特表 2024-528979 ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/165 20060101AFI20240725BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 31/167 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 31/341 20060101ALI20240725BHJP

【ＦＩ】

A61K31/165

A61P17/02

A61K31/167

A61K31/341

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506618

(86)(22)【出願日】2022-08-01

(85)【翻訳文提出日】2024-02-02

(86)【国際出願番号】 KR2022011265

(87)【国際公開番号】W WO2023014003

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】10-2021-0101359

(32)【優先日】2021-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0094406

(32)【優先日】2022-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523037716

【氏名又は名称】セルリオンバイオメッド インク．

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＩＯＮＢＩＯＭＥＤ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】＃Ａ－４０７ｈｏ， Ｄａｅｄｅｏｋ Ｂｉｚ Ｃｅｎｔｅｒ， １７ Ｔｅｃｈｎｏ ４－ｒｏ， Ｙｕｓｅｏｎｇ－ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ， ３４０１３， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110004392

【氏名又は名称】弁理士法人佐川国際特許商標事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】キム ソンジン

(72)【発明者】

【氏名】キム ソンミョン

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA03

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA89

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA19

4C206JA24

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA89

(57)【要約】

本発明は、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物に関する。前記ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、皮膚線維化に関与する線維芽細胞、角質細胞および血管内皮細胞で細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加および細胞増殖を抑制し、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）であるコラーゲンの合成を抑制することによって、難治性肥厚性瘢痕およびケロイドを効果的に治療する効能を有する。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記［化学式１］で表されるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、ことを特徴とする肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【化1】

（上記化学式１において、Ｘ_１～Ｘ_１０は、水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）であり、すべて同一又は異なっていてもよく；Ｙは、硫黄（Ｓ）またはスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、＊は、キラル体を意味し；Ｒ_１は、水素、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ビニル基、アクリル基、ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、フラン基、ヒドロフラン基、シクロプロパン基、オキラン基、サイクリックフェニル基のうちいずれか１つである。）

【請求項2】

前記［化学式１］化合物は、線維芽細胞、角質細胞、血管内皮細胞内でＣａ^２＋濃度の増加および細胞増殖を抑制し、細胞外基質であるコラーゲンの合成を抑制する効能を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【請求項3】

前記［化学式１］化合物は、２－（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド；２－（ベンズヒドリルチオ）－Ｎ－［（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル］アセトアミド；２－（ベンズヒドリルチオ）－Ｎ－フェニルアセトアミド；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－メチルアセトアミド；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－［（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル］アセトアミド；２－（ベンズヒドリルチオ）－エン－メチルアセトアミド；２－［ビス（２－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド；２－［ビス（３－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド；２－［ビス（４－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド；２－［ビス（４－クロロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－ヒドロキシアセトアミドの中から選択されたいずれか１つである、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【請求項4】

前記［化学式１］化合物は、２－（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【請求項5】

前記［化学式１］化合物は、２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－ヒドロキシアセトアミド（ａｄｒａｆｉｎｉｌ）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【請求項6】

前記［化学式１］化合物は、２－［ビス（４－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【請求項7】

前記［化学式１］化合物は、２－［ビス（４－クロロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミドである、
ことを特徴とする請求項１に記載の肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物に関し、より詳細に説明すると、前記ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、皮膚線維化に関与する線維芽細胞、角質細胞および血管内皮細胞で細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加および細胞増殖を抑制し、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）であるコラーゲンの合成を抑制することによって、難治性肥厚性瘢痕およびケロイドを効果的に治療する効能を有する。

【背景技術】

【0002】

一般的に、人体内で傷が治る過程は、炎症と増殖および再構成の３段階を経る。まず、炎症段階では、傷部位が止血し、白血球と好中球などの免疫細胞が外部から流入する危害物質と損傷組織を除去する。次に、増殖段階には、血管内皮細胞が傷部位に移動し、損傷組織に新しい血管を形成し、コラーゲンやエラスチンのような細胞外組織構成タンパク質が生成されると同時に、線維芽細胞が肉芽組織を形成する。

