特表 2024-528960 ポリヌクレオチドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】ポリヌクレオチドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240725BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240725BHJP

   A61K 47/42 20170101ALN20240725BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20240725BHJP

   A61K 39/12 20060101ALN20240725BHJP

   A61P 31/14 20060101ALN20240725BHJP

   A61P 37/04 20060101ALN20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/44

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K48/00

A61P35/00

A61K31/7105

A61K31/713

A61K31/7088

A61K47/46

C12N15/113 Z

A61K47/42

A61K38/20

A61K39/12

A61P31/14

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506487

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-03-27

(86)【国際出願番号】 US2022074491

(87)【国際公開番号】W WO2023015221

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/228,892

(32)【優先日】2021-08-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523026950

【氏名又は名称】ストランド セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】クラナ， ジャスプリート エス．

(72)【発明者】

【氏名】シャー， アロック

(72)【発明者】

【氏名】北田 輔

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA05

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA94

4C076CC06

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE41M

4C076EE57

4C076FF31

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084DA12

4C084MA05

4C084NA05

4C084NA12

4C084ZB261

4C084ZB331

4C085AA03

4C085BA61

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE05

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA12

4C086ZB26

4C086ZB33

(57)【要約】

本開示は、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１の核酸分子と、異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子とを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。本開示はまた、ポリヌクレオチドを作製する方法、細胞を改変する方法、およびそれを使用して対象を処置する方法も含む。本開示は、自然免疫阻害剤、例えば、インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、異種標的ｍＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド（例えば、レプリコン）またはポリヌクレオチドの組を提供する。このようなポリヌクレオチドは、細胞内で異種標的ｍＲＮＡの増強された持続的な発現を駆動することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項2】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子および前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第１のベクターに存在する、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項3】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子が、第１のベクターに存在し、前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第２のベクターに存在する、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項4】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子が、第１のプロモーターの制御下で発現される、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項5】

前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第２のプロモーターの制御下で発現される、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項6】

前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが同じである、請求項５に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項7】

前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが異なる、請求項５に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項8】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子と、前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第１のプロモーターの制御下で発現され、前記第１のプロモーターが、前記インフルエンザＮＳ１タンパク質と前記標的ｍＲＮＡの両方の発現を駆動する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項9】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子および前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、ＩＲＥＳ配列によって連結されている、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項10】

前記第１のベクター、前記第２のベクター、または両方が、１またはそれを超える調節エレメントを含む、請求項２～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項11】

前記標的ｍＲＮＡの発現が、前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子の不在下で前記標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項12】

前記標的ｍＲＮＡの発現が、前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子の不在下で前記標的ｍＲＮＡの発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加する、請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項13】

前記標的ｍＲＮＡの前記発現の前記増加が、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、または少なくとも約４８時間持続する、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項14】

前記標的ｍＲＮＡが、生物学的に活性なポリペプチドをコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項15】

前記生物学的に活性なポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、酵素、またはその任意の組合せを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項16】

前記サイトカインが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、その断片、その変異体、またはその任意の組合せである、請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項17】

前記標的ｍＲＮＡが、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片または変異体をコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項18】

前記標的ｍＲＮＡが、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項19】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが単一のプロモーターから発現される、請求項１８に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項20】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが単一の連続したポリペプチドとして発現される、請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項21】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが、１またはそれを超える共有結合によって連結されている、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項22】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが、１またはそれを超えるペプチド結合によって連結されている、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項23】

前記ｐ３５サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡの一部が、ＩＲＥＳによって前記ｐ４０サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡの一部から分離されている、請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項24】

前記標的ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、またはその任意の組合せをコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項25】

前記第１のプロモーターが、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである、請求項４～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項26】

前記第２のプロモーターが、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである、請求項５～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項27】

前記インフルエンザＮＳ１が、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、またはその変異体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項28】

前記インフルエンザＮＳ１が、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、またはその任意の組合せである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項29】

前記インフルエンザＮＳ１がＨ５Ｎ１ ＮＳ１である、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項30】

前記インフルエンザＮＳ１がＨ１Ｎ１ ＮＳ１である、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項31】

前記Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１が、前記Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である、請求項３０に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項32】

前記第１の核酸分子によってコードされる前記インフルエンザＮＳ１が、配列番号１または２によって示される前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記アミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項33】

前記第１の核酸分子によってコードされる前記インフルエンザＮＳ１が、配列番号１または２によって示される前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記アミノ酸配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項34】

前記第１の核酸分子が、配列番号１または２に示される前記ヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項35】

前記第１の核酸分子が、配列番号１または２に示される前記ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項36】

１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項37】

（ｉ）前記第１の核酸分子、（ｉｉ）前記第２の核酸分子、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方が環状ＲＮＡである、請求項１～３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項38】

自己複製標的ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組であって、前記自己複製標的ｍＲＮＡが、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項39】

前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの組の中の前記核酸の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、または約２５％未満が修飾された核酸分子である、請求項１～３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項40】

前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの組の中の前記核酸の約２５％が修飾された核酸分子である、請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項41】

前記１またはそれを超える修飾された核酸分子が、修飾されたｒＮＴＰである、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項42】

前記１またはそれを超える修飾された核酸分子が、Ｎ１－メチルシュードウラシル、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、またはそれらの組合せを含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組。

【請求項43】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含むベクターまたはベクターの組。

【請求項44】

レプリコンである、請求項４３に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項45】

ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンまたはその誘導体もしくは部分である、請求項４３または４４に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項46】

野生型アミノ酸配列ＶＥＥに従って、残基７３９にリジンをコードするヌクレオチド配列を含むベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンである、請求項４３～４５のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項47】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項48】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項49】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖ）Ｅ１配列；および（ｖｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項50】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項51】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項52】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項53】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項54】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項55】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項56】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項57】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１ 変異体ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項58】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号１に示される前記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項59】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号１に示される前記ヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項60】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項61】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号２に示される前記ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項62】

前記ベクターが、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号２に示される前記ヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）前記標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、前記標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組。

【請求項63】

前記１またはそれを超えるｎｓＰが、ＶＥＥ ｎｓＰまたはその誘導体を含む、請求項４７～６２のいずれか一項に記載のベクターの組のベクター。

【請求項64】

前記ＶＥＥ ｎｓＰが、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、およびそれらの任意の組合せから選択される、請求項６３に記載のベクターの組のベクター。

【請求項65】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組または請求項４３～６４のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組を含む、細胞。

【請求項66】

哺乳動物細胞である、請求項６５に記載の細胞。

【請求項67】

ヒト細胞である、請求項６５または６６に記載の細胞。

【請求項68】

免疫細胞である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項69】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、請求項４３～６４のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組、または請求項６５～６８のいずれか一項に記載の細胞と、製薬上許容され得る担体を含む、医薬組成物。

【請求項70】

細胞において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組または請求項４３～６４のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組で前記細胞をトランスフェクトすることを含む方法。

【請求項71】

前記細胞がヒト細胞である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記細胞がエクスビボヒト細胞である、請求項７０または７１に記載の方法。

【請求項73】

前記細胞がヒト免疫細胞である、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、請求項４３～６４のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項６９に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、処置を必要とする対象を処置する方法。

【請求項75】

標的ｍＲＮＡの発現を必要とする対象において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、請求項４３～６４のいずれか一項に記載のベクターまたはベクターの組、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項６９に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項76】

前記対象が癌に罹患している、請求項７４または７５に記載の方法。

【請求項77】

前記癌が、黒色腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、および頭頸部扁平上皮癌をはじめとする様々な種類の頭頸部癌からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。いくつかの態様では、前記癌は、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、およびそれらの任意の組合せであり得る。

【請求項78】

標的ｍＲＮＡを細胞において発現させる方法であって、前記標的ｍＲＮＡとインフルエンザＮＳ１タンパク質とを前記細胞において共発現させることを含み、前記標的ｍＲＮＡがインフルエンザｍＲＮＡではない、方法。

【請求項79】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質が第１の核酸分子によってコードされ、前記標的ｍＲＮＡが第２の核酸分子によってコードされる、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子および前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第１のベクターに存在する、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項81】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子が、第１のベクターに存在し、前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第２のベクターに存在する、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項82】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子が、第１のプロモーターの制御下で発現される、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第２のプロモーターの制御下で発現される、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが同じである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが異なる、請求項８３に記載の方法。

【請求項86】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子と、前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、第１のプロモーターの制御下で発現され、前記第１のプロモーターが、前記インフルエンザＮＳ１タンパク質と前記標的ｍＲＮＡの両方の発現を駆動する、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子および前記標的ｍＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子が、ＩＲＥＳ配列によって連結されている、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記第１のベクター、前記第２のベクター、または両方が、１またはそれを超える調節エレメントを含む、請求項８０～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記標的ｍＲＮＡの発現が、前記インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする前記第１の核酸分子の不在下で前記標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している、請求項７８～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

（ｉ）前記第一の核酸分子、（ｉｉ）前記第二の核酸分子、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方が環状ＲＮＡである、請求項７９～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

標的ｍＲＮＡを細胞において発現させる方法であって、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む自己複製標的ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組で前記細胞をトランスフェクトすることを含む、方法。

【請求項92】

前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの組の中の前記核酸の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、または約２５％未満が、修飾された核酸分子である、請求項９１に記載の。

【請求項93】

前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの組の中の前記核酸の約２５％が修飾された核酸分子である、請求項９１または９２に記載の方法。

【請求項94】

前記１またはそれを超える修飾された核酸分子が、修飾されたｒＮＴＰである、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記１またはそれを超える修飾された核酸分子が、Ｎ１－メチルシュードウラシル、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、またはそれらの組合せを含む、請求項９１～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記標的ｍＲＮＡの発現が、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含まない自己複製標的ｍＲＮＡからの前記標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記標的ｍＲＮＡの発現が、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加する、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記標的ｍＲＮＡの前記発現の前記増加が、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、または少なくとも約４８時間持続する、請求項９６または９７に記載の方法。

【請求項99】

前記標的ｍＲＮＡが、生物学的に活性なポリペプチドをコードする、請求項７０～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記生物学的に活性なポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、酵素、またはその任意の組合せを含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記サイトカインが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、その断片、その変異体、またはその任意の組合せである、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記標的ｍＲＮＡが、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片または変異体をコードする、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記標的ｍＲＮＡが、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードする、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが単一のプロモーターから発現される、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが単一の隣接したポリペプチドとして発現される、請求項１０３または１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが、１またはそれを超える共有結合によって連結されている、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが、１またはそれを超えるペプチド結合によって連結されている、請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記ｐ３５サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡの一部が、ＩＲＥＳによって前記ｐ４０サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡの一部から分離されている、請求項１０３または１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記標的ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、またはその任意の組合せをコードする、請求項７０～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記第１のプロモーターが、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである、請求項８２～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記第２のプロモーターが、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである、請求項８３～９０、１０９および１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記インフルエンザＮＳ１が、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、またはその変異体である、請求項７８～９０および１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記インフルエンザＮＳ１が、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、またはその組合せである、請求項７８～９０および１０９～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記インフルエンザＮＳ１がＨ５Ｎ１ ＮＳ１である、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記インフルエンザＮＳ１がＨ１Ｎ１ ＮＳ１である、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１が、前記Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記第１の核酸分子によってコードされる前記インフルエンザＮＳ１が、配列番号１または２によって示される前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記アミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記第１の核酸分子によってコードされる前記インフルエンザＮＳ１が、配列番号１または２によって示される前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記アミノ酸配列を含む、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記第１の核酸分子が、配列番号１または２に示される前記ヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記第１の核酸分子が、配列番号１または２に示される前記ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする、請求項７８～９０および１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年８月３日に出願された米国仮出願第６３／２２８，８９２号に基づく優先権利益を主張し、この仮出願の内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願において提出された、電子的に提出された配列表（４５９７＿００８ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ｓｔ２６．ｘｍｌ；サイズ：９６，７８５バイト；作成日：２０２２年８月３日）の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示の分野
本開示は、自然免疫阻害剤（innate immune inhibitor）、例えば、インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、異種標的ｍＲＮＡをコードする第２のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド（例えば、レプリコン）またはポリヌクレオチドの組を提供する。このようなポリヌクレオチドは、細胞内で異種標的ｍＲＮＡの増強された持続的な発現を駆動することができる。

【背景技術】

【0004】

本開示の背景
核酸治療薬は、幅広い種類の疾患に対する有望で急速に開発されている処置として現れた。これらの治療は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて、機能性ＲＮＡおよび／または治療用ポリペプチドなどの生物学的に活性な分子を、組換えタンパク質では達成が困難であることが多い天然の立体構造および翻訳後修飾を保持した形で産生することを細胞に依存している。合成ｍＲＮＡは、ウイルスまたはＤＮＡに基づく治療法と比較して安全性プロファイルが改善されており、貴重なツールであることが証明されている。しかしながら、ヒト免疫系はＲＮＡを自然に分解するため、投与された合成ＲＮＡ（例えば、環状ＲＮＡ）の効力および持続性を制限する。したがって、インビトロおよびインビボで強力かつ永続的な効果を提供するＲＮＡ治療薬が当技術分野で依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示の簡単な要旨
本開示のいくつかの態様は、インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。

