特表 2024-529015 ガンマデルタＴ細胞及びその組成物の操作

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】ガンマデルタＴ細胞及びその組成物の操作

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240725BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240725BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240725BHJP

   C12N 15/19 20060101ALN20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/867 Z

C12N15/09 Z

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506857

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-02-02

(86)【国際出願番号】 GB2022052039

(87)【国際公開番号】W WO2023012475

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/228,972

(32)【優先日】2021-08-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519391608

【氏名又は名称】ガンマデルタ セラピューティクス リミティッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＡＭＭＡＤＥＬＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】１ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗ２ ６ＢＤ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100200849

【弁理士】

【氏名又は名称】芦田 文人

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】コヴァックス、イストヴァン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、ウイルスベクター（例えば、ベータレトロウイルス偽型及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を有するウイルスベクター）を用いた形質導入によってγδ Ｔ細胞（例えば、ｖδ１ Ｔ細胞及びｖδ２ Ｔ細胞）を操作する方法を提供する。操作されたγδ Ｔ細胞の組成物及び同組成物を使用する方法がさらに提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、ベータレトロウイルス偽型及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含むウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することを含む、方法。

【請求項2】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＲＤ１１４である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記レトロウイルス科ウイルスベクター骨格が、レトロウイルスベクター骨格である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記レトロウイルスベクター骨格が、レンチウイルス骨格である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記レトロウイルスベクター骨格が、ガンマレトロウイルス骨格である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記レトロウイルスベクター骨格が、アルファレトロウイルス骨格である、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ１ Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ウイルスベクターが、導入遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記導入遺伝子が、細胞表面受容体をコードする、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞表面受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記導入遺伝子が、サイトカインをコードする、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記サイトカインが、分泌型である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記サイトカインが、膜結合型である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたって前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、
（ｉｉｉ）前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％を形質導入するために有効な量でベータレトロウイルス偽型を含むウイルスベクターの存在下で第２の培養期間にわたって前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、それによって、前記操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、を含む、方法。

【請求項20】

前記第１の培養期間が、１日間以上である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記第１の培養期間が、２日間以上である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記第２の培養期間が、２日間以上である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記第２の培養期間が、３日間以上である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団が、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団が、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の機能的発現を欠く、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記ウイルスベクターが、前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも２０％を形質導入するために有効な量である、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ウイルスベクターが、１０以下の感染の多重度（ＭＯＩ）において前記プライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＭＯＩが、５以下である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＭＯＩが、１～５である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ＩＬ－１５、及び前記γδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％を形質導入するために有効な量でベータレトロウイルス偽型を含むウイルスベクターの存在下で、前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養し、それによって、前記操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、を含む、方法。

【請求項31】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＡＳＣＴ－１またはＡＳＣＴ－２の発現を欠く、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＡＳＣＴ－１及びＡＳＣＴ－２の発現を欠く、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の発現を欠く、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体が、ＬＤＬ受容体である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ウイルスベクターが、１０以下のＭＯＩにおいて前記γδ Ｔ細胞の出発集団と培養される、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＭＯＩが、１～１０である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ＭＯＩが、５以下である、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ＭＯＩが、１～５である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＢａＥＶである、請求項１９～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＲＤ１１４である、請求項１９～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む、請求項１９～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記レトロウイルス科ウイルスベクター骨格が、レトロウイルスベクター骨格である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記レトロウイルスベクター骨格が、レンチウイルス骨格である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記レトロウイルスベクター骨格が、ガンマレトロウイルス骨格である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記レトロウイルスベクター骨格が、アルファレトロウイルス骨格である、請求項４３に記載の方法。

【請求項47】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ１ Ｔ細胞である、請求項１９～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項１９～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項１９～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記ウイルスベクターが、導入遺伝子を含む、請求項１９～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記導入遺伝子が、細胞表面受容体をコードする、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記細胞表面受容体が、ＣＡＲである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記導入遺伝子が、サイトカインをコードする、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記サイトカインが、分泌型である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記サイトカインが、膜結合型である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）前記ＣＡＲをコードする導入遺伝子と、
（ｉｉ）ベータレトロウイルス偽型と、
（ｉｉｉ）レトロウイルス科ウイルスベクター骨格と、を含む、ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することを含む、方法。

【請求項59】

ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）前記ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子と、
（ｉｉ）前記アーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子と、
（ｉｉｉ）ベータレトロウイルス偽型と、
（ｉｖ）レトロウイルス科ウイルスベクター骨格と、を含む、ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することを含む、方法。

【請求項60】

前記アーマータンパク質が、サイトカインである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記サイトカインが、分泌型である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記サイトカインが、膜結合型である、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項６０～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＢａＥＶである、請求項５８～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＲＤ１１４である、請求項５８～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記レトロウイルス科ウイルスベクター骨格が、レトロウイルスベクター骨格である、請求項５８～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記レトロウイルスベクター骨格が、レンチウイルス骨格である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記レトロウイルスベクター骨格が、ガンマレトロウイルス骨格である、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記レトロウイルスベクター骨格が、アルファレトロウイルス骨格である、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

前記γδ Ｔ細胞が、Ｖδ１ Ｔ細胞である、請求項５８～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記γδ Ｔ細胞が、Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項５８～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記γδ Ｔ細胞が、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項５８～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたって前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、
（ｉｉｉ）ベータレトロウイルス偽型、及び前記ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターの存在下で、第２の培養期間にわたって前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、前記ウイルスベクターが、前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％を形質導入するために有効な量であり、それによって、前記ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する、方法。

【請求項74】

ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたって前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、
（ｉｉｉ）ベータレトロウイルス偽型、前記ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子、及び前記アーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含むウイルスベクターの存在下で、第２の培養期間にわたって前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、前記ウイルスベクターが、前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％を形質導入するために有効な量であり、それによって、前記ＣＡＲ及び前記アーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する、方法。

【請求項75】

前記アーマータンパク質が、サイトカインである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記サイトカインが、分泌型である、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記サイトカインが、膜結合型である、請求項７５に記載の方法。

【請求項78】

前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記第１の培養期間が、７日間以上である、請求項７３～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記第１の培養期間が、１０日間以上である、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記第２の培養期間が、７日間以上である、請求項７３～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記第２の培養期間が、１４日間以上である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団が、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する、請求項７３～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団が、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の機能的発現を欠く、請求項７８～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記ウイルスベクターが、前記プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも２０％を形質導入するために有効な量である、請求項７３～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記ウイルスベクターが、１０以下のＭＯＩにおいて前記プライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される、請求項７３～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記ＭＯＩが、５以下である、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記ＭＯＩが、１～５である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ＩＬ－１５、ならびにベータレトロウイルス偽型及び前記ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターの存在下で、前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養し、前記ウイルスベクターが、前記γδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％を形質導入するために有効な量であり、それによって、前記ＣＡＲを発現する操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、を含む、方法。

【請求項90】

ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法であって、
（ｉ）γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、
（ｉｉ）ＩＬ－１５、ならびにベータレトロウイルス偽型、前記ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子、及び前記アーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含むウイルスベクターの存在下で、前記γδ Ｔ細胞の出発集団を培養し、前記ウイルスベクターが、前記γδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％を形質導入するために有効な量であり、それによって、前記ＣＡＲを発現する操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、を含む、方法。

【請求項91】

前記アーマータンパク質が、サイトカインである、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記サイトカインが、分泌型である、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記サイトカインが、膜結合型である、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＡＳＣＴ－１またはＡＳＣＴ－２の発現を欠く、請求項８９～９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＡＳＣＴ－１またはＡＳＣＴ－２の発現を欠く、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記操作されたγδ Ｔ細胞集団が、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する、請求項８９～９６に記載の方法。

【請求項98】

前記γδ Ｔ細胞の出発集団が、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の機能的発現を欠く、請求項８９～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

前記ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体が、ＬＤＬ受容体である、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記ウイルスベクターが、１０以下のＭＯＩにおいて前記γδ Ｔ細胞の出発集団と培養される、請求項８９～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記ＭＯＩが、５以下である、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記ＭＯＩが、１～５である、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＢａＥＶである、請求項７３～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

前記ベータレトロウイルス偽型が、ＲＤ１１４である、請求項７３～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む、請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

前記レトロウイルス科ウイルスベクター骨格が、レトロウイルスベクター骨格である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記レトロウイルスベクター骨格が、レンチウイルス骨格である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記レトロウイルスベクター骨格が、ガンマレトロウイルス骨格である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項109】

前記レトロウイルスベクター骨格が、アルファレトロウイルス骨格である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項110】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ１ Ｔ細胞である、請求項７３～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項７３～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項112】

前記操作されたγδ Ｔ細胞が、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項７３～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項５８～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法によって産生される、操作されたγδ Ｔ細胞の集団。

【請求項115】

前記集団の少なくとも１０％が、ＣＡＲを発現する、請求項１１４に記載の操作されたγδ Ｔ細胞の集団。

【請求項116】

前記集団の少なくとも１０％が、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現する、請求項１１５に記載の操作されたγδ Ｔ細胞の集団。

【請求項117】

前記集団の少なくとも５０％が、前記ＣＡＲを発現する、請求項１１５または１１６に記載の操作されたγδ Ｔ細胞の集団。

【請求項118】

前記集団の少なくとも５０％が、前記ＣＡＲ及び前記アーマータンパク質を発現する、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の操作されたγδ Ｔ細胞の集団。

【請求項119】

請求項５８～１１３のいずれか１項に記載の方法によって産生される、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

がんに対するＴ細胞免疫療法への関心の高まりは、治療部分としての操作されたＴ細胞の明らかな能力に焦点を当てている。ガンマデルタＴ細胞（γδ Ｔ細胞）は、その表面上で明確に異なる決定的なγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞のサブセットを表す。このＴＣＲは、１つのガンマ（γ）鎖及び１つのデルタ（δ）鎖から構成される。ヒトγδ Ｔ細胞は、１つまたは２つのタイプ、すなわち、末梢血常在γδ Ｔ細胞及び非造血組織常在γδ Ｔ細胞として広く分類することができる。ほとんどの血液常在γδ Ｔ細胞がＶδ２ ＴＣＲを発現する一方で、これは、より頻繁にＶδ１及び／または他のＶδ鎖を使用する組織常在γδ Ｔ細胞の間ではあまり一般的ではない。

【0002】

αβ Ｔ細胞に対して、所望の導入遺伝子を発現するためのγδ Ｔ細胞の効率的な形質導入のための方法が欠如している。したがって、γδ Ｔ細胞を形質導入し、治療法として、例えば、養子Ｔ細胞療法として使用するために十分な質及び量のγδ Ｔ細胞の集団を産生するための改善された方法が、当技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、本発明は、ベータレトロウイルス偽型及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を有するウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することによって、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。ベータレトロウイルス偽型は、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）であり得る。ベータレトロウイルス偽型は、ＲＤ１１４であり得る。

