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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】改変タンパク質の選択的分解のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240725BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240725BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240725BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240725BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240725BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240725BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240725BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240725BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/00 ZNA
C07K14/47
C07K16/30
C07K16/18
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N5/0783
C12Q1/02
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506674
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-01
(86)【国際出願番号】 US2022074589
(87)【国際公開番号】W WO2023015283
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】63/230,225
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508027464
【氏名又は名称】セルジーン コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＧＥＮＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100221523
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 渉
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(72)【発明者】
【氏名】キャロル，クリストファー ウォルトン
(72)【発明者】
【氏名】ダゴスティーノ，ローラ アクリアン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，ハイボー
(72)【発明者】
【氏名】シャンムガスンダラム，ビールバフー
(72)【発明者】
【氏名】バラハス，ブルック
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA08
4B063QQ61
4B063QR80
4B063QS36
4B063QX02
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA20
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、分解ドメインを含む改変ポリペプチド、化合物、組成物、並びにそれらの調製方法および細胞内の改変タンパク質を分解するためのものとしてのそれらの使用方法に関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分解ドメインを含む改変ポリペプチドであって、前記分解ドメインが、アミノ酸配列ＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４（配列番号１）を含み、Ｘ１が、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、バリン、スレオニン、およびフェニルアラニンから選択され、
Ｘ２が、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンから選択され、
Ｘ３が、アラニン、セリン、システイン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびグリシンから選択され、
Ｘ４が、セリン、メチオニン、リシン、イソロイシン、バリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選択される、
改変ポリペプチド。
【請求項2】
Ｘ１が、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、バリン、スレオニン、およびフェニルアラニンから選択され、Ｘ２が、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、およびメチオニンから選択され、
Ｘ３が、アラニン、セリン、システイン、およびグリシンから選択され、
Ｘ４が、セリン、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選択される、
請求項１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項3】
前記分解ドメインが、アミノ酸配列ＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５（配列番号２）を含み、Ｘ５が、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、チロシン、システイン、およびグルタミンから選択される、
請求項１または２に記載の改変ポリペプチド。
【請求項4】
Ｘ５が、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、チロシン、およびグルタミンから選択される、請求項３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項5】
Ｘ５が、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、チロシン、およびグルタミンから選択される、請求項３または４に記載の改変ポリペプチド。
【請求項6】
Ｘ５が、フェニルアラニンである、請求項３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項7】
Ｘ１が、アスパラギンである、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項8】
Ｘ２が、グルタミンである、請求項１～７のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項9】
Ｘ３が、アラニンまたはセリンである、請求項１～８のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項10】
Ｘ３が、アラニンである、請求項９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項11】
Ｘ４が、セリンである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項12】
前記分解ドメインが、アミノ酸配列ＦＣＮＱＣＧＡＳ（配列番号３）を含む、請求項１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項13】
前記分解ドメインが、少なくとも１つのジンクフィンガードメインを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項14】
前記分解ドメインが、２つのジンクフィンガードメインを含む、請求項１３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項15】
少なくとも１つの、またはそれぞれのジンクフィンガードメインが、独立して、配列番号２０～４７および５８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項16】
前記分解ドメインが、ヒトＩｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、またはＥｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項17】
前記分解ドメインが、第２のジンクフィンガードメインを含み、前記第２のジンクフィンガードメインが、ヒトＩｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、またはＥｏｓのジンクフィンガー１（ＺＮＦ１）またはＺＮＦ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１６に記載の改変ポリペプチド。
【請求項18】
前記分解ドメインが、ヒトＩｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、またはＥｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）およびジンクフィンガー３（ＺＮＦ３）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項19】
前記分解ドメインが、配列番号２１、２７、３２、および３８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項20】
前記分解ドメインが、配列番号１５、６０、６１、および６２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項21】
前記分解ドメインが、配列番号６、６３、６４、および６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項22】
前記分解ドメインが、以下：ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号５）；
ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＳＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６６）；
ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６７）；および
ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６８）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項23】
前記分解ドメインが、以下：ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７）；
ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＳＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６９）；
ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７０）；および
ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７１）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項24】
分解薬の存在下でユビキチン化される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドであって、前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する小分子である、改変ポリペプチド。
【請求項25】
分解薬の存在下で分解される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドであって、前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する小分子である、改変ポリペプチド。
【請求項26】
前記分解薬が、セレブロンにも結合する、請求項２４または２５に記載の改変ポリペプチド。
【請求項27】
前記分解薬が、前記分解ドメイン、分解薬、およびセレブロンを含む複合体を媒介する、請求項２６に記載の改変ポリペプチド。
【請求項28】
前記分解薬が、【化1】
【請求項29】
前記分解薬の存在下、細胞内でユビキチン化される、および／または分解される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項30】
前記細胞が、インビトロである、請求項２９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項31】
前記細胞が、インビボである、請求項２９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項32】
実質的に細胞内の細胞質または核であり、膜貫通ドメインを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項33】
前記分解ドメインが、内在性タンパク質と融合するか、または内在性タンパク質の内部に位置する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項34】
前記内在性タンパク質が、哺乳動物タンパク質である、請求項３３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項35】
前記内在性タンパク質が、ヒトタンパク質である、請求項３３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項36】
前記内在性タンパク質が、ＰＲＤＭ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＡＳＰ８、ＣＢＬＢ、ＣＤ５、ＣＩＳＨ、ＣＧＫＡ、ＤＧＫｚ、ＭＡＰ４Ｋ１、ＡＲＩＤ２、ＢＡＣＨ２、ＣＨＸ３７、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ６、ＭＡＦ、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＯＸ、ＺＢＴＢ３２、ＰＴＰＮ２、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＩＴＫ、ＰＡＧ１、ＰＤＣＤ４、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＲＢＭ１、ＳＴＫ４、ＴＥＴ２、ＢＮＩＰ３、ＦＡＳ、ＣＢＬ、ＢＧＡＴ５、ＲＮＦ１２８、ＳＴＫ１７Ｂ、ＴＲＩＢ１、ＴＸＮＩＰ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＢＡＴＦ、ＦＬＩ１、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＲＦ４、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ４Ｋ４、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＲＥＬＢ、ＴＭＥＭ１７３、ＵＳＰ１０、ＭＴ１Ａ、ＰＰ２Ａファミリーメンバー、ＲＡＳＡ２、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＡＨＲ、ＣＤ７０、ＬＨＡＬＳ１、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＴＡＺ、ＵＳＰ２１、またはＹＡＰ１である、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項37】
前記内在性タンパク質の生物活性が、前記改変ポリペプチドにおいて実質的に保持される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項38】
膜貫通ドメインを含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項39】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＬＡＢ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである、請求項３８に記載の改変ポリペプチド。
【請求項40】
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、請求項３８または３９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項41】
前記細胞外ドメインが、リガンド、リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメインを含む、請求項４０に記載の改変ポリペプチド。
【請求項42】
前記細胞外ドメインが、抗原結合ドメインを含む、請求項４１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項43】
前記抗原結合ドメインが、がん抗原に結合する、請求項４２に記載の改変ポリペプチド。
【請求項44】
前記抗原結合ドメインが、４－１ＢＢ、５Ｔ４、８Ｈ９、Ｂ７－Ｈ６、腺癌抗原、a－フェトプロテイン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＢＡＦＦＲ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ９、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（Ｔ ＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０ ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１５２、ＣＤ１７１、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＥ７、ＣＥＡ、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＬＡＵＤＩＮ６、ＣＬＡＵＤＩＮ１８．３、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲγＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、Ｆｅｔａｌ ＡｃｈＲ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、葉酸受容体ａ、葉酸受容体１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、糖タンパク質７５、ＧＰ ＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ（ｈｕｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ）、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧｌ、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＩＬ－１１受容体ａ、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンａ５Ｉ３１、インテグリンａｖＩ３３、カッパ軽鎖、Ｌｌ－ＣＡＭ、ラムダ軽鎖、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、メソテリン、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣｌ、ＭＵＣｌ ６、ムチンＣａｎＡｇ、ＮＣＡＭ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＰＣ－ＩＣ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺癌細胞、ＰＳＭＡ、ＰＳＣ１、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ｓｐｌ７、ＴＡＧ７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ β２、ＴＧＦ－Ｉ３、ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、および／またはビメンチンから選択される抗原に結合する、請求項４２または４３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項45】
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項46】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項47】
前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体抗原結合ドメインを含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項48】
前記細胞内ドメインが、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項49】
前記細胞内ドメインが、２つの共刺激ドメインを含む、請求項４８に記載の改変ポリペプチド。
【請求項50】