【0003】

最後に、再構成段階では、増殖した上皮細胞が成熟し、線維組織が形成されることにより、新しく合成された組織と増殖した細胞間の接合力と弾力性が増加する。このような傷治癒過程は、傷の程度によって数ヶ月～数年の時間がかかる。また、真皮層の深さまで損傷を受けた場合、皮膚の緊張度を維持する真皮層にコラーゲンが増殖し、皮膚に治癒跡である「傷痕（ｓｃａｒ）」を残すことになる。

【0004】

人体が傷を治癒する過程で線維組織が過剰に密集すると、傷部位が異常に肥大成長する「肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ）」や「ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）」が生成されることがある。肥厚性瘢痕（「肥大傷痕」ともいう）は、傷部位を越えず、時間が経つにつれて徐々に消失する傾向が見られるが、ケロイドは、時間が経つにつれて傷部位よりさらに広く成長し、正常皮膚まで侵すという点から異なっている。

【0005】

皮膚線維症（ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の一種である肥厚性瘢痕とケロイドは、傷治癒過程で細胞の移動が過剰に活性化したり、組織の細胞と毛細血管が異常増殖し、コラーゲンが過剰に蓄積されて発生する。統計的に手術患者の４０～７０％程度が１年以内に肥厚性瘢痕やケロイドに発展するほど非常に一般的であるが、これを効果的に抑制できる治療剤は、まだ開発されていない。

【0006】

従来、肥厚性瘢痕やケロイドまたは皮膚線維化を有効に抑制できる治療剤を開発しようとする努力は、ずっと試みられてきた。例えば、特許文献１（韓国登録特許第１０－２０２６１３８号（２０１９年０９月２３日））には、ＣＲＩＦ１（ＣＲ６ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏＲ１）遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含むケロイドおよび肥厚性瘢痕形成の抑制または治療用薬学組成物が開示されている。前記ＣＲＩＦ１は、ミトコンドリアに存在するタンパク質の一種であり、前記有効成分としては、ＣＲＩＦ１遺伝子に特異的に結合するアンチセンスヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを含む。

【0007】

また、特許文献２（韓国登録特許第１０－２２０６０１７号（２０２１年０１月１５日））には、ＰＡＲＰ１（ｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １）の発現または活性阻害剤を有効成分として含む皮膚線維化疾患の予防または治療用薬学的組成物が開示されている。前記有効成分としては、卵巣がん治療剤に用いられるルカパリブ（ｒｕｃａｐａｒｉｂ）が例示されている。

【0008】

特許文献３（韓国登録特許第１０－２２３２０７２号（２０２１年０３月１９日））には、次の［化学式Ａ］で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む皮膚線維症の予防または治療用組成物が開示されている。

【化1】

（上記化学式Ａにおいて、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルである。）

【0009】

上記［化学式Ａ］化合物は、線維芽細胞でＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏＸ１）と、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、フィブロネクチンおよびエラスチンの発現を抑制する。また、上記［化学式Ａ］化合物のうち代表的な化合物は、ピルビン酸で修飾されたエチルピルベート（ｅｔｈｙｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ）である。

【0010】

なお、特許文献４（韓国登録特許第１０－１９４７２７７号（２０１９年０２月０１日））には、Ｋ_Ｃａ３．１チャネル遮断剤であるＴＲＡＭ－３４（１－［（２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ）を含有する肥厚性瘢痕形成の予防または治療用薬学組成物が開示されている。前記Ｋ_Ｃａ３．１チャネルは、線維芽細胞に特異的に分布するポタシウム（Ｋ^＋）チャネルの一種であり、線維芽細胞の活性に主に関与する。

【0011】

また、特許文献５（韓国登録特許第１０－１４１４８３１号（２０１４年０６月２６日））には、嗜眠症治療剤と知られたモダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）およびその誘導体がＫ_Ｃａ３．１チャネルの電流を抑制する効能があり、Ｋ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患、すなわち鎌状赤血球貧血、自己免疫疾患、がん疾患、トラウマ脳損傷、退行性神経疾患、分泌性下痢などの治療剤に用いられ得ると報告されている。

