特表2024-529059肛門失禁の予防及び治療のための最適化された方法で使用される筋原性前駆細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】肛門失禁の予防及び治療のための最適化された方法で使用される筋原性前駆細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20240725BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240725BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
A61K35/12
A61P21/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507119
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-02-02
(86)【国際出願番号】 EP2022072088
(87)【国際公開番号】W WO2023012334
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21190102.0
(32)【優先日】2021-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524046766
【氏名又は名称】インノヴァセル ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110003063
【氏名又は名称】弁理士法人牛木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】トーナー，マルコ
(72)【発明者】
【氏名】マークシュタイナー，ライナー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BC03
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA81
(57)【要約】
本発明は、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療方法において使用するための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）であって、前記対象が肛門失禁を発症する危険性があるか又は肛門失禁に２０年以下、より好ましくは約６ヶ月～約２０年又は約６ヶ月～約１０年患っている、筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）に関する。本発明はまた、本発明による肛門失禁の予防及び／又は治療方法に使用するための、ＭＦＣと、医薬的に許容される賦形剤及び／又は担体とを含む医薬組成物にも言及する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法における使用のための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）であって、前記対象が肛門失禁を発症するリスクにある又は２０年以内、より好ましくは約６か月から約２０年間若しくは約６か月から１０年間、肛門失禁を患っていることを特徴とする、筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）。
【請求項2】
前記対象の肛門失禁又は肛門失禁の発症リスクが筋肉損傷によって惹起されることを特徴とする、請求項１に記載のＭＰＣ。
【請求項3】
前記対象が、治療の前に１週間当たり６回を超える、好ましくは７回を超える、好ましくは８回を超える、好ましくは９回を超える、又は好ましくは１０回を超える失禁エピソードとして定義される失禁の重症度を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項4】
前記対象が、治療前にほとんど又はそれ以上と分類される週２回を超える失禁エピソードとして定義される失禁の重症度を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項5】
前記ＭＰＣが、前記対象の肛門括約筋内又は肛門括約筋組織に隣接して、好ましくは外肛門括約筋内、内肛門括約筋内及び／又は恥骨直腸筋内に投与されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項6】
前記方法が、ＭＰＣの投与前及び／又は投与後に肛門括約筋組織を刺激することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項7】
刺激が、ＭＰＣの投与後の少なくとも２週間の肛門括約筋組織の刺激、より好ましくはＭＰＣの投与前後の少なくとも２週間の肛門括約筋組織の刺激を含むことを特徴とする、請求項６に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項8】
前記刺激が、ケーゲル運動及び／又は経皮的電気刺激によって行われることを特徴とする、請求項６又は７に記載のＭＰＣ。
【請求項9】
前記経皮電気刺激が毎日、好ましくは１日当たり少なくとも２回又は少なくとも３回行われる、請求項８に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項10】
各刺激が少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも２０分間であることを特徴とする、請求項６～９のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項11】
（ｉ）ＣＤ５６及びＣＤ９０のマーカーの陽性発現によって、特にＭＰＣの少なくとも６０％がＣＤ５６を発現し、筋原性前駆細胞の少なくとも６０％がＣＤ９０を発現することによって、及び／又は（ｉｉ）約２０ｍＵrel～約１０００ｍＵrel、より好ましくは約３０ｍＵrel～約８００ｍＵrel、より好ましくは約５０～約７００ｍＵrelのＡＣｈＥ活性によって測定され、前記ＡＣｈＥ活性が２×１０5細胞当たりで測定されること
で特徴付けられる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項12】
約６０～約９９．９％のＭＰＣが細胞マーカーＣＤ５６を発現し、約８０～約９９．９％のＭＰＣが細胞マーカーＣＤ９０を発現し、約０～約１０％のＭＰＣが細胞マーカーＣＤ３４を発現することを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項13】
前記方法が、好ましくは（ｉ）約１億～約２億ＭＰＣ、約４０００万～約６，０００万ＭＰＣ、約４００万～約６００万ＭＰＣ、又は約４，０００万～約６，０００万ＭＰＣの投与、及び／又は
（ｉｉ）約１×１０2ｍＵrel_total～約１×１０6ｍＵrel_total、より好ましくは約１×１０3ｍＵrel_total～約５×１０5ｍＵrel_totalのＡＣｈＥ活性を有する量のＭＰＣの投与、１０5ｍＵrel_total、さらにより好ましくは約７×１０4ｍＵrel_total～約２×１０5ｍＵrel_totalの合計ＡｃｈＥ活性を有する量のＭＰＣの投与
のＭＰＣの有効量の投与を含むことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項14】
前記ＭＰＣが、前記対象の肛門括約筋内及び／又はその近傍への１回以上の注射によって、好ましくは外肛門括約筋、、内肛門括約筋及び／又は恥骨直腸筋への１回以上の注射によって投与されることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のためのＭＰＣ。
【請求項15】
対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法に使用するための、ＭＰＣと薬学的に許容される添加剤及び／又は担体とを含む医薬組成物であって、前記対象が肛門失禁を発症するリスクがあるか、又は２０年間以内、より好ましくは約６か月間から約２０年間、若しくは約６か月間から約１０年間肛門失禁を患っている、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法において使用するための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）に関し、前記対象は、肛門失禁を発症する危険性があるか、又は２０年以下、より好ましくは約６か月～約２０年間、又は約６か月～約１０年間、肛門失禁を患っている。本発明はまた、本発明による肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法で使用するための、ＭＰＣ及び薬学的に許容される添加剤及び／又は担体を含む医薬組成物にも関する。
本発明は、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法において使用するための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）に関し、前記対象は、肛門失禁を発症する危険性があるか、又は２０年以下、より好ましくは約６か月～約２０年間、又は約６か月～約１０年間、肛門失禁を患っている。本発明はまた、本発明による肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法で使用するための、ＭＰＣ及び薬学的に許容される添加剤及び／又は担体を含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
肛門失禁とその疫学
自制心を維持する能力は、社会的存在としての私たちの幸福の基礎である。肛門の随意調節の喪失は、身体的、生理的、社会的ハンディキャップをもたらす。
一般に、肛門失禁は主に高齢者や障害者が患うと考えられているが、これらの症状はあらゆる年齢層に発生する可能性がある。肛門失禁の範囲、つまり腸の内容物の制御不能の範囲は、下着に残る小さな便の跡（痕跡）から放屁の喪失、軟便又は固形便の制御不能な排便という大規模なエピソードまで多岐にわたる。その理由は多層的かつ複雑である可能性がある。罹患者の生活の質が極度に損なわれているとは関係なく、肛門随意調節の障害は公衆衛生システムにとって過小評価できないコスト要因となる。米国では、肛門失禁支援プログラムに年間４億ドル以上が費やされている。さらに、肛門失禁は、老人ホームに入院する理由として２番目に多い（認知症よりも多い）。老人ホームや病院にいる高齢者の３分の１が便失禁をしている。
肛門失禁とその疫学
自制心を維持する能力は、社会的存在としての私たちの幸福の基礎である。肛門の随意調節の喪失は、身体的、生理的、社会的ハンディキャップをもたらす。
一般に、肛門失禁は主に高齢者や障害者が患うと考えられているが、これらの症状はあらゆる年齢層に発生する可能性がある。肛門失禁の範囲、つまり腸の内容物の制御不能の範囲は、下着に残る小さな便の跡（痕跡）から放屁の喪失、軟便又は固形便の制御不能な排便という大規模なエピソードまで多岐にわたる。その理由は多層的かつ複雑である可能性がある。罹患者の生活の質が極度に損なわれているとは関係なく、肛門随意調節の障害は公衆衛生システムにとって過小評価できないコスト要因となる。米国では、肛門失禁支援プログラムに年間４億ドル以上が費やされている。さらに、肛門失禁は、老人ホームに入院する理由として２番目に多い（認知症よりも多い）。老人ホームや病院にいる高齢者の３分の１が便失禁をしている。
【0003】
肛門失禁の解剖学と生理学
肛門の随意調節に必要な解剖学的構造は、肛門内画像技術の可能性により、過去１０年間にさらに詳細に研究された。これにより、肛門随意調節のメカニズムと、肛門随意調節の維持に関与する要因についての理解も深まった。肛門の随意調節には、異なる生理学的機能を備えた異なる解剖学的構造の調整が必要である。損傷を受けていない感覚は、直腸の充満状態の認識と便の質の認識を保証する。機能的な神経支配により、特殊なリング状の筋肉（括約筋）が増大する肛門の「閉鎖要求」に適切な方法で（自発的及び非自発的に）応答できるようになる。最後に、括約筋が無傷であれば、排便が適切になるまで肛門管を完全に閉塞する。これらの構造の１つが機能不全に陥ると、肛門の随意調節の障害をもたらす。括約筋組織の機能は、平滑筋組織からなる肛門内側の肛門括約筋（内肛門括約筋）の不随意安静圧と、肛門外側の肛門括約筋（外肛門括約筋）から生じる不随意安静圧及び随意絞り圧に基づいている。恥骨直腸筋の一定のベースライン緊張により、肛門管と直腸の間に９０°の角度を形成する結合に向かう肛門直腸移行部の「歪み」が生じる。この肛門直腸の角度は、肛門の随意調節の維持にも貢献する。しかし、恥骨直腸筋だけでは随意調節を維持することは不可能である。肛門の随意調節はさらに、内外肛門括約筋の相互作用によってもたらされる。括約筋によって締めつけられた肛門管粘膜の直腸のクッションは、最終的に気密な閉塞をもたらす。安静状態では、肛門管は外肛門括約筋の一定の強張性活動と内肛門括約筋のベースライン静止圧力によって閉塞される。内肛門括約筋は、結腸の円形平滑筋層の延長及び拡大であり、閉じた肛門管のベースライン圧力の約７５～８５％を提供する。この平滑筋成分の活動は、直腸の拡張、いわゆる直腸肛門抑制反射によって完全に阻害される。この弛緩には、外肛門括約筋と恥骨直腸筋の反射収縮が伴い、不適切な場合には排便が妨げられる。その時点で排便が都合よければ、外肛門括約筋と恥骨直腸筋が弛緩し、結腸直腸の不随意運動活動が引き起こされ、その結果肛門圧よりも直腸圧が大きくなり、その後便が排出される。便意が生じたときに排便が不都合な場合は、恥骨直腸筋と外肛門括約筋を自発的に収縮させ、排便が都合よくなるまで便を直腸内に押し戻すことで排便を延期することができる。
肛門の随意調節に必要な解剖学的構造は、肛門内画像技術の可能性により、過去１０年間にさらに詳細に研究された。これにより、肛門随意調節のメカニズムと、肛門随意調節の維持に関与する要因についての理解も深まった。肛門の随意調節には、異なる生理学的機能を備えた異なる解剖学的構造の調整が必要である。損傷を受けていない感覚は、直腸の充満状態の認識と便の質の認識を保証する。機能的な神経支配により、特殊なリング状の筋肉（括約筋）が増大する肛門の「閉鎖要求」に適切な方法で（自発的及び非自発的に）応答できるようになる。最後に、括約筋が無傷であれば、排便が適切になるまで肛門管を完全に閉塞する。これらの構造の１つが機能不全に陥ると、肛門の随意調節の障害をもたらす。括約筋組織の機能は、平滑筋組織からなる肛門内側の肛門括約筋（内肛門括約筋）の不随意安静圧と、肛門外側の肛門括約筋（外肛門括約筋）から生じる不随意安静圧及び随意絞り圧に基づいている。恥骨直腸筋の一定のベースライン緊張により、肛門管と直腸の間に９０°の角度を形成する結合に向かう肛門直腸移行部の「歪み」が生じる。この肛門直腸の角度は、肛門の随意調節の維持にも貢献する。しかし、恥骨直腸筋だけでは随意調節を維持することは不可能である。肛門の随意調節はさらに、内外肛門括約筋の相互作用によってもたらされる。括約筋によって締めつけられた肛門管粘膜の直腸のクッションは、最終的に気密な閉塞をもたらす。安静状態では、肛門管は外肛門括約筋の一定の強張性活動と内肛門括約筋のベースライン静止圧力によって閉塞される。内肛門括約筋は、結腸の円形平滑筋層の延長及び拡大であり、閉じた肛門管のベースライン圧力の約７５～８５％を提供する。この平滑筋成分の活動は、直腸の拡張、いわゆる直腸肛門抑制反射によって完全に阻害される。この弛緩には、外肛門括約筋と恥骨直腸筋の反射収縮が伴い、不適切な場合には排便が妨げられる。その時点で排便が都合よければ、外肛門括約筋と恥骨直腸筋が弛緩し、結腸直腸の不随意運動活動が引き起こされ、その結果肛門圧よりも直腸圧が大きくなり、その後便が排出される。便意が生じたときに排便が不都合な場合は、恥骨直腸筋と外肛門括約筋を自発的に収縮させ、排便が都合よくなるまで便を直腸内に押し戻すことで排便を延期することができる。
【0004】
肛門失禁の原因
これらの構造の機能不全が失禁につながるため、随意調節に関する記載された構造の重要性が強調される。肛門失禁を患う患者のほとんどは、肛門括約筋の異常と診断される。これらの異常は、外肛門括約筋、内肛門括約筋、又はその両方で発生する可能性がある。括約筋関連の失禁は、（１）産科又は偶発的な外傷、（２）手術や放射線治療などの医原性外傷、（３）多発性硬化症や糖尿病などの神経原性疾患、又は（４）加齢に伴う筋萎縮によって引き起こされる可能性がある。産科外傷は、経膣分娩の最大９％が肛門括約筋の破裂につながるため、女性の失禁の主な原因である。
これらの構造の機能不全が失禁につながるため、随意調節に関する記載された構造の重要性が強調される。肛門失禁を患う患者のほとんどは、肛門括約筋の異常と診断される。これらの異常は、外肛門括約筋、内肛門括約筋、又はその両方で発生する可能性がある。括約筋関連の失禁は、（１）産科又は偶発的な外傷、（２）手術や放射線治療などの医原性外傷、（３）多発性硬化症や糖尿病などの神経原性疾患、又は（４）加齢に伴う筋萎縮によって引き起こされる可能性がある。産科外傷は、経膣分娩の最大９％が肛門括約筋の破裂につながるため、女性の失禁の主な原因である。
【0005】
肛門失禁の治療
食事の変更、バイオフィードバック運動、下痢止め薬などの保存的治療が失敗したり、治療が不十分に成功したり、重度の解剖学的生理学的又は神経学的機能不全のためにそもそも実行できなかった場合、患者は侵襲的治療に紹介される。従来の侵襲的治療には、括約筋に欠陥がある場合には肛門括約筋の修復と再作成（括約筋形成術、人工肛門括約筋、薄膜形成術）などの外科的アプローチ、又は完全な脊髄損傷により失禁が発生した場合には人工肛門造設術や順行性抑制浣腸などの外科的アプローチが含まれる。しかし、括約筋修復のための従来の外科的アプローチは失敗率が５０％と高く、新しい括約筋を作製する外科的アプローチは罹患率が高くなる。失禁に対する侵襲性の低い治療法の１つは、肛門管の圧力を高めると考えられている増量剤の肛門周囲注射である。単一のランダム化偽対照試験では、ＮＡＳＨＡ Ｄｘ（ヒアルロン酸で安定化されたデキストラノマー）の注射が偽注射よりも有意に良好な治療結果をもたらすことが分かった。詳細には、偽治療を受けた患者の３２％と比較して、患者の５２％では１週間当たりの失禁エピソードが少なくとも５０％減少したことが判明した。しかし、完全に随意調節的であることが判明した患者はわずか６％であり、現在までに入手可能な有効性データは最大６か月の短期効果のみをカバーしている。また、増量剤が患者の生活の質に及ぼす影響は限られていることが指摘された。したがって、肛門失禁に対するより効果的な治療が必要とされている。過去 ２０年間に、神経調節は失禁の治療選択肢として注目を集めたが、その中で仙骨神経刺激（ＳＮＳ）が有効性の点で最も有望なものになった。ＳＮＳ療法は、神経筋機能を改善するために仙骨神経に慢性的な低電圧電気刺激を使用する医療機器（例：Ｉｎｔｅｒｓｔｉｍ、メドトロニック、米国）の埋め込みに基づいているが、作用機序（ＭｏＡ；ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）はまだ不明である。成功率は、ＳＮＳ後の１週間当たりの失禁頻度（ＩＥＦ）が少なくとも５０％減少した患者の割合として定義され、６１件の試験と短期（１２か月未満）、中期（１２～３６か月）及び長期（＞３６か月）の成功率の中央値から集約され、それぞれ６３％、５８％、５４％であることが確認された。しかし、スクリーニングされた患者の１３．１％はテスト刺激に反応しなかったため、永久埋め込みは受けられず、長期追跡調査に含まれた患者の約２５％は合併症（技術的又は感染症）又は効力の損失のために刺激装置の解釈を受けた。
食事の変更、バイオフィードバック運動、下痢止め薬などの保存的治療が失敗したり、治療が不十分に成功したり、重度の解剖学的生理学的又は神経学的機能不全のためにそもそも実行できなかった場合、患者は侵襲的治療に紹介される。従来の侵襲的治療には、括約筋に欠陥がある場合には肛門括約筋の修復と再作成（括約筋形成術、人工肛門括約筋、薄膜形成術）などの外科的アプローチ、又は完全な脊髄損傷により失禁が発生した場合には人工肛門造設術や順行性抑制浣腸などの外科的アプローチが含まれる。しかし、括約筋修復のための従来の外科的アプローチは失敗率が５０％と高く、新しい括約筋を作製する外科的アプローチは罹患率が高くなる。失禁に対する侵襲性の低い治療法の１つは、肛門管の圧力を高めると考えられている増量剤の肛門周囲注射である。単一のランダム化偽対照試験では、ＮＡＳＨＡ Ｄｘ（ヒアルロン酸で安定化されたデキストラノマー）の注射が偽注射よりも有意に良好な治療結果をもたらすことが分かった。詳細には、偽治療を受けた患者の３２％と比較して、患者の５２％では１週間当たりの失禁エピソードが少なくとも５０％減少したことが判明した。しかし、完全に随意調節的であることが判明した患者はわずか６％であり、現在までに入手可能な有効性データは最大６か月の短期効果のみをカバーしている。また、増量剤が患者の生活の質に及ぼす影響は限られていることが指摘された。したがって、肛門失禁に対するより効果的な治療が必要とされている。過去 ２０年間に、神経調節は失禁の治療選択肢として注目を集めたが、その中で仙骨神経刺激（ＳＮＳ）が有効性の点で最も有望なものになった。ＳＮＳ療法は、神経筋機能を改善するために仙骨神経に慢性的な低電圧電気刺激を使用する医療機器（例：Ｉｎｔｅｒｓｔｉｍ、メドトロニック、米国）の埋め込みに基づいているが、作用機序（ＭｏＡ；ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）はまだ不明である。成功率は、ＳＮＳ後の１週間当たりの失禁頻度（ＩＥＦ）が少なくとも５０％減少した患者の割合として定義され、６１件の試験と短期（１２か月未満）、中期（１２～３６か月）及び長期（＞３６か月）の成功率の中央値から集約され、それぞれ６３％、５８％、５４％であることが確認された。しかし、スクリーニングされた患者の１３．１％はテスト刺激に反応しなかったため、永久埋め込みは受けられず、長期追跡調査に含まれた患者の約２５％は合併症（技術的又は感染症）又は効力の損失のために刺激装置の解釈を受けた。
【0006】