少なくとも１つの共刺激ドメインが、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、Ｋ細胞活性化受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－Ｌ ＬＦＡ－１（ＣＤ１ｌａ／ＣＤ１８）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＲＡＮＫ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、Ｋｐ８０（ＫＬＲＦ１）、Ｋｐ４４、Ｋｐ３０、Ｋｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｐ、ＩＬ２Ｒｐ、ＩＬ２Ｒｙ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ１８、ＣＤ１３２、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＫＧ２Ｄ、ＫＧ２Ｃ、ＴＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡ ＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３のリガンド、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、および／またはシグナル伝達リンパ球活性化分子から選択される受容体タンパク質の共刺激ドメインである、請求項４８または４９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項51】
４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項４８または４９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項52】
前記細胞内ドメインが、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、請求項４０～５１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項53】
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）シグナル伝達ドメインである、請求項５２に記載の改変ポリペプチド。
【請求項54】
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃＥＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２から選択される受容体タンパク質のシグナル伝達ドメインである、請求項５２または５３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項55】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項５４に記載の改変ポリペプチド。
【請求項56】
アミノ末端からカルボキシ末端まで、（ｉ）細胞外ドメイン［ＥＣＤ］－膜貫通ドメイン［ＴＭ］－共刺激ドメイン［ＣｏＤ］－シグナル伝達ドメイン［ＳｉｇＤ］－分解ドメイン［ＤＤ］；または（２）ＥＣＤ－ＴＭ－ＣｏＤ－ＤＤ－ＳｉｇＤ；または（３）ＥＣＤ－ＴＭ－ＤＤ－ＣｏＤ－ＳｉｇＤを含む、請求項４０～５５のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項57】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４０～５６のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項58】
１つ以上のドメイン間に１つ以上のペプチドリンカーを含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項59】
細胞内に含まれる、請求項１～５８のいずれか１項に記載の改変ポリペプチド。
【請求項60】
前記細胞が、ヒトエフェクター細胞である、請求項５９に記載の改変ポリペプチド。
【請求項61】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６０に記載の改変ポリペプチド。
【請求項62】
請求項１～６１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項63】
請求項６２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項64】
請求項６２に記載の核酸分子または請求項６３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項65】
請求項１～６１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドを含む、細胞。
【請求項66】
ヒトエフェクター細胞である、請求項６４または６５に記載の細胞。
【請求項67】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６４～６６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項68】
Ｔ細胞である、請求項６７に記載の細胞。
【請求項69】
エフェクターＴ細胞である、請求項６８に記載の細胞。
【請求項70】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項６８に記載の細胞。
【請求項71】
請求項６４～７０のいずれか１項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項72】
請求項１～６１のいずれか１項に記載の改変ポリペプチドのレベルを減少させる方法であって、前記改変ポリペプチドを【化2】
【請求項73】
細胞における改変ポリペプチドのレベルを減少させる方法であって、請求項６４～７０のいずれか１項に記載の細胞を【化3】
【請求項74】
対象内の細胞における改変ポリペプチドのレベルを減少させる方法であって、前記方法が、前記対象に【化4】
【請求項75】
前記細胞が、ヒトエフェクター細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項77】
前記改変ポリペプチドが、前記分解薬の存在下でユビキチン化される、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
前記改変ポリペプチドが、前記分解薬の存在下で分解される、請求項７２～７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する、請求項７２～７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項80】
前記分解薬が、セレブロンにも結合する、請求項７２～７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項81】
前記分解薬が、前記分解ドメイン、分解薬、およびセレブロンを含む複合体を媒介する、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
対象における疾患または障害を治療する方法であって、前記対象に請求項６４～７０のいずれか１項に記載の細胞を投与することを特徴とする、方法。
【請求項83】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
前記細胞が、エフェクターＴ細胞である、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項８３に記載の方法。
【請求項86】
前記細胞が、請求項５７に記載の改変ポリペプチドを含む、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項87】
前記疾患または障害が、がんである、請求項８２～８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項88】
前記がんが、血液がんまたは固形がんから選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記血液がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群である、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記固形がんが、脳癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、子宮癌、皮膚癌、肝癌、骨癌、膵癌、卵巣癌、精巣癌、膀胱癌、腎癌、頭頸部癌、胃癌、子宮頸癌、直腸癌、喉頭癌、および食道癌である、請求項８８に記載の方法。
【請求項91】
前記細胞を前記対象に投与する前に、前記細胞をエクスビボで分解薬と接触させる、請求項８２～９０のいずれか１項に記載の方法であって、前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する小分子である、方法。
【請求項92】
前記細胞を前記対象に、分解薬と一緒に投与することを特徴とする、請求項８２～９０のいずれか１項に記載の方法であって、前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する小分子である、方法。
【請求項93】
前記細胞を前記対象に投与した後に、分解薬を投与することを特徴とする、請求項８２～９０のいずれか１項に記載の方法であって、前記分解薬が、前記分解ドメインに結合する小分子である、方法。
【請求項94】
前記分解薬が、【化5】
【請求項95】
【化6】
【請求項96】
請求項９５に記載の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月６日出願の米国仮出願第６３／２３０，２２５号の優先権を主張し、あらゆる目的のために、参照によってその全体が組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月６日出願の米国仮出願第６３／２３０，２２５号の優先権を主張し、あらゆる目的のために、参照によってその全体が組み込まれる。
【0002】
分野
本開示は、分解ドメインを含む改変ポリペプチド、化合物、組成物、並びにそれらの調製方法および細胞内の改変タンパク質を分解するためのものとしてのそれらの使用方法に関する。
本開示は、分解ドメインを含む改変ポリペプチド、化合物、組成物、並びにそれらの調製方法および細胞内の改変タンパク質を分解するためのものとしてのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞などの、改変異種ポリペプチドを含む改変細胞が、治療に用いるために開発されている。かかる改変異種ポリペプチドの発現レベルの調節は、例えば、副作用の減少および／または改変細胞の有効性の向上により、改変細胞の治療効果を改善する場合がある。
【0004】
したがって、一つの態様において、改変ポリペプチドおよび分解薬が本明細書で提供され、ここで改変ポリペプチドは、分解ドメインが分解薬に結合するときに細胞内でユビキチン化を媒介する、分解ドメインを含む。
。
。
【発明の概要】
【0005】
特定の実施形態において、細胞における異種ポリペプチドのレベルを調節するための化合物およびその組成物が、本明細書に記載される。様々な実施形態において、化合物およびその組成物は、細胞における異種ポリペプチドのレベルを減少させるために使用される場合がある。
【0006】
本願の実施形態は、非限定的な実施形態を例示することを意図する詳細な説明および実施例を参照することによって、より完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1A-1】図１Ａは、ヒトＩＫＺＦファミリータンパク質ＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の配列アライメント（配列番号４８～５２）を示す。図１Ｂは、ヒトＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の推定Ｇモチーフ含有ジンクフィンガー配列の表を示す。Ｇモチーフ配列には下線が付される。
【図1A-2】図１Ａは、ヒトＩＫＺＦファミリータンパク質ＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の配列アライメント（配列番号４８～５２）を示す。図１Ｂは、ヒトＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の推定Ｇモチーフ含有ジンクフィンガー配列の表を示す。Ｇモチーフ配列には下線が付される。
【図1B】図１Ａは、ヒトＩＫＺＦファミリータンパク質ＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の配列アライメント（配列番号４８～５２）を示す。図１Ｂは、ヒトＩＫＺＦ１～ＩＫＺＦ５の推定Ｇモチーフ含有ジンクフィンガー配列の表を示す。Ｇモチーフ配列には下線が付される。
【図5A】図５Ａは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、２、および／または３デグロンを含むＣＡＲの模式図を示す。ＣＡＲのそれぞれは、Ｎ末端ＣＤ１９結合ｓｃＦｖも含む。図５Ｂは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲが活性を保持することを示す。図５Ｃは、化合物Ａの濃度を上げていったときの、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲの分解を示す。図５Ｄは、分解が野生型ＩＫＺＦ１デグロンに特異的であることを示す。
【図5B】図５Ａは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、２、および／または３デグロンを含むＣＡＲの模式図を示す。ＣＡＲのそれぞれは、Ｎ末端ＣＤ１９結合ｓｃＦｖも含む。図５Ｂは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲが活性を保持することを示す。図５Ｃは、化合物Ａの濃度を上げていったときの、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲの分解を示す。図５Ｄは、分解が野生型ＩＫＺＦ１デグロンに特異的であることを示す。
【図5C】図５Ａは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、２、および／または３デグロンを含むＣＡＲの模式図を示す。ＣＡＲのそれぞれは、Ｎ末端ＣＤ１９結合ｓｃＦｖも含む。図５Ｂは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲが活性を保持することを示す。図５Ｃは、化合物Ａの濃度を上げていったときの、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲの分解を示す。図５Ｄは、分解が野生型ＩＫＺＦ１デグロンに特異的であることを示す。
【図5D】図５Ａは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、２、および／または３デグロンを含むＣＡＲの模式図を示す。ＣＡＲのそれぞれは、Ｎ末端ＣＤ１９結合ｓｃＦｖも含む。図５Ｂは、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲが活性を保持することを示す。図５Ｃは、化合物Ａの濃度を上げていったときの、Ｃ末端ＩＫＺＦ１デグロンを有するＣＡＲの分解を示す。図５Ｄは、分解が野生型ＩＫＺＦ１デグロンに特異的であることを示す。
【図8】図８は、特定のヒトＩＫＺＦファミリーメンバーのＧモチーフ含有Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー（配列番号２１、３２、２７、３８、４０、２９、４７、３１、２３、２０、２６、および３７）のアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
詳細な説明
本明細書で使用される「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、互換的に使用され得る。「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、言及される、記載された特徴または構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、一つ以上の特徴、または構成要素、またはそれらの群の存在または付加を排除しない。さらに、「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、「からなる（consisting of）」という用語によって包含される例を含むことが意図される。結果的に、「からなる（consisting of）」という用語は、より具体的な本発明の実施形態を提供するために、「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語の代わりに使用され得る。
本明細書で使用される「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、互換的に使用され得る。「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、言及される、記載された特徴または構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、一つ以上の特徴、または構成要素、またはそれらの群の存在または付加を排除しない。さらに、「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、「からなる（consisting of）」という用語によって包含される例を含むことが意図される。結果的に、「からなる（consisting of）」という用語は、より具体的な本発明の実施形態を提供するために、「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語の代わりに使用され得る。
【0009】
「からなる（consisting of）」という用語は、特許発明の対象が、それをなす、記載される特徴または構成要素の少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％を有することを意味する。もう一つの実施形態において、「からなる（consisting of）」という用語は、あらゆる後に続く列挙の範囲から、あらゆるその他の特徴または構成要素を除外し、達成されるべき技術的効果にとって必要不可欠でないものを除く。
【0010】
本明細書で使用される「または（or）」という用語は、いずれか１つまたはあらゆる組み合わせを意味する両立的な「または」として解釈されるべきである。したがって、「Ａ、Ｂ、またはＣ」は、以下のいずれかを意味する：「Ａ；Ｂ；Ｃ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ、Ｂ、およびＣ」。この定義の例外は、要素、機能、ステップ、または行為の組み合わせが、何らかの形で本質的に相互排他的である場合にのみ生じる。
【0011】
本明細書において、あらゆる濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に断らない限り、記載される範囲内のあらゆる整数の値、および適切な場合にはその分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むことが理解されるべきである。また、あらゆる物理的特徴（例えば高分子サブユニット、大きさ、または厚さなど）に関する、本明細書に記載されるあらゆる数値範囲は、特に断らない限り、記載される範囲内のあらゆる整数を含むことが理解されるべきである。本明細書で使用される「約（about）」および「およそ（approximately）」という用語は、特に断らない限り、示される範囲、値、または構造の±２０％、±１０％、±５％、または±１％を意味する。
【0012】
本明細書で使用される「改変ポリペプチド（engineered polypeptide）」は、天然に存在しないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。改変ポリペプチドの一部が天然に存在する場合があるが、改変ポリペプチド全体としては天然に存在しない。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、例えば分解ドメインに融合したり、あるいは分解ドメインを挿入したりすることで改変された、天然に存在するアミノ酸配列を含む。いくつかのかかる実施形態において、得られた改変ポリペプチドは、元の天然に存在するポリペプチドの活性を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、２つ以上の、または３つ以上の、または４つ以上の天然に存在するポリペプチドに由来する２つ以上の、または３つ以上の、または４つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、分解ドメインを含む。
【0013】
本明細書で使用される「デグロン」および「分解ドメイン」は互換的に使用され、細胞内のポリペプチドに存在するときに、分解ドメインおよびユビキチンリガーゼの両方に結合する化合物の存在下で、ユビキチンリガーゼによるポリペプチドのユビキチン化を引き起こすアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、化合物は、分解ドメインおよびセレブロンに結合する。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、分解ドメインを含む。ユビキチンリガーゼによるユビキチン化の後、分解ドメインを含むポリペプチドは、分解される場合がある。
【0014】
代表的な改変ポリペプチド
分解ドメインを含む改変ポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、ＣＡＲである。いくつかの実施形態において、かかるポリペプチドは、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、および細胞内ドメインを含む。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインは、改変ポリペプチドの細胞内ドメインに位置する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、リガンド、リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、がん抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖または重鎖可変領域、またはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインなどの少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、以下でさらに記載されるような分解ドメインを含むＣＡＲである。