【0012】

また、本発明者は、特許文献６（韓国登録特許第１０－２２７７７３９号（２０２１年０７月０９日））およびこれに対応する特許文献７（国際公開ＷＯ２０２０／０５５１６６Ａ１（２０２０年０３月１９日））に、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む肝線維化または肺線維化疾患の治療用組成物を提示したことがある。前記ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、モダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）を含み、細胞膜でＫ_Ｃａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する効能がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【特許文献1】韓国登録特許第１０－２０２６１３８号公報

【特許文献2】韓国登録特許第１０－２２０６０１７号公報

【特許文献3】韓国登録特許第１０－２２３２０７２号公報

【特許文献4】韓国登録特許第１０－１９４７２７７号公報

【特許文献5】韓国登録特許第１０－１４１４８３１号公報

【特許文献6】韓国登録特許第１０－２２７７７３９号公報

【特許文献7】国際公開ＷＯ２０２０／０５５１６６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

多くの細胞は、刺激を受けると、細胞内でＣａ^２＋の濃度が増加し、その機能が活性化する。Ｃａ^２＋は、細胞内信号伝達過程で二次メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）として作用して細胞の機能調節に非常に重要な役割をする。皮膚線維化過程においても細胞内Ｃａ^２＋は、線維化関連細胞の活性化および筋線維芽細胞の形成、細胞外基質の生成と分泌などを調節する非常に重要な役割をする。したがって、細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加を抑制すると、皮膚線維化、特に肥厚性瘢痕およびケロイドの生成を効果的に抑制することができる。

【0015】

これより、本発明の目的は、皮膚線維化関連細胞で細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加および細胞増殖を抑制し、さらには、細胞外基質であるコラーゲンの合成を抑制することによって、結果的に、肥厚性瘢痕およびケロイドの生成を効果的に治療できる新しい医薬組成物を提供することにある。

【0016】

また、本発明の他の目的は、従来に開発された肥厚性瘢痕治療剤としてＫ_Ｃａ３．１チャネルを遮断する効能を有するＴＲＡＭ－３４などと併用投与し、肥厚性瘢痕およびケロイドの治療効能を高めることができる新しい医薬組成物を提供することにある。

【0017】

参考として、本明細書において「治療」という用語の意味は、疾患、病気または症状の発展を抑制すること、そして軽減または除去することを全部含む。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明による肥厚性瘢痕およびケロイド治療用組成物は、下記［化学式１］で表されるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする。

【0019】

【化2】

（上記化学式１において、Ｘ_１～Ｘ_１０は、水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）であり、すべて同一又は異なっていてもよく；Ｙは、硫黄（Ｓ）またはスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、＊は、キラル体を意味し；Ｒ_１は、水素、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ビニル基、アクリル基、ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、フラン基、ヒドロフラン基、シクロプロパン基、オキラン基、サイクリックフェニル基のうちいずれか１つである。）

【0020】

上記［化学式１］で表されるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、線維芽細胞、角質細胞、血管内皮細胞内でＣａ^２＋濃度の増加および細胞増殖を抑制し、さらには、細胞外基質であるコラーゲンの合成を抑制する効能を有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0021】

本発明による上記［化学式１］のベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、難治性肥厚性瘢痕およびケロイドを効果的に治療できる効能を有し、必要に応じてポタシウムチャネル抑制効能を有する従来の肥厚性瘢痕治療剤とともに併用投与することもでき、さらには、治療補助剤や化粧用組成物などに用いられ得ることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】線維芽細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物に対する細胞内Ｃａ^２＋増加の抑制効果を測定したグラフである。

【図2】角質細胞と血管内皮細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５化合物に対する細胞内Ｃａ^２＋増加の抑制効果を測定したグラフである。

【図3】線維芽細胞を対象に細胞内Ｃａ^２＋流入遮断物質であるＬａ^３＋に対する細胞内Ｃａ^２＋増加の抑制効果を測定したグラフである。

【図4】線維芽細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ５、Ｎ８～Ｎ１０化合物に対する細胞増殖抑制効果を測定したグラフである。

