ＥＥＦ１Ａ１遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、前記ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいは前記ＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／または前記ＴＡＧ終止コドンの前にある、記載３５～３７のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0047】
３９．前記異種ＴＣＲをコードする核酸が、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を、任意選択的に、酵素切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列、好ましくはフューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ、及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２ＡもしくはＰ２Ａスキップ配列とともに含む、記載３５～３８のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0048】
４０．前記コンストラクトまたはベクターが、前記異種ＴＣＲをコードする核酸領域を組み込むための前記細胞ゲノム内の前記遺伝子座にある前記核酸領域にそれぞれ相同でありかつ組み込み部位の反対側に隣接する、左側及び右側相同領域を含む、記載３５～３９のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0049】
４１．前記コンストラクトまたはベクターが、
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、例えば配列番号４８の配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、任意選択的にネオマイシン耐性遺伝子、好ましくは、プロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現されるもの、例えば配列番号４７の配列、のいずれか１つ以上を更に含む、記載３５～４０のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、例えば配列番号４８の配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、任意選択的にネオマイシン耐性遺伝子、好ましくは、プロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現されるもの、例えば配列番号４７の配列、のいずれか１つ以上を更に含む、記載３５～４０のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0050】
４２．前記コンストラクトまたはベクターが、配列番号４５の配列を含む前記異種ＴＣＲ、配列番号４３及び配列番号４４の配列を含む相同領域、配列番号４８を含む組換え標的配列、ならびに配列番号４７及び配列番号４９を含む発現可能な選択マーカー配列、をコードするヌクレオチド配列を含む、記載３５～４１のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクター。
【0051】
４３．記載３５～４２のいずれか１つに記載の核酸コンストラクトまたはベクターを、未改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞（任意選択的に記載５で定義されたとおりのもの）に、前記細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に前記異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列の組み込みを可能にする条件下で導入すること、及び任意選択的に、前記改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を単離すること、を含む、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を生成するプロセス。
【0052】
４４．記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【0053】
４５．療法及び／または医療に使用するための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、または記載４４に記載の医薬組成物。
【0054】
４６．個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、予防、または進行の遅延に使用するための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物であって、任意選択的に、前記治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である、前記改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または前記医薬組成物。
【0055】
４５．個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療するための医薬を製造する際の、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物の使用であって、任意選択的に、前記治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である、前記使用。
【0056】
４６．個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させる方法であって、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含み、任意選択的に、前記治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である、前記方法。
【0057】
４７．前記がん及び／または腫瘍が固形腫瘍である、記載４５に記載の使用または記載４６の方法における使用のための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物。
【0058】
４８．前記改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または医薬組成物が、任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、または組み合わせて使用される、記載４５に記載の使用または記載４６の方法における使用のための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物。
【0059】
４９．（ａ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、あるいは
（ｂ）任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせた、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、を含む、キット。
（ｂ）任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせた、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、記載１～３４のいずれか１つに記載の改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または記載４４に記載の医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、を含む、キット。
【0060】
記載１～４９のいずれか１つの態様のいくつかの好ましい実施形態では、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、Ｔ細胞、例えばＤＰ Ｔ細胞、ＳＰ Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞である。
【0061】
５０．Ｔ細胞の集団を生成する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をｉＰＳＣの集団の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、及び
（ｉｉｉ）前記ｉＰＳＣの集団をＴ細胞に分化させること、を含む、前記方法。
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をｉＰＳＣの集団の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、及び
（ｉｉｉ）前記ｉＰＳＣの集団をＴ細胞に分化させること、を含む、前記方法。
【0062】
記載５０の態様の好ましい実施形態では、ゲノム内の遺伝子座は、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）をコードする遺伝子である。
【0063】
本発明の他の態様及び実施形態については、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1】ＥＥＦ１ａの染色体上の位置。ヒトＥＥＦ１ａは第６染色体上に位置し、８つのエクソンで構成される。
【図2】ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ノックイン戦略及びＰＣＲスクリーニング戦略。標的化戦略は、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲをＥＥＦ１ａ１にノックインするように設計した。編集はＡＡＶで実施した。ｒＡＡＶ修復鋳型内の相同アームは、終止コドンの上流及び下流の５００ｂｐのゲノム配列に対応する。編集により、ＥＥＦ１ａとＡＤＰ Ａ２Ｍ４との間にマルチシストロン性融合物が作り出され、各ポリペプチドコード配列はフューリン切断部位（ＲＡＫＲ）及び２Ａスキップペプチドで分離されている（ＥＥＦ１Ａ１＿ＦｕＴ２Ａ＿ＴＣＲα＿ＦｕＰ２Ａ＿ＴＣＲβ）。この設計により、単一の編集アレルから３つのポリペプチド全ての発現が可能になる。この耐性カセットは、ＥＦ１ＡプロモーターＰＣＲスクリーニング戦略から構成的に発現されるＬＯＸＰ隣接ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する。編集クローンを、９６ウェルプレートでの限界希釈により単離した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）を使用してｇＤＮＡの試料を各クローンから単離した。相同アーム領域外及び導入遺伝子カセット内のプライマーを用いて、ＰＣＲによってクローンをスクリーニングした。ＬＨＡ境界ＰＣＲを、プライマー１８２４及び１８２５を使用して実施した。ＲＨＡ境界ＰＣＲをプライマー２２９４及び２２９５を用いて実施し、ＰＣＲ産物を配列決定した。４つのクローン、すなわち５Ｆ４、５Ｈ４、３Ｄ１０，及び４Ｂ１１を分化へと進めた。
【図3】ｉＰＳＣクローンＴ１Ｅ８におけるＲＡＧ１ノックアウトの遺伝子型（Ｂ２Ｍ ＨＳＶ－ＴＫ／ＨＬＡ－Ｅ ＥＥＦ１Ａ１＋／Ａ２Ｍ４ ＲＡＧ１－／－）。一方のアレルが単一ヌクレオチド欠失を含有するのに対し、２番目のアレルは１３ヌクレオチドの欠失を含有する。両方の編集により、ＲＡＧ１のコード配列にフレームシフトが生じる。編集の標的となる配列の領域を強調表示している。
【図4】編集ｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞の表現型（第５段階）：分化は編集の影響を受けない。編集クローンはＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現する。細胞の表現型をＦＡＣＳにより決定し、抗Ｖα２４抗体及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＭＡＧＥ－４デキストラマーで染色することによりＡ２Ｍ４発現を測定した。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を促進するには、単一アレルにおけるノックインで十分である。
【図5】編集ｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は特異的かつ強力な細胞溶解エフェクター機能を示す：ｉＴ細胞の細胞溶解機能をＫＩＬＲアッセイで評価した。Ｔ２細胞を、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶで濃度を漸減させながら（１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ）パルス処理し、編集クローンから分化させたｉＴ細胞とともにインキュベートした。
【図6】編集ｉＰＳＣクローンから分化したＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞（クローン３Ｅ１０）の表現型（第６段階）：分化は編集の影響を受けない。編集クローンはＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現する。細胞の表現型をＦＡＣＳにより決定した。細胞は、編集クローンがＣＤ８ Ｔ細胞に分化する能力を示す。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を促進するには、単一アレルにおけるノックインで十分である。
【図7】編集ｉＰＳＣクローンから分化したＲＡＧ１－／－ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞（クローンＴ１Ｅ８）の表現型（第６段階）：分化はＲＡＧ１の除去の影響を受けず、細胞はＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲを発現することができた。細胞の表現型をＦＡＣＳにより決定した。細胞は、編集クローンがＣＤ８ Ｔ細胞に分化する能力を示す。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を促進するには、単一アレルにおけるノックインで十分である。
【図8】時間分解した細胞傷害性アッセイにおけるＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞による標的細胞殺傷動態。左パネルは、ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞（ｃ３Ｅ１０）が、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下または非存在下で、対照と比較してＡ３７５黒色腫（抗原陽性）標的細胞中でアポトーシスを誘導する能力が増加していることを示す。右パネルは、ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞（ｃ３Ｅ１０）が、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下で、対照と比較してＣＯＬＯ２０５（抗原陰性）標的細胞中でアポトーシスを誘導する能力が増加しているが、このペプチドの非存在下ではそうではないことを示す。
【図9】時間分解した細胞傷害性アッセイにおけるＲＡＧ－／－ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ｉＴ細胞による標的細胞殺傷動態。左パネルは、ＲＡＧ－／－ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ｉＴ細胞（Ｔ１Ｅ８）が、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下または非存在下で、対照と比較してＡ３７５黒色腫（抗原陽性）標的細胞中でアポトーシスを誘導する能力が増加していることを示す。右パネルは、ＲＡＧ－／－ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ｉＴ細胞（Ｔ１Ｅ８）が、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下で、対照と比較してＣＯＬＯ２０５（抗原陰性）標的細胞中でアポトーシスを誘導する能力が増加しているが、このペプチドの非存在下ではそうではないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0065】
本発明の態様及び実施形態を、添付図面を参照してここで考察する。
【0066】
本発明によれば、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または造血系統細胞が提供される。
【0067】
異種ＴＣＲをコードする核酸配列を遺伝子座に組み込むことにより、異種ＴＣＲを発現する細胞を一貫して作製することができ、ランダム挿入によって作製される細胞と比較して、スクリーニングの必要性が低減する。
【0068】
細胞ゲノム内の遺伝子座は、伸長因子複合体のメンバーをコードする遺伝子であるかまたはその中にある。好ましくは、伸長因子複合体は、翻訳伸長因子、最も好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）である。いくつかの特に好ましい実施形態では、遺伝子座は、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいはＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／またはＴＡＧ終止コドンの前にある。エクソン８は、ヒトＥＥＦ１Ａ１遺伝子の最後のエクソンであり、ＴＧＡ終止コドンの前に４０個の完全コドンを含む。いくつかの実施形態では、組み込み（挿入）遺伝子座は、ＥＥＦ１Ａ１遺伝子の最後の非終止コドンと終止コドンとの間にあり得る。他の実施形態では、組み込み遺伝子座は、エクソン８内の非終止コドンのうちの１つの内部に、またはエクソン８内の２つの隣接する非終止コドンの間にあり得る。そのような組み込みは、転写されたｍＲＮＡから下流の内因性コドンの欠失をもたらし得る。但し、欠失した配列が短い場合（例えば１～１０個の非終止コドン）、Ｃ末端断片のそのような短い欠失は、ＥＥＦ１Ａ１タンパク質の活性に影響を及ぼさない場合がある。いくつかの実施形態では、欠失した非終止コドン（完全または部分的のいずれであるかを問わない）は、挿入された異種核酸のＮ末端に含まれ得るため、非終止コドンは転写物にインフレームで含まれる。
【0069】
他の実施形態では、トランケート型ＥＥＦ１Ａ１転写物が、欠失部分を含むように設計された挿入された異種核酸とともに機能的なＥＥＦ１Ａ１タンパク質を合わせて発現する限り、組み込み遺伝子座は、ＥＥＦ１Ａ１遺伝子の上流エクソン、例えば、エクソン７、エクソン６、エクソン５、エクソン４、エクソン３、エクソン２、またはエクソン１のうちの１つにあり得る。
【0070】
ＥＥＦ１Ａ１遺伝子座での組み込みが、異種核酸配列によってコードされる異種ＴＣＲの一貫した高レベルの発現をもたらすことが本明細書で示される。
【0071】
伸長因子複合体のメンバーの他の例としては、例えば、ＥＥＦ１Ａ２（伸長因子１－アルファ２；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９１７）、ＥＥＦ１Ａ１Ｐ４３（真核生物翻訳伸長因子１アルファ１偽遺伝子４３；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９１８）、ＥＥＦ１Ｂ２（伸長因子１－ベータ；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３３）、ＥＥＦ１Ｂ２Ｐ１（真核生物翻訳伸長因子１ベータ２偽遺伝子１；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３２）、ｅＥＦ１Ｂ１（真核生物翻訳伸長因子１ベータ２偽遺伝子１；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３２）、ＥＥＦ１Ｂ２Ｐ２（真核生物翻訳伸長因子１ベータ２偽遺伝子２；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３４）、ＥＥＦ１Ｂ２Ｐ３（真核生物翻訳伸長因子１ベータ２偽遺伝子３；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：６４４８２０）、ＥＥＦ１Ｇ（伸長因子１－ガンマ；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３７）、ＥＥＦ１Ｄ（伸長因子１－デルタ；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３６）、ＥＥＦ１Ｅ１（真核生物翻訳伸長因子１イプシロン－１；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：９５２１）、ＶＡＲＳ（バリル－ｔＲＮＡ合成酵素；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：７４０７）、ＥＥＦ２（真核生物伸長因子２；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９３８）、及びＥＩＦ５Ａ（真核生物翻訳開始因子５Ａ－１；ヒト遺伝子のＥｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１９８４）が挙げられる。
【0072】
いくつかの実施形態では、組み込み遺伝子座は、最後のエクソン、例えば、最後の非終止コドンと終止コドンとの間にあり、あるいは上で説明したように、組み込み遺伝子座は、好ましくはその遺伝子座での遺伝子の発現及び活性を妨げずに、最後のエクソン内のより上流にあり得るか、または上流エクソンにあり得る。
【0073】
異種ＴＣＲをコードする核酸配列を遺伝子座に組み込むことにより、伸長因子複合体のメンバーをコードする核酸配列と異種ＴＣＲをコードする核酸配列とを含むマルチシストロン性融合物を作製することができる。マルチシストロン性融合物は、伸長因子複合体のメンバー及び異種ＴＣＲのマルチシストロン性融合物からの発現を可能にする１つ以上の更なる核酸配列を含み得る。例えば、マルチシストロン性融合物は、酵素切断部位をコードする核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列を１つ以上含み得る。
【0074】
異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、発現可能な異種核酸配列であり得る。例えば、異種核酸配列は、１つ以上のコーディング遺伝子または１つ以上のコーディングオープンリーディングフレーム及び／または細胞内での１つ以上のコーディング遺伝子または１つ以上のコーディングオープンリーディングフレームの発現を可能にすること及び／または調節することができる１つ以上の調節核酸配列を含み得る。好適な調節核酸配列には、コーディング遺伝子（複数可）またはオープンリーディングフレームの転写及び／または転写後修飾及び／または翻訳を可能にする配列が含まれる。好適な調節配列は、転写または翻訳開始、停止、または終結配列、オペレーター配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、末端反復、リボソーム結合部位、キャップ配列、及びポリＡテール配列のいずれかを含み得る。
【0075】
本明細書に記載される技術は、異種／外因性ＴＣＲを発現する細胞の生成に限定されず、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの他の治療用タンパク質を発現する細胞の生成に適合され得る。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、一般にＣＡＲ－Ｔ細胞と称される。ＣＡＲを発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、一般にＣＡＲ－ＮＫ細胞と称される。ＣＡＲを発現するマクロファージは、一般にＣＡＲ－マクロファージと称される。記載されているように、１つ以上のプロテアーゼ切断部位（複数可）とＣＡＲ分子とを含む融合タンパク質をコードする異種核酸を、ｉＰＳＣなどの標的細胞に組み込むことができ、次いで標的免疫細胞に分化させることができる。あるいは、組み込みは、免疫細胞で直接行うことができる。
【0076】
「改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞」という用語は、本明細書では、ＥＥＦ１Ａ１遺伝子座に異種核酸を導入するように改変された、分化の任意の段階にある細胞を説明するために使用され得る。例えば、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、ｉＰＳＣ、中胚葉細胞、造血内皮細胞、造血前駆細胞、前駆Ｔ細胞、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、単一陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、及び成熟Ｔ細胞からなる群から選択される細胞であり得る。好ましくは、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、異種ＴＣＲをコードする配列によってコードされた少なくとも１つの異種ＴＣＲを発現または提示し、好ましくは異種ＴＣＲは細胞表面に発現または提示される。好ましくは、少なくとも１つの異種ＴＣＲは、膜結合型機能的ＴＣＲ、好ましくは膜固定型ヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質、好ましくはアルファ：ベータＴＣＲ（任意選択的にガンマ：デルタ）として細胞表面に提示され、好ましくは可変アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖を含み、好ましくはインバリアントＣＤ３鎖分子との複合体として発現される。好ましくは、少なくとも１つの異種ＴＣＲは、がん抗原及び／または腫瘍抗原またはそのペプチドに、及び／または腫瘍細胞及び／またはがん細胞（例えば、がん抗原及び／または腫瘍抗原またはそのペプチドを発現するもの）に、及び／またはそれらに由来するペプチドもしくは抗原性ペプチドに、結合するまたは特異的に結合することができる。好ましくは、ＴＣＲの結合は、本明細書に記載される改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞の活性化、及び／または本明細書に記載されるＴ細胞活性の活性化を促進する。
【0077】
本発明によれば、改変造血系統細胞、好ましくはＴ細胞は、改変ｉＰＳＣに由来し得る。例えば、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含むように未改変ｉＰＳＣを改変または操作して（例えば、組換え操作して）、例えば、後に改変造血系統細胞に分化し得る改変人工多能性幹細胞を生成することができる。あるいは、未改変造血系統細胞は、例えば分化プロセスによって未改変ｉＰＳＣから得てもよく、次いで、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込まれた異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含むように改変または操作してもよい。
【0078】
「ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞」または「改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞」は、以下のいずれか１つから選択され得る：
（ａ）任意選択的に中胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（別称ＦＬＫ１もしくはＶＥＧＦＲ２）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、あるいは（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、あるいは（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）任意選択的に（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、あるいは（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋であり得る、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、
（ｆ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得る、単一陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、
（ｇ）任意選択的にアルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるヘルパーＴ細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）である、成熟Ｔ細胞、あるいは
（ｈ）任意選択的にヒトｉＰＳＣに由来するかまたはＣＤ３４＋前駆細胞から作り出され、任意選択的に臍帯血から単離され、更に任意選択的にｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用する、ｉＰＳＣ。
（ａ）任意選択的に中胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ（別称ＦＬＫ１もしくはＶＥＧＦＲ２）、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、またはＰＤＧＦアルファＲのうちのいずれか１つ以上を発現し得る、中胚葉細胞、
（ｂ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、または（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、または（ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－（ＣＤ１８４－）であり得る、造血内皮細胞、
（ｃ）任意選択的に（ａ）ＣＤ３４＋、あるいは（ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、あるいは（ｃ）ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ＋、ＣＤ３８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ３４＋及び／またはＣＤ４５＋、（ｄ）ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＦＬＫ１＋、ＣＤ３８－であり得る、造血前駆細胞、
（ｄ）任意選択的に（ａ）ＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋、あるいは（ｂ）ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３－、ＣＤ４－、ＣＤ８－のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ５＋及び／またはＣＤ７＋であり得る、前駆Ｔ細胞、
（ｅ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋ＣＤ８＋であり得る、二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ Ｔ細胞）、
（ｆ）任意選択的に（ａ）ＣＤ４＋、（ｂ）ＣＤ８＋、（ｂ）ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５＋のうちのいずれか１つ以上と組み合わせたＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得る、単一陽性Ｔ細胞（ＳＰ Ｔ細胞）、
（ｇ）任意選択的にアルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋であるヘルパーＴ細胞（ＴＨ）、ＣＤ８＋である細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）である、成熟Ｔ細胞、あるいは
（ｈ）任意選択的にヒトｉＰＳＣに由来するかまたはＣＤ３４＋前駆細胞から作り出され、任意選択的に臍帯血から単離され、更に任意選択的にｐＥＢ－Ｃ５及びｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用する、ｉＰＳＣ。
【0079】
したがって、ｉＰＳＣは、好ましくはＣＤ３４＋前駆細胞に由来するかまたはそれから作り出され、任意選択的に好ましくは臍帯血から単離され、更に任意選択的にｐＥＢ－Ｃ５及び／またはｐＥＢ－ＴＧエピソームプラスミドを使用して単離される、ヒトｉＰＳＣである。
【0080】
本発明のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、例えばＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２遺伝子の不活化またはノックアウトによって、ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２の発現を低減または消失させるように改変され得る。ＲＡＧ１及びＲＡＧ２のノックアウトは、フレームシフトまたは終止コドンなどの好適な不活化変異を導入するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む任意の好適な遺伝子編集技法によって達成され得る。
【0081】
改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及びそれらの前駆体（胚性幹細胞を含む）などのリンパ系統の細胞、ならびに多能性幹細胞（例えば、リンパ系細胞に分化し得る細胞）であり得る。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、細胞性免疫を主に担い、また適応免疫系にも関与するリンパ球であり得る。本発明によれば、Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）を含む）、ならびに２種類のエフェクターメモリーＴ細胞、例えば、ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞、制御性Ｔ細胞（別称サプレッサーＴ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ならびにガンマ－デルタＴ細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0082】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することができるＴリンパ球のサブセットである。好ましくは、Ｔ細胞は、任意選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそのようなＴ細胞、任意選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団、またはＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合集団である。
【0083】
異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞ゲノム（すなわちｉＰＳＣまたは造血系統細胞のゲノム）内の遺伝子座にまたはその中に組み込まれ得る。遺伝子座は、例えば特定の遺伝子または遺伝子マーカーが位置している、染色体上の特定位置及び／または固定位置であり得、遺伝子座は、遺伝子または遺伝子マーカーまたは遺伝子エレメントの特定位置及び／または固定位置、及び／または遺伝子もしくは遺伝子の遺伝子エレメント内の特定の固定位置、例えば、遺伝子のイントロンもしくはエクソンまたは遺伝子の調節エレメントなど（例えば、転写もしくは翻訳開始、停止、もしくは終結配列、オペレーター配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、末端反復、リボソーム結合部位、キャップ配列、ポリＡテール配列）であり得る。
【0084】
異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞ゲノム内の遺伝子座の一方または両方のアレルにまたはその中に組み込まれ得る。例えば、遺伝子座が、遺伝子または内因性遺伝子、または染色体上の特定位置及び／または固定位置、及び／またはｉＰＳＣまたは造血系統細胞の特定の遺伝子または内因性遺伝子が位置する位置である場合、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、遺伝子座のいずれか一方または両方のアレルに組み込まれ得る。
【0085】
したがって、遺伝子座は、細胞またはｉＰＳＣまたは造血系統細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子であり得るか、またはその遺伝子内にあり得る。
【0086】
異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞またはｉＰＳＣまたは造血系統細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子に隣接して組み込まれ得るかまたはその中に組み込まれ得る。任意選択的に、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、細胞またはｉＰＳＣまたは造血系統細胞の内因性タンパク質をコードする遺伝子または核酸配列のイントロンまたはエクソン、任意選択的に５’エクソンまたは３’エクソン、好ましくは３’エクソン内に組み込まれ得る。
【0087】
異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列は、内因性タンパク質をコードする遺伝子のＴＡＧ終止配列前の３’エクソン内に組み込まれ得る。好ましくは、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列の組み込みは、内因性タンパク質の生成を妨害するものではない。例えば、改変細胞による内因性タンパク質の生成は、天然タンパク質と同等に翻訳及び／または生成及び／またはプロセシングされ得る内因性タンパク質配列の全てまたは実質的に全てを提供すべきである。例えば、内因性タンパク質をコードする遺伝子は尚も、転写及び／または転写後プロセシング及び／または翻訳を行って、任意選択的に細胞内で翻訳後にプロセシング及び／または輸送され得る、内因性タンパク質配列または実質的に全ての内因性タンパク質配列を生成することができる。好ましくは、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列の組み込みは、内因性タンパク質をコードする遺伝子の欠失または置換、及び／または生成された内因性タンパク質の欠失及び／または不活化を生じさせず、組み込みは、任意選択的に融合遺伝子が生じる及び／または遺伝子産物が融合タンパク質として生成されるように、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列と内因性タンパク質をコードする核酸配列または遺伝子との連結を生じさせ得る。
【0088】
改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、異種ＴＣＲをコードする核酸と内因性タンパク質をコードする核酸との間の融合配列、例えば、異種ＴＣＲをコードする核酸の組み込みによって作製されたもの、例えば、異種ＴＣＲをコードする核酸と内因性タンパク質をコードする核酸との間の融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロン性融合遺伝子もしくは配列を含み得、例えば、異種ＴＣＲの発現は、内因性タンパク質の発現に関連付けられており、及び／または異種ＴＣＲは、遺伝子座にある遺伝子の遺伝子産物、例えば内因性遺伝子をコードする核酸と、共転写及び／または共翻訳及び／または共発現され得る。
【0089】
したがって、本発明は、異種ＴＣＲをコードする核酸が、酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列によって内因性タンパク質をコードする核酸に接続され得る、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を提供する。
【0090】