分解ドメインを含む改変ポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、ＣＡＲである。いくつかの実施形態において、かかるポリペプチドは、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、および細胞内ドメインを含む。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインは、改変ポリペプチドの細胞内ドメインに位置する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、リガンド、リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、がん抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖または重鎖可変領域、またはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインなどの少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、以下でさらに記載されるような分解ドメインを含むＣＡＲである。
【0015】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、分解ドメインが遺伝子操作によって挿入されているか、あるいは分解ドメインが融合している、天然に存在するタンパク質に基づく。結果として生じる改変ポリペプチドは、追加の天然に存在するアミノ酸配列または天然に存在しないアミノ酸配列を含む場合がある。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、天然に存在する核または細胞質タンパク質に基づく。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質の活性を実質的に保持する。改変ポリペプチドの分解は、改変ポリペプチドを発現する細胞を、例えば投与などによって、分解薬と接触させることで達成される場合がある。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインは、Ｉｋａｒｏｓ Ｆａｍｉｌｙ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ（ＺＮＦ）アミノ酸配列に由来し、分解薬は、Ｅ３リガーゼなどのユビキチンリガーゼに結合する小分子である。分解ドメインを含む改変ポリペプチドを発現する細胞に分解薬を投与すると、Ｅ３リガーゼによる分解ドメインを含む改変ポリペプチドのユビキチン化および改変ポリペプチドの分解を引き起こす。いくつかの実施形態において、分解薬は、セレブロンおよび分解ドメインに結合する化合物である。
【0016】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質および天然に存在するタンパク質に融合される、あるいは挿入される分解ドメインを含む。分解ドメインがタンパク質に「融合」される場合、改変ポリペプチドは、アミノ酸リンカーなどの、分解ドメインとタンパク質とを結合するリンカーを含む場合がある。かかるアミノ酸リンカーはどのような長さであってもよく、例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、または１～５個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸リンカーは、グリシンおよびセリンから構成される。
【0017】
分解ドメインが融合される場合がある、あるいは分解ドメインが挿入される場合がある代表的なタンパク質には、これらに限定されないが、ＰＲＤＭ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＡＳＰ８、ＣＢＬＢ、ＣＤ５、ＣＩＳＨ、ＣＧＫＡ、ＤＧＫｚ、ＭＡＰ４Ｋ１、ＡＲＩＤ２、ＢＡＣＨ２、ＣＨＸ３７、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ６、ＭＡＦ、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＯＸ、ＺＢＴＢ３２、ＰＴＰＮ２、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＩＴＫ、ＰＡＧ１、ＰＤＣＤ４、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＲＢＭ１、ＳＴＫ４、ＴＥＴ２、ＢＮＩＰ３、ＦＡＳ、ＣＢＬ、ＢＧＡＴ５、ＲＮＦ１２８、ＳＴＫ１７Ｂ、ＴＲＩＢ１、ＴＸＮＩＰ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＢＡＴＦ、ＦＬＩ１、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＲＦ４、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ４Ｋ４、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＲＥＬＢ、ＴＭＥＭ１７３、ＵＳＰ１０、ＭＴ１Ａ、ＰＰ２Ａファミリーメンバー、ＲＡＳＡ２、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＡＨＲ、ＣＤ７０、ＬＨＡＬＳ１、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＴＡＺ、ＵＳＰ２１、またはＹＡＰ１が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ヒトタンパク質などの哺乳動物タンパク質である。
【0018】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、細胞内の内在性タンパク質に融合されるか、あるいは挿入される。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインをコードする配列は、内在性タンパク質に融合される、あるいは挿入される分解ドメインを含む内在性タンパク質を発現する、改変ポリペプチドが発現されるような細胞のゲノムに挿入される場合がある。核酸配列（分解ドメインをコードする配列など）を細胞のゲノムに挿入する様々な方法が当技術分野で既知であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介した、もしくは非ウイルス相同組換え、レンチウイルス形質導入、またはトランスポゾンデリバリーが挙げられる。いくつかの実施形態において、分解ドメインをコードする核酸配列は、免疫細胞（例えばＴリンパ球など）内の内在性タンパク質に融合されるか、あるいは挿入される。いくつかのかかる実施形態において、Ｔ細胞は単離され、改変ポリペプチドを発現するように改変され、患者に投与される。患者への投与後、改変ポリペプチドの分解が望ましい場合に分解薬が続いて投与される場合がある。
【0019】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドをコードする核酸配列は、細胞に導入される。核酸を細胞に導入する方法は当技術分野で既知であり、例えば、本明細書に記載される改変ポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む、合成ベクター、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または同類のものが挙げられる。
【0020】
代表的な分解ドメイン
本明細書で提供される改変ポリペプチドは、分解ドメインを含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、分解薬に結合するアミノ酸配列を含む。分解薬は、分解ドメインおよびユビキチンリガーゼと結合し、改変ポリペプチドのユビキチン化を引き起こす。
本明細書で提供される改変ポリペプチドは、分解ドメインを含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、分解薬に結合するアミノ酸配列を含む。分解薬は、分解ドメインおよびユビキチンリガーゼと結合し、改変ポリペプチドのユビキチン化を引き起こす。
【0021】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、Ｉｋａｒｏｓファミリータンパク質（例えばＩｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、Ｅｏｓ、またはＰｅｇａｓｕｓなど）のＧモチーフに由来するアミノ酸配列を含む。非限定的な代表的なＧモチーフは、図１Ｂに示される配列に下線が付されている。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される分解ドメインは、１位のアミノ酸をフェニルアラニン（Ｆ）に置換することで天然のＧモチーフ配列から改変されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、１位にＱを天然に含むＧモチーフに由来するので、分解ドメインはＱ１Ｆ置換を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列ＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、バリン、スレオニン、およびフェニルアラニンから選択され；Ｘ２は、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンから選択され；Ｘ３は、アラニン、セリン、システイン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびグリシンから選択され；Ｘ４は、セリン、メチオニン、リシン、イソロイシン、バリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、バリン、スレオニン、およびフェニルアラニンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、およびメチオニンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ３は、アラニン、セリン、システイン、およびグリシンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ４は、セリン、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、アスパラギンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、グルタミンである。いくつかの実施形態において、Ｘ３は、アラニンまたはセリンである。いくつかの実施形態において、Ｘ３は、アラニンである。いくつかの実施形態において、Ｘ４は、セリンである。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドの分解ドメインは、アミノ酸配列ＦＣＮＱＣＧＡＳ（配列番号３）を含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列ＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５（配列番号２）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、上記で定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、チロシン、システイン、およびグルタミンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、チロシン、およびグルタミンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、チロシン、およびグルタミンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ５は、フェニルアラニンである。
【0024】
様々な実施形態において、分解ドメインは、上記の改変Ｇモチーフを含む少なくとも１つのジンクフィンガードメインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのジンクフィンガードメインは、Ｉｋａｒｏｓファミリータンパク質（例えばＩｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、Ｅｏｓ、またはＰｅｇａｓｕｓなど）に由来する。Ｇモチーフを含む非限定的な代表的なジンクフィンガーは、図１Ｂに示される。様々な実施形態において、分解ドメインは、１つ、２つ、３つ、または４つのジンクフィンガードメインを含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、Ｇモチーフを含む１つのジンクフィンガードメインおよびＧモチーフを含まない少なくとも１つのジンクフィンガードメインを含む。ジンクフィンガードメインは、同一のタンパク質に由来してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、２つのジンクフィンガードメインを含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）、および少なくとも１つの追加のジンクフィンガードメイン（Ｉｋａｒｏｓファミリータンパク質の少なくとも１つの追加のジンクフィンガードメインなど）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）およびヒトＩｋａｒｏｓのＺＮＦ１またはＺＮＦ３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓのジンクフィンガー２（ＺＮＦ２）およびジンクフィンガー３（ＺＮＦ３）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓの１４５～１６７位のアミノ酸（ＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ；配列番号２１）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＨｅｌｉｏｓの１４０～１６２位のアミノ酸（ＦＨＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ；配列番号２７）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＡｉｏｌｏｓの１４６～１６８位のアミノ酸（ＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ；配列番号３２）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＥｏｓの１８７～２０９位のアミノ酸（ＦＨＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ；配列番号３８）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓの１４１～１６８位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳ；配列番号１５）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＨｅｌｉｏｓの１３６～１６３位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＨＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳ；配列番号６０）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＡｉｏｌｏｓの１４２～１６９位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴ；配列番号６１）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＥｏｓの１８３～２１０位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＨＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳ；配列番号６２）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＩｋａｒｏｓの１４１～１９６位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣ ＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬ ＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥ ＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹ ＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧ ＨＬＲＴＨＳ；配列番号６）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＨｅｌｉｏｓの１３６～１９１位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＨＣＮＱＣ ＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬ ＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥ ＫＰＦＫＣＰＦＣＳＹ ＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧ ＨＬＲＴＨＳ；配列番号６３）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＡｉｏｌｏｓの１４２～１９７位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣ ＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬ ＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥ ＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹ ＡＣＱＲＲＤＡＬＴＧ ＨＬＲＴＨＳ；配列番号６４）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ヒトＥｏｓの１８３～２３８位のアミノ酸（ＧＥＲＰＦＨＣＮＱＣ ＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬ ＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥ ＫＰＦＫＣＰＦＣＮＹ ＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧ ＨＬＲＴＨＳ；配列番号６５）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号５）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４、およびＸ５は、上記で定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＳＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６６）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４、およびＸ５は、上記で定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６７）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４、およびＸ５は、上記で定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６８）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４、およびＸ５は、上記で定義されるとおりである。
【0030】
いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＳＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号６９）を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７０）を含む。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、アミノ酸配列：ＧＥＲＰＦＦＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳＧＥＫＰＦＫＣＰＦＣＮＹＡＣＲＲＲＤＡＬＴＧＨＬＲＴＨＳ（配列番号７１）を含む。
【0031】
代表的なキメラ抗原受容体コンストラクト
ＣＡＲの発現を分解薬の存在下でそれを分解することによって調節する能力は、ＣＡＲ発現を調節する能力がない場合と比べて多くの利点を有する。例えば、ＣＡＲを発現する治療用免疫細胞によってもたらされるオンターゲット・オフ腫瘍効果は、毒性をもたらす可能性があるが、ＣＡＲを分解することによって減少または除去することができる。強すぎるＣＡＲ介在免疫応答は、ＣＡＲを分解することによって減少または除去することができる。チェックポイントの慢性活性化および過剰発現によって引き起こされるＴ細胞機能不全は、ＣＡＲの発現の周期化および／またはＣＡＲの発現のタイトレーションによって回避できる。かかるＣＡＲ分解は、本明細書で提供される分解ドメインを含むＣＡＲを発現させ、必要に応じて分解薬を投与することによって達成される。いくつかのかかる実施形態において、分解薬は、Ｅ３リガーゼなどのユビキチンリガーゼに結合する小分子である。分解ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する細胞に分解薬を投与すると、Ｅ３リガーゼによる分解ドメインを含むＣＡＲポリペプチドのユビキチン化およびＣＡＲポリペプチドの分解を引き起こす。いくつかの実施形態において、分解薬は、セレブロンおよび分解ドメインに結合する化合物である。