失禁は主に直腸の筋肉組織の欠損／弱さによって引き起こされるため、筋肉再生の動物モデルは筋肉内注射された細胞が宿主の筋肉内に生着することを示唆しており、筋肉由来の細胞の注射による腹圧性尿失禁の治療に関する初期の臨床試験は有望であると考えられた。細胞療法によって肛門括約筋を再生するというアイデアが生まれた（Ｆｒｕｄｉｎｇｅｒら、２００９）。しかし、失禁治療のための細胞療法の市場承認、ひいては広範な適用を可能にするためには、治療法の有効性がプラセボ効果よりも優れている必要があり、必要な対象に十分な利益及び／又は完全な寛解が得られるという点で臨床的に関連性がある必要がある。１週間当たりの失禁エピソードの少なくとも５０％の減少の効果は、臨床的に関連があると考えられる。方法が有用であるためには、プラセボ治療を受けた患者と比較して、細胞療法治療を受けた患者の割合が有意に高く、方法が効果的であるとみなすためには、そのような減少が必要である。
【0007】
上記で概説したように、失禁は多くの異なる原因、病歴、重症度を伴う非常に複雑な状態であるため、特定の方法から恩恵を受ける最も適切な患者集団を選択する必要がある。治療法ごとに、重要で関連性のある治療効果を達成するためのターゲットとなる患者集団が異なる可能性がある。
【0008】
ＥＰ２１０９７６Ｂ１は、直腸損傷を患っている対象の外肛門括約筋に筋芽細胞を注射することによる肛門失禁の予防及び治療のための筋芽細胞の使用方法を開示している。ＷＯ２０１４／０４４８６７Ａ１は、骨格筋由来細胞の投与による、尿失禁及び／又は肛門失禁、あるいは尿失禁又は肛門失禁を発症するリスクのある女性及び男性に対する治療方法を開示している。ＷＯ２０１９／１１５７９０は、失禁の治療に使用するための骨格筋由来細胞を開示している。ＷＯ２０２０／１９３４６０は、対象における疾患又は障害を治療する方法に使用するための誘導平滑筋細胞を開示している。便失禁の治療における筋肉細胞の潜在的な有効性をテストするために臨床研究が実施されたが、プラセボ効果と比較してこれらの方法の優れた効果は実証されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、上述した先行技術に鑑みてなされたものである。したがって、本発明の１つの目的は、肛門失禁の予防及び／又は治療のために筋原性前駆細胞を使用する効果的な方法を提供することである。
【0010】
本発明者らは、驚くべきことに、一部の対象では筋原性前駆細胞の注射が全く効果を示さないか、あるいはほとんど効果がなかった一方、他の対象では筋原性前駆細胞の注射により対象の状態が大幅に改善されたことを発見した。
【0011】
上述の開示はいずれも、失禁の広範な適応症の範囲内で、肛門失禁の改善された予防／治療のために筋原性前駆細胞の投与に最終的に適格である狭義の患者集団を選択するものではない。したがって、本発明の基礎となる目的は、個別化された治療アプローチの状況において、筋原性前駆細胞の注射によって効果的に治療され得る対象のグループを同定することであった。本発明の別の目的は、肛門失禁のより効果的な治療をもたらす、肛門失禁の予防及び／又は治療のための筋原性前駆細胞の使用のための最適化された方法を提供することである。
【0012】
上述の開示はいずれも、失禁に関連する対象の状態、失禁の期間、及び／又は失禁の重症度に従って患者集団を選択するものではない。したがって、本発明の別の目的は、肛門失禁の予防及び／又は治療のための筋原性前駆細胞の使用方法において、失禁に関連する対象の状態、失禁の持続時間及び／又は失禁の重症度に従って患者集団を選択することを提供することである。
【0013】
上述の開示はいずれも、肛門失禁の予防及び／又は治療のための安全かつ有効な細胞数を選択するものではない。したがって、本発明の１つの目的は、肛門失禁の予防及び／又は治療のための筋原性前駆細胞の使用方法における特定の細胞用量を選択することである。
【0014】
さらに、上述の開示はいずれも、肛門失禁の予防及び／又は治療のための筋原性前駆細胞の使用方法に付随する最適化された刺激を選択していない。したがって、本発明の別の目的は、肛門失禁の予防及び／又は治療のための筋原性前駆細胞の使用方法において最適化された付随刺激を選択することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明の目的は、特許請求の範囲で定義される主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ又は複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【0017】
【図1】図１は、包括解析（ＩＴＴ）集団における治療群（低細胞数－ＬＣＣ、高細胞数－ＨＣＣ、プラセボ－ＰＢＯ）における実施例５の研究期間にわたる、ベースライン（Ａ、Ｂ）からの１週間当たりの失禁エピソード頻度（ＩＥＦ）の変化（Ａ、Ｂ）及び５０％反応率（Ｃ、Ｄ）を示す。ここで、痕跡として分類されたエピソードは分析のためにカウントされるか（Ａ、Ｃ）、又は除外される（Ｂ、Ｄ）。
【図2】図２は、実施例５による、ベースラインから治療後１２ヶ月までの１週間当たりのＩＥＦの変化（Ａ、Ｂ）及び治療後１２ヶ月における５０％反応率（Ｃ、Ｄ）を示し、それぞれ（Ａ、Ｃ）を含めるか除外する（Ｂ，Ｄ）ことによって計算される各々が失禁エピソードとしてカウントされたことから明らかにされる。実施例６の対象選択に従って、異なる患者集団における治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）間でデータを視覚化した。ＴＰＰ１と呼ばれる実施例６で定義された異なる患者集団は、１０年以下の便失禁に患っている患者である。ＴＰＰ２は、ベースラインで２回を超えるエピソードを患い、少量又はより多量と分類される患者である。ＴＰＰ３は、１０年以下の便失禁と、ベースラインで１週間当たり２回を超えるＩＥＦで少量以上と分類される患者である。ＮＲ１は１０年以上便失禁（ＦＩ）に患っている患者であり、ＮＲ２は「少量」又は「より多量」に分類される２回以下の失禁エピソード（ＩＥ）を患っている患者である。ＰＢＯとＬＣＣ又はＨＣＣを比較する両側ウィルコクソン検定（Ａ、Ｂ）又はフィッシャーの正確確率検定（Ｃ、Ｄ）のｐ値がｐ＜０．０５の有意しきい値に達した場合は常にｐ値が示される。
【図3】図３は、実施例１によって単離され、実施例２に従って分化能について試験された筋原性前駆細胞の位相差顕微鏡画像を示す。倍率６００倍で筋管が見え、複数の核（黒い矢印）が含まれており、それによって単核ＭＰＣの相互に融合する潜在能力が実証されている。
【図4】図４は、実施例５に従って実施された臨床研究の概要を示す。評価されたパラメータを含む研究通院、及びデータ収集のタイムラインがＡに示されている。治療の割り当ては、Ｂの数字（Ｎ）で示される。ＱｏＬ＝生活の質、Ｖ＝通院、ＶＡＳ＝視覚的アナログスケール、ＷＩＥ＝１週間当たりの失禁エピソード、ＣＧＩ＝床全体的な印象スケール。
【図5】図５は、実施例１に従って単離され、実施例２に従ってインビトロ分化した後、実施例３に従ってＡＣｈＥ活性について測定されたＭＰＣを含有するＬＣＣ（Ａ）及びＨＣＣ（Ｂ）バッチのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性を集約するチューキーの箱ひげ図を示す。活性は、２×１０5細胞当たりの相対ｍＵとして示される。ＬＣＣバッチ（ｎ＝８３）は、３６～５６８の範囲の２４１．９０±１５１．９０の平均±ＳＤ ＡＣｈＥ活性を保有することが判明した。ＨＣＣバッチ（ｎ＝７５）は、４９～６８０の範囲の２１３±１３７．４０の平均±ＳＤ ＡＣｈＥ活性を保有することが判明した。
【図6】図６は、実施例１に従って調製され実施例４による表面マーカーの試験された、低細胞数（ＬＣＣ、ｎ＝８３）（Ａ）及び高細胞数（ＨＣＣ、ｎ＝７５）製剤のいずれかの表面細胞マーカーＣＤ３４、ＣＤ５６及びＣＤ９０に対して陽性であるＭＰＣのパーセンテージを示す。データはチューキーの棒グラフとして視覚化される（外れ値は点として見える）。すべてのＬＣＣ及びＨＣＣバッチはＣＤ３４陰性であることが判明した（ＬＣＣについては１．２９±１．３７、ＨＣＣについては１．１０±０．９０の平均±ＳＤで％ＣＤ３４陽性）。すべてのＬＣＣ及びＨＣＣバッチはＣＤ５６陽性であることが判明した（ＬＣＣについては９２．０６±６．７３、ＨＣＣについては８９．８６±７．０６の平均±ＳＤで％ＣＤ５６陽性）。すべてのＬＣＣ及びＨＣＣバッチはＣＤ９０陽性であることが判明した（ＬＣＣについては９４．００±５．００、ＨＣＣについては９４．９９±４．５２％の平均±ＳＤで％ＣＤ９０陽性）。
【図7】図７は、ベースラインのＩＥＦ（痕跡を含む）の数の増加に従ってさらにサブグループ化したＩＴＴセット患者における、治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）間のベースラインから治療後６ヵ月までのＩＥＦの変化を示している。データは平均値±ＳＥＭとして可視化した。ベースラインから６ヵ月後までのＩＥＦの変化は、全群でベースラインＩＥＦの低い患者を連続的に除外することにより増加したが、ＬＣＣおよびＨＣＣではＰＢＯ患者よりも顕著であった。
【図8】図８は、ＩＴＴ、ＴＰＰ１、ＴＰＰ２、ＴＰＰ３、ＮＲ１およびＮＲ２の患者集団において、ＬＣＣまたはＨＣＣとＰＢＯ治療とを、失禁エピソードとして痕跡を考慮する（Ａ、Ｃ）か考慮しない（Ｂ、Ｄ）かのいずれかで比較することにより算出した、ベースラインから治療後１２ヵ月までのＩＥＦの効果量（コーエンのｄ）（Ａ、Ｂ）、および治療後１２ヵ月における５０％レスポンダー率のオッズ比（Ｃ、Ｄ）をそれぞれ示している。
【図9】図９は、ＴＰＰ３セット患者および肛門括約筋損傷に関連した便失禁を有する患者（ＴＰＰ３＿損傷）のみを選択するためにさらにサブグループ化したＴＰＰ３患者における、治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）間のベースラインから治療後１２ヶ月までのＩＥＦの変化（Ａ、Ｂ）および５０％レスポンダー率（Ｃ、Ｄ）を示している。データは、失禁エピソードとしての痕跡を含むもの（Ａ、Ｃ）、または痕跡を含まないもの（Ｂ、Ｄ）のいずれかで示した。データは平均値±ＳＥＭで示した。ＬＣＣまたはＨＣＣとＰＢＯを比較した両側ウイルコクソン順位和検定のＰ値がα誤差０．０５未満であることをＩＥＦの変化について示した。ＬＣＣまたはＨＣＣとＰＢＯ治療の反応率を比較したフィッシャーの正確検定のＰ値は、０．０５未満の場合に示した。
【発明を実施するための形態】
【0018】
[用語と定義]
本明細書で使用する「肛門失禁」という用語は、放屁、液体又は固体の糞便など、肛門を通した腸内容物の望ましくない喪失を指す。この用語は、３つの重症度グレードすべてで構成される：グレード１は気体のみ、グレード２は液体及び軟便、グレード３は固体で形成された便である。
本明細書で使用する「肛門失禁」という用語は、放屁、液体又は固体の糞便など、肛門を通した腸内容物の望ましくない喪失を指す。この用語は、３つの重症度グレードすべてで構成される：グレード１は気体のみ、グレード２は液体及び軟便、グレード３は固体で形成された便である。
【0019】
本明細書で使用される「肛門括約筋」又は「肛門括約筋組織」という用語は、好ましくは、肛門挙筋及び肛門括約筋の一部としての肛門括約筋及び恥骨直腸筋を指す。ただし、恥骨尾骨筋、尾骨筋、腸骨尾骨筋及び陰部神経も含まれる場合がある。
【0020】
本明細書で使用される「便失禁」という用語は、好ましくは、液体又は固体の糞便に限定される、肛門を通した腸内容物の望ましくない喪失を指す。この用語は、「肛門失禁」の重症度グレード：グレード２＝液体及び軟便、グレード３＝固形の形成された便を含む場合がある。
【0021】
本明細書で使用される用語「筋原性前駆細胞」又は短的に「ＭＰＣ」は、好ましくは、筋原性潜在性を有する細胞を指し、これは、筋肉組織に由来する初代細胞及び／又はインビトロ培養細胞であり得、あるいは、例えば脂肪組織又は他の幹細胞を含む組織、例えば骨髄などからのものであるが、これらに限定されない筋原性潜在性が由来する他の細胞に関する。この用語はまた、多能性幹細胞である細胞、又は単離及び培養して筋肉細胞になるか、又は筋肉組織内又は筋肉組織に隣接する投与後に筋肉細胞になることができる多能性幹細胞に由来する細胞を含む。筋原性前駆細胞は、好ましくは筋肉組織の単離によって得られるため、「筋原性前駆細胞」という用語は、いくつかの異なる細胞型の懸濁液を指す場合もあり、前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は少なくとも９９％が本明細書で定義される「筋原性前駆細胞」である。好ましくは、前記懸濁液は単一細胞の懸濁液であり、前記単一細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は少なくとも９９％が同じ細胞型の均一であり、すなわち筋原性前駆細胞である。本明細書で定義される筋原性前駆細胞に加えて、前記懸濁液は、脂肪組織、軟骨形成組織、骨形成組織、及び／又は線維形成組織起源の細胞などの他の細胞型も含み得る。そのような細胞は、間葉細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、及び／又はプロセス関連不純物であり得る、及び／又は筋原性前駆細胞と一緒に単離され得る他の任意の細胞型であり得る。そのような細胞は、筋原性前駆細胞懸濁液の最大１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を含み得る。
【0022】
「筋原性の潜在力」という用語は、好ましくは、細胞（ａ ｃｅｌｌ）、細胞（ｃｅｌｌｓ）、又は細胞集団が筋組織を発達、再生、及び／又は増強する潜在力を指す。本明細書で使用される筋原性の潜在力はさらに、インビトロで多核筋管に分化し、及び／又は酵素的に活性なアセチルコリンエステラーゼを発現する細胞（ａ ｃｅｌｌ）、細胞（ｃｅｌｌｓ）又は細胞集団の潜在力に関連し得る。
【0023】
本明細書で使用される「穿通」という用語は、好ましくは、注射プロセスにまだ影響を与えることなく、注射装置、例えば針を体組織に導入するプロセスを指す。
【0024】
本明細書で使用される「注射」という用語は、好ましくは、注射装置から人体内の特定の部位、特に肛門の失禁をもたらす筋肉組織内又は筋肉組織に隣接して（例：肛門括約筋組織）、上記の細胞を放出する注射溶液の放出を指す。注射プロセスは、静的注入であってもよいが、これに限定されない。すなわち、注射装置は到達した位置に留まる。前記静的注射プロセスは、好ましくは、注射溶液の排出中、前記注射装置が静止している、すなわち、排出された注射溶液に対して動かない注射プロセスを指す。代替的に、注射プロセスは動的であってもよい。前記動的注射プロセスは、好ましくは、注射溶液の排出中に、前記注入装置が動的である、すなわち、排出された注射溶液に対して移動する注射プロセスを指す。動的注射プロセスは、例えば、中空針を移動させることによって実行され得る。外肛門括約筋内で針の軌道を逆方向に通過し、それによって同時に注射液が排出される。あるいは好ましくは、本明細書で使用される「注射」という用語は、細胞を肛門括約筋組織に隣接させるのに適した任意の投与経路を指す。このような投与経路は、好ましくは、経口、局所、静脈内、又は動脈内投与を含む。
【0025】
本明細書で使用される「注射部位」という用語は、好ましくは、注射プロセスが開始され得る人体内の部位、例えば肛門失禁に近い部位又は筋肉組織に近い部位を指すが、これに限定されない。注射部位は、注射プロセスが終了する部位と同一であってもよく、同一でなくてもよい。
【0026】
本明細書で使用される「注射装置」という用語は、対象の注射部位に到達し、前記注射側に溶液、特に筋原性前駆細胞を含む溶液を対象の注射部位に送達するためにヒト組織を穿通するのに適した任意の装置を含む。
【0027】
本明細書で使用される「受動失禁」という用語は、好ましくは、便の喪失の感覚認識の欠如を指す。これには、肛門の基準圧力値が低いこと、及び肛門及び直腸の粘膜の感覚能力が欠如していることが含まれる。
【0028】
本明細書で使用する「切迫性尿失禁」又は「切迫性切迫感」という用語は、好ましくは、排便衝動の認識後５分以上排便を遅らせる能力が欠如していることを指す。このような患者は、すぐにトイレに行かなければならない、及び／又は、腸内容物をトイレに排泄するのに十分な早さでトイレに行くことができず、その結果、不随意の排便が生じる。
【0029】
本明細書で使用される「ＣＤ５６＋」又は「ＣＤ５６陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ５６を発現する細胞を指す。「ＣＤ５６＋」又は「ＣＤ５６陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントがＣＤ５６細胞マーカーを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0030】
本明細書で使用される用語「ＣＤ５６－」又は「ＣＤ５６陰性」は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ５６を発現しない細胞を指す。「ＣＤ５６－」又は「ＣＤ５６陰性」という用語は、好ましくは多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントの細胞集団が細胞マーカーＣＤ５６を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0031】
本明細書で使用される用語「Ａ２Ｂ５＋」又は「Ａ２Ｂ５陽性」は、好ましくは、細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する細胞を指す。「Ａ２Ｂ５＋」又は「Ａ２Ｂ５陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0032】
本明細書で使用される用語「Ａ２Ｂ５－」又は「Ａ２Ｂ５陰性」は、好ましくは、細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現しない細胞を指す。「Ａ２Ｂ５－」又は「Ａ２Ｂ５陰性」という用語は、好ましくは多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントの細胞集団が細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0033】
本明細書で使用される「デスミン陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーであるデスミンを発現する細胞を指す。「デスミン陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーデスミンを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0034】
本明細書で使用される「デスミン陰性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーであるデスミンを発現しない細胞を指す。「デスミン陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントが細胞マーカーデスミンを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0035】
本明細書で使用される「ＣＤ１０５＋」又は「ＣＤ１０５陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ１０５を発現する細胞を指す。「ＣＤ１０５＋」又は「ＣＤ１０５陽性」という用語は、好ましくは、細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＣＤ１０５を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0036】
本明細書で使用される用語「ＣＤ１０５－」又は「ＣＤ１０５陰性」は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ１０５を発現しない細胞を指す。「ＣＤ１０５－」又は「ＣＤ１０５陰性」という用語は、好ましくは多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントの細胞集団が細胞マーカーＣＤ１０５を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0037】
本明細書で使用される「ＣＤ３４＋」又は「ＣＤ３４陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ３４を発現する細胞を指す。「ＣＤ３４＋」又は「ＣＤ３４陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＣＤ３４を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用され得る。
【0038】
本明細書で使用される用語「ＣＤ３４－」又は「ＣＤ３４陰性」は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ３４を発現しない細胞を指す。「ＣＤ３４－」又は「ＣＤ３４陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１若しくは０パーセントが細胞マーカーＣＤ３４を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。特に好ましい実施形態では、「ＣＤ３４－」又は「ＣＤ３４陰性」という用語は、好ましくは多くとも１９、１０、５、４、３、２、１又は０パーセントの細胞マーカーＣＤ３４を発現する場合、異なる細胞を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0039】
本明細書で使用される「ＣＤ９０＋」又は「ＣＤ９０陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ９０を発現する細胞を指す。「ＣＤ９０＋」又は「ＣＤ９０陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＣＤ９０を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0040】
本明細書で使用される「ＣＤ９０－」又は「ＣＤ９０陰性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＣＤ９０を発現しない細胞を指す。「ＣＤ９０－」又は「ＣＤ９０陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１若しくは０パーセントが細胞マーカーＣＤ９０を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0041】