【図5】角質細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物とＬａ^３＋に対する細胞増殖抑制効果を測定したグラフである。

【図6】線維芽細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ８化合物に対する線維化抑制効果を測定したグラフである。

【図7】線維芽細胞を対象に本発明によるＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ７化合物に対する線維化抑制効果を測定したグラフである。

【図8】ウサギの耳を用いた肥大傷痕モデルで皮膚拡大鏡で肥大傷痕を観察してＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物の効果を分析した写真とグラフである。

【図9】ウサギの耳を用いた肥大傷痕モデルで肥大傷痕の表皮厚さを測定してＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物の効果を分析した顕微鏡写真とグラフである。

【図10】ウサギの耳を用いた肥大傷痕モデルで瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）を測定してＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物の効果を分析した顕微鏡写真とグラフである。

【図11】ウサギの耳を用いた肥大傷痕モデルでコラーゲン密度を測定してＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物の効果を分析した顕微鏡写真とグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、添付の図面を参照して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明を実施するのに必ず必要な構成であるとしても、従来技術に紹介されていたり、通常の技術者が公知技術から容易に実施できる事項については、具体的な説明を省略する。

【0024】

本発明による上記［化学式１］のベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、具体的には、次のＣＢＭ－Ｎ１～ＣＢＭ－Ｎ１０化合物を含む。ここで、ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０は、本発明者が付与したコード名であり、それぞれの化学名は、次のとおりである。
１）ＣＢＭ－Ｎ１；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド
２）ＣＢＭ－Ｎ２；２－（ベンズヒドリルチオ）－Ｎ－［（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル］アセトアミド
３）ＣＢＭ－Ｎ３；２－（ベンズヒドリルチオ）－Ｎ－フェニルアセトアミド
４）ＣＢＭ－Ｎ４；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－メチルアセトアミド
５）ＣＢＭ－Ｎ５；２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－［（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル］アセトアミド
６）ＣＢＭ－Ｎ６；２－（ベンズヒドリルチオ）－エン－メチルアセトアミド
７）ＣＢＭ－Ｎ７；２－［ビス（２－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド
８）ＣＢＭ－Ｎ８；２－［ビス（３－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド
９）ＣＢＭ－Ｎ９；２－［ビス（４－フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド
１０）ＣＢＭ－Ｎ１０；２－［ビス（４－クロロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド

【0025】

前記ＣＢＭ－Ｎ１化合物は、「モダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）」という一般名称と知られており、ＣＢＭ－Ｎ９化合物は、「ラウフルミド（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）」という一般名称と知られている。また、前記ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物は、全部人体内でほぼ類似の薬理機序を示す。

【0026】

前記ＣＢＭ－Ｎ１化合物の製造方法は、多様に知られており、商用化した原料を購入して使用することもできる。また、前記ＣＢＭ－Ｎ２～Ｎ６化合物の製造方法は、韓国登録特許第１０－１３４５８６０号などに周知であり、前記ＣＢＭ－Ｎ７～Ｎ９化合物の製造方法は、国際公開ＷＯ２０２０／０５５１６６Ａ１などに周知である。

【0027】

前記ＣＢＭ－１０化合物は、新規の化合物であり、前記ＣＢＭ－９化合物と同じ方法で製造することができる。ただし、出発物質としてビス（４－フルオロフェニル）メタノールの代わりに、ビス（４－クロロフェニル）メタノールを使用する。このような方法で製造されたＣＢＭ－１０化合物の^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）は、７．３～７．７ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、５．４ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ）、３．４５ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、３．２ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）で分析された。

【0028】

前記ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物以外に、アドラフィニル（ａｄｒａｆｉｎｉｌ）という一般名称と知られた２－（ベンズヒドリルスルフィニル）－Ｎ－ヒドロキシアセトアミドは、前記ＣＢＭ－Ｎ１化合物、すなわちモダフィニルの前駆体としてモダフィニルと同じ薬理作用を有する（ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌ５，Ｎｏ．３ １９３－２１２，１９９９）。