したがって、本発明は、異種ＴＣＲをコードする核酸が、酵素切断部位を含むペプチドをコードする少なくとも１つの、任意選択的に２つの核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する少なくとも１つの、任意選択的に２つの核酸配列によって内因性タンパク質をコードする核酸に接続され得る、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を提供する。リボソームスキッピングを媒介する核酸配列は、Ｔ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列のいずれかであり得る。酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列は、フューリン切断部位をコードすることができ、コードされるフューリン部位の配列は、好ましくはＲＡＫＲであり得る。
【0091】
異種ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖のコード配列を、任意選択的に、酵素切断部位を含むペプチドをコードする少なくとも１つの、任意選択的に２つの介在核酸配列、及び／またはリボソームスキッピングを媒介する少なくとも１つの、任意選択的に２つの核酸配列とともに含み得る。リボソームスキッピングを媒介する核酸配列は、Ｔ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列のいずれかであり得る。酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列は、フューリン切断部位をコードし得る。コードされるフューリン部位の配列は、好ましくはＲＡＫＲであり得る。
【0092】
したがって、本発明による異種ＴＣＲ及び改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の内因性タンパク質の転写及び／または発現は、同じプロモーターに由来し得る。したがって、異種ＴＣＲをコードする異種核酸配列及び内因性タンパク質をコードする核酸配列または遺伝子は、転写及び／または転写後修飾もしくは共転写修飾及び／または翻訳について同じ調節配列、本明細書で言及される調節配列を共有し得る。転写後修飾または共転写は、転写後のＲＮＡ一次転写物をプロセシングして成熟した機能的ＲＮＡ分子を生成することを含み得、及び／またはｍＲＮＡプロセシング及び／または５’プロセシング及び／またはキャッピング及び／または３’プロセシング及び／または切断及びポリアデニル化及び／またはイントロンスプライシング及び／またはヒストンｍＲＮＡプロセシングのいずれかを含み得る。
【0093】
本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、任意選択的に酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲ、及び／またはリボソームスキップ配列、好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列を含むペプチドによって接続された、内因性タンパク質との融合タンパク質として発現される異種ＴＣＲを含み得る。
【0094】
したがって、融合タンパク質は、任意選択的に、細胞の小胞体内で任意選択的に実施される、酵素切断部位もしくはフューリン切断部位の切断により及び／またはスキップ配列ペプチドの除去により、新生の、遊離の、または天然の異種ＴＣＲを放出するように細胞内でプロセシングされ得る。
【0095】
本発明は、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞を提供し、異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む新生異種ＴＣＲとして細胞内で発現及び／または提示され、好ましくは細胞表面で発現及び／または提示される。新生タンパク質は、例えば、細胞小胞体またはゴルジなどの細胞内における翻訳後プロセシングの際に融合タンパク質から（それにより内因性タンパク質から）分離され得、次いで任意選択的に、膜結合型機能的ＴＣＲ、好ましくは膜固定型ヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質、好ましくはアルファ；ベータＴＣＲとして細胞表面に輸送及び／または提示され、これらＴＣＲは任意選択的に、がん抗原及び／または腫瘍抗原またはそのペプチドに、及び／または腫瘍細胞及び／またはがん細胞及び／または腫瘍組織及び／またはがん組織に、及び／またはそれらに由来するペプチドもしくは抗原性ペプチドに、結合するまたは特異的に結合することができ、及び／または本明細書に記載される改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞の活性化を促進すること、及び／または本明細書に記載されるＴ細胞活性を活性化することができる。
【0096】
本発明によれば、内因性タンパク質は、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１であり得、任意選択的に、遺伝子座は、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいはＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／またはＴＡＧ終止コドンの前にある。
【0097】
異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込むことができ、遺伝子座は、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１をコードする遺伝子であるかまたはその中にあり、任意選択的に、遺伝子座は、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいはＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／またはＴＡＧ終止コドンの前にある。
【0098】
異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１つの異種核酸配列は、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に組み込むことができ、組み込みの遺伝子座または部位は、ＥＥＦＡ１Ａ遺伝子のエクソン８（好ましくは第６染色体上のＥＥＦＡ１Ａ遺伝子内）にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいはＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／またはＴＡＧ終止コドンの前にある。
【0099】
本発明は、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を提供し、融合遺伝子もしくは配列またはマルチシストロン性融合遺伝子もしくは配列は、異種ＴＣＲをコードする核酸及びＥＥＦＡ１Ａをコードする核酸を、酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／または好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含み、異種ＴＣＲをコードする核酸配列は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を、好ましくは、酵素切断部位、好ましくはフューリン切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列、及び／または好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列から選択されるリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含む。
【0100】
ＴＣＲ結合
異種ＴＣＲは、
（ａ）がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは
（ｂ）がん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、のいずれかである抗原またはペプチド抗原に結合し得るかまたは特異的に結合し得る。
異種ＴＣＲは、
（ａ）がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは
（ｂ）がん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、のいずれかである抗原またはペプチド抗原に結合し得るかまたは特異的に結合し得る。
【0101】
本発明によれば、異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に結合し得るか、あるいは特異的及び／または選択的に結合することができ、これら抗原は、任意選択的に、がん及び／または腫瘍によって、及び／またはペプチド提示分子、例えば主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＨＬＡとの複合体中で提示されるか、あるいはペプチド提示分子なしで（例えば、内因的に発現されるがん及び／または腫瘍細胞表面抗原またはペプチド抗原として）提示される。がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原は、がん及び／または腫瘍細胞または組織によって、正常細胞または組織よりも高いレベル、好ましくは著しく高いレベルで、例えば、１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１０００，０００倍以上高く発現される抗原またはそのペプチド抗原であり得、好ましくは、抗原またはそのペプチド抗原は正常細胞または組織によって発現されない。がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原は、がん精巣抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）、ＷＴ１（ウイルムス腫瘍１）、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫において優先的に発現される抗原）、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６／ＨＰＶ－Ｅ７（ヒトパピローマウイルス）、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、チログロビン（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎ）、ＴＧＦＢＩＩフレームシフト抗原、ＬＡＧＥ－１Ａ、ＫＲＡＳ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＡＧＥ、黒色腫関連抗原もしくはＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバー、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、及びＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、もしくはＭＡＧＥ－Ａ１２、またはそれらのペプチド抗原のいずれかであり得る。
【0102】
ＴＣＲは、ＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原性ペプチド、例えばヒトＭＡＧＥ Ａ４もしくは配列番号１のＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原性ペプチドに結合し得る。ＴＣＲは、配列番号２、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを含むＭＡＧＥ Ａ４の抗原性ペプチドに結合し得る。あるいは、ＴＣＲは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）またはその抗原性ペプチド、例えば、配列番号２０のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはＡＦＰのペプチド抗原、またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）もしくはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）配列番号２０に由来する残基１５８～１６６を含むＡＦＰのペプチド抗原に結合し得る。
【0103】
ＴＣＲは、
（ａ）配列番号２０の残基１５８～１６６（ＡＦＰ１５８）、
（ｂ）配列番号２０の残基１３７～１４５（ＡＦＰ１３７）、
（ｃ）配列番号２０の残基３２５～３３４（ＡＦＰ３２５）、
（ｄ）配列番号２０の残基５４２～５５０（ＡＦＰ５４２）、または
（ｅ）残基ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）、を含むかまたはそれからなるＡＦＰ抗原性ペプチドに結合し得る。
（ａ）配列番号２０の残基１５８～１６６（ＡＦＰ１５８）、
（ｂ）配列番号２０の残基１３７～１４５（ＡＦＰ１３７）、
（ｃ）配列番号２０の残基３２５～３３４（ＡＦＰ３２５）、
（ｄ）配列番号２０の残基５４２～５５０（ＡＦＰ５４２）、または
（ｅ）残基ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）、を含むかまたはそれからなるＡＦＰ抗原性ペプチドに結合し得る。
【0104】
ＴＣＲの特異的結合
異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、任意選択的にがん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に結合し得るかまたは特異的に結合し得る。
異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、任意選択的にがん性状態に関連する及び／または腫瘍もしくはがん細胞もしくは組織によって提示される、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に結合し得るかまたは特異的に結合し得る。
【0105】
特異性は、異種ＴＣＲと特定の標的がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原との間の結合強度を表し、受容体－リガンド系に対する結合状態と未結合状態との比率である解離定数Ｋｄによって表すことができる。更に、異種ＴＣＲが結合することのできる異なるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原が少ないほど、その結合特異性は大きくなる。
【0106】
異種ＴＣＲは、１０種未満、９種未満、８種未満、７種未満、６種未満、５種未満、４種未満、３種未満、または２種未満の異なるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に結合し得る。
【0107】
異種ＴＣＲは、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、がん抗原及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原、例えば、配列番号１のＭＡＧＥ Ａ４、配列番号２を含むＭＡＧＥ Ａ４の抗原性ペプチド、配列番号２０のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはＡＦＰのペプチド抗原、またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むＡＦＰのペプチド抗原に、任意選択的に表面プラズモン共鳴を用いて、任意選択的に２５℃、任意選択的に６．５～６．９または７．０～７．５のｐＨで測定して、０．０１μΜ～１００μΜ、０．０１μΜ～５０μΜ、０．０１μΜ～２０μΜ、０．０５μΜ～２０μΜ、もしくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１μΜ、０．１５μΜ、０．２μΜ、０．２５μΜ、０．３μΜ、０．３５μΜ、０．４μΜ、０．４５μΜ、０．５μΜ、０．５５μΜ、０．６μΜ、０．６５μΜ、０．７μΜ、０．７５μΜ、０．８μΜ、０．８５μΜ、０．９μΜ、０．９５μΜ、１．０μΜ、１．５μΜ、２．０μΜ、２．５μΜ、３．０μΜ、３．５μΜ、４．０μΜ、４．５μΜ、５．０μΜ、５．５μΜ、６．０μΜ、６．５μΜ、７．０μΜ、７．５μΜ、８．０μΜ、８．５μΜ、９．０μΜ、９．５μΜ、１０．０μΜ；または１０μΜ～１０００μΜ、１０μΜ～５００μΜ、５０μΜ～５００μΜ、もしくは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μΜ、１５０μΜ、２００μΜ、２５０μΜ、３００μΜ、３５０μΜ、４００μΜ、４５０μΜ、５００μΜの解離定数で結合し得る。解離定数、ＫＤまたはｋｏｆｆ／ｋｏｎは、解離速度定数ｋｏｆｆ及び会合速度定数ｋｏｎを実験的に測定することにより決定され得る。ＴＣＲ解離定数は、可溶性形態のＴＣＲを使用して測定することができ、このＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む。
【0108】
異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変細胞は、ペプチド提示分子、例えば主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＨＬＡ（任意選択的にクラスＩまたはＩＩ、例えばＨＬＡ－Ａ２を有するか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２から選択される）との複合体中のまたはそれらによって提示される、抗原またはそのペプチド抗原、例えば、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原に、例えば、本明細書にて上述した解離定数で、好ましくは０．０１μＭ～１００μＭ、例えば、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、好ましくは０．０５μＭ～２０．０μＭの解離定数で、特異的に及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0109】
異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変細胞は、任意選択的に、ＨＬＡ－Ａ＊０２（ＨＬＡ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７から任意選択的に選択され、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１またはＨＬＡ－Ａ＊０２）との複合体中の、ＭＡＧＥ Ａ４（配列番号１）、そのペプチド抗原、または配列番号２（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を含むその抗原性ペプチドに、例えば、本明細書にて上述した解離定数で、好ましくは０．０１μＭ～１００μＭ、例えば、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、好ましくは０．０５μＭ～２０．０μＭの解離定数で、特異的に及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0110】
異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／または異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変細胞は、任意選択的に、ＨＬＡ－Ａ＊０２との、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２、もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０７から選択され、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１もしくはＨＬＡ－Ａ＊０２：６４２である任意のＨＬＡとの複合体中の、ＡＦＰ（配列番号２０）、そのペプチド抗原、または配列ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むペプチド抗原に、例えば、本明細書にて上述した解離定数で、好ましくは０．０１μＭ～１００μＭ、例えば、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、好ましくは０．０５μＭ～２０．０μＭの解離定数で、特異的に及び／または高い親和性で、及び／または選択的に結合し得る。
【0111】
あるいは、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変細胞は、抗原またはそのペプチド抗原に、例えば、内因的に発現されるがん及び／または腫瘍細胞表面抗原またはペプチド抗原として本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原（例えば、ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原性ペプチド）に、例えば、本明細書にて上述した解離定数で、好ましくは０．０１μＭ～１００μＭ、例えば、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、好ましくは０．０５μＭ～２０．０μＭの解離定数で結合する、または特異的及び／または選択的に結合する、及び／または高い親和性で結合することができ、任意選択的に、この結合は、ペプチド提示分子または抗原提示分子、例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、または主要組織適合複合体クラス関連タンパク質（ＭＲ）１との複合体としての細胞表面抗原の提示とは非依存的である。
【0112】
ＴＣＲ結合は、ある抗原またはそのペプチド抗原、例えば、任意選択的にがん及び／または腫瘍細胞表面に発現する、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原（例えば、ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４またはその抗原性ペプチド）に対して、近縁のがん抗原及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原配列と比較して特異的であり得る。近縁のがん抗原及び／または腫瘍抗原またはペプチド抗原配列は、類似または同一の長さであり得、及び／または類似した数または同一の数のアミノ酸残基を有し得る。近縁のペプチド抗原配列は、５０％もしくは６０％もしくは７０％もしくは８０～９０％の同一性、好ましくは８０～９０％の同一性を共有することができ、及び／または１、２、３、もしくは４個のアミノ酸残基が異なっていてもよい。例えば、近縁のペプチド配列は、配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号２）またはＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号２１）を含むかまたは有するポリペプチド配列に由来し得る。
【0113】
結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくは放射免疫測定法（ＲＩＡ））、または動力学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）により決定され得る。結合力は、例えば相互作用の価数を考慮した、複数部位における２つの分子の相互の結合強度の総和である。改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいはがん細胞または組織の腫瘍により提示されかつ異種ＴＣＲにより認識されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に対して、異種ＴＣＲを欠くまたは別の異種ＴＣＲもしくはＣＡＲを有する細胞と比較して改善された親和性及び／または結合力を示し得る。
【0114】
選択的結合とは、異種ＴＣＲが、あるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に対して、別の抗原と比較してより大きい親和性で結合することを示す。選択的結合は、異種ＴＣＲとの複合体中での、あるリガンド抗原による別のリガンド抗原の置換に対する平衡定数によって示される。
【0115】
異種ＴＣＲ
細胞ゲノム内の遺伝子座中に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。抗原に結合すると、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、抗原を有する及び／または増殖及び／または細胞分裂を行っている細胞に対してＴ細胞エフェクター機能及び／または細胞溶解作用を示し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲを含む改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、同じがん抗原及び／または腫瘍抗原及び／またはペプチド（抗原性ペプチド）を標的とする形質導入ＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかを含むＴ細胞と比較して、同程度のまたはより良好な治療効力を示す。活性化した改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮｙ、及びＩＬ２を含み得るがこれらに限定されない抗腫瘍サイトカインを分泌し得る。
細胞ゲノム内の遺伝子座中に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。抗原に結合すると、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、抗原を有する及び／または増殖及び／または細胞分裂を行っている細胞に対してＴ細胞エフェクター機能及び／または細胞溶解作用を示し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲを含む改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、同じがん抗原及び／または腫瘍抗原及び／またはペプチド（抗原性ペプチド）を標的とする形質導入ＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかを含むＴ細胞と比較して、同程度のまたはより良好な治療効力を示す。活性化した改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮｙ、及びＩＬ２を含み得るがこれらに限定されない抗腫瘍サイトカインを分泌し得る。
【0116】
「異種」または「外因性」という用語は、細胞または宿主細胞などの特定の生体系にとって外来であり、その系に天然には存在せず、かつ人為的または組換え手段によって系に導入され得るポリペプチドまたは核酸を指す。したがって、異種であるＴＣＲの発現により、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞の免疫原性特異性を変化させて、それらが、がんを有する個体のがん細胞の表面上に存在する本明細書に記載される１つ以上の腫瘍抗原またはがん抗原及び／またはペプチドを認識するか、またはその認識の改善を示すようにすることができる。免疫原性細胞またはＴ細胞の改変及びそれに続く増大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。
【0117】
ＴＣＲの構造
好ましくは、異種ＴＣＲは、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞によって天然にまたは内因性に発現されない。すなわち、改変前に発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性もしくは異種である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含み得る。
好ましくは、異種ＴＣＲは、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞によって天然にまたは内因性に発現されない。すなわち、改変前に発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性もしくは異種である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含み得る。
【0118】
異種ＴＣＲは、組換えまたは合成または人工のＴＣＲ、すなわち天然には存在しないＴＣＲであり得る。例えば、異種ＴＣＲは、特定のがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原に対するその親和性または結合力を増加させるように操作され得る（すなわち、親和性増強ＴＣＲまたは特異的ペプチド増強親和性受容体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲ）。親和性増強ＴＣＲまたは（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲに対する１つ以上の変異、例えば、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における１つ以上の変異を含み得る。これらの変異は、任意選択的に腫瘍細胞及び／またはがん細胞により発現される場合、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原を提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させ得る。親和性増強または親和性成熟ＴＣＲを作製する好適な方法は、ファージまたは酵母ディスプレイを使用するＴＣＲ変異体のライブラリのスクリーニングを含み、当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６、Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８（３）２８１－２８３、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２ ３４８－２５６、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５ ９０１を参照されたい）。好ましい親和性増強ＴＣＲは、ＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞もしくはがん細胞、または本明細書に記載されるＡＦＰもしくはそのペプチド抗原に結合し得る。
【0119】
ＭＡＧＥＡ４／ＡＦＰ ＴＣＲ
異種ＴＣＲは、配列番号５のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと配列番号７のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントとを含み得るＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであり得る。あるいは、異種ＴＣＲは、配列番号２２のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと配列番号２３のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントとを含み得るＡＦＰ ＴＣＲであり得る。
異種ＴＣＲは、配列番号５のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと配列番号７のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントとを含み得るＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであり得る。あるいは、異種ＴＣＲは、配列番号２２のα鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントと配列番号２３のβ鎖参照アミノ酸配列またはそのバリアントとを含み得るＡＦＰ ＴＣＲであり得る。
【0120】
バリアントは、参照アミノ酸配列に対して（例えば、α鎖参照配列及び／またはβ鎖参照配列のいずれかに対して）少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＴＣＲは、配列番号６のα鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント及び配列番号８のβ鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント（ＭＡＧＥ Ａ４）によって、または配列番号２４のα鎖参照ヌクレオチド配列もしくはそのバリアント及び配列番号２５のβ鎖参照ヌクレオチド配列（ＡＦＰ）もしくはそのバリアントによってコードされ得る。バリアントは、参照ヌクレオチド配列に対して（例えば、ＡＦＰまたはＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲのα鎖参照配列及び／またはβ鎖参照配列のいずれかに対して）少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。
【0121】
ＴＣＲのＣＤＲ
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えばＭＡＧＥ Ａ４に対するもの）は、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインであって、
アルファ鎖可変ドメインが、配列
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）（配列番号１１）もしくは配列番号５のアミノ酸４８～５３、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）（配列番号１２）もしくは配列番号５のアミノ酸７１～７６、及び
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）（配列番号１３）もしくは配列番号５のアミノ酸１１１～１２５を有するＣＤＲを含み、
及び／または
ベータ鎖可変ドメインが、配列
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）（配列番号１４）もしくは配列番号７のアミノ酸４６～５０、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）（配列番号１５）もしくは配列番号７のアミノ酸６８～７３、及び
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）（配列番号１６）もしくは配列番号７のアミノ酸１１０～１２３を有するＣＤＲを含む、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメイン、
あるいは、それぞれ、それらに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性、任意選択的にそれらに対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えばＭＡＧＥ Ａ４に対するもの）は、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインであって、
アルファ鎖可変ドメインが、配列
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）（配列番号１１）もしくは配列番号５のアミノ酸４８～５３、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）（配列番号１２）もしくは配列番号５のアミノ酸７１～７６、及び
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）（配列番号１３）もしくは配列番号５のアミノ酸１１１～１２５を有するＣＤＲを含み、
及び／または
ベータ鎖可変ドメインが、配列
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）（配列番号１４）もしくは配列番号７のアミノ酸４６～５０、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）（配列番号１５）もしくは配列番号７のアミノ酸６８～７３、及び
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）（配列番号１６）もしくは配列番号７のアミノ酸１１０～１２３を有するＣＤＲを含む、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメイン、
あるいは、それぞれ、それらに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性、任意選択的にそれらに対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【0122】
本発明によれば、異種ＴＣＲ（例えばＡＦＰに対するもの）は、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含むことができ、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、配列
ＤＲＧＳＱＳ（αＣＤＲ１）（配列番号２６）もしくは配列番号２２のアミノ酸２７～３２、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）（配列番号２７）もしくは配列番号２２のアミノ酸５０～５５、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及びＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）（配列番号２８）もしくは配列番号２２のアミノ酸９０～１０１、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含み、及び／または
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインは、配列ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）（配列番号２９）もしくは配列番号２３のアミノ酸２７～３１、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）（配列番号３０）もしくは配列番号２３のアミノ酸４９～５４、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及びＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）（配列番号３１）もしくは配列番号２３のアミノ酸９２～１０２、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含み、任意選択的に、配列同一性はそれぞれ、それらに対して最小５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のいずれかの配列同一性、任意選択的に１００％の配列同一性であり得る。
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、配列
ＤＲＧＳＱＳ（αＣＤＲ１）（配列番号２６）もしくは配列番号２２のアミノ酸２７～３２、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）（配列番号２７）もしくは配列番号２２のアミノ酸５０～５５、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及びＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）（配列番号２８）もしくは配列番号２２のアミノ酸９０～１０１、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含み、及び／または
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインは、配列ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）（配列番号２９）もしくは配列番号２３のアミノ酸２７～３１、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）（配列番号３０）もしくは配列番号２３のアミノ酸４９～５４、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、及びＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）（配列番号３１）もしくは配列番号２３のアミノ酸９２～１０２、もしくはそれに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含み、任意選択的に、配列同一性はそれぞれ、それらに対して最小５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のいずれかの配列同一性、任意選択的に１００％の配列同一性であり得る。
【0123】
ＴＣＲ可変ドメイン