【0006】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のベクターに存在する。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、第１のベクターに存在し、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第２のベクターに存在する。

【0007】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第２のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じである。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは異なる。

【0008】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子と、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現され、第１のプロモーターは、インフルエンザＮＳ１タンパク質と標的ｍＲＮＡの両方の発現を駆動する。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、ＩＲＥＳ配列によって連結されている。いくつかの態様では、第１のベクター、第２のベクター、または両方は、１またはそれを超える調節エレメントを含む。

【0009】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下で標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下で標的ｍＲＮＡの発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現の増加は、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、または少なくとも約４８時間持続する。

【0010】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、生物学的に活性なポリペプチドをコードする組。いくつかの態様では、生物学的に活性なポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、酵素、またはその任意の組合せを含む。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、その断片、その変異体、またはその任意の組合せである。

【0011】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片または変異体をコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードする。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは単一のプロモーターから発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは単一の連続したポリペプチドとして発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、１またはそれを超える共有結合によって連結されている。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、１またはそれを超えるペプチド結合によって連結されている。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットをコードするｍＲＮＡの一部は、ＩＲＥＳによってｐ４０サブユニットをコードするｍＲＮＡの一部から分離されている。

【0012】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、またはその任意の組合せをコードする。

【0013】

いくつかの態様では、第１のプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである。

【0014】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、またはその変異体である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、またはその任意の組合せである。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ５Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ１Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１は、Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である。

【0015】

いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１または２によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１または２によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の核酸分子は、配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。いくつかの態様では、第１の核酸分子は、配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。いくつかの態様では、（ｉ）第１の核酸分子、（ｉｉ）第２の核酸分子、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方は、環状ＲＮＡである。

【0016】

いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組は、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む。

【0017】

本開示のいくつかの態様は、自己複製標的ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組であって、自己複製標的ｍＲＮＡが、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、または約２５％未満が修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約２５％は修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾された核酸分子は、修飾されたｒＮＴＰである。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾された核酸分子は、Ｎ１－メチルシュードウラシル、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシンまたはそれらの組合せを含む。

【0018】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含むベクターまたはベクターの組に関する。いくつかの態様では、ベクターは、レプリコンである。いくつかの態様では、ベクターは、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンまたはその誘導体もしくは部分である。いくつかの態様では、ベクターは、野生型アミノ酸配列ＶＥＥに従った残基７３９にリジンをコードするヌクレオチド配列を含むベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンである。

【0019】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0020】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0021】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖ）Ｅ１配列；および（ｖｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0022】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0023】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0024】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0025】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0026】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0027】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0028】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0029】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１ 変異体ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0030】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0031】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0032】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0033】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）ＶＥＥ ３’ＵＴＲまたはその誘導体を含む。

【0034】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）ＶＥＥ ５’ＵＴＲまたはその誘導体；（ｉｉ）１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）；（ｉｉｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、標的ｍＲＮＡはヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、１またはそれを超えるｎｓＰは、ＶＥＥ ｎｓＰまたはその誘導体を含む。いくつかの態様では、ＶＥＥ ｎｓＰは、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、およびそれらの任意の組合せから選択される。

【0035】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組または本明細書に開示のベクターまたはベクターの組を含む、細胞に関する。いくつかの態様では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞である。

【0036】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、本明細書に開示のベクターまたはベクターの組、または本明細書に開示の細胞と、製薬上許容され得る担体を含む、医薬組成物に関する。

【0037】

本開示のいくつかの態様は、細胞において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組または本明細書に開示のベクターまたはベクターの組で前記細胞をトランスフェクトすることを含む方法に関する。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞はエクスビボヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞はヒト免疫細胞である。

【0038】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、本明細書に開示のベクターまたはベクターの組、本明細書に開示の細胞、または本明細書に開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象を処置する方法に関する。

【0039】

本開示のいくつかの態様は、標的ｍＲＮＡの発現を必要とする対象において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、本明細書に開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、本明細書に開示のベクターまたはベクターの組、本明細書に開示の細胞、または本明細書に開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。

【0040】

いくつかの態様では、対象は癌に罹患している。いくつかの態様では、癌は、黒色腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、および頭頸部扁平上皮癌をはじめとする様々な種類の頭頸部癌からなる群から選択される。いくつかの態様では、癌は、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、およびそれらの任意の組合せであり得る。

【0041】

本開示のいくつかの態様は、標的ｍＲＮＡを細胞において発現させる方法であって、標的ｍＲＮＡとインフルエンザＮＳ１タンパク質とを細胞において共発現させることを含み、標的ｍＲＮＡがインフルエンザｍＲＮＡではない、方法に関する。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質は第１の核酸分子によってコードされ、標的ｍＲＮＡは第２の核酸分子によってコードされる。

【0042】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のベクターに存在する。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、第１のベクターに存在し、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第２のベクターに存在する。

【0043】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第２のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じである。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは異なる。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子と、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現され、第１のプロモーターは、インフルエンザＮＳ１タンパク質と標的ｍＲＮＡの両方の発現を駆動する。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、ＩＲＥＳ配列によって連結されている。いくつかの態様では、第１のベクター、第２のベクター、または両方は、１またはそれを超える調節エレメントを含む。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下で標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している。いくつかの態様では、（ｉ）第一の核酸分子、（ｉｉ）第二の核酸分子、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方は環状ＲＮＡである。

【0044】

本開示のいくつかの態様は、標的ｍＲＮＡを細胞において発現させる方法であって、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む自己複製標的ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組で細胞をトランスフェクトすることを含む、方法に関する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、または約２５％未満は、修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約２５％は修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾された核酸分子は、修飾されたｒＮＴＰである。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾された核酸分子は、Ｎ１－メチルシュードウラシル、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、またはそれらの組合せを含む。

【0045】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、１またはそれを超える修飾された核酸分子を含まない自己複製標的ｍＲＮＡからの標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加している。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加する。

【0046】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現の増加は、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、または少なくとも約４８時間持続する。

【0047】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、生物学的に活性なポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、生物学的に活性なポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、酵素、またはその任意の組合せを含む。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、その断片、その変異体、またはその任意の組合せである。

【0048】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片または変異体をコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードする。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは単一のプロモーターから発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは単一の連続したポリペプチドとして発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、１またはそれを超える共有結合によって連結されている。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットが、１またはそれを超えるペプチド結合によって連結されている。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットをコードするｍＲＮＡの一部は、ＩＲＥＳによってｐ４０サブユニットをコードするｍＲＮＡの一部から分離されている。

【0049】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、またはその任意の組合せを含む。

【0050】

いくつかの態様では、第１のプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的に活性なプロモーターである。

【0051】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、またはその変異体である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、またはその組合せである。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ５Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ１Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１は、Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である。

【0052】

いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１または２によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１または２によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の核酸分子は、配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。いくつかの態様では、第１の核酸分子は、配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1A】図１Ａ～１Ｂは、試料の非細胞変性ＥＧＦＰベクター（図１Ａ）および非細胞変性ＮＳ１－ＥＧＦＰベクター（図１Ｂ）の図である。

【図1B】図１Ａ～１Ｂは、試料の非細胞変性ＥＧＦＰベクター（図１Ａ）および非細胞変性ＮＳ１－ＥＧＦＰベクター（図１Ｂ）の図である。

【0054】

【図2A-D】図２Ａ～２Ｄは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用した、Ｓｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ（図２Ａ）、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｏｄＲＮＡ（図２Ｂ）、およびＳｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ ｍＲＮＡ（図２Ｃ～２Ｄ）によるトランスフェクションの２４時間後の４Ｔ１細胞の画像である。

【0055】

【図2E】図２Ｅは、図２Ａ～２Ｄで試験された各ｍＲＮＡトランスフェクションについて観察された平均蛍光強度をまとめたものである。

【0056】

【図3A-D】図３Ａ～３Ｄは、ＴＴ３脂質ナノ粒子を使用した、Ｓｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ（図３Ａ）、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｏｄＲＮＡ（図３Ｂ）、およびＳｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ ｍＲＮＡ（図３Ｃ～３Ｄ）によるトランスフェクションの２４時間後の４Ｔ１細胞の画像である。

【0057】

【図3E-F】３Ｅ～３Ｆは、タンデムＮＳ１発現（図３Ｅ）またはＮＳ１同時トランスフェクション（図３Ｆ）によってトランスフェクトされた各ｍＲＮＡについて観察された平均蛍光強度をまとめたものである。

【0058】

【図4A-B】図４Ａ～４Ｈは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用した、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ（図４Ｂおよび４Ｆ）、ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ（図４Ｃおよび４Ｇ）、またはＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（図４Ｄおよび４Ｈ）によるＨｃｃ３８腫瘍細胞のトランスフェクションの２４時間後（図４Ａ～４Ｄ）および４８時間後（図４Ｅ～４Ｈ）にｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞数を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。

【図4C-D】図４Ａ～４Ｈは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用した、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ（図４Ｂおよび４Ｆ）、ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ（図４Ｃおよび４Ｇ）、またはＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（図４Ｄおよび４Ｈ）によるＨｃｃ３８腫瘍細胞のトランスフェクションの２４時間後（図４Ａ～４Ｄ）および４８時間後（図４Ｅ～４Ｈ）にｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞数を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。

【図4E-F】図４Ａ～４Ｈは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用した、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ（図４Ｂおよび４Ｆ）、ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ（図４Ｃおよび４Ｇ）、またはＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（図４Ｄおよび４Ｈ）によるＨｃｃ３８腫瘍細胞のトランスフェクションの２４時間後（図４Ａ～４Ｄ）および４８時間後（図４Ｅ～４Ｈ）にｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞数を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。

【図4G-H】図４Ａ～４Ｈは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用した、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ（図４Ｂおよび４Ｆ）、ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ（図４Ｃおよび４Ｇ）、またはＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（図４Ｄおよび４Ｈ）によるＨｃｃ３８腫瘍細胞のトランスフェクションの２４時間後（図４Ａ～４Ｄ）および４８時間後（図４Ｅ～４Ｈ）にｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞数を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。

【0059】

【図4I】図４Ｉ～４Ｋは、Ｓｃｃ９ ＨＮＳＣＣ細胞（図４Ｉ）およびＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ細胞（図４Ｊ～４Ｋ）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。

【図4J-K】図４Ｉ～４Ｋは、Ｓｃｃ９ ＨＮＳＣＣ細胞（図４Ｉ）およびＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ細胞（図４Ｊ～４Ｋ）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。

【0060】

【図5A-D】図５Ａ～５Ｄは、元の（Ｓｔｒａｎｄ）骨格（図５Ａ～５Ｂ）かまたはＱ７３９Ｌ変異を含有するもの（非細胞変性；図５Ｃ～５Ｄ）のいずれかを含有するＥＧＦＰをコードするレプリコンベクターを含むＴＴ３ ＬＮＰを使用した、ＢＴ２０癌のトランスフェクションの２４時間後にＥＧＦＰを発現する細胞数を示すフローサイトメトリーデータのグラフによる表示である。

【0061】

【図5E-F】図５Ｅ～５Ｆは、蛍光強度中央値（ＭＦＩ；図５Ｅ）ＧＦＰ陽性細胞のパーセントによって測定されるおよびトランスフェクション効率（図５Ｆ）のグラフ表示である。

【0062】

【図6A-F】図６Ａ～６Ｆは、未修飾ｒＮＴＰ（未修飾Ｒｅｐ；図６Ａおよび６Ｄ）を使用するか、またはＵＴＰ対Ｎ１－メチル－シュードＵＴＰ（ｐｓｉで示す）の１：１（５０％；図６Ｂおよび６Ｅ）または１：３（２５％；図６Ｃおよび６Ｆ）の比を使用して作製されたレプリコンを用いてエレクトロポレーションした後の、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＢ１６．Ｆ１０細胞（図６Ａ～６Ｃ）および４Ｔ１細胞（図６Ｄ～６Ｆ）の数を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。

【0063】

【図6G】図６Ｇは、図６Ａ～６Ｇに記載の細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のグラフ表示である。

【0064】

【図7】図７は、未修飾ｒＮＴＰ（ｕｎｍｏｄ）を使用するかまたは１：３の比の特定の

【化1】

；１：３ Ｃ：５ｍｅ－Ｃ（Ｍ２）（ここで、Ｃはシチジンを指し、５ｍｅ－Ｃは５－メチル－シチジンを指す）を使用して作製された、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするレプリコンを用いてトランスフェクトした４Ｔ１細胞の相対発光を示す棒グラフである。エレクトロポレーションによるトランスフェクションの２４時間後と４８時間後に発光を測定した。

【0065】

【図8A-B】図８Ａ～８Ｂは、未修飾ｒＮＴＰ（ｕｎｍｏｄ）を使用するかまたは１：３の比の特定の

【化2】

；１：３ Ｃ：５ｍｅ－Ｃ（Ｍ２）（ここで、Ｃはシチジンを指し、５ｍｅ－Ｃは５－メチル－シチジンを指す）のいずれかを使用して作製した、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするレプリコンでトランスフェクトした、インターフェロン誘導性細胞株であるＢ１６－ＩＳＧ細胞の比色分析（図８Ｂ）を用いたＳＥＡＰレポーターアッセイを用いて測定した相対発光（図８Ａ）およびＩ型ＩＦＮ活性を示す棒グラフである。

