特表 2024-529069 デグロン含有組換えウイルスおよびその調製方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】デグロン含有組換えウイルスおよびその調製方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240725BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240725BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20240725BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 39/385 20060101ALI20240725BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240725BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20240725BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20240725BHJP

   C07K 14/005 20060101ALN20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/33

C12N15/113 130Z

C12N15/09 Z

C12N15/63 Z

A61P31/12

A61P37/04

A61K47/62

A61K39/12

A61K39/145

A61K39/39

A61K39/385

C07K19/00

C07K7/06

C07K7/08

C07K14/005

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024507170

(86)(22)【出願日】2022-08-04

(85)【翻訳文提出日】2024-02-06

(86)【国際出願番号】 CN2022110258

(87)【国際公開番号】W WO2023016336

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】202110923852.8

(32)【優先日】2021-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519002014

【氏名又は名称】中国科学院深▲チェン▼先進技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】１０６８， Ｘｕｅｙｕａｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｗｎ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０５５， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】司 龍龍

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA51

4C085BA55

4C085BB11

4C085CC03

4C085CC05

4C085CC08

4C085CC21

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF24

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA41

4H045CA01

4H045EA31

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】デグロン含有組換えウイルスおよびその調製方法と使用であって、前記デグロン含有組換えウイルスは、少なくとも１種のウイルスタンパク質には、宿主細胞のタンパク質分解系により識別可能なデグロンが少なくとも１つ含まれる。そのうち、前記デグロンは、アミノ酸配列、ポリペプチドまたは構造モチーフのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。本願はさらに、核酸分子、組換えベクター、前記デグロン含有組換えウイルスの調製方法、デグロン含有組換えウイルスの調製システム、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、および医薬品を提供する。
【手段】本願に係るデグロン含有組換えウイルスは、宿主細胞におけるタンパク質分解系により識別されて分解されることができ、複製能が弱め、ひいてはなくなり、該当するワクチン、腫瘍溶解性ウイルスまたは医薬品として調製された後、効果が良好であり、実際的な適用価値がある。

【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種のウイルスタンパク質には、宿主細胞のタンパク質分解系により識別可能なデグロンが少なくとも１つ含まれる、デグロン含有組換えウイルスであって、
前記デグロンは、アミノ酸配列、ポリペプチドまたは構造モチーフのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、デグロン含有組換えウイルス。

【請求項2】

前記タンパク質分解系は、ユビキチン－プロテアソーム系、リソソーム系、オルガネラ加水分解系、細胞膜表面加水分解系またはＣａｓｐａｓｅプロテアーゼ系のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、請求項１に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項3】

前記デグロンの位置は、ウイルスタンパク質のＣ末端、Ｎ末端または中間コード領域のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せにある、請求項１または２に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項4】

前記デグロンは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１１０で表されるアミノ酸配列のうちのいずれか１種を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項5】

前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、新型コロナウイルス、手足口ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、巨大細胞ウイルス、水痘－帯状ヘルペスウイルス、水胞性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、デングウイルス、えぼらウイルス、マールブルグウイルス、ジカウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタウイルス、新型腸管ウイルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄病ウイルス、微小ウイルス、プリオン、天然痘ウイルス、タバコモザイクウイルス、ファージ、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、ノロウイルス、ヒトボカウイルスまたはコロナウイルスのうちのいずれか１種を含み、インフルエンザウイルス、エイズウイルスまたは新型コロナウイルスのうちのいずれか１種であることが好ましい、請求項１～４のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードする、核酸分子。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸分子を含む組換えベクターであって、
好ましくは、前記組換えベクターが、請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを発現する、組換えベクター。

【請求項8】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法であって、
タンパク質分解系欠損の細胞系を構築することと、
ウイルスタンパク質のコード遺伝子に、デグロンをコードするヌクレオチド配列を導入することと、
請求項７に記載の組換えベクターを構築し、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得ることと、を含み、
好ましくは、前記タンパク質分解系欠損には、Ｅ３リガーゼノックアウトまたはノックダウン、プロテアソームノックアウトまたはノックダウンのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むユビキチン－プロテアソーム系欠損が含まれ、
好ましくは、前記細胞系には、ＣＨＯ細胞系、Ｖｅｒｏ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、Ａ５４９細胞系、ＢＨＫ細胞系、ＢＨＫ－２１／ＢＲＳ細胞系、Ｓｐ２／０細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、２９３Ｆ細胞系、ＨｅＬａ細胞系、ＴＺＭ－ｂｌ細胞系、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞系、ＭＲＣ－５細胞系、ＶＭＫ細胞系、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞系、ＨＣＴ－８細胞系、Ｈｕｈ－７細胞系またはＣａｃｏ２細胞系のうちのいずれか１種を含む哺乳動物細胞系が含まれ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系またはＡ５４９細胞系のうちのいずれか１種であることが好ましく、
好ましくは、前記デグロン含有組換えウイルスは、調製過程においてタンパク質分解系阻害剤が添加され、
好ましくは、前記タンパク質分解系阻害剤には、ＭＧ１３２、ＭＧ－３４１またはラクタシスチンのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むプロテアソーム阻害剤が含まれる、調製方法。

