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特表2024-528997放射線誘発性唾液機能低下を予防するためのＡＱＰ１遺伝子療法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】放射線誘発性唾液機能低下を予防するためのＡＱＰ１遺伝子療法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240725BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240725BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240725BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 39/00 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240725BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61K38/17
A61K35/76
A61P1/00
A61P43/00 105
A61P39/00
C12N15/12 ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506727
(86)(22)【出願日】2022-08-04
(85)【翻訳文提出日】2024-03-25
(86)【国際出願番号】 US2022074559
(87)【国際公開番号】W WO2023015269
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】63/229,279
(32)【優先日】2021-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/297,342
(32)【優先日】2022-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510002280
【氏名又は名称】アメリカ合衆国
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】チオリーニ、ジョン エー．
(72)【発明者】
【氏名】ホフマン、マシュー ピー．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA25
4C084DC50
4C084NA06
4C084NA14
4C084ZA66
4C084ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA06
4C087NA14
4C087ZA66
4C087ZB21
(57)【要約】
電離放射線（ＩＲ）で処理する前にアクアポリン－１（ＡＱＰ１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を唾液腺に投与することで、その後のＩＲ誘発性機能喪失が予防される。（例えば、頭頸部がん患者における）ＩＲ治療の前にＡＱＰ１（例えば、ヒトＡＱＰ１；ｈＡＱＰ１）を投与すると、ＩＲ誘発性唾液機能低下を軽減又は予防することができ、その結果、唾液分泌量が増加する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法であって、（ａ）アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターを前記対象に投与すること、及び
（ｂ）（ａ）に続いて電離放射線を前記対象に投与すること、
を含み、
それにより、前記対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法。
【請求項2】
対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法におけるアクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターの使用であって、前記方法が、（ａ）アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターを前記対象に投与すること、及び
（ｂ）（ａ）に続いて電離放射線を前記対象に投与すること、
を含み、
それにより、前記対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する、使用。
【請求項3】
前記ベクターが前記対象の唾液腺に投与される、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項4】
ＡＱＰタンパク質が、ＡＱＰ１タンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項5】
前記ＡＱＰ１タンパク質が、ヒトＡＱＰ１タンパク質を含む、請求項４に記載の方法又は使用。
【請求項6】
前記ベクターが、ウイルスベクターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項7】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターを含む、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項8】
前記アデノウイルスベクターが、血清型２又は血清型５を含む、請求項７に記載の方法又は使用。
【請求項9】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項10】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ４４．９、又はＢＡＡＶを含む、請求項９に記載の方法又は使用。
【請求項11】
前記ＡＡＶベクターが、前記ＡＡＶベクターを含むビリオンとして投与される、請求項９又は１０に記載の方法又は使用。
【請求項12】
前記ビリオンが、ＡＡＶビリオンを含む、請求項１１に記載の方法又は使用。
【請求項13】
唾液腺の機能が、前記電離放射線を投与する前の唾液腺の機能と等価又は少なくとも等価なレベルで維持される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項14】
前記対象が、ヒト患者である、請求項１～１３のいずれかに記載の使用の方法。
【請求項15】
前記患者が、頭頚部がんを有する、請求項１４に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
この特許出願は、参照により援用される、２０２１年８月４日出願の米国仮特許出願第６３／２２９，２７９号の利益を主張する。この特許出願はまた、参照により援用される、２０２２年１月７日出願の米国仮特許出願第６３／２９７，３４２号の利益を主張する。
この特許出願は、参照により援用される、２０２１年８月４日出願の米国仮特許出願第６３／２２９，２７９号の利益を主張する。この特許出願はまた、参照により援用される、２０２２年１月７日出願の米国仮特許出願第６３／２９７，３４２号の利益を主張する。
【0002】
電子的に提出された文献の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に援用される：２０２２年８月４日付の「７６３１１１．ｘｍｌ」という名称の６，２７４バイトのファイル。