【0066】

【図9A-B】図９Ａ～９Ｃは、未修飾または単一（Ｍ１）もしくは二重修飾されたｒＮＴＰを使用して作製したＮＳ１－ＥＧＦＰ（Ｐ２Ａリンカー）を発現するＱ７３９Ｌレプリコンを用いてトランスフェクトされたＢ１６－ＩＳＧ細胞のペイロード発現（図９Ａ）、シグナル強度（図９Ｂ）、およびＩ型ＩＦＮ活性（図９Ｃ）のグラフ表示である。

【図9C】図９Ａ～９Ｃは、未修飾または単一（Ｍ１）もしくは二重修飾されたｒＮＴＰを使用して作製したＮＳ１－ＥＧＦＰ（Ｐ２Ａリンカー）を発現するＱ７３９Ｌレプリコンを用いてトランスフェクトされたＢ１６－ＩＳＧ細胞のペイロード発現（図９Ａ）、シグナル強度（図９Ｂ）、およびＩ型ＩＦＮ活性（図９Ｃ）のグラフ表示である。

【0067】

【図10A-F】図１０Ａ～１０Ｆは、組換えタンパク質（エンハンサー）を培地に添加した場合（図１０Ｄ～１０Ｆ）または添加しない場合（図１０Ａ～１０Ｃ）の高用量ＩＬ－２を含む抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２カクテルで２日間活性化したＴ細胞のＧＦＰ発現の画像である。Ｔ細胞に、脂質１（図１０Ａおよび１０Ｄ）、脂質２－コレステロール（図１０Ｂおよび１０Ｅ）、または脂質２－β－シトステロール（図１０Ｃおよび１０Ｆ）をトランスフェクトした。

【0068】

【図11A-C】図１１Ａ～１１Ｃは、ＩＬ－２および抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２を使用して解凍後２日間活性化され、上記で用いたようにＮＳ１－ＥＧＦＰを駆動するＱ７３９Ｌレプリコンを使用してトランスフェクトされ、未修飾または単一（Ｍ１）もしくは二重修飾された（Ｍ２）ｍＲＮＡを使用して作製された、初代ヒトＴ細胞におけるトランスフェクション効率（ＧＦＰ陽性細胞％；図１１Ａ）、蛍光強度中央値（図１１Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図１１Ｃ）のグラフ表示である。

【0069】

【図12A-B】図１２Ａ～１２Ｂは、３人の健康なドナーから単離され、お抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２カクテル（活性化）の存在下で低用量のＩＬ－２（休止）かまたは高用量のＩＬ－２のいずれかを用いて２日間増殖させた後、ＮＳ１－ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰを駆動するＭ２修飾Ｑ７３９Ｌレプリコン、または従来のＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｍｏｄ）を用いてｍＲＮＡ：脂質を送達したヒトＰＢＭＣにおけるトランスフェクション効率（ＧＦＰ陽性細胞％；図１２Ａ）およびＩＦＮ－α活性化（図１２Ｂ）のグラフ表示である。測定は、トランスフェクションの２４時間後に行った。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本開示の詳細な説明
本開示のいくつかの態様は、インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１の核酸分子と、異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子とを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。本開示は、ポリヌクレオチド、例えばレプリコンによってコードされる標的ｍＲＮＡの発現がインフルエンザＮＳ１の存在下で増強され得ることを提供する。特に、インフルエンザＮＳ１と標的ｍＲＮＡとの共発現は、細胞における標的ｍＲＮＡの発現量および標的ｍＲＮＡの発現持続性を増加させる。したがって、本開示のいくつかの態様は、細胞、例えば、ヒト細胞において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、インフルエンザ非構造（ＮＳ１）タンパク質をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含むポリヌクレオチド（例えば、環状ＲＮＡ）またはポリヌクレオチドの組（例えば、環状ＲＮＡの組）を細胞にトランスフェクトすることを含む方法に関する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードする。

【0071】

本開示のさらなる態様は、本出願を通じて提供される。

【0072】

Ｉ．定義
本開示がより容易に理解されるように、最初に特定の用語を定義する。本出願で使用される場合、本明細書で他に明示的に提供される場合を除き、以下の各用語は、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通じて記載される。

【0073】

「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、１またはそれを超えるその実態を指すことに留意されたい。例えば、「１つの（ａ）ヌクレオチド配列」は、１またはそれを超えるヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１またはそれを超える」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「もっぱら」、「のみ」などの排他的な用語を使用したり、「否定的な」限定を使用したりする際の先行根拠となることが意図されている。

【0074】

本明細書で使用される「および／または」という用語は、２つの指定された特徴または成分のそれぞれが他方の有無にかかわらず具体的に開示されると解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズで使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などのフレーズで使用される「および／または」という用語は、次の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各々を包含することを意図する。

【0075】

態様が「含む」という文言で本明細書に記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載されている他の類似の態様も提供されることが理解される。

【0076】

本明細書で使用される場合、１またはそれを超える関心対象の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された基準値に類似しており、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、記載される基準値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲内にある値を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。「およそ」または「約」という用語が本明細書で特定の値に適用される場合、「およそ」または「約」という用語のない値も本明細書に開示される。

【0077】

本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、特に明記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合はその分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解される。

【0078】

本明細書で使用される場合、「ｕｇ」および「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」および「μＭ」と互換的に使用される。

【0079】

別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の属する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。

【0080】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）で承認された形式で示されている。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。値の範囲が記載されている場合、その範囲の記載された上限と下限との間に介在する各整数値およびその各分数もまた、そのような値の間の各部分範囲と共に具体的に開示されることを理解されたい。任意の範囲の上限および下限は、独立に範囲に含めることも範囲から除外することもでき、どちらかの限界を含むか、どちらも含まないか、または両方の限界を含む各範囲も本開示に包含される。したがって、本明細書に列挙される範囲は、列挙された端点を含む、範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。

【0081】

値が明示的に列挙されている場合、列挙された値とほぼ同じ量または量である値も本開示の範囲内であることを理解されたい。組合せが開示されている場合、その組合せの要素の各部分組合せも具体的に開示されており、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、それらの組合せも開示される。本開示の任意の要素が複数の代替形態を有するものとして開示されている場合、各代替形態が単独で、または他の代替形態と任意に組み合わせて除外されるその開示の例も本明細書によって開示される。本開示の２つ以上の要素がそのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素のすべての組合せが本明細書に開示される。

【0082】

ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字コードによって呼ばれる。別段示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の向きで左から右に記載される。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されるその一般的に知られている１文字記号によって本明細書中で言及される。したがって、「ａ」はアデニンを表し、「ｃ」はシトシンを表し、「ｇ」はグアニンを表し、「ｔ」はチミンを表し、「ｕ」はウラシルを表す。

【0083】

アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれている。アミノ酸は、一般に知られている３文字の記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかによって本明細書で言及される。

【0084】

「投与」、「投与すること」、という用語およびその文法上の変形は、薬学的に許容され得る経路を介して組成物（例えば、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドなど）を対象に導入することを指す。対象への組成物の導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、直腸、リンパ内、髄腔内、眼周囲または局所を含む任意の適切な経路によって行うことができる。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。適切な投与経路は、組成物がその意図された機能を果たすことを可能にする。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物を対象の静脈内に導入することによって投与することができる。

【0085】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、体内の異常細胞の制御されない増殖を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されていない細胞分裂および増殖分裂および増殖により、悪性腫瘍が形成され、近隣の組織を浸潤し、リンパ系または血流を通って体の離れた部分に転移する可能性がある。本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、黒色腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、および頭頸部扁平上皮癌を含む様々な種類の頭頸部癌をはじめとする任意の癌の処置に使用することができる。いくつかの態様では、癌は、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、およびそれらの任意の組合せであり得る。

【0086】

「コード配列」または配列を「コードする」という用語は、本明細書では、特定のタンパク質、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質または標的異種タンパク質を「コードする」ＤＮＡまたはＲＮＡ領域（転写領域）を意味するために使用される。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれると、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、限定されるものではないが、原核生物または真核生物由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物由来のゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得る。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置し得る。

【0087】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’に位置するヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。

【0088】

「賦形剤」および「キャリア」という用語は互換的に使用され、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。

【0089】

本明細書において使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、治療用タンパク質、例えばインフルエンザＮＳ１非構造タンパク質）を産生する過程を指す。それには、限定されないが、マイクロＲＮＡ結合部位、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物へのポリヌクレオチドの転写が含まれる。それには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのポリヌクレオチドの転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、例えば、遺伝子の転写によって産生されるＲＮＡなどの核酸であり得る。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、遺伝子の転写によって産生される核酸、ＲＮＡ（例えば、環状ＲＮＡ）もしくはｍｉＲＮＡ、あるいは転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。

【0090】

本明細書で使用される場合、「異種標的ｍＲＮＡ」という用語は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを使用して標的細胞で発現させることができる、標的細胞に天然には存在しない任意のｍＲＮＡ（線状または環状）を指す。別段の指示がない限り、異種標的ｍＲＮＡは、調節機能を有するポリペプチドまたはＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド結合ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、またはそれらの組合せ）をコードすることができる。したがって、本明細書において使用される、「コードする」という用語は、核酸分子（例えば、異種標的ｍＲＮＡ）からの関心対象の部分（例えば、ポリペプチドまたは環状ＲＮＡなどのＲＮＡ分子）の産生を指す。いくつかの態様では、異種標的ｍＲＮＡは、限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、酵素、またはその任意の組合せをはじめとする生物学的に活性なポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、異種標的ｍＲＮＡは、本明細書において「ペイロード」と呼ばれる。別段の指示がない限り、「標的ｍＲＮＡ」および「異種標的ｍＲＮＡ」という用語は互換的に使用される。

【0091】

いくつかの態様では、２またはそれを超える配列は、それらが互いに１００％同一である場合に、「同一である」と言われる。いくつかの態様では、２またはそれを超える配列は、それらが互いに少なくとも約７０％同一である、少なくとも約８０％同一である、少なくとも約９０％同一である、または少なくとも約９５％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの態様では、２またはそれを超える配列は、それらが互いに約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％同一である、約９８％同一である、または約９９％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの態様では、２またはそれを超える配列は、それらが互いに少なくとも約３０％同一である、少なくとも約４０％同一である、少なくとも約５０％同一である、少なくとも約６０％同一である、少なくとも約７０％同一である、少なくとも約８０％同一である、少なくとも約９０％同一である、または少なくとも約９５％同一である場合に、「保存されている」と言われる。いくつかの態様では、２またはそれを超える配列は、それらが互いに約３０％同一である、約４０％同一である、約５０％同一である、約６０％同一である、約７０％同一である、約８０％同一である、約９０％同一である、約９５％同一である、約９８％同一である、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用することもできるし、その一部、領域もしくは特徴に適用することもできる。

【0092】

本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の全体的なモノマー保存を指す。追加の修飾語を含まない「同一」という用語、例えばタンパク質Ａはタンパク質Ｂと同一であるということは、配列が１００％同一である（配列同一性が１００％である）ことを意味する。２つの配列を例えば「７０％同一」と記載することは、それらを例えば「７０％の配列同一性」を有するとして記載することと同等である。

【0093】

２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる。）。いくつかの態様では、比較目的でアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置のアミノ酸、またはポリヌクレオチドの場合は塩基を比較する。

【0094】

第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸で占められている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0095】

タンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアライメントに適したソフトウェア プログラムはさまざまなソースから入手可能である。配列同一性パーセントを決定するのに適したプログラムの１つは、ｂｌ２ｓｅｑである。これは、米国政府の国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ Ｗｅｂ サイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手できる一式のＢＬＡＳＴプログラムの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の適したプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。これらは生物情報科学プログラムの一式のＥＭＢＯＳＳの一部であり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａから入手することもできる。

【0096】

配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。

【0097】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセントの値は、小数点以下第２位が四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は切り捨てられて８０．１となり、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は切り上げられて８０．２となる。長さの値は常に整数であることにも留意されたい。

【0098】

いくつかの態様では、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する同一率（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１および第２の配列のアライメント（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによってアライメントされた）において完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高くなる。

【0099】

当業者であれば、配列同一性パーセントを計算するための配列アライメントの生成は、一次配列データによってのみ駆動されるバイナリ配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。また、配列アライメントは、配列データを、構造データ（例えば、タンパク質の結晶構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生学的データなどの異種ソースからのデータと統合することによって生成され得ることも理解されよう。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する適したプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ、あるいは例えばＥＢＩからも入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アライメントは、自動的にまたは手動でキュレートすることができることも理解されよう。