【0004】

いくつかの実施形態では、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格は、レトロウイルスベクター骨格（例えば、レンチウイルス骨格、ガンマレトロウイルス骨格、またはアルファレトロウイルス骨格）である。

【0005】

操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ１ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。

【0006】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、細胞表面受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））及び／またはサイトカイン（例えば、分泌型サイトカインもしくは膜結合型サイトカイン）をコードし得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＩＬ－１５（例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の導入遺伝子は、ＣＡＲをコードし、第２の導入遺伝子は、アーマータンパク質（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする。

【0008】

別の態様では、本発明は、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。本方法は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたってγδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することと、を含む。本方法は、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量でベータレトロウイルス偽型を有するウイルスベクターの存在下で、第２の培養期間にわたってプライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、それによって、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することをさらに含み得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも２０％を形質導入するために有効な量である。

【0010】

いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、１日間以上（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、１～３日間、３～５日間、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、２日間以上（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、１～３日間、３～５日間、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、５日間以上（例えば、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、７日間以上（例えば、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、７～１０日間以上）である。

【0011】

いくつかの実施形態では、第２の培養期間は、２日間以上（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間以上、例えば、２～４日間、４～７日間、７～１０日間、１０～１４日間以上）である。いくつかの実施形態では、第２の培養期間は、７日間以上（例えば、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間以上、例えば、７～１０日間、１０～１４日間以上）である。

【0012】

いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体（例えば、ＬＤＬ受容体）の機能的発現を欠く。

【0013】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１０以下（例えば、５以下、例えば、約１～約５）の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。

【0014】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、ＩＬ－１５、及びγδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ｍ１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量でベータレトロウイルス偽型を有するウイルスベクターの存在下で、γδ Ｔの出発集団を培養し、それによって、操作されたγδ Ｔ細胞の出発集団を産生することとによって、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。

【0015】

いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の出発集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２の発現を欠く。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する。γδ Ｔ細胞の出発集団は、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体（例えば、ＬＤＬ受容体）の機能的発現を欠き得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１０以下（例えば、５以下、例えば、約１～約５）のＭＯＩにおいてγδ Ｔ細胞の出発集団と培養される。

【0017】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＢａＥＶまたはＲＤ１１４のベータレトロウイルス偽型を有する。

【0018】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む。レトロウイルス科ウイルスベクター骨格は、レトロウイルスベクター骨格（例えば、レンチウイルス骨格、ガンマレトロウイルス骨格、またはアルファレトロウイルス骨格）であり得る。

【0019】

操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ１ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。

【0020】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、細胞表面受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはサイトカイン（例えば、分泌型サイトカインもしくは膜結合型サイトカイン）をコードし得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＩＬ－１５（例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の導入遺伝子は、ＣＡＲをコードし、第２の導入遺伝子は、アーマータンパク質（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする。

【0022】

別の態様では、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子、ベータレトロウイルス偽型、及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む、ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することによって、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。

【0023】

別の態様では、本発明は、ＣＡＲコードする第１の導入遺伝子、アーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子、ベータレトロウイルス偽型、及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む、ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞の集団を形質導入することによって、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、アーマータンパク質は、サイトカイン（例えば、膜結合型サイトカインまたは分泌型サイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１５または分泌型ＩＬ－１５）である。

【0024】

いくつかの実施形態では、ベータレトロウイルス偽型は、ＢａＥＶである。他の実施形態では、ベータレトロウイルス偽型は、ＲＤ１１４である。

【0025】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む。レトロウイルス科ウイルスベクター骨格は、レトロウイルスベクター骨格（例えば、レンチウイルス骨格、ガンマレトロウイルス骨格、またはアルファレトロウイルス骨格）であり得る。

【0026】

γδ Ｔ細胞は、Ｖδ１ Ｔ細胞であり得る。γδ Ｔ細胞は、Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。γδ Ｔ細胞は、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。

【0027】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供し、ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたってγδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することによって、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。本方法は、ベータレトロウイルス偽型、及びＣＡＲをコードする導入遺伝子を有するウイルスベクターの存在下で、第２の培養期間にわたってプライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、ウイルスベクターが、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ｍ１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量であり、それによって、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生することをさらに含み得る。

【0028】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供し、ウイルスベクターの非存在下で第１の培養期間にわたってγδ Ｔ細胞の出発集団を培養して、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を産生することによって、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。本方法は、ベータレトロウイルス偽型、ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子、及びアーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を有するウイルスベクターの存在下で、第２の培養期間にわたってプライミングされたγδ Ｔ細胞の集団を培養し、ウイルスベクターが、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ｍ１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量であり、それによって、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＩＬ－１５（例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の導入遺伝子は、ＣＡＲをコードし、第２の導入遺伝子は、アーマータンパク質（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）をコードする。

【0029】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも２０％を形質導入するために有効な量である。

【0030】

いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、１日間以上（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、１～３日間、３～５日間、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、２日間以上（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、１～３日間、３～５日間、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、５日間以上（例えば、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、５～７日間、７～１０日間以上）である。いくつかの実施形態では、第１の培養期間は、７日間以上（例えば、７日間、８日間、９日間、１０日間以上、例えば、７～１０日間以上）である。

【0031】

いくつかの実施形態では、第２の培養期間は、２日間以上（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間以上、例えば、２～４日間、４～７日間、７～１０日間、１０～１４日間以上）である。いくつかの実施形態では、第２の培養期間は、７日間以上（例えば、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間以上、例えば、７～１０日間、１０～１４日間以上）である。

【0032】

いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現する。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体（例えば、ＬＤＬ受容体）の機能的発現を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９５％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９６％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９７％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９８％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９９％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。

【0033】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１０以下（例えば、５以下、例えば、約１～約５）のＭＯＩにおいてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。

【0034】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、ＩＬ－１５、ならびにベータレトロウイルス偽型及びＣＡＲをコードする導入遺伝子を有するベクターの存在下で、γδ Ｔ細胞の出発集団を培養し、ウイルスベクターが、γδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ｍ１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量であり、それによって、ＣＡＲを発現する、操作されたγδ Ｔ細胞の出発集団を産生することとによって、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。

【0035】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供することと、ＩＬ－１５、ならびにベータレトロウイルス偽型、ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子、及びアーマータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を有するウイルスベクターの存在下で、γδ Ｔ細胞の出発集団を培養し、ウイルスベクターが、γδ Ｔ細胞の出発集団の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ｍ１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質変換するために有効な量であり、それによって、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現する、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生することとによって、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、アーマータンパク質は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５である。

【0036】

いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の出発集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２の発現を欠く。操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現し得る。γδ Ｔ細胞の出発集団は、ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体（例えば、ＬＤＬ受容体）の機能的発現を欠き得る。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９５％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９６％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９７％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９８％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞集団の９９％超は、（例えば、ＢｌａＭ－Ｖｐｒベースのアッセイによって測定される）検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現（例えば、ＬＤＬ受容体）を欠く。

【0037】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１０以下（例えば、５以下、例えば、約１～約５）のＭＯＩにおいてγδ Ｔ細胞の出発集団と培養される。

【0038】

いくつかの実施形態では、ベータレトロウイルス偽型は、ＢａＥＶまたはＲＤ１１４である。

【0039】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス科ウイルスベクター骨格を含む。レトロウイルス科ウイルスベクター骨格は、レトロウイルスベクター骨格（例えば、レンチウイルス骨格、ガンマレトロウイルス骨格、またはアルファレトロウイルス骨格）であり得る。

【0040】

操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ１ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。操作されたγδ Ｔ細胞は、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞であり得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする。

【0042】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生される、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を特徴とする。

【0043】

いくつかの実施形態では、集団の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、アーマータンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、分泌型サイトカインまたは膜結合型サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、アーマータンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、分泌型サイトカインまたは膜結合型サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、ＣＡＲ及びアーマータンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、分泌型サイトカインまたは膜結合型サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、ＣＡＲ及びアーマータンパク質、例えば、サイトカイン（例えば、分泌型サイトカインまたは膜結合型サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）を発現する。

【0044】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生される、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞の集団を特徴とする。

【0045】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生される、ＣＡＲ及びアーマータンパク質を発現するγδ Ｔ細胞の集団を特徴とする。いくつかの実施形態では、アーマータンパク質は、サイトカイン（例えば、分泌型サイトカインまたは膜結合型サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、例えば、分泌型ＩＬ－１５または膜結合型ＩＬ－１５）である。

【0046】

本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途指示されない限り、複数の対象を含む。

【0047】

本明細書で使用される場合の「約」という用語は、当業者に容易に公知となるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書での「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。いくつかの場合では、「約」は、そのような変動が開示される方法を実施するために適切であるため、指定値から＋２０％、いくつかの事例では＋１０％、いくつかの事例では＋５％、いくつかの事例では＋１％、またはいくつかの事例では＋０．１％の変動を包含する。

【0048】

本明細書で使用される場合、「操作されたγδ Ｔ細胞」という用語は、導入遺伝子（すなわち、操作されたγδ Ｔ細胞またはその親細胞に形質導入された遺伝子）を発現するγδ Ｔ細胞を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、「プライミングされたγδ Ｔ細胞」という用語は、培養条件によって影響を受けた出発集団（例えば、γδ Ｔ細胞の内因性集団）を指す。いくつかの事例では、プライミングされたγδ Ｔ細胞は、培養条件を経験する前のそのプライミングされていない対応物に対して異なる機能的ウイルス侵入受容体プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、γδ Ｔ細胞の増殖した集団である。

【0050】

本明細書で使用される場合、「γδ細胞の増殖した集団」とは、γδ細胞の増殖、すなわち、γδ細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたγδ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。同様に、本明細書で使用される場合の「Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖した集団」とは、Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖、すなわち、Ｖδ１細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたＶδ１ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。同様に、本明細書で使用される場合の「Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖した集団」とは、Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖、すなわち、Ｖδ２細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたＶδ２ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。