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に援用される：２０２２年８月４日付の「７６３１１１．ｘｍｌ」という名称の６，２７４バイトのファイル。
【背景技術】
【0003】
頭頸部がん患者に対する一般的な治療には、電離放射線（ＩＲ）が用いられる。しかし、これら患者にＩＲを投与すると唾液腺が損傷し、不可逆的なダメージを受け、患者のＱＯＬに悪影響を及ぼす。
【0004】
この状態に対する従来の治療法は存在しない。しかし、放射線療法後にアクアポリン－１（ＡＱＰ１）をコードしているベクターを投与すると、唾液腺の修復及び再設計に影響を与え得ることが判明した。このプロセスは、幾つかの点では有効であるが、患者にかなりの疼痛及び苦痛を与えることに加えて、口腔の健康にも大きな問題をもたらす場合がある。従って、ＩＲ療法が唾液腺に及ぼす悪影響に対抗するために頭頸部がん患者等のＩＲ治療を受けている患者を治療するための改善された法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本発明によれば、驚くべきことに、ＡＱＰＩをコードしているベクターを照射前に投与することにより、ＩＲ療法の有害な影響を軽減又は予防できることが見出された。ＩＲで処理する前にＡＱＰ１相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を唾液腺に投与することで、その後のＩＲ誘発性機能喪失が予防される。（例えば、頭頸部がん患者における）ＩＲ治療の前にＡＱＰ１（例えば、ヒトＡＱＰ１；ｈＡＱＰ１）を投与すると、ＩＲ誘発性唾液機能低下を軽減又は予防することができ、その結果、唾液分泌量が増加する。
【0006】
従って、態様によれば、本発明は、対象における放射線誘発性唾液機能不全（例えば、機能低下）を予防又は軽減するための、ＡＱＰ１タンパク質をコードしているベクター（例えば、ＡＡＶベクター）及びそのようなベクターを含むビリオン（例えば、ＡＡＶビリオン）を提供する。対象の放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減するための医薬を調製するためのベクター又はビリオンの使用も提供される。一態様においては、そのようなベクター又はビリオンは、放射線誘発性唾液機能不全から対象を保護するのに有用である。
【0007】
態様によれば、本発明は、対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法を提供する。方法は、（ａ）アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターを対象に投与すること、及び（ｂ）（ａ）に続いて電離放射線を対象に照射すること、を含み、それにより対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する。一態様においては、唾液腺の機能は、電離放射線を投与する前の唾液腺機能と等価又は少なくとも等価なレベルで維持され得る。
【0008】
ＡＱＰタンパク質は、ＡＱＰ１タンパク質を含むがこれに限定されない任意の好適なＡＱＰタンパク質であり得る。例えば、一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、ヒトＡＱＰ１（ｈＡＱＰ１）タンパク質であるか又はそれを含む。
【0009】
ＡＱＰ（例えば、ｈＡＰＱＰ１）をコードしているベクターは、ウイルスベクターを含むがこれに限定されない任意の好適なベクターであってもよく、又はそれを含んでいてもよい。例えば、一態様においては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、血清型２又は血清型５のアデノウイルスベクター）であるか又はそれを含む。別の態様においては、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ４４．９、又はＢＡＡＶ）であるか又はそれを含む。
【0010】
ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、ベクターとして、又はベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含むビリオンとして対象に投与してよい。一態様においては、ビリオンは、ＡＡＶビリオンであるか又はそれを含む。ベクター又はビリオンは、任意の好適な位置及び任意の好適な投与経路で対象に投与してよい。態様においては、ベクター又はビリオンは、対象の唾液腺に投与される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、唾液腺（例えば、耳下腺、顎下腺、又は舌下腺）に影響を及ぼすＩＲ治療を受けている対象（例えば、ヒト患者）を、アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターで前処理することを含む方法を提供する。例えば、方法は、頭頸部がん等のがんのＩＲ治療を受けている対象に適用することができる。従って、第１の態様によれば、本発明は、対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法であって、（ａ）アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質をコードしているベクターを対象に投与すること、及び（ｂ）（ａ）に続いて電離放射線を対象に照射すること、を含み、それにより対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する方法を提供する。
【0013】
本明細書で使用するとき、ＡＱＰタンパク質とも呼ばれるアクアポリンタンパク質は、水の通過を可能にするチャネルを形成する能力等の、例示的なアクアポリンタンパク質（例えば、ヒトアクアポリン（「ｈＡＱＰ」））の活性を示す任意のタンパク質であってもよく、又はそれを含んでいてもよい。ＡＱＰのタンパク質、核酸、及び関連ベクターは、当業者に公知であり、非限定的な例としてはその全体が参照により本明細書に援用される米国特許第１０，１６６，２９９号に記載されている。
【0014】
本発明の文脈におけるＡＱＰタンパク質は、野生型（ｗｔ）ＡＱＰ配列（すなわち、天然のＡＱＰタンパク質と同じアミノ酸配列を有する）を有していてもよく若しくはそれを含んでいてもよく、ｗｔ ＡＱＰタンパク質の任意の部分であってもよく若しくはそれを含んでいてもよく、又は天然のＡＱＰタンパク質のバリアントであってもよく若しくはそれを含んでいてもよいが、ただし、そのような部分又はバリアントは、水の通過を可能にするチャネルを形成する能力を保持している。本発明のＡＱＰタンパク質の水の通過を可能にするチャネルを形成する能力を判定するためのアッセイは、当業者に公知である（例えば、Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１，１５４８５－１５４９５（２００６）を参照、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【0015】