【0100】

本明細書で使用される場合、「単離」および「精製された」という用語およびその文法上の変形は互換的に使用され、１またはそれを超える精製プロセスを経た本開示の所望の組成物の調製物の状態を指す。いくつかの態様では、本明細書で使用される単離または精製は、汚染物質を含有する試料から本開示の組成物を除去、部分的に除去（例えば、画分）するプロセスである。いくつかの態様では、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有していないか、あるいは、望ましくない活性のレベルまたは量が許容され得るレベルまたは量よりも低い。いくつかの態様では、単離された組成物は、許容され得る量および／または濃度および／または活性またはそれ以上の本開示の所望の組成物の量および／または濃度を有する。いくつかの態様では、単離された組成物は、組成物が得られる出発物質と比較して濃縮される。この濃縮は、出発材料と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの態様では、単離された調製物は、残留生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離された調製物は、汚染生物学的物質を１００％含まない、少なくとも約９９％含まない、少なくとも約９８％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９６％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９４％含まない、少なくとも約９３％含まない、少なくとも約９２％含まない、少なくとも約９１％含まない、または少なくとも約９０％含まない。残留生物学的産物には、非生物的物質（化学物質を含む）または望ましくない核酸、タンパク質、脂質もしくは代謝産物が含まれ得る。

【0101】

本明細書において使用される「連結した」という用語は、第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列にそれぞれ共有結合または非共有結合した第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に直接結合または並置することができ、あるいは、介在配列が第１の配列を第２の配列に共有結合させることができる。「連結した」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端での融合を意味するだけでなく、第１のポリヌクレオチド配列（または第２のポリヌクレオチド配列）全体の第２のポリヌクレオチド配列（またはそれぞれ第１のポリヌクレオチド配列）中の任意の２つのヌクレオチドへの挿入も含む。第１のポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のポリヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。

【0102】

本明細書において使用される、「調節する」、「修飾する」という用語、およびその文法上の変形は、一般に、特定の濃度、レベル、発現、機能または挙動に適用される場合に、特定の濃度、レベル、発現、機能もしくは挙動を増加または減少させることによって、例えば直接的または間接的に促進／刺激／上方制御または干渉／阻害／下方制御することによって、例えばアンタゴニストまたはアゴニストとして作用するように、変化させる能力を指す。場合によっては、モジュレーターは、対照と比較して、または一般に予想される平均活性レベルと比較して、または対照活性レベルと比較して、特定の濃度、レベル、活性または機能を増加および／または減少させることができる。

【0103】

本明細書で使用される場合、「非構造タンパク質」という用語は、ウイルスによってコードされるがウイルス粒子の一部ではないタンパク質を指す。より具体的には、本明細書に記載の非構造タンパク質は、限定されるものではないが、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、それらの組合せ、またはそれらの変異体を含む、インフルエンザＮＳ１タンパク質を含む。そのような非構造タンパク質に関するさらなる開示は、本開示の他所に提供される。

【0104】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、およびそれらの文法上の変形は、互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのそれらのリン酸エステル類似体の、一本鎖形態または二本鎖らせん形態のいずれかを指す。さらに、本開示から明らかなように、いくつかの態様では、核酸分子は環状形態（例えば、環状ＲＮＡ）であってもよい。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡらせん体が可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、それを特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語には、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイル状ＤＮＡおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際、本明細書では、配列をＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従って記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「環状ＲＮＡ」という用語は、共有結合によって環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを指す。本開示から明らかなように、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組、第１の核酸分子および第２の核酸分子はいずれも、構造が環状であり得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸を含む）は、環状ＲＮＡを含む。いくつかの態様では、本明細書に提供される第１の核酸分子（例えば、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする）は、環状ＲＮＡを含む。いくつかの態様では、本明細書に提供される第２の核酸分子（例えば、異種標的ｍＲＮＡをコードする）は、環状ＲＮＡを含む。いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む環状ＲＮＡを含む。

【0106】

「薬学的に許容され得る担体」、「薬学的に許容され得る賦形剤」、という用語およびその文法上の変形は、ヒトを含む動物における使用のために、米国連邦政府の規制機関によって承認された薬剤、または米国薬局方に記載された薬剤のいずれか、ならびに、対象への組成物の投与を禁止する程度まで望ましくない生理的影響の産生を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない任意の担体または希釈剤を包含する。医薬組成物の調製に有用であり、一般に安全で、無毒であり、望ましい賦形剤および担体が含まれる。

【0107】

本明細書において使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容され得る担体および賦形剤などの１またはそれを超える他の化学成分と混合、または混和、または懸濁された、１またはそれを超える本明細書に記載のポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様では、薬学的組成物の目的は、対象へのポリヌクレオチドの調製物の投与を容易にすることである。

【0108】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの態様では、本開示に有用なポリヌクレオチドは直鎖状であり得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは環状（例えば、環状ＲＮＡ）である。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語には、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。これには、例えばアルキル化によって、および／またはキャッピングによって修飾された形態、および修飾されていない形態のポリヌクレオチドも含まれる。

【0109】

より詳細には、「ポリヌクレオチド」という用語には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有）、スプライシングされているか否かにかかわらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍＲＮＡ（環状ＲＮＡを含む）を含むポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および、非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）およびポリモルホリノポリマー、ならびに、他の合成配列特異的核酸ポリマー（このポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有する）が含まれる。

【0110】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。この用語は、自然に修飾された、あるいは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの任意のその他の操作もしくは修飾、によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１またはそれを超える類似体（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸およびクレアチンなどを含む）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および上記の他の等価物、変異体および類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであってもよいし、二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体であってもよい。それらは一本鎖または多鎖ポリペプチドを含むこともできる。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１またはそれを超えるアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。いくつかの態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。

【0111】

本明細書で使用される「防止する」、「防止すること」という用語およびその変形は、疾患、障害および／または症状の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害および／または症状の１またはそれを超える症候、特徴、または臨床症状の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害および／または症状の１またはそれを超える症候、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害および／または症状からの進行を部分的または完全に遅延させること；ならびに／あるいは疾患、障害、および／または症状に関連する病態を発症するリスクを低下させることを指す。いくつかの態様では、アウトカムの防止は、予防的処置によって達成される。

【0112】

本明細書で使用される場合、「類似度」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いの類似性パーセントの計算は、当技術分野で理解されているように、類似性パーセントの計算が保存的置換を考慮することを除いて、同一性パーセントの計算と同じ方法で行うことができる。類似性のパーセンテージは、使用される比較尺度、すなわち、アミノ酸が例えばそれらの進化的近接性、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組合せに従って比較されるかどうかに左右されることが理解される。

【0113】

「対象」、「患者」、「個体」および「宿主」という用語ならびにそれらの変形は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置または治療が望まれる、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書で提供される開示は、ヒト治療および獣医学用途の両方に適用可能である。

【0114】

本明細書で使用される「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、例えば、疾患または症状の重症度の低下；疾患経過期間の短縮；疾患または症状に関連する１またはそれを超える症候の改善または除去；疾患または症状を必ずしも治癒させなくても疾患または症状を有する対象に有益な効果を提供することを指す。この用語はまた、疾患もしくは症状またはその症候の予防または防止も含む。いくつかの態様では、用語「処置すること」または「処置」は、抗原（例えば、本明細書に開示される異種ペイロード）に対する免疫応答を対象において誘導することを意味する。

【0115】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’に位置するヌクレオチド配列を指す。

【0116】

ＩＩ．本開示の組成物
本開示のいくつかの態様は、自然免疫阻害剤をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。いくつかの態様では、第１の核酸分子は環状である。いくつかの態様では、第２の核酸分子は環状である。いくつかの態様では、第１の核酸分子と第２の核酸分子の両方が環状である。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組は環状ＲＮＡを含む。したがって、いくつかの態様では、自然免疫阻害剤をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含む環状ＲＮＡが本明細書において提供される。自然免疫阻害剤をコードする第１の核酸分子および異種標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含む環状ＲＮＡの組も本明細書において提供される。

【0117】

任意の自然免疫阻害剤を、本明細書において開示される組成物および方法に使用することができる。自然免疫阻害剤の例としては、限定されるものではないが、インフルエンザＮＳ１、アフリカ豚コレラウイルス（ＡＳＦＶ）ｇ５Ｒ、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）２Ａプロテアーゼ、ＣＶＢ３ ３Ｃプロテアーゼ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）２Ａタンパク質（例えば、ＮＬＳを含まない）、ＥＭＣＶ ３Ｃプロテアーゼ、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）３Ｃ様プロテアーゼ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）Ｌプロテアーゼ、Ａ群ロタウイルス（ＲＶＡ）ＮＳＰ３、ハンタウイルスＮ、ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）１００Ｋ、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）プロテアーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）２Ａプロテアーゼ、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ、ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ）ｖｈｓ、ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ）ｖｈｓ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）プロテアーゼ、インフルエンザＡウイルス（ＦｌｕＡｖ）Ｐｏｌ、ヒトヘルペスウイルス８（ＫＳＨＶ）ＳＯＸ、ＭＤ１４５－１２ ３Ｃ様プロテアーゼ、麻疹ウイルス（ＭＶ）Ｎ、ポリオウイルス（ＰＶ）２Ａプロテアーゼ、ＰＶ３Ｃプロテアーゼ、モロニ－マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロテアーゼ３Ｃ、狂犬病ウイルス（ＲＶ）Ｍ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＳＰ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイク、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ｓｍａｌｌ Ｔ抗原、ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｄ１０、ＶＶ Ｄ９、マウス４Ｅ－ＢＰ１（例えば、構成的活性）、マウス４Ｅ－ＢＰ２（例えば、構成的活性）、マウス４Ｅ－ＢＰ３（例えば、構成的活性）、マウス４ＥＨＰ、マウスＡｇｏ１、マウスＡｇｏ２、マウスＡｇｏ３、マウスＡｇｏ４、マウスＣＰＥＢ２、マウスＤＤＸ６、マウスｅＩＦ４Ｅ、マウスｅＩＦ４Ｅ（Ｓ２０９Ａ）、マウスｅＩＦ４Ｅ（Ｓ２０９Ｄ）、マウスｅＩＦ４Ｅ（Ｓ２０９Ｅ）、マウスｅＩＦ４ｇ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、マウスＦＭＲＰ、マウスＧＷ１８２、マウスｐ５４、マウスｐ５６ マウスｐ６０、マウスＰＡＢＰ（ｅＩＦ４Ｇ結合ドメイン）、マウスＰＤＣＤ４、マウスＲＮアーゼＬ（ＮΔ３８５：構成的活性）、マウスＵｐｆ１（例えば、構成的活性）、マウス（Ｍｅ３１Ｂ）、ＥＢＦＰ２、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤は、米国特許出願公開第２０１８０２９６７０２号に開示されている自然免疫阻害剤であり、その内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤は、ウイルス非構造（ＮＳ）タンパク質、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、第１の核酸分子はウイルス非構造（ＮＳ）タンパク質をコードする。いくつかの態様では、第１の核酸分子は、インフルエンザＮＳ１タンパク質またはその誘導体をコードする。

【0118】

いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のベクター中に存在する。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は第１のベクターに存在し、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は第２のベクターに存在する。

【0119】

いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、単一のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、ポリシストロニックｍＲＮＡとして転写される。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現され、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第２のプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じである。いくつかの態様では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは異なっている。

【0120】

いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、第１のプロモーターの制御下で発現し、第１のプロモーターは、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質と標的ｍＲＮＡの両方の発現を駆動する。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子は、ＩＲＥＳ配列によって連結されている。

【0121】

いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子、またはその両方は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子、またはその両方は、組織特異的プロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、自然免疫阻害剤、例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子、またはその両方は、構成的活性型プロモーターの制御下で発現される。

【0122】

本開示のいくつかの態様は、自己複製標的ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関し、自己複製標的ｍＲＮＡは１またはそれを超える修飾された核酸分子を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、または約２５％未満は、修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組の中の核酸の約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％または約３０％が、修飾された核酸分子である。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾された核酸分子は修飾ｒＮＴＰである。