本明細書で使用される「Ｔｕｊ１＋」又は「Ｔｕｊ１陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＴｕｊ１を発現する細胞を指す。「Ｔｕｊｌ＋」又は「Ｔｕｊｌ陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＴｕｊ１を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0042】
本明細書で使用される用語「Ｔｕｊ１－」又は「Ｔｕｊ１陰性」は、好ましくは、細胞マーカーＴｕｊ１を発現しない細胞を指す。「Ｔｕｊｌ－」又は「Ｔｕｊｌ陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１若しくは０パーセントが細胞マーカーＴｕｊ１を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0043】
本明細書で使用される「ネスチン＋」又は「ネスチン陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーであるネスチンを発現する細胞を指す。「ネスチン＋」又は「ネスチン陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントがその細胞マーカーネスチンを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0044】
本明細書で使用される「ネスチン－」又は「ネスチン陰性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーであるネスチンを発現しない細胞を指す。「ネスチン－」又は「ネスチン陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１若しくは０パーセントが細胞マーカーネスチンを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0045】
本明細書で使用される用語「Ｓｃａ－１＋」又は「Ｓｃａ－１陽性」は、好ましくは、細胞マーカーＳｃａ－１を発現する細胞を指す。「Ｓｃａ－１＋」又は「Ｓｃａ－１陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが細胞マーカーＳｃａ－１を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0046】
本明細書で使用される「Ｓｃａ－１－」又は「Ｓｃａ－１陰性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＳｃａ－１を発現しない細胞を指す。「Ｓｃａ－１－」又は「Ｓｃａ－１陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、若しくは０パーセントが細胞マーカーＳｃａ－１を発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0047】
本明細書で使用される「ＭｙｏＤ＋」又は「ＭｙｏＤ陽性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＭｙｏＤを発現する細胞を指す。「ＭｙｏＤ＋」又は「ＭｙｏＤ陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９パーセントが、細胞マーカーＭｙｏＤを発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0048】
本明細書で使用される「ＭｙｏＤ－」又は「ＭｙｏＤ陰性」という用語は、好ましくは、細胞マーカーＭｙｏＤを発現しない細胞を指す。「ＭｙｏＤ－」又は「ＭｙｏＤ陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の５０％未満、又は多くとも４９、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１若しくは０パーセントが発現する場合、異なる細胞型を含む細胞集団に対しても使用することができる。
【0049】
本明細書で使用される「分化培地」という用語は、好ましくは、多核融合コンピテント細胞又は筋原性前駆細胞、例えば筋芽細胞で融合を誘導する細胞培養培地を指す。しかし、この用語は、多核融合コンピテント細胞又は筋原性細胞がそれぞれの誘導なしに融合できる場合、融合の誘導に必要な物質を含まない細胞培養培地を指す場合もある。
【0050】
本明細書で使用される「細胞増殖培地」という用語は、好ましくは、インキュベーション容器（フラスコ又はディッシュ）の表面上に前記哺乳動物細胞を付着させることができる、筋原性前駆細胞などの哺乳動物細胞のインキュベーションに適した任意の培地を指す。
【0051】
本明細書で使用される「失禁エピソード」又は「ＩＥ」という用語は、好ましくは、直腸を通る液体又は固体の糞便が制御されず、予期せず、及び／又は不本意に失われる事象を指す。失禁のエピソードは、「痕跡」、「少量」、又は「より多量」に分類できる。この分類は、患者に日記を記入してもらうことによって行うことができ、これにより失禁事象が発生した日時を追跡することができ、できれば失禁のサイズ及び／又は量を分類することができる。前記日記は、好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは約１～約４週間、約１～約３週間、又は約１～約２週間保存される。
【0052】
本明細書で使用される「１週間当たりの失禁エピソードの頻度」は、「１週間当たりのＩＥ頻度」とも言われ、「１週間当たりのＩＥＦ」とも言われ、好ましくは、７日間の期間に正規化され次のように計算される２８日間の期間中に発生した失禁エピソードの数を指す：
１週間当たりのＩＥＦ＝（期間中に報告された失禁エピソード数／期間中に完結した日数）ｘ７
１週間当たりのＩＥＦ＝（期間中に報告された失禁エピソード数／期間中に完結した日数）ｘ７
【0053】
本明細書において「痕跡」として分類される失禁のエピソードは、好ましくは、液体又は固体の糞便が対象の直腸から予期せず漏出し、そのため糞便の量が非常に少ないため、リネンの汚れ又は跡として現れる肛門失禁のエピソードに相当する。このような「痕跡」は、その量が下着のリネンに吸収されるため、患者が下着を交換する必要がない場合がある。
【0054】
本明細書で使用される「レスポンダー」という用語は、好ましくは、２つの失禁日記を比較することによって計算された１週間当たりのＩＥＦが少なくとも５０％減少している患者を指し、そのうちの１つの日記は特定の介入（例えば本発明による筋原性前駆細胞の使用のための方法）前の特定の期間中に記入されたもおのであり、及び、１つは特定の介入後の特定の期間中に記入されたものである。介入前及び／又は介入後のそのような期間は、好ましくは１週間、より好ましくは２週間、さらにより好ましくは３週間、さらにより好ましくは４週間である。
【0055】
本明細書において「少量」として分類される失禁エピソードは、好ましくは、対象の直腸から液体又は固体の便が予期せず漏れ、その便の量が対象のリネンに汚れや跡として現れる以上の量の肛門失禁のエピソードを指す。しかし、その量は通常の排便の結果と比較するとほんのわずかである。そのようなエピソードでは、その量がリネンに効率的に吸収されず不快感を引き起こすため、患者は下着を交換する必要がある場合がある。
【0056】
本明細書で「より多量」として分類される失禁エピソードは、好ましくは、液体又は固体の糞便が対象の直腸から予期せず漏出し、そのため糞便の量が対象のリネンに汚れや跡として現れる以上の量である可能性がある肛門失禁のエピソードを指す。その量は、通常の排便で生じる量に匹敵する可能性がある。そのようなエピソードでは、下着と二次衣類の両方が影響を受け、重度の不快感につながるため、好ましくは患者は両方を交換する必要がある。
【0057】
本明細書で使用される「増分圧搾圧力」という用語は、好ましくは、最大肛門圧搾圧力から肛門安静圧力を差し引いた結果に相当する。
【0058】
本明細書で使用される「失禁に関連する状態」という用語は、好ましくは、肛門失禁を発症する危険性がある対象又は肛門失禁を発症した対象を検査するときに得られる医師の結果に相当する。そのような対象は、筋肉損傷及び／又は筋萎縮の状態を定義するために、例えば超音波及び／又は圧力測定による検査によって、肛門括約筋組織について検査される可能性がある。さらに、検査者は、骨盤底機能不全、神経損傷、又は貯蔵能力の喪失などの状態が、肛門失禁を発症するリスクと関連しているのか、又は発症した肛門失禁と関連しているのかを検討する可能性がある。失禁に関連する症状として分類されるものには、下痢や便秘もある。
【0059】
本明細書で使用される「骨盤底機能不全」という用語は、好ましくは、対象が排尿又は排便のために骨盤底の筋肉を正しく弛緩させ調整することができない状態に相当する。骨盤底機能不全の影響を受ける骨盤底臓器は、膀胱、子宮、膣、前立腺、直腸などである。排尿痛、失禁、又はトイレに行きたいという一貫した切迫感は、骨盤底機能不全の兆候である可能性がある。
【0060】
本明細書で使用される用語「筋肉損傷」は、好ましくは、肛門括約筋組織の筋肉の欠損に相当する。このような筋肉の損傷は、肛門括約筋を視覚化するために超音波又はその他の有用な検査技術を実施するときに医師によって検出される場合がある。このような筋肉の損傷は、例えば外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋に影響を与える可能性がある。超音波で見える筋肉損傷の典型的な例は、出産時の括約筋破裂後の瘢痕形成である。
【0061】
本明細書で使用される用語「筋萎縮」又は代替的に「萎縮」は、好ましくは、肛門括約筋の筋肉量の減少に相当する。このような筋肉量の減少は、筋肉細胞間の結合組織及び／又は脂肪組織の沈着を伴う可能性がある。筋萎縮は、加齢や筋肉が使われないままになっているときに発生することがある。医師は、例えば超音波によって、肛門括約筋組織の筋萎縮を検出できる可能性がある。
【0062】
本明細書で使用される用語「神経損傷」は、好ましくは、通常は肛門括約筋組織を機能的に支配し、括約筋組織の一部である神経組織の機能の欠如に相当する。そのような神経は、陰部神経及び／又は陰部神経につながる神経であり得る。この用語はさらに、失禁に関連する可能性のある神経組織の欠損に相当する場合がある。
【0063】
本明細書で使用される「貯蔵能力の喪失」という用語は、好ましくは、直腸の許容容積の異常に相当する。手術、炎症、又は放射線療法により直腸が硬くなり、正常な弾力性を失った場合、貯蔵能力の喪失が発生する可能性がある。直腸の貯蔵能力の喪失は、直腸の伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）（すなわち伸長（ｅｌｏｎｇａｔｅ））能力の欠如につながり、その結果、直腸を通って過剰な便が漏れる結果となる。
【0064】
本明細書で使用される「失禁の持続時間」という用語は、好ましくは、失禁の発症日又は診断日から経過した時間に相当する。失禁の発症日は、好ましくは、症状の発症日、すなわち失禁エピソードの最初の発生日と一致する。失禁の診断日は、好ましくは、医師が患者を失禁と診断した日付に相当する。前記失禁の診断日は、好ましくは、症状の発症日と同一であるか、あるいは代替的に症状の発症日よりも遅い。便失禁の場合、「失禁の継続時間」という用語は、「ＦＩの継続時間」又は「失禁の継続時間」と言われることもある。失禁の診断から失禁の継続時間が測定される場合、「失禁の継続時間」という用語は「ＦＩの最初の診断からの時間」を指す場合もある。
【0065】
本明細書で使用される「失禁の重症度」という用語は、好ましくは、肛門失禁を発症した対象の負担の量に相当する。このような重症度は、１週間当たりの失禁エピソードの数、患者の生活に対する失禁の影響、便失禁の生活の質スコア及び／又はウェクスナースコアによって表現される場合がある。好ましくは、ウェクスナースコアは、Ｊｏｒｇｅら、１９９３の表３に開示されている排便・排尿の随意調節の評価尺度に相当する。
【0066】
本明細書で使用される「刺激する」という用語は、好ましくは、筋肉の収縮をもたらす肛門括約筋組織に対して行われる任意の動作に相当する。本明細書で使用される刺激は、肛門括約筋の自発的収縮を含むか、又は電気刺激によって実行され得る。後者は、肛門括約筋を支配する神経を刺激することによって、又は外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋などの肛門括約筋を直接刺激することによって実行され得る。
【0067】
本明細書で使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加の他の物質の存在を除く）という意味に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、「含む」は、任意選択で追加の物質が存在し得ることを意味する。「含む」という用語は、その範囲内に含まれる特に想定される実施形態として、「からなる」（すなわち、追加の他の物質の存在を除く）及び「含むが～からならない（すなわち、追加の他の物質の存在を必要とする）」を包含し、前者が、より好ましい。
【0068】
本明細書で使用される「ＡＣｈＥ陽性」又は「ＡＣｈＥ＋」という用語は、好ましくは、（すなわち、陽性の）アセチルコリンエステラーゼ酵素（ＡＣｈＥ）活性を示す細胞又は細胞集団を指す。特に、このようなＡＣｈＥ活性は、２×１０5個の細胞が約２０ｍＵrel～約１０００ｍＵrel、より好ましくは約３０ｍＵrel～約８００ｍＵrel、さらにより好ましくは約５０ｍＵrel～約７００ｍＵrelのＡＣｈＥ活性を示す場合に陽性である。好ましくは、前記２×１０5個の細胞は、例えば、本明細書の実施例に記載される骨格筋分化培地中で培養される。単位「ｍＵrel」は、ヨウ化アセチルチオコリン（ＡＴＩ）及び５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の添加６０分後に測定
された２×１０5個の細胞の相対「ｍＵ／ｍｌ」を指し、原液の希釈液のＯＤが６～８分、好ましくはＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加後６、７、又は８分に、すでに測定されている点を除き、同じ条件下で４～５００ｍＵ／ｍｌの範囲のＡＣｈＥ原液の希釈系列によって得られる直線方程式に関連した相対「ｍＵ／ｍｌ」を指す。「ｍＵrel」という用語は、実施例３で測定及び計算された２×１０5個の細胞の相対「ｍＵ／ｍｌ」を指す場合もある。
された２×１０5個の細胞の相対「ｍＵ／ｍｌ」を指し、原液の希釈液のＯＤが６～８分、好ましくはＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加後６、７、又は８分に、すでに測定されている点を除き、同じ条件下で４～５００ｍＵ／ｍｌの範囲のＡＣｈＥ原液の希釈系列によって得られる直線方程式に関連した相対「ｍＵ／ｍｌ」を指す。「ｍＵrel」という用語は、実施例３で測定及び計算された２×１０5個の細胞の相対「ｍＵ／ｍｌ」を指す場合もある。
【0069】
本明細書で使用される「ＡＣｈＥ陰性」又は「ＡＣｈＥ－」という用語は、好ましくは、ＡＣｈＥ活性を有さない（すなわち、陰性の）細胞又は細胞集団を指す。特に、２×１０5個の細胞が約０ｍＵrel～約１９ｍＵrelのＡＣｈＥ活性を示す場合、このようなＡＣｈＥ活性は陰性であり、細胞は好ましくは例えば骨格筋分化培地中で培養される。これについては本明細書の実施例２に記載されている。
【0070】
本明細書で使用される「多分化能」という用語は、好ましくは、少なくとも脂肪生成系統、軟骨形成系統、及び骨形成系統に対するインビトロ分化能を特徴とする間葉細胞の分化能を指す。
【0071】
本明細書で使用される「オリゴポテント」という用語は、好ましくは、平滑筋、横紋筋、及び／又は心筋などの筋原性系統に限定されるインビトロ分化能を特徴とする細胞の分化能を指す。
【0072】
本明細書で使用される「筋原性分化能」という用語は、好ましくは、インビボで筋原性細胞によって発現されることが知られている検出可能な量のタンパク質、例えば、これらに限定されないが、以下のマーカーのデスミン及びミオシンの１つ又は複数を発現する細胞の能力を指す。インビトロ培養細胞におけるそのようなマーカーの発現に関する試験は、当業者によく知られている。このような試験は、好ましくは、フローサイトメトリー及び／又は蛍光免疫染色及びウェスタンブロッティングを含む他の免疫細胞化学的アッセイが含まれる。あるいは、細胞（例えば、筋原性前駆細胞）が多核筋管を形成する能力を指す、筋原性分化能という用語の使用が好ましい。このような筋管は、好ましくは少なくとも３つの別個の核を含む筋細胞として当業者に知られている。もともと単核細胞によるこのような筋管の形成は、例えば、細胞内で起こる。したがって、分化培地は、筋原性分化能の試験として使用することができる。
【0073】
本明細書で使用される用語「筋管」は、好ましくは、少なくとも３つの別個の核を含む筋細胞を指す。好ましくは、そのような筋管は、単核細胞（例えば、筋原性前駆細胞）の融合によって形成される。
【0074】
本明細書で使用される「神経性分化能」又は「神経分化能」という用語は、好ましくは、マーカーＡ２Ｂ５、ＴＵＪ１、ＮＣＡＭ、ネスチン又は同等のマーカーのうちの１つ以上などの神経マーカーを発現する細胞集団を指すが、これらに限定されない。好ましくは、前記用語は、細胞の少なくとも６０％がＡ２Ｂ５を発現する、より好ましくは細胞の少なくとも６０％がＡ２Ｂ５及びＴＵＪ１を発現する、又は細胞の少なくとも６０％がＡ２Ｂ５及びＮＣＡＭを発現する、又は細胞の少なくとも６０％がＡ２Ｂ５及びネスチンを発現する、又は少なくとも６０％の細胞がＴＵＪ１及びＮＣＡＭを発現する、又は少なくとも６０％の細胞がＴＵＪ１及びネスチンを発現する、又は少なくとも６０％の細胞がＮＣＡＭ及びネスチンを発現する細胞集団を指す。より好ましくは、前記用語は、少なくとも６０％の細胞がＡ２Ｂ５、ＴＵＪ１及びＮＣＡＭを発現するか、少なくとも６０％の細胞がＴＵＪ１、ＮＣＡＭ及びネスチンを発現するか、少なくとも６０％の細胞がＡ２Ｂ５、ＮＣＡＭ及びネスチンを発現する細胞集団を指す。さらにより好ましくは、前記用語は、少なくとも６０％の細胞がＡ２Ｂ５、ＴＵＪ１、ＮＣＡＭ及びネスチンを発現する細胞集団を指す。インビトロ培養細胞におけるそのようなマーカーの発現に関する試験は、当業者によく知られている。このような試験は、好ましくは、フローサイトメトリー及び／又は蛍光免疫染色及びウェスタンブロッティングを含む他の免疫細胞化学的アッセイが含まれる。
【0075】
本明細書で使用される「隣接する」という用語は、医薬品成分を患者に注射する場合に、好ましくは、事前に特定された位置と実際に到達した位置との間の距離を指す。好ましくは、「隣接する」位置は、事前に特定された位置に直接隣接するものである。あるタイプの組織が別のタイプの組織に直接隣接する、すなわち互いに直接接触することによって、好ましくは「隣接する」という用語は、粘膜、粘膜下層、粘膜筋層又は肛門管上皮に限定されない肛門括約筋組織の筋肉に間接的に、より好ましくは直接的に接着している任意のタイプの組織を指す。代替的に好ましくは、「隣接する」という用語は、対象内の注射部位から対象内の所望の部位に向かって、細胞、好ましくは筋原性前駆細胞が注射部位から目的の部位に移動し得る距離、好ましくは０．３～１５ｍｍを指す。代替的に、「隣接する」とは、実際の注射部位と所望の位置との間の相対距離を指し、２つの位置が互いに５ｃｍ以上、より好ましくは１ｃｍ、さらにより好ましくは０．５ｃｍ未満離れていないことが好ましい。
【0076】
[実施形態の説明]
本発明は、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法で使用するための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）を対象とし、前記対象は、２０年以下、より好ましくは６か月～約２０年間、又は約６か月～約１０年間肛門失禁を患っていることを特徴とする。
本発明は、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法で使用するための筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）を対象とし、前記対象は、２０年以下、より好ましくは６か月～約２０年間、又は約６か月～約１０年間肛門失禁を患っていることを特徴とする。
【0077】
対象の選択
本発明者らは、実施例５の広範な患者集団（ＩＴＴ）を選択し、この患者集団内の患者を本発明の方法に従ってＭＰＣで治療すると、ＩＴＴ集団内の同等の患者集団のプラセボ治療よりも失禁症状が有意に高い減少を示すことを見出した（図１）。しかしながら、統計的に有意であることは、その効果がランダムではないこと（例えば、プラセボ効果又はＭＰＣに無関係な効果によるものではないこと）を示すに過ぎない。第二に、観察された効果が臨床的に適切である必要がある。週間ＩＥＦの減少率が高いほど、及び／又は、レスポンダーの割合が高いほど、特定の患者集団における治療法の結果は臨床的に適切である。本出願人は、実施例７に記載されたように、ＩＴＴから患者の異なる部分集団を選択することにより、治療効果が変化することを見出した。
本発明者らは、実施例５の広範な患者集団（ＩＴＴ）を選択し、この患者集団内の患者を本発明の方法に従ってＭＰＣで治療すると、ＩＴＴ集団内の同等の患者集団のプラセボ治療よりも失禁症状が有意に高い減少を示すことを見出した（図１）。しかしながら、統計的に有意であることは、その効果がランダムではないこと（例えば、プラセボ効果又はＭＰＣに無関係な効果によるものではないこと）を示すに過ぎない。第二に、観察された効果が臨床的に適切である必要がある。週間ＩＥＦの減少率が高いほど、及び／又は、レスポンダーの割合が高いほど、特定の患者集団における治療法の結果は臨床的に適切である。本出願人は、実施例７に記載されたように、ＩＴＴから患者の異なる部分集団を選択することにより、治療効果が変化することを見出した。
【0078】