【0029】

上記［化学式１］化合物は、皮膚線維化に関与する線維芽細胞、角質細胞、血管内皮細胞などで細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加を抑制する。細胞内Ｃａ^２＋は、線維化関連細胞の活性化および筋線維芽細胞の形成、細胞外基質の生成と分泌に関与して肥厚性瘢痕やケロイドの形成を促進する。

【0030】

また、上記［化学式１］化合物は、皮膚線維化過程に補助的役割をする角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の機能を抑制する。角質細胞は、各種成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を分泌し、線維芽細胞を刺激して成長因子を生成させる。また、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の形成を刺激し、肥厚性瘢痕とケロイドの形成に寄与する。

【0031】

また、上記［化学式１］化合物は、皮膚線維化過程に補助的役割をする血管内皮細胞の機能を抑制する。血管内皮細胞は、血管を新生させ、線維芽組織の成長に必要な血液供給を円滑にし、線維芽組織の成長に寄与する。

【0032】

本発明による薬学組成物は、上記［化学式１］化合物の薬学的に許容可能な塩を含む。ここで、「薬学的に許容可能な塩」というのは、通常の金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などを含む。

【0033】

本発明による薬学組成物は、上記［化学式１］化合物の溶媒和物および水和物を全部含み、可能なすべての立体異性体をも含んでもよい。前記溶媒和物、水和物および立体異性体は、通常の方法を用いて製造することができる。また、上記［化学式１］化合物の結晶形態または非結晶形態を含み、結晶形態で製造される場合、任意に水和されたり溶媒化されてもよい。

【0034】

本発明による薬学組成物は、薬学的分野において公知の方法によって、それ自体または薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、賦形剤（ｆｏｒｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、希釈剤などと混合して多様な剤形で製造することができる。例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ、エマルジョンのような経口型剤形や、外用剤または注射剤などの剤形で製造することができる。

【0035】

特に本発明による組成物の用途が皮膚傷に生成される肥厚性瘢痕およびケロイドの治療という点を考慮すると、局所投与が可能な皮膚外用剤または注射剤の形態であることがより好ましい。前記皮膚外用剤の形態としては、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、エアロゾル剤などを例示することができる。

【0036】

本発明による組成物は、薬学的に有効な用量で投与することができる。このような有効投与量は、傷の種類およびサイズと深さ、患者の年齢および性別、薬物の活性、薬物感受性、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、同時使用薬物などを含む諸般要素を考慮して決定することができる。

【0037】

上記［化学式１］化合物の好ましい１日有効投与量は、０．２～２０ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．５～１０ｍｇ／ｋｇであってもよく、１日に１回～２回投与することができるが、これに制限されない。

【実施例】

【0038】

以下、本発明によるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物について次のような方法で肥厚性瘢痕およびケロイドの治療効能の試験を行った。

【0039】

［線維芽細胞、角質細胞および血管内皮細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験］
１）試験方法
ダルベッコ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３（ＣＲＬ－２７９５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）とマウス大動脈の血管内皮細胞を培養し、ＭＶ２培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ）で角質細胞（ＨａＣａＴ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を培養した。

【0040】

前記線維芽細胞は、線維化誘発物質であるＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）に、そして、角質細胞は、ＡＴＰ（１０μＭ）にそれぞれ露出させて、細胞内Ｃａ^２＋濃度、すなわち［Ｃａ^２＋］_ｉを増加させた。

【0041】

［Ｃａ^２＋］_ｉが安定状態に到達したとき、本発明のＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物を投与し、［Ｃａ^２＋］_ｉに及ぼす影響を観察した。

【0042】

なお、［Ｃａ^２＋］_ｉの測定方法は、次のとおりである。まず、細胞培養用プレート（１２ ｗｅｌｌ）でカバーグラスの上に細胞を培養し、その培養液にＣａ^２＋感受性色素であるＦｕｒａ－２／ＡＭ（２μＭ）を添加し、３７℃で２５分間Ｆｕｒａ－２／ＡＭを細胞の中に浸透させた。