【0123】

いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾核酸分子は、Ｎ１－メチルシュードウラシルを含む。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾核酸分子は５－メチルシトシンを含む。いくつかの態様では、１またはそれを超える修飾核酸分子は、Ｎ１－メチルシュードウラシルおよび５－メチルシトシンを含む。本開示で使用することができるさらなる修飾核酸分子の非限定的な例としては：６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、シュード－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、１，６－ジメチル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－（１－プロピニル）－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－（２－プロピニル）－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－アリル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－エチニル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－ホモアリル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－ビニル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ウラシル、１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（置換されていてもよいフェニル）シュード－ウラシル、１－メチル－６－アミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－アジド－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ブロモ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ブチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－クロロ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－シアノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－フルオロ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ホルミル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヨード－シュード－ウラシル、１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－メトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－フェニル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－プロピル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ウラシル、６－（４－モルホリノ）－シュード－ウラシル、６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ウラシル、６－（置換されていてもよいフェニル）－シュード－ウラシル、６－アミノ－シュード－ウラシル、６－アジド－シュード－ウラシル、６－ブロモ－シュード－ウラシル、６－ブチル－シュード－ウラシル、６－クロロ－シュード－ウラシル、６－シアノ－シュード－ウラシル、６－ジメチルアミノ－シュード－ウラシル、６－エトキシ－シュード－ウラシル、６－エチルカルボキシレート－シュード－ウラシル、６－エチル－シュード－ウラシル、６－フルオロ－シュード－ウラシル、６－ホルミル－シュード－ウラシル、６－ヒドロキシアミノ－シュード－ウラシル、６－ヒドロキシ－シュード－ウラシル、６－ヨード－シュード－ウラシル、６－イソ－プロピル－シュード－ウラシル、６－メトキシ－シュード－ウラシル、６－メチルアミノ－シュード－ウラシル、６－メチル－シュード－ウラシル、６－フェニル－シュード－ウラシル、６－プロピル－シュード－ウラシル、６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、６－トリフルオロメトキシ－シュード－ウラシル、６－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、
１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ウラシル、１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ウラシル、１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ウラシル、１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ウラシル、１－（２－アミノ－エチル）シュード－ウラシル、１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ウラシル、１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ウラシル、１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ウラシル、１－アミノメチル－シュード－ウラシル、１－ベンジル－シュード－ウラシル、１－ブチル－シュード－ウラシル、１－シクロブチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロブチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘプチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘプチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘキシルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘキシル－シュード－ウラシル、１－シクロオクチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロオクチル－シュード－ウラシル、１－シクロペンチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロペンチル－シュード－ウラシル、１－シクロプロピルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロプロピル－シュード－ウラシル、１－エチル－シュード－ウラシル、１－へキシル－シュード－ウラシル、１－イソ－プロピル－シュード－ウラシル １－ペンチル－シュード－ウラシル、１－フェニル－シュード－ウラシル、１－プロピル－シュード－ウラシル、１－ｐ－トルイル－シュード－ウラシル、１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、１－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、３－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－シュード－ウラシル、シュード－ウラシル－Ｎ１－２－エタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－３－プロピオン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－４－ブタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－５－ペンタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－６－ヘキサン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－７－ヘプタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸、６－フェニル－シュード－ウラシル、６－アジド－シュード－ウラシル、シュード－ウラシル－Ｎ１－ｐ－安息香酸、Ｎ３－メチル－シュード－ウラシル、５－メチル－アミノ－メチル－ウラシル、５－カルボキシ－メチル－アミノ－メチル－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシルメチルエステル５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、２－アンヒドロ－シトシン、２－アンヒドロ－ウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウラシル、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウラシル、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－ウラシル、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウラシル、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－ウラシル、５－トリデューテロメチル－６－デューテロ－ウラシル、５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオ－シトシン、５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオ－シトシン、５－（２－フラニル）－ウラシル、８－トリフルオロメチル－アデノシン、２－トリフルオロメチル－アデノシン、３－デアザ－３－フルオロ－アデノシン、３－デアザ－３－ブロモ－アデノシン、３－デアザ－３－ヨード－アデノシン、
１－ヒドロキシメチル－シュード－ウラシル、１－（２－ヒドロキシエチル）－シュード－ウラシル、１－メトキシメチル－シュード－ウラシル、１－（２－メトキシエチル）－シュード－ウラシル、１－（２，２－ジエトキシエチル）－シュード－ウラシル、１－（２－ヒドロキシプロピル）－シュード－ウラシル、（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）－シュード－ウラシル、（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）－シュード－ウラシル、１－シアノメチル－シュード－ウラシル、１－モルホリノメチル－シュード－ウラシル、１－チオモルホリノメチル－シュード－ウラシル、１－ベンジルオキシメチル－シュード－ウラシル、１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）－シュード－ウラシル、１－チオメトキシメチル－シュード－ウラシル、１－メタンスルホニルメチル－シュード－ウラシル、１－ビニル－シュード－ウラシル、１－アリル－シュード－ウラシル、１－ホモアリル－シュード－ウラシル、１－プロパルギル－シュード－ウラシル、１－（４－フルオロベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－クロロベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－ブロモベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－ヨードベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－メチルベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－トリフルオロメチルベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－メトキシベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－チオメトキシベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－メタンスルホニルベンジル）－シュード－ウラシル、シュード－ウラシル １－（４－メチル安息香酸）、シュード－ウラシル １－（４－メチルベンゼンスルホン酸）、１－（２，４，６－トリメチルベンジル）－シュードウラシル、１－（４－ニトロベンジル）－シュード－ウラシル、１－（４－アジドベンジル）－シュード－ウラシル、１－（３，４－ジメトキシベンジル）－シュード－ウラシル、１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）－シュード－ウラシル、１－アセチル－シュード－ウラシル、１－トリフルオロアセチル－シュード－ウラシル、１－ベンゾイル－シュード－ウラシル、１－ピバロイル－シュード－ウラシル、１－（３－シクロプロピル－プロパ－２－イニル）－シュードウラシル、シュード－ウラシル １－メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード－ウラシル １－メチルホスホン酸、シュード－ウラシル １－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸、シュード－ウラシル １－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］ プロピオン酸、シュード－ウラシル １－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュード－ウラシル １－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュード－ウラシル １－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュード－ウラシル，１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］－シュード－ウラシル、１－ビオチニル－シュード－ウラシル、１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュード－ウラシル、５－（Ｃ３～８ シクロアルキル）－シトシン、５－メチル－Ｎ６－アセチル－シトシン、５－（カルボキシメチル）－Ｎ６－トリフルオロアセチル－シトシントリフルオロメチルエステル、Ｎ６－プロピオニル－シトシン、５－モノフルオロメチル－シトシン、５－トリフルオロメトキシ－シトシン、Ｎ６－（１，１，１－トリフルオロ－プロピオニル）－シトシン、４－アセチル－シュード－イソ－シトシン、１－エチル－シュード－イソ－シトシン、１－ヒドロキシ－シュード－イソ－シトシン、または１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ウラシル、１，６－ジメチル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－（１－プロピニル）－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－（２－プロピニル）－シュードウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－アリル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－エチニル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－ホモアリル－シュード－ウラシル、１－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－６－ビニル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ウラシル、１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ウラシル、１－メチル－６－（置換されていてもよいフェニル）シュード－ウラシル、１－メチル－６－アミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－アジド－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ブロモ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ブチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－クロロ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－シアノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ウラシル、１－メチル－６－エチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－フルオロ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ホルミル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ヨード－シュード－ウラシル、１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－メトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－フェニル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－プロピル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ウラシル、１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ウラシル、６－（４－モルホリノ）－シュード－ウラシル、６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ウラシル、６－（置換フェニル）－シュード－ウラシル、６－アミノ－シュード－ウラシル、６－アジド－シュード－ウラシル、６－ブロモ－シュード－ウラシル、６－ブチル－シュード－ウラシル、６－クロロ－シュード－ウラシル、６－シアノシュード－ウラシル、６－ジメチルアミノ－シュード－ウラシル、６－エトキシ－シュード－ウラシル、６－エチルカルボキシレート－シュード－ウラシル、６－エチル－シュード－ウラシル、６－フルオロ－シュード－ウラシル、６－ホルミル－シュード－ウラシル、６－ヒドロキシアミノ－シュード－ウラシル、６－ヒドロキシ－シュード－ウラシル、６－ヨード－シュード－ウラシル、６－イソ－プロピル－シュード－ウラシル、６－メトキシ－シュード－ウラシル、６－メチルアミノ－シュード－ウラシル、６－メチル－シュード－ウラシル、６－フェニル－シュード－ウラシル、６－フェニル－シュード－ウラシル、６－プロピル－シュード－ウラシル、６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、６－トリフルオロメトキシ－シュード－ウラシル、６－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ウラシル、１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ウラシル、１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ウラシル、１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ウラシル、１－（２－アミノ－エチル）シュード－ウラシル、１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ウラシル、１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ウラシル、１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ウラシル、１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ウラシル、１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ウラシル、１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ウラシル、１－アミノメチル－シュード－ウラシル、１－ベンジル－シュード－ウラシル、１－ブチル－シュード－ウラシル、１－シクロブチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロブチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘプチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘプチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘキシルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロヘキシル－シュード－ウラシル、１－シクロオクチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロオクチル－シュード－ウラシル、１－シクロペンチルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロペンチル－シュード－ウラシル、１－シクロプロピルメチル－シュード－ウラシル、１－シクロプロピル－シュード－ウラシル、１－エチル－シュード－ウラシル、１－へキシル－シュード－ウラシル、１－イソ－プロピル－シュード－ウラシル、１－ペンチル－シュード－ウラシル、１－フェニル－シュード－ウラシル、１－プロピル－シュード－ウラシル、１－ｐ－トリル－シュード－ウラシル、１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ウラシル、１－トリフルオロメチル－シュード－ウラシル、３－（置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル）－シュード－ウラシル、シュード－ウラシル－Ｎ１－２－エタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－３－プロピオン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－４－ブタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－５－ペンタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－６－ヘキサン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－７－ヘプタン酸、シュード－ウラシル－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸、６－フェニル－シュード－ウラシル、６－アジド－シュード－ウラシル、またはシュード－ウラシル－Ｎ１－ｐ－安息香酸、Ｎ３－メチル－シュード－ウラシル、５－メチル－アミノ－メチル－ウラシル、５－カルボキシ－メチル－アミノ－メチル－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシルメチルエステルまたは５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0124】

いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物は、宿主細胞における異種標的ｍＲＮＡ発現を増加させた。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、１またはそれを超える修飾核酸分子を含まない複製ＲＮＡから発現する標的ｍＲＮＡの発現と比較して増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または少なくとも約５００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約１００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約２００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約３００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約４００％増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約５００％増加する。

【0125】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、または少なくとも約６倍増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約２倍増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約３倍増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約４倍増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約５倍増加する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、例えば、少なくとも約６倍増加する。

【0126】

いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物は、宿主細胞における異種標的ｍＲＮＡ発現の増加および／または異種標的ｍＲＮＡ持続性の増加を有する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現、例えば、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子の不在下での標的ｍＲＮＡの発現と比較して、あるいは１またはそれを超える修飾核酸分子を含まない複製ＲＮＡから発現する標的ｍＲＮＡの発現と比較して、増加した発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０８時間、または少なくとも約１２０時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は少なくとも約４８時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約４８時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約６０時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約７２時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約８４時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約９６時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約１０８時間持続する。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、細胞のトランスフェクション後、少なくとも約１２０時間持続する。

【0127】

ＩＩ．Ａ．異種標的ｍＲＮＡ
本開示の異種標的ｍＲＮＡは、関心対象の任意のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードすることができる。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、生物学的に活性なポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、凝固因子、ホルモン、受容体、マイトジェン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、酵素、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0128】

いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、その断片、その変異体、またはその任意の組合せから選択されるサイトカインを含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２は、単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ－１２、不安定化ＩＬ－１２、膜結合ＩＬ－１２、インターカレートＩＬ－１２である。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードする。いくつかの態様では、ＩＬ－１２はヒトＩＬ－１２である。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットおよびＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードする。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、単一のプロモーターから発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、単一の連続したポリペプチドとして発現される。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、１またはそれを超える共有結合によって連結されている。いくつかの態様では、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットは、１またはそれを超えるペプチド結合によって連結されている。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットに共有結合したＩＬ－１２のｐ３５サブユニットを含むヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットとＩＬ－１２のｐ４０サブユニットは、１またはそれを超えるアミノ酸を含むリンカーによって連結される。

【0129】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは第１の部分および第２の部分を含み、標的ｍＲＮＡの第１の部分はＩＬ－１２のｐ３５サブユニットをコードし、標的ｍＲＮＡの第２の部分はＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードし、第１の部分と第２の部分はＩＲＥＳによって分離されている。

【0130】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡはケモカインをコードする。例示的なケモカインとしては、限定されるものではないが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（ｏｒ ＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、およびＣＸ３ＣＬ１が挙げられる。

【0131】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡはインターフェロン（ＩＦＮ）をコードする。例示的なインターフェロンとしては、限定されるものではないが、インターフェロンＩ型（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κおよびＩＦＮ－ω）、インターフェロンＩＩ型（例えば、ＩＦＮ－γ）およびインターフェロンＩＩＩ型が挙げられる。いくつかの態様では、ＩＦＮ－αは、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１を含む約１３のサブタイプにさらに分類される。

【0132】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは成長因子をコードする。例示的な成長因子としては、限定されるものではないが、骨形成因子（ＢＭＰ）、アンジオポエチン、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、成長分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ；肝細胞成長因子様タンパク質、ＨＧＦＬＰとしても公知）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、およびニューロトロフィン－４（ＮＴ－４））、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路メンバーが挙げられる。

【0133】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは酵素をコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡはｃａｓ９をコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼをコードする。

【0134】

いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは機能性ＲＮＡをコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せをコードする。いくつかの態様では、標的ｍＲＮＡは、例えば、ｃａｓ９と組み合わせて使用するためのガイドＲＮＡをコードする。

【0135】

ＩＩ．Ｂ．インフルエンザＮＳ１
任意のインフルエンザＮＳ１を本開示の組成物および方法において使用することができる。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１、またはそれらの変異体である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ｃ型インフルエンザウイルスＮＳ１である。