ＩＥに罹患して１０年以下であると定義された実施例５のＩＴＴ集団（ＴＰＰ１集団）から、実施例７に従って患者のサブグループを選択すると、これらの患者において、ＬＣＣ及び／又はＨＣＣ治療が、ＩＴＴ患者においてＬＣＣ又はＨＣＣ治療が行っているよりも、１週間当たりのＩＥＦのより高い減少をもたらし、より高いレスポンダー率をもたらすことが観察された（図２）。本発明者らは、このような狭い対象集団を導入することにより、ＭＰＣの使用方法が、効果量及びオッズ比の点で広い患者集団に比べてより効果的であり（図８）、したがってＭＰＣの使用方法がすでに知られている方法と比べて有利であることを見出した。
【0079】
従って、本発明の好ましい実施形態では、肛門失禁、より好ましくは便失禁に罹患している前記対象者は、限られた時間の間、前記失禁に罹患している。より好ましくは、そのような期間は、約６ヶ月～約２０年に限定され、より好ましくは、約６ヶ月～約１０年に限定され、より好ましくは、約６ヶ月～約８年に限定され、より好ましくは、約６ヶ月～約６年に限定され、より好ましくは、約６ヶ月～約４年に限定され、さらに好ましくは、約６ヶ月～約２年に限定される。好ましい時期の開始点は、失禁の発症又は失禁の診断のいずれかである。
【0080】
好ましい一実施形態において、本発明は、対象が肛門失禁、好ましくは便失禁の点で健康な対象であるが、しかし、好ましくは括約筋組織の組織学的及び／又は解剖学的異常のために、前記失禁を発症する危険性がある場合、特に、肛門失禁、好ましくは便失禁の予防方法における使用のためのＭＰＣを提供する。前記異常は、筋肉の損傷（例えば、産科的肛門括約筋損傷又は肛門性交による）、遺伝性疾患（例えば、ヒルシュスプルング病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、肛門周囲瘻、外科的処置（例えば、グラシル形成術、括約筋オーバーラップ修復術、癌切除術）によって引き起こされる。好ましくは、前記異常は、外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋などの肛門括約筋の断裂又は裂傷に関連する。より好ましくは、前記破裂又は裂け目は、超音波画像内で肛門括約筋が見える全角度３６０°に対して１８０°未満の角度である。
【0081】
予防の場合は、筋肉が損傷した時点、又は肛門失禁を発症する危険性があると診断された時点など、肛門失禁を発症する危険性が生じた時点から開始することが望ましい。
【0082】
本発明の別の好ましい実施形態は、治療される対象が肛門失禁、特に便失禁、より好ましくは切迫性便失禁及び／又は受動性便失禁、より好ましくは切迫性便失禁に罹患している、治療のための方法における使用のためのＭＰＣを提供する。
【0083】
本発明の好ましい一実施形態では、対象の肛門失禁、好ましくは便失禁、又は前記失禁を発症する危険性は、例えば上述したような筋肉の損傷によって引き起こされる。好ましくは、前記筋損傷は、肛門内超音波によって可視化される外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋内の瘢痕として存在する。前記筋損傷は、外肛門括約筋、内肛門括約筋、又はその両方で生じ得る。その原因としては、（１）産科的外傷や偶発的外傷、（２）手術や放射線などの異所性外傷、（３）多発性硬化症や糖尿病などの神経原性疾患、（４）加齢に伴う筋萎縮などがある。膣分娩の最大９％が肛門括約筋の破裂につながるため、産科的外傷は女性における失禁の主な原因である。
【0084】
好ましくは、前記対象は、十分に定義された重症度によって便失禁に罹患している。好ましくは、そのような重症度は、特定の量の失禁エピソード頻度に患うことによって定義される。より好ましくは、そのような肛門失禁又は便失禁患者は、２回を超える、より好ましくは３回を超える、さらにより好ましくは４回を超える、さらにより好ましくは５回を超える、さらにより好ましくは６回を超える、さらにより好ましくは７回を超える、さらにより好ましくは８回を超える、さらにより好ましくは９回を超える、さらにより好ましくは１０回を超える、さらにより好ましくは１１回を超える、さらにより好ましくは１０回を超える１週間当たりの失禁エピソードを患っており、ここで、「痕跡」、「少量」、及び／又は「より多量」に分類されるすべての種類のエピソードが考慮される。
【0085】
本発明者らは、重症度が増加する（すなわち、ベースラインＩＥＦが増加する）患者は、ＭＰＣ治療に対してより反応性が高いことを見出した（図７）。本発明者らは、実施例７に従って、ＴＰＰ１の定義に加えて、治療前に６を超える週間ＩＥＦを有することによって定義される（ＴＰＰ２）患者のそのような狭いサブグループを選択することによって、ＭＰＣ（ＬＣＣ又はＨＣＣ）の投与後の前記患者集団において、より広範な患者集団（ＩＴＴ、ＴＰＰ１）において観察されたものと比較して、週間ＩＥＦの減少が増加し、応答率が増加し、効果量及びオッズ比が増加することを見出した（図２）。これはさらに、全体的な効果の大きさとオッズ比の増加によって強調される（図８）。
【0086】
さらに、本発明者らは、本発明による肛門失禁又は便失禁の治療は、「痕跡」と比較して「より多量」及び「少量」と定義されるエピソードタイプに最も効果的であることを見出した（表３）。従って、好ましくは、前記重症度は、特定の量の週単位の失禁エピソード頻度に患うことによって定義される。好ましい実施形態では、重症度を評価するためのエピソード頻度は、「少量」及び「より多量」と定義される失禁エピソードに限定され、それにより「痕跡」は除外される。本発明者らは、効果量及びオッズ比の増加（図８）によって実施例７に例示されるように、治療前の失禁重症度によって「少量」又は「より多量」の失禁エピソードが週２回を超えると定義されたＴＰＰ１の部分集団（ＴＰＰ３）が、他の患者集団（ＩＴＴ、ＴＰＰ１及びＴＰＰ２）よりもＬＣＣ又はＨＣＣによる治療に反応性が高いことを見出した。
【0087】
代替的に好ましい実施形態において、ＭＰＣは、対象における肛門失禁の治療のための方法における使用のためのものであり、ここで、前記対象は、治療前に「少量」又は「より多量」と分類される１週間当たりの失禁エピソードが２回を超える、より好ましくは３回を超える、さらにより好ましくは４回を超えると定義される失禁の重症度を有する、治療前に「少量」又は「より多量」と分類される失禁エピソードが定義される。治療前とは、好ましくは、本発明による治療を指す。従って、好ましくは、週単位の失禁エピソードは、本明細書に記載されるＭＰＣの投与の前に分類される。好ましくは、「治療前」には、例えば、ロペラミドによる保存的治療又はグラシロプラスティもしくは括約筋形成術による外科的治療のような、本発明による治療以外の治療の試みは含まれない。
【0088】
本発明者らは、実施例７に従って、ＴＰＰ１の定義に加えて、治療前に６週間を超えるＩＥＦを有することによって定義される患者のサブグループ（ＴＰＰ２）を選択すると、ＭＰＣ（ＬＣＣ又はＨＣＣ）の投与後に、より広範な患者集団（ＩＴＴ、ＴＰＰ１）で観察されたものと比較して、当該患者集団において、週間ＩＥＦの減少が増加し、レスポンダー率が増加することを見出した（図２）。これはさらに、全体的な効果量とオッズ比の増加によって強調される（図８）。したがって、この狭い範囲の患者集団の選択は、当該技術分野ですでに知られている広い範囲の患者集団の選択と比較して有利である。
【0089】
従って、本発明の非常に好ましい実施形態において、ＭＰＣは、対象における肛門失禁、より好ましくは便失禁の治療方法における使用のためのものであり、ここで、前記対象は
（ｉ）肛門失禁、より好ましくは便失禁を、２０年以下、より好ましくは約６ヶ月～約１０年間患っており、及び
（ｉｉ）治療前に週６回を超える失禁エピソードがあり、及び／又は
（ｉｉｉ）治療前に、少量又はより多量と分類される、２回を超える、３回を超える、又は４回を超える１週間当たりの失禁エピソードの失禁の重症度を有する。
（ｉ）肛門失禁、より好ましくは便失禁を、２０年以下、より好ましくは約６ヶ月～約１０年間患っており、及び
（ｉｉ）治療前に週６回を超える失禁エピソードがあり、及び／又は
（ｉｉｉ）治療前に、少量又はより多量と分類される、２回を超える、３回を超える、又は４回を超える１週間当たりの失禁エピソードの失禁の重症度を有する。
【0090】
本発明者らは、限定された失禁期間と、「痕跡」として分類されるエピソードが除外される週単位の失禁エピソード頻度という点におけるＦＩの重症度の増加との組み合わせが、本発明に従ってＭＰＣを使用して便失禁を治療する方法からはるかに良好な利益を得る患者を選択するための実施例７の好適な選択プロセスであることを見出した。本発明者らは、ＴＰＰ１の定義に加えて、治療前（ＴＰＰ３）に、痕跡が失禁エピソードとして計上されない週２回を超えるＩＥＦを有することによって定義される、実施例７に従った患者のそのような狭いサブグループを選択することによって、ＭＰＣ（ＬＣＣ及び／又はＨＣＣ）の投与後の前記患者集団において、より広い患者集団（ＩＴＴ、ＴＰＰ１）において観察されたものと比較して、週１回のＩＥＦの減少が増大し、レスポンダー率が増大することを見出した（図２）。これはさらに、全体的な効果量とオッズ比の増加によって強調される（図８）。したがって、この狭い範囲の患者集団の選択は、当該技術分野ですでに知られている広い範囲の患者集団の選択と比較して有利である。
【0091】
本発明者らは、便失禁の初診から１０年以下であり、治療前に週２回を超えるＩＥＦの、筋損傷を伴う便失禁を患う患者のサブグループを選択すると、本発明の方法による症状の治療に特に反応することを見出した（実施例７、図９及び図１０）。
【0092】
好ましい実施形態では、対象者は１８歳以上である。さらに好ましい実施形態において、対象は、６ヶ月以上便失禁に罹患しており、これは、関連する病歴及び肛門検査によってスクリーニング時に確認される。さらに好ましい実施形態では、対象者は、ウェクスナースコアが９を超え、かつ、例えば２、３又は４週間などの一定期間にわたって腸日記で測定した便失禁のエピソードが週に少なくとも３回ある。さらに好ましい実施形態では、対象は、上記のように日記を用いて測定された１週間当たり少なくとも３回の非気体性失禁エピソードを有する。
【0093】
好ましい実施形態において、対象は、ＭＰＣを投与する日以前の過去６ヶ月以内に肛門手術を受けていない。さらに好ましい実施形態において、対象は、オーバーラップ修復手術を過去に１回以上受けていない。本明細書で使用される「オーバーラップ修復」という用語は、好ましくは、当該技術分野において出生時の裂傷の場合に急性損傷を修正するために通常行われるような一次オーバーラップ修復を指す。好ましくは、前記用語はまた、一次オーバーラップ修復で行われるが後の時期（急性損傷なし）に行われる同等の治療を指し、この治療はまた「括約筋形成術」とも呼ばれ得る。さらに好ましい実施形態では、対象者は合計で２回を超える肛門外科手術（例えば、分娩後の一次修復と、後に行われる１回のオーバーラップ修復、又は永久神経刺激システムの挿入及び抜去）を受けていない。さらに好ましい実施形態において、対象は、外肛門括約筋の重複修復及び関連する早期萎縮を有さない。さらに好ましい実施形態において、対象は、人工肛門括約筋（ＡＡＳ）手術の既往歴がない。好ましい実施形態において、対象は、いかなる増量製品の経又は肛門周囲注射も受けていない。好ましい実施形態において、対象は、腸及び骨盤の放射線療法を受けていない。好ましい実施形態において、対象は、ＭＰＣを投与する日以前の過去５年以内に化学療法を受けていない。好ましい実施形態において、対象は、腸及び骨盤の化学療法関連神経障害を有さない。好ましい実施形態において、対象は免疫抑制療法を受けていない。好ましい実施形態において、対象は、慢性炎症性腸疾患の診断を受けていない。好ましい実施形態において、対象は、現在及び肛門瘻疾患の診断を有さない。好ましい実施形態において、対象は、慢性下痢を有さない。好ましい実施形態において、対象は、産科的外傷及び他の外傷、急性椎間板脱落、又は神経疾患（脊髄損傷、多発性硬化症、パーキンソン病、脳卒中など）を含む急性肛門括約筋損傷を有さない。好ましい実施形態において、対象は、制御されていないＩ型又はＩＩ型糖尿病を有しておらず、又は糖尿病性末梢神経障害性疼痛を患っていない。好ましい実施形態において、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、急性又は慢性のウイルス性肝炎ＨＣＶ、急性又は慢性のウイルス性肝炎ＨＢＶ、活動性梅毒、ＨＴＬＶ（例えば、治験責任医師によるリスク評価に基づいて検査される）と診断されていない。好ましい実施形態において、対象は、電気刺激治療領域に金属部品の埋め込みがない。好ましい実施形態において、対象は、慢性便秘及び／又は溢流性尿失禁を有していない。
【0094】
好ましい実施形態において、対象は、筋肉損傷、骨盤底機能障害、神経損傷、貯蔵能力の喪失、又は萎縮の失禁に関連する状態を有する。好ましい実施形態において、対象の便失禁は、受動性失禁、切迫性失禁、又は便の染み出しである。非常に好ましい実施形態において、対象は、筋肉損傷、萎縮、及び／又は切迫性便失禁の便失禁に関連する状態を有する。
【0095】
本発明に従って使用するためのＭＰＣは、好ましくは、本明細書においてさらに記載されるように、前記対象の肛門括約筋組織に、好ましくは外肛門括約筋に、内肛門括約筋に、及び／又は恥骨筋に、又は隣接して投与される。投与は、好ましくは、注射によって行われる。注射工程は、静的な注入、すなわち、注射装置が到達した位置に留まる注射であってもよいが、これに限定されない。あるいは、注射工程は動的であってもよい。あるいは、ＭＰＣの投与は、細胞を肛門括約筋組織に隣接させるのに適した任意の投与経路を含んでよい。このような投与経路は、例えば、経口投与、局所投与、静脈内投与、又は動脈内投与からなる。
【0096】
本実施形態の上記の好ましい実施形態のいずれかにおいて、前記方法は、ＭＰＣの投与前及び／又は投与後に肛門括約筋組織を刺激することをさらに含む。好ましくは、前記刺激は、ＭＰＣの投与後、少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも４週間の肛門括約筋組織刺激を含み、より好ましくは、ＭＰＣの投与前、及びＭＰＣの投与後、少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも４週間の肛門括約筋組織刺激を含む。
【0097】
好ましくは、前記刺激は、ケーゲル運動及び／又は電気刺激によって、より好ましくは、ケーゲル運動及び／又は経皮的電気刺激によって行われる。前記経皮電気刺激は、好ましくは毎日、より好ましくは１日２回、さらに好ましくは１日３回行われる。好ましくは、前記刺激のいずれかが少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも２０分間行われる。また、好ましくは、刺激は１日に複数回、より好ましくは１～１０回、さらに好ましくは１～５回、さらに好ましくは３回行われる。
【0098】
前記電気刺激は、好ましくは１日あたり特定の時間、例えば１回あたり少なくとも５分、好ましくは少なくとも１５分、より好ましくは少なくとも２０分間行う。好ましくは、患者は、１日に３回、それぞれ約１～６０分間、好ましくは約１０～３０分間、より好ましくは約２０分間刺激を実施する。好ましくは、電気刺激は、刺激装置に取り付けられた直腸肛門プローブの使用を含む。好ましくは、前記直腸肛門プローブは、刺激中に対象の直腸内に挿入される。好ましくは、前記刺激装置は電気パルスをプローブに送信するようにプログラムされ、パルスは好ましくは二相性又は単相性である。好ましくは、前記パルスは、休止、増加、平衡、減少、休止のシーケンスで埋め込まれる。好ましくは、前記二相又は単相パルスは、前記平衡において、約１０Ｈｚ～約１００Ｈｚ、より好ましくは約２５Ｈｚ～約７５Ｈｚ、より好ましくは約５０Ｈｚの周波数を有する。好ましくは、各平衡相は、各増加相又は減少相と同じ持続時間を有する。好ましくは、各休止、増加、減少、又は平衡相は、約１秒～約１５秒、より好ましくは約２秒～約８秒、より好ましくは約４秒持続する。好ましくは、平衡相における電流の強さは、約１ｍＡ～約１０００ｍＡ、より好ましくは約１０ｍＡ～約５００ｍＡ、より好ましくは約５０ｍＡ～約２５０ｍＡ、より好ましくは約７５ｍＡ～約１５０ｍＡ、より好ましくは約１００ｍＡに設定される。好ましくは、二相又は単相パルスは、約５０μｓ～約５００μｓ、より好ましくは約１５０μｓ～約３００μｓ、より好ましくは約２００μｓ～約３００μｓ、より好ましくは約２５０μｓの幅を有する。
【0099】
ケーゲル運動は、好ましくは、対象により骨盤底筋の随意的な収縮によって行う。好ましくは、収縮は約１秒から約１０秒、より好ましくは約２秒から約５秒、より好ましくは約３秒保持される。収縮後、好ましくは筋肉は約１秒～約１０秒、より好ましくは約２秒～約５秒、より好ましくは約３秒弛緩される。好ましくは、前記収縮と前記弛緩のシーケンスは、１～２０回、より好ましくは５～１５回、より好ましくは約１０回繰り返される。好ましくは、前記回数のシーケンスの各セットは、好ましくは毎日１～１０回、より好ましくは３～５回、より好ましくは３回繰り返される。
【0100】
本発明者らは、電気刺激と細胞注入の組み合わせ（例えば、実施例１によるＨＣＣ又はＬＣＣ治療）が、電気刺激と偽注入単独（例えば、実施例１によるＰＢＯ治療）よりも良好であることを見出し（図１）、ＭＰＣと電気刺激の組み合わせが失禁の有効な治療法であることを示唆した。
【0101】
細胞用量の選択
好ましくは、ＭＰＣは、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法における使用のためのものであり、該方法は、有効量のＭＰＣ、好ましくは約１００万～約２億ＭＰＣ、好ましくは約４００万～約６０００万ＭＰＣ、より好ましくは約４００万～約６００万ＭＰＣ又は約４０００万～約６０００万ＭＰＣの投与を含む。
好ましくは、ＭＰＣは、対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法における使用のためのものであり、該方法は、有効量のＭＰＣ、好ましくは約１００万～約２億ＭＰＣ、好ましくは約４００万～約６０００万ＭＰＣ、より好ましくは約４００万～約６００万ＭＰＣ又は約４０００万～約６０００万ＭＰＣの投与を含む。
【0102】
本発明者らは、幅広い患者集団（ＩＴＴ）において、４，０００万～６，０００万ＭＰＣの（ＨＣＣ）注射後、治療後６ヵ月で、痕跡を失禁エピソードとしてカウントした場合（図１Ａ）、及び治療後１２ヵ月で、痕跡を失禁エピソードとして除外した場合（図ＩＢ）に、プラセボ注射（ＰＢＯ）と比較して、週単位の失禁エピソード頻度が有意に高い減少を示すことを見出した。実施例５の全試験期間において、失禁エピソードとして痕跡を含める／含めないにかかわらず、ＨＣＣの方がＰＢＯよりも週単位の失禁頻度の減少率が高い傾向が観察された（図１）。さらに、ＩＴＴ患者集団において痕跡を含めると（図１Ｃ）、ＰＢＯ群と比較してＬＣＣ及びＨＣＣ群で一貫して高いレスポンダー数が認められた（図ＩＤ）。また好ましくは、本実施形態によれば、患者１人当たり４００万～６００万細胞の量である。本出願人は、ＰＢＯ治療と比較して、４００万～６００万細胞（ＬＣＣ）によるＩＴＴ患者の治療後に、週ＩＥＦの減少及びレスポンダー率の増加の高い傾向の両方が観察されることを見出した（図１）。この傾向は、便失禁から１０年以上経過していない便失禁患者に対して４００万～６００万個の細胞を用いた場合に顕著になった。本発明者らは、このような患者に対して、ＬＣＣ移植は、ベースラインから治療後１２ヶ月までＩＥＦを有意に減少させ（図２Ａ及びＢ）、また、ほとんどの患者において、１週間当たりのＩＥＦ（痕跡を除く）を少なくとも５０％減少させることにより臨床的に重要であることを見出した（図２Ｄ）。本発明者らはさらに、４，０００万～６，０００万個の細胞を注入した患者は、４００万～６００万個の細胞を注入した患者と比較して、便失禁症状（１週間当たりのＩＥＦ）がより高い減少傾向を示すことを見出した。
【0103】
注射手順
本発明の好ましい実施態様において、ＭＰＣは対象の肛門括約筋組織内又は肛門括約筋組織に隣接して注射される。好ましくは、前記細胞は、外肛門括約筋、内肛門括約筋、及び／又は恥骨筋の中又はそれに隣接して注射される。より好ましくは、前記細胞は外肛門括約筋、内肛門括約筋又は恥骨筋に注射される。最も好ましくは、前記細胞は外肛門括約筋に注射される。本発明者らは、ＭＰＣの外肛門括約筋への注射が、プラセボ治療と比較して有効であることを見出した（図１）。本発明者らは、実施例１に従って単離された細胞を、実施例５に従って必要とする対象に注射することが成功することを見出した。注射部位は、肛門括約筋組織に属する外肛門括約筋とした。
本発明の好ましい実施態様において、ＭＰＣは対象の肛門括約筋組織内又は肛門括約筋組織に隣接して注射される。好ましくは、前記細胞は、外肛門括約筋、内肛門括約筋、及び／又は恥骨筋の中又はそれに隣接して注射される。より好ましくは、前記細胞は外肛門括約筋、内肛門括約筋又は恥骨筋に注射される。最も好ましくは、前記細胞は外肛門括約筋に注射される。本発明者らは、ＭＰＣの外肛門括約筋への注射が、プラセボ治療と比較して有効であることを見出した（図１）。本発明者らは、実施例１に従って単離された細胞を、実施例５に従って必要とする対象に注射することが成功することを見出した。注射部位は、肛門括約筋組織に属する外肛門括約筋とした。
【0104】
本発明の好ましい一実施態様では、ＭＰＣは所定の組織又は損傷部位に注射され、それによってＭＰＣは溶液又は懸濁液中の治療上有効な細胞数、例えば約１×１０6～約２×１０8個の細胞を含む。注射用の前記細胞数は、好ましくは約０．１ｍＬ～約１００ｍＬ、より好ましくは約１ｍＬ～約１０ｍＬ、より好ましくは約３ｍＬ～約６ｍＬ、さらに好ましくは６ｍＬの溶液に懸濁される。注射液は、血清の有無にかかわらず、生理学的に許容される媒体である。生理学的に許容される媒体は、非限定的な例として、生理食塩水、又はリン酸緩衝溶液であってもよい。
【0105】
本発明の好ましい一実施形態において、肛門括約筋組織へのＭＰＣ注射は、外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋を増強、改善、及び／又は修復するために、肛門失禁の治療として実施される。好ましくは、ＭＰＣは外肛門括約筋及び／又は内肛門括約筋に注射されるか、又は隣接して注射され、生存して成熟筋肉細胞に分化し、括約筋を増強及び／又は括約筋機能を改善する。本実施形態に従ったＭＰＣの実現可能性及び長期生存は、以前に示されている（Ｍｅｓｓｎｅｒら、２０２１；Ｔｈｕｍｅｒら、２０２０）。
【0106】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＭＰＣ注射は、既存の失禁組織を増強及び／又は強化することによって肛門失禁を予防するために、肛門括約筋組織に行われる。健康な筋肉組織へのＭＰＣ注射の実行可能性は、既に実証されている（Ｆｒｕｄｉｎｇｅｒら、２０１５年）。