一態様においては、本発明の方法において有用なタンパク質は、天然に存在するＡＱＰ１タンパク質の全アミノ酸配列を含むＡＱＰ１タンパク質である。ヒトＡＱＰ１タンパク質の例としては、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿９３２７６６．１（配列番号１）、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１７１９８９．１（配列番号２）、及びＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１７１９９０．１（配列番号３）、及びＮＰ＿００１１７１９９１．１（配列番号４）が挙げられるが、これらに限定されない。マウスＡＱＰ１タンパク質の例としては、配列番号５が挙げられるが、これに限定されない。
【0016】
本発明で使用するためのＡＱＰのタンパク質、核酸、及び関連ベクターの例は、本明細書及び米国特許第１０，１６６，２９９号に記載されており、その全体が参照により援用される。
【0017】
一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、ＡＱＰ１タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、ＡＱＰ１タンパク質のそのような部分は、水の通過を可能にするチャネルを細胞膜に形成する能力を保持している。ＡＱＰ１タンパク質には幾つかのアイソフォームが存在する。従って、一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、ＡＱＰタンパク質のアイソフォームであるか又はそれを含み、そのようなアイソフォームは水の通過を可能にするチャネルを形成する能力を保持している。一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、ＡＱＰ１タンパク質のアイソフォーム又は他の天然に存在するバリアントの一部であるか又はそれを含み、そのような部分は、水の通過を可能にするチャネルを膜に形成する能力を保持している。ＡＱＰ１タンパク質の機能的部分及びバリアント、例えば保存的バリアントを生成する方法は、当業者に公知である。
【0018】
また、遺伝子操作によって変化したＡＱＰ１タンパク質バリアントも本発明に包含される。このようなバリアントに関しては、バリアントが本明細書に記載される少なくとも１つのＡＱＰ１タンパク質活性を保持している限り、アミノ酸配列のいかなる種類の変化も許容可能である。このような多様性の例としては、アミノ酸の欠失、アミノ酸の挿入、アミノ酸の置換、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、そのタンパク質の活性に著しい影響を与えることなく、タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）のアミノ酸を除去できる場合が多いことは、当業者によく理解されている。同様に、タンパク質の活性に著しい影響を与えることなく、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）のアミノ酸をタンパク質に挿入できる場合も多い。
【0019】
前述のように、本発明の単離されたバリアントタンパク質は、本明細書に開示される野生型ＡＱＰ１タンパク質と比較してアミノ酸置換を含有することもできる。タンパク質の活性に著しい影響を与えない限り、いかなるアミノ酸置換も許容可能である。この点に関して、アミノ酸はその物理的性質に基づいてグループに分類できることが当技術分野では理解されている。このようなグループの例としては、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、及び疎水性アミノ酸等が挙げられるが、これらに限定されない。置換を含む好ましいバリアントは、アミノ酸が同じグループのアミノ酸で置換されたものである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。
【0020】
当業者であれば、そのような置換が望まれる時点で所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）を決定することができる。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＡＱＰ１タンパク質の重要な残基を同定したり、本明細書に記載されるＡＱＰ１タンパク質の親和性を増大若しくは低下させたりすることができる。従って、一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質バリアントは、本明細書に記載されるＡＱＰ１タンパク質（例えば、配列番号１～５）に対する少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれらの値の任意の範囲）アミノ酸置換（例えば、保存的置換）を含む。一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、本明細書に記載のＡＱＰ１タンパク質（例えば、配列番号１～５）と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0021】
本発明のタンパク質は、本明細書に開示される配列及びその開示されるバリアントのみからなっていてもよいが、そのようなタンパク質は、ＡＱＰ１活性を付与しないが他の有用な機能を有するアミノ酸配列を更に含有し得る。追加の配列が水の通過を可能にするチャネルを形成するタンパク質の能力に望ましくない影響を与えることのない限り、単離されたタンパク質配列に任意の有用な追加のアミノ酸配列を付加してもよい。例えば、本発明の単離されたタンパク質は、ペプチドの可視化又は精製に有用なアミノ酸配列を含有し得る。このような配列は、標識（例えば酵素）又はタグ（例えば抗体結合部位）として作用する。このような標識及びタグの例としては、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ＨＩＳタグ、ビオチンタグ、及び蛍光タグ等が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を標識又はタグ付けするための他の有用な配列は、当業者に公知である。
【0022】
上記の修飾に加えて、本発明の単離されたタンパク質は、そのような修飾が水の通過を可能にするチャネルを形成するタンパク質の能力に著しい影響を与えない限り、更に修飾されてもよい。そのような修飾は、例えば、タンパク質の安定性、溶解性、又は吸収性を高めるために行ってよい。そのような修飾の例としては、ペプチドのペグ化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、パルミトイル化、アミド化、及び／又は他の化学修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【0023】
ＡＱＰ１タンパク質は、機能的なＡＱＰ１タンパク質を発現する任意の種に由来していてよい。ＡＱＰ１タンパク質は、ヒト又は他の哺乳動物のＡＱＰ１タンパク質の配列又はその一部を含み得る。更なる例としては、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、若しくは他のコンパニオンアニマル、他の動物園動物、又は他の家畜のＡＱＰ１タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、ヒトＡＱＰ１タンパク質のアミノ酸配列又はその一部を含む。別の態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は、マウスＡＱＰ１タンパク質のアミノ酸配列又はその一部を含む。
【0024】