【請求項9】

前記調製方法はさらに、前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出するステップを含み、
好ましくは、前記調製方法はさらに、大規模に生産するステップを含み、
好ましくは、前記調製方法は、
タンパク質分解系欠損の哺乳動物細胞系を構築するステップ（１）であって、
遺伝子編集技術により、細胞系におけるタンパク質分解系のキー要素をノックアウトするステップ（１）と、
デグロンを導入したウイルスタンパク質、および前記デグロンの種類、数、および導入サイトを確定し、ウイルスタンパク質のコード遺伝子にデグロンをコードするヌクレオチド配列を導入して、組換えウイルス配列を得るステップ（２）と、
組換えベクターを構築するステップ（３）であって、
ステップ（２）における組換えウイルス配列とプラスミドを連結させて、前記組換えベクターを得るステップ（３）と、
組換えベクターを前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得るステップ（４）であって、
逆遺伝学技術により、ステップ（３）における組換えベクターとウイルスレスキュープラスミドを、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に共トランスフェクトし、タンパク質分解系阻害剤を添加し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得るステップ（４）と、
前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出し、大規模に生産するステップと、を含む、請求項８に記載の調製方法。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製システムであって、
タンパク質分解系欠損の細胞系、組換えベクターおよびウイルスレスキュープラスミドを含む、調製システム。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルス、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載の組換えベクター、請求項８または９に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法または請求項１０に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製システムのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せの、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または医薬品の製造における使用。

【請求項12】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含むワクチンであって、
好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能のない生ワクチン、複製制御可能生ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスワクチンのうちのいずれか１種を含み、
好ましくは、前記ワクチンはさらに、アジュバントおよび補助材料を含む、ワクチン。

【請求項13】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む、腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項14】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む医薬品であって、
好ましくは、前記医薬品はさらに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、医薬品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物技術分野に属し、特に、デグロン含有組換えウイルスおよびその調製方法と使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ウイルス感染は、人間の健康、および社会経済の発展に対して深刻に危害をもたらしている。ワクチンとは、ウイルス感染を予防するための最も効果的な手段の１つである。現在、ウイルスワクチンの種類には、主に、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンおよびウイルス様粒子などが含まれている。

【0003】

過去数十年間、ウイルスワクチン技術は、大きく進歩しているが、依然として、例えば、ウイルスの不活化処理に起因して抗原の天然構造が破壊されてウイルスワクチンの免疫原性が低下し、または、ウイルスの弱毒化の不十分に起因してウイルスワクチンの複製活性が残留してワクチンが安全リスクを持ち、または、ウイルスワクチンの調製技術が複雑であることに起因して他のウイルスワクチンにおいて普及できなかった、という一定の限界がある。そのため、従来のウイルスワクチンの設計構想を突破し、安全で高効率であり、シンプルで汎用な新規なワクチン技術を開発することは、将来の理想的なウイルスワクチンの重要な発展方向であり、重要な科学的価値および臨床価値がある。

【0004】

より安全で、適用性が広く、免疫原性が強いウイルスワクチンの調製方法を如何に提供するかは、早急に解決すべき問題となっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願は、デグロン含有組換えウイルスおよびその調製方法と使用を提供する。ウイルスの少なくとも１つのタンパク質コード遺伝子に少なくとも１つのデグロンを挿入することにより調製された組換えウイルスは、宿主細胞におけるタンパク質分解系により識別され、ウイルスタンパク質が分解されることができ、ウイルスの複製能が弱め、ひいては複製能が完全になくなり、調製されたワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスは、より安全であり、適用見込みが広い。

【課題を解決するための手段】

【0006】

第１の態様として、本願は、少なくとも１種のウイルスタンパク質には、宿主細胞におけるタンパク質分解系により識別可能なデグロンが少なくとも１つ含まれるデグロン含有組換えウイルスであって、
前記デグロンは、アミノ酸配列、ポリペプチドまたは構造モチーフのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むデグロン含有組換えウイルスを提供する。

【0007】

本願において、ウイルスの少なくとも１つのタンパク質に少なくとも１つのデグロンを挿入することにより、該デグロンは、ウイルスゲノムの複製につれて複製されることができるとともに、ウイルスタンパク質の翻訳につれてウイルスタンパク質に融合発現されることができ、それによって、デグロンにより部位特異的修飾された組換えウイルスを得る。それと同時に、宿主細胞におけるタンパク質分解系を利用して、ウイルスタンパク質の宿主細胞における安定的な分解を実現し、ウイルスの宿主における複製などの生命活動を人為的に制御し、複製制御可能なウイルスワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスの調製に用いられ、極めて高い適用価値を有する。