【0107】
本発明の好ましい一実施態様では、有効細胞数は１つ又は複数の細胞懸濁液の分割量（アリコート）で投与される。好ましくは、患者あたり複数の分割量が注射され、より好ましくは２～５０アリコート、より好ましくは２～２０アリコート、さらに好ましくは５～１５アリコート、好ましくは、患者当たり合計０．１～１００ｍｌ、より好ましくは１～１０ｍｌ、さらに好ましくは３～６ｍｌが注射される。本発明者らは、このような分注数及び分注量が有効であり（すなわち、プラセボ適用より優れている）、臨床的に適切である（すなわち、ほとんどの患者が１週間当たりのＩＥＦを少なくとも５０％減少させる）ことを見出した（図１及び図２）。
【0108】
本発明の好ましい実施形態において、ＭＰＣは、前記対象の肛門括約筋組織内及び／又は肛門括約筋組織に隣接する１回以上の注射によって、好ましくは外肛門括約筋、内肛門括約筋及び／又は恥骨筋への１回以上の注射によって投与される。好ましくは、本発明に従って使用するためのＭＰＣは、対象の内肛門括約筋に注射され、ここで、対象は、さらに、受動性便失禁又は受動性便失禁及び切迫性便失禁に罹患していることを特徴とする。好ましくは、本発明に従って使用するためのＭＰＣは、対象の外肛門括約筋及び／又は恥骨筋、より好ましくは外肛門括約筋に注射され、ここで前記対象はさらに、切迫性便失禁又は切迫性及び受動性便失禁に罹患していることを特徴とする。好ましくは、ＭＰＣの注入は、肛門括約筋組織全体の複数の位置で行われる。
【0109】
好ましくは、ＭＰＣは１箇所又は複数箇所、より好ましくは約２～約２０箇所、より好ましくは約６～約１８箇所、より好ましくは約１０～約１５箇所、さらに好ましくは約１２箇所に注射する。本発明者らは、実施例１のＭＰＣの注射を実施例５に従って患者に分布させることが有効であり、プラセボ治療よりも有意に有効であることを見出した（図１）。
【0110】
本発明で使用するＭＰＣ
本発明は、本発明に従って使用するためのＭＰＣを提供する。本発明の一実施形態においてＭＰＣは、ＥＰ２１２０９７６Ｂ１に既に開示されている「筋肉由来細胞」として特徴付けられる。このような細胞の非限定的な例としては、筋組織に存在する筋芽細胞、線維芽細胞、筋由来幹細胞が挙げられる。また、本発明では、特に肛門括約筋組織の修復に使用するための、筋原性の可能性を有する細胞（例えば、脂肪吸引した組織１５、又は他の幹細胞を保有する組織（骨髄）、又は脂肪由来細胞から）も使用することを意図している。特に、本発明で使用する細胞は、インビトロ及び／又はインビボで融合（少なくとも３つの細胞の合胞体を形成）し、配向性の収縮性細胞骨格（アクチン・ミオシン配列）を確立することができる。本発明に従って、筋芽細胞を含むＭＰＣは、初代細胞であっても培養細胞であってもよい。これらは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性（自家）であっても非組織適合性（同種）であってもよい。本発明の特定の実施形態は、筋芽細胞及び筋由来幹細胞であり、レシピエントにとって異物とは認識されない自己の筋芽細胞及び筋由来幹細胞を含む。この点で、筋芽細胞は主要組織適合の中心（ヒトではＭＨＣ又はＨＬＡ）に対して適合させることができる。このようなＭＨＣ又はＨＬＡ適合細胞は自家細胞でもよい。あるいは、同じか類似のＭＨＣやＨＬＡ抗原プロファイルを持つヒトの細胞であってもよい。患者はまた、同種ＭＨＣ抗原に寛容であるか、あるいは細胞がＭＨＣタンパク質を欠くように操作され、それによって元々ＨＬＡが不一致のレシピエントに対して免疫寛容となる。
本発明は、本発明に従って使用するためのＭＰＣを提供する。本発明の一実施形態においてＭＰＣは、ＥＰ２１２０９７６Ｂ１に既に開示されている「筋肉由来細胞」として特徴付けられる。このような細胞の非限定的な例としては、筋組織に存在する筋芽細胞、線維芽細胞、筋由来幹細胞が挙げられる。また、本発明では、特に肛門括約筋組織の修復に使用するための、筋原性の可能性を有する細胞（例えば、脂肪吸引した組織１５、又は他の幹細胞を保有する組織（骨髄）、又は脂肪由来細胞から）も使用することを意図している。特に、本発明で使用する細胞は、インビトロ及び／又はインビボで融合（少なくとも３つの細胞の合胞体を形成）し、配向性の収縮性細胞骨格（アクチン・ミオシン配列）を確立することができる。本発明に従って、筋芽細胞を含むＭＰＣは、初代細胞であっても培養細胞であってもよい。これらは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性（自家）であっても非組織適合性（同種）であってもよい。本発明の特定の実施形態は、筋芽細胞及び筋由来幹細胞であり、レシピエントにとって異物とは認識されない自己の筋芽細胞及び筋由来幹細胞を含む。この点で、筋芽細胞は主要組織適合の中心（ヒトではＭＨＣ又はＨＬＡ）に対して適合させることができる。このようなＭＨＣ又はＨＬＡ適合細胞は自家細胞でもよい。あるいは、同じか類似のＭＨＣやＨＬＡ抗原プロファイルを持つヒトの細胞であってもよい。患者はまた、同種ＭＨＣ抗原に寛容であるか、あるいは細胞がＭＨＣタンパク質を欠くように操作され、それによって元々ＨＬＡが不一致のレシピエントに対して免疫寛容となる。
【0111】
本発明の別の実施形態では、ＭＰＣは、米国特許５，５３８，７２２号に記載されているような、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＩＩ抗原を欠いている。
【0112】
非常に好ましい実施形態では、ＭＰＣは骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）の細胞集団であり、細胞の少なくとも６０％がＣＤ５６陽性であり、細胞の少なくとも８０％がＣＤ９０陽性であり、細胞の多くとも１０％がＣＤ３４陽性である。好ましくは、さらに少なくとも６０％の細胞がＡ２Ｂ５及びＣＤ１０５に対して陽性である。好ましくは、ＳＭＤＣの前記細胞集団はＳｃａ－１陰性であり、特に、細胞の多くとも１０％又は０％がＳｃａ－１を発現する。好ましくは、また、細胞の少なくとも６０％がデスミンに対して陽性である。好ましくは、ＳＭＤＣの前記細胞集団はＭｙｏＤ陰性であり、特に、細胞の多くとも５％又は１０％がＭｙｏＤを発現する。
【0113】
さらに好ましい実施形態では、ＭＰＣはＳＭＤＣの細胞集団であり、細胞の約６４％～約９９．９％がＣＤ５６陽性であり、細胞の約８０％～約９９．９％がＣＤ９０陽性であり、細胞の約０％～約９％がＣＤ３４陽性である。好ましくは、細胞の少なくとも６０％がＡ２Ｂ５及びＣＤ１０５に陽性である。好ましくは、ＳＭＤＣの前記細胞集団はＳｃａ－１陰性であり、特に、細胞の多くとも１０％又は０％がＳｃａ－１を発現する。好ましくは、また、細胞の少なくとも６０％がデスミンに対して陽性である。好ましくは、ＳＭＤＣの前記細胞集団はＭｙｏＤ陰性であり、特に、細胞の多くとも５％又は１０％がＭｙｏＤを発現する。
【0114】
本発明の別の実施形態において、ＭＰＣは、ＷＯ２０１９／１１５７９０（Ｔｈｕｍｅｒら、２０１９年、１１５７９０頁）に開示される「骨格筋由来細胞」（ＳＭＤＣ）として特徴付けられる。ＳＭＤＣは、好ましくは、特徴的な発現パターンを示す。好ましくは、前記ＳＭＤＣの約６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上が、ＣＤ５６及びＡ２Ｂ５を発現する。好ましくは、前記ＳＭＤＣはＣＤ３４、Ｓｃａ－１及びＭｙｏＤを発現しない。これにより、「発現しない」という用語は、好ましくは、ＳＭＤＣの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は２％未満が前記マーカーを発現することを意味する。好ましい実施形態では、前記ＳＭＤＣの０％がＳｃａ－１を発現する。
【0115】
さらなる好ましい実施形態において、ＭＰＣは、ＳＭＤＣの細胞集団であり、この集団は、少なくとも９０％のＣＤ５６陽性、少なくとも９０％のＡ２Ｂ２陽性、少なくとも９０％のＣＤ１０５陽性、及び少なくとも９０％のデスミン陽性細胞からなり、集団の１０％未満がＣＤ３４、Ｓｃａ－１及びＭｙｏＤを発現する。好ましい実施形態では、前記ＳＭＤＣの０％がＳｃａ－１を発現する。
【0116】
上記のようなＳＭＤＣの発現パターンは、分化を必要とせずに、細胞培養の筋原性指標を決定するために使用することができる。したがって、前記ＳＭＤＣの発現パターンは、骨格筋由来細胞を筋機能不全の治療、特に尿失禁及び／又は肛門失禁などの失禁の治療に使用できるかどうかを確認するために使用することができる。
【0117】
本発明の別の実施態様において、本明細書に記載されるＭＰＣは、ＷＯ２０２０／１９３４６０に開示される「筋原性前駆細胞」として特徴付けられる。好ましくは、これらの細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ９０の陽性発現、ならびにＣＤ３４の陰性発現によって特徴付けられる。本発明のさらに好ましい実施形態では、ＭＰＣは乏遺伝子である。本発明者らは、このような細胞が本発明の方法に有用であることを見出した（図１）。
【0118】
本発明の別の実施形態において、本明細書に記載されるＭＰＣは、ＷＯ２０２０／１９３４６０に開示される「間葉系間質細胞」又は「ＭＳＣ」として特徴付けられ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３の陽性発現、及びＣＤ３４、及びＣＤ５６の陰性発現によって特徴付けられる。本発明のさらに好ましい実施形態において、ＭＰＣは、デスミンの陰性発現及び／又はＣＤ９０の陽性発現によって特徴付けられるＭＳＣである。本発明のさらに好ましい実施形態において、ＭＰＣは多能性ＭＳＣである。
【0119】
本発明の別の実施態様において、本明細書に記載のＭＰＣは、ａＳＭＡ、ＣＤ４９ａ、デスミン、ＣＤ５６、及びＣＤ１４６の陽性発現、ならびにＣＤ３４の陰性発現によって特徴付けられる。
【0120】
本発明の別の実施態様において、本明細書に記載のＭＰＣは、ａＳＭＡ、ＣＤ４９ａ及びＣＤ１４６の陽性発現、ならびにＣＤ５６の陰性発現によって特徴付けられる。
【0121】
非常に好ましい実施形態において、本発明による方法において使用するためのＭＰＣは、ＣＤ５６及びＣＤ９０のマーカーの陽性発現によって特徴付けられ、特に、ＭＰＣの少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％がＣＤ５６を発現し、筋原性前駆細胞の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％がＣＤ９０を発現する。好ましくは、前記ＭＰＣの約６０～約９９．９％がＣＤ５６を発現し、前記ＭＰＣの約８０～約９９．９％がＣＤ９０を発現する。好ましくは、前記ＭＰＣはマーカーＣＤ３４及び／又はＳｃａ－１の陰性発現によってさらに特徴付けられ、特にＭＰＣの最大１０％、より好ましくは最大５％、さらに好ましくは最大１％がＣＤ３４及び／又はＳｃａ－１を発現する。さらに好ましくは、ＭＰＣはマーカーデスミンの陽性発現によってさらに特徴付けられ、特に、細胞の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９５％がデスミン陽性である。
【0122】
好ましい実施形態において、本発明による方法において使用するためのＭＰＣは、以下のマーカー発現特性を有する細胞集団から構成される：
前記細胞集団（すなわちＭＰＣ）の約６０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約６０～約９９．９％がマーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１５％がマーカーＣＤ３４を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約６０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約７０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１０％が細胞マーカーＣＤ３４を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約８０～約９９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約８０～約９９．９％がマーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約５％がマーカーＣＤ３４を発現する。
前記細胞集団（すなわちＭＰＣ）の約６０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約６０～約９９．９％がマーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１５％がマーカーＣＤ３４を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約６０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約７０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１０％が細胞マーカーＣＤ３４を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約８０～約９９％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約８０～約９９．９％がマーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約５％がマーカーＣＤ３４を発現する。
【0123】
本発明による使用のためのＭＰＣは、さらに以下のマーカー発現特性を有することができる：
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、及び／又は前記細胞集団の約６０～約１００％がマーカーＣＤ１０５を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約６０～約９９．９％が細胞マーカーデスミンを発現し、約９０～約１００％の細胞が細胞マーカーＣＤ１０５を発現する。好ましくは、前記細胞集団の約６０～約１００％がさらに細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する。
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、及び／又は前記細胞集団の約６０～約１００％がマーカーＣＤ１０５を発現する。より好ましくは、前記細胞集団の約６０～約９９．９％が細胞マーカーデスミンを発現し、約９０～約１００％の細胞が細胞マーカーＣＤ１０５を発現する。好ましくは、前記細胞集団の約６０～約１００％がさらに細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現する。
【0124】
さらに特に好ましい実施形態では、ＭＰＣは以下のマーカー発現特性を有する：
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１０％が細胞マーカーＣＤ３４を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ１０５を発現する。好ましくは、前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＳｃａ－１の発現を示す。
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０～約１０％が細胞マーカーＣＤ３４を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現し、前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ１０５を発現する。好ましくは、前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＳｃａ－１の発現を示す。
【0125】
上記のＭＰＣに関する全ての実施形態のさらに好ましい実施形態では、ＭＰＣの約０～約１０％がＭｙｏＤを発現し、及び／又はＭＰＣの約０～約１０％がＳｃａ－１を発現する。
【0126】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明による使用のためのＭＰＣは、以下のマーカー発現特性を有する：
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約８０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０％～約１０％の細胞マーカーＣＤ３４を発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーＣＤ１０５を発現し、前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＭｙｏＤ及び／又は前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＳｃａ－１を発現する。
前記細胞集団の約６０～約１００％が細胞マーカーＣＤ５６を発現し、前記細胞集団の約８０～約９９．９％が細胞マーカーＣＤ９０を発現し、前記細胞集団の約０％～約１０％の細胞マーカーＣＤ３４を発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーデスミンを発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーＡ２Ｂ５を発現し、前記細胞集団の約６０％～約１００％が細胞マーカーＣＤ１０５を発現し、前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＭｙｏＤ及び／又は前記細胞集団の約０％～約１０％が細胞マーカーＳｃａ－１を発現する。
【0127】
本発明の別の好ましい実施態様において、本発明の方法において使用するためのＭＰＣは、細胞系譜への分化能によって特徴付けられる。好ましくは、ＭＰＣは、インビトロ及び／又はインビボで筋原性分化能を含むものとして特徴付けられ、それによって分化能は、多核筋線維の形成によって、又は複数の単一核細胞の電気生理学的結合によって、すなわち、成熟筋組織を増大させる、形成する、又は成熟筋組織になる能力として定義される。好ましくは、ＭＰＣは、インビトロ及び／又はインビボにおいて、成熟筋組織を増大させ、形成し、又は成熟筋組織となり得る。好ましくは、ＭＰＣは、インビトロ及び／又はインビボにおいて、成熟骨格筋組織及び／又は平滑筋組織を増大させ、形成し、又は成熟骨格筋組織及び／又は平滑筋組織になることができる。ＭＰＣはさらに、培養において有糸分裂によって自己複製する能力、及び対象への投与後に有糸分裂を終了する能力によって特徴付けられる。
【0128】
本発明の別の実施形態では、ＭＰＣは筋原性及び神経原性の分化能を有することが特徴である。さらに、ＭＰＣは、さらなる分化能、すなわち、オリゴ、マルチ又は多能性を有することができる。好ましくは、ＭＰＣは、必要とする肛門失禁対象の前記注射部位に隣接する全ての組織に対する分化能を含む。より好ましくは、このような分化能は、骨格組織、平滑組織及び／又は神経細胞組織への分化を含む。好ましくは、前記細胞は、肛門括約筋組織の骨格筋組織及び平滑筋組織の増大及び再生を可能にする多能性である。より好ましくは、前記細胞は、肛門括約筋組織の骨格筋組織及び平滑筋組織、ならびに神経組織の増大及び再生を可能にするために多能性である。筋原性及び／又は神経原性の可能性を含む細胞は、筋組織から、好ましくは筋生検を行うことによって単離することができる。好ましくは、筋原性の可能性を持つ細胞は、骨格筋由来細胞（ＳＭＤＣ）を得ることによって筋生より単離される。
【0129】
このような細胞は、当業者に公知の方法で筋原性潜在能について試験することができる。本発明によるＭＰＣの筋原性及び／又は神経原性の可能性を決定するために、細胞は、本発明の実施例又は当業者に公知の他の方法（例えば、Ｔｈｕｍｅｒら、２０１８）に従って、そのＡＣｈＥ活性について陽性と試験される。
【0130】
本発明に従って使用するためのＭＰＣは、好ましくは約２０ｍＵrel～約１０００ｍＵrel、より好ましくは約３０ｍＵrel～約８００ｍＵrel、さらに好ましくは約５０～約７００ｍＵrelのＡＣｈＥ活性を有し、各ＡＣｈＥ活性は、好ましくは約５～約７日間骨格筋分化培地で培養された２ｘ１０5細胞当たりで測定される。
【0131】
上記のように対象に投与される選択された細胞用量の細胞は、好ましくは約ｌｘ１０2ｍＵrel_total～約ｌｘ１０6ｍＵrel_totalの総ＡＣｈＥ活性を示し、より好ましくは約ｌｘ１０3ｍＵrel_total～約５ｘ１０5ｍＵrel_total、さらに好ましくは約７ｘ１０4ｍＵrel_total～約２ｘ１０5ｍＵrel_totalである。前記総ＡＣｈＥ活性を決定するために、２ｘ１０5個の細胞について決定されたＡＣｈＥ活性を外挿することができる。例えば、細胞のバッチが２ｘ１０5個の細胞あたり５０ｍＵrelのアセチルコリンエステラーゼ酵素活性を有する場合、そのような細胞を５０００万個含む細胞の懸濁液が合計１．２５ｘ１０4ｍＵrelの総アセチルコリンエステラーゼ酵素活性を有することを外挿することができる。従って、単位「ｍＵrel_total」は、好ましくは、ある数の細胞の外挿ＡＣｈＥ活性を指し、ここで、ＡＣｈＥ活性は、ｍＵrelで測定された相対ＡＣｈＥ活性から直線的に外挿される。さらなる好ましい実施形態において、ｍＵrel_totalで与えられる総ＡＣｈＥ活性は、本明細書に記載されるようなＡＣｈＥ標準に対するＭＰＣの細胞集団又は細胞用量の総ＡＣｈＥ活性である。従って、単位「ｍＵrel_total」はまた、原液の希釈液のＯＤが、ＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加の６～８分後、好ましくは６、７、又は８分後に既に測定されることを除いて、同じ条件下で、４～５００ｍＵ／ｍｌの範囲のＡＣｈＥ原液の希釈系列によって得られる直線式に関して、ＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加の６０分後に測定される前記細胞集団又はＭＰＣの細胞用量の相対的な「ｍＵ／ｍｌ」を指す場合がある。