一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質は融合セグメントに接合され、そのようなタンパク質はＡＱＰ１融合タンパク質と呼ばれる。そのようなタンパク質は、ＡＱＰ１タンパク質ドメイン（本明細書ではＡＱＰ１ドメインとも呼ばれる）及び融合セグメントを含む。融合セグメントは、ＡＱＰ１タンパク質の特性を向上させることができる任意のサイズのアミノ酸セグメントである。例えば、本発明の融合セグメントは、ＡＱＰ１融合タンパク質の安定性を増大させる、柔軟性を付加する、又はＡＱＰ１融合タンパク質の多量体化を強化若しくは安定化することができる。融合セグメントの例としては、免疫グロブリン融合セグメント、アルブミン融合セグメント、並びにタンパク質の生物学的半減期を延長する、タンパク質に柔軟性を与える、及び／又は多量体化を強化若しくは安定化する任意の他の融合セグメントが挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の融合セグメントを使用することは、本開示の範囲内である。融合セグメントは、本発明のＡＱＰ１タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に接合させてよい。本明細書で使用するとき、「接合」とは、遺伝子工学技術を用いた結合によって組み合わせることを指す。そのような態様においては、２つのコード配列がインフレームであり、転写産物が連続融合タンパク質を形成するように、ＡＱＰ１タンパク質をコードしている核酸分子を、融合セグメントをコードしている核酸分子に物理的に連結させる。一態様においては、ＡＱＰ１タンパク質を融合セグメントに直接接合させてもよく、又はＡＱＰ１タンパク質を１つ以上のアミノ酸のリンカーによって融合セグメントに連結させてもよい。
【0025】
本明細書に記載のＡＱＰ１タンパク質（例えば、ＡＱＰ１融合タンパク質）をコードしている核酸分子（ポリヌクレオチド）もまた、本発明の態様として提供される。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又はＲＮＡを含んでいてよく、一本鎖又は二本鎖であってよく、天然、合成、及び／又は組換えであってよい。
【0026】
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホホロチオエートヌクレオチド等）を含み得る。コード配列のサイレント変異は、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）に起因し、それによって、１つを超えるコドンが同じアミノ酸残基をコードすることができる。従って、例えば、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、又はＴＴＧがロイシンをコードすることができ；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、又はＡＧＣがセリンをコードすることができ；ＡＡＴ又はＡＡＣがアスパラギンをコードすることができ；ＧＡＴ又はＧＡＣがアスパラギン酸をコードすることができ；ＴＧＴ又はＴＧＣがシステインをコードすることができ；ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、又はＧＣＧがアラニンをコードすることができ；ＣＡＡ又はＣＡＧがグルタミンをコードすることができ；ＴＡＴ又はＴＡＣがチロシンをコードすることができ；ＡＴＴ、ＡＴＣ、又はＡＴＡがイソロイシンをコードすることができる。
【0027】
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと、細胞へのポリヌクレオチドの送達及び／又は細胞内でのポリヌクレオチドの発現を可能にするエレメントとを含むコンストラクトの一部として提供され得る。例えば、ＡＱＰ１をコードしているポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結され得る。コード配列に動作可能に連結された発現制御配列は、発現制御配列に適合する条件下でコード配列が発現するようにライゲーションされる。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードしている遺伝子の前にある開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持、及び停止コドン等が含まれるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ最初期Ｉ型プロモーター、ポックスウイルスプロモーター、３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ｓＥ／Ｌプロモーター、７．５Ｋプロモーター、４０Ｋプロモーター、及びＣ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
ＡＱＰ１又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自己持続配列複製系（３ＳＲ）、及びＱＯＥ≦レプリカーゼ増幅系（ＱＢ）等のインビトロ法によってクローニング又は増幅することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、分子のＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いたｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅の方法論は当業者に周知である。
【0029】
本発明で使用するためのベクターとしては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）、細菌ベクター、及びウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターが挙げられる。ベクターがプラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）である場合、プラスミドをキトサンと複合体化してもよい。
【0030】
一態様においては、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、血清型２又は血清型５）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターであるか又はそれを含む。そのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、ＡＡＶ１２ベクター、ＡＡＶ４４．９（その全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１８／０３５５３７６号及び前述の米国特許第１０，１６６，２９９号に記載）、ＡＡＡＶベクター、及びＢＡＡＶベクターから選択することができ、このようなベクターはいずれも、本明細書に記載されるＡＱＰ１タンパク質をコードしている。
【0031】
一態様においては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、又はＢＡＡＶベクターであるか又はそれを含み、それぞれのベクターは、本明細書に記載のＡＱＰ１タンパク質をコードしている。一態様においては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲと、ＡＱＰ１タンパク質をコードしている核酸分子に動作可能に連結されたＣＭＶプロモーターと、を含む。