【0136】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、Ｈ１Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ１Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ２Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ３Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ９ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ７ ＮＳ１、Ｈ９Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ７Ｎ３ ＮＳ１、Ｈ５Ｎ２ ＮＳ１、Ｈ１０Ｎ７ ＮＳ１、その変異体、またはそれらの組合せである。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ１Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ２Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ３Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ７Ｎ９ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ７Ｎ７ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ９Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ７Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ７Ｎ３ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ５Ｎ２ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ１０Ｎ７ ＮＳ１である。

【0137】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ１Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザはＨ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（表１）。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＨ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１をコードする第１の核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。

【0138】

いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１はＨ５Ｎ１ ＮＳ１である。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（表１）。いくつかの態様では、第１の核酸分子によってコードされるインフルエンザＮＳ１は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＨ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１である。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１をコードする第１の核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【0139】

ＩＩ．Ｃ．ベクター
いくつかの態様では、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子および標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子の１つまたは複数は、ベクター中に存在する。本明細書に開示される組成物および方法では、任意のベクターを使用することができる。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、細菌ベクター、またはそれらの組合せもしくはその変異体を含む。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ハイブリッドベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群から選択される。

【0140】

いくつかの態様では、ベクターはレプリコンを含む。いくつかの態様では、アルファウイルスに由来するレプリコンは、治療用ペイロードを同時に転写し、細胞質に入るとレプリコンを自己増幅するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラス鎖ＲＮＡを含む。いくつかの態様では、ベクターはレプリコンを含み、レプリコンは、（１）親ウイルスおよび非構造タンパク質のＵＴＲならびに親ウイルスのサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）と、（２）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子、標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子、またはインフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子と標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子の両方とを含む。本明細書に開示される組成物および方法では、任意のレプリコンを使用することができる。いくつかの態様では、レプリコンはベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンまたはその誘導体もしくはその部分を含む。いくつかの態様では、レプリコンは、親ウイルスレプリコンに対して１またはそれを超える点突然変異、例えばＶＥＥレプリコン配列に対して１またはそれを超える点突然変異を含む。レプリコンの配列に対する修飾を用いて、標的ｍＲＮＡの発現を増加させるか、標的ｍＲＮＡの持続性を増加させるか（例えば、標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに対する免疫応答を低下させることによって、かつ／あるいは標的細胞、例えば、標的癌細胞におけるＩ型インターフェロン活性を低下させることによる）、またはその両方を行うことができる。いくつかの態様では、ベクターはＶＥＥレプリコンを含み、ＶＥＥレプリコンは親ＶＥＥレプリコンに対してＱ７３９Ｌ突然変異を含む。いくつかの態様では、第１のベクター、第２のベクターまたはその両方は、１またはそれを超えるさらなる調節エレメントを含む。いくつかの態様では、第１のベクター、第２のベクター、またはその両方は、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的サイレンサー、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0141】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えばＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えばＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0142】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えばＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えばＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0143】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えばＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えばＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖ）Ｅ１配列；および（ｖｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0144】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えばＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えばＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；（ｖｉｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0145】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0146】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0147】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0148】

いくつかの態様では、ベクターは（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0149】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0150】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１またはＨ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0151】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ１Ｎ１ ＴＸ９１変異体ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0152】

いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１ ＮＳ１をコードする第１の核酸分子；（ｉｖ）Ｐ２Ａリンカー；（ｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；（ｖｉ）Ｅ１配列；および（ｖｉｉ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、ベクターは、（ｉ）親レプリコン由来の５’ＵＴＲ、例えばＶＥＥ由来の５’ＵＴＲ；（ｉｉ）親レプリコン由来の１またはそれを超える非構造タンパク質（ｎｓＰ）、例えば、ＶＥＥ由来の１またはそれを超えるｎｓＰ、例えば、ＶＥＥ由来のｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４；（ｉｉｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｉｖ）標的ｍＲＮＡをコードする第２の核酸分子であって、該標的ｍＲＮＡがヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする第２の核酸分子；および（ｖ）親レプリコン由来の３’ＵＴＲ、例えば、ＶＥＥ由来の３’ＵＴＲを含む。

【0153】

ＩＩ．Ｄ．脂質ナノ粒子
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含む、例えばカプセル化する脂質ナノ粒子に関する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組は、脂質ナノ粒子にパッケージングおよび／または送達される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子によってカプセル化された本明細書に記載のポリヌクレオチド、その組成物、およびその組成物の使用に関する。

【0154】

本明細書において使用される「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）は、連続した脂質二重層を有する球状小胞などの小胞を指す。脂質ナノ粒子は、薬物療法を標的部位に送達する方法で使用することができる。ＬＮＰの非限定的な例としては、リポソーム、双頭型両親媒性化合物、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、および単層膜構造（例えば、古細菌およびミセル）が挙げられる。

【0155】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、１またはそれを超える種類の脂質を含む。脂質は、本明細書において、限定されるものではないが脂肪酸のエステルを含む有機化合物の群を指し、いくつかの態様では、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。それらは通常、少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；（３）ステロイド等の「由来脂質」。脂質の非限定的な例としては、トリグリセリド（例えば、トリステアリン）、ジグリセリド（例えば、グリセロールベヘネート）、モノグリセリド（例えば、モノステアリン酸グリセロール）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）およびワックス（例えば、パルミチン酸セチル）が挙げられる。いくつかの態様では、ＬＮＰ中の１またはそれを超える種類の脂質は、カチオン性脂質を含む。いくつかの態様では、ＬＮＰ中の１またはそれを超える種類の脂質は、リピドイド、例えばＴＴ３を含む。

【0156】

本開示に有用なかかる脂質としては、限定されるものではないが、Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）；リポフェクタミン；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）；ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ，－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオールイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ－Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｐｒｏｐ）－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。

【0157】

本開示のいくつかの態様では、脂質、例えばリピドイドはＴＴ３である。本明細書において使用されるＴＴ３は、様々な生物活性剤を細胞に送達するための脂質ナノ粒子を形成することができる。

【0158】

本開示のいくつかの態様では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。本明細書において使用されるＤＯＴＡＰは、脂質ナノ粒子を形成することもできる。ＤＯＴＡＰは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むＤＮＡを真核細胞に高効率でトランスフェクションし、一過性または安定的に遺伝子を発現させるために使用することができ、また、その他の負に帯電した分子、例えばＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびタンパク質などを哺乳動物細胞の研究試料に効率的に導入するのにも適している。

【0159】

本開示のいくつかの態様では、カチオン性脂質はリポフェクタミンである。本明細書において使用されるリポフェクタミンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって製造および販売され、分子生物学および細胞生物学で使用される一般的なトランスフェクション試薬である。これは、リポフェクションによるインビトロ細胞培養物へのＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む）またはプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率を高めるために使用される。リポフェクタミンは、水性環境でリポソームまたは脂質ナノ粒子を形成することができる脂質サブユニットを含み、これはトランスフェクションペイロード、例えばｍｏｄＲＮＡを捕捉する。ＲＮＡ含有リポソーム（表面が正に帯電している）は、リポソームと細胞膜との融合を媒介する中性の共脂質のために、生細胞の負に帯電した細胞膜と融合することができ、核酸カーゴ分子が複製または発現のために細胞質に移行することを可能にする。

【0160】

いくつかの態様では、ＬＮＰは、他の脂質成分と共に主にカチオン性脂質から構成される。これらには、通常、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）クラス（例えば、１，ｓ－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ステロール（例えば、コレステロール）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［葉酸（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、およびＣ１４－ＰＥＧ２０００に属する他の脂質分子が含まれる。表２は、例示的なＬＮＰ、ＴＴ３－ＬＮＰおよびＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの製剤を示す。

【表2】

【0161】

いくつかの態様では、ＬＮＰはＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む。いくつかの態様では、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、またはその両方を含む。いくつかの態様では、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００（または本明細書に開示される他の脂質成分）は、ポリヌクレオチドのカプセル化の前にＬＮＰに埋め込むことができる。いくつかの態様では、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００（または本明細書に開示される他の脂質成分）を、ポリヌクレオチドのカプセル化の後にＬＮＰに添加することができる。

【0162】

脂質ナノ粒子の粒径は、薬物放出速度、生体内分布、粘膜付着、細胞による水の取り込みおよびナノ粒子内部への緩衝剤交換、ならびにタンパク質拡散に影響を及ぼし得る。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰの直径は、約３０～約５００ｎｍの範囲である。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰの直径は、約３０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約７０～約３００ｎｍ、約１００～約２００ｎｍ、約１００～約１７５ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍの範囲である。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰの直径は１００～１６０ｎｍの範囲である。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰの直径は、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０１ｎｍ、約１０２ｎｍ、約１０３ｎｍ、約１０４ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１０６ｎｍ、約１０７ｎｍ、約１０８ｎｍ、約１０９ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１１ｎｍ、約１１２ｎｍ、約１１３ｎｍ、約１１４ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１６ｎｍ、約１１７ｎｍ、約１１８ｎｍ、約１１９ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、または約１６０ｎｍであり得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は約１４０ｎｍの直径を有する。

【0163】

ゼータ電位は、脂質ナノ粒子表面の有効電荷の尺度である。ゼータ電位の大きさは、粒子安定性に関する情報を提供する。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰのゼータ電位は、約３～約６ｍｖの範囲である。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰのゼータ電位は、約３ｍｖ、約３．１ｍｖ、約３．２ｍｖ、約３．３ｍｖ、約３．４ｍｖ、約３．５ｍｖ、約３．６ｍｖ、約３．７ｍｖ、約３．８ｍｖ、約３．９ｍｖ、約４ｍｖ、約４．１ｍｖ、約４．２ｍｖ、約４．３ｍｖ、約４．４ｍｖ、約４．５ｍｖ、約４．６ｍｖ、約４．７ｍｖ、約４．８ｍｖ、約４．９ｍｖ、約５ｍｖ、約５．１ｍｖ、約５．２ｍｖ、約５．３ｍｖ、約５．４ｍｖ、約５．５ｍｖ、約５．６ｍｖ、約５．７ｍｖ、約５．８ｍｖ、約５．９ｍｖ、または約６ｍｖであり得る。

【0164】

いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を有するカプセル化されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に関する。本開示のいくつかの態様では、ＬＮＰの脂質とポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組との質量比は、約１：２～約１５：１の範囲である。いくつかの態様では、脂質とポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組との質量比は、約１：２、約１：１．９、約１：１．８、約１：１．７、約１：１．６、約１：１．５、約１：１．４、約１：１．３、約１：１．２、約１：１．１、約１：１、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１、約５．５：１、約６：１、約６．５：１、約７：１、約７．５：１、約８：１、約８．５：１、約９：１、約９．５：１、約１０：１、約１０．５：１、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、または約１５：１であり得る。本開示のいくつかの態様において、脂質とポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組との質量比は約１０：１である。

【0165】

ＩＩ．Ｅ．細胞
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含むように改変されている細胞が本明細書において提供される。いくつかの態様では、細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含むベクターまたはベクターの組を含む。いくつかの態様では、細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含む脂質ナノ粒子を含む。いくつかの態様では、細胞は癌細胞である。いくつかの態様では、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、単球、またはＰＢＭＣを含む。

【0166】

いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組、またはこれを含むベクターもしくはベクターの組を含む）は、（ｉ）ヒトインフルエンザＮＳ１および（ｉｉ）標的異種ｍＲＮＡを産生することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組、またはこれを含むベクターもしくはベクターの組を含む）は、インビボで（ｉ）ヒトインフルエンザＮＳ１および（ｉｉ）標的異種ｍＲＮＡを産生することができる。例えば、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組またはこれを含むベクターもしくはベクターの組は、エクスビボで（例えば、トランスフェクションを介して）細胞に導入することができ、次いで、細胞は、対象に投与することができ（例えば、養子細胞治療）、この際、（ｉ）ヒトインフルエンザＮＳ１および（ｉｉ）標的異種ｍＲＮＡは、投与後に対象において産生される。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組またはそれを含むベクターもしくはベクターの組は、例えば遺伝子治療の一部として、対象に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（すなわち、本開示のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組、または本開示のポリヌクレオチドもしくは一組のポリヌクレオチドを含むベクターもしくはベクターの組を含む）は、インビトロおよびインビボの両方において、（ｉ）ヒトインフルエンザＮＳ１および（ｉｉ）標的異種ｍＲＮＡを産生することができる。

【0167】

いくつかの態様では、細胞は宿主細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞、植物細胞、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの態様では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの態様では、原核細胞は細菌細胞である。

【0168】

いくつかの態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本開示に適した哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、ＨＢＫ、ＮＳＯ、ＨＴ１０８０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0169】

ＩＩ．Ｆ．医薬組成物
本開示から明らかなように、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、脂質ナノ粒子、および細胞（本明細書では「活性」とも呼ばれる）のいずれも、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。したがって、いくつかの態様では、医薬組成物は、活性化合物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む。

【0170】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」（本明細書では「薬学的に許容され得る担体」とも呼ばれる）という用語は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な化合物のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。