異種ＴＣＲは、ＴＣＲ、例えばＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸残基１～１３６の配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
異種ＴＣＲは、ＴＣＲ、例えばＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸残基１～１３６の配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸残基１～１３３の配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0124】
異種ＴＣＲ、例えばＡＦＰ ＴＣＲは、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／またはベータ鎖可変ドメインが、配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0125】
ＭＡＧＥ Ａ４及びＡＦＰ ＴＣＲのＣＤＲ及びフレームワーク
いくつかの実施形態では、「前駆ＴＣＲ」または「親ＴＣＲ」という用語は、本明細書では、それぞれ配列番号５及び７のＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖及びＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖を含むＴＣＲ、またはそれぞれ配列番号２２及び２３のＡＦＰ ＴＣＲ α鎖及びＡＦＰ ＴＣＲ β鎖を含むＴＣＲを指すために使用され得る。
いくつかの実施形態では、「前駆ＴＣＲ」または「親ＴＣＲ」という用語は、本明細書では、それぞれ配列番号５及び７のＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖及びＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖を含むＴＣＲ、またはそれぞれ配列番号２２及び２３のＡＦＰ ＴＣＲ α鎖及びＡＦＰ ＴＣＲ β鎖を含むＴＣＲを指すために使用され得る。
【0126】
前駆ＴＣＲに対して変異または改変され、かつペプチド－ＨＬＡ複合体に対して、前駆ＴＣＲと等しい、同等の、もしくはそれより高い親和性、及び／または等しい、同等の、もしくはそれより遅いｏｆｆ速度を有する異種ＴＣＲを提供することが望ましい場合がある。異種ＴＣＲは、前駆ＴＣＲに対する、アルファ鎖可変ドメイン及び／またはベータ鎖可変ドメインに存在する複数の変異を有し得、「操作ＴＣＲ」または「変異型ＴＣＲ」と示され得る。これらの変異（複数可）は、標的ＡＦＰもしくはＭＡＧＥ Ａ４またはそのペプチド抗原に対する結合親和性及び／または特異性及び／または選択性及び／または結合力を改善し得る。特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメインには１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、例えば４つもしくは８つの変異、及び／またはベータ鎖可変ドメインには１、２、３、４、もしくは５つの変異、例えば５つの変異がある。いくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸残基（ＭＡＧＥ Ａ４）または配列番号２２のアミノ酸１～１１２（ＡＦＰ）の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号１０のアミノ酸残基（ＭＡＧＥ Ａ４）または配列番号２３のアミノ酸１～１１２（ＡＦＰ）の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0127】
異種ＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号９、または配列番号５のアミノ酸残基１～１３６のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基１～４７、５４～７０、７７～１１０、及び１２６～１３６が配列番号９のアミノ酸残基１～４７、５４～７０、７７～１１０、及び１２６～１３６のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、及び／またはアミノ酸残基４８～５３、７１～７６、及び１１１～１２５（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がそれぞれ、配列番号９のアミノ酸残基４８～５３、７１～７６、及び１１１～１２５（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0128】
異種ＴＣＲは、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４７の配列が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基１～４７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号９の残基１～４７に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４８～５３の配列が、ＶＳＰＦＳＮ、ＣＤＲ１（配列番号１１）もしくは配列番号９のアミノ酸４８～５３である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７０の配列が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７１～７６の配列が、ＬＴＦＳＥＮ、ＣＤＲ２（配列番号１２）もしくは配列番号９のアミノ酸７１～７６であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基７７～１１０の配列が、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１１～１２５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ、ＣＤＲ３（配列番号１３）もしくは配列番号９のアミノ酸１１１～１２５であり得る、及び／または
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２６～１３６の配列が、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４７の配列が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基１～４７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号９の残基１～４７に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４８～５３の配列が、ＶＳＰＦＳＮ、ＣＤＲ１（配列番号１１）もしくは配列番号９のアミノ酸４８～５３である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７０の配列が、（ａ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号９のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７１～７６の配列が、ＬＴＦＳＥＮ、ＣＤＲ２（配列番号１２）もしくは配列番号９のアミノ酸７１～７６であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基７７～１１０の配列が、配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号９のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１１～１２５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ、ＣＤＲ３（配列番号１３）もしくは配列番号９のアミノ酸１１１～１２５であり得る、及び／または
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２６～１３６の配列が、配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号９のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
【0129】
異種ＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのベータ鎖可変ドメインに、配列番号１０のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９、及び１２４～１３３が配列番号１０のアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９、及び１２４～１３３のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基４６～５０、６８～７３、及び１１０～１２３が、配列番号１０のアミノ酸残基４６～５０、６８～７３、及び１１０～１２３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0130】
異種ＴＣＲは、ＴＣＲであって、そのベータ鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５の配列が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基１～４５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号１０の残基１～４５に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列が、ＫＧＨＤＲ、ＣＤＲ１（配列番号１４）もしくは配列番号１０のアミノ酸４６～５０である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３の配列が、ＳＦＤＶＫＤ、ＣＤＲ２（配列番号１５）もしくは配列番号１０のアミノ酸６８～７３であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基７４～１０９の配列が、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ、ＣＤＲ３（配列番号１６）もしくは配列番号１０のアミノ酸１１０～１２３であり得る、及び／または
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３３の配列が、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５の配列が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基１～４５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号１０の残基１～４５に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列が、ＫＧＨＤＲ、ＣＤＲ１（配列番号１４）もしくは配列番号１０のアミノ酸４６～５０である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは（ｂ）配列番号１０のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３の配列が、ＳＦＤＶＫＤ、ＣＤＲ２（配列番号１５）もしくは配列番号１０のアミノ酸６８～７３であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基７４～１０９の配列が、配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号１０のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ、ＣＤＲ３（配列番号１６）もしくは配列番号１０のアミノ酸１１０～１２３であり得る、及び／または
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３３の配列が、配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、もしくは配列番号１０のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
【0131】
異種ＴＣＲは、配列番号９のアルファ鎖可変ドメイン及び／または配列番号１０のベータ鎖可変ドメインを含むＴＣＲを含み得る。ＴＣＲは、配列番号５のアルファ鎖及び／または配列番号７のベータ鎖を含むＴＣＲを含み得る。
【0132】
ＡＦＰ ＴＣＲのＣＤＲ及びフレームワーク
異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２が配列番号２２のアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、及び／またはアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がそれぞれ、配列番号２２のアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインが、配列番号２２のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２が配列番号２２のアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８９、及び１０２～１１２のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、及び／またはアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がそれぞれ、配列番号２２のアミノ酸残基２７～３２、５０～５５、９０～１０１（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0133】
異種ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのアルファ鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６の配列が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２の残基１～２６に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３２の配列が、ＤＲＧＳＱＳ、αＣＤＲ１（配列番号２６）または配列番号２２のアミノ酸２７～３２、またはＤＲＧＳＱＡ（配列番号３２）である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３～４９の配列が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０～５５の配列が、ＩＹＳＮＧＤ、αＣＤＲ２（配列番号２７）または配列番号２２のアミノ酸５０～５５であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基５６～８９の配列が、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸９０～１００の配列が、ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮまたは配列番号２２のアミノ酸９０～１００であり得る、
（ｖｉｉ）アミノ酸９０～１０１の配列が、ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ、αＣＤＲ３（配列番号２８）または配列番号２２のアミノ酸９０～１０１であり得る、
（ｖｉｉｉ）そのアミノ酸残基１０２～１１２の配列が、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６の配列が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２の残基１～２６に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３２の配列が、ＤＲＧＳＱＳ、αＣＤＲ１（配列番号２６）または配列番号２２のアミノ酸２７～３２、またはＤＲＧＳＱＡ（配列番号３２）である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３～４９の配列が、（ａ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２２のアミノ酸残基３３～４９の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基５０～５５の配列が、ＩＹＳＮＧＤ、αＣＤＲ２（配列番号２７）または配列番号２２のアミノ酸５０～５５であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基５６～８９の配列が、配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２２のアミノ酸残基５６～８９の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸９０～１００の配列が、ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮまたは配列番号２２のアミノ酸９０～１００であり得る、
（ｖｉｉ）アミノ酸９０～１０１の配列が、ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ、αＣＤＲ３（配列番号２８）または配列番号２２のアミノ酸９０～１０１であり得る、
（ｖｉｉｉ）そのアミノ酸残基１０２～１１２の配列が、配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２２のアミノ酸残基１０２～１１２の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
【0134】
ＴＣＲ（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲ）は、ＴＣＲであって、そのベータ鎖可変ドメインに、配列番号２３のアミノ酸残基１～１１２のアミノ酸配列、またはアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９１、１０３～１１２が配列番号２３のアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９１、１０３～１１２のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基２７～３１、４９～５４、及び９２～１０２が、配列番号２３のアミノ酸残基２７～３１、４９～５４、及び９２～１０２（βＣＤＲ１、βＣＤＲ２、βＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを含み得る。
【0135】
ＴＣＲは、ＴＣＲであって、そのベータ鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６の配列が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３の残基１～２６に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３１の配列が、ＳＧＤＬＳ、βＣＤＲ１（配列番号２９）または配列番号２３のアミノ酸２７～３１である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２～４８の配列が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９～５４の配列が、ＹＹＮＧＥＥ、βＣＤＲ２（配列番号３０）または配列番号２３のアミノ酸４９～５４であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５～９１の配列が、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸９２～１０２の配列が、ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ、βＣＤＲ ３（配列番号３１）または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２であり得る、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０３～１１２の配列が、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６の配列が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３の残基１～２６に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基２７～３１の配列が、ＳＧＤＬＳ、βＣＤＲ１（配列番号２９）または配列番号２３のアミノ酸２７～３１である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３２～４８の配列が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号２３のアミノ酸残基３２～４８の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基４９～５４の配列が、ＹＹＮＧＥＥ、βＣＤＲ２（配列番号３０）または配列番号２３のアミノ酸４９～５４であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５～９１の配列が、配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２３のアミノ酸残基５５～９１の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸９２～１０２の配列が、ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ、βＣＤＲ ３（配列番号３１）または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２であり得る、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１０３～１１２の配列が、配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号２３のアミノ酸残基１０３～１１２の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
【0136】
異種ＴＣＲは、アルファ鎖が配列番号４１のアミノ酸残基を含み、かつベータ鎖可変ドメインが配列番号２３または配列番号４２のアミノ酸残基を含むＴＣＲを含み得る。
【0137】
変異型ＡＦＰ ＴＣＲ
いくつかの実施形態では、異種ＴＣＲは、親ＡＦＰ ＴＣＲ（アルファ鎖が配列番号２２のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが配列番号２３のアミノ酸残基を含む）、またはアルファ鎖が配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが配列番号２３もしくは配列番号４２のアミノ酸残基を含むＡＦＰ ＴＣＲに対して変異され得る。
いくつかの実施形態では、異種ＴＣＲは、親ＡＦＰ ＴＣＲ（アルファ鎖が配列番号２２のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが配列番号２３のアミノ酸残基を含む）、またはアルファ鎖が配列番号４１のアミノ酸残基を含み、ベータ鎖可変ドメインが配列番号２３もしくは配列番号４２のアミノ酸残基を含むＡＦＰ ＴＣＲに対して変異され得る。
【0138】
したがって、そのような変異異種ＴＣＲは、
ａ．配列ＤＲＧＳＱＡ（配列番号３２）を有するαＣＤＲ１、
ｂ．配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号３３）を有するαＣＤＲ３、
ｃ．配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、
ｄ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１（配列番号３２）及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、
ｅ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３、
ｆ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（配列番号３６）を有するαＣＤＲ３、
ｇ．配列ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号４０）を有するαＣＤＲ３、
ｈ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１（配列番号３２）及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３、
ｉ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３６）を有するαＣＤＲ３、
ｊ．配列ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（配列番号３７）を有するαＣＤＲ３、
ｋ．配列ＤＲＧＳＦＳ（配列番号３８）を有するαＣＤＲ１、
ｌ．配列ＤＲＧＳＹＳ（配列番号３９）を有するαＣＤＲ１、
ｍ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号３３）を有するαＣＤＲ３、
ｎ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、または
ｏ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３を含み得る。
ａ．配列ＤＲＧＳＱＡ（配列番号３２）を有するαＣＤＲ１、
ｂ．配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号３３）を有するαＣＤＲ３、
ｃ．配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、
ｄ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１（配列番号３２）及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、
ｅ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３、
ｆ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（配列番号３６）を有するαＣＤＲ３、
ｇ．配列ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号４０）を有するαＣＤＲ３、
ｈ．配列ＤＲＧＳＱＡを有するαＣＤＲ１（配列番号３２）及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３、
ｉ．配列ＡＶＮＳＱＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３６）を有するαＣＤＲ３、
ｊ．配列ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（配列番号３７）を有するαＣＤＲ３、
ｋ．配列ＤＲＧＳＦＳ（配列番号３８）を有するαＣＤＲ１、
ｌ．配列ＤＲＧＳＹＳ（配列番号３９）を有するαＣＤＲ１、
ｍ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（配列番号３３）を有するαＣＤＲ３、
ｎ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（配列番号３４）を有するαＣＤＲ３、または
ｏ．配列ＤＲＧＳＹＳを有するαＣＤＲ１（配列番号３９）及び配列ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（配列番号３５）を有するαＣＤＲ３を含み得る。
【0139】
異種ＴＣＲまたは異種変異ＴＣＲは、配列番号２２に示される番号付けを参照して、３１Ｑ、３２Ｓ、９４Ｄ、９５Ｓ、９６Ｇ、９７Ｙ、及び９８Ａに対応するアミノ酸のうちの１つ以上に変異を含むアルファ鎖可変ドメインを含み得る。例えば、アルファ鎖可変ドメインは、配列番号２２に示される番号付けに従って、以下の変異、すなわちＱ３１Ｆ／Ｙ、Ｓ３２Ａ、Ｄ９４Ｑ、Ｓ９５Ｎ、Ｇ９６Ｓ、Ｙ９７Ｖ、Ａ９８Ｓのうちの１つ以上を有し得る。
【0140】
異種ＴＣＲは、配列番号２２のＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン（但し、配列番号２２に示される番号付けに従って、３１Ｑ、３２Ｓ、９４Ｄ、９５Ｓ、９６Ｇ、９７Ｙ、及び９８Ａに対応するアミノ酸のうちの１つ以上に変異、例えば、Ｑ３１Ｆ／Ｙ、Ｓ３２Ａ、Ｄ９４Ｑ、Ｓ９５Ｎ、Ｇ９６Ｓ、Ｙ９７Ｖ、Ａ９８Ｓのうちの１つ以上を含む）、及び／または配列番号２３もしくは配列番号４２のＤ１～Ｔ１１２を含むベータ鎖可変ドメインを含み得る。
【0141】
異種ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含むことができ、
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、配列
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）（配列番号３２）または配列番号４１のアミノ酸２７～３２、
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）（配列番号２７）または配列番号２２のアミノ酸５０～５５、及び
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）（配列番号３５）または配列番号４１のアミノ酸９０～１０１を有するＣＤＲを含み、
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインは、配列
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）（配列番号２９）または配列番号２３のアミノ酸２７～３１、
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）（配列番号３０）または配列番号２３のアミノ酸４９～５４、及び
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）（配列番号３１）または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２を有するＣＤＲを含む。
（ｉ）アルファ鎖可変ドメインは、配列
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）（配列番号３２）または配列番号４１のアミノ酸２７～３２、
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）（配列番号２７）または配列番号２２のアミノ酸５０～５５、及び
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）（配列番号３５）または配列番号４１のアミノ酸９０～１０１を有するＣＤＲを含み、
（ｉｉ）ベータ鎖可変ドメインは、配列
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）（配列番号２９）または配列番号２３のアミノ酸２７～３１、
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）（配列番号３０）または配列番号２３のアミノ酸４９～５４、及び
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）（配列番号３１）または配列番号２３のアミノ酸９２～１０２を有するＣＤＲを含む。
【0142】
異種ＴＣＲは、アルファ鎖可変ドメインが配列番号４１のアミノ酸残基１～１１２を含み、かつベータ鎖可変ドメインが配列番号３３または配列番号４２のアミノ酸残基１～１１２を含むＴＣＲを含み得る。
【0143】
異種ＴＣＲは、アルファ鎖が配列番号４１のアミノ酸残基を含み、かつベータ鎖可変ドメインが配列番号３３または配列番号４２のアミノ酸残基１～１１２を含むＴＣＲを含み得る。
【0144】
ＴＣＲバリアント
アミノ酸及びヌクレオチド配列の同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標），Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して、２つの完全な配列を、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にするようにアラインメントする。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４が用いられる。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ、またはＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を使用してもよく、一般にデフォルトパラメータを用いる。
アミノ酸及びヌクレオチド配列の同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標），Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して、２つの完全な配列を、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にするようにアラインメントする。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４が用いられる。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ、またはＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を使用してもよく、一般にデフォルトパラメータを用いる。
【0145】
特定のアミノ酸配列バリアントは、１アミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０または２０～３０アミノ酸の挿入、付加、置換、または欠失により参照配列と異なり得る。いくつかの実施形態では、バリアント配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の残基が挿入、欠失、または置換された参照配列を含み得る。例えば、最大１５個、最大２０個、最大３０個、または最大４０個の残基が、挿入、欠失、または置換され得る。
【0146】
いくつかの好ましい実施形態では、バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の保存的置換によって参照配列とは異なり得る。保存的置換は、アミノ酸を、類似の特性を有する異なるアミノ酸と置き換えることを含む。例えば、脂肪族残基を別の脂肪族残基と置き換えることができ、非極性残基を別の非極性残基と置き換えることができ、酸性残基を別の酸性残基と置き換えることができ、塩基性残基を別の塩基性残基と置き換えることができ、極性残基を別の極性残基と置き換えることができ、または芳香族残基を別の芳香族残基と置き換えることができる。保存的置換は、例えば、以下の群内のアミノ酸の間であり得る：
アラニン及びグリシン；
グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、及びアスパラギン、アルギニン、及びリジン；
アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸；
イソロイシン、ロイシン、及びバリン；
フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；ならびに
セリン、トレオニン、及びシステイン。
アラニン及びグリシン；
グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、及びアスパラギン、アルギニン、及びリジン；
アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸；
イソロイシン、ロイシン、及びバリン；
フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；ならびに
セリン、トレオニン、及びシステイン。
【0147】
ＣＤ８α補助受容体
細胞ゲノム内の遺伝子座中に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含み、及び／または本明細書に記載される異種ＴＣＲを発現もしくは提示する改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、異種補助受容体を更に発現または提示し得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、補助受容体、例えばＣＤ８補助受容体をコードする核酸を形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。
細胞ゲノム内の遺伝子座中に組み込まれた異種ＴＣＲをコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含み、及び／または本明細書に記載される異種ＴＣＲを発現もしくは提示する改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、異種補助受容体を更に発現または提示し得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、補助受容体、例えばＣＤ８補助受容体をコードする核酸を形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。
【0148】
異種補助受容体は、ＣＤ８補助受容体であり得る。ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８－α鎖とＣＤ８－β鎖、またはＣＤ８－α鎖とＣＤ８－α鎖を含む、ＣＤ８鎖の二量体または対を含み得る。好ましくは、ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８－α鎖とＣＤ８－α鎖とを含むＣＤ８αα補助受容体である。ＣＤ８α補助受容体は、配列番号３、配列番号３、またはそのバリアントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ８α補助受容体は、ホモ二量体であり得る。
【0149】
好ましくは、ＣＤ８補助受容体は、クラス１ ＭＨＣに結合し、ＴＣＲシグナル伝達を強化する。ＣＤ８補助受容体は、配列番号３の参照アミノ酸配列を含み得るか、またはそのバリアントであり得る。バリアントは、参照アミノ酸配列である配列番号３に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ８補助受容体は、配列番号４の参照ヌクレオチド配列によってコードされ得るか、またはそのバリアントであり得る。バリアントは、参照ヌクレオチド配列である配列番号４に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。
【0150】
異種ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８補助受容体であって、そのＩｇ様Ｖ型ドメインに、配列
（ｉ）ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、ＣＤＲ１（配列番号１７）もしくは配列番号３のアミノ酸４５～５３、
（ｉｉ）ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２（配列番号１８）もしくは配列番号３のアミノ酸７２～７９、
（ｉｉｉ）ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３（配列番号１９）もしくは配列番号３のアミノ酸８０～１１７、
または、それぞれ、それらに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含む、ＣＤ８補助受容体を含み得る。
（ｉ）ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、ＣＤＲ１（配列番号１７）もしくは配列番号３のアミノ酸４５～５３、
（ｉｉ）ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２（配列番号１８）もしくは配列番号３のアミノ酸７２～７９、