【0051】

本明細書で使用される場合、γδ Ｔ細胞の「集団」とは、３つ以上のγδ Ｔ細胞（例えば、少なくとも１０、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、または少なくとも１０^１３個の）γδ Ｔ細胞（例えば、操作されたγδ Ｔ細胞）の群を指す。特定の細胞型の集団（例えば、内因性γδ Ｔ細胞の集団、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団、または操作されたγδ Ｔ細胞の集団）は、その型の細胞を指し、より広範な集団内の異なる型の細胞を指さない。例えば、１０^８個のＴ細胞の出発集団の細胞の１０％がγδ Ｔ細胞である場合、γδ Ｔ細胞の出発集団は、１０^７個である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「アーマータンパク質」とは、γδ Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲを発現するγδ Ｔ細胞）によって発現されると、例えば、パラクリンシグナル伝達（例えば、サイトカインシグナル伝達）を通して、標的細胞に向けたγδ Ｔ細胞の持続性免疫原性または増加した免疫原性を増加させて、例えば、細胞持続性、細胞生存性、活性化、及び他の所望の特性を改善する、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。アーマータンパク質は、膜結合型タンパク質または可溶性タンパク質であり得る。例えば、アーマータンパク質は、膜結合型受容体（例えば、αβ ＴＣＲ、天然細胞傷害性受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２受容体）、及び／またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ２受容体）などの膜結合型タンパク質、及び／または膜結合型リガンドもしくはサイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－７、膜結合型ＣＤ４０Ｌ、膜結合型４－１ＢＢ、膜結合型４－１ＢＢＬ、膜結合型ＣＣＬ１９）を含む。加えて、または代替的に、アーマータンパク質は、可溶性リガンドまたはサイトカイン（例えば、可溶性ＩＬ－１５、可溶性ＩＬ－７、可溶性ＩＬ－１２、可溶性ＣＤ４０Ｌ、可溶性４－１ＢＢＬ、及び／または可溶性ＣＣＬ１９）などの可溶性タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、アーマータンパク質は、抗原特異的ではない。

【0053】

本明細書で使用される場合、「ＩＬ－１５」とは、１つ以上のＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）サブユニット（例えば、その変異体、ムテイン、類似体、サブユニット、受容体複合体、断片、アイソフォーム、及びペプチド模倣体）のアゴニストとして作用する、天然もしくは組換えＩＬ－１５またはそのバリアントを指す。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２のように、ＩＬ－２依存性細胞株、ＣＴＬＬ－２の増殖を支援することができる既知のＴ細胞増殖因子である。ＩＬ－１５は、最初にＧｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４．５１６１：９６５－９６９，１９９４）によって１１４アミノ酸成熟タンパク質として報告された。本明細書で使用される場合の「ＩＬ－１５」という用語は、天然もしくは組換えＩＬ－１５、及びそのムテイン、類似体、サブユニット、またはその複合体（例えば、受容体複合体、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０４６００６号に記載されるｓｕｓｈｉペプチド）であり、その各々は、ＣＴＬＬ－２細胞の増殖を刺激することができる。ＣＴＬＬ－２増殖アッセイでは、組換えによって発現された前駆体でトランスフェクトされた細胞の上清及びＩＬ－１５の成熟型のフレーム内融合が、ＣＴＬＬ－２細胞増殖を誘導することができる。

【0054】

ヒトＩＬ－１５は、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４．５１６１：９６５－９６９，１９９４）によって記載される手順に従って、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって、取得することができる。ヒトＩＬ－１５ ｃＤＮＡの供託が、１９９３年２月１９日にＡＴＣＣ（登録商標）で行われ、アクセッション番号６９２４５を割り当てられた。

【0055】

ヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列（遺伝子ＩＤ ３６００）は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、アクセッションロケータＮＰ０００５７６．１ ＧＩ：１０８３５１５３（アイソフォーム１）及びＮＰ＿７５１９１５．１ ＧＩ：２６７８７９８６（アイソフォーム２）の下で見出される。マウス（ハツカネズミ）ＩＬ－１５アミノ酸配列（遺伝子ＩＤ １６１６８）は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、アクセッションロケータＮＰ＿００１２４１６７６．１ ＧＩ：３６３０００９８４の下で見出される。

【0056】

ＩＬ－１５はまた、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、及びマウスを含む、様々な哺乳類種に由来するＩＬ－１５も指し得る。本明細書で言及される場合のＩＬ－１５「ムテイン」または「バリアント」は、天然哺乳類ＩＬ－１５の配列と実質的に相同であるが、アミノ酸欠失、挿入、または置換により、天然哺乳類ＩＬ－１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドである。バリアントは、所与のアミノ酸残基が、類似生理化学的特性を有する残基によって置き換えられることを意味する、保存的に置換された配列を含み得る。保存的置換の例としては、互いに対するＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａなどの１つの脂肪族残基の別の脂肪族残基に対する置換、またはＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの間などの１つの極性残基の別の極性残基に対する置換が挙げられる。他のそのような保存的置換、例えば、類似疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。天然に存在するＩＬ－１５バリアントもまた、本発明によって包含される。そのようなバリアントの例は、交互のｍＲＮＡスプライシング事象から、またはＩＬ－１５結合特性が保持される、ＩＬ－１５タンパク質のタンパク質分解切断から生じるタンパク質である。ｍＲＮＡの交互のスプライシングは、切断型であるが生物学的に活性なＩＬ－１５タンパク質を生じさせ得る。タンパク質分解に起因するバリエーションとしては、例えば、ＩＬ－１５タンパク質からの（一般的に、１～１０個のアミノ酸からの）１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解除去に起因する、異なるタイプの宿主細胞における発現時のＮ末端またはＣ末端の差異が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質の末端は、例えば、ポリエチレングリコールなどの化学基を用いて、その物理的特性を改変するように修飾することができる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ７６：６８７－６９４，１９９５）。いくつかの実施形態では、タンパク質の末端または内部は、追加のアミノ酸で修飾することができる（Ｃｌａｒｋ－Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０：３５７４－３５７７，１９９３）。

【0057】

本明細書で使用される場合、「非造血細胞」は、間質細胞及び上皮細胞を含む。間質細胞は、任意の臓器の非造血結合組織細胞であり、その臓器の実質細胞の機能を支援する。間質細胞の例としては、線維芽細胞、周皮細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、及び非血液系腫瘍細胞が挙げられる。上皮細胞は、身体の全体を通した血管及び臓器の空洞及び表面を覆う非造血細胞である。それらは通常、形状がうろこ状、柱状、または立方体であり、細胞の単層として、または２つ以上の細胞の層として配置され得る。

【0058】

本明細書で使用される場合、「非造血組織常在γδ Ｔ細胞」、「非造血組織由来」、及び「非造血組織天然γδ Ｔ細胞」とは、組織が外植されるときに非造血組織に存在したγδ Ｔ細胞を指す。非造血組織常在γδ Ｔ細胞は、任意の好適なヒトまたは非ヒト動物非造血組織から取得され得る。非造血組織は、血液または骨髄以外の組織である。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、血液または滑液などの特定のタイプの生体液の試料から取得されない。そのような好適なヒトまたは非ヒト動物非造血組織の例としては、皮膚またはその一部（例えば、真皮または表皮）、胃腸管（例えば、胃腸上皮、結腸、小腸、胃、虫垂、盲腸、または直腸）、乳腺組織、肺（好ましくは、組織が気管支肺胞洗浄によって取得されない）、前立腺、肝臓、及び膵臓が挙げられる。いくつかの実施形態では、非造血組織常在γδ Ｔ細胞は、胸腺、脾臓、または扁桃腺などのリンパ組織に由来し得る。γδ Ｔ細胞はまた、ヒトがん組織、例えば、乳房及び前立腺に常在し得る。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、ヒトがん組織から取得されない。非造血組織試料は、標準的技術、例えば、外植（例えば、生検）によって取得され得る。非造血組織常在γδ Ｔ細胞には、例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞、二重陰性（ＤＮ）Ｔ細胞、Ｖδ２ Ｔ細胞、Ｖδ３ Ｔ細胞、及びＶδ５ Ｔ細胞が含まれる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「有効な量で」という語句は、検出可能な結果を誘導する量（例えば、ｐ＜０．０５で、例えば、出発集団に対して統計的に有意な増加した数を有する細胞の数）を指す。

【0060】

本明細書で使用される場合、「γδ細胞の増殖した集団」とは、γδ細胞の増殖、すなわち、γδ細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたγδ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。同様に、本明細書で使用される場合の「Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖した集団」とは、Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖、すなわち、Ｖδ１細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたＶδ１ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。同様に、本明細書で使用される場合の「Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖した集団」とは、Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖、すなわち、Ｖδ２細胞数の増加を誘導した条件及び持続時間で培養されたＶδ２ Ｔ細胞を含む、造血細胞の集団を指す。

【0061】

本明細書の「マーカー」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、糖脂質、または細胞ベースの分子マーカーを指し、患者の試料中のその発現または存在を、標準的方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができる。

【0062】

目的のマーカーを「発現する」細胞または細胞集団は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはその断片を含むタンパク質自体が、細胞または集団に存在すると決定されるものである。マーカーの発現を、様々な手段によって検出することができる。例えば、いくつかの実施形態では、マーカーの発現とは、細胞上のマーカーの表面密度を指す。例えば、フローサイトメトリーの読み出しとして使用される場合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、細胞集団上のマーカーの密度を表す。当業者は、ＭＦＩ値が染色パラメータ（例えば、濃度、持続時間、及び温度）ならびに蛍光色素組成物に依存することを理解するであろう。しかしながら、ＭＦＩは、適切な対照との関連で考慮されるときに定量的であり得る。例えば、細胞集団は、そのマーカーに対する抗体のＭＦＩが、同等の条件下で染色された同じ細胞集団上の適切なアイソタイプ対照抗体のＭＦＩよりも有意に高い場合に、マーカーを発現すると言われ得る。加えて、または代替的に、細胞集団は、従来のフローサイトメトリー分析方法に従って（例えば、アイソタイプまたは「蛍光マイナス１」（ＦＭＯ）対照に従ってゲートを設定することによって）正及び負のゲートを使用して、細胞ごとにマーカーを発現すると言われ得る。このメトリックによって、集団は、マーカーに対して陽性と検出された細胞の数が（例えば、アイソタイプ対照上のゲーティングによって）バックグラウンドよりも有意に高い場合に、マーカーを「発現する」と言われ得る。

【0063】

本明細書で使用される場合、「ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の機能的発現」とは、ベータ－ラクタマーゼ－Ｖｐｒ（ＢｌａＭ－ＶｐＲ）ベースのアッセイによって測定される、標的細胞集団の少なくとも５％で検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現のレベルを指す。例えば、Ｃａｖｒｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１１５１－１１５４，２００２を参照されたい。逆に、「ＶＳＶ－Ｇ侵入受容体の機能的発現を欠く」細胞集団では、細胞集団の９５％超は、ＢｌａＭ－ＶｐＲベースのアッセイによって測定される、検出可能なＶＳＶ－Ｇ侵入を媒介するために十分なレベルのＶＳＶ－Ｇ侵入受容体発現を欠く。

【0064】

本明細書で使用される場合、集団の発現が陽性細胞の割合として述べられ、その割合が参照集団の陽性細胞の対応する割合と比較されると、割合差は、各それぞれの集団の親集団の割合である。例えば、マーカーが集団Ａの細胞の１０％で発現され、同じマーカーが集団Ｂの細胞の１％で発現される場合、集団Ａは、集団Ｂよりもマーカー陽性細胞の９％高い頻度（すなわち、１０％÷１％ではなく、１０％－１％）を有すると言われる。頻度が親集団内の細胞の数で乗算されると、細胞の絶対数の差が計算される。上記に挙げられる例では、集団Ａに１００個の細胞があり、集団Ｂに１０個の細胞がある場合、集団Ａは、集団Ｂに対して１００倍の細胞の数を有し、すなわち、（１０％×１００）÷（１％×１０）である。