【0171】

いくつかの態様では、（ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組および（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、（ａ）本明細書に記載のベクターまたはベクターの組および（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、（ａ）本明細書に記載の脂質ナノ粒子および（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、（ａ）本明細書に記載の細胞（例えば、本開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組を含むように改変されたもの）および（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。

【0172】

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。いくつかの態様では、本開示と共に使用することができる適した投与経路は、筋肉内投与を含む。いくつかの態様では、適した投与経路には、鼻腔内投与が含まれる。適した投与経路のさらなる例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）、および経粘膜、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。別の投与経路には、肺投与が含まれる。さらに、治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、手術中の局所または領域への注入または灌流、局所適用、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラント（例えば、サイラスティック膜または繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料から形成されたインプラント）などによって達成することができる。いくつかの態様では、治療有効量の医薬組成物は、リポソームなどの小胞で送達される（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０およびＴｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３５３－６５，１９８９参照）。

【0173】

いくつかの態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、制御放出系で送達することができる。例えば、いくつかの態様では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０；Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６，１９８０；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３２１：５７４－７９，１９８９参照）。いくつかの態様では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２，１９８５；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒａｌ．２５：３５１－５６，１９８９；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２，１９８９参照）。Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３，１９９０）によって論じられているものなどの他の制御放出系も使用することができる。

【0174】

許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0175】

非経口調製物に使用される薬学上許容され得る担体としては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤ならびに他の薬学的に許容され得る物質が挙げられる。水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、ブドウ糖および乳酸リンゲル注射液が挙げられる。非水性非経口ビヒクルには、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナッツ油が含まれる。静菌濃度または静真菌濃度の抗菌剤を、複数回投与容器に包装された非経口製剤に添加することができる。これにはフェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルエステルおよびプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが含まれる。等張剤には、塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝剤には、リン酸塩およびクエン酸塩が含まれる。抗酸化剤には、重硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔薬には、塩酸プロカインが含まれる。懸濁剤および分散剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。金属イオンの捕捉剤またはキレート剤には、ＥＤＴＡが含まれる。薬学的担体には、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；ｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含まれる。

【0176】

非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアルに封入され得る。

【0177】

注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＳ（ＢＡＳＦ；ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性がなければならない。これは、製造条件および貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの多価アルコールを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

【0178】

滅菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙した成分の中から必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり得、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から、有効成分と任意の追加の望ましい成分の粉末が得られる。

【0179】

吸入による投与の場合、化合物は、適した噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。

【0180】

経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用の洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に公知の軟膏、サルヴェ、ゲルまたはクリームに製剤化される。化合物は、直腸送達のための坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）の形態または停留浣腸の形態で調製することもできる。

【0181】

いくつかの態様では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容され得る担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

【0182】

いくつかの態様では、本開示の活性化合物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化することができる。本明細書において使用される投薬単位形態とは、処置される対象への単位投与量として適する物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにそのような機能性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

【0183】

ＩＩＩ．本開示の方法
本開示のいくつかの態様は、標的異種ｍＲＮＡの発現を増加させる核酸分子に関する。したがって、本開示の組成物は、処置を必要とするヒト対象の細胞を含む、細胞における標的の発現を増加させる方法に使用することができる。

【0184】

本開示のいくつかの態様は、細胞において標的ｍＲＮＡを発現させる方法であって、標的ｍＲＮＡとインフルエンザＮＳ１タンパク質とを細胞において共発現させることを含み、標的ｍＲＮＡがインフルエンザｍＲＮＡではない方法に関する。いくつかの態様では、例えば、本明細書中に記載されるように、インフルエンザＮＳ１タンパク質は、第１の核酸分子によってコードされ、標的ｍＲＮＡは、第２の核酸分子によってコードされる。

【0185】

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される組成物、例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組、本明細書に開示されるベクターまたはベクターの組、本明細書に開示される脂質ナノ粒子、細胞、または医薬本明細書に開示される組成物を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象の疾患または症状を処置する方法に関する。例えば、本明細書に記載の組成物は、いくつかの態様では疾患または障害を処置するのに役立ち得る、細胞（例えば、腫瘍細胞および／または免疫細胞）内のコードされた標的異種ｍＲＮＡの選択的かつ持続的な発現を誘導するために、インビトロもしくはエクスビボで培養中の細胞に、または例えばインビボでヒト対象に投与され得る。

【0186】

したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を使用する治療方法に関する。いくつかの態様では、本開示の組成物を対象に投与することを含む、標的異種ｍＲＮＡをそれを必要とする対象において発現させる方法が本明細書に開示される。

【0187】

いくつかの態様では、本開示で処置することができる疾患または障害は、癌を含む。いくつかの態様では、癌は、扁平上皮癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、胃腸癌、腎癌（例えば、腎明細胞癌）、卵巣癌、肝癌（例えば、肝細胞癌）、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌）、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、および頭頸部癌（または癌腫）、胃癌、胚細胞性腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰の癌、食道の癌（例えば、胃食道接合部癌）、小腸の癌、内分泌系の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、腫瘍血管新生、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストに誘発される癌を含む環境誘発癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ関連もしくはＨＰＶ起源の腫瘍））、および、２つの主要な血液細胞系列、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する）またはリンパ系細胞株（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞を産生する）のいずれかに由来する血液悪性腫瘍、例えばすべての種類の白血病、リンパ腫、および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍｌ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変種［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加を伴うＭ４変種［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、孤立性顆粒球肉腫、および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性など；ならびにリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、真性組織球性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系の造血器腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉腫またはセザリー症候群とも呼ばれる）、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無痛性骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫をはじめとする間葉系起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫をはじめとする間葉系起源の腫瘍；ならびに、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌腫をはじめとする他の腫瘍、リンパ系の造血器腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞型および脳様細胞型を含むＴ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含む、Ｔ細胞およびＢ細胞腫瘍；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢性／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性サブタイプ）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄性リンパ腫、またはその任意の組合せを含む。

【0188】

いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に、インビボで腫瘍負荷または癌細胞増殖を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれを超えて減少させるのに十分な量で投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物は、免疫活性を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれを超えて増加させるのに有効な量で投与される。

【0189】

いくつかの態様では、本開示で処置することができる疾患または障害は、自己免疫疾患を含む。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、宿主の免疫系が外来分子と自己分子を区別できないことによって引き起こされ、その結果、宿主の免疫系が自己分子を攻撃して破壊する疾患を指す。本明細書で使用される場合、「自己分子」（例えば、タンパク質またはＤＮＡ）は、宿主に由来するかまたは宿主に固有の分子を指す。本明細書で使用される場合、「外来分子」は、別のものに由来し、非天然起源の分子を指す。自己免疫疾患の非限定的な例としては、多発性硬化症、末梢神経炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、脱毛症、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、デビック病（視神経脊髄炎）、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、各種脈管炎、強皮症、糖尿病、動脈炎、白斑、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、乾癬、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー症候群）、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0190】

いくつかの態様では、処置される疾患または障害が自己免疫疾患を含む場合、組成物（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、脂質ナノ粒子または医薬組成物）を対象に投与すると、対象のＴ細胞活性などの免疫活性を低下させることができる。例えば、本開示から明らかなように、いくつかの態様では、免疫細胞機能を低下させるおよび／または免疫抑制活性を促進する（例えば、発生調節性Ｔ細胞を促進する）ことのできる標的異種ｍＲＮＡをコードすることにより、本明細書に記載のポリヌクレオチドを使用して免疫活性を低下させることができる。いくつかの態様では、免疫活性は、参照対象（例えば、組成物の投与前の対象または組成物の投与を受けなかった対応する対象）の免疫活性と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上低下する。

【実施例】

【0191】

実施例１
本実施例で使用したレプリコンプラスミドは以下を含んでいた：Ｓｔｒａｎｄ－ＥＧＦＰ（配列番号３；表６）；Ｓｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号４；表６）；非細胞変性ＥＧＦＰ（配列番号５；図１Ａ；表６）；Ｓｔｒａｎｄ－ＮＳ１－Ｈ５Ｎ１（配列番号２；表１）；Ｓｔｒａｎｄ－ＮＳ１－ＴＸ９１（配列番号１；表１）；Ｓｔｒａｎｄ－ＮＳ１－ＥＧＦＰ（配列番号６；表６）；Ｓｔｒａｎｄ－ＮＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７；表６）；および非細胞変性－ＮＳ１－ＥＧＦＰ（配列番号８；図１Ｂ；表６）。

【0192】

方法

【0193】

鋳型調製

【0194】

レプリコンＲＮＡについては、ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡペイロードを含有するＶＥＥレプリコンベクターを、適切なプラスミド調製法によって調製した。プラスミドをＢｓｐＱＩ処置によってさらに線状化した。簡単に説明すると、５μｇのレプリコンプラスミドＤＮＡを、ＮＥＢ３．１緩衝液中のＢｓｐＱＩで５０℃で３時間処置した。酵素を８０℃で２０分間熱不活性化し、試料をＤＮＡ浄化ステップに進めた。

【表3】

【0195】

ｍＣｈｅｒｒｙを含有するレプリコンプラスミド（Ｓｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＳｔｒａｎｄ－ＮＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙ）ならびにＮＳ１のみを含有するプラスミド（Ｓｔｒａｎｄ－ＮＳ１－Ｈ５Ｎ１およびＳｔｒａｎｄ－ＮＳ１－ＴＸ９１）の場合、ＩＳｃｅＩを使用してレプリコンテンプレートを消化した。反応には、Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝液が含まれ、３７℃で３時間反応させた。

【0196】

ｍｏｄＲＮＡ鋳型生成

【0197】

修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）鋳型の場合、Ｔ７プロモーターおよびサブゲノムプロモーターを含有するフォワードプライマーと、１２０アミノ酸のストレッチを有する３’－ＵＴＲ中のリバースプライマーとを有するレプリコンプラスミドを使用して、ＰＣＲによってＤＮＡを生成した。

【表4A】

【表4B】

【0198】

ＤｐｎＩ消化

【0199】

ＰＣＲ反応におけるプラスミドＤＮＡ（鋳型）をＤｐｎＩによって消化した。１ｕｇの初期プラスミド当たり１ｕＬのＤｐｎＩをＰＣＲ試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。

【0200】

ＤＮＡクリーンアップ

【0201】

ＰＣＲ増幅ＤＮＡ試料を、ＮＥＢＰＣＲクリーンアップキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って洗浄し、ＤＮＡを２０μＬの水に溶出した。

【0202】

ＰＣＲ（ｍｏｄＲＮＡテンプレート）およびＢｓｐＱＩ処置されたレプリコンＤＮＡ（ｒｅｐＲＮＡテンプレート）をプレキャストゲルでチェックして、純度（ＰＣＲ）および完全性（レプリコンテンプレート）を確認した。１μｇの精製鋳型を、以下の各２０μＬのＩＶＴ反応に使用した。

【0203】

最大２０ｎｇの総ＤＮＡを１．２％ＤＮＡゲルにロードし、２７５Ｖで７～１０分間実行した。

【0204】

インビトロ転写

【0205】

ＮＥＢＨｉＳｃｒｉｂｅＨｉｇｈｙｉｅｌｄＴ７キットをＲＮＡ産生のために使用した。修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）合成のために、キットのＵＴＰ成分をＮ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸で置き換えた。

【0206】

ＩＶＴ反応の準備ができたら、必要なキット成分を氷上で解凍し、混合し、微量遠心機でパルススピンして溶液をチューブの底に集めた。試料を氷上に保持し、酵素はボルテックスしなかった。

【0207】

共転写キャッピング法

【0208】

キャップ類似体レプリコンプラスミドおよびｍｏｄＲＮＡ鋳型を使用した産生のために、反応物を以下の順序で室温で組み立てた。

【表4C】

【0209】

次に、試料を完全に混合し、微量遠心機でパルススピンし、サーモミキサーで４００ｒｐｍで３７℃で３時間インキュベートした。品質管理のために１ｕＬのアリコートを保存した。

【0210】

ＤＮａｓｅ処置

【0211】

Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ酵素を使用して鋳型ＤＮＡを消化させた。酵素はＩＶＴ反応で活性であるので、１０×緩衝液は添加しなかった。反応物をヌクレアーゼフリー水で２００ｕＬに希釈した。

【0212】

１００μＬのＩＶＴ反応あたり２０μＬの酵素（２Ｕ／μＬ）を使用し、３７℃で６０分間インキュベートした。反応後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキットを使用してＲＮＡを精製した。品質管理のためにＲＮＡの１μＬアリコートを保存した。

【0213】

ＲＮＡの品質管理

【0214】

試料の濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐでチェックされ、品質管理はすべての中間ステップからのＲＮＡを含むゲルで確認した。最大２００ｎｇのＲＮＡを１．２％ＲＮＡゲル上で泳動させた。１ｕＬのＬｏｎｚａ ＲＮＡラダーをサイズマーカーとして使用した。５０％ホルムアルデヒド試料緩衝液を６５℃で５分間添加することによりＲＮＡを変性させ、試料を直ちに氷上に置き、少なくとも１分間保持した。