【0032】
ＡＱＰ１タンパク質をコードしているプラスミドベクターも提供される。そのようなプラスミドベクターはまた、ＡＡＶ ＩＴＲ等の制御領域、ＡＱＰ１タンパク質をコードしている核酸分子に動作可能に連結されたプロモーター、１つ以上のスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含んでいてもよい。そのようなプラスミドベクターはまた、通常、薬物耐性をコードしている核酸分子と共に、多数の制限酵素部位を含む。
【0033】
また、本発明は、ＡＡＶビリオンを提供する。本明細書で使用するとき、ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシドにカプシド形成された本発明のＡＱＰ１タンパク質をコードしているＡＡＶベクターを含む。ＡＡＶカプシドの例としては、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ４４．９カプシド、ＡＡＡＶカプシド、ＢＡＡＶカプシド、及び当業者に公知の他のＡＡＶ血清型由来のカプシドが挙げられる。一態様においては、カプシドは、キメラカプシド、すなわち１つを超える血清型由来のＶＰタンパク質を含むカプシドである。本明細書で使用するとき、本発明のＡＡＶビリオンの血清型は、ＶＰカプシドタンパク質によって付与される血清型である。例えば、ＡＡＶ２ビリオンは、ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のタンパク質を含むビリオンである。ビリオンが唾液腺の腺管細胞又は腺房細胞に効率的に形質導入できる限り、任意のＡＡＶビリオンを用いて本発明の方法を実施することもできる。
【0034】
一態様においては、ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２ビリオン、ＡＡＶ５ビリオン、ＡＡＶ６ビリオン、及びＢＡＡＶビリオンから選択され、ビリオン内のＡＡＶベクターはＡＱＰ１タンパク質をコードしている。
【0035】
本明細書で開示するＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンの生成に有用な方法は、当業者に公知である。簡潔に述べると、本発明のＡＡＶベクターは、例えば制限酵素消化、ライゲーション、ＰＣＲ増幅等の当業者に公知の技術を用いることによって、本明細書に記載の通り対象となる核酸配列を単離し、互いに接合させるために組換えＤＮＡ又はＲＮＡ技術を用いて生成することができる。本発明のＡＡＶビリオンを生成する方法は、通常、（ａ）本発明のＡＡＶベクターを宿主に導入すること、（ｂ）ヘルパーベクターを宿主細胞に導入することであって、該ヘルパーベクターがＡＡＶベクターから失われたウイルス機能を備えていること、及び（ｃ）ヘルパーウイルスを宿主細胞に導入すること、を含む。ＡＡＶベクターの複製及びＡＡＶビリオンへのパッケージングを達成するためには、ＡＡＶビリオンの複製及びパッケージングのための全ての機能が存在する必要がある。幾つかの例では、ヘルパーベクターによってコードされるウイルス機能のうちの少なくとも１つが宿主細胞によって発現され得る。ベクター及びヘルパーウイルスの導入は、標準的な技術を用いて行うことができ、同時又は連続的に行うことができる。次いで、宿主細胞を培養してＡＡＶビリオンを生成し、次いで、ＣｓＣｌ勾配等の標準的な技術を用いて精製する。残存するヘルパーウイルス活性は、熱不活化等の公知の方法を用いて不活化することができる。そのような方法では、通常、使用できる状態の高力価の高度に精製されたＡＡＶビリオンが得られる。
【0036】
特定の血清型のＡＡＶベクターは、同じ血清型のカプシドにパッケージングすることができる。例えば、ＡＡＶ２ベクターはＡＡＶ２カプシドにパッケージングすることができる。他の例では、得られたビリオンの向性を変更するために、特定の血清型のＡＡＶベクターを異なる血清型のカプシドにパッケージングする。当業者であれば、ＡＡＶベクターの血清型とＡＡＶカプシドの血清型との組み合わせを決定することができる。
【0037】
本発明で使用するためのベクターは、発現制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、コード配列に動作可能に連結された発現制御配列を含み得る。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードしている遺伝子の前にある開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持、及び停止コドン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0038】
本明細書で使用するとき、「エンハンサー」という用語は、例えば、それが動作可能に連結されるヌクレオチド配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、ヌクレオチド配列のコード領域から何キロベースも離れて位置していてもよく、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、又はＤＮＡ構造の変化を媒介することができる。様々な異なる供給源からの多数のエンハンサーが当技術分野において周知であり、（例えば、ＡＴＣＣ等の寄託機関、並びに他の商用又は個人の供給源から）クローニングされたポリヌクレオチドとして又は該ポリヌクレオチド内で入手可能である。プロモーターを含むポリヌクレオチド（一般的に使用されているＣＭＶプロモーター等）の多くは、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流、内、又は下流に位置し得る。例えば、ポリペプチドをコードしているヌクレオチドは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（「ＣＡＧプロモーター」とも呼ばれる）に動作可能に連結され得る。更に、ベクターは、ベクターのトランスフェクション／形質導入効率を特定するためのレポーターをコードしている核酸配列を含み得る。
【0039】
ＡＱＰタンパク質をコードしているベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物も提供される。ＡＱＰ１タンパク質をコードしているＡＡＶベクターを含むＡＡＶビリオンを含む組成物も提供される。そのような組成物は、担体（例えば、薬学的又は生理学的に許容される担体）を含み得る。例えば、そのような組成物は、生理学的に適合するバッファ等の水溶液を含み得る。組成物に含まれる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、及び他の生理学的平衡塩水溶液が挙げられる。幾つかの態様においては、例えば粒子の安定性を維持するため又は凝集を防ぐために賦形剤が添加される。そのような賦形剤の例としては、当業者に公知の粒子の安定性を維持するためのマグネシウム、粘着性を低下させるためのプルロン酸、凝集を低減するためのマンニトール等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