【0065】

マーカーの発現レベルは、核酸発現レベル（例えば、ＤＮＡ発現レベルまたはＲＮＡ発現レベル、例えば、ｍＲＮＡ発現レベル）であり得る。核酸発現レベルを決定する任意の好適な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸発現レベルは、ｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、多重ｑＰＣＲもしくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）技術、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、またはそれらの組み合わせを使用して決定される。

【0066】

本明細書で使用される場合、細胞の「参照集団」は、目的の細胞に対応する細胞集団を指し、これに対して目的の細胞の表現型が測定される。例えば、非造血組織由来のγδ細胞の分離された集団上のマーカーの発現レベルは、造血組織由来のγδ Ｔ細胞（例えば、血液常在γδ細胞、例えば、同じドナーまたは異なるドナーに由来する血液常在γδ細胞）、または異なる条件下で（例えば、実質的なＴＣＲ活性化の存在下で、外因性ＴＣＲ活性化剤（例えば、抗ＣＤ３）の存在下で、もしくは間質細胞（例えば、線維芽細胞）と実質的に接触して）増殖された非造血組織由来のγδ Ｔ細胞上の同じマーカーの発現レベルと比較され得る。集団はまた、以前の状態でのそれ自体と比較され得る。例えば、参照集団は、その増殖の前の分離された細胞集団であり得る。この場合、増殖された集団は、増殖ステップの前のそれ自体の組成物と比較され、すなわち、その過去の組成物は、この場合、参照集団である。

【0067】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意選択的に、細胞を活性化する活性化シグナル及び／または共刺激シグナルを伝播する細胞内ドメインを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のＮ末端に任意選択的なリーダー配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】広域トロピズムＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターがＶδ１ γδ Ｔ細胞を形質導入することができないことを示すグラフである。代表的なドットプロットは、増殖培養の７日目に様々な感染の多重度を使用して、ＶＳＶ－Ｇ（Ａ）またはＢａＥＶ（Ｂ）偽型のＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたγδ Ｔ細胞を示す。形質導入効率は、形質導入の７２時間後にＦＡＣＳ分析によって決定された。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、感染の多重度；ＮＶＰ、ネビラピン（ＲＴ阻害剤）。

【図2A】ＶＳＶ－Ｇ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いたＶδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入が偽形質導入をもたらすことを示すグラフである。ネビラピンの存在または非存在下で、ＭＯＩ＝１においてＶＳＶ－Ｇ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いた形質導入の４日後（上段）または８日後（下段）のＣＡＲ陽性Ｖδ１ γδ Ｔ細胞の代表的なドットプロットを示す。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、感染の多重度；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図2B】ＶＳＶ－Ｇ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いたＶδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入が偽形質導入をもたらすことを示すグラフである。ネビラピンの存在または非存在下で、様々なＭＯＩ（ＭＯＩ＝５～０．１）においてＶＳＶ－Ｇ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いた形質導入の４日後（黒い棒）または８日後（ドット付きの棒）のＣＡＲ陽性Ｖδ１ γδ Ｔ細胞の割合を示すグラフである。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、感染の多重度；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図3A】サイトカインプライミングがＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターによるＶδ１ γδ Ｔ細胞形質導入の主要な決定因子であることを示すグラフである。形質導入の３日後にＧＦＰをコードするＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターでＭＯＩ＝１において形質導入されたＧＦＰ陽性Ｖδ１細胞の割合を示す棒グラフである。細胞を、培養の開始時（０日目）、または増殖期の７日目、１０日目、１４日目、及び１５日目に形質導入した。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、多重感染；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図3B】サイトカインプライミングがＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターによるＶδ１ γδ Ｔ細胞形質導入の主要な決定因子であることを示すグラフである。増殖培養の１４日目に形質導入された細胞の代表的なドットプロットを示す。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、多重感染；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図4A】Ｖδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入効率が感染の多重度（ＭＯＩ）と相関することを示すグラフである。異なるＭＯＩによるＣＡＲをコードするＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターを用いた形質導入の３日後のＣＡＲ陽性Ｖδ１細胞の割合を示す。細胞を増殖の１０日目に形質導入した。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、感染の多重度；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図4B】Ｖδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入効率が感染の多重度（ＭＯＩ）と相関することを示すグラフである。ＭＯＩ＝５において形質導入されたＣＡＲ陽性細胞を示す代表的なドットプロットを示す。ＵＴＤ、非形質導入対照；ＭＯＩ、感染の多重度；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＮＶＰ、ネビラピン。

【図5A】ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターがＶδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３）γδ Ｔ細胞の両方を形質導入することを示すグラフである。ドットプロットは、Ｖδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３）γδ Ｔ細胞を発現するＣＡＲ（Ａ）及びＧＦＰ（Ｂ）を示す。細胞をＢａＥＶ偽型ベクター（ＭＯＩ＝５）で形質導入し、汎γδ Ｔ細胞上のゲーティング、続いて、Ｖδ１細胞上のゲーティングによって、形質導入効率を形質導入の３日後に決定した。

【図5B】ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターがＶδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３）γδ Ｔ細胞の両方を形質導入することを示すグラフである。ドットプロットは、Ｖδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３）γδ Ｔ細胞を発現するＣＡＲ（Ａ）及びＧＦＰ（Ｂ）を示す。細胞をＢａＥＶ偽型ベクター（ＭＯＩ＝５）で形質導入し、汎γδ Ｔ細胞上のゲーティング、続いて、Ｖδ１細胞上のゲーティングによって、形質導入効率を形質導入の３日後に決定した。

【図6】ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターを用いたＶδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入が反復形質導入によってさらに増強され得ることを示すグラフのセットである。Ｖδ１細胞を、１０日目（１ヒット）または連続２日（２ヒット：１０日目及び１１日目）のいずれかに、ＢａＥＶ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでＭＯＩ＝１において形質導入した。ＣＡＲ陽性細胞の割合を形質導入の７２時間後に決定した。

【図7】ベクトフシンの存在下での形質導入がレトロネクチンの存在下と同様に効率的であることを示すグラフである。Ｖδ１細胞を、様々なＭＯＩ及び様々な頻度（１または２ヒット）で、レトロネクチン（左）またはベクトフシン（右）の存在下で形質導入した。細胞を増殖の１０日目に形質導入し、ＦＡＣＳ分析を形質導入の３日後に行った。

【図8】Ｖδ１細胞がＲＤ１１４偽型ウイルスベクターで形質導入され得ることを示すグラフのセットである。Ｖδ１細胞を、ＢａＥＶ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターまたはＲＤ１１４偽型ガンマレトロウイルスベクターでＭＯＩ＝１において形質導入した。ドットプロットは、形質導入の３日後のＣＡＲを発現するＶδ１細胞を示す。

【発明を実施するための形態】

【0069】

本発明は、ウイルスベクター（例えば、ベータレトロウイルス偽型及びレトロウイルス科ウイルスベクター骨格を有するウイルスベクター）を用いた形質導入によってγδ Ｔ細胞（例えば、ｖδ１ Ｔ細胞及びｖδ２ Ｔ細胞）を操作する方法を提供する。操作されたγδ Ｔ細胞の組成物及び同組成物を使用する方法がさらに提供される。

【0070】

本発明は、部分的に、γδ Ｔ細胞がベータレトロウイルス偽型ウイルスベクターで高レベルまで形質導入され得るという予想外の発見に基づく。他のリンパ球型に対して、γδ Ｔ細胞は、例えば、ＶＳＶ－Ｇ偽型ウイルスベクターを使用する、レトロウイルス形質導入を許容しない。ＶＳＶ－Ｇベクターは、γδ Ｔ細胞に最も近い細胞型である、αβ Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞を容易に形質導入する。したがって、ベータレトロウイルス偽型ウイルスベクターがγδ Ｔ細胞を形質導入することができることは予期されなかった。さらに、本発明は、γδ Ｔ細胞の集団をベクターで形質導入するためのウイルスベクターの存在下でのγδ Ｔ細胞の最適な培養条件及び持続時間の発見にも基づく。本明細書に記載される形質導入の方法は、所望の導入遺伝子を発現するγδ Ｔ細胞の操作された集団を産生するために、γδ Ｔ細胞の効率的な形質導入を可能にする。

【0071】

形質導入の方法
一態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞、Ｖδ２ Ｔ細胞、及び／または非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞）の集団を、ベータレトロウイルス偽型及びレトロウイルス科（例えば、レトロウイルス）ベクター骨格を含むウイルスベクターで形質導入することによって、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を提供する。レトロウイルスベクター骨格は、例えば、レンチウイルス骨格、ガンマレトロウイルス骨格、またはアルファレトロウイルス骨格であり得る。ベータレトロウイルス偽型は、例えば、ＢａＥＶまたはＲＤ１１４であり得る。いくつかの実施形態では、ベータレトロウイルス偽型は、ＢａＥＶである。いくつかの実施形態では、ベータレトロウイルス偽型は、ＲＤ１１４である。

【0072】

別の態様では、本発明は、γδ Ｔ細胞の出発集団を提供し、ウイルスベクターの非存在下でγδ Ｔ細胞をプライミングし、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団をウイルスベクターの存在下で、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）を形質導入するために有効な量で培養することによって、操作されたγδ Ｔ細胞の集団を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも５％を形質導入するために有効な量のウイルスベクターの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、プライミングされたγδ Ｔ細胞の集団は、プライミングされたγδ Ｔ細胞の少なくとも２０％を形質導入するために有効な量のウイルスベクターの存在下で培養される。

【0073】

プライミングされたγδ Ｔ細胞は、ウイルスベクターの非存在下でγδ Ｔ細胞の出発集団を培養することによって取得され得る。例えば、γδ Ｔ細胞の出発集団は、少なくとも１時間（例えば、少なくとも２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日以上、例えば、約１時間～約１４日、約６時間～約１４日、約１日～約１４日、約２日～約１４日、約５日～約１４日、約７日～約１４日、約５日～約１０日、約５日～約７日、または約７日～約１０日）の第１の培養期間にわたって培養され得る。例えば、ウイルスベクターの非存在下で細胞を培養した後に、プライミングされたγδ Ｔ細胞が取得されると、プライミングされたγδ Ｔ細胞は、少なくとも１日（例えば、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日以上、例えば、約１日～約１４日、約２日～約１４日、約５日～約１４日、約７日～約１４日、約５日～約１０日、約５日～約７日、または約７日～約１０日）の第２の培養期間にわたってさらに培養され得る。第２の培養期間は、約１日～約１４日（例えば、約３日～約１４日、約３日～約１２日、約４日～約１日、約５日～約１０日、または約５日～約７日）であり得る。