【0215】

最大５ｕＬの総試料をゲルに負荷し、可視化した。ＲＮＡの完全性は、断片分析装置で実行することによってもチェックすることができる。

【0216】

Ｔ接合を有する従来のＴＴ３ ＬＮＰ製剤を調製する

【0217】

脂質材料をそれぞれ秤量し、エタノールに溶解した。以下のフォームの組成比に従って全ての脂質材料を混合することによってエタノール相を調製した。水相は、最終的な塩の組成が１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）となるように、シリカカラム精製されたｒｅｐＲＮＡ／ｍｏｄＲＮＡを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび水で希釈することによって調製した。従来のＴＴ３ ＬＮＰを、ＬＮＰのエタノール相と水相をＴ接合混合によって３：１（水相：エタノール相）の流量比で混合することによって得た。

【表5】

【0218】

Ｔ接合を有するＰＥＧ後ミセルＴＴ３ ＬＮＰ製剤の調製

【0219】

脂質材料をそれぞれ秤量し、エタノールに溶解した。上記のフォームの組成比に従って、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋを除くすべての脂質材料を混合することによってエタノール相を調製した。水相は、最終的な塩の組成が１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）となるように、シリカカラム精製されたｒｅｐＲＮＡ／ｍｏｄＲＮＡを ２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび水で希釈することによって調製した。対応する体積のＤＭＧ－ＰＥＧ－２ＫをＴＢＳ緩衝液に添加し、ボルテックスによって完全に混合することによってＰＥＧミセル相を調製した。最後に、ＰＥＧ後ミセルＴＴ３ ＬＮＰは、まずＬＮＰのエタノール相と水相をＴ接合混合によって３：１の流量比（水相：エタノール相）で混合し、続いて１：１の流量比（ＬＮＰ相：ＰＥＧ相）でＴ接合混合によってＰＥＧミセル相で直ちにインライン希釈することによって得た。ＰＥＧ後ミセルＴＴ３ ＬＮＰの最終脂質組成を表Ｂに記載する。

【表A】

【表B】

【0220】

ＴＴ３ ＬＮＰの緩衝液交換および凍結／解凍

【0221】

得られたＴＴ３ ＬＮＰを透析カセットに移し、ＴＢＳ緩衝液中で２時間透析した。次いで、接線流濾過によってＴＴ３ ＬＮＰを濃縮した。続いて、ＴＢＳストック溶液中４０％スクロース（Ｗ／Ｖ）を、調製したすべてのＴＴ３ ＬＮＰに添加して、１０％スクロース中ＴＴ３ ＬＮＰの最終溶液を作製した。ＬＮＰの最終ＲＮＡ濃度を、２％ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）でＬＮＰを解離させることによって測定し、さらにＱｕｂｉｔアッセイで検出した。ＴＴ３ ＬＮＰを５０μｌ／チューブの一定分量に分割し、－８０℃で凍結させた。細胞をＬＮＰで処置する前に、ＴＴ３ ＬＮＰを室温で解凍した。

【0222】

脂質トランスフェクション

【0223】

細胞株については、５０ｎｇのＴＴ３：ＲＮＡをそれぞれのウェルに添加した。いくつかの実験では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、製造業者の推奨に従ってペイロードを送達した。

【0224】

ＦＡＣＳ試料の調製

【0225】

ＺｏｍｂｉｅＮＩＲ染色緩衝液を、１００倍の色素ストックをＰＢＳで希釈することによって調製した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ディープウェルの９６ウェルプレートに移し、懸濁細胞について５００ｇ、１０分で遠心分離した。接着細胞の場合、細胞を５分間トリプシン処理し、続いて５００ｇで１０分間遠心分離する。細胞をＰＢＳに再懸濁し、９６Ｖ底プレートに移し、続いてＺｏｍｂｉｅＮＩＲ色素を含有する１００ｕＬのＰＢＳを用いて暗所、ＲＴで１０分間生／死染色する。２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液（色素をクエンチするためのＢＳＡを含有する）を添加することによって反応を停止させ、再び遠心分離し、最後に２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。細胞を、レポーター（ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ）シグナルおよび生存率についてフローサイトメーターで分析する。

【0226】

結果

【0227】

ｒｅｐＲＮＡによるＮＳ１のタンデムトランスフェクションは、４Ｔ１マウス腫瘍細胞株におけるレプリコン発現を改善した。４Ｔ１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用してＳｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｏｄＲＮＡ、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡｍＲＮＡでトランスフェクトした。このタンデムトランスフェクションでは、ｒｅｐＲＮＡをトランスフェクトする６時間前にＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした。これにより、細胞がレプリコンを経験する前に、細胞にＮＳ１タンパク質を提供する機会が与えられる。トランスフェクションの２４時間後、細胞を顕微鏡で可視化するとともに、フローサイトメトリーによって処理して定量的シグナルを調べた（図２Ａ～２Ｄ）。ｒｅｐＲＮＡによるＨ５Ｎ１とＴＸ９１の両方からのＮＳ１のタンデムトランスフェクションにより、レプリコン発現が改善された（図２Ｅ）。

【0228】

次に、４Ｔ１細胞を、ＴＴ３脂質ナノ粒子を使用してＳｔｒａｎｄ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｏｄＲＮＡ、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。この同時トランスフェクションでは、ｒｅｐＲＮＡとともにＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を顕微鏡で可視化するとともに、フローサイトメトリーによって処理して定量的シグナルを調べた（図３Ａ～３Ｆ）。タンデムＮＳ１発現（図３Ｅ）およびＮＳ１同時トランスフェクション（図３Ｆ）は、４Ｔ１細胞においてｒｅｐＲＮＡからより高いＭＦＩを媒介した。

【0229】

ｒｅｐＲＮＡによるＮＳ１の同時トランスフェクションは、様々なヒト癌細胞株におけるレプリコン発現を改善する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して、Ｈｃｃ３８腫瘍細胞を、ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ（図４Ｂおよび４Ｆ）、ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ（図４Ｃおよび４Ｇ）、またはＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（図４Ｄおよび４Ｈ）でトランスフェクトした。この実験では、ＮＳ１をｍｏｄＲＮＡ（ＮＳ１ ｍｏｄＲＮＡ；図４Ｂおよび４Ｆ）として、または別個の（ＮＳ１ ｒｅｐＲＮＡ；図４Ｃおよび４Ｇ）もしくはバイシストロニックなｒｅｐＲＮＡベクター（ＮＳ１－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ；図４Ｄおよび４Ｈ）として提供した。トランスフェクションの２４時間後（図４Ａ～４Ｄ）または４８時間後（図４Ｅ～４Ｈ）に、細胞を顕微鏡で可視化するとともに、フローサイトメトリーによって処理して定量的シグナルを調べた。同様に、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）が、Ｓｃｃ９ ＨＮＳＣＣ（図４Ｉ）およびＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ細胞（図４Ｊ～４Ｋ）においてＮＳ１発現とともに増大することが認められた。

【0230】

ベクター工学をＮＳ１と組み合わせると、相加的な改善が観察された。ＢＴ２０癌細胞を、元の（Ｓｔｒａｎｄ）骨格（図５Ａ～５Ｂ）かまたはＱ７３９Ｌ変異（非細胞変性；図５Ｃ～５Ｄ）のいずれかを含有するＥＧＦＰをコードするレプリコンベクターを使用してＴＴ３ ＬＮＰを使用してトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して細胞を分析してレポーターシグナルを定量した。Ｑ７３９Ｌベクター中のＮＳ１を組み合わせると、相加的改善は容易に明らかになった（図５Ａ～５Ｆ）。

【0231】

次に、Ｂ１６．Ｆ１０（図６Ａ～６Ｃ）または４Ｔ１（図６Ｄ～６Ｆ）細胞に、未修飾ｒＮＴＰ（未修飾Ｒｅｐ；図６Ａおよび６Ｄ）を使用するか、または１：１（５０％；図６Ｂおよび６Ｅ）もしくは１：３（２５％；図６Ｃおよび６Ｆ）のＵＴＰ：Ｎ１－メチル－シュードＵＴＰ（ｐｓｉで示す）の比を使用して作製したレプリコンをエレクトロポレーションした。１：１の比はペイロード発現の有意な減少をもたらすが、１：３の比は発現ならびにシグナル強度を維持する（図６Ｇ）。

【0232】

レプリコン駆動ペイロード発現において、ベクター工学と修飾ｒＮＴＰの使用との組合せで相加効果が観察された（図７）。ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードしたレプリコンを、未修飾ｒＮＴＰ（ｕｎｍｏｄ）を使用するかまたは１：３の比の特定の

【化3】

；１：３ Ｃ：５ｍｅ－Ｃ（Ｍ２）（ここで、Ｃはシチジンを指し、５ｍｅ－Ｃは５－メチル－シチジンをさす）を使用して作製した。４Ｔ１細胞におけるエレクトロポレーションによるトランスフェクションの２４時間後と４８時間後に発光を測定した（図７）。これらのＦｌｕｃレプリコンを次にインターフェロン誘導性細胞株、Ｂ１６－ＩＳＧ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、ペイロード発現を発光単位（図８Ａ）で測定し、比色法（図８Ｂ）を使用するＳＥＡＰレポーターアッセイを使用してＩ型ＩＦＮ活性を測定した。単一（Ｍ１）もしくは二重修飾された（Ｍ２）レプリコンは、ペイロード発現の改善ならびにＩ型ＩＦＮ活性の低下を示した。

【0233】

レプリコン駆動ペイロード発現における修飾ｒＮＴＰの使用は、発現を改善し、ＩＦＮ活性化を減少させた（図９Ａ～９Ｃ）。Ｂ１６－ＩＳＧ細胞を、上記のように、未修飾または単一（Ｍ１）もしくは二重修飾されたｒＮＴＰを使用して作製したＮＳ１－ＥＧＦＰ（Ｐ２Ａリンカー）を発現するＱ７３９Ｌレプリコンでトランスフェクトした。二重修飾されたレプリコンは、ポリ（Ｉ：Ｃ）処置細胞と比較して、ペイロード発現（図９Ａ）、シグナル強度（図９Ｂ）、およびＩ型ＩＦＮ活性の低下（図９Ｃ）を改善する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ｄｓＲＮＡ類似体であり、強力なＩ型ＩＦＮアゴニストである。

【0234】

高用量ＩＬ－２を含む抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２カクテルで２日間活性化したＴ細胞におけるＬＮＰ送達は、培地への組換えタンパク質（エンハンサー）の添加によって改善され、脂質１でトランスフェクトした細胞およびエンハンサーに曝露されなかった細胞（図１０Ａ～１０Ｄ）と比較して、脂質２－コレステロール（図１０Ｅ）または脂質２－ｂ－シトステロール（図１０Ｆ）でトランスフェクトした細胞において、強固なシグナルをもたらした。

【0235】

レプリコン駆動ペイロード発現における修飾ｒＮＴＰの使用は、発現を改善し、ＩＦＮ活性化を低下させた。初代ヒトＴ細胞を、解凍後２日間、ＩＬ－２および抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２を使用して活性化させ、上記で使用されるように、ＮＳ１－ＥＧＦＰを駆動するＱ７３９Ｌレプリコンを使用してトランスフェクトし、非修飾または単一（Ｍ１）もしくは二重修飾された（Ｍ２）ｍＲＮＡを使用して作製した。加えて、未改変ベクターに１または１０％のポリ（Ｉ：Ｃ）、ｄｓＲＮＡ類似体をスパイクし、脂質に共カプセル化した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析してＧＦＰシグナルを定量し、細胞上清を使用して炎症促進性サイトカイン、例えばＩＦＮ－γを分析した。Ｍ２レプリコンは、最低量のＩＦＮ－γ分泌を維持しながら（図１１Ｃ）、最高レベルの発現（図１１Ａ～１１Ｂ）を示す。

【0236】

ヒトＰＢＭＣを３人の健常ドナーから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２カクテル（活性化）の存在下、低用量ＩＬ－２（休止）または高用量ＩＬ－２で２日間増殖させ、続いてＮＳ１－ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰを駆動するＭ２修飾Ｑ７３９Ｌレプリコンまたは従来のＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｍｏｄ）を用いてｍＲＮＡ：脂質送達を行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞を生死生存率染色で染色し、ＧＦＰシグナルについて分析した（図１２Ａ）。上清をサイトカインプロファイリングのために収集し、ＩＦＮ－α検出のためにＥＬＩＳＡに供した。レプリコンをコードするＮＳ１は、休止状態と活性化状態の両方でＩＦＮ－α活性化を低下させた（図１２Ｂ）。
配列

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【表6-8】

【表6-9】

【表6-10】

【表6-11】

【表6-12】

【表6-13】

【表6-14】

【表6-15】

【表6-16】

【表6-17】

【表6-18】

【表6-19】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E-F】

【図4A-B】

【図4C-D】

【図4E-F】

【図4G-H】

【図4I】

【図4J-K】

【図5A-D】

【図5E-F】

【図6A-F】

【図6G】

【図7】

【図8A-B】

【図9A-B】

【図9C】

【図10A-F】

【図11A-C】

【図12A-B】

【配列表】

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【国際調査報告】