【0043】

倒立顕微鏡（ＤＭ ＩＲＢ，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｃａ^２＋測定装置（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）を用いて３６０および３８０ｎｍの光源を５０Ｈｚで細胞に交互に照明した。細胞から発散する蛍光を５１０ｎｍで測定し、当該結果から細胞内Ｃａ^２＋の濃度を換算した。また、多様なＣａ^２＋チャネルを介したＣａ^２＋の流入を遮断するために、Ｌａ^３＋（１０μＭ）を使用した。

【0044】

前記線維芽細胞と角質細胞をＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ－β＋ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０およびＴＧＦ－β＋Ｌａ^３＋に２４時間露出させた後、ＭＴＴアッセイあるいはＣＣＫ－８アッセイ方法で細胞増殖に及ぼす影響を分析した。

【0045】

また、前記線維芽細胞をＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β＋ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ７に２４時間露出させ、線維化マーカーであるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、コラーゲン １α（Ｃｏｌ１α）、コラーゲン ３α（Ｃｏｌ３α）の発現量をウェスタンブロットあるいはＰＣＲで分析した。

【0046】

２）試験結果
図１は、線維芽細胞でＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）による細胞内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃａ^２＋］_ｉ）の増加とこれに及ぼすＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０の効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＊＜０．００１である）。

【0047】

図２は、角質細胞（ＡとＢ）と血管内皮細胞（ＣとＤ）でＡＴＰ（１０μＭ）による［Ｃａ^２＋］_ｉの増加とこれに及ぼすＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５の効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＊＜０．００１である）。

【0048】

図３は、線維芽細胞でＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）による［Ｃａ^２＋］_ｉ増加とこれに及ぼすＬａ^３＋（１０μＭ）の効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＊＜０．００１である）。前記Ｌａ^３＋（１０μＭ）は、多様なＣａ^２＋チャネルを介してＣａ^２＋の細胞内流入を遮断することが知られている。

【0049】

図４は、線維芽細胞でＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ、２４時間露出）による細胞増殖（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を遮断するＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ５、Ｎ８～Ｎ１０化合物の効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＜０．０５、＊＊＜０．０１である）。前記細胞増殖は、ＭＴＴアッセイで測定した。

【0050】

図５は、角質細胞でＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ、２４時間露出）による細胞増殖を遮断するＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物の効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＊＜０．００１である）。前記細胞増殖は、ＣＣＫ－８アッセイで測定した。

【0051】

図６は、ＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）に２４時間露出させた線維芽細胞でＣＢＭ－Ｎ１化合物（１μＭ）がα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ｃｏｌｌａｇｅｎ ３α（Ｃｏｌ３α）、ｃｏｌｌａｇｅｎ １α（Ｃｏｌ１α）の発現に及ぼす効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＜０．０１である）。前記α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ３α、Ｃｏｌ１αタンパク質の発現は、ウェスタンブロット方法で測定した。

【0052】

図７は、ＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）に２４時間露出させた線維芽細胞でＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ７化合物（１μＭ）がα－ＳＭＡとＣｏｌ１αの発現に及ぼす効果を示す図である（平均±ＳＥで表記し、ｎ＝５．＊＊＜０．０１である）。前記α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１αｍＲＮＡの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ方法で測定した。

【0053】

３）評価および分析
図１と図２、図４および図５から分かるように、本発明のＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物は、線維化関連細胞である線維芽細胞、角質細胞および血管内皮細胞でＴＧＦ－βあるいはＡＴＰによる細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加と細胞増殖を効果的に抑制することが確認された。

【0054】

また、図３と図５から分かるように、Ｌａ^３＋を用いてＣａ^２＋の細胞内流入を遮断すると、細胞増殖の増加が抑制されることが確認された。この結果は、本発明のＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物がＣａ^２＋の細胞内流入を抑制し、細胞増殖を抑制することを意味する。