ＣＡＲの発現を分解薬の存在下でそれを分解することによって調節する能力は、ＣＡＲ発現を調節する能力がない場合と比べて多くの利点を有する。例えば、ＣＡＲを発現する治療用免疫細胞によってもたらされるオンターゲット・オフ腫瘍効果は、毒性をもたらす可能性があるが、ＣＡＲを分解することによって減少または除去することができる。強すぎるＣＡＲ介在免疫応答は、ＣＡＲを分解することによって減少または除去することができる。チェックポイントの慢性活性化および過剰発現によって引き起こされるＴ細胞機能不全は、ＣＡＲの発現の周期化および／またはＣＡＲの発現のタイトレーションによって回避できる。かかるＣＡＲ分解は、本明細書で提供される分解ドメインを含むＣＡＲを発現させ、必要に応じて分解薬を投与することによって達成される。いくつかのかかる実施形態において、分解薬は、Ｅ３リガーゼなどのユビキチンリガーゼに結合する小分子である。分解ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する細胞に分解薬を投与すると、Ｅ３リガーゼによる分解ドメインを含むＣＡＲポリペプチドのユビキチン化およびＣＡＲポリペプチドの分解を引き起こす。いくつかの実施形態において、分解薬は、セレブロンおよび分解ドメインに結合する化合物である。
【0032】
（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激ドメインなどのＣＡＲの構成要素、および（ｂ）分解ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を含むか、またはそれからなる改変ポリペプチドが本明細書で提供される。分解ドメインに融合されるＣＡＲが、セレブロン結合化合物などの分解薬の存在下、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞）内で発現する場合、セレブロンなどのＥ３リガーゼおよびＣＡＲの分解ドメインが分解薬に結合し、分解ドメインをユビキチン化するＥ３リガーゼ複合体が形成される。それゆえ、本明細書に記載されるＣＡＲの活性（例えば、インビボ活性）は、分解ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞（例えば、前記ＣＡＲポリペプチドを発現するように改変されたＴリンパ球）をセレブロン結合化合物などの分解薬と接触させることで制御され得る。
【0033】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内一次シグナル伝達ドメイン、および分解ドメインを含むＣＡＲである改変ポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順に抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、一次Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激ドメイン、および分解ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ＣＡＲのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、分解ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。
【0035】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順に（ｉ）細胞外ドメイン［ＥＣＤ］－膜貫通ドメイン［ＴＭ］－共刺激ドメイン［ＣｏＤ］－シグナル伝達ドメイン［ＳｉｇＤ］－分解ドメイン［ＤＤ］を含むＣＡＲである。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順にＥＣＤ－ＴＭ－ＣｏＤ－ＤＤ－ＳｉｇＤを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順にＥＣＤ－ＴＭ－ＤＤ－ＣｏＤ－ＳｉｇＤを含むＣＡＲである。分解ドメインは、好ましくはドメインの望ましい活性が保持されるように、別のドメイン（例えば共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインなど）に挿入されることもある。
【0036】
代表的な抗原結合ドメイン
本明細書で提供されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のポリペプチドドメイン、モチーフ、または配列であり得る。
本明細書で提供されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のポリペプチドドメイン、モチーフ、または配列であり得る。
【0037】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、受容体の抗原結合部分である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍細胞によって産生されるリガンドの受容体である。
【0038】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部分である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体、抗体鎖、一本鎖抗体、またはそれらの抗原結合部分、Ｆｃドメイン、グリコホスファチジルイノシトールアンカードメイン、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【0039】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、ペプチド系高分子抗原結合剤、例えば、ファージディスプレイタンパク質である。
【0040】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによる抗原結合は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と関連する抗原提示に拘束される。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによる抗原結合は、ＭＨＣ非拘束性である。
【0041】
本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合/認識される抗原は、興味の対象となる任意の抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、細胞（例えば、固形腫瘍細胞または血液がん腫瘍細胞などの腫瘍細胞）の表面上に発現する抗原である。
【0042】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合／認識される抗原は、腫瘍細胞上の抗原であり、例えば、抗原は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。本明細書に記載されるＣＡＲによって認識され得る（すなわち、ＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合され得る）代表的な腫瘍細胞抗原には、これらに限らないが、４－１ＢＢ、５Ｔ４、８Ｈ９、Ｂ７－Ｈ６、腺癌抗原、ａ－フェトプロテイン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＢＡＦＦＲ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ９、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（Ｔ ＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０ ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１５２、ＣＤ１７１、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＥ７、ＣＥＡ、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＬＡＵＤＩＮ６、ＣＬＡＵＤＩＮ１８．３、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲγＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、Ｆｅｔａｌ ＡｃｈＲ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、葉酸受容体ａ、葉酸受容体１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、糖タンパク質７５、ＧＰ ＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧｌ、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＩＬ－１１受容体ａ、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンａ５Ｉ３１、インテグリンａｖＩ３３、カッパ軽鎖、Ｌｌ－ＣＡＭ、ラムダ軽鎖、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、メソテリン、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣｌ、ＭＵＣｌ ６、ムチンＣａｎＡｇ、ＮＣＡＭ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＰＣ－ＩＣ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺癌細胞、ＰＳＭＡ、ＰＳＣ１、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ｓｐｌ７、ＴＡＧ７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ β２、ＴＧＦ－Ｉ３、ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、および／またはビメンチンが挙げられる。
【0043】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合／認識される抗原は、リンパ腫/白血病、肺癌、乳癌、前立腺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒色腫、例えば、悪性黒色腫、皮膚癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、固形胚細胞腫瘍、肝芽腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫、粘液腫、線維腫、脂肪腫、または同類のものの腫瘍細胞上に発現するか、あるいはそれに関連する抗原である。
【0044】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合／認識される抗原は、慢性リンパ性白血病（小リンパ球性リンパ腫）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体腔液リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、Ｔ細胞性大顆粒リンパ球性白血病、急速進行性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（非特定）、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫の腫瘍細胞上に発現するか、あるいはそれに関連する抗原である。
【0045】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合／認識される抗原は、非腫瘍関連抗原または非腫瘍特異抗原である。特定の実施形態において、抗原は、腫瘍の状況、例えば、腫瘍環境に関連する。例えば、腫瘍は、腫瘍周囲の組織における炎症状態を引き起こし得、腫瘍内部および周辺における血管形成を促進する血管新生増殖因子、インターロイキン、および／またはサイトカインを放出し得る。それゆえ、特定の実施形態において、抗原は、増殖因子、サイトカイン、またはインターロイキン（例えば、血管新生または脈管形成血管新生または脈管形成と関連する増殖因子、サイトカイン、またはインターロイキン）である。かかる増殖因子、サイトカイン、およびインターロイキンには、これらに限らないが、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、およびインターロイキン－８（ＩＬ－８）を挙げることができる。
【0046】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合／認識される抗原は、腫瘍に起因する局所損傷に応答して正常組織によって放出されるダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ；別名アラーミン）である。本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインが結合し得る代表的なＤＡＭＰには、これらに限らないが、熱ショックタンパク質、クロマチン関連タンパク質高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢｌ）、Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８、カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４、カルグラニュリンＢ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、デオキシリボ核酸、アデノシン三リン酸、尿酸、およびヘパリン硫酸が挙げられる。
【0047】
代表的な膜貫通ドメイン
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」には、膜貫通ドメインを含むポリペプチドが細胞内および細胞外ドメインの両方を含む膜貫通ドメイン、並びに膜貫通ドメインを含むポリペプチドが細胞内ドメインを含むが細胞外ドメインを含まない膜アンカードメインが挙げられる。
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」には、膜貫通ドメインを含むポリペプチドが細胞内および細胞外ドメインの両方を含む膜貫通ドメイン、並びに膜貫通ドメインを含むポリペプチドが細胞内ドメインを含むが細胞外ドメインを含まない膜アンカードメインが挙げられる。
【0048】
本明細書に記載される改変ポリペプチドの膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインとして機能することが当技術分野で既知の、例えば、それが使用される状況で（例えばＣＡＲなどで）機能することが当業者によって既知の、任意の分子を含み得る。本明細書に記載される改変ポリペプチドの膜貫通ドメインは、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインから得ることができるか、あるいはそれに由来し得、かかる膜貫通ドメインの全部または一部を含み得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドの膜貫通ドメイン（例えばＣＡＲなど）は、Ｔ細胞受容体から得られるか、あるいはそれに由来し、例えば、本明細書に記載される改変ポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖から得られるか、あるいはそれに由来する。
【0050】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＬＡＢ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、または増殖因子受容体から得られるか、あるいはそれに由来する。
【0051】
代表的なシグナル伝達ドメイン
本明細書に記載されるCARの一次細胞シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達ドメインとして機能することが当技術分野で既知の、例えば、ＣＡＲの状況で機能することが当業者によって既知の、任意の分子を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞シグナル伝達ドメインは、一次Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
本明細書に記載されるCARの一次細胞シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達ドメインとして機能することが当技術分野で既知の、例えば、ＣＡＲの状況で機能することが当業者によって既知の、任意の分子を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞シグナル伝達ドメインは、一次Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【0052】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの一次細胞シグナル伝達ドメインは、ＺＡＰ－７０、またはそのシグナル伝達バリアントであるか、あるいはそれを含む。
【0053】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの一次細胞シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭであるか、それを含む。いくつかの実施形態において、前記ＩＴＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃＥＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２のＩＴＡＭである。
【0054】
代表的な共刺激ドメイン
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。本明細書に記載されるＣＡＲの共刺激ドメインは、共刺激ドメインとして機能することが当技術分野で既知の、例えば、ＣＡＲの状況で機能することが当業者によって既知の、任意の分子を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。本明細書に記載されるＣＡＲの共刺激ドメインは、共刺激ドメインとして機能することが当技術分野で既知の、例えば、ＣＡＲの状況で機能することが当業者によって既知の、任意の分子を含み得る。
【0055】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの共刺激ドメインは、共刺激ＣＤ２７ポリペプチド配列、共刺激ＣＤ２８ポリペプチド配列、共刺激ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ポリペプチド配列、共刺激４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）ポリペプチド配列、または共刺激誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）ポリペプチド配列から得られるか、あるいはそれに由来する。
【0056】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＯＸ４０、Ｋ細胞活性化受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－Ｌ ＬＦＡ－１（ＣＤ１ｌａ／ＣＤ１８）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＲＡＮＫ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、Ｋｐ８０（ＫＬＲＦ１）、Ｋｐ４４、Ｋｐ３０、Ｋｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｐ、ＩＬ２Ｒｐ、ＩＬ２Ｒｙ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ１８、ＣＤ１３２、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＫＧ２Ｄ、ＫＧ２Ｃ、ＴＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡ ＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３のリガンド、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、および／またはシグナル伝達リンパ球活性化分子であるか、あるいはそれを含む。
【0057】
その他の代表的な構成要素
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲなどの改変ポリペプチドは、Ｔ細胞生存モチーフ（survival motif）をさらに含む。Ｔ細胞生存モチーフは、抗原による刺激の後にＴリンパ球の生存を促進する任意のアミノ酸配列またはモチーフであり得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞生存モチーフは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦＢ）受容体の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、あるいはそれに由来する。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲなどの改変ポリペプチドは、Ｔ細胞生存モチーフ（survival motif）をさらに含む。Ｔ細胞生存モチーフは、抗原による刺激の後にＴリンパ球の生存を促進する任意のアミノ酸配列またはモチーフであり得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞生存モチーフは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦＢ）受容体の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、あるいはそれに由来する。
【0058】
代表的な修飾
特定の実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドは、例えば、アシル化、アミド化、グリコシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、ＳＵＭＯ化、および／またはユビキチン化（またはその他のタンパク質修飾）によって修飾される。
特定の実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドは、例えば、アシル化、アミド化、グリコシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、ＳＵＭＯ化、および／またはユビキチン化（またはその他のタンパク質修飾）によって修飾される。