（ｉｉｉ）ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３（配列番号１９）もしくは配列番号３のアミノ酸８０～１１７、
または、それぞれ、それらに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、を有するＣＤＲを含む、ＣＤ８補助受容体を含み得る。
【0151】
異種ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８補助受容体であって、配列番号３のアミノ酸配列の残基２２～１３５、またはアミノ酸残基２２～４４、５４～７１、８０～１１７、１２４～１３５が配列番号３のアミノ酸残基２２～４４、５４～７１、８０～１１７、１２４～１３５（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基４５～５３、７２～７９、及び１１８～１２３が、配列番号３のアミノ酸残基４５～５３、７２～７９、及び１１８～１２３のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらをそのＩｇ様Ｖ型ドメインに含む、ＣＤ８補助受容体を含み得る。
【0152】
ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８補助受容体であって、
（ｉ）そのアミノ酸残基２２～４４が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基２２～４４の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３の残基２２～４４に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４５～５３が、ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１７）ＣＤＲ１または配列番号３のアミノ酸４５～５３である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７１が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７２～７９が、ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２（配列番号１８）または配列番号３のアミノ酸７２～７９であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基８０～１１７が、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸残基１１８～１２３が、ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３（配列番号１９）または配列番号３のアミノ酸８０～１１７であり得る、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３５が、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＣＤ８補助受容体を含み得る。
（ｉ）そのアミノ酸残基２２～４４が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基２２～４４の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３の残基２２～４４に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４５～５３が、ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１７）ＣＤＲ１または配列番号３のアミノ酸４５～５３である、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５４～７１が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または（ｂ）配列番号３のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して挿入もしくは欠失された１、２、もしくは３つのアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７２～７９が、ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２（配列番号１８）または配列番号３のアミノ酸７２～７９であり得る、
（ｖ）そのアミノ酸残基８０～１１７が、配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号３のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸残基１１８～１２３が、ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３（配列番号１９）または配列番号３のアミノ酸８０～１１７であり得る、
（ｖｉｉ）そのアミノ酸残基１２４～１３５が、配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有し得るか、または配列番号３のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して１、２、もしくは３つの挿入、欠失、もしくは置換を有し得る、ＣＤ８補助受容体を含み得る。
【0153】
異種ＣＤ８補助受容体をコードする核酸を含み、及び／または異種ＣＤ８補助受容体を発現する改変人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞は、任意選択的にＨＬＡ上に提示される際に、抗原性ペプチド、腫瘍抗原、またはがん抗原による刺激に対してまたは刺激に応じて本明細書に開示されるアッセイによって決定することができる、異種ＣＤ８補助受容体を発現しない改変細胞（例えば、人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞）と比較して改善された親和性及び／または結合力及び／または改善されたＴ細胞活性化を示し得る。
【0154】
改変細胞の異種ＣＤ８は、ＭＨＣと相互作用し得るかまたはＭＨＣに特異的に結合し得る。ＭＨＣは、クラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、ＨＬＡ－Ｉ分子またはＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ／Ｂ２Ｍ二量体であり得る。好ましくは、ＣＤ８－αは、好ましくはＣＤ８のＩｇＶ様ドメインを介して、クラスＩ ＭＨＣのα３部分（残基２２３と２２９との間）と相互作用する。異種ＣＤ８は、任意選択的に抗原提示細胞、樹状細胞、及び／または腫瘍細胞もしくはがん細胞、腫瘍組織もしくはがん組織の表面上で、ＨＬＡに対する及び／またはＨＬＡ ｐＭＨＣＩもしくはｐＨＬＡにより結合もしくは提示される抗原性ペプチドに対する細胞のＴＣＲ結合を、異種ＣＤ８を欠く細胞と比較して改善させ得る。
【0155】
異種ＣＤ８は、任意選択的に抗原提示細胞、樹状細胞、及び／または腫瘍細胞もしくはがん細胞、または腫瘍組織もしくはがん組織の表面上での、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞の細胞（ＴＣＲ）／ペプチド主要組織適合複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）相互作用のｏｆｆ速度（ｋｏｆｆ）、故にその半減期を、異種ＣＤ８を欠く細胞（ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞）と比較して改善または増加させることができ、それにより改善された連結親和性及び／または結合力も提供することができる。異種ＣＤ８は、幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞表面上のＴＣＲの組織化を改善し、ｐＨＬＡ結合における協同作用を可能にすることができ、かつ改善された治療的結合力を提供することができる。したがって、異種ＣＤ８補助受容体で改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞は、ＬＣＫ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）に亜鉛依存的に結合または相互作用して、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κΒ、及びＡＰ－１などの転写因子を活性化することができる。
【0156】
改変人工多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞と比較して、任意選択的にがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原（任意選択的にがん細胞または組織の腫瘍によって提示される）に応答して、改善されたまたは増加したＣＤ４０Ｌの発現、サイトカイン産生、細胞傷害性活性、樹状細胞成熟の誘導、または樹状細胞サイトカイン産生の誘導を有し得る。
【0157】
共刺激リガンド
改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、外因性または異種または組換え共刺激リガンド、少なくとも１つ、任意選択的に１つ、２つ、３つ、または４つの共刺激リガンドを更に含み得る（例えば、発現または提示し得る）（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共刺激リガンドをコードする核酸を形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。改変細胞（複数可）は、異種ＴＣＲ及び少なくとも１つの外因性共刺激リガンドを共発現し得る。異種ＴＣＲと少なくとも１つの外因性共刺激リガンドとの間の相互作用は、非抗原特異的シグナル及び細胞の活性化を提供し得る。
改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、外因性または異種または組換え共刺激リガンド、少なくとも１つ、任意選択的に１つ、２つ、３つ、または４つの共刺激リガンドを更に含み得る（例えば、発現または提示し得る）（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、共刺激リガンドをコードする核酸を形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。改変細胞（複数可）は、異種ＴＣＲ及び少なくとも１つの外因性共刺激リガンドを共発現し得る。異種ＴＣＲと少なくとも１つの外因性共刺激リガンドとの間の相互作用は、非抗原特異的シグナル及び細胞の活性化を提供し得る。
【0158】
共刺激リガンドとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとしては、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤｌ５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦＰ）／リンホトキシン－アルファ（ＬＴａ）、リンホトキシン－ベータ（ＴＴｂ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－ｌ、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は免疫グロブリンと構造的特徴を共有しており、すなわちこれらは免疫グロブリンドメイン（折り畳み）を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとしては、いずれもＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬまたはＣＤ８０であり得、好ましくは、少なくとも１つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬである。
【0159】
改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞は、２つの外因性または組換え共刺激リガンドを含み得、好ましくは、２つの外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ及びＣＤ８０である。
【0160】
改変細胞は、免疫抑制性腫瘍微小環境を克服する外因性または組換えの少なくとも１つのコンストラクトを含み得る（例えば、細胞は、例えば遺伝子ノックインによって、当該少なくとも１つのコンストラクトをコードする核酸を形質導入されるか、またはそれを含むように操作される）。そのようなコンストラクトは、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ及びドミナントネガティブ形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）受容体ＩＩであり得るが、これらに限定されない。改変幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えば改変Ｔ細胞または改変Ｔ細胞の集団は、当該細胞の細胞溶解活性に正の影響を及ぼすサイトカインを放出するように操作され得る。そのようなサイトカインとしては、インターロイキン－７、インターロイキン－１５、及びインターロイキン－２１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0161】
細胞機能及び活性化
本発明は、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞を提供し、ここで、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞及び／または異種ＴＣＲを、抗原またはペプチド抗原、例えば、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原を発現または提示するがん及び／または腫瘍細胞または組織に結合させることにより、任意選択的に以下のいずれか１つ以上によって決定される、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の活性化及び／または機能を誘導することができる。
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、またはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上のアップレギュレーション、
（ｃ）抗原または抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性の誘導、
（ｄ）抗原または抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を殺傷する能力、
（ｅ）サイトカイン及び／またはインターフェロンのｉＰＳＣまたは造血系統細胞の分泌の増加、
（ｆ）例えば細胞マーカーにより判断される（例えばＫｉ６７発現レベルにより判断される）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の増殖の増加、
（ｇ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の抗原応答性の増加、
（ｈ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の標的細胞殺傷の増加、
（ｉ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞のＣＤ２８シグナル伝達の増加、
（ｊ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の腫瘍浸潤能の増加、
（ｋ）樹状細胞提示抗原を認識しかつそれに結合する、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の能力の増加、
（ｌ）例えば、Ｔ－ｒｅｇ、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現、またはＣＣＬ３、ＩＬ８、ＩＬ１β、ＣＸＣＬ１０、もしくはｓＩＬ２Ｒαから選択される血清サイトカインレベル、またはＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、もしくはＴＩＧＩＴから選択される抑制性受容体のレベルに対する抑制性応答の低減により決定される、Ｔ細胞抑制因子に抵抗するｉＰＳＣまたは造血系統細胞の能力の増加、あるいは
（ｍ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞による、インターフェロン－γ、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びグランザイムＢのレベルの増加。
本発明は、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞を提供し、ここで、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞及び／または異種ＴＣＲを、抗原またはペプチド抗原、例えば、がん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、あるいは本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原を発現または提示するがん及び／または腫瘍細胞または組織に結合させることにより、任意選択的に以下のいずれか１つ以上によって決定される、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の活性化及び／または機能を誘導することができる。
（ａ）Ｔ細胞活性化マーカー、例えばＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及び／またはＣＤ２５のいずれかのアップレギュレーション、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、またはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上のアップレギュレーション、
（ｃ）抗原または抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性の誘導、
（ｄ）抗原または抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞を殺傷する能力、
（ｅ）サイトカイン及び／またはインターフェロンのｉＰＳＣまたは造血系統細胞の分泌の増加、
（ｆ）例えば細胞マーカーにより判断される（例えばＫｉ６７発現レベルにより判断される）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の増殖の増加、
（ｇ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の抗原応答性の増加、
（ｈ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の標的細胞殺傷の増加、
（ｉ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞のＣＤ２８シグナル伝達の増加、
（ｊ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の腫瘍浸潤能の増加、
（ｋ）樹状細胞提示抗原を認識しかつそれに結合する、ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の能力の増加、
（ｌ）例えば、Ｔ－ｒｅｇ、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現、またはＣＣＬ３、ＩＬ８、ＩＬ１β、ＣＸＣＬ１０、もしくはｓＩＬ２Ｒαから選択される血清サイトカインレベル、またはＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、もしくはＴＩＧＩＴから選択される抑制性受容体のレベルに対する抑制性応答の低減により決定される、Ｔ細胞抑制因子に抵抗するｉＰＳＣまたは造血系統細胞の能力の増加、あるいは
（ｍ）ｉＰＳＣまたは造血系統細胞による、インターフェロン－γ、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びグランザイムＢのレベルの増加。
【0162】
好ましくは、（ａ）～（ｍ）のｉＰＳＣまたは造血系統細胞は、Ｔ細胞である。
【0163】
ＴＣＲ＋細胞の持続性
本発明はまた、本明細書に記載される異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現または提示する改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の持続性の測定により決定される、ＴＣＲ＋細胞の持続性の改善を例えば培養物中または対象試料中で示す、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞を提供する。注入された、操作されかつ改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の持続性は、治療効果と相関し、また長期安全性の尺度でもある。細胞持続性は、ｑＰＣＲまたはフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって決定され得る。例えば、ＤＮＡ由来のコード遺伝子のＰＣＲによるＴＣＲ＋（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲまたはＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ）細胞の定量化。あるいは、異種ＴＣＲに関連するＴ細胞の表現型及び活性の定量化は、様々なアッセイ、例えば、
・細胞生成物／培養物中または注入前及び注入後の対象血液中のＴ細胞系統を決定するための表現型分析
・細胞生成物／培養物中のまたは対象試料由来のＴ細胞の老化及び活性化状態の定量化
・ＴＣＲ＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能を反映する可溶性因子の定量化、により決定され得る。
本発明はまた、本明細書に記載される異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現または提示する改変多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の持続性の測定により決定される、ＴＣＲ＋細胞の持続性の改善を例えば培養物中または対象試料中で示す、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞を提供する。注入された、操作されかつ改変された多能性幹細胞ｉＰＳＣまたは造血系統細胞の持続性は、治療効果と相関し、また長期安全性の尺度でもある。細胞持続性は、ｑＰＣＲまたはフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって決定され得る。例えば、ＤＮＡ由来のコード遺伝子のＰＣＲによるＴＣＲ＋（例えば、ＡＦＰ ＴＣＲまたはＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ）細胞の定量化。あるいは、異種ＴＣＲに関連するＴ細胞の表現型及び活性の定量化は、様々なアッセイ、例えば、
・細胞生成物／培養物中または注入前及び注入後の対象血液中のＴ細胞系統を決定するための表現型分析
・細胞生成物／培養物中のまたは対象試料由来のＴ細胞の老化及び活性化状態の定量化
・ＴＣＲ＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能を反映する可溶性因子の定量化、により決定され得る。
【0164】
核酸コンストラクトまたはベクター
本発明はまた、本発明による異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、異種ＴＣＲをコードする核酸領域を組み込むための細胞ゲノム内の遺伝子座にある核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む核酸コンストラクトまたはベクターを提供する。好ましくは、遺伝子座は本明細書で前述したとおりである。
本発明はまた、本発明による異種ＴＣＲをコードする核酸領域と、異種ＴＣＲをコードする核酸領域を組み込むための細胞ゲノム内の遺伝子座にある核酸領域に相同な核酸領域を含む少なくとも１つの相同領域と、を含む核酸コンストラクトまたはベクターを提供する。好ましくは、遺伝子座は本明細書で前述したとおりである。
【0165】
好ましくは、遺伝子座は、伸長因子複合体のメンバー、好ましくは翻訳伸長因子、好ましくは真核生物翻訳伸長因子１アルファ１をコードする遺伝子であるかまたはその中にあり、任意選択的に、遺伝子座は、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子のエクソン８にあり、任意選択的に、ＴＡＧ終止コドンの前に、あるいはＴＡＧ終止コドンに直接隣接して及び／またはＴＡＧ終止コドンの前にある。
【0166】
異種ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖のコード配列、例えば本明細書に記載されるものを、任意選択的に、酵素切断部位を含むペプチドをコードする介在核酸配列及び／またはリボソームスキッピングを媒介する核酸配列とともに含むことができ、好ましくは、酵素切断部位を含むペプチドをコードする核酸配列は、フューリン切断部位、好ましくはＲＡＫＲをコードし、好ましくは、リボソームスキッピングを媒介する核酸配列は、リボソームスキップ配列、好ましくはＴ２Ａ及び／またはＰ２Ａスキップ配列である。
【0167】
コンストラクトまたはベクターは、異種ＴＣＲをコードする核酸領域を組み込むための細胞ゲノム内の遺伝子座にある核酸領域にそれぞれ相同である左側及び／または右側相同領域を含むことができ、これは任意選択的に、組み込み部位の反対側に隣接する。
【0168】
したがって、コンストラクトまたはベクターは、
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、例えば配列番号４８のｌｏｘＰ配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、任意選択的にネオマイシン耐性遺伝子、好ましくは、プロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現されるもの、例えば配列番号４７のＥＦ１Ａプロモーター配列、のいずれか１つ以上を更に含み得る。
（ａ）組換え標的配列、好ましくはｌｏｘＰ（Ｘ－ｏｖｅｒ Ｐ１の遺伝子座）配列、例えば配列番号４８のｌｏｘＰ配列、
（ｂ）発現可能な選択マーカー配列、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、任意選択的にネオマイシン耐性遺伝子、好ましくは、プロモーター、例えばＥＦ１Ａプロモーターから構成的に発現されるもの、例えば配列番号４７のＥＦ１Ａプロモーター配列、のいずれか１つ以上を更に含み得る。
【0169】
コンストラクトまたはベクターは、配列番号４５の配列を含む異種ＴＣＲ、配列番号４３及び配列番号４４の配列を含む相同領域、ならびに任意選択的に、配列番号４８を含む組換え標的配列、及び／または配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５６を含む発現可能な選択マーカー配列、をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、コンストラクトまたはベクターは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含み得る。
【0170】
細胞集団の生成
本発明は更に、本発明による核酸コンストラクトまたはベクターを、未改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞（任意選択的に本明細書に記載のもの）に、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列の組み込みを可能にする条件下で導入すること、及び任意選択的に、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を単離すること、を含む、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞を生成するプロセスを提供する。このプロセスは、ＡＡＶ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または操作されたメガヌクレアーゼを用いるものなどの既知のゲノム編集手法を使用して達成することができる。
本発明は更に、本発明による核酸コンストラクトまたはベクターを、未改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞（任意選択的に本明細書に記載のもの）に、細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列の組み込みを可能にする条件下で導入すること、及び任意選択的に、改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞を単離すること、を含む、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、例えばＴ細胞を生成するプロセスを提供する。このプロセスは、ＡＡＶ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または操作されたメガヌクレアーゼを用いるものなどの既知のゲノム編集手法を使用して達成することができる。
【0171】
好ましい実施形態は、本発明による核酸コンストラクトまたはベクターを未改変ｉＰＳＣに導入して、改変ｉＰＳＣ（任意選択的に本明細書に記載のもの）を生成すること、及び改変ｉＰＳＣをＴ細胞に分化させることに関するプロセスを提供する。例えば、Ｔ細胞の集団を生成する方法は、
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をｉＰＳＣの集団の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、及び
（ｉｉ）ｉＰＳＣの集団をＴ細胞に分化させること、を含み得る。
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をｉＰＳＣの集団の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、及び
（ｉｉ）ｉＰＳＣの集団をＴ細胞に分化させること、を含み得る。
【0172】
他の実施形態は、改変免疫細胞、例えばＴ細胞の生成に関するプロセスを提供する。例えば、Ｔ細胞の集団を生成する方法は、
（ｉ）任意選択的に、ｉＰＳＣの集団をＴ細胞（もしくは他の免疫細胞）に分化させること、またはＴ細胞（もしくは他の免疫細胞）の集団を異なる供給源から得ること；及び
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をＴ細胞（または他の免疫細胞）の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、を含み得る。
（ｉ）任意選択的に、ｉＰＳＣの集団をＴ細胞（もしくは他の免疫細胞）に分化させること、またはＴ細胞（もしくは他の免疫細胞）の集団を異なる供給源から得ること；及び
（ｉ）Ｔ細胞受容体をコードする異種核酸をＴ細胞（または他の免疫細胞）の細胞ゲノム内の遺伝子座にまたはその中に導入すること、を含み得る。
【0173】
好ましくは、細胞ゲノム内の遺伝子座は、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）遺伝子である。
【0174】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するためのｉＰＳＣは、ＲＡＧ不活化ｉＰＳＣ（ＲＡＧ－／－ｉＰＳＣ）、例えばＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２不活化ｉＰＳＣであり得る。
【0175】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団は、ｉＰＳＣの集団を造血系統細胞に分化させ、造血系統細胞をＴ細胞に分化及び／または成熟させることにより、Ｔ細胞に分化させることができる。例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を、
（ｉ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を中胚葉細胞に分化させること；
（ｉｉ）中胚葉細胞（ＭＣ）を分化させて造血内皮細胞（ＨＥＣ）の集団を生成すること；
（ｉｉｉ）ＨＥＣを造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団に分化させること；
（ｉｖ）ＨＰＣの集団を前駆Ｔ細胞に分化させること；及び
（ｖ）前駆Ｔ細胞を成熟させて二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生成すること、を含む方法により、Ｔ細胞に分化させることができる。
（ｉ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団を中胚葉細胞に分化させること；
（ｉｉ）中胚葉細胞（ＭＣ）を分化させて造血内皮細胞（ＨＥＣ）の集団を生成すること；
（ｉｉｉ）ＨＥＣを造血前駆細胞（ＨＰＣ）の集団に分化させること；
（ｉｖ）ＨＰＣの集団を前駆Ｔ細胞に分化させること；及び
（ｖ）前駆Ｔ細胞を成熟させて二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生成すること、を含む方法により、Ｔ細胞に分化させることができる。
【0176】
本方法は、
（ｖｉ）Ｔ細胞を活性化及び増大させて、単一陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団または単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生成することを更に含み得る。
（ｖｉ）Ｔ細胞を活性化及び増大させて、単一陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団または単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生成することを更に含み得る。
【0177】
本明細書に記載される方法の工程における細胞集団の分化及び成熟は、分化因子のセットを補充した培養培地で細胞を培養することにより誘導される。各培養培地について挙げられる分化因子のセットは、好ましくは網羅的であり、培地は他の分化因子を欠いていてもよい。好ましい実施形態では、培養培地は既知組成培地である。例えば、培養培地は、後述するように、有効量の１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。既知組成栄養培地は、１つ以上の無血清培養培地サプリメントを補充した基本培地を含み得る。
【0178】
分化因子は、哺乳動物細胞の分化を媒介するシグナル伝達経路を調整する、例えば促進または阻害する因子である。分化因子は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、またはＢＭＰシグナル伝達経路のうちの１つ以上を調整する成長因子、サイトカイン、及び小分子を含み得る。分化因子の例としては、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、レチノイン酸、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＧＦβリガンド、ＧＤＦ、ＬＩＦ、インターロイキン、ＧＳＫ－３阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤が挙げられる。
【0179】
本明細書に記載される培地のうちの１つ以上で使用される分化因子には、ＴＧＦβリガンド、例えばアクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ－９９０２１）、インターロイキン、ならびにＩＧＦ－１及びアンギオテンシンＩＩなどのホルモンが含まれる。分化因子は、培地で培養される細胞におけるシグナル伝達経路を調整するのに有効な量で、本明細書に記載される培地に存在し得る。
【0180】
いくつかの実施形態では、培養培地中の、上記または下記に挙げる分化因子を、同じシグナル伝達経路に対して同じ効果（すなわち刺激または阻害）を及ぼす因子によって置き換えてもよい。好適な因子は、当該技術分野で公知であり、タンパク質、核酸、抗体、及び小分子を含む。
【0181】
各工程中の細胞集団の分化の程度は、分化中の細胞集団における１つ以上の細胞マーカーの発現をモニタリングする及び／または検出することによって決定され得る。例えば、分化度の高い細胞型に特徴的なマーカーの発現の増加、または分化度の低い細胞型に特徴的なマーカーの発現の減少が決定され得る。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学、免疫蛍光、ＲＴ－ＰＣＲ、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び酵素分析を含む任意の好適な技法によって決定され得る。好ましい実施形態では、マーカーが細胞表面上で検出可能であれば、細胞はマーカーを発現すると言える。例えば、本明細書においてマーカーを発現しないと記載される細胞は、マーカー遺伝子の活発な転写及び細胞内発現を示す可能性があるが、細胞の表面に検出可能なレベルのマーカーは存在しない可能性がある。
【0182】
本明細書に記載される方法の一工程によって生成される、部分的に分化した細胞の集団は、次の分化工程の前に培養する、維持する、または増大させることができる。部分的に分化した細胞は、任意の簡便な技法によって増大させることができる。
【0183】
各工程の後、その工程によって生成される部分的に分化した細胞の集団は、培地中での培養後に、１％以上、５％以上、１０％以上、または１５％以上の部分的に分化した細胞を含有し得る。必要に応じて、部分的に分化した細胞の集団は、ＭＡＣまたはＦＡＣＳなどの任意の簡便な技法によって精製することができる。
【0184】
細胞は、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた表面または基質上で、フィーダー細胞の非存在下で単層において培養することができる。細胞培養に好適な技法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５ Ｏｃｔ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９ Ｄｅｃ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ（２ Ａｕｇ ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３、Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０－５２、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ｅｄ．Ｒ．Ｌａｎｚａ）ＩＳＢＮ：０１２４３６６４３０）Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９７）、‘Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’ｂｙ Ａ．Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）、‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ’ｂｙ Ａ．Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｍ．Ｒａｏ（２００３）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ’ｂｙ Ａ．Ｂｏｎｇｓｏ（２００５）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＆Ｌｏｒｉｎｇ（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｕａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ（２００６）を参照されたい）。培地及びその成分は、商業的供給源（例えばＧｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から取得され得る。上記の培養工程では、標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、５％または２１％の酸素、５％の二酸化炭素を用いることができる。培地は２日ごとに交換し、細胞を重力によって沈降させることが好ましい。
【0185】