【0055】

また、図６と図７から分かるように、ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ７化合物は、線維化誘発物質であるＴＧＦ－βによるα－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１αまたはＣｏｌ３αの発現増加を抑制した。線維芽細胞で細胞内Ｃａ^２＋の増加は、α－ＳＭＡおよびコラーゲンのような細胞外基質の形成に重要な役割をすることが知られている。したがって、本発明のＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ７化合物によるα－ＳＭＡ、Ｃｏｌ１αあるいはＣｏｌ３αの発現抑制は、Ｃａ^２＋の増加抑制による結果と推定される。

【0056】

参考として、線維化過程に最も重要な段階は、筋線維芽細胞が形成されることであり、筋線維芽細胞が形成される場合に、線維化過程が起こる。筋線維芽細胞は、線維芽細胞が活性化したり血管内皮細胞、平滑筋細胞などが上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を通じて形成される。

【0057】

α－ＳＭＡは、筋線維芽細胞のマーカーであり、α－ＳＭＡ発現の増加は、筋線維芽細胞が生成されることを示す。また、筋線維芽細胞が生成されると、コラーゲン生成が増加する。したがって、α－ＳＭＡ発現とコラーゲン形成が増加するというのは、線維化過程の非常に重要な根拠となる筋線維芽細胞の形成を意味する。

【0058】

前述のような試験結果は、本発明による［化学式１］のベンズヒドリルチオアセトアミド化合物が線維芽細胞の活性化を抑制することによって、結果的に、皮膚線維化を抑制する効能があることを意味する。

【0059】

［ウサギの肥大傷痕モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験］
１）試験モデルの準備
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔ ２．６～３ｋｇ雌８匹を麻酔し、８ｍｍ 生検パンチを用いてウサギの耳皮膚の表皮、真皮および軟骨膜を円形で除去して創傷を生成した。このような創傷は、ウサギの片方の耳部位当たり３個ずつ生成した。ウサギの手術部位を消毒し、３週間の自然治癒を通じて肥大傷痕の生成を誘導した。

【0060】

３週間の自然治癒後に傷痕部位の完全な上皮化および肥大傷痕の生成を確認し、試験群別に治療を始めた。前記試験群は、正常群（正常組織）、対照群（治療しない創傷、肥大傷痕組織）、試験群１（溶媒塗布）、試験群２（ＣＢＭ－Ｎ１ １０％）、試験群３（ＣＢＭ－Ｎ３ １０％）、試験群４（ＣＢＭ－Ｎ １０％）、試験群５（ＣＢＭ－Ｎ １０％）に分類した。

【0061】

各試験群に対して２週（１４日）間毎日０．５ｍＬずつ薬物を塗布して治療した後、組織解剖検査を実施した。生検した組織は、１０％ホルマリン溶液に保管し、組織スライドを製作した。肥大傷痕治療の有効性の有無を皮膚拡大鏡および組織学的評価によって確認した。

【0062】

２）目視評価
対照群および試験群の皮膚組織部位を治療開始日と治療終了日（治療１４日目）に皮膚拡大鏡を用いて観察し、肥大傷痕の生成程度によって次の［表１］のように目視評価に対するスコアを付与した。

【0063】

【表1】

【0064】

図８から分かるように、創傷後３週間自然治癒して肥大傷痕が生成された時点（Ｄａｙ ０）では、対照群および各試験群間に目視評価スコアで有意差がなかった。これは、各試験群で肥大傷痕が類似に生成されたことを意味する。

【0065】

しかしながら、２週間の治療を終了した時点（Ｄａｙ １４）では、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）および溶媒処理群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物を処理した試験群においてそれぞれ評価スコアが顕著に低く現れた。評価スコアが低いというのは、肥大傷痕のサイズが正常な傷痕に近く減少したことを意味する。

【0066】

３）表皮厚さ（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の分析
固定されたウサギの耳組織のパラフィンブロックを製作し、３μｍの厚さで切片し、組織スライドを製作した。水和過程を経てヘマトキシリン・エオジン溶液で染色を進めた。染色された組織スライドを２００倍率で顕微鏡撮影し、ＺＥＩＳＳ ＺＥＮ 顕微鏡ソフトウェアを用いて表皮厚さを測定した。