【0008】

本願において、デグロン（Ｄｅｇｒｏｎｓ）とは、タンパク質分解系により特異的識別可能となり、さらにマトリックスタンパク質の分解を媒介する各種の分子、例えば、特異的なアミノ酸配列、ポリペプチド、構造モチーフまたは他の分子を指す。デグロンは、通常、短い線形モチーフ（ｍｏｔｉｆ）であり、特異的な配列モデルを有し、相互作用が非常に重要なアミノ酸残基に対して強い進化的な保存性を示す。

【0009】

好ましくは、前記タンパク質分解系には、ユビキチン－プロテアソーム系、リソソーム系、オルガネラ加水分解系、細胞膜表面加水分解系またはＣａｓｐａｓｅプロテアーゼ系のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せが含まれる。

【0010】

本願において、ウイルスタンパク質の機能の正常な実行は、ウイルスの宿主細胞における複製などのすべての生命活動の前提条件である。宿主細胞において複数種の天然なタンパク質分解系が存在し、細胞内にタンパク質の安定状態を維持して正常な細胞機能を維持することに対して極めて重要である。タンパク質分解系は、マトリックスタンパク質におけるデグロンを特異的に識別することができる。デグロンの一つの重要な特徴は、移動可能であり、遺伝子工学によってそれらのデグロンを連結した後、生命周期が長いタンパク質が不安定になる。それらのタンパク質分解系、および対応するデグロンは、調節制御可能なウイルスタンパク質の宿主細胞における安定化及び分解する「生命スイッチ」を設計するために生物学基礎を提供する。

【0011】

好ましくは、前記デグロンの位置は、ウイルスタンパク質のＣ末端、Ｎ末端または中間コード領域のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せにある。

【0012】

本願において、動物や人体などのタンパク質分解系は、複数種のデグロンを識別することができるため、ウイルスタンパク質のＮ末端、Ｃ末端または他のいずれかのサイトに、異なる種類、異なる数のデグロンを導入することができる。それらの種類や数が異なるデグロンは、任意に組み合わせて、複製効率が異なり、弱毒化程度が異なるウイルスワクチンの調製のために保障を提供することができる。それは、ウイルスワクチンの生産効率および免疫原性に対して極めて重要である。

【0013】

好ましくは、前記デグロンは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１１０で表されるアミノ酸配列のうちのいずれか１種を含む。