【0059】
特定の実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドは、検出可能なシグナルを提供することができる標識、例えば、放射性同位体または蛍光化合物で標識される。
【0060】
特定の実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドの１つ以上の側鎖は、例えば、コハクまたはその他のカルボン酸無水物によるリシニルおよびアミノ末端残基の誘導体化、または例えば、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応による誘導体化によって誘導体化される。特定の実施形態において、カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－（４－エチル）カルボジイミドまたはｌ－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－）との反応によって選択的に修飾される場合がある。
【0061】
代表的な核酸
本明細書に記載される改変ポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。本明細書に記載される改変ポリペプチドの生産に有用な核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログが挙げられる。核酸アナログは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾され得、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン置換、デオキシシチジンに対する５－メチル－２’－デオキシシチジンまたは５－ブロモ－２’－デオキシシチジン置換を含み得る。糖部分の修飾には、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が挙げられる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルフォリノ環に結合したモルフォリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格に置換され、４つの塩基が保持されるペプチド核酸となるように修飾され得る。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ （１９９７） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７： １８７－１９５； ａｎｄ Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇａｎ． Ｍｅｄ． Ｃｈａｉｎ． ４：５－２３を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格に置換され得る。
本明細書に記載される改変ポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。本明細書に記載される改変ポリペプチドの生産に有用な核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログが挙げられる。核酸アナログは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾され得、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン置換、デオキシシチジンに対する５－メチル－２’－デオキシシチジンまたは５－ブロモ－２’－デオキシシチジン置換を含み得る。糖部分の修飾には、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が挙げられる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルフォリノ環に結合したモルフォリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格に置換され、４つの塩基が保持されるペプチド核酸となるように修飾され得る。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ （１９９７） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７： １８７－１９５； ａｎｄ Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇａｎ． Ｍｅｄ． Ｃｈａｉｎ． ４：５－２３を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格に置換され得る。
【0062】
特定の実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドコード核酸は、核酸ベクター内に含まれる。例えば、興味の対象となる細胞（例えば、Ｔリンパ球）は、本明細書に記載される改変ポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む、合成ベクター、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または同類のものを用いて形質転換され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドを含むベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、レンチウイルスベクターである。細胞（例えば、Ｔリンパ球）の形質転換に適するレンチウイルスベクターには、米国特許第５，９９４，１３６号；第６，１６５，７８２号；第６，４２８，９５３号；第７，０８３，９８１号；および第７，２５０，２９９号に記載のレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限らない。細胞（例えば、Ｔリンパ球）の形質転換に適するＨＩＶベクターには、米国特許第５，６６５，５７７号に記載のベクターが挙げられるが、これに限らない。
【0063】
特定の実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドコード核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、Ｔ細胞特異的プロモーター、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞またはＮＫ細胞内で機能する誘導性プロモーター、または構成的プロモーターである。
【0064】
代表的な細胞
本明細書で提供される改変ポリペプチドは、改変ポリペプチド（例えばＣＡＲなど）の発現が有用である細胞において発現し得る、すなわち、細胞は、細胞における核酸の発現時に細胞が本明細書に記載される改変ポリペプチドを発現するような、本明細書で提供される改変ポリペプチドコード核酸を含むように改変される。例えば、本明細書に記載される改変ポリペプチドは、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞において発現し得る。本明細書に記載されるＣＡＲを発現する本明細書で提供される細胞は、「ＣＡＲ細胞」と呼ばれる場合がある。
本明細書で提供される改変ポリペプチドは、改変ポリペプチド（例えばＣＡＲなど）の発現が有用である細胞において発現し得る、すなわち、細胞は、細胞における核酸の発現時に細胞が本明細書に記載される改変ポリペプチドを発現するような、本明細書で提供される改変ポリペプチドコード核酸を含むように改変される。例えば、本明細書に記載される改変ポリペプチドは、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞において発現し得る。本明細書に記載されるＣＡＲを発現する本明細書で提供される細胞は、「ＣＡＲ細胞」と呼ばれる場合がある。
【0065】
特定の実施形態において、本明細書で提供される分解ドメインを含む改変ポリペプチドを発現するように改変された細胞(例えば、Tリンパ球またはナチュラルキラー細胞)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激ドメインなどのＣＡＲの構成要素、および（ｂ）分解ドメインを含むＣＡＲである改変ポリペプチドを発現するように改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、別のタンパク質に融合される、あるいは挿入される分解ドメインを含む改変ポリペプチドを発現するように改変されている。改変細胞を本明細書で提供される分解薬と接触させると改変ポリペプチドのユビキチン化および分解が引き起こされる。
【0066】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドは、Ｔリンパ球において発現する。Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球またはＭＨＣ拘束性Ｔリンパ球であり得る。特定の実施形態において、Ｔリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）である。特定の実施形態において、Ｔリンパ球は、腫瘍生検から単離されているか、あるいは腫瘍生検から単離されたＴリンパ球から増殖されている。特定の他の実施形態において、Ｔリンパ球は、末梢血、臍帯血、またはリンパから単離されているか、あるいはそれから増殖されたＴリンパ球から増殖される。
【0067】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドを含む／発現するように改変される細胞（例えば、Ｔリンパ球）は、本明細書に記載される治療方法の一部として細胞（例えば、Ｔリンパ球）が投与される個人に対して自己由来である。他の実施形態において、本明細書に記載される改変ポリペプチドを含む／発現するように改変される細胞（例えば、Ｔリンパ球）は、細胞（例えば、Ｔリンパ球）が投与される個人に対して同種である。同種細胞（例えば、Ｔリンパ球）がＣＡＲ細胞などの改変細胞を調製するために使用される場合、個人における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性を低下させる細胞（例えば、Ｔリンパ球）を選択するのが好ましい。例えば、特定の実施形態において、ウイルス特異的Ｔリンパ球は、ＣＡＲ Ｔリンパ球の調製のために選択され、かかるリンパ球は、任意のレシピエント抗原に結合し、それによって活性化するという元々の能力が大きく低下していることが期待される。特定の実施形態において、レシピエントを介した同種細胞（例えば、Ｔリンパ球）の拒絶は、１つ以上の免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、シクロホスファミド、または同類のものを宿主に共投与することで軽減することができる。
【0068】
いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、個人から得て、適宜増殖され、続いて本明細書で提供される改変ポリペプチドをコードするベクターで形質転換され、次に適宜増殖される。いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、個人から得て、適宜増殖され、続いて本明細書に記載されるＣＡＲである改変ポリペプチドをコードするベクターで形質転換され、次に適宜増殖される。いくつかの実施形態において、ベクターを含む細胞は、選択可能なマーカーを用いて得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、個人から得て、適宜増殖され、続いて内在性タンパク質に融合される、あるいは挿入される分解ドメインを含む改変ポリペプチドが発現するように、分解ドメインを目的の内在性タンパク質遺伝子に挿入するように改変される。改変Ｔリンパ球は、適宜さらに増殖される場合がある。
【0069】
特定の実施形態において、本明細書で提供される改変ポリペプチドを発現させるために使用されるＴリンパ球は、天然ＴＣＲ複合体を形成することができる天然ＴＣＲタンパク質（例えば、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β）を含む。特定の他の実施形態において、Ｔリンパ球においてＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－βをコードする天然遺伝子のいずれか一方または両方は、機能しないように改変され、例えば、一部または全部が欠失されるか、あるいは変異が挿入される。
【0070】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む／発現する細胞（例えば、Ｔリンパ球）の増殖（proliferation）および増殖（expansion）を促進するために使用され得る。例えば、未改変Ｔリンパ球、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含むポリペプチドを含むＴリンパ球は、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体、例えば、ビーズに結合した抗体を用いて、増殖され得る。例えば、米国特許第５，９４８，８９３号；第６，５３４，０５５号；第６，３５２，６９４号；第６，６９２，９６４号；第６，８８７，４６６号；および第６，９０５，６８１号を参照されたい。同様に、シグナル伝達モチーフに対する抗体は、本明細書に記載されるＣＡＲを含む細胞（例えば、Ｔリンパ球）の増殖を刺激するために使用され得る。
【0071】
特定の実施形態において、改変ポリペプチドは、望ましいときに改変ポリペプチドを発現する実質的にすべての細胞を死滅させることを可能にする「自殺遺伝子」または「安全スイッチ」として使用される場合がある。例えば、分解ドメインは、生存および／または細胞の特定の活性に必要な内在性タンパク質を発現する遺伝子に挿入される場合がある。細胞を分解薬と接触させると、内在性タンパク質（すなわち、分解ドメインおよび内在性タンパク質を含む改変ポリペプチド）のユビキチン化および分解が引き起こされ、細胞の活性を無効にするか、あるいは細胞を死滅させる。
【0072】
代表的な分解薬
本明細書で使用される「分解薬」という用語は、本明細書で提供される分解ドメインおよびE3リガーゼなどのユビキチンリガーゼと結合することができる分子(例えば、小分子)を指す。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメインおよびセレブロンに結合する。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメインおよびユビキチンリガーゼに結合し、E3リガーゼと分解ドメインとの会合をもたらす。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインを含む改変ポリペプチドは、分解薬によって媒介される会合の後にユビキチンリガーゼによってユビキチン化される。
本明細書で使用される「分解薬」という用語は、本明細書で提供される分解ドメインおよびE3リガーゼなどのユビキチンリガーゼと結合することができる分子(例えば、小分子)を指す。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメインおよびセレブロンに結合する。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメインおよびユビキチンリガーゼに結合し、E3リガーゼと分解ドメインとの会合をもたらす。いくつかのかかる実施形態において、分解ドメインを含む改変ポリペプチドは、分解薬によって媒介される会合の後にユビキチンリガーゼによってユビキチン化される。
【0073】
いくつかの実施形態において、分解薬は、セレブロン結合化合物である。いくつかの実施形態において、分解薬は、3-(5-(6,7-ジヒドロ-5H-ピロロ[3,4-b]ピリジン-6-カルボニル)-1－オキソイソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｂ）、3-(5-((4-(2-メチルピリジン-3－イル)ピペラジン-1－イル)メチル)-1－オキソイソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｃ）、または3-[5-[1-(1,3-ベンゾチアゾール-6－イルメチル)-4-ピペリジル]-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｄ）である。
【表1】
【0074】
いくつかの実施形態において、分解薬は、ＷＯ２０１９／０３８７１７Ａ１に記載される化合物であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0075】
本明細書に記載される方法に従って使用される分解薬、またはそのエナンチオマーもしくはエナンチオマーの混合物；またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形は、単一用量（例えば、単回ボーラス注射、または経口錠剤もしくは丸剤など）として、あるいは時間をかけて（例えば、長時間の持続注入または長時間の分割ボーラス投与）送達され得る。
【0076】
本明細書に記載される方法に従って使用される分解薬は、静脈内、動脈内、非経口、筋肉内、皮下、髄腔内、または眼内投与、または特定の臓器または組織内への投与のために製剤化され得る。
【0077】
代表的な方法
いくつかの実施形態において、分解ドメインを含む改変ポリペプチドのレベルを減少させる方法であって、改変ポリペプチドを分解薬と接触させることを特徴とする、方法が提供される。いくつかの実施形態において、接触は細胞内で起こり、分解薬は分解ドメインおよびユビキチンリガーゼに結合し、改変ポリペプチドのユビキチン化および分解を引き起こす。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドの分解は、少なくとも１つの細胞の活性の減少および／または少なくとも１つの細胞の活性の増加および／または細胞死をもたらす。非限定的な代表的な効果には、細胞（Ｔ細胞など）活性化の閾値の低下、細胞（Ｔ細胞など）の機能的な持続（functional persistence）の増加、細胞生存の促進、および細胞増殖の増加が挙げられる。いくつかの実施形態において、分解薬は、化合物Ｂ、化合物Ｃ、または化合物Ｄである。いくつかの実施形態において、方法は、対象に分解薬を投与することを特徴とし、ここで、前記対象は、改変ポリペプチドを含む細胞を含む。
いくつかの実施形態において、分解ドメインを含む改変ポリペプチドのレベルを減少させる方法であって、改変ポリペプチドを分解薬と接触させることを特徴とする、方法が提供される。いくつかの実施形態において、接触は細胞内で起こり、分解薬は分解ドメインおよびユビキチンリガーゼに結合し、改変ポリペプチドのユビキチン化および分解を引き起こす。いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドの分解は、少なくとも１つの細胞の活性の減少および／または少なくとも１つの細胞の活性の増加および／または細胞死をもたらす。非限定的な代表的な効果には、細胞（Ｔ細胞など）活性化の閾値の低下、細胞（Ｔ細胞など）の機能的な持続（functional persistence）の増加、細胞生存の促進、および細胞増殖の増加が挙げられる。いくつかの実施形態において、分解薬は、化合物Ｂ、化合物Ｃ、または化合物Ｄである。いくつかの実施形態において、方法は、対象に分解薬を投与することを特徴とし、ここで、前記対象は、改変ポリペプチドを含む細胞を含む。
【0078】
いくつかの実施形態において、改変ポリペプチドは、分解薬の存在下で分解される。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメインおよびセレブロンなどのユビキチンリガーゼと相互作用する。いくつかの実施形態において、分解薬は、分解ドメイン、分解薬、およびユビキチンリガーゼを含む複合体を媒介し、改変ポリペプチドのユビキチン化を引き起こす。
【0079】
改変ポリペプチドを含む／発現するように改変されるＴリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）などの、本明細書で提供される改変細胞（例えば、ＣＡＲ細胞）は、例えば、ＣＡＲの標的を発現するがんを有するという理由で改変細胞から利益を得る個人を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、エフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかが、改変ポリペプチドを含む。
【0080】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合される抗原を発現する標的細胞を死滅させる方法が本明細書で提供され、ここで、前記方法は、本明細書に記載されるＣＡＲを含む／発現する、本明細書で提供される改変細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）と前記標的細胞を接触させることを特徴とする。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、がん細胞、例えば、血液がん細胞または固形腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、がんを治療する方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲを含む／発現する、本明細書に記載される改変細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）集団を対象に投与することを特徴とする、方法が本明細書で提供され、ここで、前記ＣＡＲは、がん抗原（例えば、ＴＳＡまたはＴＡＡ）に対して特異的な抗原結合ドメインを含む。
【0081】