組成物は、対象への投与に適した形態で製剤化するのが好都合である。そのような組成物を製剤化する技術は、当業者に公知である。例えば、本発明のベクター（例えば、ＡＡＶベクター）又はビリオンは、生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶液と組み合わせることができる。幾つかの態様においては、賦形剤も添加される。別の態様においては、ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）又はビリオンを含む組成物を乾燥させ、投与前に生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶液を組成物に添加してよい。
【0041】
更に、ベクター又はビリオンは、単独で又は医薬製剤の一部として、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【0042】
組成物（例えば、医薬組成物）は、１つ以上の他の追加の治療剤を含んでいてもよい。組成物において使用するのに好適であり得るそのような追加の治療薬の例としては、遺伝子治療剤、抗炎症剤、フリーラジカルスカベンジャー、放射線防護剤、並びに唾液の産生を増加させる剤又は薬物が挙げられる。
【0043】
ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、ベクターとして、又はベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含むビリオンとして対象に投与してよい。一態様においては、ビリオンは、ＡＡＶビリオンである。ベクター又はビリオンは、任意の好適な位置及び任意の好適な投与経路で対象に投与してよい。態様においては、ベクター又はビリオンは、対象の唾液腺に投与される。
【0044】
本明細書で使用するとき、放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減するベクター又はビリオンの能力とは、放射線誘発性唾液機能不全を完全に又は部分的に排除するそのようなベクター又はビリオンの能力を指す。例えば、唾液流量に関して、本発明の方法は、そのような流量を正常個体（すなわち、放射線が投与されていない個体）で観察される値の７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に戻すことができる。
【0045】
本開示は、ベクター又はビリオンを対象に投与することを含む方法であって、そのような投与によって、放射線照射後にそのような対象の唾液腺機能が維持される方法を提供する。本明細書で使用するとき、ベクター又はビリオンが投与された対象において唾液腺機能が維持されるとは、放射線投与後の唾液腺機能が、放射線投与前のその対象における唾液腺機能と等価（又は少なくとも等価）であることを意味する。例えば、ベクター又はビリオンが投与された対象への照射後、対象の唾液腺機能は悪化せず、照射前の機能と等価（又は少なくとも等価）である。本発明の態様においては、方法は、（ａ）電離放射線で処理されていない対象にＡＱＰタンパク質をコードしているベクターを投与すること、及び（ｂ）（ａ）に続いて電離放射線を対象に投与することと、を含み、それにより対象における放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する。
【0046】
本明細書で使用するとき、「対象」には、ヒト及び他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、他のコンパニオンアニマル、他の動物園動物、実験動物（例えばマウス）、及び家畜が含まれる。
【0047】
ベクター又はビリオンは、様々な経路で投与することができる。幾つかの態様においては、ベクター又はビリオンは、エアロゾルによって投与される。幾つかの態様においては、ベクター又はビリオンは、粘膜に投与される。幾つかの態様においては、ベクター又はビリオンは、組織又は臓器に直接投与される。幾つかの態様においては、ベクター又はビリオンは、唾液腺（例えば、耳下腺、顎下腺、又は舌下腺）に投与される。
【0048】
本発明はまた、放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減するためのエクスビボ法を提供する。そのような方法は、ベクター又はビリオンを対象の体外の細胞、組織、又は臓器に投与し、次いで、その細胞、組織、又は臓器を体内に入れることを含み得る。そのような方法は、当業者に公知である。
【0049】
態様においては、本発明は、ＡＱＰ１タンパク質をコードしているＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、唾液腺細胞）、組織、又は臓器を提供する。細胞（例えば、唾液腺細胞）、組織、又は臓器（例えば、耳下腺、顎下腺、又は舌下腺等の唾液腺）は、照射を計画中であるか若しくは照射を受けた対象のものであってもよく、又はエクスビボの細胞、組織、若しくは臓器であってもよい。
【0050】
ベクター、ビリオン、又はその組成物（例えば、医薬組成物）は、単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。好適であり得るそのような追加の治療薬の例としては、遺伝子治療剤、抗炎症剤、フリーラジカルスカベンジャー、放射線防護剤、並びに唾液の産生を増加させる剤又は薬物が挙げられる。
【0051】
有効である（すなわち、放射線誘発性唾液機能不全を予防又は軽減する）ように対象に投与される本明細書に開示される組成物の用量は、対象の状態、投与方法、及び処方する医師の判断に依存する。例示的な用量は、対象１キログラム当たりビリオン粒子約１０４個～１キログラム当たりビリオン粒子約１０１２個の範囲であり得る（例えば、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、及びそれらの範囲）。好ましい用量は、１キログラム当たりビリオン粒子約１０６個～１キログラム当たりビリオン粒子約１０１２個の範囲である。より好ましい用量は、１キログラム当たりビリオン粒子約１０８個～１キログラム当たりビリオン粒子約１０１２個の範囲である。
【0052】
例示的な用量は、腺１グラム当たりビリオン粒子約１０４個～腺１グラム当たりビリオン粒子約１０１２個の範囲であり得る（例えば、約１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、又はそれらの範囲）。
【0053】
幾つかの態様においては、用量は腺を満たすのに必要な流体の量によって決定される。ベクターと細胞との接触が生じるためには、ベクターを細胞に導入するために腺を流体で満たさなければならない。ＩＲ患者の場合、体積は、萎縮及び線維化に応じて、約５００μＬ～約２．５ｍＬの範囲である（例えば、以下の通り）、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１ｍＬ、１．１ｍＬ、１．２ｍＬ、１．３ｍＬ、１．４ｍＬ、１．５ｍＬ、１．６ｍＬ、１．７ｍＬ、１．８ｍＬ、１．９ｍＬ、２ｍＬ、２．１ｍＬ、２．２ｍＬ、２．３ｍＬ、２．４ｍＬ、２．５ｍＬ、又はそれらの範囲）。
【実施例】
【0054】
以下の実施例は本発明を更に説明するが、無論、決してその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0055】
実施例１
この実施例は、ＩＲ治療の前後にＡＱＰ１をコードしているベクター（ＡＡＶベクター）を投与することで、唾液腺機能が促進されることを実証する。
この実施例は、ＩＲ治療の前後にＡＱＰ１をコードしているベクター（ＡＡＶベクター）を投与することで、唾液腺機能が促進されることを実証する。
【0056】