【0014】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：ＡＬＡＰＹＩＰ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：ＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：ＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５：ＤＳＧＸＸＳ（そのうち、Ｘは、いずれかのアミノ酸を示す）、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６：ＤＲＨＤＳＧＸＸＳＭ（そのうち、Ｘは、いずれかのアミノ酸を示す）、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７：ＬＧＳＷＲＨＷＲＧＱＥＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８：ＳＬＹＫＫＶＶＧＴＭＡＡＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９：ＭＬＳＥＳＲＮＦＰＡＱＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０：ＥＲＡＰＴＧＲＷＧＲＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１：ＫＫＶＧＲＡＲＰＣＱＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２：ＡＰＲＡＰＲＱＲＳＲＤＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３：ＳＷＲＬＴＧＳＧＭＫＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４：ＷＲＰＧＲＲＧＰＳＳＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５：ＬＲＧＰＳＰＰＰＭＡＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６：ＷＲＰＧＲＲＧＰＳＳＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７：ＭＡＬＡＶＲＶＶＹＣＧＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８：ＫＫＮＶＥＡＩＧＬＬＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９：ＰＰＧＰＰＬＳＳＰＲＰＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０：ＴＭＮＮＥＥＤＬＬＲＳＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１：ＴＭＥＰＰＧＧＲＱＫＫＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２：ＱＥＲＧＰＴＷＤＫＮＬＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３：ＧＴＭＡＶＬＲＱＲＰＧＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４：ＬＣＴＲＳＷＤＶＴＰＮＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５：ＡＮＱＰＡＱＣＲＫＴＲＩ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６：ＥＥＡＲＬＫＹＤＫＳＲＩ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７：ＬＮＤＧＰＫＰＧＱＳＲＦ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８：ＴＳＬＹＫＫＶＧＭＧＲＫ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９：ＹＫＫＶＧＴＭＲＧＲＧＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０：ＶＧＴＭＡＡＧＲＡＰＧＫ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１：ＫＫＶＧＴＭＲＧＶＧＹＰ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２：ＥＧＰＬＷＨＰＲＩＣＧＳ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３：ＥＭＡＬＳＰＰＲＳＷＧＱ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４：ＲＳＧＬＲＲＲＲＨＲＧＥ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５：ＶＳＧＩＭＲＲＰＷＧＭＮ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６：ＫＲＶＬＩＲＶＴＹＣＧＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７：ＭＡＬＡＶＲＶＶＹＣＧＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８：ＰＳＳＰＶＱＴＴＰＬＳＱＡＶＡＴＰＳＲＳＳＡＡＡＡＡＡＬＤＬＳＧＲＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９：ＨＨＧＫＧＦＦＧＳＧＨＹＴＡＹＣＹＮＴＥＧＧＡＣＡＬＬＣＧＶＧＤＴＥＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０：ＶＡＥＩＴＫＱＬＰＰＶＶＰＶＳＫＰＧＡＬＲＲＳＬＳＲＳＭＳＱＥＡＱＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１：ＫＫＲＰＰＰＧＬＤＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２：ＳＶＮＳＬＬＫＥＬＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３：ＨＥＷＶＬＲＥＧＥＥ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４：ＥＹＬＬＫＭＡＴＥＥ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５：ＥＬＣＫＳＹＲＲＬＱ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６：ＶＡＬＫＦＫＰＲＫＨ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４７：ＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４８：ＲＨＣＧＲＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９：ＲＳＨＧＴＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０：ＲＦＲＧＬＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５１：ＲＮＬＧＩＲ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５２：ＲＧＲＬＴＲＮＫＧＰ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３：ＳＬＦＲＫＲＮＫＧＫ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５４：ＲＴＡＡＳＧＲＲＷＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５５：ＧＬＬＫＲＰＣＬＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５６：ＱＲＫＬＱＲＴＳＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５７：ＰＫＳＫＶＣＱＱＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５８：ＫＲＬＬＫＧＳＱＹＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５９：ＰＨＫＲＬＬＫＧＳＱＹＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６０：ＫＥＳＮＤＣＳＣＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６１：ＤＣＶＣＲＧＳＴＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６２、ＶＡＰＲＳＲＤＥＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６３：ＡＨＱＬＱＡＬＲＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６４：ＬＴＧＫＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６５：ＹＹＣＦＦＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６６：ＬＥＫＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６７：ＡＡＨＫＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６８：ＡＬＲＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６９：ＧＧＳＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７０：ＲＤＥＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７１：ＳＲＶＫＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７２：ＰＡＳＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３：ＡＩＨＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４：ＧＡＥＡＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５：ＧＳＴＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６：ＲＧＭＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７：ＬＶＨＡＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８：ＳＬＱＴＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９：ＰＶＰＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０：ＮＹＫＳＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１：ＰＲＫＱＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８２：ＴＰＲＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８３：ＧＣＳＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８４：ＥＡＱＲＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８５：ＧＫＡＷＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８６：ＰＡＧＧＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８７：ＶＶＬＹＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８８：ＬＴＬＫＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８９：ＧＦＱＳＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９０：ＲＶＱＷＧ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９１：ＳＲＴＥＧＱＦＧＴＴＱＳＮＧＴＦＦＮＧＡＳＰＧＴＰＰＡＰＳＱＨＱＱＳＬＴＳＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９２：
ＹＲＰＩＰＦＱＰＥＧＡＧＥＧＴＤＥＤＫＳＮＲＩＧＮＮＧＬＲＬＮＤＧＮＧＮＧＱＬＡＰＳＰＴＰＱＧＴＥＡＶＲＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９３：ＲＫＦＳＮＮＰＱＰＮＡＩＳＮＧＴＳＴＳＥＲＰＧＥＧＡＴＱＧＩＶＥＥＥＶＬＱ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９４：ＩＲＴＥＳＡＥＥＡＥＭＡＳＶＰＮＧＳＰＳＷＨＰＧＡＳＨＶＶＮＧＡＡＧＨＳＮ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９５：ＷＨＥＩＥＭＥＳＧＥＥＡＭＥＰＡＮＥＴＧＮＴＬＮＧＳＰＳＷＨＰＳＰＳＨＶＩ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９６：ＮＲＴＤＦＡＧＥＥＤＥＭＤＧＶＬＮＧＳＰＳＷＨＡＡＴＳＨＩＶＮＧＡＴＶＨＱ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９７：ＮＲＴＤＴＡＡＥＡＥＭＤＳＶＬＮＧＳＰＳＷＨＰＰＡＧＨＶＶＮＧＡＴＶＨＲＳ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９８：ＮＲＴＤＴＡＡＥＡＥＭＤＳＶＬＮＧＳＰＳＷＨＰＰＡＧＨＶＶＮＧＡＡＶＨＲＳ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９９：ＮＲＴＥＶＬＥＧＡＥＩＰＳＴＶＮＧＳＰＳＷＨＰＡＤＳＲＡＶＳＧＡＴＧＨＳＳ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１００：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＬＰＳＴＶＮＧＳＰＳＷＨＰＡＤＳＲＡＧＳＧＡＴＧＨＳＳ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０１：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＲＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０２：
ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＶＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＱＬＡＤＳＰＡＩＮＧＡＴＧＨＳＳＳＬＤＡＲＥＶＩＰＭＡＡＶＫＱＱＡＬ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＤＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＡＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＧＰＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＡＷＨＰＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０５：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＤＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０６：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＡＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０７：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＰＡＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０８：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＤＳＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＡＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０９：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＤＳＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＶＶＮＧＡＴ、または
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１０：ＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴ。