いくつかの実施形態において、標的細胞またはがん細胞は、１つ以上の以下の抗原、またはその断片を発現する：４－ＩＢＢ、５Ｔ４、８Ｈ９、Ｂ７－Ｈ６、腺癌抗原、ａ－フェトプロテイン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ９、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（Ｔ ＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１５２、ＣＤ１７１、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＥ７、ＣＥＡ、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、Ｆｅｔａｌ ＡｃｈＲ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、葉酸受容体ａ、葉酸受容体１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、糖タンパク質７５、ＧＰ ＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧｌ、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＩＬ－１１受容体ａ、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンａ５Ｉ３１、インテグリンａｖＩ３３、カッパ軽鎖、Ｌｌ－ＣＡＭ、ラムダ軽鎖、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、メソテリン、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣｌ、ＭＵＣｌ ６、ムチンＣａｎＡｇ、ＮＣＡＭ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＰＣ－ＩＣ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺癌細胞、ＰＳＭＡ、ＰＳＣ１、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ｓｐｌ７、ＴＡＧ７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ β２、ＴＧＦ－Ｉ３、ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、および／またはビメンチン。
【0082】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞などの本明細書で提供される改変細胞の投与後、ＣＡＲの発現を減少または除去し、それにより標的細胞の死滅を減少または除去することが望ましい場合がある。いくつかのかかる実施形態において、方法は、本明細書で提供される分解薬を対象に投与することをさらに特徴とする場合がある。分解薬の投与は、改変ポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）の分解を引き起こし、ＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合される抗原を発現する細胞への改変細胞の標的化を減少または除去する。この方法では、ＣＡＲ細胞による治療の活性が調節される場合があり、安全性が向上する場合がある。
【0083】
いくつかの実施形態において、前記改変細胞集団は、最初に対象に投与され、続いて改変細胞集団の投与後一定期間で、例えば、細胞集団の投与後３０分、１時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または１週間で、分解薬が投与される。
【0084】
いくつかの実施形態において、分解薬は、化合物Ｂ、化合物Ｃ、または化合物Ｄである。
【0085】
本明細書に記載される治療方法に従って治療され得るがんの非限定的な一覧には、リンパ腫、白血病、肺癌、乳癌、前立腺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒色腫、皮膚癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、固形胚細胞腫瘍、肝芽腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、粘液腫、線維腫、および脂肪腫が含まれる。代表的なリンパ腫および白血病には、これらに限らないが、慢性リンパ性白血病（小リンパ球性リンパ腫）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体腔液リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、Ｔ細胞性大顆粒リンパ球性白血病、急速進行性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（非特定）、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【0086】
疾患または障害の治療における、例えば、がんを有する個人の治療における、ＣＡＲ細胞などの本明細書に記載される改変細胞の有効性は、疾患または障害の進行を示すことが当業者に既知である、特定の疾患または障害に特異的な１つ以上の基準によって評価され得る。一般に、疾患／障害（例えば、癌）を有する個人に対するＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔリンパ球）の投与は、前記基準のうちの１つ以上が検出可能なほどに、例えば有意に、疾患状態の値または範囲から正常な値または範囲に、あるいはそれに向かって移動する場合に有効である。
【0087】
本明細書に記載される改変細胞は、任意の薬学的に許容される溶液、好ましくは生細胞の送達に適する溶液（例えば生理食塩水(リンゲル液など)、ゼラチン、炭水化物(例えば、ラクトース、アミロース、デンプン、または同類のもの)、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン(pyrolidine)など）中に製剤化され得る。かかる製剤は、好ましくはＣＡＲ細胞の添加前に滅菌され、助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、および着色剤など）と混合される場合がある。ＣＡＲ細胞の製剤化に使用するのに適する医薬担体は、当技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ９６／０５３０９に記載される。
【0088】
特定の実施形態において、本明細書に記載される改変細胞（例えば、ＣＡＲ細胞）は、個人の用量に製剤化され、ここで、前記個人の用量は、少なくとも、多くても、または約ｌｘｌ０４、５ｘｌ０４、ｌｘ１０５、５ｘｌ０５、ｌｘｌ０６、５ｘｌ０６、ｌｘｌ０７、５ｘｌ０７、ｌｘｌ０８、５ｘｌ０８、ｌｘｌ０９、５ｘｌ０９、ｌｘｌ０１０、５ｘｌ０１０、またはｌｘｌ０１１ｃｅｌｌｓを含む。
【0089】
特定の実施形態において、本明細書に記載される改変細胞（例えば、ＣＡＲ細胞）は、静脈内、動脈内、非経口、筋肉内、皮下、髄腔内、または眼内投与、または特定の臓器または組織内への投与のために製剤化される。
【実施例】
【0090】
実施例１：ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２ Ｇモチーフ標識ＣＡＲは機能を保持する
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（図２、配列番号１５のＺＮＦ２アミノ酸配列）の機能をレポーターアッセイで評価した。ここで、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＡＲおよびＴＣＲの活性化に関連するＮｕｒ７７遺伝子が活発に転写されるときにｔｄＴｏｍａｔｏを発現するように改変されている（図３）。ＺＮＦ標識ＣＤ１９ ＣＡＲ、非標識ＣＤ１９ ＣＡＲ、または非標識ＢＣＭＡ ＣＡＲネガティブコントロールをコードするレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔレポーター細胞株に形質導入した。次に形質導入細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と３７℃で共培養した。ｔｄＴｏｍａｔｏのレベルを平均蛍光強度（ＭＦＩ）および全体的な陽性細胞の割合の両方で、フローサイトメトリーによって２時間ごとに１２時間評価した。結果は、ＣＡＲ活性化のタイミングおよびレベルの両方が標識および非標識ＣＤ１９ ＣＡＲの間で同じであったが、ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＴはＣＤ１９標的細胞株の存在下で活性化しなかったことを示した（図４Ａ）。
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（図２、配列番号１５のＺＮＦ２アミノ酸配列）の機能をレポーターアッセイで評価した。ここで、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＡＲおよびＴＣＲの活性化に関連するＮｕｒ７７遺伝子が活発に転写されるときにｔｄＴｏｍａｔｏを発現するように改変されている（図３）。ＺＮＦ標識ＣＤ１９ ＣＡＲ、非標識ＣＤ１９ ＣＡＲ、または非標識ＢＣＭＡ ＣＡＲネガティブコントロールをコードするレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔレポーター細胞株に形質導入した。次に形質導入細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と３７℃で共培養した。ｔｄＴｏｍａｔｏのレベルを平均蛍光強度（ＭＦＩ）および全体的な陽性細胞の割合の両方で、フローサイトメトリーによって２時間ごとに１２時間評価した。結果は、ＣＡＲ活性化のタイミングおよびレベルの両方が標識および非標識ＣＤ１９ ＣＡＲの間で同じであったが、ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＴはＣＤ１９標的細胞株の存在下で活性化しなかったことを示した（図４Ａ）。
【0091】
異なる濃度の化合物Ａで達成されるＣＡＲ分解のレベルを評価するために、化合物Ａ（図４Ｂ）のタイトレーションをＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２標識または非標識 ＣＤ１９ ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔについて行った。化合物Ａは、米国特許公開公報２０１９／０００８８５２Ａ１の４２ページ目、表４（化合物Ａ）に示される。細胞を化合物Ａとともに２４時間、３７℃でインキュベートし、その後ＣＡＲレベルをフローサイトメトリーによって評価した。データは、ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２ Ｇモチーフデグロンが高化合物Ａ濃度で約５５％のＣＡＲ分解を媒介したことを示す（図４Ｃ）。このＣＡＲ分解のレベルは、ＣＡＲによって認識される抗原を発現するＫ５６２でチャレンジする場合に、ＣＡＲ活性を抑制するのに十分でないことがある（データ示さず）。この結果は、より強力に化合物Ａに反応できるようにデグロンタンパク質配列を改変する研究を促した。
【0092】
実施例２：ＩＫＺＦ１ジンクフィンガーの代替配列の評価
改善されたＣＡＲ分解を促進するようにＩＫＺＦ１－ＺＮＦ２デグロンをさらに改変した。非標識ＣＡＲおよびオリジナルのＩＫＺＦ１－ＺＮＦ２デグロンで標識したＣＡＲをＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、ＺＮＦ２、およびＺＮＦ３の別の向きおよび組み合わせと並んで試験した（図５Ａ）。各ＣＡＲはＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）シグナル伝達ドメインを含んだ。ＩＫＺＦ１デグロンは、Ｃ末端に融合された。配列番号５３～５７を参照されたい。非標識ＣＤ１９ ＣＡＲまたは様々な配列のＩＫＺＦ１－ＺＮＦｓで標識されたＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔ細胞株に形質導入した。初めに形質導入細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と３７℃で７．５時間共培養し、正規化したｔｄＴｏｍａｔｏレポーターのレベルをフローサイトメトリーで評価した。結果は、いずれのデグロン標識も、非標識ＣＡＲと比較して、抗原の存在下でＣＡＲ活性を減少させなかったことを示した。次に、ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を化合物Ａの存在下（タイトレーション）で、３７℃で２４時間培養し、各デグロンについてＹ－ｍａｘおよびＥＣ５０値を決定した。この実験から、ＺＮＦ２＿３標識が最低濃度の化合物Ａで分解を増強させたことが分かった（図５Ｃ）。ＺＮＦ１＿２標識は、ＺＮＦ１がＧモチーフを含み、タンデムデグロンにさらなる複雑性を与えるため除外された。したがって、この配列はさらなる試験のために選択された。
改善されたＣＡＲ分解を促進するようにＩＫＺＦ１－ＺＮＦ２デグロンをさらに改変した。非標識ＣＡＲおよびオリジナルのＩＫＺＦ１－ＺＮＦ２デグロンで標識したＣＡＲをＩＫＺＦ１ ＺＮＦ１、ＺＮＦ２、およびＺＮＦ３の別の向きおよび組み合わせと並んで試験した（図５Ａ）。各ＣＡＲはＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）シグナル伝達ドメインを含んだ。ＩＫＺＦ１デグロンは、Ｃ末端に融合された。配列番号５３～５７を参照されたい。非標識ＣＤ１９ ＣＡＲまたは様々な配列のＩＫＺＦ１－ＺＮＦｓで標識されたＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔ細胞株に形質導入した。初めに形質導入細胞をＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と３７℃で７．５時間共培養し、正規化したｔｄＴｏｍａｔｏレポーターのレベルをフローサイトメトリーで評価した。結果は、いずれのデグロン標識も、非標識ＣＡＲと比較して、抗原の存在下でＣＡＲ活性を減少させなかったことを示した。次に、ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を化合物Ａの存在下（タイトレーション）で、３７℃で２４時間培養し、各デグロンについてＹ－ｍａｘおよびＥＣ５０値を決定した。この実験から、ＺＮＦ２＿３標識が最低濃度の化合物Ａで分解を増強させたことが分かった（図５Ｃ）。ＺＮＦ１＿２標識は、ＺＮＦ１がＧモチーフを含み、タンデムデグロンにさらなる複雑性を与えるため除外された。したがって、この配列はさらなる試験のために選択された。
【0093】
この分解が機能性のデグロンに依存することを示すために、ＷＴ ＺＮＦ２＿３（配列番号１３）で標識されたＣＡＲを上記の通り、化合物Ａのタイトレーションで、Ｇモチーフ中にＧ６Ｎ変異を含むＺＮＦ２＿３（ＱＣＮＱＣＮＡＳＦ；配列番号１７）で標識されたＣＡＲと並んで試験した（図５Ｄ）。ＷＴデグロンが高化合物Ａ濃度でＣＡＲを強く分解させた一方、Ｇ６Ｎ変異体標識ＣＡＲはいかなる用量の化合物Ａにも反応しなかった。これらの結果は、ＧモチーフのＧ６残基が化合物Ａと最適化されたＺＮＦ２＿３デグロンとの相互作用に寄与することを示唆する。
【0094】
実施例３：ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３標識ＣＡＲの分解は活性を抑制する
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を分解することによってＣＡＲ Ｔシグナル伝達を抑制する能力をＪｕｒｋａｔレポーターアッセイで評価した。ＺＮＦ２＿３標識または非標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（実施例２を参照）をレポーター細胞株に形質導入した。次に、形質導入細胞を１００ｎＭ 化合物Ａで４８時間前処置し、その後３７℃で８時間、ＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と共培養した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図６Ｂ）および全体的な陽性細胞の割合（図６Ｃ）という形でｔｄＴｏｍａｔｏのレベルを、並びに正規化したＣＡＲレベルをフローサイトメトリーで評価した（図６Ａ）。この化合物Ａの濃度において、ＺＮＦ２＿３デグロンを含むＣＡＲの分解は、同種抗原を発現するＫ５６２細胞でチャレンジした場合にＣＡＲ活性を強く抑制するのに十分に強かった。
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を分解することによってＣＡＲ Ｔシグナル伝達を抑制する能力をＪｕｒｋａｔレポーターアッセイで評価した。ＺＮＦ２＿３標識または非標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（実施例２を参照）をレポーター細胞株に形質導入した。次に、形質導入細胞を１００ｎＭ 化合物Ａで４８時間前処置し、その後３７℃で８時間、ＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と共培養した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図６Ｂ）および全体的な陽性細胞の割合（図６Ｃ）という形でｔｄＴｏｍａｔｏのレベルを、並びに正規化したＣＡＲレベルをフローサイトメトリーで評価した（図６Ａ）。この化合物Ａの濃度において、ＺＮＦ２＿３デグロンを含むＣＡＲの分解は、同種抗原を発現するＫ５６２細胞でチャレンジした場合にＣＡＲ活性を強く抑制するのに十分に強かった。
【0095】
ＣＡＲ分解によるシグナル伝達の抑制を下流のＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を測定することで評価した。上記のように、Ｊｕｒｋａｔ細胞に非標識、ＷＴデグロン標識、またはＧ６Ｎデグロン標識ＣＡＲを形質導入した。細胞を１ｍＭ 化合物Ａで１２時間、３７℃で前処置し、次に親またはＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞のいずれかと３０分間共培養した。次に細胞をペレット化し、溶解し、変性タンパク質ゲル上で泳動させ、メンブレンに転写し、抗体でプローブし、フィルムで可視化した（図７）。これらの結果は、ＷＴ ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３標識ＣＡＲを含む細胞に化合物Ａを投与すると、ＣＡＲによって活性化される内因性シグナル伝達経路（ここではＥｒｋリン酸化(ｐＥｒｋ)で表される）が抗原の存在下で減弱することを示す。
【0096】
実施例４：新規デグロン－化合物ペアを特定するためのデグロン変異導入
構造研究により、基質がセレブロン／化合物複合体に結合するとき、Ｇモチーフの１位が化合物に近接することが明らかになる（示さず）。ＩＫＺＦファミリーのＧモチーフデグロン配列のアライメント（図８）およびその他のＣ２Ｈ２ジンクフィンガーにおける予測されるデグロン（図９）から、この位置には多様なアミノ酸が存在することが明らかになる。したがって、さらなる化合物：デグロンペアを特定するために、ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２のＱ１位に変異を作り、これらの変異体に対する活性について有望な化合物をスクリーニングした。Ｑ１位に別のアミノ酸を有するＩｋａｒｏｓ ＭＢＰ－ＺＮＦ２（ａａ １４１～１９６）を含むプラスミドを構築し、化合物Ｂ（図１０Ａ）を含む様々な化合物を用いてインビトロユビキチン化スクリーニングを行った。処置後、細胞をペレット化し、溶解し、変性タンパク質ゲル上で泳動させ、メンブレンに転写し、抗体でプローブし、フィルムで可視化した（図１０Ｂ）。図１０Ｂに示すように、ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２ Ｑ１Ｆは、化合物Ｂの存在下で強くユビキチン化された。
構造研究により、基質がセレブロン／化合物複合体に結合するとき、Ｇモチーフの１位が化合物に近接することが明らかになる（示さず）。ＩＫＺＦファミリーのＧモチーフデグロン配列のアライメント（図８）およびその他のＣ２Ｈ２ジンクフィンガーにおける予測されるデグロン（図９）から、この位置には多様なアミノ酸が存在することが明らかになる。したがって、さらなる化合物：デグロンペアを特定するために、ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２のＱ１位に変異を作り、これらの変異体に対する活性について有望な化合物をスクリーニングした。Ｑ１位に別のアミノ酸を有するＩｋａｒｏｓ ＭＢＰ－ＺＮＦ２（ａａ １４１～１９６）を含むプラスミドを構築し、化合物Ｂ（図１０Ａ）を含む様々な化合物を用いてインビトロユビキチン化スクリーニングを行った。処置後、細胞をペレット化し、溶解し、変性タンパク質ゲル上で泳動させ、メンブレンに転写し、抗体でプローブし、フィルムで可視化した（図１０Ｂ）。図１０Ｂに示すように、ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２ Ｑ１Ｆは、化合物Ｂの存在下で強くユビキチン化された。
【0097】
実施例５：Ｑ１Ｆデグロンに対して強力な活性を有する化合物を特定するための小分子スクリーニング
Ｑ１Ｆデグロンに対して一連の有望なデグロン標的化合物をスクリーニングし、一連の強力なデグロン／小分子ペアを得た。ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿ＺＮＦ３ Ｑ１Ｆ Ｎｌｕｃで標識されたＣＤ１９ ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。このＣＤ１９ ＣＡＲは、実施例２のＣＤ１９と類似しているが、ＺＮＦ２＿ＺＮＦ３ Ｑ１Ｆデグロン（配列番号１９）を含む。形質導入細胞を各小分子のタイトレーションまたは薬物なしで処置し、続いて３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適切な染色試薬で染色し、ＣＡＲレベルを測定した。細胞を４℃で、染色試薬中で２０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した後、フローサイトメーターで読み取った。ＣＡＲレベルを薬物で処置していない細胞に正規化した。得られたタイトレーションカーブを用いて、ＥＣ５０およびＹｍｉｎ値を算出した。これによりＱ１Ｆデグロン標識ＣＡＲを強力に分解した小分子が特定された（表１）。