【0132】
本発明者らは、本発明に開示された方法に従って得られたＭＰＣが、ＬＣＣバッチの場合、３６ｍＵrel～５６８ｍＵrelの範囲の２４１．９０±ＳＤ ＡＣｈＥ活性を保有することを見出した（ここで、前記ＡＣｈＥ活性はそれぞれ２ｘ１０5個の細胞当たりで測定される）。ＨＣＣバッチ（ｎ＝７５）は、４９ｍＵrel～６８０ｍＵrelの範囲の平均±ＳＤ ＡＣｈＥ活性２１３±１３７．４０ｍＵrelを保有することが見出された。
【0133】
筋原性前駆細胞を得るための方法
本発明による方法で使用するＭＰＣは、好ましくは筋組織の単離細胞である。これらは、当業者に周知の方法、例えば、筋生検からの単離によって得ることができる。好ましくは、細胞は、筋組織から、好ましくは筋生検を得ることによって単離することができる。好ましくは、筋生検は外科手術によって対象から得られる。好ましくは、ＭＰＣは、対象から、より好ましくはヒト対象から、さらに好ましくは、例えば失禁に罹患している対象のような必要としているヒト対象から単離される。好ましくは、ＭＰＣは、対象の筋生検から単離されるか、又は代わりに、脂肪組織もしくは結合組織のような、しかしこれらに限定されない別の組織源から単離される。好ましくは、前記筋生検は骨格筋から得られ、より好ましくは、大胸筋、上腕二頭筋、又は広背筋から得られる。
本発明による方法で使用するＭＰＣは、好ましくは筋組織の単離細胞である。これらは、当業者に周知の方法、例えば、筋生検からの単離によって得ることができる。好ましくは、細胞は、筋組織から、好ましくは筋生検を得ることによって単離することができる。好ましくは、筋生検は外科手術によって対象から得られる。好ましくは、ＭＰＣは、対象から、より好ましくはヒト対象から、さらに好ましくは、例えば失禁に罹患している対象のような必要としているヒト対象から単離される。好ましくは、ＭＰＣは、対象の筋生検から単離されるか、又は代わりに、脂肪組織もしくは結合組織のような、しかしこれらに限定されない別の組織源から単離される。好ましくは、前記筋生検は骨格筋から得られ、より好ましくは、大胸筋、上腕二頭筋、又は広背筋から得られる。
【0134】
ＭＰＣは、（ａ）得られた筋生検の冷却；（ｂ）サンプルの処理及び冷却；（ｃ）ステップ（ｂ）のサンプルを、少なくとも１つの酵素を含む血清を含む培地に再懸濁し、３８℃まで１～２０時間加熱する；サンプルをペレット化する；及び（ｄ）ステップ（ｃ）のサンプルのペレットを再懸濁し、ステップ（ｃ）のサンプルから単一細胞懸濁液を提供し、それによってＭＰＣを得る、という以下のステップを含む方法によって、得られた筋生検から好ましくは得られる。ステップ（ａ）は筋生検を実施することを含む。ＭＰＣの供給源となるこのような筋生検は、損傷部位の筋肉から、又は臨床外科医がより容易にアクセスし得る別の部位から得ることができる。さらなる好ましい実施形態において、ステップ（ａ）は、１６℃より低い温度、好ましくは１～１６℃、好ましくは４～１０℃、特に好ましくは７℃の温度範囲で；そして最大９６時間の範囲の時間で実施される。したがって、ステップ（ａ）は、１～１６℃の温度範囲、又はこの範囲の中間の任意の温度、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃、又はこの範囲内の任意の中間温度、例えば６～８℃の温度範囲で実施することができる。あるいは、温度範囲は４℃以下、好ましくは１～３℃の範囲である。ステップ（ａ）は、好ましくは、９６時間までの範囲の時間、又はこの範囲内の任意の時間、例えば、１２時間～９６時間、１２時間～７２時間、１２時間～４８時間、２４時間～９６時間、２４時間～７２時間、２４時間～４８時間、又は他の任意の中間範囲の時間で実施される。好ましくは、ステップ（ｂ）の処理は、ハサミ、メス、ピンセット、フィルター、ボールミル、遠心分離機の使用を含む。前記の処理とは、特に前記組織試料の機械的破壊を指す。試料の処理は、好ましくは室温で行われる。ステップ（ｂ）における冷却は、好ましくは、試料の処理後に実施される。ステップ（ｂ）における冷却は、１～１６℃の範囲内の温度、又はこの範囲内の任意の温度、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃、又はこの範囲内の任意の中間温度、例えば４～８℃の範囲内、又は１～３℃の範囲内の温度で実施することができる。ステップ（ｂ）、特に冷却は、２～４８時間、２～３６時間、又は２～２４時間などの明確な時間範囲で実施することができる。ステップ（ｃ）は、好ましくは、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ及びＤＮＡｓｅからなる群から選択されるいずれか１種以上を含む溶液を用いて酵素処理を行うことからなる。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）はコラゲナーゼの使用を含む。ステップ（ｃ）における再懸濁は、好ましくは、ステップ（ｂ）の試料を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットをトリプシンなどの少なくとも一種の酵素を含む血清入り培地に再懸濁することを含む。ステップ（ｃ）はさらに、緩衝液のような適切な溶液中で細胞をボルテックスすることを含む、一つ以上の洗浄ステップを含んでもよい。ステップ（ｂ）の試料は、好ましくは、インキュベーション時間後に遠心分離して試料の細胞をペレット化し、酵素含有上清を廃棄する。ステップ（ｃ）は、２５～３８℃、好ましくは３６～３８℃の範囲の温度で実施することができる。好ましくは、ステップ（ｄ）は、ＦＡＣＳソーティング、遠心分離、動電泳動ソーティング、音響泳動ソーティング、ビーズベースセルソーティング、及び光学ソーティングの少なくとも１つから選択される方法を含む。単一細胞懸濁液を得るのに適した濃縮法は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ（登録商標））である。ＭＡＣＳ法では、特定の表面抗原に対する抗体をコートした粒子と細胞をインキュベートすることにより、細胞を分離することができる。その後、インキュベートされた細胞は磁場中に置かれたカラムに移される。このステップでは、抗原を発現してナノ粒子に付着した細胞はカラム上に留まり、抗原を発現していない他の細胞はカラムを通過する。この方法により、細胞は特定の抗原に対してポジティブ及び／又はネガティブに分離される。好適な濃縮方法の別の例は、例えばＷｅｂｓｔｅｒら（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １９８８ Ｊａｎ； １７４（ｌ）：２５２－６５）に記載されているような蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（登録商標）である。ステップ（ｄ）で得られた単一細胞懸濁液のインキュベーションを含むステップ（ｄ）の後に、さらなる任意のステップ（ｅ）を実施することができ、ステップ（ｅ）のインキュベーションは、好ましくは２５～３８℃、好ましくは３６～３８℃、特に好ましくは３７℃の範囲の温度で実施され、それによって接着ＭＰＣを得る。このさらなる任意のインキュベーションステップにより、細胞を増殖させ、より多量のＭＰＣを得ることができる。ステップ（ｅ）の後、任意に、ステップ（ｅ）の非付着細胞を廃棄することを含むさらなるステップ（ｆ）を実施してもよく、ステップ（ｆ）は好ましくは少なくとも６時間～４日後に実施される。ステップ（ｆ）の後、任意に、ステップ（ｅ）の接着細胞を増殖させるさらなるステップ（ｇ）を実施してもよく、ステップ（ｈ）の増殖は、接着細胞を７０～８０％コンフルエントまで１～５継代培養することからなる。
【0135】
本発明の別の実施態様では、ＭＰＣは任意のドナー、及びインビトロで培養可能で初期化可能な任意の体細胞から得られる。好ましくは、これらの体細胞はまず、Ｋｌｆ－４、Ｓｏｘ－２、Ｏｃｔ４及びＭｙｃからなる初期化因子の異所性発現によって、誘導多能性幹細胞に初期化される（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉｉ・Ｙａｍａｎａｋａ、２００６；Ｙａｍａｎａｋａ、２００８）、続いて、先行技術にすでに記載されているように、ＭＰＣへの指向性分化を行う（Ｂａｊｐａｉら、２０１２；Ｉｎｃｉｔｔｉら、２０２０；Ｍｉｙａｇｏｅ－Ｓｕｚｕｋｉ ＆ Ｔａｋｅｄａ、２０１７；Ｘｕａｎら、２０２１）。より好ましくは、筋原性前駆由来細胞は、当該技術分野で公知の方法（Ｈｉｒａｉら、２０１８；Ｉｔｏら、２０１７）に従って、多能性中間体を含まない直接的な初期化により体細胞から誘導される。
【0136】
本発明はまた、対象における肛門失禁を予防又は治療する方法を提供し、該方法は、（ａ）肛門失禁、より好ましくは便失禁を発症する危険性のある対象、又は肛門失禁に罹患している対象を選択する工程を包含する、より好ましくは便失禁を、失禁に関連する対象の状態に従って選択する工程 （ｂ）有効量のＭＰＣを肛門括約筋組織内又は肛門括約筋組織に隣接して投与する工程、好ましくは注射する工程、及び（ｃ）任意に、工程（ｂ）の前及び／又は後に肛門括約筋組織を刺激する工程を包含する。
【0137】
好ましくは、前記方法は、上述され、使用のためのＭＰＣが提供される対象における肛門失禁の予防及び／又は治療のための方法と同じ方法である。従って、失禁の期間、重篤度及び原因性の観点からの対象の選択に関連する実施形態、ＭＰＣの特徴に関連する実施形態、細胞用量、標的組織及び分布の観点からの有効量のＭＰＣの注入に関連する実施形態、及び／又は電気刺激及びケーゲル運動の観点からの刺激に関連する実施形態など、上述した全ての実施形態もまた、本発明による方法の実施形態を表す。
【0138】
本発明による方法のステップ（ａ）は、失禁に関連する状態として筋肉損傷を有する対象を選択することからなる場合がある。代替的又は追加的に、ステップ（ａ）は、肛門失禁期間が２０年以下、好ましくは１０年以下、又は上記に開示されたさらなるそれぞれの時間範囲のいずれかを有する対象を選択することを含む場合がある。代替的又は追加的に、ステップ（ａ）は、治療前に、６回を超えて、好ましくは７回を超えて、好ましくは８回を超えて、９回を超えて、又は１０回を超えて１週間当たりの失禁エピソードとして定義される失禁の重症度を有する対象を選択することを含む場合がある。代替的又は追加的に、ステップ（ａ）は、治療前に、週２回を超えた失禁エピソードが少量又はより多量と分類されると定義される失禁の重症度を有する対象を選択することを含む場合がある。ステップ（ｃ）は、ＭＰＣを注射した後、又はＭＰＣを注射する前及び注射した後に、好ましくは少なくとも２週間の肛門括約筋組織刺激を含む。
【0139】
本発明はまた、ＭＰＣと、対象における肛門失禁、好ましくは便失禁の予防及び／又は治療のための方法において使用するための医薬上許容される賦形剤及び／又は担体とを含む医薬組成物であって、前記対象が２０年以下、より好ましくは約６ヶ月～約２０年、又は約６ヶ月～約１０年の間、肛門失禁、好ましくは便失禁を発症する危険性があるか、又は肛門失禁、好ましくは便失禁に罹患している、医薬組成物を提供する。特に、本発明は、（ｉ）本発明の全ての実施形態による方法において使用するためのＭＰＣ、及び（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【0140】
本発明による医薬組成物は、さらに、１つ又は複数の従来の添加剤を含むことができる。このような添加物の例としては、生理学的に許容される緩衝液、アルブミン、コラーゲン、ラミニン、及びジメチルスルホキシドが挙げられる。
【0141】
本発明はさらに、本発明による方法において使用するための医薬組成物を調製するためのプロセスに向けられている。好ましくは、前記プロセスは、ＭＰＣを、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤、又は担体と混和する工程を包含する。
【0142】
本発明はさらに、１つ以上のコンパートメントを含む医薬パックに向けられ、ここで少なくとも１つのコンパートメントは、本発明による方法において使用するためのＭＰＣを含む。
【0143】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような対象における肛門失禁、好ましくは便失禁の予防及び／又は治療のための医薬品としてのＭＰＣの使用に向けられている。
【0144】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような対象における肛門失禁、好ましくは便失禁の予防及び／又は治療のための医薬の製造におけるＭＰＣの使用に向けられている。
【0145】
上述した実施形態のいずれかに従って疾患を治療又は発症予防する対象は、好ましくはヒト又は動物、特に哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【0146】
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではないと考えられる。
【実施例】
【0147】
実施例１－骨格筋由来筋原細胞（ＭＰＣ）の単離
本出願人が実施した臨床試験（ＥｕｄｒａＣＴ番号：２０１０－０２１４６３－３２）において、ＷＯ２０１９１１５７９０に既に開示されているように、ヒト便失禁患者からＭＰＣを単離した。ＷＯ２０１９１１５７９０では、少数の患者のサンプルからの筋原性骨格筋前駆細胞の単離が実施されたが、上記の臨床試験では、約１７０人の別個の患者のサンプルからの骨格筋由来筋原性前駆細胞の単離が実施された。したがって、当該試験に使用されたサンプルの質は、患者及び得られた生検の質に応じて、ＷＯ２０１９１１５７９０で使用されたサンプルとは部分的にかなり異なっていた可能性がある。詳細には、実施例５に従って治療される各失禁患者の大胸筋又は上腕二頭筋から骨格筋生検を採取した。生検を行うために、まず、大胸筋の筋膜に達するまで、約１ｃｍの長さで筋肉の上を切開して皮膚を開いた。筋膜を開いた後、１ｃｍ3の筋組織（生検）を採取した。生検は、ゲンタマイシン（最終濃度１～５μｇ／ｍｌ）を添加したＨａｍ Ｆ１０基礎培地からなる、約４℃に予冷された生検輸送培地に直接移された。生検は生検輸送培地内で１～１１℃で約２６時間保存した。次に、生検をｌｘ ＰＢＳで満たしたシャーレに移した。滅菌鉗子とメスを用いて筋組織を結合組織から分離した。次に、筋組織をｌｘ ＰＢＳを満たした別のシャーレに移し、メスを用いて２～３ｍｍ2の大きさに切り分けた。上記のような追加的な移送ステップの後、組織片をさらに１ｍｍ角に切断した。この断片を最後に、ｌｘ ＰＢＳを満たした遠心チューブに移し、１３００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、筋肉組織を８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したｌｘ ＰＢＳに懸濁した。その後、筋組織懸濁液を２～８℃に４８時間冷却した。冷却後、筋組織懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した後、１～５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、２～４％ｖ／ｖのＨｅｐｅｓ緩衝液、０．１～１０％ｖ／ｖの子牛胎児血清、５～１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンをＨａｍ Ｆ１０に溶解した消化液２．５ｍｌを添加した。筋組織懸濁液を３７℃、５％ＣＯ2で６～２０時間インキュベートした。次に、懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去し、ペレットを１０～２０％ｖ／ｖのＦＣＳ、１～３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３～１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＨａｍ Ｆ１０培地に再懸濁し、細胞培養フラスコにプレーティングした。培養フラスコの底に付着したＭＰＣは、３～４日ごとに培地を交換し、コンフルエントに達した後に剥離した後、サブ培養を行うことでさらに維持した。サブ培養は１ｘ１０6～８ｘ１０7ＭＰＣに達するまで行った。本実施例に従って単離されたＭＰＣは、分化条件（実施例２及び３）で培養すると多核筋管を形成し、ＡＣｈＥ活性が非常に陽性であることがわかった（図３及び図５）。さらに、実施例４に従って細胞を分析したところ、ＣＤ５６とＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３４が陰性であった（図６）。さらに、実施例２に従って分化条件で培養すると、細胞は多核筋管を形成することがわかった（図３）。
本出願人が実施した臨床試験（ＥｕｄｒａＣＴ番号：２０１０－０２１４６３－３２）において、ＷＯ２０１９１１５７９０に既に開示されているように、ヒト便失禁患者からＭＰＣを単離した。ＷＯ２０１９１１５７９０では、少数の患者のサンプルからの筋原性骨格筋前駆細胞の単離が実施されたが、上記の臨床試験では、約１７０人の別個の患者のサンプルからの骨格筋由来筋原性前駆細胞の単離が実施された。したがって、当該試験に使用されたサンプルの質は、患者及び得られた生検の質に応じて、ＷＯ２０１９１１５７９０で使用されたサンプルとは部分的にかなり異なっていた可能性がある。詳細には、実施例５に従って治療される各失禁患者の大胸筋又は上腕二頭筋から骨格筋生検を採取した。生検を行うために、まず、大胸筋の筋膜に達するまで、約１ｃｍの長さで筋肉の上を切開して皮膚を開いた。筋膜を開いた後、１ｃｍ3の筋組織（生検）を採取した。生検は、ゲンタマイシン（最終濃度１～５μｇ／ｍｌ）を添加したＨａｍ Ｆ１０基礎培地からなる、約４℃に予冷された生検輸送培地に直接移された。生検は生検輸送培地内で１～１１℃で約２６時間保存した。次に、生検をｌｘ ＰＢＳで満たしたシャーレに移した。滅菌鉗子とメスを用いて筋組織を結合組織から分離した。次に、筋組織をｌｘ ＰＢＳを満たした別のシャーレに移し、メスを用いて２～３ｍｍ2の大きさに切り分けた。上記のような追加的な移送ステップの後、組織片をさらに１ｍｍ角に切断した。この断片を最後に、ｌｘ ＰＢＳを満たした遠心チューブに移し、１３００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、上清を除去し、筋肉組織を８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したｌｘ ＰＢＳに懸濁した。その後、筋組織懸濁液を２～８℃に４８時間冷却した。冷却後、筋組織懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した後、１～５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、２～４％ｖ／ｖのＨｅｐｅｓ緩衝液、０．１～１０％ｖ／ｖの子牛胎児血清、５～１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンをＨａｍ Ｆ１０に溶解した消化液２．５ｍｌを添加した。筋組織懸濁液を３７℃、５％ＣＯ2で６～２０時間インキュベートした。次に、懸濁液を１３００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去し、ペレットを１０～２０％ｖ／ｖのＦＣＳ、１～３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３～１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＨａｍ Ｆ１０培地に再懸濁し、細胞培養フラスコにプレーティングした。培養フラスコの底に付着したＭＰＣは、３～４日ごとに培地を交換し、コンフルエントに達した後に剥離した後、サブ培養を行うことでさらに維持した。サブ培養は１ｘ１０6～８ｘ１０7ＭＰＣに達するまで行った。本実施例に従って単離されたＭＰＣは、分化条件（実施例２及び３）で培養すると多核筋管を形成し、ＡＣｈＥ活性が非常に陽性であることがわかった（図３及び図５）。さらに、実施例４に従って細胞を分析したところ、ＣＤ５６とＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３４が陰性であった（図６）。さらに、実施例２に従って分化条件で培養すると、細胞は多核筋管を形成することがわかった（図３）。
【0148】
実施例２－ＭＰＣの分化能
実施例１に従って得られた２ｘ１０6個のＭＰＣを、２４ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅプラスチックプレートに播種した。播種から約２～４日後、増殖培地を骨格筋細胞分化培地（５００ｍＬ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、ドイツ）に交換し、１０ｍＬの骨格筋細胞分化培地サプリメントパック（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、ドイツ）と２４０μＬのゲンタマイシン（８ｍｇ／ｍＬ、Ｓａｎｄｏｚ ＧｍｂＨ、オーストリア）を添加することにより、細胞の骨格筋分化を開始した。細胞を約５～７日間培養し、位相差顕微鏡で分析した。
実施例１に従って得られた２ｘ１０6個のＭＰＣを、２４ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅプラスチックプレートに播種した。播種から約２～４日後、増殖培地を骨格筋細胞分化培地（５００ｍＬ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、ドイツ）に交換し、１０ｍＬの骨格筋細胞分化培地サプリメントパック（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、ドイツ）と２４０μＬのゲンタマイシン（８ｍｇ／ｍＬ、Ｓａｎｄｏｚ ＧｍｂＨ、オーストリア）を添加することにより、細胞の骨格筋分化を開始した。細胞を約５～７日間培養し、位相差顕微鏡で分析した。
【0149】
実施例１によって得られたＭＰＣを、適切な培養条件下で骨格筋原系へのインビトロ分化について試験した。実施例５による処理に用いたＭＰＣの全バッチにおいて、分化の成功が認められた。筋原性分化の成功は、少なくとも１個の筋管、すなわち複数の単一核ＭＰＣの融合により形成された少なくとも３個の別々の核を有する筋肉細胞の顕微鏡観察により決定した（図３）。