【0074】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約１０以下、例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、または０．２５以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約５以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約４以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約３以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約２以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約１以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約０．５以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約０．２５以下の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、約０．２５～約１０（例えば、約０．５～約１０、約１～約１０、または約１～約５）の感染の多重度（ＭＯＩ）においてプライミングされたγδ Ｔ細胞と培養される。

【0075】

いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の形質導入は、形質導入効率を増強するための形質導入エンハンサーの使用を含む。好適な形質導入エンハンサーとしては、例えば、ベクトフシン、精子細胞、及び／またはレトロネクチンが挙げられる。本方法は、培養中にγδ Ｔ細胞を形質導入エンハンサーと接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞をネビラピンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の形質導入は、ベータレトロウイルス偽型ウイルスベクターのウイルス侵入受容体である、ＡＳＣＴ－２のγδ Ｔ細胞発現を増加させることができる、ＩＬ－１５で培地を補充することを含む。

【0076】

スピノキュレーション
本開示のいくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、（例えば、本明細書に記載される１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて）ウイルスベクターと培養されている間に、例えば、遠心分離によってスピンされ得る。この「スピノキュレーション」プロセスは、例えば、約２００ｘｇ～約２，０００ｘｇの求心力で生じ得る。求心力は、例えば、約３００ｘｇ～約１，２００ｘｇ（例えば、約３００ｘｇ、４００ｘｇ、５００ｘｇ、６００ｘｇ、７００ｘｇ、８００ｘｇ、９００ｘｇ、１，０００ｘｇ、１，１００ｘｇ、または１，２００ｘｇ以上）であり得る。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、約１０分～約３時間（例えば、約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、１１５分、１２０分、１２５分、１３０分、１３５分、１４０分、１４５分、１５０分、１５５分、１６０分、１６５分、１７０分、１７５分、１８０分以上）スピンされる。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、約２５℃の温度などの室温でスピンされる。

【0077】

スピノキュレーションステップを伴う例示的な形質導入プロトコルは、例えば、各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ６４６１， ２００９、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５：９８２４－９８３３，２０１１、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：１００７４－１００８０，２０００、及びＦｅｄｅｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４４８，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，２０１６に記載されている。

【0078】

ウイルスベクター
本明細書に記載される組成物及び方法は、γδ Ｔ細胞の効率的な形質導入のためのベータレトロウイルス偽型ウイルスベクターの使用を含む。ウイルスゲノムは、哺乳類細胞内への外因性遺伝子の効率的な送達に使用することができるベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが、典型的には、一般化または特殊形質導入によって哺乳類細胞の核ゲノムに組み込まれるため、遺伝子送達のための特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として生じ、遺伝子組み込みを誘導するために追加タンパク質または試薬を必要としない。ベータレトロウイルス偽型化され得るウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、レトロウイルス科ウイルスベクター）が挙げられる。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９６）））である。他の例は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）、テナガザル白血病ウイルス、メイソン・ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスである。本方法のためのベータレトロウイルスで偽型化され得るベクターの他の例は、例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＶｅｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８０１，０３０号）に記載されている。

【0079】

レトロウイルスベクター
いくつかの事例では、本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。本明細書に記載される方法及び組成物で使用され得る１つのタイプのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レトロウイルスのサブセットであるレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、広範囲の分裂及び非分裂細胞型を高効率で形質導入し、導入遺伝子の安定した長期的発現をもたらす。ＬＶをパッケージング及び形質導入するための最適化方略の概要は、Ｄｅｌｅｎｄａ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：Ｓ１２５，２００４で提供され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0080】

レンチウイルスベースの遺伝子移入技術の使用は、目的の導入遺伝子が収容される、高度に欠失したウイルスゲノムを持つ組換えレンチウイルス粒子のインビトロ産生に依拠する。特に、組換えレンチウイルスは、（１）パッケージング構築物、すなわち、Ｇａｇ－Ｐｏｌ前駆体をＲｅｖ（代替的にトランスで発現される）とともに発現するベクター、（２）一般的に異種性質のエンベロープタンパク質を発現するベクター、及び（３）全てのオープンリーディングフレームを奪われているが、発現される配列が挿入される、複製、カプシド封入、及び発現に必要とされる配列を維持する、ウイルスｃＤＮＡからなる移入ベクターの許容細胞株におけるイントランス共発現を通して回収される。

【0081】

本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、５’－長い末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ Ｐｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、デルタ－ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－アルファプロモーター、及び３’－自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。レンチウイルスベクターは、任意選択的に、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，１３６，５９７に記載される、中央ポリプリン管（ｃＰＰＴ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。レンチウイルスベクターは、例えば、以下に提供されるものを含み得る、ｐＨＲ’骨格をさらに含み得る。

【0082】

Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：９６３，２００４に記載されるＬｅｎｔｉｇｅｎ ＬＶが、ＤＮＡ分子を発現し、及び／または細胞を形質導入するために使用され得る。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、５’－長い末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ Ｐｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、デルタ－ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－アルファプロモーター、及び３’－自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）であり得る。任意選択的に、これらの領域のうちの１つ以上は、類似機能を実施する別の領域で置換されることが、当業者に容易に明らかになるであろう。

【0083】

エンハンサーエレメントが、修飾ＤＮＡ分子の発現を増加させるか、またはレンチウイルス組み込み効率を増加させるために使用され得る。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、ｎｅｆ配列を含み得る。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、ベクターの組み込みを増強するｃＰＰＴ配列を含み得る。ｃＰＰＴは、（＋）－鎖ＤＮＡ合成の第２の起点として作用し、その天然ＨＩＶゲノムの中央に部分的な鎖の重複を導入する。移入ベクター骨格内のｃＰＰＴ配列の導入は、核輸送及び標的細胞のＤＮＡに組み込まれるゲノムの総量を強く増加させた。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み得る。ＷＰＲＥは、転写産物の核輸出を促進することによって、及び／または新生転写産物のポリアデニル化の効率を増加させ、したがって、細胞内のｍＲＮＡの総量を増加させることによって、転写レベルで作用する。ＬＶへのＷＰＲＥの追加は、インビトロ及びインビボの両方で、いくつかの異なるプロモーターからの導入遺伝子発現レベルの大幅な改善をもたらす。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるＬＶは、ｃＰＰＴ配列及びＷＰＲＥ配列の両方を含み得る。ベクターはまた、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を可能にするＩＲＥＳ配列を含み得る。

【0084】

ＩＲＥＳ配列に加えて、複数のポリペプチドの発現を可能にする他のエレメントが有用である。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるベクターは、１つより多くのポリペプチドの発現を可能にする複数のプロモーターを含み得る。本明細書に記載される方法及び組成物で使用されるベクターは、１つより多くのポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位を含み得る。１つより多くのポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位の例は、Ｋｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．；８：８１１，２００１、Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：５６９，２００５、Ｓｚｙｍｃｚａｋ ａｎｄ Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：６２７，２００５、及びＳｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９，２００４に記載されており、それらの開示は、１つより多くのポリペプチドの発現を可能にするタンパク質切断部位に関するため、参照により本明細書に組み込まれる。将来同定される複数のポリペプチドの発現を可能にする他のエレメントが有用であり、本明細書に記載される組成物及び方法とともに使用するために好適なベクターで利用され得ることが、当業者に容易に明らかであろう。

【0085】

本明細書に記載される組成物及び方法と併せて使用され得る他のレトロウイルスベクター（例えば、レトロウイルス骨格）には、ガンマレトロウイルスベクターが含まれる。例示的なガンマレトロウイルスベクターは、ニワトリ合胞体ウイルス、ネコ白血病ウイルス、フィンケル・ビスキス・ジンキンスマウス肉腫ウイルス、ガードナー・アーンスタインネコ肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、モルモットＣ型オンコウイルス、ハーディ・ザッカーマンネコ肉腫ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、キルステンマウス肉腫ウイルス、コアラレトロウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス白血病ウイルス、ブタＣ型オンコウイルス、細網内皮症ウイルス、スナイダー・ザイレンネコ肉腫ウイルス、トレーガーアヒル脾臓壊死ウイルス、マムシレトロウイルス、及びウーリーモンキー肉腫ウイルスであるか、またはこれらに由来する。

【0086】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクター骨格は、レンチウイルス（ＬＶ）に由来する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクター骨格は、第三世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ＬＶ）（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＥＩＡＶ）に由来する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクター骨格は、自己不活性化ではないＬＶ（例えば、）に由来する。

【0087】

本明細書に記載される組成物及び方法と併せて使用され得る他のレトロウイルスベクター（例えば、レトロウイルス骨格）には、アルファレトロウイルスベクターが含まれる。例示的なアルファレトロウイルスベクターは、トリがんミルヒルウイルス２、トリ白血病ウイルス、トリ骨髄芽腫症ウイルス、トリ骨髄腫症ウイルス２９、トリ肉腫ウイルスｃｔ１０、藤浪肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ｕｒ２肉腫ウイルス、及びｙ７３肉腫ウイルスであるか、またはこれらに由来する。

【0088】

ベータレトロウイルス偽型
本明細書に記載される組成物及び方法と併せて使用されるウイルスベクターには、ベータレトロウイルス偽型エンベロープ遺伝子が含まれる。ベータレトロウイルスエンベロープ遺伝子は、正準Ｂ型またはＤ型ベータレトロウイルスに由来し得る。ベータレトウイルス偽型は、任意の好適なベータレトロウイルスに由来し得る。ベータレトロウイルスには、例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、地方病性鼻腫瘍ウイルス１型及び２型（ＥＮＴ－１及びＥＮＴ－２）、サルレトロウイルス１型、２型（ＳＲＶ－１及びＳＲＶ－２）、及び３型、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、リスザルレトロウイルス（ＳＭＲＶ）、フクロギツネ内因性Ｄ型レトロウイルス（ＴｖＥＲＶ－Ｄ）、ハツカネズミＤ型レトウイルス（ＭｕｓＤ）、サル内因性レトロウイルス（ＳＥＲＶ）、メイソン・ファイザーサルウイルスＭＰＭＶが含まれる。いくつかの実施形態では、ベータレトロウイルスエンベロープ遺伝子は、非ベータレトロウイルスベクターに由来する。これらのウイルスは、組換え及び異種間伝播を通してベータレトロウイルス偽型を潜在的に獲得している。好適な例としては、ＢａＥＶ、ネコレトロウイルスＲＤ１１４、シンノンブルウイルス（ＳＮＶ）、及び細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）が挙げられる。本明細書に記載される組成物及び方法と併せて使用され得るエンベロープ遺伝子には、その開示が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｂａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：５７８４－５７９８，２００４に記載されるものが含まれる。