Ｑ１Ｆデグロンに対して一連の有望なデグロン標的化合物をスクリーニングし、一連の強力なデグロン／小分子ペアを得た。ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿ＺＮＦ３ Ｑ１Ｆ Ｎｌｕｃで標識されたＣＤ１９ ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターをＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。このＣＤ１９ ＣＡＲは、実施例２のＣＤ１９と類似しているが、ＺＮＦ２＿ＺＮＦ３ Ｑ１Ｆデグロン（配列番号１９）を含む。形質導入細胞を各小分子のタイトレーションまたは薬物なしで処置し、続いて３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適切な染色試薬で染色し、ＣＡＲレベルを測定した。細胞を４℃で、染色試薬中で２０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した後、フローサイトメーターで読み取った。ＣＡＲレベルを薬物で処置していない細胞に正規化した。得られたタイトレーションカーブを用いて、ＥＣ５０およびＹｍｉｎ値を算出した。これによりＱ１Ｆデグロン標識ＣＡＲを強力に分解した小分子が特定された（表１）。
【表2】
【0098】
実施例６：ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲは化合物Ｃの存在下でＣＲＢＮおよびユビキチン－プロテアソーム経路依存的に分解される
Ｑ１Ｆデグロン標識ＣＡＲの分解のＣＲＢＮおよびユビキチンタンパク質分解経路への依存を評価した。ＣＤ１９標的ＣＡＲはＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ（配列番号１９）またはＱ１Ｆ／Ｇ６Ｎ（配列番号５９）のいずれかで標識された。次に、これらの標識ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを野生型（ＷＴ）またはセレブロン（ＣＲＢＮ）ノックアウト（ＫＯ）Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。
Ｑ１Ｆデグロン標識ＣＡＲの分解のＣＲＢＮおよびユビキチンタンパク質分解経路への依存を評価した。ＣＤ１９標的ＣＡＲはＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ（配列番号１９）またはＱ１Ｆ／Ｇ６Ｎ（配列番号５９）のいずれかで標識された。次に、これらの標識ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを野生型（ＷＴ）またはセレブロン（ＣＲＢＮ）ノックアウト（ＫＯ）Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。
【0099】
Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲが化合物ＣによってＣＲＢＮ依存的に分解され得るかどうかを決定するために、形質導入Ｊｕｒｋａｔ ＷＴまたはＪｕｒｋａｔ ＣＲＢＮ ＫＯ細胞をＤＭＳＯまたは１ｍＭ 化合物Ｃ（図１１Ａ）で、３７℃で１時間処置し、その後ＣＡＲレベルをフローサイトメトリーで評価した。この化合物Ｃの濃度において、標識ＣＡＲは、ＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞では２０％未満が残るまで分解されたが、Ｊｕｒｋａｔ ＣＲＢＮ ＫＯ細胞では標識ＣＡＲのレベルは非標識ＣＡＲと同じままであった（図１１Ｂ）。次に、ＣＡＲ分解のユビキチン－プロテオソーム経路への依存を試験するために、標識ＣＡＲを形質導入したＷＴ Ｊｕｒｋａｔを２時間、ＤＭＳＯ、２０ｎＭまたは２００ｎＭ 化合物Ｃ単独で、あるいは２μＭのＮＥＤＤ８ Ｅ１酵素阻害剤 ＭＬＮ４９２４または２μＭのプロテアソーム阻害薬ボルテゾミブのいずれかとともに処置した（図１１Ｃ）。いずれかの阻害薬の存在下で化合物Ｃが標識ＣＡＲを分解しなかったことは、機能性のユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＰ）がＱ１Ｆ標識ＣＡＲの分解にとって必須であることを示す。
【0100】
実施例７：ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲの分解は活性を抑制する
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を分解することによってＣＡＲ Ｔシグナル伝達を抑制する能力をＪｕｒｋａｔレポーターアッセイで評価した（図２および３）。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１ＦまたはＱ１Ｆ／Ｇ６Ｎ標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをレポーター細胞株に形質導入した。次に、形質導入細胞を１ｍＭ 化合物Ｃまたは化合物Ｂで１２時間前処置し、その後３７℃で８時間、親またはＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と共培養した。全体的な陽性細胞の割合（図１２Ａ）並びに平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図１２Ｂ）という形でｔｄＴｏｍａｔｏのレベルをフローサイトメトリーで評価した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆデグロンを含むＣＡＲの分解は、１ｍＭ 化合物Ｃでは約３０％、化合物Ｂでは約７５％シグナル伝達を減少させた。この相対的差異は、それぞれで見られる分解の強さと相関する。さらに、活性の減少は、Ｇ６Ｎ変異が抑制を妨げるように、インタクトなＧモチーフを有することに依存する。
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を分解することによってＣＡＲ Ｔシグナル伝達を抑制する能力をＪｕｒｋａｔレポーターアッセイで評価した（図２および３）。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１ＦまたはＱ１Ｆ／Ｇ６Ｎ標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをレポーター細胞株に形質導入した。次に、形質導入細胞を１ｍＭ 化合物Ｃまたは化合物Ｂで１２時間前処置し、その後３７℃で８時間、親またはＣＤ１９発現Ｋ５６２標的細胞株と共培養した。全体的な陽性細胞の割合（図１２Ａ）並びに平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図１２Ｂ）という形でｔｄＴｏｍａｔｏのレベルをフローサイトメトリーで評価した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆデグロンを含むＣＡＲの分解は、１ｍＭ 化合物Ｃでは約３０％、化合物Ｂでは約７５％シグナル伝達を減少させた。この相対的差異は、それぞれで見られる分解の強さと相関する。さらに、活性の減少は、Ｇ６Ｎ変異が抑制を妨げるように、インタクトなＧモチーフを有することに依存する。
【0101】
実施例８：ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲの分解は初代Ｔ細胞の活性を抑制する
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（図１３Ａ）を分解することによって初代ＣＡＲ Ｔエフェクター機能を調整する化合物の能力を評価した。ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲと同様に膜貫通、共刺激、およびシグナル伝達ドメインを含むが、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖを有した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識または非標識抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを活性化初代Ｔ細胞に形質導入した。形質導入細胞をＩＬ２、ＩＬ７、およびＩＬ１５を添加した培地中で１０日間増殖させ、その後凍結させた。実験の前に、細胞を解凍し、用量漸増で化合物Ｃを含む、または薬物なしの培地中に放置した。ＣＡＲレベルはフローサイトメトリーで測定され（図１３Ｂ）、ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲの表面レベルが化合物Ｃの濃度範囲で調整できることが示された。ＣＡＲの分解がＣＡＲ Ｔ活性に及ぼす影響を決定するために、次に細胞を１：４ エフェクター：標的細胞の比でＮｕｃｌｉｇｈｔレッド標識Ｈ－１９７５ ＲＯＲ１発現標的細胞株と共培養した。共培養物をＩｎｃｕｃｙｔｅの中に２４時間置き、Ｎｕｃｌｉｇｈｔレッドシグナルを介して腫瘍殺傷を監視し（図１４Ａ）、上清を回収して炎症性サイトカイン産生をＭＳＤで測定した（図１４Ｂ～１４Ｄ；ＩＬ－２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγ）。これらの実験は、殺傷およびサイトカイン産生の両方で測定される初代ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能が、異なる濃度の化合物ＣでＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲを標的化し、分解することによって調整され得ることを示した。
ＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（図１３Ａ）を分解することによって初代ＣＡＲ Ｔエフェクター機能を調整する化合物の能力を評価した。ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲと同様に膜貫通、共刺激、およびシグナル伝達ドメインを含むが、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖを有した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識または非標識抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを活性化初代Ｔ細胞に形質導入した。形質導入細胞をＩＬ２、ＩＬ７、およびＩＬ１５を添加した培地中で１０日間増殖させ、その後凍結させた。実験の前に、細胞を解凍し、用量漸増で化合物Ｃを含む、または薬物なしの培地中に放置した。ＣＡＲレベルはフローサイトメトリーで測定され（図１３Ｂ）、ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲの表面レベルが化合物Ｃの濃度範囲で調整できることが示された。ＣＡＲの分解がＣＡＲ Ｔ活性に及ぼす影響を決定するために、次に細胞を１：４ エフェクター：標的細胞の比でＮｕｃｌｉｇｈｔレッド標識Ｈ－１９７５ ＲＯＲ１発現標的細胞株と共培養した。共培養物をＩｎｃｕｃｙｔｅの中に２４時間置き、Ｎｕｃｌｉｇｈｔレッドシグナルを介して腫瘍殺傷を監視し（図１４Ａ）、上清を回収して炎症性サイトカイン産生をＭＳＤで測定した（図１４Ｂ～１４Ｄ；ＩＬ－２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγ）。これらの実験は、殺傷およびサイトカイン産生の両方で測定される初代ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能が、異なる濃度の化合物ＣでＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲを標的化し、分解することによって調整され得ることを示した。
【0102】
実施例９：Ｑ１Ｆデグロンを介したＣＡＲの分解はインビトロ慢性抗原曝露の間、ＣＡＲの機能を維持する
ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲの分解によって、慢性抗原曝露中の初代Ｔ細胞に一過性の休息を与えることの機能的影響をインビトロで試験した。刺激はＣＡＲ ｓｃＦｖに対する抗体でコーティングしたプレートによって提供され、様々な期間の休息が評価された（図１５）。細胞を３．９ｎＭの化合物Ｄ（図１６Ａ）で処置し、続いて洗浄し、培地中に放置してＣＡＲをリチャレンジ前に完全にリバウンドさせた。放置した細胞をフローサイトメトリーで分析し、ナイーブ型集団の代わりとしてＣＤ２７およびＣＤ２８レベルを評価した（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。次にＣＡＲ Ｔ細胞をスフェロイド（３Ｄ）フォーマットのＮｕｃｌｉｇｈｔレッド標識腫瘍細胞株でチャレンジし、上清を回収して炎症性サイトカイン産生をＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。これらの実験は、ＣＡＲ Ｔ細胞に一過性の休息を与えると、継続的な抗原曝露を受けるＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、活性化が抑えられ、より多くのナイーブ型集団が維持されることを示す。この一過性の休息は、ＩＬ－２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγのような炎症性サイトカインの産生（図１７Ａ）および抗腫瘍機能（図１７Ｂ）の観点からも機能的利益をもたらす。これらのサイトカインおよび細胞毒性の漸減は、Ｔ細胞疲弊の特徴である。
ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲの分解によって、慢性抗原曝露中の初代Ｔ細胞に一過性の休息を与えることの機能的影響をインビトロで試験した。刺激はＣＡＲ ｓｃＦｖに対する抗体でコーティングしたプレートによって提供され、様々な期間の休息が評価された（図１５）。細胞を３．９ｎＭの化合物Ｄ（図１６Ａ）で処置し、続いて洗浄し、培地中に放置してＣＡＲをリチャレンジ前に完全にリバウンドさせた。放置した細胞をフローサイトメトリーで分析し、ナイーブ型集団の代わりとしてＣＤ２７およびＣＤ２８レベルを評価した（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。次にＣＡＲ Ｔ細胞をスフェロイド（３Ｄ）フォーマットのＮｕｃｌｉｇｈｔレッド標識腫瘍細胞株でチャレンジし、上清を回収して炎症性サイトカイン産生をＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。これらの実験は、ＣＡＲ Ｔ細胞に一過性の休息を与えると、継続的な抗原曝露を受けるＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、活性化が抑えられ、より多くのナイーブ型集団が維持されることを示す。この一過性の休息は、ＩＬ－２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγのような炎症性サイトカインの産生（図１７Ａ）および抗腫瘍機能（図１７Ｂ）の観点からも機能的利益をもたらす。これらのサイトカインおよび細胞毒性の漸減は、Ｔ細胞疲弊の特徴である。
【0103】
実施例１０：Ｑ１Ｆデグロンを介したＣＡＲの分解はインビトロ慢性抗原曝露の間、ＣＡＲの機能を保持する
ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲをインビボで分解する能力を評価した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを活性化初代Ｔ細胞に形質導入した。形質導入細胞をＩＬ２、ＩＬ７、およびＩＬ１５を添加した培地中で１０日間増殖させ、その後凍結させた。
ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＡＲをインビボで分解する能力を評価した。ＺＮＦ２＿３ Ｑ１Ｆ標識ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを活性化初代Ｔ細胞に形質導入した。形質導入細胞をＩＬ２、ＩＬ７、およびＩＬ１５を添加した培地中で１０日間増殖させ、その後凍結させた。
【0104】
腫瘍がない場合にデグロン標識ＣＡＲをインビボで分解する能力を決定するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、２４時間放置し、腫瘍を有さないメスのＮＳＧ（商標）免疫不全マウスに１匹あたり２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの用量で適合移植した。２４時間後、マウスにビークル、０．８５、または８．５ｍｇ／ｋｇ 化合物Ｄ（図１８Ｂ）を経口投与した。８、２４、４８、および７２時間後に採血し（図１８Ａ）、抗ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３抗体による染色によって決定されるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合をフローで評価した。どちらの用量においても、８時間の時点でＣＤ３＋ ＣＡＲ＋細胞の５％未満が残存し、２４時間の時点においてもＣＡＲは有意に分解されたままであり（図１８Ｃ）、Ｑ１Ｆデグロン標識ＣＡＲがインビボで効率的に分解され得ることを示す。投与後４８時間までに、ＣＡＲの発現は実質的に回復した（図１８Ｃ）。
【0105】
異種移植がんモデルにおけるデグロン標識ＣＡＲのインビボ下方制御およびＣＡＲ Ｔ機能への影響を検討するために、メスのＮＳＧ（商標）マウスにウミシイタケルシフェラーゼを安定発現する５ｘ１０５個のＲａｊｉ腫瘍細胞を注射した。６日後にＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、２４時間放置し、マウスに１匹あたり２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの用量で適合移植した。マウスにビークルまたは６．８５ｍｇ／ｋｇ 化合物ＤをＢＩＤで０日目および１日目に経口投与した（図１９Ａ）。Ｄ１、Ｄ３、およびＤ１０で採血し、腫瘍蛍光を測定し（図１９Ａ）、抗ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３抗体による染色によって決定されるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合をフローで評価した。ＣＡＲの分解はデグロン標識ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および細胞傷害性機能を低下させ（図１９Ｂ～Ｄ）、ＣＡＲ Ｔ細胞を機能的に休息させるＣＡＲ周期化の能力が示される。
【0106】
実施例１１：インフレームデグロン標識ノックインは化合物を介した内在性タンパク質レベルの制御を可能にする
化合物を介した内在性タンパク質レベルの調節を可能にするためにデグロン標識をインフレームで遺伝子座にノックインする能力を研究した。Ｊｕｒｋａｔ細胞内で、ＮおよびＣ末端の両方向で、インフレームでＡＵＲＡ（図２０Ａ～１０Ｂ）またはＴＯＸ遺伝子座（図２０Ｃ～２０Ｄ）にノックインされるＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３－Ｖ５標識－Ｔ２Ａ－ｍｕＴｈｙ１．１標識を送達するようにアデノ随伴ウイルスベクターを設計した。次にＪｕｒｋａｔを電気穿孔し、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質を導入した。５日後、ノックイン細胞を１μＭ 化合物ＡまたはＤＭＳＯとともに１６時間インキュベートした。次に細胞をペレット化し、溶解し、変性タンパク質ゲル上で泳動させ、メンブレンに転写し、抗体でプローブし、フィルムで可視化した。ウェスタンブロッティングは、Ａｕｒｏｒａ Ａ（図２０Ａ～２０Ｂ）および標識ＴＯＸ（図２０Ｄ）の両方のレベルが化合物Ａの存在下で減少したことを示し、デグロンで内在性タンパク質を標識することはタンパク質レベルの小分子制御を可能にすることが示された。
化合物を介した内在性タンパク質レベルの調節を可能にするためにデグロン標識をインフレームで遺伝子座にノックインする能力を研究した。Ｊｕｒｋａｔ細胞内で、ＮおよびＣ末端の両方向で、インフレームでＡＵＲＡ（図２０Ａ～１０Ｂ）またはＴＯＸ遺伝子座（図２０Ｃ～２０Ｄ）にノックインされるＩＫＺＦ１ ＺＮＦ２＿３－Ｖ５標識－Ｔ２Ａ－ｍｕＴｈｙ１．１標識を送達するようにアデノ随伴ウイルスベクターを設計した。次にＪｕｒｋａｔを電気穿孔し、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質を導入した。５日後、ノックイン細胞を１μＭ 化合物ＡまたはＤＭＳＯとともに１６時間インキュベートした。次に細胞をペレット化し、溶解し、変性タンパク質ゲル上で泳動させ、メンブレンに転写し、抗体でプローブし、フィルムで可視化した。ウェスタンブロッティングは、Ａｕｒｏｒａ Ａ（図２０Ａ～２０Ｂ）および標識ＴＯＸ（図２０Ｄ）の両方のレベルが化合物Ａの存在下で減少したことを示し、デグロンで内在性タンパク質を標識することはタンパク質レベルの小分子制御を可能にすることが示された。
【0107】
実施例１２：3-(5-(6,7-ジヒドロ-5H-ピロロ[3,4-b]ピリジン-6-カルボニル)-1－オキソイソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｂ）の合成
CH3CN (ACN) (5 mL)中、2-(2,6-ジオキソ-3-ピペリジル)-1－オキソ-イソインドリン-5-カルボン酸(400 mg、1.4 mmol)の溶液に、N,N,N',N'-テトラメチルクロロホルムアミジニウム ヘキサフルオロホスフェート(TCFH) (779 mg、2.8 mmol)、N-メチルイミダゾール(NMI) (1.2 g、14 mmol)、および6,7-ジヒドロ-5H-ピロロ[3,4-b]ピリジン;ジヒドロクロライド(349 mg、1.8 mmol)を添加した。次に、混合物を室温で１時間攪拌した。反応をLCMSで監視した。沈殿した固体を濾過により回収した。粗製物をPrep-HPLCで精製し、3-[5-(5,7-ジヒドロピロロ[3,4-b]ピリジン-6-カルボニル)-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(438.7 mg、79% 収率)を灰色固体として得た。分析LC/MS (方法５): MS[M+H+] 391.1. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 11.03 (s, 1H), 8.54 - 8.43 (m, 1H), 7.94 - 7.65 (m, 4H), 7.41 - 7.23 (m, 1H), 5.23 - 5.11 (m, 1H), 5.00 - 4.75 (m, 4H), 4.62 - 4.36 (m, 2H), 3.04 - 2.84 (m, 1H), 2.69 - 2.56 (m, 1H), 2.50 - 2.36 (m, 1H), 2.12 - 2.00 (m, 1H).