【0150】
実施例３－ＡＣｈＥ酵素活性測定
実施例１に従って単離した細胞を、実施例２に従って分化条件下で５～７日間培養した後、ＡＣｈＥの発現を分析した。
実施例１に従って単離した細胞を、実施例２に従って分化条件下で５～７日間培養した後、ＡＣｈＥの発現を分析した。
【0151】
試薬調製
米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）リン酸緩衝液、ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ、ドイツ）を製造業者の指示に従って調製した。要約すると、１７ｇの粉末混合物（リン酸一カリウム２２．６６ｇ／Ｌ及び炭酸ナトリウム７．７８ｇ／Ｌ）を４００ｍＬの蒸留水に添加した。０．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した後、混合物を室温で３０分間マグネチックスターラー上で溶解した。最終体積をメスシリンダーで５００ｍＬとし、さらに希釈せずに使用した。緩衝液は使用するまで４°Ｃで保管した。エルマン試薬（５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ、０．５ｍＭ）は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに２ｍｇを秤量し、各ＡＣｈＥアッセイ用に新たに調製した。これを１ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に１～２分間ボルテックスして溶解した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を入れた１５ｍＬファルコンチューブで最終容量を１０ｍＬとし、使用まで４℃で保存した。ヨウ化アセチルチオコリン（ＡＴＩ、５．７６ｍＭ）は、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに２ｍｇを秤量し、各ＡＣｈＥアッセイ用に新たに調製した。１．２ｍＬの蒸留水に１～２分間ボルテックスして溶解し、使用まで４℃で保存した。
米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）リン酸緩衝液、ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ、ドイツ）を製造業者の指示に従って調製した。要約すると、１７ｇの粉末混合物（リン酸一カリウム２２．６６ｇ／Ｌ及び炭酸ナトリウム７．７８ｇ／Ｌ）を４００ｍＬの蒸留水に添加した。０．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した後、混合物を室温で３０分間マグネチックスターラー上で溶解した。最終体積をメスシリンダーで５００ｍＬとし、さらに希釈せずに使用した。緩衝液は使用するまで４°Ｃで保管した。エルマン試薬（５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ、０．５ｍＭ）は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに２ｍｇを秤量し、各ＡＣｈＥアッセイ用に新たに調製した。これを１ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に１～２分間ボルテックスして溶解した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を入れた１５ｍＬファルコンチューブで最終容量を１０ｍＬとし、使用まで４℃で保存した。ヨウ化アセチルチオコリン（ＡＴＩ、５．７６ｍＭ）は、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに２ｍｇを秤量し、各ＡＣｈＥアッセイ用に新たに調製した。１．２ｍＬの蒸留水に１～２分間ボルテックスして溶解し、使用まで４℃で保存した。
【0152】
ＡＣｈＥ標準酵素の調製と測定：
ＡＣｈＥ標準希釈液はリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で調製し、直ちに使用した。直ちに使用可能な５０Ｕ／ｍＬのＡＣｈＥストック（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ由来）をＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ（登録商標）Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，米国より購入した。このＡＣｈＥを、製造者の指示に従い１０００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥを調製するために希釈し、さらに１：２の比率で希釈して、４～５００ｍＵ／ｍＬの範囲で８種類の希釈液を得た。各ＡＣｈＥ標準酵素希釈液２００μＬを０．５ｍＭ ＤＴＮＢ ３００μＬ及び５．７６ｍＭ ＡＴＩ ５０μＬと混合した。さらに、０ｍＵ／ｍＬのリン酸緩衝液と上記のＤＴＮＢ及びＡＴＩを混合し、少なくとも１つのブランク反応ミックスを作製した。標準品とブランクは、暗所３０℃で６分、７分、又は８分間インキュベートした後、Ａｎｔｈｏｓ Ｚｅｎｙｔｈ ３４０ｒｔ マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）で４１２ｎｍのＯＤ測定を行った。ブランク反応のＯＤ値は、標準酵素反応のＯＤ値から差し引いた。ブランク補正したＯＤ４１２ｎｍ値と標準希釈液のＡＣｈＥ濃度（ｍＵ／ｍＬ）との相関は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで可視化した。ＡＣｈＥ濃度と補正ＯＤ値の直線式を計算した。
ＡＣｈＥ標準希釈液はリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で調製し、直ちに使用した。直ちに使用可能な５０Ｕ／ｍＬのＡＣｈＥストック（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ由来）をＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ（登録商標）Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，米国より購入した。このＡＣｈＥを、製造者の指示に従い１０００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥを調製するために希釈し、さらに１：２の比率で希釈して、４～５００ｍＵ／ｍＬの範囲で８種類の希釈液を得た。各ＡＣｈＥ標準酵素希釈液２００μＬを０．５ｍＭ ＤＴＮＢ ３００μＬ及び５．７６ｍＭ ＡＴＩ ５０μＬと混合した。さらに、０ｍＵ／ｍＬのリン酸緩衝液と上記のＤＴＮＢ及びＡＴＩを混合し、少なくとも１つのブランク反応ミックスを作製した。標準品とブランクは、暗所３０℃で６分、７分、又は８分間インキュベートした後、Ａｎｔｈｏｓ Ｚｅｎｙｔｈ ３４０ｒｔ マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）で４１２ｎｍのＯＤ測定を行った。ブランク反応のＯＤ値は、標準酵素反応のＯＤ値から差し引いた。ブランク補正したＯＤ４１２ｎｍ値と標準希釈液のＡＣｈＥ濃度（ｍＵ／ｍＬ）との相関は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで可視化した。ＡＣｈＥ濃度と補正ＯＤ値の直線式を計算した。
【0153】
細胞の測定
細胞のＡＣｈＥ活性を測定するために、実施例２に従って骨格筋分化培地で培養して得られた細胞を以下のように処理した：分化培地を２４ウェルプレートから注意深く除去し、直ちに３００μＬの０．５ｍＭ ＤＴＮＢ溶液（リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で調製）を添加した。室温、暗所で２分間インキュベートした後、５０μＬの５．７６ｍＭ ＡＴＩ（蒸留水で調製）を加えた。さらに、リン酸緩衝液とＤＴＮＢ及びＡＴＩを上記のように混合して、少なくとも１つのブランク反応ミックスを作製した。すべての反応ミックスを３０℃、暗所で６０分間インキュベートした後、Ａｎｔｈｏｓ Ｚｅｎｙｔｈ ３４０ｒｔ マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）で４１２ｎｍのＯＤ測定を行った。
細胞のＡＣｈＥ活性を測定するために、実施例２に従って骨格筋分化培地で培養して得られた細胞を以下のように処理した：分化培地を２４ウェルプレートから注意深く除去し、直ちに３００μＬの０．５ｍＭ ＤＴＮＢ溶液（リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で調製）を添加した。室温、暗所で２分間インキュベートした後、５０μＬの５．７６ｍＭ ＡＴＩ（蒸留水で調製）を加えた。さらに、リン酸緩衝液とＤＴＮＢ及びＡＴＩを上記のように混合して、少なくとも１つのブランク反応ミックスを作製した。すべての反応ミックスを３０℃、暗所で６０分間インキュベートした後、Ａｎｔｈｏｓ Ｚｅｎｙｔｈ ３４０ｒｔ マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英国）で４１２ｎｍのＯＤ測定を行った。
【0154】
ｍＵrelにおけるＡＣｈＥの計算：
細胞の６０分間の比色測定後、上記のようにして得られたＯＤ４１２ｎｍ値を、ブランク反応からのＯＤ４１２ｎｍ値の減算によって補正した。６０分後の細胞の補正されたＯＤ４１２ｎｍ値を、ＡＣｈＥ標準酵素反応（ＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加後６、７又は８分後に４１２ｎｍのＯＤを測定した上記の概説）から生成された直線式に入力し、ＡＣｈＥ標準に対する２ｘ１０5個の細胞当たりのＡＣｈＥ活性を決定した。従って、前記決定されたＡＣｈＥ活性の単位は、２ｘ１０5個の細胞の相対ＡＣｈＥ活性を意味するｍＵrelで与えられる。
細胞の６０分間の比色測定後、上記のようにして得られたＯＤ４１２ｎｍ値を、ブランク反応からのＯＤ４１２ｎｍ値の減算によって補正した。６０分後の細胞の補正されたＯＤ４１２ｎｍ値を、ＡＣｈＥ標準酵素反応（ＡＴＩ及びＤＴＮＢの添加後６、７又は８分後に４１２ｎｍのＯＤを測定した上記の概説）から生成された直線式に入力し、ＡＣｈＥ標準に対する２ｘ１０5個の細胞当たりのＡＣｈＥ活性を決定した。従って、前記決定されたＡＣｈＥ活性の単位は、２ｘ１０5個の細胞の相対ＡＣｈＥ活性を意味するｍＵrelで与えられる。
【0155】
実施例１に従って製造され、実施例５に従って治療に使用されたＭＰＣは、本実施例３に従って測定した場合、２ｘ１０5個の細胞あたり少なくとも３６、最高６８０ｍＵrelのＡＣｈＥを有することが判明した（図４）。
【0156】
実施例４－表面マーカー発現
実施例１に従って単離され、約１７０人の異なる対象に由来する細胞を、表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０の発現について試験した。表面マーカー発現を決定するために、フローサイトメトリーをＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６ＨＴ ２Ｌフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）で行った。簡潔に説明すると、実施例１によって得られた細胞を、３７℃で５分間、ＩＸトリプシンで覆うことによって採取し、４００＊ｇで遠心分離し、１％ＦＣＳを添加したＩｘ ＰＢＳに再懸濁した。４０，０００個の細胞を１９５μｌの１ｘ ＰＢＳに懸濁し、５μＬのＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ９０－ＰＥ（ベックマン・コールター社製）を加えた後、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブで２０分間、４℃、暗所でインキュベートした。次に、各反応に５μＬの生存率色素７－アミノアクチノマイシン Ｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、フランス）を加え、プレートを暗所、室温で１０分間インキュベートした。最後に、Ｇｕａｖａ ＩｎＣｙｔｅ（商標）ｖ．２．３ ソフトウェアを使用して細胞イベントを取得した。ヒストグラムとドットプロットは、サンプル流量１．８μＬ／ｍＬで最小５０００イベントで生成された。陽性染色は、少なくとも９５％陰性として設定されたアイソタイプコントロールとの比較、又はコントロール（陰性）細胞との比較によって得られた。
実施例１に従って単離され、約１７０人の異なる対象に由来する細胞を、表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０の発現について試験した。表面マーカー発現を決定するために、フローサイトメトリーをＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６ＨＴ ２Ｌフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）で行った。簡潔に説明すると、実施例１によって得られた細胞を、３７℃で５分間、ＩＸトリプシンで覆うことによって採取し、４００＊ｇで遠心分離し、１％ＦＣＳを添加したＩｘ ＰＢＳに再懸濁した。４０，０００個の細胞を１９５μｌの１ｘ ＰＢＳに懸濁し、５μＬのＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ９０－ＰＥ（ベックマン・コールター社製）を加えた後、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブで２０分間、４℃、暗所でインキュベートした。次に、各反応に５μＬの生存率色素７－アミノアクチノマイシン Ｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、フランス）を加え、プレートを暗所、室温で１０分間インキュベートした。最後に、Ｇｕａｖａ ＩｎＣｙｔｅ（商標）ｖ．２．３ ソフトウェアを使用して細胞イベントを取得した。ヒストグラムとドットプロットは、サンプル流量１．８μＬ／ｍＬで最小５０００イベントで生成された。陽性染色は、少なくとも９５％陰性として設定されたアイソタイプコントロールとの比較、又はコントロール（陰性）細胞との比較によって得られた。
【0157】
さらに、実施例１により得られた細胞の個々の無作為かつ例示的に選択されたバッチを、フローサイトメトリーによりＳｃａ－１、Ａ２Ｂ５及びＣＤ１０５の発現について試験した。そこで、フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６ＨＴ ２Ｌフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を用いて行った。簡潔に言うと、細胞をトリプシンにより３７℃で５分間採取し、４００ｒｃｆで遠心分離し、１％ＦＣＳを添加したｌｘ ＰＢＳに再懸濁した。４００００／反応濃度の細胞を、５μＬのＩｇＧｌ－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ａｌｅｘａ４８８（Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＤ１０５－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス）又はＡ２Ｂ５－Ａｌｅｘａ４８８抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に、１．５ｍＬエッペンドルフ（登録商標）チューブ中、暗所、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４００ｒｃｆで遠心分離し、９６ウェル丸底プレートでのＦＡＣＳ分析のために２００μＬの１ｘＰＢＳに再懸濁した。洗浄及び再懸濁後、各反応に生存率色素７－アミノアクチノマイシンＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、フランス）５μＬを加え、プレートを４℃で１０分間インキュベートした。細胞イベントはＧｕａｖａ ＩｎＣｙｔｅ（登録商標）ｖ２．３ ソフトウェアを使用して取得した。ヒストグラムとドットプロットは、サンプル流量１．８μＬ／ｍＬで最小３０００イベントで生成された。少なくとも９９％陰性として設定されたアイソタイプコントロールとの比較により、陽性染色が得られた。
【0158】
実施例１に従って製造され、実施例５に従って治療に使用されたＭＰＣバッチは、６４．１０％～９９．８３％の範囲でＣＤ５６陽性、８０．０５％～９９．８８％の範囲でＣＤ９０陽性、０．０４％～８．３３％の範囲でＣＤ３４陽性であることが判明した。この発現プロファイルは、約１７０人の異なる患者の生検から単離されたＭＰＣバッチについて決定された。さらに、前記ＭＰＣバッチから無作為に例示的に選択された個々のバッチは、各マーカーについてバッチあたり少なくとも６０％の細胞がＡ２Ｂ５及びＣＤ１０５を陽性に発現し、多くとも１０％の細胞がＳｃａ－１を陽性に発現するＳｃａ－１陰性であることが判明した。
【0159】
実施例１に従って分離した細胞におけるデスミン、及びＭｙｏＤ発現の細胞内検出のために、免疫細胞化学を行った。まず、細胞培養皿の上清を捨て、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。透過固定は、４％ホルムアルデヒド溶液（ｖ／ｖ；ＰＢＳで希釈）で細胞を覆い、室温で２０分間行った。その後、各インキュベーションステップの後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を５００μｌの過酸化水素ブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で覆い、室温で５分間インキュベートした。最終濃度４０μｇ ｐｒｏ ｍｌ （ｗ／ｖ）の一次抗体（デスミン又はＭｙｏＤ）を細胞にピペッティングし、少なくとも９０分間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。次に、細胞を５００μｌのビオチン標識二次抗体（ヤギ抗ウサギ、ポリクローナル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で覆い、一次抗体と同じ条件下でインキュベートしたが、少なくとも６０分間はインキュベートした。抗体結合を可視化するために、５００μｌの西洋ワサビストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を最終濃度２～５μｇ／ｍｌ（ＰＢＳで希釈）で添加し、３７℃、５％ＣＯ2、２０分間インキュベートした。結果を観察する前に、ＰＢＳで最終洗浄を行った。免疫細胞化学でデスミン陽性に染色された細胞は暗赤色で可視化される。
【0160】
上記のように実施例１に従って単離されたＭＰＣのバッチから無作為に例示的に選択された個々のバッチは、デスミン陽性であることが見出され、ここで細胞の少なくとも６０％が陽性であることが見出された。さらに、実施例１に従って単離されたＭＰＣバッチの無作為かつ例示的に選択された個々のバッチは、ＭｙｏＤ陰性であることが見出され、ここで細胞の多くとも１０％がＭｙｏＤ陽性であることが見出された。
【0161】
実施例５－ＭＰＣを用いた便失禁患者の治療
本出願人は、臨床現場で実際に遭遇する多様性を反映した患者集団において、筋原性前駆細胞を用いた治療の有効性を調査する概念実証試験として、多国籍、多施設、無作為、二重盲検、プラセボ対照、並行群間臨床第ＩＩｂ試験を実施した。患者の組み入れ基準及び除外基準を以下に示す（表１）。実施された診察と検査の概要と患者の流れを図４に示す。
本出願人は、臨床現場で実際に遭遇する多様性を反映した患者集団において、筋原性前駆細胞を用いた治療の有効性を調査する概念実証試験として、多国籍、多施設、無作為、二重盲検、プラセボ対照、並行群間臨床第ＩＩｂ試験を実施した。患者の組み入れ基準及び除外基準を以下に示す（表１）。実施された診察と検査の概要と患者の流れを図４に示す。
【0162】
表１：実施例５による臨床試験のＩＴＴ集団に含めるべき患者の包含基準及び除外基準。
【0163】
【表1-1】
【0164】
【表1-2】
【0165】
【表1-3】
【0166】
適格な患者は、３つの治療群（無作為化手順については補足的方法を参照）のいずれかに無作為化され、実施例１に従って単離された注入細胞の低用量（ＬＣＣ、５±１ｘ１０6）又は高用量（ＨＣＣ、５０±１０ｘ１０6）と４週間の電気刺激との組み合わせによる細胞治療を受けるか、又は電気刺激と組み合わせた無細胞培地の注入による対照治療を受けた。ＭＰＣの移植は、訓練を受けた医師により、麻酔をかけた患者を対象として、前述のように行われた。患者は仰臥位にされ、細胞又はプラセボが、特別に設計された注射装置を用いて、直接超音波ガイド下で注射された。各患者には、適切な細胞濃度に乳酸リンゲルで希釈した凍結細胞の一定分量が投与された。その結果、総容量６ｍｌが１２個のデポ（１２ｘ０．５ｍｌ）で注射され、各デポは外肛門括約筋（ＥＡＳ）に直接円形に配列された。縦走筋、内肛門括約筋、上皮下への細胞注射は避けた。この治療のために、すべての患者は１日入院した。実施例１に従って単離され、移植に用いられた細胞は、骨格筋分化能（実施例２）、ＡＣｈＥ酵素活性（実施例３）及び表面マーカー発現（実施例４）について分析された。試験中に生産された細胞バッチはすべて、多核筋管を形成する可能性が陽性であることが判明した（図３）。さらに、ＬＣＣとＨＣＣの両方の治療に用いられた細胞集団は、ＣＤ５６が６４．１０％～９９．８３％、ＣＤ９０が８０．０５％～８９．９９％陽性であり、ＣＤ３４が０．０４％～８．３３％陽性であることがわかった（図６）。骨盤底筋電気刺激療法は、筋肉の成長と成長に関連したシグナル伝達を刺激することが知られているため、便失禁の保存的治療のゴールドスタンダードと考えられている。試験の概要は図４のＡに示されている。本試験で治療に選択された患者（包括解析集団、ＩＴＴ）は、表２に示す基本的な集団統計学的パラメータを有していた。
【0167】
表２：臨床試験のＩＴＴ患者集団におけるデモグラフィック、ＦＩ初診からの期間、及び関連する括約筋異常
【0168】
【表2-1】