【0089】

γδ Ｔ細胞
ガンマデルタＴ細胞（γδ Ｔ細胞）は、その表面上で明確に異なる決定的なγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞のサブセットを表す。このＴＣＲは、１つのガンマ（γ）鎖及び１つのデルタ（δ）鎖から構成される。ヒトγδ Ｔ細胞は、１つまたは２つのタイプ、すなわち、末梢血常在γδ Ｔ細胞及び非造血組織常在γδ Ｔ細胞として広く分類することができる。ほとんどの血液常在γδ Ｔ細胞がＶδ２ ＴＣＲを発現する一方で、これは、より頻繁にＶδ１及び／または他のＶδ鎖を使用する組織常在γδ Ｔ細胞の間ではあまり一般的ではない。本発明は、本明細書に記載されるように、所望の導入遺伝子をコードするウイルスベクターで形質導入されるγδ Ｔ細胞を提供する。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたγδ Ｔ細胞の供給源として使用するための好適なγδ Ｔ細胞には、Ｖδ１細胞、Ｖδ２細胞、Ｖδ３細胞、Ｖδ５細胞、及びＶδ８細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、Ｖδ１細胞またはＶδ２細胞の集団に由来する。いくつかの事例では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、非Ｖδ１／Ｖδ２ Ｔ細胞の集団に由来する。いくつかの事例では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、Ｖδ１細胞及びＶδ２細胞の混合集団に由来する。

【0091】

本明細書に記載されるγδ Ｔ細胞（例えば、内因性γδ Ｔ細胞またはプライミングされたγδ Ｔ細胞）は、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）侵入受容体（例えば、ＬＤＬ）を欠き得る。γδ Ｔ細胞（例えば、内因性γδ Ｔ細胞またはプライミングされたγδ Ｔ細胞）は、ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２を発現し得る。ＡＳＣＴ－１及び／またはＡＳＣＴ－２の発現は、ベータレトロウイルス偽型ベクター（例えば、ＢａＥＶ及びＲＤ１１４）を用いた形質導入を可能にし得る。ＶＳＶ－Ｇの発現の欠如は、ＶＳＶ－Ｇ偽型ベクターを用いた形質導入を妨げ得る。

【0092】

一態様では、本発明は、膜結合型タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの膜結合型タンパク質）、αβ ＴＣＲ、天然細胞傷害性受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２受容体）、ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ２受容体）、及び／または膜結合リガンドもしくはサイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－７、膜結合型ＣＤ４０Ｌ、膜結合型４－１ＢＢ、膜結合型４－１ＢＢＬ、膜結合型ＣＣＬ１９）、可溶性タンパク質（例えば、可溶性リガンドもしくはサイトカイン、例えば、可溶性ＩＬ－１５、可溶性ＩＬ－７、可溶性ＩＬ－１２、可溶性ＣＤ４０Ｌ、可溶性４－１ＢＢＬ、及び／または可溶性ＣＣＬ１９）、選択可能マーカー（例えば、レポーター遺伝子）、または自殺遺伝子をコードし得る、１つ以上の導入遺伝子を発現するように操作されたγδ Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの事例では、本発明は、ＣＡＲ及び１つ以上の追加の導入遺伝子によってコードされたタンパク質（例えば、アーマータンパク質）を発現するように操作されたγδ Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、コドン最適化される。

【0093】

いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、導入遺伝子をコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、導入遺伝子を安定的に発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、導入遺伝子を一過性に発現し得る。

【0094】

一態様では、本発明は、操作されたγδ Ｔ細胞（例えば、少なくとも１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、または１０^１３個の細胞）の細胞集団（例えば、単離された細胞集団）を特徴とし、細胞集団の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）は、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ及び／または１つ以上の追加のタンパク質）を発現する操作されたγδ Ｔ細胞の集団である。

【0095】

γδ Ｔ細胞を採取し、増殖させる方法
本発明の操作されたγδ Ｔ細胞は、任意の好適な自己もしくは同種異系γδ Ｔ細胞またはその集団に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたγδ Ｔ細胞の供給源として使用するための好適なγδ Ｔ細胞には、Ｖδ１細胞、Ｖδ２細胞、Ｖδ３細胞、Ｖδ５細胞、及びＶδ８細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、操作されたγδ Ｔ細胞の集団は、Ｖδ１細胞またはＶδ２細胞の集団に由来する。

【0096】

例えば、本明細書では、皮膚または腸などの非造血組織からＶδ１細胞を分離し、増殖させる方法が提供される。他の実施形態では、好適なγδ Ｔ細胞は、血液（例えば、末梢血）に由来し得る。血液からＶδ１細胞を単離し、増殖させる方法には、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４９９，７８８号及び国際特許公開第ＷＯ ２０１６／１９８４８０号に記載されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、好適なγδ Ｔ細胞は、腫瘍組織（例えば、腫瘍浸潤性γδ Ｔ細胞）に由来し得る。代替的に、導入遺伝子を発現するように操作され得る好適なγδ Ｔ細胞は、以下に記載される方法に従って、非造血組織に由来し得る。

【0097】

血液からのγδ Ｔ細胞の単離及び増殖
いくつかの実施形態では、本発明の操作されたγδ Ｔ細胞は、対象の血液（例えば、末梢血）に由来する。例えば、操作されたγδ Ｔ細胞は、血液由来のＶδ２細胞または血液由来のＶδ１細胞に由来し得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当技術分野で公知である任意の好適な方法に従って、対象から取得することができる。ＰＢＭＣは、ＩＬ－２の存在下で１～２週間、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）、合成ホスホ抗原（例えば、ブロモヒドリンピロリン酸塩；ＢｒＨＰＰ）、２Ｍ３Ｂ１ＰＰ、または２－メチル－３－ブテニル－１－ピロリン酸塩の存在下で培養されて、Ｖδ２細胞の濃縮集団を生成することができる。代替的に、固定化された抗ＴＣＲγδ（例えば、汎ＴＣＲγδ）は、ＩＬ－２の存在下で、例えば、約１４日間、ＰＢＭＣの集団からのＶδ２細胞の優先的な増殖を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣからのＶδ２細胞の優先的な増殖は、ＩＬ－２及びＩＬ－４の存在下での固定化された抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）の培養時に達成することができる。いくつかの実施形態では、前述の培養は、可溶性抗ＣＤ３、ＩＬ－２、及びＩＬ－４中の継代培養の前に約７日間維持される。代替的に、人工抗原提示細胞を使用して、Ｖδ２細胞などのγδ Ｔ細胞の優先的な増殖を促進することができる。例えば、照射されたａＡＰＣ、ＩＬ－２、及び／またはＩＬ－２１の存在下で培養されるＰＢＭＣ由来のγδ Ｔ細胞は、増殖して、高い割合のＶδ２細胞、中程度の割合のＶδ１細胞、及びいくつかの二重陰性細胞を含む、γδ Ｔ細胞の集団を生成することができる。前述の方法のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、（例えば、ＴＣＲγδ特異的薬剤を用いた陽性選択またはＴＣＲαβ特異的薬剤の陰性選択を通して）事前濃縮または事後濃縮することができる。Ｖδ２細胞などのγδ Ｔ細胞の増殖のためのそのような方法及び他の好適な方法は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，６３６：１－１０，２０１４に記載されている。

【0099】

いくつかの実施形態では、Ｖδ１ Ｔ細胞は、導入遺伝子（例えば、異種標的構築物）を発現するように操作することができる。Ｖδ１ Ｔ細胞の集団を取得する任意の好適な方法を使用することができる。例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，２３；５７９５－５８０５，２０１６）は、本明細書に記載される異種標的構築物を発現するように操作され得るＶδ１ Ｔ細胞の集団を取得する好適な方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、９０％を超えるγδ Ｔ細胞を生じさせ得る、磁気ビーズ選別を使用して事前濃縮される。これらの細胞は、ガス透過性バイオリアクターバッグ内で最大２１日間、１つ以上の因子（例えば、ＴＣＲアゴニスト、共受容体アゴニスト、及び／またはサイトカイン、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、及び／またはＩＦＮ－γ）の存在下で培養することができる。本方法の変形例、及びＶδ１ Ｔ細胞を取得する他の方法は、本発明の一部として好適である。例えば、血液由来Ｖδ１ Ｔ細胞は、代替的に、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４９９，７８８号及び国際特許公開第ＷＯ２０１６／１９８４８０号に記載される方法を使用して取得することができる。

【0100】

非造血組織からの非造血組織常在γδ Ｔ細胞の分離及び増殖
以下に記載されるように取得される非造血組織常在γδ Ｔ細胞は、良好な腫瘍浸潤及び保持能力を示すことができるため、本明細書に記載される導入遺伝子のための好適なビヒクルであり得る。非造血組織常在γδ Ｔ細胞の単離及び増殖のためのより詳細な方法は、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０／０９５０５８号、同第ＷＯ２０２０／０９５０５９号、同第ＷＯ２０１７／０７２３６７号、及び英国特許出願第２００６９８９．４号に記載されている。

【0101】

非造血組織常在γδ Ｔ細胞（例えば、皮膚由来のγδ Ｔ細胞及び／または非Ｖδ２ Ｔ細胞、例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞及び／またはＤＮ Ｔ細胞）は、本発明の方法による操作に好適な細胞を取得するために患者から摘出され得る、任意のヒトまたは非ヒト動物非造血組織から単離することができる。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞が由来し、増殖される非造血組織は、当技術分野で公知の方法によって取得することができる皮膚（例えば、ヒト皮膚）である。いくつかの実施形態では、皮膚は、パンチ生検によって取得される。代替的に、本明細書で提供されるγδ Ｔ細胞の単離及び増殖の方法は、胃腸管（例えば、結腸）、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、及び膵臓に適用することができる。γδ Ｔ細胞はまた、ヒトがん組織、例えば、乳房または前立腺の腫瘍に常在し得る。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞は、ヒトがん組織（例えば、固形腫瘍組織）に由来し得る。他の実施形態では、γδ Ｔ細胞は、ヒトがん組織以外の非造血組織（例えば、相当数の腫瘍細胞を含まない組織）に由来し得る。例えば、γδ Ｔ細胞は、近くのまたは隣接するがん組織から分離している皮膚の領域（例えば、健康な皮膚）に由来し得る。