【0015】

好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、手足口ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（ＥＢウイルス）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、巨大細胞ウイルス、水痘－帯状ヘルペスウイルス、水胞性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、デングウイルス、えぼらウイルス、マールブルグウイルス、ジカウイルス（Ｚｉｋａ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタウイルス、新型腸管ウイルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄病ウイルス、微小ウイルス、プリオン、天然痘ウイルス、タバコモザイクウイルス、ファージ、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトボカウイルスまたはコロナウイルスのうちのいずれか１種を含み、インフルエンザウイルス、エイズウイルスまたは新型コロナウイルスのうちのいずれか１種であることが好ましい。

【0016】

好ましくは、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＮＰタンパク質、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質またはＮＥＰタンパク質のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せには、少なくとも１つのデグロンが含まれる。例えば、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質およびＰＢ２タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質およびＰＢ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質およびＰＢ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質およびＰＢ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質およびＭ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質およびＮＰタンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質およびＭ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質およびＭ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ１タンパク質およびＭ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質およびＭ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質およびＮＳ１タンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質およびＮＥＰタンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよいし、インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質およびＮＥＰタンパク質には、いずれも少なくとも１つのデグロンが含まれてもよい。

【0017】

好ましくは、エイズウイルスのＧａｇポリタンパク質（Ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐｏｌポリタンパク質（ｐｏｌ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ｇｐ１６０、ＨＩＶ転写トランス活性化因子（ＨＩＶ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ｔａｔ）、ビリオンタンパク質発現調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒｅｖ）、Ｎｅｆ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ、Ｎｅｆ）、レンチウイルスタンパク質Ｒ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ、Ｖｐｒ）、ウイルス感染因子（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｆ）、ウイルスタンパク質Ｕ（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ、Ｖｐｕ）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＡ、ｐ１７）、カプシドタンパク質（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＡ、ｐ２４）、スペーサーペプチド１（ｓｐａｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ １、ＳＰ１、ｐ２）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＣ、ｐ７）、スペーサーペプチド２（ｓｐａｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ２、ＳＰ２、ｐ１）、Ｐ６、逆トランスクリプターゼ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＴ）、リボヌクレアーゼＨ（Ｒｎａｓｅ Ｈ）、インテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、ＩＮ）、ＨＩＶプロテアーゼ（ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＰＲ）、ｇｐ１２０またはｇｐ４１タンパク質のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せには、少なくとも１つのデグロンが含まれる。

【0018】

好ましくは、新型コロナウイルスのスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、膜糖タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非構造タンパク質１（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ｎｓｐ１）、非構造タンパク質２、非構造タンパク質３、非構造タンパク質４、非構造タンパク質５、非構造タンパク質６、非構造タンパク質７、非構造タンパク質８、非構造タンパク質９、非構造タンパク質１０、非構造タンパク質１１、非構造タンパク質１２、非構造タンパク質１３、非構造タンパク質１４、非構造タンパク質１５、非構造タンパク質１６、３ａタンパク質、３ｂタンパク質、６タンパク質、７ａタンパク質、７ｂタンパク質、８ａタンパク質、８ｂタンパク質、９ｂタンパク質、３Ｃ様プロテアーゼ（３Ｃ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、リーダータンパク質（ｌｅａｄｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、２’－Ｏ－リボシルメチルトランスフェラーゼ（２’－Ｏ－ｒｉｂｏｓｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏＲＮＡｓｅ）、３’－～－５’エキソヌクレアーゼ（３’－ｔｏ－５’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ｏｒｆ１ａポリタンパク質（ｏｒｆ１ａ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ１０タンパク質（ＯＲＦ１０ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ８タンパク質（ＯＲＦ８ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ７ａタンパク質（ＯＲＦ７ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ６タンパク質（ＯＲＦ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＯＲＦ３ａタンパク質（ＯＲＦ３ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せには、少なくとも１つのデグロンが含まれる。

【0019】

本願において、前記組換えウイルスは、さらに修飾されてもよく、例えば、一部の免疫補強剤をウイルスタンパク質の特定領域または特定のアミノ酸に導入することで、性能が改善されて免疫原性が補強された組換えウイルスを得る。