全てのマウス実験は、米国国立歯科頭蓋顔面研究所（ＮＩＤＣＲ）動物飼育使用委員会の承認を得た。８週齢の雌性Ｃ３Ｈマウス（国立がん研究センター動物実験施設）を用いた。照射（ＩＲ）の１０日前又は２ヵ月後に、７～８頭のＣ３Ｈマウスの群を、ＧＦＰ、ＡＱＰ１、ニュールツリン、又はＡＡＶ２－ＡＱＰ１＋ＡＡＶ２－ニュールツリンの組み合わせのいずれかをコードしているＡＡＶ２ベクターで処理した。
【0057】
具体的には、処理群は、ＩＲ１０日前又はＩＲ６０日後にＡＡＶ２－ＧＦＰ（１０１０ｖｐ／ｇ）又はＡＡＶ２－ｈＡＱＰ１（１０１０又は１０７ｖｐ／ｇ）又はＡＡＶ２ＮＲＴＮ（１０６、１０８、又は１０１０ｖｐ／ｇ）を注射することを含んでいた。ベースライン唾液（非ＩＲ）は、ベクターの送達又はＩＲの前に採取したものであった。唾液腺に照射するために、各動物を特別に作られたルーサイト製治具に入れた。この治具は麻酔薬を使用せずに動物を固定し、頭頸部にのみＩＲを行うことを可能にする。
【0058】
Ｔｈｅｒａｐａｘ ＤＸＴ３００ Ｘ線照射装置（Ｐａｎｔａｋ）を用いて５回に分けてマウスに照射した（６Ｇｙ／日、５日間）。ＩＲ後、動物を治具から取り出し、気候及び採光が制御された環境に収容し（１ケージあたり５頭）、餌及び水に自由にアクセスできるようにした。ウイルスベクターを顎下腺に送達するために、マウスをケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内麻酔し、その後、ベクターを管後方に注入することにより両顎下腺に送達した。カニューレ挿入中は、形質導入効率を高めるために、０．５ｍｇ／ｋｇのアトロピンを筋肉内に適用して唾液の分泌を抑制した。
【0059】
唾液を採取するために、マウスを上記のように麻酔した後、唾液分泌を刺激するために体重１ｋｇ当たり０．２５ｍｇのピロカルピンを皮下注射した。７５ｍｍヘマトクリット管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）を用いて１．５ｍＬの予め秤量したエッペンドルフチューブに２０分間全唾液を採取し、直ちに凍結させた。１０ヵ月後、マウスを二酸化炭素室で殺処分し、分析のために腺を摘出した。実験開始前にマウスから唾液を採取した（ベースライン／非ＩＲ）。結果を図１～３に提示する。
【0060】
結果は、ＡＡＶ２－ＧＦＰ処理マウスと比較して、ＡＡＶ２－ＡＱＰ１処理は、ＩＲ前に投与した場合唾液流量の喪失を防ぐことができた、又はＩＲ後に唾液流量の回復を惹起することができた（ｐ＜．０１）ことを示した（図１～３参照）。対照的に、ニュールツリンは唾液流量の喪失を防ぐことしかできず、実質的な回復を惹起することはできなかった。更に、２つのベクターを組み合わせても相乗効果はなく、ＡＡＶ２ＡＱＰ１ベクター単独をＩＲの前又は後に投与して達成されるレベルを超えて唾液流量が実質的に増加した。
【0061】
これら結果は、ＩＲ処理前後にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与すると唾液腺機能が促進されることを裏付けている。
【0062】
本発明以前は、ＡＱＰ１発現によって流体移動のための促進された経路を形成するためにＡＱＰ１遺伝子療法には安定した上皮細胞が必要であるというのが従来の理解であった。ＡＱＰ１の臨床試験では、患者はＩＲ処理後少なくとも２年間経過している必要があった。ＩＲ処理後の細胞のターンオーバー及びリモデリングは著しいので、ＩＲ処理後に形質導入された細胞からＡＱＰ１ ＡＡＶ ＤＮＡが失われ（すなわち、持続しない）、従って流体移動のための促進された経路を形成できないであろうと予想される。例えば、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（３）：１７７６－１７８３（１９９７））には、ＡＡＶは非分裂細胞でのみ持続することができ、分裂集団では経時的に失われることが教示されている。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．，６２（５）：１５１０－１５１６（２００５））には、ＩＲ後に腺が著しくリモデリングされ、その変化に続いて機能が喪失することが教示されている。更に、Ｖｉｔｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，８：１８３－１９１（２００２））には、ＡＱＰ１遺伝子療法が腺の修復のためであるのに対し、他のアプローチは腺に対するＩＲ損傷を予防するためであることが教示されている。Ｖｉｔｏｌｏらはまた、唾液腺はゆっくりと分裂する細胞集団であり、唾液腺ではＡＡＶの形質導入が持続し得ることも開示している。
【0063】
従って、本発明以前は、ＡＱＰ１遺伝子療法はＩＲ後の唾液腺のように変化及びリモデリングする環境では持続しないため、ＡＱＰ１遺伝子療法はＩＲ誘発性機能低下に対する予防アプローチとは考えられていなかった。しかし、本明細書に記載されているように、ＩＲ処理の前後にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与することにより唾液腺機能が促進されるという本明細書に開示される発明は、驚くべきであり、かつ予想外である。
【0064】
実施例２
この実施例は、ＩＲ前後の唾液流の機序を特徴付けるものである。
この実施例は、ＩＲ前後の唾液流の機序を特徴付けるものである。
【0065】
非ＩＲマウス、ＧＦＰ処理ＩＲマウス、又は前（ＡＱＰ１Ｂ）若しくは後（ＡＱＰ１Ａ）にＡＱＰ１処理したマウスのいずれかのシングルセルＲＮＡｓｅｑのデータを用いてＵＭＡＰを作成し、１６の異なる細胞クラスターを同定した。４つの条件それぞれにおける異なるクラスター間の細胞分布の比較を用いて、図４のヒートマップを作成した。
【0066】
ＡＱＰ１Ｂは、非ＩＲと同じクレードにみられるが、ＧＦＰ及びＡＱＰ１Ａは、互いにかつＡＱＰ１Ｂ／非ＩＲクレードとは別のクレードにある。この結果は、ＡＱＰ１ＡとＡＱＰ１Ｂとの間で細胞集団が異なることを示唆している。更に、ＡＱＰ１Ｂにおける細胞型をベースとする分布のクレード構成は、非ＩＲに最も類似しているが、ＡＱＰ１Ａはこの群及びＩＲ効果ＧＦＰ群とは異なるクレードを形成している。
【0067】
これら結果は、ＩＲの前に投与された場合、唾液流量は腺の保護の結果であるが、ＩＲの後に投与された場合、唾液流量の回復は、異なる細胞集団及び環境において可能であることを裏付けている。
【0068】
実施例３
この実施例は、照射前にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与すると、照射後にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与した場合に比べて病理学的変化が少ないことを実証する。
この実施例は、照射前にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与すると、照射後にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与した場合に比べて病理学的変化が少ないことを実証する。
【0069】
マウスの顎下腺の組織学的評価を行った。照射前にＡＡＶ－ＧＦＰを投与したマウス（図５Ａ）、照射前にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与したマウス（図５Ｂ）、照射後にＡＡＶ－ＧＦＰを投与したマウス（図５Ｃ）、及び照射後にＡＡＶ－ＡＱＰ１を投与したマウス（図５Ｄ）の画像を、門近傍の各腺のおおよそ同じ領域をスキャンしたスライド全体から撮影した。腺の全体的な形態学的変化をＨ＆Ｅ染色で評価した。
【0070】