【0102】

血液中で優勢であるγδ Ｔ細胞が、主にＶδ２ Ｔ細胞である一方で、非造血組織中で優勢であるγδ Ｔ細胞は、Ｖδ１ Ｔ細胞が非造血組織常在γδ Ｔ細胞集団の約７０～８０％を含むように、主にＶδ１ Ｔ細胞である。しかしながら、いくつかのＶδ２ Ｔ細胞は、非造血組織、例えば、腸でも見出され、それらは、γδ Ｔ細胞の約１０～２０％を含むことができる。非造血組織に常在するいくつかのγδ Ｔ細胞は、Ｖδ１もＶδ２ ＴＣＲも発現せず、それらは二重陰性（ＤＮ）γδ Ｔ細胞と名付けられている。これらのＤＮ γδ Ｔ細胞は、ほとんどがＶδ３発現であり、少数のＶδ５発現Ｔ細胞を含む可能性が高い。したがって、通常、非造血組織に常在し、本発明の方法によって増殖されるγδ Ｔ細胞は、好ましくは、より少量のＤＮ γδ Ｔ細胞を含む、非Ｖδ２ Ｔ細胞、例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞である。

【0103】

いくつかの実施形態では、重要なステップは、例えば、数日または数週間の培養後に、（例えば、αβ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、並びにγδ２及び非γδ２ Ｔ細胞を含み得る、例えば、混合リンパ球集団内の）非造血組織常在Ｔ細胞を、Ｔ細胞が取得された組織の非造血細胞（例えば、間質細胞、特に、線維芽細胞）から意図的に分離することである。これは、非造血組織由来のＶδ１ Ｔ細胞及びＤＮ γδ Ｔ細胞の以降の数日間及び数週間にわたる優先的かつ急速な増殖を可能にする。

【0104】

一般に、非造血組織常在γδ Ｔ細胞は、間質細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）との物理的接触の除去時に、自発的に増殖することが可能である。したがって、上記に記載される足場ベースの培養方法を使用して、そのような分離を誘導し、γδ Ｔ細胞の抑制解除をもたらして、増殖を誘発することができる。したがって、いくつかの実施形態では、実質的なＴＣＲ経路活性化が増殖ステップ中に存在しない（例えば、外因性ＴＣＲ経路活性化因子が培養物に含まれない）。さらに、本発明は、非造血組織常在γδ Ｔ細胞を増殖させる方法を提供し、本方法は、支持細胞、腫瘍細胞、及び／または抗原提示細胞との接触を伴わない。

【0105】

増殖プロトコルは、効率的なγδ Ｔ細胞の増殖を支援するために、生物学的因子の有効なカクテルの存在下で、非造血組織常在γδ Ｔ細胞を培養することを伴う。一実施形態では、γδ Ｔ細胞を増殖させる方法は、非造血組織（例えば、非造血組織由来のγδ Ｔ細胞の分離された集団、例えば、本明細書に記載される方法に従って分離される集団）から取得されたγδ Ｔ細胞の集団を提供することと、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ならびに任意選択的に、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、及び／またはＩＬ－２１の存在下でγδ Ｔ細胞を培養することと、を含む。これらのサイトカインまたはその類似体は、γδ Ｔ細胞の増殖された集団を産生するために有効な量で、ある持続時間にわたって（例えば、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間以上、例えば、５日～４０日間、７日～３５日間、１４日～２８日間、または約２１日間）細胞と培養することができる。

【0106】

完全培地、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）、ＡＩＭ－Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地、ならびにＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴＥＸＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などのγδ Ｔ細胞のプライミング及び／または増殖に使用するために好適な多数の基礎培地が、利用可能である。培地は、血清、血清タンパク質、及び抗生物質などの選択的薬剤などの他の培地因子で補充され得る。例えば、いくつかの実施形態では、培地は、２ｍＭのグルタミン、１０％のＦＢＳ、ｐＨ７．２で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸（例えば、１００μＭのＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、及びＳｅｒ、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸 Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０μｌ／Ｌのβ－メルカプトエタノールを含有する、ＲＰＭＩ－１６４０を含む。便宜的に、細胞は、好適な培地中で、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中で３７℃において培養される。

【0107】

γδ Ｔ細胞は、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグまたは皿、及び中空繊維バイオリアクターなどの他のバイオリアクターを含む、任意の好適なシステム内で本明細書に記載されるように培養され得る。そのようなシステムの使用は、当技術分野で周知である。リンパ球の培養のための一般的な方法及び技術は、当技術分野で周知である。

【0108】

本明細書に記載される方法は、１つより多くの選択ステップ、例えば、１つより多くの枯渇ステップを含むことができる。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを対象とした抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象としたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／または選択である。

【0109】

導入遺伝子
本発明の操作されたγδ Ｔ細胞は、所望の導入遺伝子を発現するように操作される。導入遺伝子を発現するように操作されたγδ Ｔ細胞は、がん治療（例えば、免疫療法）で使用するために好適である。本明細書に記載されるウイルスベクターは、導入遺伝子をコードし、これは次いで、導入されたγδ Ｔ細胞において安定的または一過性に発現される。本明細書に記載される組成物及び方法と併せて使用され得る導入遺伝子には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれる。

【0110】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、がん胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、組み合わせでのＨＥＲ２－ＨＥＲ３、組み合わせでのＨＥＲ１－ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｇ９ｄ２、またはそれらの組み合わせを標的とする。

【0111】

いくつかの事例では、本発明の操作されたγδ Ｔ細胞によって発現される導入遺伝子は、選択可能マーカー（例えば、レポーター遺伝子）または自殺遺伝子を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、例えば、毒性の場合に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を使用するインビボ枯渇のための導入遺伝子として使用することができる。同様に、ＣＤ２０は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を使用するインビボ枯渇のための導入遺伝子として使用することができる。別の例示的な導入遺伝子は、投与される操作されたγδ Ｔ細胞の薬物媒介制御を容易にするための自殺遺伝子である。自殺遺伝子の使用を通して、有害事象の場合に、修飾細胞を患者から枯渇させることができる。一実施例では、薬物結合ドメインが、カスパーゼ９アポトーシス促進分子に融合される。いくつかの事例では、導入遺伝子は、シトシンデアミナーゼである。いくつかの事例では、導入遺伝子は、チミジンキナーゼである。

【0112】

加えて、または代替的に、本開示の操作されたγδ Ｔによる発現のための導入遺伝子は、膜結合型受容体（例えば、αβ ＴＣＲ、天然細胞傷害性受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２受容体）、及び／またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ２受容体）などの膜結合型タンパク質、及び／または膜結合型リガンドもしくはサイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－７、膜結合型ＣＤ４０Ｌ、膜結合型４－１ＢＢ、膜結合型４－１ＢＢＬ、膜結合型ＣＣＬ１９）をコードする。膜結合型リガンド及びサイトカインには、天然膜結合型リガンド及びサイトカイン（例えば、トランス提示されたＩＬ－１５及び４－１ＢＢＬ）ならびに合成膜結合型構成（例えば、膜貫通タンパク質に人工的に融合されたリガンド）が含まれる。加えて、または代替的に、本発明の操作されたγδ Ｔ細胞によって発現される導入遺伝子は、可溶性リガンドまたはサイトカイン（例えば、可溶性ＩＬ－１５、可溶性ＩＬ－７、可溶性ＩＬ－１２、可溶性ＣＤ４０Ｌ、可溶性４－１ＢＢＬ、及び／または可溶性ＣＣＬ１９）などの可溶性タンパク質をコードする。

【0113】

いくつかの事例では、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を有する操作されたγδ Ｔ細胞は、免疫原性に寄与する追加の導入遺伝子で防御され得る。このような防御ＣＡＲ Ｔ細胞は、本明細書に記載される膜結合型または可溶性タンパク質のうちのいずれかなどのアーマータンパク質を発現する。例えば、アーマータンパク質は、膜結合型受容体（例えば、αβ ＴＣＲ、天然細胞傷害性受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２受容体）、及び／またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ２受容体）などの膜結合型タンパク質、及び／または膜結合型リガンドもしくはサイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－７、膜結合型ＣＤ４０Ｌ、膜結合型４－１ＢＢ、膜結合型４－１ＢＢＬ、膜結合型ＣＣＬ１９）を含む。加えて、または代替的に、本発明の操作されたγδ ＣＡＲ Ｔ細胞によって発現されるアーマータンパク質は、可溶性リガンドまたはサイトカイン（例えば、可溶性ＩＬ－１５、可溶性ＩＬ－７、可溶性ＩＬ－１２、可溶性ＣＤ４０Ｌ、可溶性４－１ＢＢＬ、及び／または可溶性ＣＣＬ１９）などの可溶性タンパク質を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、本発明の操作されたγδ Ｔ細胞は、γδ Ｔ細胞を防御するための１つ以上の導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される導入遺伝子のうちのいずれかの１つ以上）を発現するように操作される（例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｙｅｋｕ ａｎｄ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２０１６，１５：４４，２，４１２－４１８に記載されるように、防御ＣＡＲ Ｔ細胞として）。

【0115】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、コドン最適化される。

【0116】

いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１またはＶδ２細胞）の操作された集団の少なくとも３％（例えば、少なくとも４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）が、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合型もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１またはＶδ２細胞）の操作された集団の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）が、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合型もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１またはＶδ２細胞）の操作された集団の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的に全て）が、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合型もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１またはＶδ２細胞）の操作された集団の３％～９５％（例えば、５％～９５％、１０％～９５％、２０％～９５％、２５％～９５％、または５０％～９５％）が、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合型もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞（例えば、Ｖδ１またはＶδ２細胞）の操作された集団の３％～９０％（例えば、５％～９０％、１０％～９０％、２０％～９０％、２５％～９０％、または５０％～９０％）が、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合型もしくは可溶性タンパク質を発現する。

【実施例】

【0117】

材料及び方法
レトロウイルスベクターの産生及び滴定
ゲノム（ＧＦＰまたは抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体）、ｇａｇ／ｐｏｌ、逆転写酵素（ｒｅｖ）、及びエンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ、ＢａＥＶ）をコードするプラスミドからなる第３世代自己不活性化ベクタープラットフォームを用いたＨＥＫ２９３細胞の一過性のトランスフェクションによって、レンチウイルスベクターを産生した。

【0118】

マウス白血病ウイルスゲノムプラスミド（ＧＦＰまたは抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体）を用いたＦＬＹＲＤ１８細胞の一過性のトランスフェクションによって、ガンマレトロウイルスベクターを産生した。ベクターを、トランスフェクションの４８時間後に採取し、０．４５ｕｍ細孔径ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過し、低速遠心分離（４℃で６，０００ｇ）を使用して濃縮した。

【0119】

ベクター力価を、ポリブレン（８ｕｇ／ｍＬ）の存在下で、濃縮ベクター材料の連続希釈を伴うヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）の形質導入によって決定した。形質導入の３日後に、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｒｉｃフローサイトメーターを使用して、形質導入効率を決定した。以下の式を使用して、感染力価（ＴＵ／ｍＬ）を計算した：ＴＵ／ｍＬ＝（（形質導入細胞の数）×ベクター希釈×（形質導入効率％／１００））／ベクターの体積（ｍＬ）。