【0067】

図９から分かるように、肥大傷痕が生成された対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と溶媒処理群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）は、正常皮膚（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて、表皮の厚さが有意に増加したが（ｐ＜０．０５）、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９処理群は、対照群および溶媒処理群に比べて、平均的に薄い表皮厚さが観察された。

【0068】

４）瘢痕隆起指数（Ｓｃａｒ Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）の分析
固定されたウサギの耳組織を表皮厚さ分析法と同一にヘマトキシリン・エオジン溶液で染色を進め、染色された組織スライドを５０倍率で撮影した。ＺＥＩＳＳ ＺＥＮ 顕微鏡ソフトウェアを用いて傷痕部位と正常皮膚に対して表皮から軟骨までの長さを測定し、当該結果から瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）を算出した。ここで、瘢痕隆起指数（ＳＥＩ）は、「傷痕部位で最も厚い地点の表皮から軟骨までの長さ」を「正常皮膚部位の表皮から軟骨までの長さ」で割った値である。

【0069】

図１０から分かるように、肥大傷痕が生成された対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と溶媒処理群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）は、正常皮膚（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて、ＳＥＩ値が有意に増加したが（ｐ＜０．０５）、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９処理群は、対照群および溶媒処理群に比べて、平均的に低いＳＥＩ値が観察された。

【0070】

５）コラーゲン密度（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｎｓｉｔｙ）の分析
固定されたウサギの耳組織を用いてパラフィンブロックを製作し、３μｍの厚さで切片し、組織スライドを製作した。水和過程を経てビーブリッヒ・スカーレット－酸フクシン溶液で５分間染色および洗浄過程を実施した後、さらに、リンタングステン酸／リンモリブデン酸で５分間染色を進めた。

【0071】

次に、アニリンブルー・酢酸溶液で染色を進め、染色された組織スライドを４００倍率で撮影した。撮影された写真において全体面積のうち青色で染色された部分、すなわちコラーゲンが占める面積の割合をＩｍａｇｅ Ｊ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）で分析した。

【0072】

図１１から分かるように、肥大傷痕が生成された対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と溶媒処理群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）は、正常皮膚（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて、コラーゲン密度が有意に減少し、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９処理群は、対照群および溶媒処理群と比較して、平均的にさらに低いコラーゲン密度が観察された。

【0073】

６）評価および分析
図８から分かるように、ウサギの耳の創傷が３週間自然治癒しながら形成された肥大傷痕をＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物で治療した結果、対照群や溶媒処理群に比べて、肥大傷痕のサイズが顕著に減少した。また、図９、図１０および図１１の試験結果では、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物を処理した試験群において表皮厚さと瘢痕隆起指数およびコラーゲン密度が相対的に減少した。

【0074】

このような試験結果は、本発明のＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物がコラーゲン密度と表皮厚さを減少させて、結果的に、肥大傷痕の生成を抑制する効能があることを意味する。

【0075】

［結論］
本発明の［化学式１］化合物を代表するＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物は、線維化関連細胞である線維芽細胞、角質細胞、血管内皮細胞において全部類似のレベルで細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加を抑制し、さらには、細胞の増殖とα－ＳＭＡおよび細胞外基質であるコラーゲンの合成を抑制する効能を有することが確認された。また、ＣＢＭ－Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ９化合物は、ウサギの肥大傷痕モデルで創傷による肥大傷痕の生成を抑制する効能を有することが確認された。

【0076】

現実的条件上、すべての［化学式１］化合物に対して同じ効能試験を実施しない限界があるが、薬物動力学的な経験によれば、前記試験から除外された他の［化学式１］化合物も、前記ＣＢＭ－Ｎ１～Ｎ１０化合物と同一または類似の薬理作用を示すことが予想される。したがって、本発明による［化学式１］ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、全部肥厚性瘢痕およびケロイドの生成を効果的に抑制または治療する効能を有するといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】