【化1】
【0108】
実施例１３：3-[5-(ブロモメチル)-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン（中間体１ｃ）の合成
【化2】
【0109】
化合物２の合成
メタノール (1.0 L)中、4-ブロモ-2-メチル安息香酸(120 g、558 mmol)の溶液に、２０～４０℃の濃硫酸(109 g、1.12 mol、60 mL)を添加し、次に混合物を１８時間、６５℃に加熱した。TLC (石油エーテル/酢酸エチル = 3:1、Rf (反応物) = 0.1、Rf (生成物) = 0.4)は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、残留物を水相と有機層とに分液した。水相を酢酸エチル(1 L x 3)で抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(500 mL)、ブライン(500 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、メチル 4-ブロモ-2-メチルベンゾエート(122 g、95 % 収率)を黄色油として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.35 (dd, J = 8.4 Hz, 1.6 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)
【化3】
【0110】
化合物３の合成
アセトニトリル(1.20 L)中、メチル 4-ブロモ-2-メチルベンゾエート(122 g、533 mmol)の溶液に、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル) (6.12 g、37.3 mmol)を添加し、反応混合物を８２℃に加熱し、N-ブロモスクシンイミド(142 g、799 mmol)を数回に分けて添加し、３時間攪拌した。LCMSは、反応が終了したことを示した。反応物を真空濃縮した(５０℃)。残留物を石油エーテル/ジクロロメタン(20:1、100 mL)中に懸濁し、濾過し、濾液を濃縮し、粗製物 150 gを得、これをさらに精製することなく次のステップにそのまま使用した。
【化4】
【0111】
化合物５の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(80 mL)中、メチル メチル 4-ブロモ-2-(ブロモメチル)ベンゾエート(115 g、375 mmol)および3-アミノピペリジン-2,6-ジオン(61.7 g、375 mmol、HCl塩)の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(145 g、1.13 mol)を添加した。混合物を５０℃で１６時間攪拌した。HPLCは、出発物質の大半が消費されたことを示した。反応混合物に酢酸(150 mL)を添加し、５０℃で１時間攪拌した。HPLCは、中間体が完全に消費されたことを示した。反応物を２０℃に冷却し、濾過し、濾過ケーキを水(200 mL)およびエーテルアセテート(200 mL)で洗浄し、3-(5-ブロモ-1－オキソ-イソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン(91g、75.1 % 収率)をオフブルー固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.01 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.73-7.66 (m, 2H), 5.14-5.09 (m, 1H), 4.47 (d, J = 16 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 16 Hz, 1H), 2.92-2.89 (m, 1H), 2.73-2.58 (m, 1H), 2.41-2.37 (m, 1H), 2.03-1.99 (m, 1H)
【化5】
【0112】
化合物６の合成
ドライジオキサン(20 mL)中、3-(5-ブロモ-1－オキソ-イソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン(80 g、248 mmol)の溶液に、トリブチルスタンニルメタノール(87 g、272 mmol)を添加し、混合物を２５℃で攪拌し、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (28.6 g、24.8 mmol)を反応物に窒素下で添加した。反応混合物を１００℃で１６時間攪拌した。LCMSは、反応が終了したことを示した。反応物を濃縮し、ジクロロメタン/メタノール(10:1、250 mL x 2)で洗浄し、3-[5-(ヒドロキシメチル)-1-オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(62 g、91.3 % 収率)を褐色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.96 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.10-5.06 (m, 1H), 4.59 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.35 (dd, J = 17.2 Hz, 54 Hz, 2H), 2.91-2.85 (m, 1H), 2.59-2.55 (m, 1H), 2.38-2.35 (m, 1H), 2.02-1.99 (m, 1H)
【化6】
【0113】
化合物１ｃの合成
ジクロロメタン(1.5 L)中、3-[5-(ヒドロキシメチル)-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(62 g、226 mmol)の懸濁液に、臭化スルフィニル(70.5 g、339 mmol)を添加した。反応混合物を１８℃で１６時間攪拌した。HPLCは、反応が終了したことを示した。反応混合物を濾過し、固体をメタノール(150 mL x 2)で洗浄し、3-[5-(ブロモメチル)-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(45.0 g、 59.0 % 収率)をオフブラウン固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.97 (s, 1H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.10-5.06 (m, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.36 (dd, J = 54 Hz, 17.2 Hz, 2H), 2.91-2.85 (m, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.47-2.35 (m, 1H), 2.00-1.98 (m, 1H)
【化7】
【0114】
実施例１４：3-(5-((4-(2-メチルピリジン-3－イル)ピペラジン-1－イル)メチル)-1－オキソイソインドリン-2－イル)ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｃ）の合成
MeCN (ACN) (5 mL)中、3-[5-(ブロモメチル)-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(400 mg、1.2 mmol)の攪拌溶液に、1-(2-メチル-3-ピリジル)ピペラジン(315 mg、1.8 mmol)およびDIEA (460 mg、3.6 mmol)を添加した。混合物を５０℃で３時間攪拌した。反応をLCMSで監視した。混合物を濃縮し、残留物をPrep-HPLCで精製し、3-[5-[[4-(2-メチル-3-ピリジル)ピペラジン-1－イル]メチル]-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(187.9 mg、34% 収率)を灰色固体として得た。分析LC/MS (方法１): MS[M+H+] 434.2. 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ 8.40 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.83 - 7.76 (m, 2H), 7.72 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.23 - 5.12 (m, 1H), 4.90 - 4.80 (m, 4H), 4.65 - 4.50 (m, 4H), 3.54 (s, 4H), 2.98 - 2.85 (m, 1H), 2.84 - 2.75 (m, 1H), 2.74 (s, 3H), 2.60 - 2.44 (m, 1H), 2.24 - 2.14 (m, 1H)
【化8】
【0115】
実施例１５：3-[5-[1-(1,3-ベンゾチアゾール-6－イルメチル)-4-ピペリジル]-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン（化合物Ｄ）の合成
DCM (20 mL)中、3-[1－オキソ-5-(4-ピペリジル)イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン;ヒドロクロライド(1.5 g、4.12 mmol)の攪拌溶液に、1,3-ベンゾチアゾール-6-カルボアルデヒド(1.35 g、8.25 mmol)およびNaBH(OAc)3 (2.62 g、12.37 mmol)を添加した。混合物を室温で終夜攪拌した。混合物を濃縮し、prep-HPLCで精製し、3-[5-[1-(1,3-ベンゾチアゾール-6－イルメチル)-4-ピペリジル]-1－オキソ-イソインドリン-2－イル]ピペリジン-2,6-ジオン(968.9 mg、2.0233 mmol、49.076% 収率)を白色固体として得た。LCMS: 475.1 [M+1]+. 1H NMR (300 MHz, メタノール-d4): δ 9.40 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.81-7.71 (m, 2H), 7.55-7.36 (m, 2H), 5.24-5.09 (m, 1H), 4.62-4.39 (m, 4H), 3.76-3.62 (m, 2H), 3.33-3.19 (m, 2H), 3.13-2.99 (m, 1H), 2.95-2.73 (m, 2H), 2.60-2.38 (m, 1H), 2.24-1.95 (m, 5H).
【化9】
【0116】
実施例１６：化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、および化合物Ｄの選択性
ｅＰＬ標識Ａｉｏｌｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ、またはＧＳＰＴ１を安定発現するＤＦ１５多発性骨髄腫細胞およびｅＰＬ標識ＣＫ１ａを安定発現するＭＤＳ－Ｌ細胞を、ｐＬＯＣ－ｅＰＬ－Ａｉｏｌｏｓ（またはＩｋａｒｏｓ、ＧＳＰＴ１、またはＣＫ１ａ）を有するレンチウイルスの感染を介して作成した。ｅＰＬ標識（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）に融合されるＩｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、およびＧＳＰＴ１を発現するＤＦ１５多発性骨髄腫細胞ならびにｅＰＬ標識に融合されるＣＫ１ａを発現するＭＤＳ－Ｌ細胞を、化合物（化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、および化合物Ｄ）を予め添加した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｎｏ．３５７０）に分配した。化合物はアコースティックディスペンサー（ＥＤＣ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＴＳアコースティックトランスファーシステム）を用いて、１０点用量反応曲線で３８４ウェルプレートに分配され、１０μＭから３倍希釈で０．０００５μＭまで希釈された。次に、１ウェルあたり、５０００個のＤＦ１５またはＭＳＤ－Ｌ細胞を含む２５μＬの培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ 熱不活化ＦＢＳ＋２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ＋１×ＮＥＡＡ＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を分配した。アッセイプレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間（ＧＳＰＴ１は２０時間）インキュベートした。インキュベート後、２５μＬのＩｎＣＥＬＬ Ｈｕｎｔｅｒ検出試薬ワーキング溶液（カリフォルニア州、フリーモント、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、カタログ番号９６－０００２）を各ウェルに添加し、室温で６０分間、遮光してインキュベートした。６０分後、ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＰＨＥＲＡｓｔａｒ発光リーダーで発行を読み取った。
ｅＰＬ標識Ａｉｏｌｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ、またはＧＳＰＴ１を安定発現するＤＦ１５多発性骨髄腫細胞およびｅＰＬ標識ＣＫ１ａを安定発現するＭＤＳ－Ｌ細胞を、ｐＬＯＣ－ｅＰＬ－Ａｉｏｌｏｓ（またはＩｋａｒｏｓ、ＧＳＰＴ１、またはＣＫ１ａ）を有するレンチウイルスの感染を介して作成した。ｅＰＬ標識（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）に融合されるＩｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、およびＧＳＰＴ１を発現するＤＦ１５多発性骨髄腫細胞ならびにｅＰＬ標識に融合されるＣＫ１ａを発現するＭＤＳ－Ｌ細胞を、化合物（化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、および化合物Ｄ）を予め添加した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｎｏ．３５７０）に分配した。化合物はアコースティックディスペンサー（ＥＤＣ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＴＳアコースティックトランスファーシステム）を用いて、１０点用量反応曲線で３８４ウェルプレートに分配され、１０μＭから３倍希釈で０．０００５μＭまで希釈された。次に、１ウェルあたり、５０００個のＤＦ１５またはＭＳＤ－Ｌ細胞を含む２５μＬの培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ 熱不活化ＦＢＳ＋２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ＋１×ＮＥＡＡ＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を分配した。アッセイプレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間（ＧＳＰＴ１は２０時間）インキュベートした。インキュベート後、２５μＬのＩｎＣＥＬＬ Ｈｕｎｔｅｒ検出試薬ワーキング溶液（カリフォルニア州、フリーモント、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、カタログ番号９６－０００２）を各ウェルに添加し、室温で６０分間、遮光してインキュベートした。６０分後、ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＰＨＥＲＡｓｔａｒ発光リーダーで発行を読み取った。
【0117】
Ｈｅｌｉｏｓについて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、インフレームＨｉＢｉｔ標識をＩＫＺＦ２遺伝子のカルボキシ末端リーディングフレームに挿入するように安定なＪｕｒｋａｔ細胞株を改変した。アコースティックディスペンサーを用いて試験化合物を１５３６ウェルプレートに移し、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中、Ｊｕｒｋａｔ／Ｈｅｌｉｏｓ／ＨｉＢｉｔ細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、最終体積５ｕｌで播種した。細胞を３７℃、９５％ ＲＨで１８時間インキュベートした。Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２ｕｌ／ｗｅｌｌで添加し、ＲＴで３０分間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーで発光を読み取ることで、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0118】
所与の基質の分解に対する化合物のＥＣ５０値（観察される最大分解の半分を達成する化合物の濃度）を決定するために、４パラメーターロジスティックモデル（シグモイド型用量反応モデル）（ＦＩＴ＝（Ａ＋｛（Ｂ－Ａ）／１＋［（Ｃ／ｘ）Ｄ］｝））を用いた（式中、Ｃは変曲点(ＥＣ５０)であり、Ｄは相関係数であり、ＡおよびＢはそれぞれ適合度の下限および上限である）。全ての基質分解曲線は、データ解析ソフトウェアパッケージのＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）を用いて処理され、評価された。Ｙｍｉｎはタンパク質残存率の最小値である。
【0119】
結果を表２～５に示す。
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【0120】
表２に示すように、化合物ＡはＨｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ、およびＩｋａｒｏｓを０．０２２μＭ以下のＥＣ５０で分解した。化合物ＡはＣＫ１ａもかなりの程度まで分解した。反対に、化合物Ｂは実施例５に記載のＪｕｒｋａｔアッセイでＱ１Ｆデグロンを５ｎＭ未満のＥＣ５０で分解した。化合物ＢはＨｅｌｉｏｓに対していくらかの分解活性を示したが、ＥＣ５０は＞１０μＭであり、これはＱ１ＦデグロンにおけるＥＣ５０よりも３桁以上高かった（表３）。化合物ＢはＧＳＰＴ１に対してもいくらかの分解活性を示した（表３）。化合物Ｃは、実施例５に記載のＪｕｒｋａｔアッセイでＱ１Ｆデグロンに対して高い選択性を示し、ＥＣ５０は２５ｎＭ未満であった（表４）。化合物Ｄもまた、実施例５に記載のＪｕｒｋａｔアッセイでＱ１Ｆデグロンに対して選択性を示し、ＥＣ５０は１ｎＭ未満であった（表５）が、Ｈｅｌｉｏｓに対してもいくらかの分解を示し、ＥＣ５０は０．４６μＭであった（表５）。
【0121】
均等物
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されない。実際、本明細書で提供される特許発明の対象の様々な変更は、記載された変更に加えて、本明細書から当業者にとって明らかになる。かかる変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されない。実際、本明細書で提供される特許発明の対象の様々な変更は、記載された変更に加えて、本明細書から当業者にとって明らかになる。かかる変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【0122】
様々な公報、特許、および特許出願が本明細書に引用され、それらの開示内容は参照により全体として組み込まれる。
【0123】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【図1A-1】
【図1A-2】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B-4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A-6C】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10A-10B】
【図11A-11C】
【図12A-12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16A-16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図18A-18B】
【図18C】
【図19A-19B】
【図19C-19D】
【図20A】
【図20B】
【図20C-20D】
【配列表】
【国際調査報告】