【0120】

フローサイトメトリー
ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｒｉｃフローサイトメーターを使用して、免疫表現型検査を実施した。ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００ 抗ＴＣＲ α／β（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＡＰＣ 抗ＴＣＲ γ／δ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、及びＶｉｏＢｌｕｅ 抗ＴＣＲ Ｖδ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）抗体を使用して、細胞を表面マーカーの発現について分析した。ｅＦｌｕｏｒ ７８０固定可能生存性染料を使用して、生存細胞を検出した。ＦＩＴＣ標識ヒトＣＤ１９タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＣＡＲ１９発現を検出した。

【0121】

γδ Ｔ細胞の単離及び増殖
Ｖδ１ γδ Ｔ細胞濃縮生成物（ＧＤＸ０１２）を、Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：５７９５－８０４，２０１６に基づく修正されたプロトコルを使用して産生した。簡潔に述べると、２．５％の自己血漿及びＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した無血清培地（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、αβ枯渇末梢血単核細胞を増殖させた。単離された細胞を、組換えＩＬ－４［ｒＩＬ４］（１００ｎｇ／ｍＬ）、組換えインターフェロンγ［ｒＩＦＮγ］（７０ｎｇ／ｍＬ）、組換えＩＬ－２１［ｒＩＬ２１］（７ｎｇ／ｍＬ）、組換えＩＬ－１β［ｒＩＬ１β］（１５ｎｇ／ｍＬ、及び可溶性ＯＫＴ－３抗ＣＤ３モノクローナル抗体（７０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。細胞を、加湿インキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ２においてインキュベートした。増殖する細胞に、組換えＩＬ－１５［ｒＩＬ１５］（７０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＯＫＴ３（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地を定期的に供給した。

【0122】

レトロウイルス形質導入
増殖するγδ Ｔ細胞を、定義された感染の多重度（ＭＯＩ）においてレトロウイルスベクターで形質導入した。ＭＯＩとは、形質導入中に１つの細胞当たり添加された感染性粒子の数（フローサイトメトリーによって測定される）を指す。γδ Ｔ細胞（１Ｅ＋０６／ｍＬ）を、レトロネクチンでコーティングされた（２０μｇ／ｍＬ）非組織培養処理２４ウェルプレート内で、またはベクトフシン（１μｇ／ｍＬ）の存在下での２４ウェルプレート内で形質導入した。ウイルスベクターを、（上記のように）サイトカイン、ＯＫＴ－３、及び２．５％の自己血漿を補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中で希釈した。γδ Ｔ細胞及びベクターストックを、３７℃で２時間、１，０００ｘｇにおいてスピノキュレートした。一定の間隔で形質導入後３日後にフローサイトメトリーを使用して、形質導入効率を決定した。ある特定の実験では、逆転写酵素活性を阻害するために、培地を、１０μＭの最終濃度における非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であるネビラピン（ＮＶＰ）で補充した。

【0123】

実施例１．広域トロピズムＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターは、γδ Ｔ細胞を形質導入することができない
ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを、それぞれ、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ－Ｇ）またはヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープで偽型化した。増殖したγδ Ｔ細胞（Ｖδ１、Ｖδ２、及び非Ｖδ１／Ｖδ２細胞からなる）を、定義された感染の多重度（ＭＯＩ）において濃縮ウイルスベクターストックで形質導入した。形質導入の３日後にフローサイトメトリーを使用して、形質導入効率を決定した。

【0124】

フローサイトメトリー分析は、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターが、高いＭＯＩ（ＭＯＩ ５０以上、図１Ａ）でさえもγδ Ｔ細胞を形質導入することができないことを明らかにした。反対に、ＢａＥＶエンベロープレンチウイルスベクターを用いた形質導入は、低い感染の多重度でさえも高い形質導入効率をもたらした（図１Ｂ）。逆転写酵素阻害剤ＮＶＰを用いたγδ Ｔ細胞の前処理は、ＧＦＰ発現を無効にし、ＧＦＰ発現がＶδ１細胞における形質導入及びＧＦＰ発現の成功の結果であることを示した。

【0125】

実施例２．ＶＳＶ－Ｇ偽型のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いたＶδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入は、偽形質導入をもたらす
ＣＡＲ発現がベクター組み込みまたは偽形質導入の結果であったかどうかを決定するために、Ｖδ１ γδ Ｔ細胞を、ネビラピン（ＮＶＰ）の存在または非存在下で、キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。ネビラピンは、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を阻害することによってウイルス形質導入を阻止する逆転写酵素阻害剤である。したがって、ネビラピンの存在下でのレンチウイルスベクターに曝露された細胞のインキュベーションは、導入遺伝子発現を減少させるはずである。ＣＡＲ発現は、ＢａＥＶ偽型ベクターを用いた形質導入がネビラピンの存在下で実施されたときに完全に無効化され、ＣＡＲ発現が偽形質導入から生じないことを実証した（図４Ｂ及び図６）。逆に、ネビラピンを用いたＶδ１細胞の処理は、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターで形質導入された細胞におけるＣＡＲ発現を撤回しなかった。この結果は、ＶＳＶ－Ｇ偽型ベクターがＶδ１細胞を形質導入することができず、導入遺伝子（ＣＡＲ）発現が偽形質導入の結果であることを実証する。偽形質導入が、形質導入後（形質導入の４日及び８日後）に長期間にわたってＣＡＲ発現を監視することによってさらに確認された。ＦＡＣＳ分析によってベクター処理細胞を監視することにより、ＣＡＲ発現が経時的に徐々に失われることが明らかになった（図２Ａ）。この現象はまた、ＮＶＰの存在または非存在下での様々な感染の多重度にわたって実証された（図２Ｂ）。全体的に、結果は、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターがγδ Ｔ細胞に侵入することができないことを示唆する。

【0126】

実施例３．サイトカインプライミングは、ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターによるＶδ１ γδ Ｔ細胞形質導入の主要な決定因子である
ＢａＥＶ形質導入効率が、γδ Ｔ細胞増殖中のサイトカインプライミングの長さに依存するかどうかを調べるために、Ｖδ１細胞を細胞増殖プロセス中の異なる時点で形質導入した。細胞を、培養の開始時（０日目）、または増殖期の７日目、１０日目、１４日目、及び１５日目にＭＯＩ＝１で形質導入した。形質導入細胞を、形質導入の３日後にＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーによって分析した。形質導入効率は、細胞増殖期中に徐々に増加し、１５日目に形質導入の最高レベルに達した（図３Ａ）。ＮＶＰを用いた細胞の処理は、ＧＦＰ発現がベクター組み込みの成功の結果であることを実証した（図３Ｂ）。全体的に、結果は、初期「サイトカインプライミング」期がＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターによるＶδ１形質導入の成功に必要であることを示唆する。

【0127】

実施例４．Ｖδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入効率は、感染の多重度（ＭＯＩ）と相関する
ＢａＥＶ形質導入効率がウイルスベクター用量（ＭＯＩ）に依存するかどうかを調べるために、Ｖδ１ γδ Ｔ細胞を、増加する量のＢａＥＶエンベロープ偽型の抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の３日後に、細胞をＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＭＯＩを増加させることにより、形質導入Ｖδ１細胞の割合が有意に増加した（図４Ａ）。ＮＶＰの存在または非存在下のＭＯＩ＝５におけるＣＡＲ形質導入の代表的なドットプロットが、図４Ｂに示される。

【0128】

実施例５．ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターは、Ｖδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３）γδ Ｔ細胞の両方を形質導入する
ＢａＥＶ偽型ベクターがＶδ１細胞を独占的に形質導入するか、または他のγδ Ｔ細胞サブタイプも形質導入することができるかどうかを試験するために、形質導入効率を汎γδ及びＶδ１細胞集団内で決定した。γδ Ｔ細胞を増殖させ、増殖の１０日目に、ＭＯＩ＝１においてＧＦＰまたはＣＡＲをコードするＢａＥＶエンベロープレンチウイルスベクターで形質導入した。汎γδ及びＶδ１特異的抗体を使用したＦＡＣＳ分析は、ＢａＥＶエンベロープベクターがＶδ１及び非Ｖδ１（Ｖδ２、Ｖδ３、及びその他）γδ Ｔ細胞の両方を形質導入することを明らかにした（図５）。

【0129】

実施例６．ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターを用いたＶδ１ γδ Ｔ細胞の形質導入を、反復形質導入によってさらに増強することができる
連続的な形質導入が、増殖したＶδ１ γδ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現をさらに増強することができるかどうかを決定するために、研究を行った。この目的のために、Ｖδ１細胞を、ＭＯＩ＝１で、１回（１０日目）または２回（１０日目及び１１日目）のいずれかで形質導入した。３日後、細胞を収集し、ＦＡＣＳによって分析した。フローサイトメトリー分析は、単一のベクターヒットでＶδ１細胞を効率的に形質導入することができ、これは、連日の二重形質導入によってさらに増強され得る効果であることを明らかにした（図６）。

【0130】

実施例７．ベクトフシンの存在下での形質導入は、レトロネクチンの存在下と同様に効率的である
形質導入エンハンサーの選択がＶδ１形質導入効率に何らかの影響を及ぼすかどうかを試験するために、２つの広く使用されている形質導入エンハンサー（レトロネクチン及びベクトフシン）を評価した。細胞増殖の１０日目に、Ｖδ１細胞を、レトロネクチンまたはベクトフシンの存在下で、様々なＭＯＩで形質導入し、形質導入効率を形質導入の３日後に決定した。ＦＡＣＳ分析は、ベクトフシンがレトロネクチンと同様にレトロウイルス遺伝子移入を増加させるために効率的であることを明らかにした（図７）。

【0131】

実施例８．Ｖδ１細胞がＲＤ１１４偽型ウイルスベクターで形質導入され得る
Ｖδ１ γδ Ｔ細胞が他のベータレトロウイルスウイルスエンベロープ偽型ベクターによって形質導入され得るかどうかを試験するために、Ｖδ１ γδ Ｔ細胞をまた、ＲＤ１１４エンベロープ偽型ガンマレトロウイルスベクターで形質導入した。細胞を以前のように増殖させ、増殖の１０日目にＭＯＩ＝１で形質導入した。ＦＡＣＳ分析は、ＢａＥＶ偽型レンチウイルスベクターと同様に、ＲＤ１１４エンベロープガンマレトロウイルスベクターが、Ｖδ１ γδ Ｔ細胞を高効率で形質導入することができることを明らかにした（図８）。

【0132】

他の実施形態
本明細書で記述される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各独立した刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0133】

本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載されているが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内の既知の実践または慣行内に入る本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形例、使用、または適応を網羅することを意図しており、本明細書で以前に記載された本質的特徴に適用され得、特許請求の範囲において以下に続くことが理解されるであろう。

【0134】

他の実施形態は、特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】