【0020】

第２の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードする、核酸分子を提供する。

【0021】

第３の態様として、本願は、第２の態様に記載の核酸分子を含む組換えベクターを提供する。

【0022】

好ましくは、前記組換えベクターは、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスを発現する。

【0023】

第４の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法であって、
タンパク質分解系欠損の細胞系を構築することと、
ウイルスタンパク質のコード遺伝子に、デグロンをコードするヌクレオチド配列を導入することと、
第３の態様に記載の組換えベクターを構築し、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得ることと、を含む、調製方法を提供する。

【0024】

本願において、タンパク質分解系が広く宿主細胞に分布するため、組換えウイルスが調製過程において細胞におけるタンパク質分解系により分解されることに起因して生産効率が低下することを回避するように、本願は、タンパク質分解系に欠損の、人為的に修飾された細胞系を提供する。この人為的に修飾された細胞系において、デグロンが識別されず、ウイルスタンパク質がタンパク質分解系により分解されずに保留されるので、組換えウイルスは、この特定の人為的に修飾された細胞系において効率的に複製し、大量の調製を行うことができる。正常な細胞において、タンパク質分解系は、ウイルスタンパク質と融合するデグロンを識別して、ウイルスタンパク質を分解させて、ウイルスの複製能が弱め、ひいては複製能が完全になくなるため、組換えウイルスは、極めて高い安全性を有する。

【0025】

この特定のウイルス生産体系に対する組換えウイルスの依存性により、このシステムにおいて組換えウイルスの大量の調製を行うことができる。人体や動物などの正常な細胞においてタンパク質分解系が存在するので、ウイルスタンパク質と融合発現するデグロンを識別してウイルスタンパク質を分解させることができる。そのため、調製された組換えウイルスは、動物や人体における複製能が低下するか、または複製繁殖を行うことができず、ウイルスの安全性を向上させて、この組換えウイルスが名実ともに弱毒化生ウイルスワクチンとなる。

【0026】

本願において、前記組換えウイルスの調製原理は以下の通りである。（１）ウイルスタンパク質の特定サイトに導入されたデグロンは、宿主細胞におけるタンパク質分解系により識別されることができて、関連するウイルスタンパク質の分解、不活化を誘導する。（２）ウイルスタンパク質の特定サイトに導入されたデグロンは、特定のウイルス生産システムにおいて識別されず、または抑制されることができて、ウイルスタンパク質が宿主細胞におけるタンパク質分解系により分解されることを回避または低減する。（３）ウイルスタンパク質の特定サイトに導入されたデグロンは正常な宿主細胞においてタンパク質分解系により識別されるため、調製されたウイルスは、動物や人体などの宿主細胞においてタンパク質分解系により識別・分解可能となることで、複製能が低下し、ひいては複製繁殖能が完全になくなり、ウイルスの安全性を向上させる。

【0027】

好ましくは、前記タンパク質分解系欠損には、Ｅ３リガーゼノックアウトまたはノックダウン、プロテアソームノックアウトまたはノックダウンのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むユビキチン－プロテアソーム系欠損が含まれる。

【0028】

好ましくは、前記細胞系には、ＣＨＯ細胞系、Ｖｅｒｏ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、Ａ５４９細胞系、ＢＨＫ細胞系、ＢＨＫ－２１／ＢＲＳ細胞系、Ｓｐ２／０細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、２９３Ｆ細胞系、ＨｅＬａ細胞系、ＴＺＭ－ｂｌ細胞系、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞系、ＭＲＣ－５細胞系、ＶＭＫ細胞系、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞系、ＨＣＴ－８細胞系、Ｈｕｈ－７細胞系またはＣａｃｏ２細胞系のうちのいずれか１種を含む哺乳動物細胞系が含まれ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系またはＡ５４９細胞系のうちのいずれか１種であることが好ましい。

【0029】

本願において、さらに、哺乳動物細胞系を選用することにより、従来方法においてニワトリ胚を用いてウイルスを繁殖することによる人体のアレルギーなどの不良反応を引き起こしやすいという欠点を解決した。

【0030】

好ましくは、前記デグロン含有組換えウイルスは、調製過程においてタンパク質分解系阻害剤が添加される。

【0031】

好ましくは、前記タンパク質分解系阻害剤には、ＭＧ１３２、ＭＧ－３４１またはラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むプロテアソーム阻害剤が含まれる。

【0032】

好ましくは、前記調製方法はさらに、前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出するステップを含む。

【0033】

本願において、前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能を検出することにより、前記組換えウイルスの修飾に成功するか否かを確定する。そのうち、前記タンパク質分解系欠損の細胞系において正常に複製する、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能が低下する、または複製できない組換えウイルスは、修飾に成功する組換えウイルスである。