【0169】
【表2-2】
【0170】
【表2-3】
【0171】
実施例６－有効性の分析
実施例５の最初のスクリーニング診察の後、患者は、次の診察で大胸筋から筋生検サンプルを採取する前に、失禁日記を２週間記入するよう指示された。その後、４週間の電気刺激治療が開始された。さらに４週間日誌を記入した後、患者は細胞（ＬＣＣ又はＨＣＣ）又は対照（ＰＢＯ）注射を受け、翌日に移植後のコントロールを受けた。患者はさらに４週間の電気刺激治療を受け、日記をつけた。注射後３ヵ月、６ヵ月、１２ヵ月の時点で患者を調査し、４週間の日誌をつける前に対照群と面談した。日記では、便失禁が１日にどのような悪影響を及ぼすかを視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）で毎日点数化し、便失禁エピソードを記録し、「痕跡」、「少量」、「より多量」の３つのカテゴリーに分類することが求められた。さらなるパラメータは、スキームに概説されているように、応答率の評価、肛門マノメトリー、超音波測定、及びＦＩ－ＱｏＬ質問票で構成される。主要評価項目として、注射前４週間のベースライン値（ＶＯ）と比較して、注射後６ヵ月（図１ではＶ４＝治療後６ヵ月）までの４週間の失禁エピソード頻度（ＩＥＦ）の変化を評価した。副次評価項目は、４週間の日記期間の平均値から算出したＶＡＳの変化とＱＯＬである。さらに、ベースラインと比較してＩＥＦが２５％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上減少した患者の割合、肛門マノメトリー及び超音波検査データの経時的変化を評価した。さらなる探索的エンドポイントは、ベースラインから注射後１２ヵ月までのＩＥＦ及びその他のパラメータの変化、さまざまなタイプの失禁エピソード（ＩＥ）の変化、失禁のない日数であった。
実施例５の最初のスクリーニング診察の後、患者は、次の診察で大胸筋から筋生検サンプルを採取する前に、失禁日記を２週間記入するよう指示された。その後、４週間の電気刺激治療が開始された。さらに４週間日誌を記入した後、患者は細胞（ＬＣＣ又はＨＣＣ）又は対照（ＰＢＯ）注射を受け、翌日に移植後のコントロールを受けた。患者はさらに４週間の電気刺激治療を受け、日記をつけた。注射後３ヵ月、６ヵ月、１２ヵ月の時点で患者を調査し、４週間の日誌をつける前に対照群と面談した。日記では、便失禁が１日にどのような悪影響を及ぼすかを視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）で毎日点数化し、便失禁エピソードを記録し、「痕跡」、「少量」、「より多量」の３つのカテゴリーに分類することが求められた。さらなるパラメータは、スキームに概説されているように、応答率の評価、肛門マノメトリー、超音波測定、及びＦＩ－ＱｏＬ質問票で構成される。主要評価項目として、注射前４週間のベースライン値（ＶＯ）と比較して、注射後６ヵ月（図１ではＶ４＝治療後６ヵ月）までの４週間の失禁エピソード頻度（ＩＥＦ）の変化を評価した。副次評価項目は、４週間の日記期間の平均値から算出したＶＡＳの変化とＱＯＬである。さらに、ベースラインと比較してＩＥＦが２５％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上減少した患者の割合、肛門マノメトリー及び超音波検査データの経時的変化を評価した。さらなる探索的エンドポイントは、ベースラインから注射後１２ヵ月までのＩＥＦ及びその他のパラメータの変化、さまざまなタイプの失禁エピソード（ＩＥ）の変化、失禁のない日数であった。
【0172】
肛門内視鏡検査、超音波検査、肛門内圧測定は、参加した各施設で設定された基準に従って行われた。評価項目は、肛門管の長さ、安静時圧、最大絞り圧などであった。バルーン排出試験により、最初の感覚に達するまでの充填量、排便欲求量、排便切迫量、最大耐容量が測定された。
【0173】
試験期間中、有害事象（ＡＥ）及び重篤なＡＥの発生が記録され、健康診断、血液学、血液化学、尿検査の標準検査が実施され、併用薬が登録された。本試験は、独立したデータ安全性モニタリング委員会によって監督された。この評価により、合計２５２例の患者が１：１：１の割合で３つの治療群に無作為に割り付けられた。主要エンドポイント解析には、ｐ値＜０．０２５を有意とみなして片側ウイルコクソン順位和検定を適用した。連続変数の副次評価項目は、ｐ値＜０．０５を有意とみなして対応のないｔ検定（比較した試験群が正規分布している場合）又はウイルコクソン順位和検定（比較した試験群が正規分布していない場合）により試験群間で比較した。非連続変数はカイ２乗検定又はフィッシャー検定により試験群間で比較した。
【0174】
異なるタイプの失禁エピソードに対するＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ治療の５回目の来院時（治療後１２ヵ月）の５０％レスポンダー率という観点から治療効果を分析した結果、レスポンダー率は一貫して「痕跡」に分類されるエピソードで最も低いことが明らかになった（表３）。したがって、ＩＥＦの変化とレスポンダー率のさらなる分析のために、すべてのエピソードタイプを数える場合と、「少量」と「より多量」のエピソードタイプのみを数える場合の計算が行われた。
【0175】
表３：治療群（ＬＣＣ、ＨＣＣ、ＰＢＯ）及びエピソードのタイプ（痕跡、少量、より多量）別に、ベースラインから治療後１２ヵ月までに週１回の失禁エピソードが少なくとも５０％減少した患者の割合。
【0176】
【表3】
【0177】
ＩＴＴ患者集団における治療群間のＩＥＦの変化を分析した結果、すべてのエピソードタイプをカウントした場合、又はトレースを除外した場合にかかわらず、すべての治療群で移植後の来院期間にわたって一貫した減少が認められた（図１Ａ、図ＩＢ、表４、表５）。ＩＥＦの低下は、ＨＣＣ群で治療後のすべての診察で最も高く、次いでＬＣＣ群、最後にＰＢＯ群であった。ＩＴＴセットにおいて、ＨＣＣ対ＰＢＯ及びＬＣＣ対ＰＢＯの間で、αレベル０．０５の２側ウイルコクソン マンーホイットニー検定を実施したところ、ベースラインから移植後の来院時までのＩＥＦの変化は、痕跡を含めると治療後６ヵ月で（ｐ＝０．０３５）、痕跡を除くと１２ヵ月で（ｐ＝０．０３４）、ＰＢＯと比較してＨＣＣで有意に増加することが判明し（図１Ａ及びＢ）、ＭＰＣの高細胞数移植がプラセボ治療よりも優れていることが示唆された。
【0178】
表４：ＩＴＴ患者集団における治療群別、実施例５の試験期間中のベースライン（ＶＯ）からの週間ＩＥＦ（痕跡を含む）の絶対変化量。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数。ＳＤ、標準偏差。Ｎ、患者数。
【0179】
【表4】
【0180】
表５：ＩＴＴ患者集団における治療群別、実施例５の試験期間中のベースライン（ＶＯ）からの週間ＩＥＦ（痕跡を除く）の絶対変化量。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数。ＳＤ、標準偏差。Ｎ、患者数。
【0181】
【表5】
【0182】
レスポンダー率
他の研究者（Ｒａｏ，２０１６）と一致するように、われわれはＩＥＦが５０％以上減少することを臨床的に意義のある改善とみなし、この程度の減少を示す患者をレスポンダーと分類し、減少がより小さい非レスポンダーとは区別した。したがって、注射後１ヵ月及び３ヵ月のデータを含め、各治療群におけるレスポンダーの割合に関するデータを評価し、上記のサブグループを再検討した。我々は、定義されたすべての群及び小集団において、レスポンダーの割合が６ヵ月の追跡調査まで継続的に増加し、すべての症例で細胞群が対照群を上回り、ほとんどの症例でＨＣＣがＬＣＣを上回ったことを検出した（ＩＴＴ患者集団における治療群別の、実施例５によるベースラインから治療後の来院まで、１週間当たりのＩＥＦ（痕跡を含む）が少なくとも５０％減少した患者の割合）。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数（表６）。６ヵ月から１２ヵ月の間に、対照群とＬＣＣ群ではレスポンダー率は横ばいか低下したが、ＨＣＣ群では痕跡を含めると５０％以上（表６）、痕跡を除くと６０％以上（表７）まで増加し続けた。ＩＴＴ患者におけるＬＣＣ又はＨＣＣとＰＢＯ治療との間の５０％レスポンダー率について、有意差をｐ＝０．０５としてフィッシャーの正確検定を行ったところ、解析から痕跡を除いた場合、治療後１ヵ月（ｐ＝０．０３７）及び１２ヵ月（ｐ＝０．００６）において、ＰＢＯ治療よりもＨＣＣ治療の優位性が認められた（図１Ｄ、表７）。このことは、筋原性前駆細胞の高細胞数適用が、失禁に対する効果的かつ臨床的に適切な治療法であることを示唆している。
他の研究者（Ｒａｏ，２０１６）と一致するように、われわれはＩＥＦが５０％以上減少することを臨床的に意義のある改善とみなし、この程度の減少を示す患者をレスポンダーと分類し、減少がより小さい非レスポンダーとは区別した。したがって、注射後１ヵ月及び３ヵ月のデータを含め、各治療群におけるレスポンダーの割合に関するデータを評価し、上記のサブグループを再検討した。我々は、定義されたすべての群及び小集団において、レスポンダーの割合が６ヵ月の追跡調査まで継続的に増加し、すべての症例で細胞群が対照群を上回り、ほとんどの症例でＨＣＣがＬＣＣを上回ったことを検出した（ＩＴＴ患者集団における治療群別の、実施例５によるベースラインから治療後の来院まで、１週間当たりのＩＥＦ（痕跡を含む）が少なくとも５０％減少した患者の割合）。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数（表６）。６ヵ月から１２ヵ月の間に、対照群とＬＣＣ群ではレスポンダー率は横ばいか低下したが、ＨＣＣ群では痕跡を含めると５０％以上（表６）、痕跡を除くと６０％以上（表７）まで増加し続けた。ＩＴＴ患者におけるＬＣＣ又はＨＣＣとＰＢＯ治療との間の５０％レスポンダー率について、有意差をｐ＝０．０５としてフィッシャーの正確検定を行ったところ、解析から痕跡を除いた場合、治療後１ヵ月（ｐ＝０．０３７）及び１２ヵ月（ｐ＝０．００６）において、ＰＢＯ治療よりもＨＣＣ治療の優位性が認められた（図１Ｄ、表７）。このことは、筋原性前駆細胞の高細胞数適用が、失禁に対する効果的かつ臨床的に適切な治療法であることを示唆している。
【0183】
表６：ＩＴＴ患者集団の治療群別で、実施例５に従ってベースラインから治療後の来院まで、毎週のＩＥＦ（痕跡を含む）が少なくとも５０％減少した患者の割合。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数。
【0184】
【表6】
【0185】
表７：ＩＴＴ患者集団の治療群別で、実施例５に従ってベースラインから治療後の来院まで、１週間当たりのＩＥＦ（痕跡を除く）が少なくとも５０％減少した患者の割合。ＰＢＯ、プラセボ。ＬＣＣ、低細胞数。ＨＣＣ、高細胞数。
【0186】
【表7】
【0187】
実施例７－患者の特徴と治療結果との関係
実施例５で概説した臨床試験では、２８８人の患者がスクリーニングされ、２５１人が無作為に割り付けられ、そのうち２４４人が試験薬を投与された。女性２１８人、男性１９人が少なくとも６ヵ月の追跡調査まで試験を完了した（９６％）（図４）。参加者の年齢中央値は６３歳（四分位範囲、ＩＱＲ、５３．８～７０）で、ＦＩに罹患していた期間は中央値で５．３年（ＩＱＲ、２．７～９．９）であった。主要評価項目の解析に利用可能なＩＴＴ患者のベースライン人口統計学的及び臨床的特徴を表２に要約した。
実施例５で概説した臨床試験では、２８８人の患者がスクリーニングされ、２５１人が無作為に割り付けられ、そのうち２４４人が試験薬を投与された。女性２１８人、男性１９人が少なくとも６ヵ月の追跡調査まで試験を完了した（９６％）（図４）。参加者の年齢中央値は６３歳（四分位範囲、ＩＱＲ、５３．８～７０）で、ＦＩに罹患していた期間は中央値で５．３年（ＩＱＲ、２．７～９．９）であった。主要評価項目の解析に利用可能なＩＴＴ患者のベースライン人口統計学的及び臨床的特徴を表２に要約した。
【0188】
サブグループ特異的影響
プラセボよりも細胞治療に特異的に反応する患者グループを確立するために、探索的な事後解析を行った。この目的のために、次のような仮説駆動型のアプローチを適用した。注射された細胞がＥＡＳの機能を回復させるためには、既存の筋組織に注射されるか、その近くに注射されることが有効であるという仮説を立てた。これは、移植後のＭＰＣの遊走能が限られているためと考えられる。従って、損傷したＥＡＳの瘢痕形成が持続するため、あるいは時間依存性のサルコペニアのため、筋組織が希薄な患者では筋再生が損なわれている可能性がある。どちらの状態も試験前のＦＩ期間と相関する。１０年未満のＦＩに罹患している患者（ＩＴＴセットの７３％；対象集団１、ＴＰＰ１）のみを対象として治療効果を再分析したところ、ＬＣＣ群とＨＣＣ群におけるＩＥＦの低下は、最終的に対照群におけるＩＥＦの低下を有意に上回り、その結果、ＩＴＴセットにおけるそれぞれの変化と比較して、ベースラインから１２ヵ月後までのＩＥＦの変化は、痕跡を除外した場合、はるかに高いものとなった（図２Ｂ）。レスポンダー率とＴＰＰ１患者サブグループ内では、痕跡を除外した場合、治療後１２カ月でＰＢＯよりもＨＣＣで有意に高い５０％レスポンダー率が認められた（図２Ｂ）。
プラセボよりも細胞治療に特異的に反応する患者グループを確立するために、探索的な事後解析を行った。この目的のために、次のような仮説駆動型のアプローチを適用した。注射された細胞がＥＡＳの機能を回復させるためには、既存の筋組織に注射されるか、その近くに注射されることが有効であるという仮説を立てた。これは、移植後のＭＰＣの遊走能が限られているためと考えられる。従って、損傷したＥＡＳの瘢痕形成が持続するため、あるいは時間依存性のサルコペニアのため、筋組織が希薄な患者では筋再生が損なわれている可能性がある。どちらの状態も試験前のＦＩ期間と相関する。１０年未満のＦＩに罹患している患者（ＩＴＴセットの７３％；対象集団１、ＴＰＰ１）のみを対象として治療効果を再分析したところ、ＬＣＣ群とＨＣＣ群におけるＩＥＦの低下は、最終的に対照群におけるＩＥＦの低下を有意に上回り、その結果、ＩＴＴセットにおけるそれぞれの変化と比較して、ベースラインから１２ヵ月後までのＩＥＦの変化は、痕跡を除外した場合、はるかに高いものとなった（図２Ｂ）。レスポンダー率とＴＰＰ１患者サブグループ内では、痕跡を除外した場合、治療後１２カ月でＰＢＯよりもＨＣＣで有意に高い５０％レスポンダー率が認められた（図２Ｂ）。
【0189】
細胞治療の明らかな影響を減少させるもう一つの要因は、対照群でもＩＥＦが低下したことである。したがって、細胞注入の効果を明確に捉えるためには、ベースラインのＩＥＦが高い方が、治療後のＩＥＦの減少が大きく、ＰＢＯ群と細胞群（ＬＣＣ、ＨＣＣ）の間に明確な差が見られるという仮説を立てた。この仮説は、ベースラインＩＥＦ（痕跡を含む）に応じてＩＴＴセット患者をサブグループ分けし、治療群とサブグループ間でベースラインから６ヵ月後までのＩＥＦの変化を比較することによって検証した。その結果、ベースラインＩＥＦが低い患者をその後除外すると、すべての群でＩＥＦの変化が増加することがわかった。しかし、ＰＢＯ群と細胞群との間の差は、ベースラインＩＥＦが高くなるにつれてますます顕著に現れた（図７、表８）。このことは、ベースラインＩＥＦが高い患者は、ベースラインＩＥＦが低い患者に比べ、ＭＰＣに基づく治療からより多くの利益を得ることを示唆している。ベースラインＩＥＦが６を超えると、治療群間の差が急速に拡大したため、ＴＰＰ１とこの特徴を組み合わせてＴＰＰ２（ＦＩ初診から１０年未満、ベースラインＩＥＦが６を超える）とした。これらの患者のみを対象に治療効果を再分析すると、ＬＣＣ群とＨＣＣ群のＩＥＦの低下は対照群のそれを有意に上回り、その結果、ＩＴＴ群とＴＰＰ１群のそれぞれの変化と比較すると、ベースラインから１２ヵ月後までのＩＥＦの変化ははるかに大きかった（図２Ａ）。ＴＰＰ２患者サブグループのレスポンダー率に関しては、治療後１２カ月でＰＢＯよりもＨＣＣで有意に高い５０％のレスポンダー率が認められ、最終的にＩＴＴ患者のＨＣＣグループと比較してＴＰＰ２のＨＣＣグループでレスポンダー率が高くなった（図２Ｃ）。このことは、ＴＰＰ２症例がＩＴＴ症例と比較してＭＰＣベースの治療により反応性が高いことを示唆している。
【0190】
痕跡として分類される失禁エピソードは、実施例５による治療に対して最も反応性が低く、ベースラインＩＥＦが高い患者はＭＰＣに基づく治療に対してより良好に反応することが上記で実証されたので、「痕跡」として分類されない可能性のあるベースラインＩＥＦを２を超えるＴＰＰ１患者を分析した。この患者集団をＴＰＰ３と呼んだ。ＴＰＰ３の患者のみを対象に治療効果を再分析したところ、ＬＣＣ群とＨＣＣ群におけるＩＥＦの低下は、痕跡をカウントしなかった対照群のそれを有意に上回り（図２Ｂ）、最終的に、ＩＴＴ、ＴＰＰ１、ＴＰＰ２のそれぞれの変化と比較すると、ベースラインから１２ヵ月までのＩＥＦの変化がはるかに大きくなった（図２Ａ及び図２Ｂ）。ＴＰＰ３患者サブグループの奏効率に関しては、痕跡を含めると、治療後１２ヵ月の時点でＰＢＯよりもＨＣＣで有意に高い５０％の奏効率が認められた。痕跡を解析に含めなかった場合、ＨＣＣとＬＣＣの両方で、ＰＢＯと比較して有意に高いレスポンダー率が認められた。最終的に、ＨＣＣ治療患者のＴＰＰ３レスポンダー率は、痕跡をエピソードとしてカウントするかどうかにかかわらず、他のすべての患者群と比較して最も高かった（図２Ｃ、図２Ｄ）（表１１、表１２）。このことは、ＴＰＰ３患者が、ＩＴＴ、ＴＰＰ１、ＴＰＰ２患者と比較して、ＭＰＣに基づく治療に最も反応することを示唆している。その逆に、ＴＰＰ３のサブグループ分けによって除外された患者（すなわち、１０年を超えるＦＩ期間を持つ「ＮＲ１」、又はベースライン時のＩＥＦが２未満（痕跡を除く）の「ＮＲ２」）は、ＴＰＰ１、ＴＰＰ２、ＴＰＰ３の患者よりもＩＥＦの変化と反応率が低かった。患者群の選択は、ＬＣＣ又はＨＣＣによる細胞治療がＩＥＦ低下と奏効率にどのような影響を及ぼすかだけでなく、プラセボ（ＰＢＯ）治療がどのような影響を及ぼすかにも影響を及ぼす可能性がある。そこでさらに、ＩＥＦ変化率とレスポンダー率について、それぞれ効果量とオッズ比を算出した。詳細には、表１３に従って、患者サブグループのＬＣＣ又はＨＣＣとＰＢＯ治療の比較を行い、コーヘンのｄと奇数比を算出した。痕跡をエピソードとしてカウントするかどうかに関係なく、ＴＰＰ３患者は、効果量及び奇数比の点で、ＬＣＣ又はＨＣＣ治療（それぞれＰＢＯ治療と比較）による治療効果が最も高かった（図８）。
【0191】
さらに、治療前の便失禁に関連する外肛門括約筋の損傷（ＴＰＰ３＿損傷）を有するＴＰＰ３患者と比較した、すべてのＴＰＰ３患者におけるベースラインから治療後１２ヶ月までのＩＥＦ変化とレスポンダー率、それに関連する効果量とオッズ比を分析した（表９、表１０、表１１、表１２）。これらの患者群を比較すると、筋損傷によるＦＩに罹患しているＴＰＰ３患者では、ＦＩの原因が特定されていないＴＰＰ３患者と比較して、ＨＣＣ治療後のＩＥＦ低下がより高いことがわかった（図９ Ａ及びＢ）。この効果は、痕跡をＦＩとしてカウントするかどうかとは無関係に認められた。また、ＴＰＰ３＿損傷集団では、ＨＣＣ治療後のＩＥＦ減少は、ＰＢＯ治療と比較して有意に高かった。同様に、ＴＰＰ３＿損傷集団では、痕跡を数える、数えないにかかわらず、５０％レスポンダー率が高いことがわかった（図９ Ｃ及びＤ）。ＴＰＰ３＿損傷患者において、ＰＢＯ治療よりもＨＣＣ治療の方が有意に高いレスポンダー率が認められたが、その痕跡を解析から除外すると、最終的にＨＣＣ治療患者のレスポンダー率は８７．５％となり、全期間最高となった（表１２）。ＴＰＰ３＿損傷患者において、ＰＢＯ治療と比較したＬＣＣ又はＨＣＣによるＩＥＦ変化及びレスポンダー率の効果量及びオッズ比を解析したところ、ＴＰＰ３＿損傷患者集団では、痕跡を失禁エピソードとみなすかどうかに関係なく、ＴＰＰ３患者集団よりもＨＣＣ治療の方が高い効果量を示した（図１０ Ａ、Ｂ）。５０％レスポンダー率のオッズ比もまた、ＬＣＣとＨＣＣ治療の両方において、ＴＰＰ３患者集団と比較してＴＰＰ３＿損傷患者集団で高いことが、それぞれ痕跡のカウントや除外とは無関係に見出された（図１０ Ｃ、Ｄ）。これらの結果は、治療前にＥＡＳ損傷に苦しんでいた患者が、ＦＩに関連する状態（例えば、ＥＡＳ萎縮、骨盤底機能障害など）の複数の可能性を有するより広範な患者集団と比較して、異なる数のＭＰＣで治療した場合に、失禁エピソードのより高い減少及び反応に対するより高い変化を経験していることを示唆している。
【0192】
表８：治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）間でベースラインのＩＥＦに従ってさらにグループ分けしたＩＴＴセットにおけるベースラインから治療後６ヵ月までのＩＥＦの変化。平均値、標準偏差「ＳＤ」、患者数「Ｎ」を示す。
【0193】
【表8】
【0194】
表９：ベースラインから治療後１２ヵ月までのＩＥＦ（痕跡を含む）治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）、及び平均値、標準偏差（ＳＤ）及び患者数（Ｎ）で示した患者集団の変化。
【0195】
【表9】
【0196】
表１０：治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）によるベースラインから治療後１２ヵ月までのＩＥＦ（痕跡を除く）、及び平均値、標準偏差（ＳＤ）及び患者数（Ｎ）で示した患者集団の変化。
【0197】
【表10】
【0198】
表１１：治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）及び患者集団別に、ベースラインから治療後１２ヵ月までにＩＥＦ（痕跡を含む）が少なくとも５０％減少した患者の割合。
【0199】
【表11】
【0200】
表１２：治療群（ＰＢＯ、ＬＣＣ、ＨＣＣ）及び患者集団別に、ベースラインから治療後１２ヵ月までにＩＥＦ（痕跡を除く）が少なくとも５０％減少した患者の割合。
【表12】
【0201】
表１３：患者数（Ｎ）、便失禁の重症度、便失禁の診断からの時間、及びＦＬに関連する状態による、実施例７に従って分析した患者集団の概要
Ｍ．Ｄ．＝筋損傷、Ｐ．Ｆ．Ｄ．＝骨盤底機能障害、Ｎ．Ｄ．＝神経損傷、ＬＯＳＣ＝貯蔵能力の喪失、ＡＴ＝萎縮。
Ｍ．Ｄ．＝筋損傷、Ｐ．Ｆ．Ｄ．＝骨盤底機能障害、Ｎ．Ｄ．＝神経損傷、ＬＯＳＣ＝貯蔵能力の喪失、ＡＴ＝萎縮。
【0202】
【表13】
【0203】
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】