細胞は培養容器内で培養され得る。好適な細胞培養容器は、当該技術分野で周知であり、培養プレート、ディッシュ、フラスコ、バイオリアクター、及びマルチウェルプレート、例えば６ウェル、１２ウェル、または９６ウェルプレートを含む。
【0186】
培養容器は、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質で容器の１つ以上の表面をコーティングすることによって、組織培養用に処理されることが好ましい。培養容器は、標準的技法を使用して、例えば本明細書に記載されるコーティング溶液とともにインキュベートすることによって組織培養用に処理してもよく、または商業的供給者から前処理されたものを取得してもよい。
【0187】
第１段階では、中胚葉分化を促進する好適な条件下でｉＰＳＣの集団を培養することにより、ｉＰＳＣが中胚葉細胞に分化し得る。例えば、ｉＰＳＣ細胞は、中胚葉細胞への分化を誘導するために第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で連続的に培養され得る。
【0188】
好適な第１の中胚葉誘導培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、アクチビンを含み得る。
【0189】
好適な第２の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し得る。例えば、第２の中胚葉誘導培地は、アクチビン、好ましくはアクチビンＡ、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、及びＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦを含み得る。
【0190】
好適な第３の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害し得る。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、アクチビン、好ましくはアクチビンＡ、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。
【0191】
第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は、上記の分化因子以外の分化因子を欠いていてもよい。
【0192】
ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介細胞内シグナル伝達経路は、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第１のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。第１のＴＧＦβリガンドは、アクチビンであり得る。アクチビン（アクチビンＡ：ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６２４ 核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２ ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１ ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路の刺激を介して様々な細胞効果を及ぼす二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１８：４４９５－４５０９（２００５））。アクチビンは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される培地中のアクチビンの濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５～５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0193】
第２及び第３の中胚葉誘導培地の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性は、培地中の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の存在によって提供され得る。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することによって細胞の成長、増殖、及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。好適な線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＦＧＦ１～ＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３のいずれか１つを含む。好ましくは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２（別称ｂＦＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、ＦＧＦ７（別称ケラチノサイト成長因子（またはＫＧＦ）、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、またはＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子はＦＧＦ２である。
【0194】
好都合なことに、本明細書に記載される培地中のＦＧＦ、例えばＦＧＦ２の濃度は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子は、慣例的な組換え技法を使用して生成するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。
【0195】
ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介細胞内シグナル伝達経路は、第２及び第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第２のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。
【0196】
第２のＴＧＦβリガンドは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）であり得る。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９によって媒介される経路を通じて細胞内シグナル伝達を刺激する。好適な骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰファミリーのいずれかのメンバー、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、またはＢＭＰ７を含む。好ましくは、第２のＴＧＦβリガンドは、ＢＭＰ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５０、核酸配列ＮＭ＿００１２００．２ ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１ ＧＩ：４５５７３６９）またはＢＭＰ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５２、核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３ ＧＩ：１５７２７６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２ ＧＩ：１５７２７６５９３）である。好適なＢＭＰはＢＭＰ４を含む。好都合なことに、本明細書に記載される培地中の骨形態形成タンパク質、例えばＢＭＰ２またはＢＭＰ４の濃度は、１～５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。ＢＭＰは、慣例的な組換え技法を使用して生成するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。
【0197】
第３の中胚葉誘導培地中のＧＳＫ３β阻害活性は、培地中のＧＳＫ３β阻害剤の存在によって提供され得る。ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（遺伝子ＩＤ ２９３２：ＥＣ２．７．１１．２６）の活性を阻害する。好ましい阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの活性を特異的に阻害する。好適な阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６－（（２－（（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル；Ｒｉｎｇ Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５８８－５９５（２００３））、アルステルパウロン、ケンパウロン、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ｊａｎ；１０（１）：５５－６３）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、リチウム及びＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；Ｃｏｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；７（１０）：７９３－８０３）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。好適なグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤は、商業的供給者（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＭＩ ＵＳＡ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，ＭＡ ＵＳＡ）から取得することができる。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、０．１～１００μＭ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５μＭのいずれか、好ましくは約１０μＭのＧＳＫ３β阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１を含有し得る。
【0198】
好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は、既知組成培地である。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充した既知組成栄養培地からなることができ、第２の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦとを補充した既知組成栄養培地からなることができ、第３の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ－９９０２１、例えば１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１とを補充した既知組成栄養培地からなることができる。
【0199】
既知組成培地（ＣＤＭ）は、特定の成分、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する、細胞を培養するための栄養溶液である。ＣＤＭは、フィーダー細胞、間質細胞、血清、及びｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のような複雑な細胞外マトリックスなどの不定成分を含めた不定の成分または構成成分を欠いている。例えば、ＣＤＭは、ＤＬＬ１またはＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９細胞などの間質細胞を含有しない。
【0200】
既知組成栄養培地は、既知組成基本培地を含み得る。好適な既知組成基本培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、改良されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ Ｆｏｃｕｓ（２００３），２５ ３－６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１３９－１４２（１９７４））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ．３，５０３－５０８）、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４ ＰＬＵＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。
【0201】
基本培地には、培地中に無血清培養培地サプリメント及び／または追加の成分を補充してもよい。好適なサプリメント及び追加の成分は上述されており、Ｌ－グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）などの代替物、アスコルビン酸、モノチオールグリセロール（ＭＴＧ）、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質、ヒト血清アルブミン、例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｉｇｍａ）及びＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（商標）（ａｌｂｕｍｅｄｉｘ．ｃｏｍ）などの組換えヒト血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、ならびに２－メルカプトエタノールを含み得る。基本培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの血清代替物を補充してもよい。
【0202】
ｉＰＳＣは、中胚葉細胞の集団を生成するために、第１の中胚葉誘導培地で１～１２時間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間のいずれか、好ましくは約４時間培養され、次いで第２の中胚葉誘導培地で３０～５４時間、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０時間のいずれか、好ましくは約４４時間培養され、次いで第３の中胚葉誘導培地で３６～６０時間、例えば３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３時間のいずれか、好ましくは約４８時間培養され得る。
【0203】
中胚葉細胞は、中胚葉系統にコミットした部分的に分化した前駆細胞であり、適切な条件下で間葉（線維芽細胞）、筋肉、骨、脂肪、血管、及び造血系の全ての細胞型に分化することができる。中胚葉細胞は、１つ以上の中胚葉マーカーを発現し得る。例えば、中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、及びＰＤＧＦαＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ全てを発現し得る。
【0204】
第２段階では、造血内皮（ＨＥ）分化を促進する好適な条件下で中胚葉細胞の集団を培養することにより、中胚葉細胞が造血内皮細胞（ＨＥＣ）に分化し得る。例えば、ｉＰＳＣ細胞は、ＨＥ誘導培地で培養され得る。
【0205】
好適なＨＥ誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。例えば、ＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ及びＶＥＧＦを含み得る。
【0206】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ受容体に結合し、脈管形成及び血管新生を刺激するＰＤＧＦファミリーのタンパク質因子である。好適なＶＥＧＦは、ＶＥＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＶＥＧＦ－Ａ～ＶＥＧＦ－Ｄ及びＰＩＧＦのうちのいずれか１つを含む。好ましくは、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ（別称ＶＥＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４２２、核酸配列ＮＭ＿００１０２５３６６．２、アミノ酸配列ＮＰ＿００１０２０５３７．２）である。ＶＥＧＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載されるＨＥ誘導培地中のＶＥＧＦの濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0207】
ＨＥ誘導培地のいくつかの例では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激するＶＥＧＦアクチベーターまたはアゴニストによって置き換えられ得る。好適なＶＥＧＦアクチベーターは、当該技術分野で公知であり、グレムリンなどのタンパク質（Ｍｉｔｏｌａ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１６（１８）３６７７－３６８０）、ｓｈＲＮＡなどの核酸（例えば、Ｔｕｒｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００９ Ｓｅｐ １１；１０５（６）：６０４－９）、ＣＲＩＳＰＲベースのプラスミド（例えば、ＶＥＧＦ ＣＲＩＳＰＲ活性化プラスミド；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、抗体及び小分子を含む。
【0208】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ＫＩＴ受容体（ＫＩＴがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ）（ＣＤ１１７；ＳＣＦＲ）に結合するサイトカインであり、造血に関与する。ＳＣＦ（別名ＫＩＴＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４２５４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８９９．５またはＮＭ＿０３９９４．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８９０．１またはＮＰ＿００３９８５．５を有し得る。ＳＣＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載されるＨＥ誘導培地中のＳＣＦの濃度は、１～１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0209】
好ましい実施形態では、ＨＥ誘導培地は既知組成培地である。例えば、ＨＥ誘導培地は、有効量のＶＥＧＦ、例えば１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと、ＳＣＦ、例えば１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。
【0210】
好適な既知組成栄養培地は上述されており、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。
【0211】
中胚葉細胞は、ＨＥ細胞の集団を生成するために、ＨＥ誘導培地で２～６日間、または３～５日間、好ましくは約４日間培養され得る。
【0212】
造血内皮細胞（ＨＥＣ）は、造血能を有し、適切な条件下で造血系統に分化することができる、部分的に分化した内皮前駆細胞である。ＨＥ細胞はＣＤ３４を発現し得る。いくつかの実施形態では、ＨＥＣは、ＣＤ７３またはＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）を発現しない場合がある。例えば、ＨＥ細胞は、表現型ＣＤ３４＋ＣＤ７３－またはＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－を有し得る。
【0213】
第３段階では、造血分化を促進する好適な条件下でＨＥ細胞の集団を培養することにより、造血内皮（ＨＥ）細胞が造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化し得る。例えば、ＨＥ細胞は、造血誘導培地で培養され得る。
【0214】
好適な造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路、（ｉｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路、（ｉｖ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路、（ｖ）ＩＧＦ１Ｒ及び／またはＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達経路、（ｖｉ）ＳＭＡＤ１、５及び９及び／またはＳＭＡＤ１、５及び９媒介シグナル伝達経路、（ｖｉｉ）ヘッジホッグ及び／またはヘッジホッグシグナル伝達経路、（ｖｉｉｉ）ＥｐｏＲ及び／またはＥｐｏＲ媒介シグナル伝達経路、ならびに（ｉｘ）ＡＧＴＲ２及び／またはＡＧＴＲ２媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。好適な造血誘導培地はまた、ＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１））及び／またはＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１））媒介シグナル伝達経路を阻害し得る。好適な造血誘導培地は、インターロイキン（ＩＬ）活性及びＦＧＦ活性も有し得る。
【0215】
例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストを含み得る。好適な造血誘導培地の一例は、以下の表１に示す第３段階培地である。
【0216】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板の生成を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＴＰＯ（別名ＴＨＰＯ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０６６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００４６０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００４５１．１を有し得る。ＴＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＴＰＯの濃度は、３～３００ｎｇ／ｍｌ、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、２７、３０、３２、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0217】
Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドまたはＦＬＴ３Ｌ）は、ＦＬＴ３受容体に結合する造血活性を有するサイトカインであり、前駆細胞の増殖及び分化を刺激する。Ｆｌｔ３リガンド（別名ＦＬＴ３ＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３２３）は、参照核酸配列ＮＭ＿００１２０４５０２．２及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１４３１．１を有し得る。Ｆｌｔ３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＦｌｔ３リガンドの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0218】
インターロイキン（ＩＬ）は、免疫の発達及び機能において重要な役割を果たすサイトカインである。造血誘導培地中のＩＬには、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、及びＩＬ－１１が含まれ得る。
【0219】
ＩＬ－３（別名ＩＬ３またはＭＣＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６２）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００５８８．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５７９．２を有し得る。ＩＬ－３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－３の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0220】
ＩＬ－６（別名ＩＬ６またはＨＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６００．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５９１．５を有し得る。ＩＬ－６は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－６の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0221】
ＩＬ－７（別名ＩＬ７、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５７４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８８０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８７１．１を有し得る。ＩＬ－７は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－７の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0222】
ＩＬ－１１（別名ＡＧＩＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５８９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６４１．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６３２．１を有し得る。ＩＬ－１１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－１１リガンドの濃度は、０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９５ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0223】
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）は、チロシンキナーゼＩＧＦ－１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）及びインスリン受容体に結合するホルモンであり、複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＩＧＦ－１（別名ＩＧＦまたはＭＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３４７９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６１８．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６０９．１を有し得る。ＩＧＦ－１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＧＦ－１の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0224】
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、脊椎動物の器官形成を調節するヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドである。ＳＨＨ（別名ＴＰＴまたはＨＨＧ１、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００１９３．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００１８４．１を有し得る。ＳＨＨは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＳＨＨの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0225】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）に結合する糖タンパク質サイトカインであり、赤血球形成を刺激する。ＥＰＯ（別名ＤＢＡＬ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２０５６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００７９９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００７９０．２を有し得る。ＥＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＥＰＯの濃度は、０．０２～２０Ｕ／ｍｌ、例えば約０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、または１９Ｕ／ｍｌのいずれか、好ましくは約２Ｕ／ｍｌであり得る。
【0226】
アンギオテンシンＩＩは、アンギオテンシンＩに対するアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用によって形成されるヘプタペプチドホルモンである。アンギオテンシンＩＩは、血管収縮を刺激する。アンギオテンシンＩ及びＩＩは、参照核酸配列ＮＭ＿００００２９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００００２０．１を有し得るアンギオテンシノーゲン（別名ＡＧＴ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１８３）の切断によって形成される。アンギオテンシンＩＩは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｔｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩの濃度は、０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0227】
アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト（ＡＲＢ）は、ＡＴ１受容体（ＡＧＴＲ１；遺伝子ＩＤ １８５）の活性化を選択的に遮断する化合物である。好適なＡＴ１アンタゴニストとしては、ロサルタン（２－ブチル－４－クロロ－１－｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）－４－ビフェニリル］メチル｝－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール）、バルサルタン（（２Ｓ）－３－メチル－２－（ペンタノイル｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）ビフェニル－４－イル］メチル｝アミノ）ブタン酸）、及びテルミサルタン（４’［（１，４’－ジメチル－２’－プロピル［２，６’－ビ－１Ｈ－ベンズイミダゾール］－１’－イル）メチル］［１，１’－ビフェニル］－２－カルボン酸が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＴ１アンタゴニストはロサルタンである。好適なＡＴ１アンタゴニストは、商業的供給者（例えばＴｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＭＩ ＵＳＡ）から取得することができる。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストの濃度は、１～１０００μＭ、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍｌのいずれか、好ましくは約１００μＭであり得る。
【0228】
好ましい実施形態では、造血誘導培地は既知組成培地である。例えば、造血誘導培地は、有効量の、例えば１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと、例えば１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦと、例えば３０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３と、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６と、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７と、例えば５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１と、例えば２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１と、ＢＭＰ、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、例えば５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、例えば２５ｎｇ／ｍｌのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）と、例えば２Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と、例えば１０μｇ／ｍｌのアンギオテンシンＩＩと、アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト、例えば１００μＭのロサルタンとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適な造血誘導培地は、他の分化因子を欠いていてもよい。例えば、造血誘導培地は、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなることができ、ここで、１つ以上の分化因子は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストからなる（すなわち、培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト以外の分化因子を含有しない）。
【0229】
好適な既知栄養培地は上述されており、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４ ＰＬＵＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または後述するようなアルブミン、インスリン、セレニウムトランスフェリン、及び脂質を補充したＩＭＤＭなどの基本培地を含む。
【0230】
ＨＥ細胞は、ＨＰＣの集団を生成するために、造血誘導培地で８～２１日間、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間のいずれか、好ましくは約１６日間培養され得る。
【0231】
ＨＰＣ（別名造血幹細胞）は、造血系統にコミットした多分化能性幹細胞であり、単球、Ｂ細胞、及びＴ細胞を含む、骨髄系統及びリンパ系統を含めた全ての血液細胞型への更なる造血分化が可能である。ＨＰＣはＣＤ３４を発現し得る。ＨＰＣは、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、及びＦＬＫ１（別称ＫＤＲまたはＶＥＧＦＲ２）を共発現する場合があり、ＣＤ３８及び他の系統特異的マーカーの発現について陰性であり得る。例えば、ＨＰＣは、表現型ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ４５＋ＦＬＫ１＋ＣＤ３８－を示し得る。
【0232】
ＨＥ細胞からＨＰＣを作製した後、１つ以上のＣＤ３４などの細胞表面マーカーを発現するＨＰＣの集団は、更なる分化に供される前に、例えば磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により精製され得る。例えば、ＣＤ３４＋ＨＰＣの集団が精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、ＨＥ誘導培地で８日間、例えば８、９、または１０日間の培養後に精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、１６日間の分化後、例えば分化方法の１６、１７、または１８日目に精製され得る。
【0233】
第４段階において、造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、リンパ系分化を促進する好適な条件下でＨＰＣの集団を培養することにより、前駆Ｔ細胞に分化し得る。例えば、造血前駆細胞は、リンパ系増大培地で培養され得る。
【0234】
リンパ系増大培地は、前駆Ｔ細胞へのＨＰＣのリンパ系分化を促進する細胞培養培地である。
【0235】
好適なリンパ系増大培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｖ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、リンパ系増大培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７を含み得る。
【0236】
好ましい実施形態では、リンパ系増大培地は、既知組成培地である。例えば、リンパ系増大培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なリンパ系増大培地は、当該技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）リンパ系増大サプリメント（カタログ番号９９１５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を含む。
【0237】
ＨＰＣは、前駆Ｔ細胞への分化中に表面上で培養され得る。例えば、ＨＰＣは、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。
【0238】
好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当該技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。
【0239】
表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、もしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを含み、細胞外マトリックスタンパク質または細胞表面接着タンパク質を含まないコーティングを有し得る。
【0240】
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンド、ビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及びＶＣＡＭ１などの細胞表面接着タンパク質を含むコーティングを有し得る。表面は、表面をコーティング溶液と接触させることにより、細胞外マトリックスタンパク質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、及び細胞表面接着タンパク質でコーティングされ得る。例えば、コーティング溶液は、表面をコーティングするのに好適な条件下で、表面上でインキュベートされ得る。条件は、例えば、室温で約２時間を含み得る。細胞外マトリックスタンパク質とＮｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子とを含むコーティング溶液は、商業的供給者から入手可能である（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ；カタログ番号９９２５；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）。
【0241】