【0034】

好ましくは、前記調製方法はさらに、大規模に生産するステップを含む。

【0035】

好適な技術態様として、本願に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法は以下のステップを含む。
ステップ（１）、タンパク質分解系欠損の哺乳動物細胞系を構築することであって、
遺伝子編集技術により、細胞系におけるタンパク質分解系のキー要素をノックアウトする。
ステップ（２）、デグロンが導入されたウイルスタンパク質および前記デグロンの種類、数、および導入サイトを確定し、ウイルスタンパク質のコード遺伝子に、デグロンをコードするヌクレオチド配列を導入して、組換えウイルス配列を得る。
ステップ（３）、組換えベクターを構築することであって、
ステップ（２）における組換えウイルス配列とプラスミドを連結させて、前記組換えベクターを得る。
ステップ（４）、組換えベクターを前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得ることであって、
逆遺伝学技術により、ステップ（３）における組換えベクターとウイルスレスキュープラスミドを前記タンパク質分解系欠損の細胞系に共トランスフェクトし、タンパク質分解系阻害剤を添加し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得る。
前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出し、大規模に生産する。

【0036】

本願のステップ（２）において、インフルエンザウイルスに対して生物情報学分析およびタンパク質構造予測を行うことにより、ウイルスの各タンパク質にデグロン配列が導入されたウイルスのタンパク質構造を予測して分析することにより、デグロンが導入されたウイルスタンパク質を選別し、導入されたデグロンの種類、数及び具体的なサイトを確定する。

【0037】

本願のステップ（４）において、逆遺伝学技術により、従来のウイルスモデルにおけるいずれかの遺伝子を、他の亜型または毒株の遺伝子に置き換えることができ、または既有のウイルスモデルを、他の亜型または毒株に置き換えることによって、他の亜型または毒株の組換えウイルスを調製し、その方法が、いずれかの亜型または毒株のウイルスに用いることができ、さらに、調製されたウイルスはタンパク質分解系欠損の細胞株で大量複製し、正常な宿主細胞においてタンパク質分解系により識別され、分解される。

【0038】

本願において、修飾に成功する組換えウイルスは、ステップ（２）～（４）を繰り返して、組換えウイルスの複数のウイルスタンパク質にいずれもデグロンを導入するか、または組換えウイルスのいずれかのウイルスタンパク質に複数のデグロンを導入することを実現できる。

【0039】

また、逆遺伝学技術により、さらに多価のウイルスを調製することができ、より重要なことは、調製された突然変異型強毒、および多価ウイルスは、極めて高い安全性および有効性を有することである。

【0040】

第５の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製システムであって、タンパク質分解系欠損の細胞系、組換えベクターおよびウイルスレスキュープラスミドを含む調製システムを提供する。

【0041】

第６の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルス、第２の態様に記載の核酸分子、第３の態様に記載の組換えベクター、第４の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法または第５態様に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製システムのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せの、ワクチンおよび／または医薬品の調製における使用を提供する。

【0042】

第７の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスを含むワクチンを提供する。

【0043】

好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能のない生ワクチン、複製制御可能な生ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスワクチンのうちのいずれか１種を含む。

【0044】

好ましくは、前記ワクチンはさらに、アジュバントおよび補助材料を含む。

【0045】

第８の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。

【0046】

第９の態様として、本願は、第１の態様に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む医薬品を提供する。

【0047】

好ましくは、前記医薬品はさらに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。

【発明の効果】

【0048】

従来技術と比べ、本願は、以下の有益な効果を有する。

【0049】

（１）汎用性については、ウイルスタンパク質にデグロンを導入するだけでウイルスの複製を制御することができるので、本願の技術方案は、すべてのウイルスを修飾することができ、すべてのウイルスワクチンの調製に用いることができ、選択可能なタンパク質分解系、および対応するデグロンは、複数種あり、限定要素が少なく、適用性が強い。

【0050】

（２）操作がシンプルである。簡単なウイルスベクターの構築、およびウイルスのパッケージング技術だけが必要であり、技術が成熟し、成功率が高く、関連製品の調製および普及を促進する。

【0051】

（３）効果が良好である。本願の技術方案により、不活化程度が異なるワクチンを設計することができ、安全な制御可能性を有し、調製されたワクチンは、極めて良好な免疫原性を有し、使用将来性が広い。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1A】実施例３においてＤｅｇｒｏｎ１を含む毒株の調製効率を示す図である。

【図1B】実施例３においてＤｅｇｒｏｎ２を含む毒株の調製効率を示す図である。

【図1C】実施例３において同時にＤｅｇｒｏｎ１およびＤｅｇｒｏｎ２を含む組換え毒株の調製効率を示す図である。

【図2A】実施例３においてＤｅｇｒｏｎ１を含む毒株の、ＭＤＣＫ細胞における生長曲線である。

【図2B】実施例３においてＤｅｇｒｏｎ２を含む毒株の、ＭＤＣＫ細胞における生長曲線である。

【図2C】実施例３において複数のＤｅｇｒｏｎ１および／またはＤｅｇｒｏｎ２を含む組換え毒株の、ＭＤＣＫ細胞における生長曲線である。

【図3】実施例４においてＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔで検出されたウイルスタンパク質発現レベルを示す図である。