０～３の採点スコアを用いて、切片の萎縮、線維化、及び免疫浸潤を評価した。全体として、全てで萎縮及び線維化が増加していた。また、腺内胚中心形成を伴う炎症が増加し、腺カプセル内に反応性リンパ節が存在していた。多核腺房細胞の数が増加し、幾つかの管過形成の領域もみられた。
【0071】
しかし、処理後群の平均スコアは２．２±０．７５点、処理前群は１．５±０．５４点であった（ｐ＞０．０５）。従って、ＩＲ処理後群では、ＩＲ処理前群と比較して、より顕著な病理学的変化を示す傾向があった（図５Ａ～Ｄ）。
【0072】
これら結果は、ＡＱＰ１をコードしているベクターを照射前に投与すると、ＡＱＰＩをコードしているベクターを照射後に投与した場合に観察される有害な影響が軽減されることを裏付けている。
【0073】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって援用されると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書に援用される。
【0074】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「等」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【0075】
本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。
【0076】
生物学的配列
本明細書では以下の配列を参照する：
配列番号１：
１ ｍａｓｅｆｋｋｋｌｆ ｗｒａｖｖａｅｆｌａ ｔｔｌｆｖｆｉｓｉｇ ｓａｌｇｆｋｙｐｖｇ ｎｎｑｔａｖｑｄｎｖ ｋｖｓｌａｆｇｌｓｉ
６１ ａｔｌａｑｓｖｇｈｉ ｓｇａｈｌｎｐａｖｔ ｌｇｌｌｌｓｃｑｉｓ ｉｆｒａｌｍｙｉｉａ ｑｃｖｇａｉｖａｔａ ｉｌｓｇｉｔｓｓｌｔ
１２１ ｇｎｓｌｇｒｎｄｌａ ｄｇｖｎｓｇｑｇｌｇ ｉｅｉｉｇｔｌｑｌｖ ｌｃｖｌａｔｔｄｒｒ ｒｒｄｌｇｇｓａｐｌ ａｉｇｌｓｖａｌｇｈ
１８１ ｌｌａｉｄｙｔｇｃｇ ｉｎｐａｒｓｆｇｓａ ｖｉｔｈｎｆｓｎｈｗ ｉｆｗｖｇｐｆｉｇｇ ａｌａｖｌｉｙｄｆｉ ｌａｐｒｓｓｄｌｔｄ
２４１ ｒｖｋｖｗｔｓｇｑｖ ｅｅｙｄｌｄａｄｄｉ ｎｓｒｖｅｍｋｐｋ
配列番号２：
１ ｍｐｇａｒｐｌｐｌｖ ｌｖｐｑｎｔｌａｗｍ ｑｌｄａｋａｐａｈｐ ｒｐｌｑｌｌｇｒｖｇ ｐｇｓｒｑｌａｄｇｖ ｎｓｇｑｇｌｇｉｅｉ
６１ ｉｇｔｌｑｌｖｌｃｖ ｌａｔｔｄｒｒｒｒｄ ｌｇｇｓａｐｌａｉｇ ｌｓｖａｌｇｈｌｌａ ｉｄｙｔｇｃｇｉｎｐ ａｒｓｆｇｓａｖｉｔ
１２１ ｈｎｆｓｎｈｗｉｆｗ ｖｇｐｆｉｇｇａｌａ ｖｌｉｙｄｆｉｌａｐ ｒｓｓｄｌｔｄｒｖｋ ｖｗｔｓｇｑｖｅｅｙ ｄｌｄａｄｄｉｎｓｒ
１８１ ｖｅｍｋｐｋ
配列番号３：
１ ｍｆｗｔｆｇｙｅａｖ ｓｐａｇｐｓｈｌｆａ ｓｌｌｌｇｖｌｌｔｉ ｔｆｍｐｇａｒｐｌｐ ｌｖｌｖｐｑｎｔｌａ ｗｍｑｌｄａｋａｐａ
６１ ｈｐｒｐｌｑｌｌｇｒ ｖｇｐｇｓｒｑｌａｄ ｇｖｎｓｇｑｇｌｇｉ ｅｉｉｇｔｌｑｌｖｌ ｃｖｌａｔｔｄｒｒｒ ｒｄｌｇｇｓａｐｌａ
１２１ ｉｇｌｓｖａｌｇｈｌ ｌａｉｄｙｔｇｃｇｉ ｎｐａｒｓｆｇｓａｖ ｉｔｈｎｆｓｎｈｗｉ ｆｗｖｇｐｆｉｇｇａ ｌａｖｌｉｙｄｆｉｌ
１８１ ａｐｒｓｓｄｌｔｄｒ ｖｋｖｗｔｓｇｑｖｅ ｅｙｄｌｄａｄｄｉｎ ｓｒｖｅｍｋｐｋ
配列番号４：
１ ｍｑｓｇｍｇｗｎｖｌ ｄｆｗｌａｄｇｖｎｓ ｇｑｇｌｇｉｅｉｉｇ ｔｌｑｌｖｌｃｖｌａ ｔｔｄｒｒｒｒｄｌｇ ｇｓａｐｌａｉｇｌｓ
６１ ｖａｌｇｈｌｌａｉｄ ｙｔｇｃｇｉｎｐａｒ ｓｆｇｓａｖｉｔｈｎ ｆｓｎｈｗｉｆｗｖｇ ｐｆｉｇｇａｌａｖｌ ｉｙｄｆｉｌａｐｒｓ
１２１ ｓｄｌｔｄｒｖｋｖｗ ｔｓｇｑｖｅｅｙｄｌ ｄａｄｄｉｎｓｒｖｅ ｍｋｐｋ
配列番号５
１ ｍａｓｅｉｋｋｋｌｆ ｗｒａｖｖａｅｆｌａ ｍｔｌｆｖｆｉｓｉｇ ｓａｌｇｆｎｙｐｌｅ ｒｎｑｔｌｖｑｄｎｖ ｋｖｓｌａｆｇｌｓｉ
６１ ａｔｌａｑｓｖｇｈｉ ｓｇａｈｌｎｐａｖｔ ｌｇｌｌｌｓｃｑｉｓ ｉｌｒａｖｍｙｉｉａ ｑｃｖｇａｉｖａｔａ ｉｌｓｇｉｔｓｓｌｖ
１２１ ｄｎｓｌｇｒｎｄｌａ ｈｇｖｎｓｇｑｇｌｇ ｉｅｉｉｇｔｌｑｌｖ ｌｃｖｌａｔｔｄｒｒ ｒｒｄｌｇｇｓａｐｌ ａｉｇｌｓｖａｌｇｈ
１８１ ｌｌａｉｄｙｔｇｃｓ ｉｎｐａｒｓｆｇｓａ ｖｌｔｒｎｆｓｎｈｗ ｉｆｗｖｇｐｆｉｇｇ ａｌａｖｌｉｙｄｆｉ ｌａｐｒｓｓｄｆｔｄ
２４１ ｒｍｋｖｗｔｓｇｑｖ ｅｅｙｄｌｄａｄｄｉ ｎｓｒｖｅｍｋｐｋ
本明細書では以下の配列を参照する：
配列番号１：
１ ｍａｓｅｆｋｋｋｌｆ ｗｒａｖｖａｅｆｌａ ｔｔｌｆｖｆｉｓｉｇ ｓａｌｇｆｋｙｐｖｇ ｎｎｑｔａｖｑｄｎｖ ｋｖｓｌａｆｇｌｓｉ
６１ ａｔｌａｑｓｖｇｈｉ ｓｇａｈｌｎｐａｖｔ ｌｇｌｌｌｓｃｑｉｓ ｉｆｒａｌｍｙｉｉａ ｑｃｖｇａｉｖａｔａ ｉｌｓｇｉｔｓｓｌｔ
１２１ ｇｎｓｌｇｒｎｄｌａ ｄｇｖｎｓｇｑｇｌｇ ｉｅｉｉｇｔｌｑｌｖ ｌｃｖｌａｔｔｄｒｒ ｒｒｄｌｇｇｓａｐｌ ａｉｇｌｓｖａｌｇｈ
１８１ ｌｌａｉｄｙｔｇｃｇ ｉｎｐａｒｓｆｇｓａ ｖｉｔｈｎｆｓｎｈｗ ｉｆｗｖｇｐｆｉｇｇ ａｌａｖｌｉｙｄｆｉ ｌａｐｒｓｓｄｌｔｄ
２４１ ｒｖｋｖｗｔｓｇｑｖ ｅｅｙｄｌｄａｄｄｉ ｎｓｒｖｅｍｋｐｋ
配列番号２：
１ ｍｐｇａｒｐｌｐｌｖ ｌｖｐｑｎｔｌａｗｍ ｑｌｄａｋａｐａｈｐ ｒｐｌｑｌｌｇｒｖｇ ｐｇｓｒｑｌａｄｇｖ ｎｓｇｑｇｌｇｉｅｉ
６１ ｉｇｔｌｑｌｖｌｃｖ ｌａｔｔｄｒｒｒｒｄ ｌｇｇｓａｐｌａｉｇ ｌｓｖａｌｇｈｌｌａ ｉｄｙｔｇｃｇｉｎｐ ａｒｓｆｇｓａｖｉｔ
１２１ ｈｎｆｓｎｈｗｉｆｗ ｖｇｐｆｉｇｇａｌａ ｖｌｉｙｄｆｉｌａｐ ｒｓｓｄｌｔｄｒｖｋ ｖｗｔｓｇｑｖｅｅｙ ｄｌｄａｄｄｉｎｓｒ
１８１ ｖｅｍｋｐｋ
配列番号３：
１ ｍｆｗｔｆｇｙｅａｖ ｓｐａｇｐｓｈｌｆａ ｓｌｌｌｇｖｌｌｔｉ ｔｆｍｐｇａｒｐｌｐ ｌｖｌｖｐｑｎｔｌａ ｗｍｑｌｄａｋａｐａ
６１ ｈｐｒｐｌｑｌｌｇｒ ｖｇｐｇｓｒｑｌａｄ ｇｖｎｓｇｑｇｌｇｉ ｅｉｉｇｔｌｑｌｖｌ ｃｖｌａｔｔｄｒｒｒ ｒｄｌｇｇｓａｐｌａ
１２１ ｉｇｌｓｖａｌｇｈｌ ｌａｉｄｙｔｇｃｇｉ ｎｐａｒｓｆｇｓａｖ ｉｔｈｎｆｓｎｈｗｉ ｆｗｖｇｐｆｉｇｇａ ｌａｖｌｉｙｄｆｉｌ
１８１ ａｐｒｓｓｄｌｔｄｒ ｖｋｖｗｔｓｇｑｖｅ ｅｙｄｌｄａｄｄｉｎ ｓｒｖｅｍｋｐｋ
配列番号４：
１ ｍｑｓｇｍｇｗｎｖｌ ｄｆｗｌａｄｇｖｎｓ ｇｑｇｌｇｉｅｉｉｇ ｔｌｑｌｖｌｃｖｌａ ｔｔｄｒｒｒｒｄｌｇ ｇｓａｐｌａｉｇｌｓ
６１ ｖａｌｇｈｌｌａｉｄ ｙｔｇｃｇｉｎｐａｒ ｓｆｇｓａｖｉｔｈｎ ｆｓｎｈｗｉｆｗｖｇ ｐｆｉｇｇａｌａｖｌ ｉｙｄｆｉｌａｐｒｓ
１２１ ｓｄｌｔｄｒｖｋｖｗ ｔｓｇｑｖｅｅｙｄｌ ｄａｄｄｉｎｓｒｖｅ ｍｋｐｋ
配列番号５
１ ｍａｓｅｉｋｋｋｌｆ ｗｒａｖｖａｅｆｌａ ｍｔｌｆｖｆｉｓｉｇ ｓａｌｇｆｎｙｐｌｅ ｒｎｑｔｌｖｑｄｎｖ ｋｖｓｌａｆｇｌｓｉ
６１ ａｔｌａｑｓｖｇｈｉ ｓｇａｈｌｎｐａｖｔ ｌｇｌｌｌｓｃｑｉｓ ｉｌｒａｖｍｙｉｉａ ｑｃｖｇａｉｖａｔａ ｉｌｓｇｉｔｓｓｌｖ
１２１ ｄｎｓｌｇｒｎｄｌａ ｈｇｖｎｓｇｑｇｌｇ ｉｅｉｉｇｔｌｑｌｖ ｌｃｖｌａｔｔｄｒｒ ｒｒｄｌｇｇｓａｐｌ ａｉｇｌｓｖａｌｇｈ
１８１ ｌｌａｉｄｙｔｇｃｓ ｉｎｐａｒｓｆｇｓａ ｖｌｔｒｎｆｓｎｈｗ ｉｆｗｖｇｐｆｉｇｇ ａｌａｖｌｉｙｄｆｉ ｌａｐｒｓｓｄｆｔｄ
２４１ ｒｍｋｖｗｔｓｇｑｖ ｅｅｙｄｌｄａｄｄｉ ｎｓｒｖｅｍｋｐｋ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】