ＨＰＣは、基質または表面上のリンパ系増大培地で、ＨＰＣを前駆Ｔ細胞に分化させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、ＨＰＣは、２～６週間、２～５週間、または２～４週間、好ましくは３週間培養され得る。
【0242】
前駆Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、組織常在性Ｔ細胞、及びＮＫＴ細胞を生じさせることができる多分化能性リンパ球生成前駆細胞である。前駆Ｔ細胞は、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にαβＴ細胞系統にコミットし得る。前駆Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで胸腺に定着することができる可能性があり、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にＴ細胞系統にコミットすることができる可能性がある。前駆Ｔ細胞は、サイトカイン産生ＣＤ３＋Ｔ細胞に成熟することができる可能性もある。
【0243】
前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＣＤ７を発現する場合があり、すなわち、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型を有する場合がある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２５、及びＣＤ２を共発現する場合もある。例えば、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋ＣＤ２＋表現型を有し得る。いくつかの実施形態では、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４５を共発現する場合もある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の発現、例えば細胞表面での発現を欠く場合がある。
【0244】
第５段階では、Ｔ細胞成熟を促進する好適な条件下で前駆Ｔ細胞の集団を培養することにより、前駆Ｔ細胞がＴ細胞へと成熟し得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、Ｔ細胞成熟培地で培養され得る。
【0245】
Ｔ細胞成熟培地は、成熟Ｔ細胞への前駆Ｔ細胞の成熟を促進する細胞培養培地である。好適なＴ細胞成熟培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）を刺激し、及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ７を含み得る。
【0246】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞成熟培地は既知組成培地である。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なＴ細胞成熟培地は、当該技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）Ｔ細胞成熟サプリメント（カタログ番号９９３０；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）、ならびにＥｘＣｅｌｌｅｒａｔｅヒトＴ細胞増大培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）などのＰＢＭＣ及びＣＤ３＋細胞の増大に好適な他の培地を含む。他の好適なＴ細胞成熟培地には、本明細書の他の箇所に記載されるような、ＩＴＳ、アルブミン、及び脂質を補充し、有効量の上記の分化因子を更に補充した、ＩＭＤＭなどの基本培地が含まれ得る。
【0247】
前駆Ｔ細胞は、表面上で培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。
【0248】
好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当該技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、もしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。好適なコーティングは、当該技術分野で周知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0249】
前駆Ｔ細胞は、基質または表面上のＴ細胞成熟培地で、前駆Ｔ細胞をＴ細胞に成熟させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、１～４週間、好ましくは２または３週間培養され得る。
【0250】
いくつかの実施形態では、前駆Ｔ細胞の成熟により生成されるＴ細胞は、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【0251】
上述の方法により、前駆Ｔ細胞がＴ細胞へと成熟し得る。Ｔ細胞（別名Ｔリンパ球）は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、他のリンパ球から区別され得る。Ｔ細胞には数種類あり、各種類が異なる機能を有する。
【0252】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫系において重要な役割を果たし、Ｔ細胞サイトカインを放出して免疫応答の抑制または調節を助けることによって他の免疫細胞の活動を助ける。これらは、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び成長に不可欠である。
【0253】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊するように作用する。大部分のＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子により感染細胞または損傷細胞の表面に提示された特異的抗原を認識することができるＴＣＲを発現する。抗原及びＭＨＣ分子へのＴＣＲ及びＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、Ｔ細胞を介した感染細胞または損傷細胞の破壊をもたらす。
【0254】
本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞は、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、または単一陽性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【0255】
本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞は、成熟ＣＤ３＋Ｔ細胞であり得る。例えば、細胞は、ＴＣＲ＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４＋表現型を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ２８も発現し得る。
【0256】
本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞は、γδＴ細胞、αβＴ細胞、またはＮＫＴ細胞であり得る。
【0257】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞は、αβＴ細胞である。
【0258】
前駆Ｔ細胞の成熟（第５段階）の後、Ｔ細胞の集団は、主に二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【0259】
第６段階では、単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはより好ましくは単一陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するように、またはその割合を増加させるように、ＴＣＲ Ｔ細胞の集団を活性化及び／または増大させることができる。Ｔ細胞を活性化及び増大させるための好適な方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞は、適切な培養条件下でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露され得る。好適なＴＣＲアゴニストとしては、ビーズまたは樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子（ＭＨＣ－ペプチド複合体）上に提示されるペプチドなどのリガンド、及び抗ＴＣＲ抗体などの可溶性因子、例えば抗体ＣＤ２８抗体、及びＭＨＣ－ペプチド四量体、五量体、またはデキストラマーなどの多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体が挙げられる。
【0260】
活性化とは、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を行っているＴ細胞を指す。
【0261】
抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３、またはαＣＤ２８などのＴＣＲの成分に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に好適な抗ＴＣＲ抗体は、当該技術分野で周知であり（例えばＯＫＴ３）、商業的供給者（例えばｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣＯ ＵＳＡ）から入手可能である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及びＩＬ２、ＩＬ７、またはＩＬ１５への曝露によって活性化され得る。より好ましくは、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及び抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化される。活性化は、ＣＤ１４＋単球の存在下でも非存在下でも起こり得る。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣあるいはＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞を含むＴ細胞サブセットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）または抗原を用いずに、抗体でコーティングされたビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して活性化され得る。他の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２細胞表面リガンドと結合する可溶性四量体抗体複合体、例えば、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ ＡｃｔｉｖａｔｏｒまたはＨｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒを使用して、Ｔ細胞を活性化することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、任意選択的に抗ＣＤ２８抗体と組み合わせた、ＭＨＣ－ペプチド複合体、好ましくは多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体で活性化され得る。
【0262】
いくつかの実施形態では、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ－１５を補充した、本明細書に記載されるＴ細胞成熟培地で培養され得る。培地には、単一陽性Ｔ細胞を活性化させ、その集団を増大させ、かつそれを生成するために、上述のように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、例えば１つ以上の抗ＴＣＲ抗体、例えば抗αＣＤ３抗体、及び抗αＣＤ２８抗体を更に補充してもよい。
【0263】
Ｔ細胞は、増大した集団を生成するための任意の簡便な技法を使用して培養され得る。好適な培養系には、撹拌タンクファーメンター、エアリフトファーメンター、ローラーボトル、培養バッグまたはディッシュ、及び他のバイオリアクター、特に中空糸バイオリアクターが含まれる。そのような系の使用は、当該技術分野で周知である。
【0264】
本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞は、標的抗原と結合する異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原またはそのペプチド断片を発現するがん細胞に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、内因性ＴＣＲを発現しないように、ＲＡＧ不活化され得る（すなわち、細胞内のＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２遺伝子は、欠失または他の変異によってノックアウトされている）。Ｔ細胞は、後述するように、例えば免疫療法において有用であり得る。
【0265】
Ｔ細胞、例えば（二重陽性）ＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、（単一陽性）ＳＰ ＣＤ４＋細胞またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、生成後、単離及び／または精製され得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または抗体でコーティングされた磁気粒子を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含む、任意の簡便な技法を使用することができる。
【0266】
Ｔ細胞、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＳＰ ＣＤ４＋細胞またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、増大及び／または濃縮され得る。任意選択的に、本明細書に記載のとおりに生成されるＴ細胞の集団は、使用前に、例えば凍結保存によって保管され得る。
【0267】
治療
本発明は更に、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
本発明は更に、本発明による改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【0268】
本発明は更に、療法及び／または医療に使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を提供する。
【0269】
本発明はまた、以下のうちのいずれか１つ以上を含む、医療用途または治療方法を提供する。
（ａ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、予防、または進行の遅延に使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物であって、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法であるもの、
（ｂ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療するための医薬を製造する際の、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物の使用であって、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である使用、
（ｃ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させる方法であって、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を個体に投与することを含み、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である方法。
（ａ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍の治療、予防、または進行の遅延に使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物であって、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法であるもの、
（ｂ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療するための医薬を製造する際の、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物の使用であって、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である使用、
（ｃ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させる方法であって、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を個体に投与することを含み、任意選択的に、治療ががん免疫療法療法及び／または養子Ｔ細胞療法、任意選択的に同種養子Ｔ細胞療法である方法。
【0270】
本発明によれば、固形腫瘍であり得るがん及び／または腫瘍は、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性または進行性ＮＳＣＬＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、腺扁平上皮ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、胃癌、尿路上皮癌、食道癌、食道胃接合部癌（ＥＧＪ）、黒色腫、膀胱癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、口腔癌、中咽頭癌、下咽頭癌、咽喉癌、喉頭癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｙｎｘ）、扁桃腺癌、舌癌、軟口蓋癌、咽頭癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｒｙｎｘ）、滑膜肉腫、粘液円形細胞型脂肪肉腫（ＭＲＣＬＳ）から選択することができ、任意選択的に、がんまたは腫瘍は、本明細書に記載されるＭＡＧＥまたはＡＦＰタンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原、任意選択的に、本明細書に記載されるＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原を発現する。
【0271】
本発明によれば、がんは、乳癌、転移性乳癌、肝癌、腎細胞癌、滑膜肉腫、尿路上皮癌または腫瘍、膵癌、結腸直腸癌、転移性胃癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、転移性胃癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、転移性肝癌、転移性卵巣癌、転移性膵癌、転移性結腸直腸癌、転移性肺癌、結腸直腸癌または結腸直腸腺癌、肺癌または肺腺癌、膵癌または膵腺癌、粘液性腺腫、膵管癌、及び血液悪性腫瘍のいずれか１つ以上から選択することができ、任意選択的に、がんまたは腫瘍は、本明細書に記載されるＭＡＧＥまたはＡＦＰタンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原、任意選択的に、本明細書に記載されるＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原を発現する。
【0272】
がん及び／または腫瘍は、肝癌、例えば、胆管癌、肝血管肉腫、肝芽腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）のいずれかから選択される肝癌であり得、任意選択的に、がんは移植または切除に不適であり、好ましくは、がんは肝細胞癌（ＨＣＣ）である。更に、肝癌は、糖尿病、肥満、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝硬変のいずれか１つ以上と同時に生じる場合があり、任意選択的に、がんまたは腫瘍は、本明細書に記載されるＭＡＧＥまたはＡＦＰタンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原、任意選択的に、本明細書に記載されるＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原を発現する。
【0273】
本発明によれば、がんは、再発性がんもしくは難治性がんもしくは再発がんもしくは局所再発がんもしくは転移性がん、切除不能がんもしくは限局性がん、外科的もしくは放射線療法の選択肢のないがんもしくは手術不能がん、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。がん及び／または腫瘍は、固形腫瘍であり得る。
【0274】
本発明はまた、
（ａ）Ｔ細胞活性化をアップレギュレーションする方法、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、もしくはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上をアップレギュレーションする方法、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性を誘導する方法、または
（ｄ）抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞の殺傷を誘導する方法、
に使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を提供し、これらは、任意選択的に、がん及び／または腫瘍を有する対象におけるものであり、任意選択的に、がん及び／または腫瘍は、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、好ましくは、本明細書に記載されるＭＡＧＥまたはＡＦＰタンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原を発現する。
（ａ）Ｔ細胞活性化をアップレギュレーションする方法、
（ｂ）サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、もしくはグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上をアップレギュレーションする方法、
（ｃ）抗原もしくは抗原ペプチドの存在下における細胞傷害活性を誘導する方法、または
（ｄ）抗原もしくは抗原ペプチドを提示する腫瘍細胞の殺傷を誘導する方法、
に使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を提供し、これらは、任意選択的に、がん及び／または腫瘍を有する対象におけるものであり、任意選択的に、がん及び／または腫瘍は、本明細書に記載されるがん抗原及び／または腫瘍抗原あるいはそのペプチド抗原、好ましくは、本明細書に記載されるＭＡＧＥまたはＡＦＰタンパク質、ペプチド、抗原、またはそのペプチド抗原を発現する。
【0275】
組み合わせ
本発明は更に、前述の医療用途または治療方法に従って使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を提供し、改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物は、任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、または組み合わせて使用される。
本発明は更に、前述の医療用途または治療方法に従って使用するための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物を提供し、改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物は、任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものであるか、または組み合わせて使用される。
【0276】
したがって、１つ以上の更なる治療剤は、化学療法剤、ホルモン療法剤、標的化薬、または免疫療法を含み得る。したがって、化学療法は、ゲムシタビン、ドセタキセル、ペメトレキセド、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、ビノレルビンリポプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、フェナントリプラチン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン、ピコプラチン、メトトレキサート、カペシタビン、タキサン、アントラサイクリン、パクリタキセル、ドセタキセル、パクリタキセルタンパク質結合粒子、ドキソルビシン、エピルビシン、５－フルオロウラシル、シクロホスファミド、ビンクリスチン、エトポシドのうちのいずれか１つ以上を含み得る。付加的または代替的に、化学療法は、ＦＥＣ：５－フルオロウラシル、エピルビシン、シクロホスファミド、ＦＡＣ：５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ＡＣ：ドキソルビシン、シクロホスファミド、ＥＣ：エピルビシン、シクロホスファミドから選択される１つ以上の化学療法剤を含み得る。付加的または代替的に、１つ以上の更なる治療剤は、ソラフェニブ、ＰＤ１もしくはＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストもしくは阻害剤、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、スニチニブブリバニブ、エベロリムス、チバンチニブ、リニファニブフロムソラフェニブ（Ｌｉｎｉｆａｎｉｂｆｒｏｍ Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＰＤ１もしくはＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストもしくは阻害剤、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、スニチニブ、ブリバニブ、エベロリムス、チバンチニブ、リニファニブ、またはチロシンキナーゼ阻害剤もしくは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えば、クリゾチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、及びアファチニブ、免疫チェックポイント阻害剤、例えばペンブロリズマブもしくはニボルマブ、または核内因子カッパ－Ｂリガンドに対するモノクローナル抗体、例えばデノスマブ、または上皮成長因子受容体アンタゴニスト抗体、任意選択的にセツキシマブのうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【0277】
本明細書で使用される場合、「改変ｉＰＳＣまたは造血系統細胞」という用語には、改変人工多能性幹細胞ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞または改変された人工多能性幹細胞ｉＰＳＣの集団もしくは造血系統細胞の集団も含まれ得る（改変という用語はまた、ＩＰＳＣ（複数可）及び造血系統細胞（複数可）の両方に適用される）。
【0278】
キット
本発明は更に、
（ａ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、あるいは
（ｂ）任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤（任意選択的に本明細書に記載のもの）と組み合わせた、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、を含むキットを提供する。
本発明は更に、
（ａ）個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、あるいは
（ｂ）任意選択的に別々に、連続的に、または同時に投与されるかまたは投与するための、１つ以上の更なる治療剤（任意選択的に本明細書に記載のもの）と組み合わせた、個体または対象におけるがん及び／または腫瘍を治療する、予防する、またはその進行を遅延させるための、本発明による改変ｉＰＳＣもしくは造血系統細胞、好ましくはＴ細胞、または医薬組成物、及びその使用説明書を含む添付文書、を含むキットを提供する。
【0279】
本発明の他の態様及び実施形態は、上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語に置き換えたもの、ならびに上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に置き換えたものを提供する。
【0280】
文脈上別段の解釈を必要としない限り、本出願は、上記の態様及び上述の実施形態のいずれかの相互のあらゆる組み合わせを開示するものであることを理解されたい。同様に、本出願は、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単独で、または他の態様のいずれかと合わせて、好ましい及び／または任意選択の特徴のあらゆる組み合わせを開示する。
【0281】
上記の実施形態の改変形態、更なる実施形態、及びそれらの改変形態は、本開示を読めば当業者には明らかとなり、したがって、これらは本発明の範囲内にある。
【0282】
本明細書で使用される任意のセクションの見出しは構成の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0283】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリーは、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0284】
本明細書で使用される「及び／または」は、他方の有無にかかわらず、指定された２つの特徴または構成要素の各々の具体的開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書で個別に明記されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的開示として解釈されるべきである。
【実施例】
【0285】
概論：
本明細書では、規定の異種組換えαβＴＣＲを発現するｉＴ細胞の作製について記載する。本発明者らは、ＧＭＰに準拠したｈｉＰＳＣ源から出発して、ＨＬＡ－Ａ＊０２により提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を認識する組換え異種Ｔ細胞受容体ＡＤＰ Ａ２Ｍ４をノックインした。本発明者らは、操作ｉＰＳＣ由来のＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、抗ＴＣＲＶα２４及びデキストラマー染色によって測定した場合にＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを特異的に発現することを示す。編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、同族抗原を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２発現腫瘍株とともにインキュベートした場合に、ＣＤ２５及びＣＤ６９を含む活性化マーカーをアップレギュレートし、かつそれらの株の強力な抗原依存的殺傷を示す。以下の実施例は、治療的価値及び治療活性を有するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の生成を可能にする、限られたゲノム編集による、同種ｈｉＰＳＣ由来のプラットフォームの開発を表す。
本明細書では、規定の異種組換えαβＴＣＲを発現するｉＴ細胞の作製について記載する。本発明者らは、ＧＭＰに準拠したｈｉＰＳＣ源から出発して、ＨＬＡ－Ａ＊０２により提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を認識する組換え異種Ｔ細胞受容体ＡＤＰ Ａ２Ｍ４をノックインした。本発明者らは、操作ｉＰＳＣ由来のＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が、抗ＴＣＲＶα２４及びデキストラマー染色によって測定した場合にＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲを特異的に発現することを示す。編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞は、同族抗原を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２発現腫瘍株とともにインキュベートした場合に、ＣＤ２５及びＣＤ６９を含む活性化マーカーをアップレギュレートし、かつそれらの株の強力な抗原依存的殺傷を示す。以下の実施例は、治療的価値及び治療活性を有するＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の生成を可能にする、限られたゲノム編集による、同種ｈｉＰＳＣ由来のプラットフォームの開発を表す。
【0286】
ＥＥＦ１Ａ１遺伝子座でのノックインにより、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをｉＴ細胞へと安定的に導入する。ＥＥＦ１Ａ１エクソン８へのＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲのノックインが可能となるように、ｒＡＡＶターゲティングプラスミドを作製した。このコンストラクトは、ＥＥＦ１Ａ１とＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲとの間にマルチシストロン性融合遺伝子を生じさせるように設計した。これにより、内因性ＥＥＦ１Ａ１プロモーターからのＥＥＦ１Ａ１及びＡＤＰ Ａ２Ｍ４の転写及び発現を調節することができる。Ｔ２ＡまたはＰ２Ａスキップ配列ペプチドと組み合わせたフューリン切断部位は、ＥＥＦ１Ａ１とＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲα及びＡ２Ｍ４ ＴＣＲβコード配列とを分離する（図２）。これにより、単一のｍＲＮＡから複数のポリペプチドを生成することができる。小胞体におけるフューリンプロテアーゼによる切断により、スキップ配列ペプチドが除去されて、新生タンパク質配列の発現が可能になる。
【0287】
ｉＰＳＣ細胞株の生成
ｉＰＳＣ株（ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２）は、臍帯血から単離したＣＤ３４＋前駆細胞の再プログラミングにより作り出されたＧＲ１．１の派生株である［Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ＢＡ，Ｓｙａｍａ Ａ，Ｓｉｖａｐａｔｈａｍ Ｒ，Ｐｅｉ Ｙ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｏ，Ｆｅｌｌｎｅｒ Ｔ，Ｚｅｎｇ，Ｒａｏ ＭＳ，Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２０１６ Ｊｕｎ １０］。ゲノム安定性を、ＴＣＲ編集の前にｃｙｔｏ－ＳＮＰ分析、核型分析により評価した。多能性を、ＩＨＣ（免疫組織化学）、フローサイトメトリー、及びＰｌｕｒｉｔｅｓｔ［Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１．８（４）：ｐ．３１５－７］で決定した。ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２ ｉＰＳＣクローンからのｉＴ細胞の分化も確認した。
ｉＰＳＣ株（ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２）は、臍帯血から単離したＣＤ３４＋前駆細胞の再プログラミングにより作り出されたＧＲ１．１の派生株である［Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ＢＡ，Ｓｙａｍａ Ａ，Ｓｉｖａｐａｔｈａｍ Ｒ，Ｐｅｉ Ｙ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｏ，Ｆｅｌｌｎｅｒ Ｔ，Ｚｅｎｇ，Ｒａｏ ＭＳ，Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２０１６ Ｊｕｎ １０］。ゲノム安定性を、ＴＣＲ編集の前にｃｙｔｏ－ＳＮＰ分析、核型分析により評価した。多能性を、ＩＨＣ（免疫組織化学）、フローサイトメトリー、及びＰｌｕｒｉｔｅｓｔ［Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１．８（４）：ｐ．３１５－７］で決定した。ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２ ｉＰＳＣクローンからのｉＴ細胞の分化も確認した。
【0288】
ｉＰＳＣ細胞の培養
ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２を編集実験に使用した。ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてビトロネクチン上で培養し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）での酵素による解離に適合させ、４～５日ごとに継代した。ｉＰＳＣ培養物を、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿したインキュベータ内で維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現ならびに分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析により慣例的にモニタリングした。
ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２を編集実験に使用した。ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてビトロネクチン上で培養し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）での酵素による解離に適合させ、４～５日ごとに継代した。ｉＰＳＣ培養物を、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿したインキュベータ内で維持した。多能性マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１６０、及びＳＯＸ２）の発現ならびに分化マーカーＳＳＥＡ－１の不在を、ＦＡＣＳ分析により慣例的にモニタリングした。
【0289】
ＡＡＶターゲティングベクターの作製
ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）プラスミドをＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化して、左右の末端逆位反復（ＩＴＲ）領域間の配列を除去した。ベクター骨格をアガロースゲル抽出により精製した。左右の相同アーム（ＬＨＡ、配列番号４３及びＲＨＡ、配列番号４４）、ＦｕＴＡ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセット（配列番号４５）、及びＰ２Ａ＿ＰＵＲＯカセット（配列番号４８）を、ＰＣＲにより増幅した。各プライマーは、ギブソンアセンブリによるターゲティングベクターの作製を可能にする重複配列を含んでいた。左右の相同アーム配列（５００ｂｐ）を、ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２から単離したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から増幅した。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ導入遺伝子は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含有し、２つのＴＣＲ鎖の間にフューリン切断部位（ＲＡＫＲ）及びＰ２Ａスキップ配列を有する。
ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）プラスミドをＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化して、左右の末端逆位反復（ＩＴＲ）領域間の配列を除去した。ベクター骨格をアガロースゲル抽出により精製した。左右の相同アーム（ＬＨＡ、配列番号４３及びＲＨＡ、配列番号４４）、ＦｕＴＡ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセット（配列番号４５）、及びＰ２Ａ＿ＰＵＲＯカセット（配列番号４８）を、ＰＣＲにより増幅した。各プライマーは、ギブソンアセンブリによるターゲティングベクターの作製を可能にする重複配列を含んでいた。左右の相同アーム配列（５００ｂｐ）を、ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２から単離したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から増幅した。ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ導入遺伝子は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のコード配列を含有し、２つのＴＣＲ鎖の間にフューリン切断部位（ＲＡＫＲ）及びＰ２Ａスキップ配列を有する。
【0290】
ＡＡＶの生成
ｒＡＡＶ生成に使用されるパッケージングプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２４００７１）及びＡＡＶ－３ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ ＶＰＫ－４２３）を、ＮＥＢ（登録商標）５－アルファＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させた。相同アーム、Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ＿Ｔ２Ａ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセットを含有するＡＡＶターゲティングプラスミドを、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させた。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）またはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのＩＴＲ完全性を、ＡｈｄＩ及びＢｇｌＩの単一制限酵素消化を用いて確認した。
ｒＡＡＶ生成に使用されるパッケージングプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２４００７１）及びＡＡＶ－３ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ ＶＰＫ－４２３）を、ＮＥＢ（登録商標）５－アルファＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させた。相同アーム、Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ＿Ｔ２Ａ＿Ａ２Ｍ４導入遺伝子カセットを含有するＡＡＶターゲティングプラスミドを、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させた。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｇｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）またはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのＩＴＲ完全性を、ＡｈｄＩ及びＢｇｌＩの単一制限酵素消化を用いて確認した。
【0291】
ｒＡＡＶの生成に使用した２９３ＡＡＶ細胞株（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、２９３ＡＡＶを２１６×１０６／５ＣＳの密度で５層細胞スタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｒＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びＡＡＶ－３ Ｒｅｐ－Ｃａｐを２：１：１のモル比で２９３ＡＡＶにトランスフェクトした。各トランスフェクションに、合計２．６ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用した。採取及びウイルス精製の前に細胞を７２時間培養した。細胞を採取するために、６．２５ｍＭの最終濃度にＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加し、組織培養プラスチックからの細胞剥離を促進した。製造業者の説明書に従って、ｒＡＡＶウイルスをイオジキサノール勾配超遠心分離またはＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）により精製した。
【0292】
イオジキサノール勾配精製のために、細胞ペレットを遠心分離（３００ｇ、５分）により収集し、細胞溶解緩衝液５ｍｌ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁させ、ドライアイス／エタノール浴及び３７℃の水浴を使用して３回の凍結融解に供した。最後の融解に続いて、溶解物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２００Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で１時間処理した。イオジキサノール勾配にロードする前に、遠心分離（１０００ｇ、２９分、４℃）により残存細片を除去した。６０％イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を希釈することにより、イオジキサノール勾配（１５％イオジキサノール９ｍｌ、２５％イオジキサノール６ｍｌ、４０％イオジキサノール５ｍｌ、及び６０％イオジキサノール５ｍｌ）を調製した。ＰＢＳ－ＭＫ緩衝液（１×ＰＢＳ、２．７６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＫＣｌ）で６０％イオジキサノールを希釈することにより、２５％及び４０％のイオジキサノール相を調製した。ＰＢＳ－ＭＫ緩衝液（１×ＰＢＳ １Ｍ ＮａＣｌ、２．７６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＫＣｌ）で６０％イオジキサノールを希釈することにより、１５％のイオジキサノール相を調製した。これらの層を区別するために、２５％及び６０％の相にフェノールレッドを添加した。勾配相を、段階的にＯｐｔｉＳｅａｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に添加する。細胞溶解物を１５％相の上にロードし、チューブを７０Ｔｉ超遠心ローターにて６７，０００ｒｐｍ、１８℃で９０分間遠心分離する。遠心分離後、４０％相からｒＡＡＶを抽出する。ｒＡＡＶウイルス調製物を、遠心フィルターユニット（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して更に濃縮し、緩衝液をＰＢＳ ０．００１％（ｖ／ｖ）プルロニック酸（Ｓｉｇｍａ）に交換した。ウイルス調製物を－８０℃で保管した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したｑＰＣＲにより、ウイルス力価を確認した。プライマー配列及びプローブ配列は、ＩＴＲに対して設計されている（Ａｕｒｎｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。プライマー配列ＩＴＲ＿Ｆ ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ（配列番号５４）、ＩＴＲ＿Ｒ ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ（配列番号５５）、プローブ５６－ＦＡＭ／ＣＡＣＴＣＣＣＴＣ／ＺＥＮ／ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ／３ＩＡＢｋＦＱ。既知の濃度及びコピー数のｐＡＡＶＳ由来のプラスミドＤＮＡから調製した標準曲線に対して、ウイルス定量を求めた。ＰＣＲプログラムは、１サイクルの９５℃で１５分間の変性、それに続く４０サイクルの９５℃で１５秒間の変性、及び６０℃で６０秒間のプライマーアニーリング／伸長からなるものであった。ｑＰＣＲ反応をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７で実施し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアで分析した。
【0293】
遺伝子編集－ＥＥＦ１ａ遺伝子座のエクソン８へのＡ２Ｍ４ ＳＰＥＡＲのノックイン
ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２を単一細胞懸濁液として酵素的に継代した。解離後、ｉＰＳＣを計数し、完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓを含有するコーティングされた（ビトロネクチン）６ウェルプレートのウェル内に播種した。翌日、培地を完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓに交換した。ＡＡＶの形質導入前にｉＰＳＣを４８時間培養した。
ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２を単一細胞懸濁液として酵素的に継代した。解離後、ｉＰＳＣを計数し、完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓを含有するコーティングされた（ビトロネクチン）６ウェルプレートのウェル内に播種した。翌日、培地を完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓに交換した。ＡＡＶの形質導入前にｉＰＳＣを４８時間培養した。
【0294】
ＡＡＶ３血清型ウイルス（５００～１００００Ｖｇ／細胞）をｉＰＳＣに形質導入した。抗生物質による選択（ピューロマイシン、３０～１００μｇ／ｍｌ）を形質導入の４８時間後に開始し、残りの培養全体を通じて継続した。ウイルス形質導入の３～６日後に、スクリーニング及びクローン単離のために、コーティングされた９６ウェルプレートにｉＰＳＣを播種した。ＰＣＲスクリーニングの前に、クローンを９６ウェルプレート内で１０～１６日間増大させた。場合によっては、陽性クローンを、限界希釈による更なるクローン単離に供した。全てのクローンをＰＣＲによりスクリーニングし、組み込みを確認した。全てのＰＣＲ産物の配列を検証した。
【0295】
クローンの単離及びスクリーニング
編集ｉＰＳＣの細胞プールをピューロマイシンで選択した後に、ｉＰＳＣクローンを単離した。ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２株由来の編集クローンを、ビトロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレートでの限界希釈により単離した。細胞を平均１００細胞／ウェルで播種した。９６００個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後１列目（Ａ１～Ｈ１）で２倍連続希釈を行った。次いで、プレートの全ての行にわたり細胞を２倍希釈した。編集したＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２をｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓに播種した。培地を２日ごとに完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓに交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。標的とした導入遺伝子の挿入を確認するため、クローンを増大させ、ＰＣＲによるスクリーニングのためにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。
編集ｉＰＳＣの細胞プールをピューロマイシンで選択した後に、ｉＰＳＣクローンを単離した。ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２株由来の編集クローンを、ビトロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレートでの限界希釈により単離した。細胞を平均１００細胞／ウェルで播種した。９６００個のｉＰＳＣをウェルＡ１に播種し、その後１列目（Ａ１～Ｈ１）で２倍連続希釈を行った。次いで、プレートの全ての行にわたり細胞を２倍希釈した。編集したＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２をｍＴｅＳＲ（商標）Ｐｌｕｓに播種した。培地を２日ごとに完全ｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓに交換した。単一コロニーの存在についてウェルをスクリーニングする前に、細胞を１２～１４日間培養した。標的とした導入遺伝子の挿入を確認するため、クローンを増大させ、ＰＣＲによるスクリーニングのためにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。
【0296】
相同アームの境界全体にわたってＰＣＲ反応を実施した。５’ＬＨＡ境界を、５’相同アームの上流にあるプライマー１８２４（配列番号５０）ＴＡＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡ及びピューロマイシン耐性遺伝子内にあるプライマー１８２５（配列番号５１）ＧＣＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＧＴＡＧＣで増幅した。３’ＲＨＡ境界を、ピューロマイシン耐性遺伝子内にあるプライマー２２９４（配列番号５２）ＴＣＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣ及びＥＥＦ１Ａ１エクソン８の右側相同領域内にあるプライマー２２９５（配列番号５３）ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＧで増幅した。
【0297】
ＰＣＲ反応を、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲプログラム ９８℃、３０秒間、１サイクルの変性、９８℃、５秒間、４０サイクルの変性、６６℃、１０秒間のアニーリング、７２℃、２５秒間の伸長、７２℃、５分間、１サイクルの伸長。ＰＣＲ産物をゲル精製し、サンガーシーケンシングを行って組み込みを確認した。陽性クローンを増大させ、小さな細胞バンクを生成した。フローサイトメトリーにより多能性マーカー発現の維持を確認した。４Ｂ１１、５Ｆ４、５Ｈ４、及び３Ｄ１０と命名した４つのクローンを分化へと進めた。
【0298】
ＲＡＧ１エクソン２をガイドＲＮＡ配列ＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＣＴの標的とした。この配列は、ビルドＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８で、第１１染色体：３６，５７４，４９４～３６，５７４，５１３に対応する。
【0299】
ヌクレオフェクション
細胞剥離の開始前に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成させた。各ヌクレオフェクションは、ＳｐｙＦｉ－Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）５２ｐｍｏｌ及びＲＡＧ１（ＩＤＴ）を標的とする一本鎖ガイドＲＮＡ ６０ｐｍｏｌを、ＤＰＢＳ中に最終容量５μｌで含有していた。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して３７℃で６分間細胞を剥離し、２×１０Ｅ５（３Ｅ１０）個の細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄでの各ヌクレオフェクションに使用した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳで洗浄し、２０μｌの補充した一次緩衝液（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｕｆｆｅｒ）Ｐ３に再懸濁させた。５μのＲＮＰを添加し、１６ストリップのヌクレオキュベット内のスロットに移し、プログラムＣＡ－１３７を使用してヌクレオフェクトした。細胞を３分間インキュベートし、８０μｌの予熱したｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ／１×ＣｌｏｎｅＲを添加し、更に１分間インキュベートし、次いで、ｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ／１×ＣｌｏｎｅＲをウェルあたり１ｍｌ含有する１２ウェルプレートのウェルに移した。
細胞剥離の開始前に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成させた。各ヌクレオフェクションは、ＳｐｙＦｉ－Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）５２ｐｍｏｌ及びＲＡＧ１（ＩＤＴ）を標的とする一本鎖ガイドＲＮＡ ６０ｐｍｏｌを、ＤＰＢＳ中に最終容量５μｌで含有していた。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して３７℃で６分間細胞を剥離し、２×１０Ｅ５（３Ｅ１０）個の細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄでの各ヌクレオフェクションに使用した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳで洗浄し、２０μｌの補充した一次緩衝液（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｕｆｆｅｒ）Ｐ３に再懸濁させた。５μのＲＮＰを添加し、１６ストリップのヌクレオキュベット内のスロットに移し、プログラムＣＡ－１３７を使用してヌクレオフェクトした。細胞を３分間インキュベートし、８０μｌの予熱したｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ／１×ＣｌｏｎｅＲを添加し、更に１分間インキュベートし、次いで、ｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ／１×ＣｌｏｎｅＲをウェルあたり１ｍｌ含有する１２ウェルプレートのウェルに移した。
【0300】
単一細胞の播種及びクローンの増大
ヌクレオフェクションから５日後、Ｓｏｌｅｎｔｉｍ ＶＩＰＳ（商標）を使用して１０枚の９６ウェルプレートに細胞を播種し、播種の２時間後と、最初の４日間は毎日、次いで隔日に、Ｓｏｌｅｎｔｉｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔｒｉｃ（登録商標）でイメージングした。ＣｌｏｎｅＲは、単一細胞増殖の最初の３日間に、濃度１倍で２４時間、次いで０．２５倍で更に４８時間存在していた。プレートに隔日で供給した。播種後１３日目及び１４日目に、単一細胞に由来するコロニーをＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、１２ウェルプレート（４０％、増大用）と９６ウェルプレート（６０％、遺伝子型決定用）に分けた。２日後、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔを使用して細胞の遺伝子型を決定し、両アレルの編集で複数の早期終止コドンが生じた細胞のみを、６ウェルプレートに増大させた。クローンを、プライマーＡＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴ及びＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣを使用してコロニーＰＣＲに供し、陽性確認後に凍結保存した。
ヌクレオフェクションから５日後、Ｓｏｌｅｎｔｉｍ ＶＩＰＳ（商標）を使用して１０枚の９６ウェルプレートに細胞を播種し、播種の２時間後と、最初の４日間は毎日、次いで隔日に、Ｓｏｌｅｎｔｉｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔｒｉｃ（登録商標）でイメージングした。ＣｌｏｎｅＲは、単一細胞増殖の最初の３日間に、濃度１倍で２４時間、次いで０．２５倍で更に４８時間存在していた。プレートに隔日で供給した。播種後１３日目及び１４日目に、単一細胞に由来するコロニーをＶｅｒｓｅｎｅで剥離し、１２ウェルプレート（４０％、増大用）と９６ウェルプレート（６０％、遺伝子型決定用）に分けた。２日後、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔを使用して細胞の遺伝子型を決定し、両アレルの編集で複数の早期終止コドンが生じた細胞のみを、６ウェルプレートに増大させた。クローンを、プライマーＡＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴ及びＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣを使用してコロニーＰＣＲに供し、陽性確認後に凍結保存した。
【0301】
Ｔ細胞分化
ＨｉＰＳＣ維持培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄した。２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｔｅｍＰｒｏ３４；サプリメントを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４基本培地、ならびにペニシリンストレプトマイシン（１％ｖ／ｖ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びモノチオグリセロール（１００μＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を更に補充したもの）を添加し、４時間インキュベートした。容量は培養フラスコのサイズに依存し、典型的には少なくとも２ｍｌ／９ｃｍ２、及び２０ｍｌ／１５０ｃｍ２である。
ＨｉＰＳＣ維持培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄した。２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｔｅｍＰｒｏ３４；サプリメントを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４基本培地、ならびにペニシリンストレプトマイシン（１％ｖ／ｖ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びモノチオグリセロール（１００μＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を更に補充したもの）を添加し、４時間インキュベートした。容量は培養フラスコのサイズに依存し、典型的には少なくとも２ｍｌ／９ｃｍ２、及び２０ｍｌ／１５０ｃｍ２である。
【0302】
４時間後、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄して、残留していた高濃度のアクチビンＡを除去した。５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及び５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、４４時間インキュベートした（第１段階培地）。
【0303】
次いで、新鮮な第１段階培地と培地を交換し、１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充し、更に４８時間培養した。
【0304】
４日目に、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄して、残留していた第１段階のサイトカインを除去した。次いで、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、４８時間インキュベートした（第２段階培地）。次いで、培地に新鮮な第２段階培地を補給し、細胞を更に４８時間培養した。
【0305】
次いで、この培地を、最小限のＳＣＦ及びＶＥＧＦを必要とする第３段階培地と交換し、細胞を１６～１８日間、４８時間ごとに半分を除去供給しながら培養した。典型的には、これには、培地を採取し、遠心分離（３００ｇ、１０分）により懸濁液中の細胞を収集し、懸濁細胞を新鮮培地での培養（すなわち、Ｔ１５０フラスコに対し２０ｍｌ）に戻すことが含まれた。
【0306】
およそ１６日目に、以後の培養用に、得られた単層からＣＤ３４＋細胞を単離した。ＣＤ３４＋細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３７℃で３０分間、次いでコラゲナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で３０分間、連続的にインキュベートすることにより採取した。細胞懸濁液を収集し、洗浄し（ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３００ｇで１２分間の遠心分離を２回）、その後、磁気活性化ビーズ（ＭＡＣＳ）単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ：製造業者の説明書に従った）によるＣＤ３４＋細胞の単離を行った。
【0307】
持続的なリンパ系の増殖及び分化のために、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ独自の２段階（リンパ系増殖／Ｔ細胞成熟）培地を用いた。
【0308】
ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリンパ系増殖培地における培養中、未編集対照株のＴ細胞前駆細胞に、ポロキサマーＦ１０８（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲをレンチウイルスにより形質導入した。
【0309】
Ｔ細胞の表現型決定
フローサイトメトリーを使用して、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型を決定した。ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの発現を示すために、細胞をＣＤ３（クローンＳＫ７）；Ａ２Ｍ４デキストラマー及び生／死染色ＥＦ５０６で染色した。
フローサイトメトリーを使用して、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型を決定した。ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲの発現を示すために、細胞をＣＤ３（クローンＳＫ７）；Ａ２Ｍ４デキストラマー及び生／死染色ＥＦ５０６で染色した。
【0310】
ｉＴ細胞におけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現は、上述したようにＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞のレンチウイルス形質導入によって誘導することができる。ｉＰＳＣ株ＨＣＰ１３２４＿ｃ１Ａ１２を分化させ、第４段階のＡＤＰ Ａ２Ｍ４ Ｔ細胞（ＣＤ７＋ＣＤ５＋前駆細胞）を含むレンチウイルス発現により形質導入し、形質導入細胞を、分化プロトコルを通じて進行させた。細胞の表現型をＦＡＣＳにより決定し、抗ＴＣＲ抗体である抗Ｖα２４及びＭＡＧＥ－Ａ４ ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２０１デキストラマーで染色することによりＡＤＰ Ａ２Ｍ４発現を測定した。分化は編集の影響を受けないことが判明した。加えて、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４の発現を促進するには、単一アレルにおけるＡＤＰ Ａ２Ｍ４のノックインで十分である（図４）。
【0311】
フローサイトメトリー染色
フローサイトメトリーには以下の抗体を使用した：ＣＤ８αβ－ＢＶ６５０（クローン２ＳＴ８．５Ｈ７）、ＴＣＲγδ－ＡＰＣ（クローンＢ１）、ＴＣＲ Ｖα２４－ＰＥ（クローンＩＰ２６）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８α－ＰＥ－ＣＹ７（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ６９－ＢＵＶ３９５（クローンＦＮ５０）、ＣＤ２５－ＢＶ４２１（クローンＢＣ９６）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＦ４８８（クローンＬ２４３）、及びＥＦ５０６－ＢＶ５１０。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで得た。
フローサイトメトリーには以下の抗体を使用した：ＣＤ８αβ－ＢＶ６５０（クローン２ＳＴ８．５Ｈ７）、ＴＣＲγδ－ＡＰＣ（クローンＢ１）、ＴＣＲ Ｖα２４－ＰＥ（クローンＩＰ２６）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８α－ＰＥ－ＣＹ７（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ６９－ＢＵＶ３９５（クローンＦＮ５０）、ＣＤ２５－ＢＶ４２１（クローンＢＣ９６）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＦ４８８（クローンＬ２４３）、及びＥＦ５０６－ＢＶ５１０。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで得た。
【0312】
ＫＩＬＲ細胞傷害性アッセイ
３８４ウェル白色ＬＵＭＩＴＲＡＣ ６００マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、１ウェルあたり１０，０００個のＫＩＬＲ Ｔ２（ＫＩＬＲレトロウイルス粒子（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）による形質導入により作製）を添加した。第６段階の終了時のｉＰＳＣ株に由来するＴ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞で添加した。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍで滴定して細胞に添加した。細胞及びペプチドを酸素正常状態下にて３７℃で２４時間共培養してから、ＫＩＬＲ検出溶液（ＫＩＬＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ））を室温で１時間添加した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して試料からの発光を検出した。編集ｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は、特異的かつ強力な細胞溶解エフェクター機能を示すことが判明した（図５）。
３８４ウェル白色ＬＵＭＩＴＲＡＣ ６００マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、１ウェルあたり１０，０００個のＫＩＬＲ Ｔ２（ＫＩＬＲレトロウイルス粒子（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）による形質導入により作製）を添加した。第６段階の終了時のｉＰＳＣ株に由来するＴ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞で添加した。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）を、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍで滴定して細胞に添加した。細胞及びペプチドを酸素正常状態下にて３７℃で２４時間共培養してから、ＫＩＬＲ検出溶液（ＫＩＬＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ））を室温で１時間添加した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して試料からの発光を検出した。編集ｉＰＳＣクローンから分化したｉＴ細胞は、特異的かつ強力な細胞溶解エフェクター機能を示すことが判明した（図５）。
【0313】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）細胞傷害性アッセイ
ＧＦＰ＋ｉｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｉｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｉｖｅ）標的細胞を、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）に１５００／ウェルの密度で２０μｌの完全ＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中に播種した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍに加え、加湿インキュベータ内にて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、標的を最終濃度１０μΜのＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）でパルス処理するか、またはペプチドなしで放置した。６０００個のｉＴ細胞を１０μｌの培地中に三連で添加した。画像を６日間、２時間ごとにＩｎｃｕｃｙｔｅで取得した。次いで、トップハット処理定義を使用し、ＺＯＯＭ２０１８Ａソフトウェアを使用してデータを分析した。
ＧＦＰ＋ｉｖｅＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４＋ｉｖｅ、ＨＬＡ－Ａ２＊０２＋ｉｖｅ）標的細胞を、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）に１５００／ウェルの密度で２０μｌの完全ＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中に播種した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍに加え、加湿インキュベータ内にて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、標的を最終濃度１０μΜのＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）でパルス処理するか、またはペプチドなしで放置した。６０００個のｉＴ細胞を１０μｌの培地中に三連で添加した。画像を６日間、２時間ごとにＩｎｃｕｃｙｔｅで取得した。次いで、トップハット処理定義を使用し、ＺＯＯＭ２０１８Ａソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0314】
ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ｉＴ細胞（ｃ３Ｅ１０）及びＲＡＧ－／－ＥＥＦ１α＋／Ａ２Ｍ４ｉＴ細胞（Ｔ１Ｅ８）は、ＭＡＧＥＡ４＋細胞において、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下または非存在下の両方でアポトーシスを誘導するが、ＭＡＧＥＡ４－細胞においては、ＭＡＧＥ－Ａ４由来ペプチドの存在下でのみアポトーシスを誘導することが判明した（図８及び９）。
【0315】
結論
本発明者らは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ発現ｉＴ細胞の分化を可能にした新規編集戦略を提示した。編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の活性化及び細胞溶解エフェクター機能は、抗原依存的であることが示された。ＣＤ８αα発現を含む編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の表現型、強力なサイトカイン及び細胞傷害活性により、編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が自然様かつ適応様の表現型を有することが示唆される。
本発明者らは、ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ発現ｉＴ細胞の分化を可能にした新規編集戦略を提示した。編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞の活性化及び細胞溶解エフェクター機能は、抗原依存的であることが示された。ＣＤ８αα発現を含む編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の表現型、強力なサイトカイン及び細胞傷害活性により、編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が自然様かつ適応様の表現型を有することが示唆される。
【0316】
デキストラマー染色は、編集ＡＤＰ Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞がＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ＴＣＲのみを発現することを示唆しているが、この技術は完全なＴＣＲレパートリーに適用可能である。編集Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ ｉＴ細胞は、強力な細胞溶解機能及びエフェクター機能を示し、これは健常ドナー由来のＡ２Ｍ４ ＴＣＲ形質導入ＰＢＬと比較して同程度であるか、または増加している。このことは、自家Ａ２Ｍ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と同様に、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞が細胞療法に効果的であり、患者に臨床的利益をもたらすことを示唆している。
【0317】
ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ ｉＴ細胞の作製は、ｉＰＳＣ由来の同種プラットフォームの生成における重要なマイルストーンである。単一の規定の遺伝子座での遺伝子ノックインを介したｉＴ細胞におけるＴＣＲ発現の促進が可能であることは、様々な腫瘍抗原に対する特定のＴＣＲをコードする複数のクローンｉＰＳＣバンクを生成する機会をもたらす。この「既製」プラットフォームは、患者に、自身の腫瘍抗原発現プロファイルに特化した、規定され一貫した様々なＴ細胞療法を適時に送達することができる。
【0318】
配列
配列番号１、ＭＡＧＥ Ａ４
ＭＳＳＥＱＫＳＱＨＣ ＫＰＥＥＧＶＥＡＱＥ ＥＡＬＧＬＶＧＡＱＡ ＰＴＴＥＥＱＥＡＡＶ ＳＳＳＳＰＬＶＰＧＴ
ＬＥＥＶＰＡＡＥＳＡ ＧＰＰＱＳＰＱＧＡＳ ＡＬＰＴＴＩＳＦＴＣ ＷＲＱＰＮＥＧＳＳＳ ＱＥＥＥＧＰＳＴＳＰ
ＤＡＥＳＬＦＲＥＡＬ ＳＮＫＶＤＥＬＡＨＦ ＬＬＲＫＹＲＡＫＥＬ ＶＴＫＡＥＭＬＥＲＶ ＩＫＮＹＫＲＣＦＰＶ
ＩＦＧＫＡＳＥＳＬＫ ＭＩＦＧＩＤＶＫＥＶ ＤＰＡＳＮＴＹＴＬＶ ＴＣＬＧＬＳＹＤＧＬ ＬＧＮＮＱＩＦＰＫＴ
ＧＬＬＩＩＶＬＧＴＩ ＡＭＥＧＤＳＡＳＥＥ ＥＩＷＥＥＬＧＶＭＧ ＶＹＤＧＲＥＨＴＶＹ ＧＥＰＲＫＬＬＴＱＤ
ＷＶＱＥＮＹＬＥＹＲ ＱＶＰＧＳＮＰＡＲＹ ＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡ ＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨ ＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ
ＡＹＰＳＬＲＥＡＡＬ ＬＥＥＥＥＧＶ
配列番号２、ＭＡＧＥ Ａ４ペプチド
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ
配列番号４；（ＣＤ８α）
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
配列番号６；（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖コード配列）
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ
配列番号８；（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖コード配列）
ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣ
配列番号１１；ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖（残基４８～５３）
ＶＳＰＦＳＮ
配列番号１２；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖（残基７１～７６）
ＬＴＦＳＥＮ
配列番号１３；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖（残基１１１～１２５）
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ
配列番号１４；ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖（残基４６～５０）
ＫＧＨＤＲ
配列番号１５；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖（残基６８～７３）
ＳＦＤＶＫＤ
配列番号１６；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖（残基１１０～１２３）
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ
配列番号１７ ＣＤＲ１ ＣＤ８α（残基４５～５３）
ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ
配列番号１８ ＣＤＲ２ ＣＤ８α（残基７２～７９）
ＹＬＳＱＮＫＰＫ
配列番号１９ ＣＤＲ３ ＣＤ８α（残基１１８～１２３）
ＬＳＮＳＩＭ
配列番号２１ ヒトアルファ－フェトプロテインペプチド
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ
配列番号２２ 親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列
Ｑ Ｋ Ｅ Ｖ Ｅ Ｑ Ｎ Ｓ Ｇ Ｐ Ｌ Ｓ Ｖ Ｐ Ｅ Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｌ Ｎ Ｃ Ｔ Ｙ Ｓ Ｄ
Ｒ Ｇ Ｓ Ｑ Ｓ Ｆ Ｆ Ｗ Ｙ Ｒ Ｑ Ｙ Ｓ Ｇ Ｋ Ｓ Ｐ Ｅ Ｌ Ｉ Ｍ Ｓ Ｉ Ｙ Ｓ Ｎ Ｇ
Ｄ Ｋ Ｅ Ｄ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ａ Ｑ Ｌ Ｎ Ｋ Ａ Ｓ Ｑ Ｙ Ｖ Ｓ Ｌ Ｌ Ｉ Ｒ Ｄ Ｓ Ｑ Ｐ
Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｌ Ｃ Ａ Ｖ Ｎ Ｓ Ｄ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ Ｌ Ｎ Ｆ Ｇ Ｋ Ｇ Ｔ Ｓ Ｌ Ｌ
Ｖ Ｔ Ｐ Ｈ Ｉ Ｑ Ｎ Ｐ Ｄ Ｐ Ａ Ｖ Ｙ Ｑ Ｌ Ｒ Ｄ Ｓ Ｋ Ｓ Ｓ Ｄ Ｋ Ｓ Ｖ Ｃ Ｌ
Ｆ Ｔ Ｄ Ｆ Ｄ Ｓ Ｑ Ｔ Ｎ Ｖ Ｓ Ｑ Ｓ Ｋ Ｄ Ｓ Ｄ Ｖ Ｙ Ｉ Ｔ Ｄ Ｋ Ｔ Ｖ Ｌ Ｄ
Ｍ Ｒ Ｓ Ｍ Ｄ Ｆ Ｋ Ｓ Ｎ Ｓ Ａ Ｖ Ａ Ｗ Ｓ Ｎ Ｋ Ｓ Ｄ Ｆ Ａ Ｃ Ａ Ｎ Ａ Ｆ Ｎ
Ｎ Ｓ Ｉ Ｉ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ｆ Ｆ Ｐ Ｓ Ｐ Ｅ Ｓ Ｓ
配列番号２３ 親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＢＶ９＊０１／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－７＊０１／ＴＲＢＣ２ベータ鎖アミノ酸細胞外配列
Ｄ Ｓ Ｇ Ｖ Ｔ Ｑ Ｔ Ｐ Ｋ Ｈ Ｌ Ｉ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ Ｑ Ｒ Ｖ Ｔ Ｌ Ｒ Ｃ Ｓ Ｐ Ｒ Ｓ
Ｇ Ｄ Ｌ Ｓ Ｖ Ｙ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｓ Ｌ Ｄ Ｑ Ｇ Ｌ Ｑ Ｆ Ｌ Ｉ Ｑ Ｙ Ｙ Ｎ Ｇ Ｅ Ｅ
Ｒ Ａ Ｋ Ｇ Ｎ Ｉ Ｌ Ｅ Ｒ Ｆ Ｓ Ａ Ｑ Ｑ Ｆ Ｐ Ｄ Ｌ Ｈ Ｓ Ｅ Ｌ Ｎ Ｌ Ｓ Ｓ Ｌ
Ｅ Ｌ Ｇ Ｄ Ｓ Ａ Ｌ Ｙ Ｆ Ｃ Ａ Ｓ Ｓ Ｌ Ｇ Ｇ Ｅ Ｓ Ｅ Ｑ Ｙ Ｆ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｒ
Ｌ Ｔ Ｖ Ｔ Ｅ Ｄ Ｌ Ｋ Ｎ Ｖ Ｆ Ｐ Ｐ Ｅ Ｖ Ａ Ｖ Ｆ Ｅ Ｐ Ｓ Ｅ Ａ Ｅ Ｉ Ｓ Ｈ
Ｔ Ｑ Ｋ Ａ Ｔ Ｌ Ｖ Ｃ Ｌ Ａ Ｔ Ｇ Ｆ Ｙ Ｐ Ｄ Ｈ Ｖ Ｅ Ｌ Ｓ Ｗ Ｗ Ｖ Ｎ Ｇ Ｋ
Ｅ Ｖ Ｈ Ｓ Ｇ Ｖ Ｓ Ｔ Ｄ Ｐ Ｑ Ｐ Ｌ Ｋ Ｅ Ｑ Ｐ Ａ Ｌ Ｎ Ｄ Ｓ Ｒ Ｙ Ｃ Ｌ Ｓ
Ｓ Ｒ Ｌ Ｒ Ｖ Ｓ Ａ Ｔ Ｆ Ｗ Ｑ Ｎ Ｐ Ｒ Ｎ Ｈ Ｆ Ｒ Ｃ Ｑ Ｖ Ｑ Ｆ Ｙ Ｇ Ｌ Ｓ
Ｅ Ｎ Ｄ Ｅ Ｗ Ｔ Ｑ Ｄ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ｖ Ｔ Ｑ Ｉ Ｖ Ｓ Ａ Ｅ Ａ Ｗ Ｇ Ｒ Ａ Ｄ
配列番号２４ 参照ＴＣＲアルファ鎖ＤＮＡ配列
ｃａａａａａｇａａｇｔｔｇａｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｔｃｃａｇａｇｇｇａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｃｔｃｔｃａａｃｔｇｃａｃｔｔａｃａｇｔｇａｃｃｇａｇｇｔｔｃｃｃａｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇｔａｃａｇａｃａａｔａｔｔｃｔｇｇｇａａａａｇｃｃｃｔｇａｇｔｔｇａｔａａｔｇｔｃｃａｔａｔａｃｔｃｃａａｔｇｇｔｇａｃａａａｇａａｇａｔｇｇａａｇｇｔｔｔａｃａｇｃａｃａｇｃｔｃａａｔａａａｇｃｃａｇｃｃａｇｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｃａｔｃａｇａｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｃａｇｔｇａｔｔｃａｇｃｃａｃｃｔａｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇａａｔａｇｔｇａｔｔｃｃｇｇｇｔａｔｇｃａｃｔｃａａｃｔｔｃｇｇｃａａａｇｇｃａｃｃｔｃｇｃｔｇｔｔｇｇｔｃａｃａｃｃｃｃａｔａｔｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃａｇｃｔｇａｇａｇａｃｔｃｔａａｇｔｃｇａｇｔｇａｃａａｇｔｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔａｔｔｃａｃｃｇａｔｔｔｔｇａｔｔｃｔｃａａａｃａａａｔｇｔｇｔｃａｃａａａｇｔａａｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｔｇｔａｔａｔｃａｃａｇａｃａａａｔｇｔｇｔｇｃｔａｇａｃａｔｇａｇｇｔｃｔａｔｇｇａｃｔｔｃａａｇａｇｃａａｃａｇｔｇｃｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｇｃａａｃａａａｔｃｔｇａｃｔｔｔｇｃａｔｇｔｇｃａａａｃｇｃｃｔｔｃａａｃａａｃａｇｃａｔｔａｔｔｃｃａｇａａｇａｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａａａｇｔｔｃｃ
配列番号２５ 参照ＴＣＲベータ鎖ＤＮＡ配列
ｇａｔｔｃｔｇｇａｇｔｃａｃａｃａａａｃｃｃｃａａａｇｃａｃｃｔｇａｔｃａｃａｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｇｔｇａｃｇｃｔｇａｇａｔｇｃｔｃｃｃｃｔａｇｇｔｃｔｇｇａｇａｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔａｃｔｇｇｔａｃｃａａｃａｇａｇｃｃｔｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃｔｃｃａｇｔｔｃｃｔｃａｔｔｃａｇｔａｔｔａｔａａｔｇｇａｇａａｇａｇａｇａｇｃａａａａｇｇａａａｃａｔｔｃｔｔｇａａｃｇａｔｔｃｔｃｃｇｃａｃａａｃａｇｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔｇａａｃｔａａａｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｇｇａｃｔｃａｇｃｔｔｔｇｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｃｇｇｇｇｇｇｇａａｔｃｔｇａｇｃａｇｔａｃｔｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｃａｃｃａｇｇｃｔｃａｃｇｇｔｃａｃａｇａｇｇａｃｃｔｇａａａａａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｃｃｃｇａｇｇｔｃｇｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｃａｔｃａｇａａｇｃａｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｃａｃｃｃａａａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｇａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃａｇｔｇｇｇｇｔｃｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｇｇａｇｃａｇｃｃｃｇｃｃｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｃａｇａｔａｃｇｃｔｃｔｇａｇｃａｇｃｃｇｃｃｔｇａｇｇｇｔｃｔｃｇｇｃｃａｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇｃａａｃｃａｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｔａｃｇｇｇｃｔｃｔｃｇｇａｇａａｔｇａｃｇａｇｔｇｇａｃｃｃａｇｇａｔａｇｇｇｃｃａａａｃｃｃｇｔｃａｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔａｇａｇｃａｇａｃ
ＤＲＧＳＱＳ（αＣＤＲ１）、配列番号２６
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）、配列番号２７
ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号２８
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）、配列番号２９
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）、配列番号３０
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）、配列番号３１
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）、配列番号３２
ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３３
ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３４
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３５
ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３６
ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３７
ＤＲＧＳＦＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３８
ＤＲＧＳＹＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３９
ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号４０
配列番号４３ 左相同アーム（ＬＨＡ）
ＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＡＣＡＡＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＧＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＧＧＣＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡ
配列番号４４ 右相同アーム（ＲＨＡ）
ＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＡＴＧＴＴＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＡＧＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣ
配列番号４５ ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４
ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡ
配列番号４６ 合成ポリＡ配列
ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号４７ ＥＦ１Ａプロモーター
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣ ＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ
配列番号４８ ＬＯＸＰ
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
配列番号４９ ピューロマイシン耐性遺伝子
ＡＴＧＡＣＣ ＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣ ＣＣＡＣＣＧＴＧＡＧ ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣ ＡＧＡＧＡＣＧＡＣＧ ＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣ ＣＧＴＧＡＧＡＡＣＣ ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧ ＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡ ＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣ ＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣ ＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣ ＡＴＣＧＡＧＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＧＡＧＣＴ ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡ ＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴ ＧＧＡＣＡＴＣＧＧＣ ＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧ ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡ ＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴ ＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴ ＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣ ＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧ ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ ＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣ ＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣ ＣＣＴＡＧＡＡＴＧＧ ＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣ ＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧ ＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ ＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴ ＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣ ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＡ ＧＧＡＧＣＣＣＧＣＣ ＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧ ＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧ ＡＧＴＧＡＧＣＣＣＴ ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧ ＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴ ＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴ ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣ ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡ ＡＧＣＣＧＣＴＧＡＧ ＡＧＡＧＣＣＧＧＡＧ ＴＧＣＣＣＧＣＣＴＴ ＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣ ＴＣＣＧＣＣＣＣＣＡ ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣ ＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧ ＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴ ＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣ ＣＧＣＣＧＡＴＧＴＧ ＧＡＡＧＴＧＣＣＴＧ ＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧ ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣ ＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣ Ｃ
プライマー１８２４（配列番号５０）
ＴＡＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡ
プライマー１８２５（配列番号５１）
ＧＣＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＧＴＡＧＣ
プライマー２２９４（配列番号５２）
ＴＣＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣ
プライマー２２９５（配列番号５３）
ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＧ
プライマーＩＴＲ＿Ｆ（配列番号５４）
ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｒ（配列番号５５）
ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ
配列番号１、ＭＡＧＥ Ａ４
ＭＳＳＥＱＫＳＱＨＣ ＫＰＥＥＧＶＥＡＱＥ ＥＡＬＧＬＶＧＡＱＡ ＰＴＴＥＥＱＥＡＡＶ ＳＳＳＳＰＬＶＰＧＴ
ＬＥＥＶＰＡＡＥＳＡ ＧＰＰＱＳＰＱＧＡＳ ＡＬＰＴＴＩＳＦＴＣ ＷＲＱＰＮＥＧＳＳＳ ＱＥＥＥＧＰＳＴＳＰ
ＤＡＥＳＬＦＲＥＡＬ ＳＮＫＶＤＥＬＡＨＦ ＬＬＲＫＹＲＡＫＥＬ ＶＴＫＡＥＭＬＥＲＶ ＩＫＮＹＫＲＣＦＰＶ
ＩＦＧＫＡＳＥＳＬＫ ＭＩＦＧＩＤＶＫＥＶ ＤＰＡＳＮＴＹＴＬＶ ＴＣＬＧＬＳＹＤＧＬ ＬＧＮＮＱＩＦＰＫＴ
ＧＬＬＩＩＶＬＧＴＩ ＡＭＥＧＤＳＡＳＥＥ ＥＩＷＥＥＬＧＶＭＧ ＶＹＤＧＲＥＨＴＶＹ ＧＥＰＲＫＬＬＴＱＤ
ＷＶＱＥＮＹＬＥＹＲ ＱＶＰＧＳＮＰＡＲＹ ＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡ ＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨ ＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ
ＡＹＰＳＬＲＥＡＡＬ ＬＥＥＥＥＧＶ
配列番号２、ＭＡＧＥ Ａ４ペプチド
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＡ
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ
ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣ
ＶＳＰＦＳＮ
配列番号１２；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖（残基７１～７６）
ＬＴＦＳＥＮ
配列番号１３；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲα鎖（残基１１１～１２５）
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ
配列番号１４；ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖（残基４６～５０）
ＫＧＨＤＲ
配列番号１５；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲβ鎖（残基６８～７３）
ＳＦＤＶＫＤ
配列番号１６；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖（残基１１０～１２３）
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ
配列番号１７ ＣＤＲ１ ＣＤ８α（残基４５～５３）
ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ
配列番号１８ ＣＤＲ２ ＣＤ８α（残基７２～７９）
ＹＬＳＱＮＫＰＫ
配列番号１９ ＣＤＲ３ ＣＤ８α（残基１１８～１２３）
ＬＳＮＳＩＭ
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ
配列番号２２ 親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＡＶ１２－２＊０２／ＴＲＡＪ４１＊０１／ＴＲＡＣアルファ鎖アミノ酸細胞外配列
Ｑ Ｋ Ｅ Ｖ Ｅ Ｑ Ｎ Ｓ Ｇ Ｐ Ｌ Ｓ Ｖ Ｐ Ｅ Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｓ Ｌ Ｎ Ｃ Ｔ Ｙ Ｓ Ｄ
Ｒ Ｇ Ｓ Ｑ Ｓ Ｆ Ｆ Ｗ Ｙ Ｒ Ｑ Ｙ Ｓ Ｇ Ｋ Ｓ Ｐ Ｅ Ｌ Ｉ Ｍ Ｓ Ｉ Ｙ Ｓ Ｎ Ｇ
Ｄ Ｋ Ｅ Ｄ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ａ Ｑ Ｌ Ｎ Ｋ Ａ Ｓ Ｑ Ｙ Ｖ Ｓ Ｌ Ｌ Ｉ Ｒ Ｄ Ｓ Ｑ Ｐ
Ｓ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｙ Ｌ Ｃ Ａ Ｖ Ｎ Ｓ Ｄ Ｓ Ｇ Ｙ Ａ Ｌ Ｎ Ｆ Ｇ Ｋ Ｇ Ｔ Ｓ Ｌ Ｌ
Ｖ Ｔ Ｐ Ｈ Ｉ Ｑ Ｎ Ｐ Ｄ Ｐ Ａ Ｖ Ｙ Ｑ Ｌ Ｒ Ｄ Ｓ Ｋ Ｓ Ｓ Ｄ Ｋ Ｓ Ｖ Ｃ Ｌ
Ｆ Ｔ Ｄ Ｆ Ｄ Ｓ Ｑ Ｔ Ｎ Ｖ Ｓ Ｑ Ｓ Ｋ Ｄ Ｓ Ｄ Ｖ Ｙ Ｉ Ｔ Ｄ Ｋ Ｔ Ｖ Ｌ Ｄ
Ｍ Ｒ Ｓ Ｍ Ｄ Ｆ Ｋ Ｓ Ｎ Ｓ Ａ Ｖ Ａ Ｗ Ｓ Ｎ Ｋ Ｓ Ｄ Ｆ Ａ Ｃ Ａ Ｎ Ａ Ｆ Ｎ
Ｎ Ｓ Ｉ Ｉ Ｐ Ｅ Ｄ Ｔ Ｆ Ｆ Ｐ Ｓ Ｐ Ｅ Ｓ Ｓ
配列番号２３ 親ＡＦＰ ＴＣＲ ＴＲＢＶ９＊０１／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－７＊０１／ＴＲＢＣ２ベータ鎖アミノ酸細胞外配列
Ｄ Ｓ Ｇ Ｖ Ｔ Ｑ Ｔ Ｐ Ｋ Ｈ Ｌ Ｉ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ Ｑ Ｒ Ｖ Ｔ Ｌ Ｒ Ｃ Ｓ Ｐ Ｒ Ｓ
Ｇ Ｄ Ｌ Ｓ Ｖ Ｙ Ｗ Ｙ Ｑ Ｑ Ｓ Ｌ Ｄ Ｑ Ｇ Ｌ Ｑ Ｆ Ｌ Ｉ Ｑ Ｙ Ｙ Ｎ Ｇ Ｅ Ｅ
Ｒ Ａ Ｋ Ｇ Ｎ Ｉ Ｌ Ｅ Ｒ Ｆ Ｓ Ａ Ｑ Ｑ Ｆ Ｐ Ｄ Ｌ Ｈ Ｓ Ｅ Ｌ Ｎ Ｌ Ｓ Ｓ Ｌ
Ｅ Ｌ Ｇ Ｄ Ｓ Ａ Ｌ Ｙ Ｆ Ｃ Ａ Ｓ Ｓ Ｌ Ｇ Ｇ Ｅ Ｓ Ｅ Ｑ Ｙ Ｆ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｒ
Ｌ Ｔ Ｖ Ｔ Ｅ Ｄ Ｌ Ｋ Ｎ Ｖ Ｆ Ｐ Ｐ Ｅ Ｖ Ａ Ｖ Ｆ Ｅ Ｐ Ｓ Ｅ Ａ Ｅ Ｉ Ｓ Ｈ
Ｔ Ｑ Ｋ Ａ Ｔ Ｌ Ｖ Ｃ Ｌ Ａ Ｔ Ｇ Ｆ Ｙ Ｐ Ｄ Ｈ Ｖ Ｅ Ｌ Ｓ Ｗ Ｗ Ｖ Ｎ Ｇ Ｋ
Ｅ Ｖ Ｈ Ｓ Ｇ Ｖ Ｓ Ｔ Ｄ Ｐ Ｑ Ｐ Ｌ Ｋ Ｅ Ｑ Ｐ Ａ Ｌ Ｎ Ｄ Ｓ Ｒ Ｙ Ｃ Ｌ Ｓ
Ｓ Ｒ Ｌ Ｒ Ｖ Ｓ Ａ Ｔ Ｆ Ｗ Ｑ Ｎ Ｐ Ｒ Ｎ Ｈ Ｆ Ｒ Ｃ Ｑ Ｖ Ｑ Ｆ Ｙ Ｇ Ｌ Ｓ
Ｅ Ｎ Ｄ Ｅ Ｗ Ｔ Ｑ Ｄ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ｖ Ｔ Ｑ Ｉ Ｖ Ｓ Ａ Ｅ Ａ Ｗ Ｇ Ｒ Ａ Ｄ
配列番号２４ 参照ＴＣＲアルファ鎖ＤＮＡ配列
ｃａａａａａｇａａｇｔｔｇａｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｔｃｃａｇａｇｇｇａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｃｔｃｔｃａａｃｔｇｃａｃｔｔａｃａｇｔｇａｃｃｇａｇｇｔｔｃｃｃａｇｔｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇｔａｃａｇａｃａａｔａｔｔｃｔｇｇｇａａａａｇｃｃｃｔｇａｇｔｔｇａｔａａｔｇｔｃｃａｔａｔａｃｔｃｃａａｔｇｇｔｇａｃａａａｇａａｇａｔｇｇａａｇｇｔｔｔａｃａｇｃａｃａｇｃｔｃａａｔａａａｇｃｃａｇｃｃａｇｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｃａｔｃａｇａｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｃａｇｔｇａｔｔｃａｇｃｃａｃｃｔａｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃｇｔｇａａｔａｇｔｇａｔｔｃｃｇｇｇｔａｔｇｃａｃｔｃａａｃｔｔｃｇｇｃａａａｇｇｃａｃｃｔｃｇｃｔｇｔｔｇｇｔｃａｃａｃｃｃｃａｔａｔｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃａｇｃｔｇａｇａｇａｃｔｃｔａａｇｔｃｇａｇｔｇａｃａａｇｔｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔａｔｔｃａｃｃｇａｔｔｔｔｇａｔｔｃｔｃａａａｃａａａｔｇｔｇｔｃａｃａａａｇｔａａｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｔｇｔａｔａｔｃａｃａｇａｃａａａｔｇｔｇｔｇｃｔａｇａｃａｔｇａｇｇｔｃｔａｔｇｇａｃｔｔｃａａｇａｇｃａａｃａｇｔｇｃｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｇｃａａｃａａａｔｃｔｇａｃｔｔｔｇｃａｔｇｔｇｃａａａｃｇｃｃｔｔｃａａｃａａｃａｇｃａｔｔａｔｔｃｃａｇａａｇａｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａａａｇｔｔｃｃ
配列番号２５ 参照ＴＣＲベータ鎖ＤＮＡ配列
ｇａｔｔｃｔｇｇａｇｔｃａｃａｃａａａｃｃｃｃａａａｇｃａｃｃｔｇａｔｃａｃａｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｇｔｇａｃｇｃｔｇａｇａｔｇｃｔｃｃｃｃｔａｇｇｔｃｔｇｇａｇａｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔａｃｔｇｇｔａｃｃａａｃａｇａｇｃｃｔｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃｔｃｃａｇｔｔｃｃｔｃａｔｔｃａｇｔａｔｔａｔａａｔｇｇａｇａａｇａｇａｇａｇｃａａａａｇｇａａａｃａｔｔｃｔｔｇａａｃｇａｔｔｃｔｃｃｇｃａｃａａｃａｇｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔｇａａｃｔａａａｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｇｇａｃｔｃａｇｃｔｔｔｇｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｃｇｇｇｇｇｇｇａａｔｃｔｇａｇｃａｇｔａｃｔｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｃａｃｃａｇｇｃｔｃａｃｇｇｔｃａｃａｇａｇｇａｃｃｔｇａａａａａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｃｃｃｇａｇｇｔｃｇｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｃａｔｃａｇａａｇｃａｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｃａｃｃｃａａａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｇａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃａｇｔｇｇｇｇｔｃｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｇｇａｇｃａｇｃｃｃｇｃｃｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｃａｇａｔａｃｇｃｔｃｔｇａｇｃａｇｃｃｇｃｃｔｇａｇｇｇｔｃｔｃｇｇｃｃａｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇｃａａｃｃａｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｔａｃｇｇｇｃｔｃｔｃｇｇａｇａａｔｇａｃｇａｇｔｇｇａｃｃｃａｇｇａｔａｇｇｇｃｃａａａｃｃｃｇｔｃａｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔａｇａｇｃａｇａｃ
ＤＲＧＳＱＳ（αＣＤＲ１）、配列番号２６
ＩＹＳＮＧＤ（αＣＤＲ２）、配列番号２７
ＡＶＮＳＤＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号２８
ＳＧＤＬＳ（βＣＤＲ１）、配列番号２９
ＹＹＮＧＥＥ（βＣＤＲ２）、配列番号３０
ＡＳＳＬＧＧＥＳＥＱＹ（βＣＤＲ３）、配列番号３１
ＤＲＧＳＱＡ（αＣＤＲ１）、配列番号３２
ＡＶＮＳＤＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３３
ＡＶＮＳＤＳＧＶＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３４
ＡＶＮＳＱＳＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３５
ＡＶＮＳＱＳＧＹＳＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３６
ＡＶＮＳＱＮＧＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号３７
ＤＲＧＳＦＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３８
ＤＲＧＳＹＳ（αＣＤＲ１）、配列番号３９
ＡＶＮＳＱＳＳＹＡＬＮＦ（αＣＤＲ３）、配列番号４０
ＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＡＣＡＡＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＧＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＧＧＣＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡ
配列番号４４ 右相同アーム（ＲＨＡ）
ＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＡＡＡＣＣＡＡＴＧＴＴＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＡＧＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣ
配列番号４５ ＦｕＴ２Ａ＿Ａ２Ｍ４
ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡ
配列番号４６ 合成ポリＡ配列
ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ
配列番号４７ ＥＦ１Ａプロモーター
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣ ＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ
配列番号４８ ＬＯＸＰ
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ
配列番号４９ ピューロマイシン耐性遺伝子
ＡＴＧＡＣＣ ＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣ ＣＣＡＣＣＧＴＧＡＧ ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣ ＡＧＡＧＡＣＧＡＣＧ ＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣ ＣＧＴＧＡＧＡＡＣＣ ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧ ＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡ ＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣ ＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡ ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣ ＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣ ＡＴＣＧＡＧＡＧＧＧ ＴＧＡＣＣＧＡＧＣＴ ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡ ＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴ ＧＧＡＣＡＴＣＧＧＣ ＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧ ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡ ＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴ ＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴ ＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣ ＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧ ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ ＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣ ＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣ ＣＣＴＡＧＡＡＴＧＧ ＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣ ＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧ ＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ ＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴ ＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣ ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＡ ＧＧＡＧＣＣＣＧＣＣ ＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧ ＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧ ＡＧＴＧＡＧＣＣＣＴ ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧ ＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴ ＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴ ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣ ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡ ＡＧＣＣＧＣＴＧＡＧ ＡＧＡＧＣＣＧＧＡＧ ＴＧＣＣＣＧＣＣＴＴ ＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣ ＴＣＣＧＣＣＣＣＣＡ ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣ ＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧ ＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴ ＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣ ＣＧＣＣＧＡＴＧＴＧ ＧＡＡＧＴＧＣＣＴＧ ＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧ ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣ ＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣ Ｃ
プライマー１８２４（配列番号５０）
ＴＡＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡ
プライマー１８２５（配列番号５１）
ＧＣＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＧＴＡＧＣ
プライマー２２９４（配列番号５２）
ＴＣＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣ
プライマー２２９５（配列番号５３）
ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＧ
プライマーＩＴＲ＿Ｆ（配列番号５４）
ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ
プライマーＩＴＲ＿Ｒ（配列番号５５）
ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】