【図4A】実施例５においてマウスの組換えインフルエンザウイルスを接種した後の体重の変化を示す図である。

【図4B】実施例５においてマウスの組換えインフルエンザウイルスを接種した後の生存率を示す図である。

【図4C】実施例５においてマウスの組換えインフルエンザウイルスを接種した後に肺におけるウイルス力価を示す図である。

【図5A】実施例６において組換えインフルエンザウイルスを接種した後の中和抗体価、および凝血抑制抗体価を示す図である。

【図5B】実施例６において組換えインフルエンザウイルスを接種した後のａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＧ、ａｎｔｉ－ＨＡ ＩｇＧ、ａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＡの力価を示す図である。

【図5C】実施例６において組換えインフルエンザウイルスを接種した後の脾臓、肺臓におけるＴ細胞応答を示す図である。

【図5D】実施例６においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型同種インフルエンザ毒株（ＷＳＮ）の攻撃を行った後の体重変化を示す図である。

【図5E】実施例６においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型同種インフルエンザ毒株（ＷＳＮ）の攻撃を行った後の生存率を示す図である。

【図5F】実施例６においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型同種インフルエンザ毒株（ＷＳＮ）の攻撃を行った３日後の肺におけるウイルス力価を示す図である。

【図6A】実施例７においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型異種インフルエンザ毒株（Ｈ３Ｎ２）の攻撃を行った後の体重変化を示す図である。

【図6B】実施例７においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型異種インフルエンザ毒株（Ｈ３Ｎ２）の攻撃を行った後の生存率を示す図である。

【図6C】実施例７においてマウスは、組換えインフルエンザウイルスを接種してから野生型異種インフルエンザ毒株（Ｈ３Ｎ２）の攻撃を行った３日後の肺におけるウイルス力価を示す図である。

【図7】デグロンを含むウイルスのワーク原理を示す図である。正常な細胞において、ウイルスタンパク質と共有結合したデグロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとウイルスタンパク質の識別を誘導し、ウイルスタンパク質をユビキチン化させ、さらに、プロテアソームは、ユビキチン化されたウイルスタンパク質を分解させ、最終に、ウイルスを弱毒化させてワクチンにする。Ｅ３ユビキチンリガーゼのノックアウトされた細胞において、デグロンは、ウイルスタンパク質のユビキチン化を誘導できないため、ウイルスタンパク質は、プロテアソームにより分解されることなく保留されて、最終に、ウイルスが、野生型ウイルスのように効率的に複製し、大量の調製を行うことができる。

【発明を実施するための形態】

【0053】

さらに本願に用いられる技術手段およびその効果を説明するために、以下は、実施例を参照しながら本願をさらに説明する。ここで説明する具体的な実施形態は、本願を解釈するためのものに過ぎ、本願を限定するためのものではないことを理解できる。

【0054】

実施例において具体的な技術または条件が明記されていないものについては、当該分野における文献に記載された技術または条件、若しくは製品マニュアルに応じて行う。用いられる試薬または装置は、メーカが明記されていない場合、いずれも正規卸売業者から購入可能な通常のものである。

【0055】

材料：
ｐＨＨ２１、ｐＣＤＮＡ３（ｎｅｏ）およびｐｃＡＡＧＧＳ／ＭＣＳベクターは、北京中科裕博生物技術有限公司から購入されるものである。

【0056】

実施例１
本実施例は、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスを発現する組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、以下の方法によって調製される。

【0057】

（１）ウイルスレスキュープラスミドの構築
ｐｕｂｍｅｄに公開されたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３の遺伝子配列に基づく。

【0058】

ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ２、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ１、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＨＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＰ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋Ｍ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＳ。

【0059】

遺伝子全体の合成により、該インフルエンザウイルスの各遺伝子セグメントの遺伝子を得た。それぞれ、ｐＨＨ２１、ｐＣＤＮＡ３（ｎｅｏ）、ｐｃＡＡＧＧＳ／ＭＣＳベクターに連結して、野生型インフルエンザウイルスレスキュープラスミドを得た。得たプラスミドの命名および構成は、表１に示される。

【表1】

【0060】

（２）組換えベクターの構築
ウイルスタンパク質にデグロンのコード配列を導入し、プラスミドに連結させ、一連の組換えプラスミドを構築した。この作業は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．の協力を依頼して完成されており、シーケンシングを行い、突然変異構築に成功したことを検証した。

【0061】

組換えベクターの命名原則は、以下の通りである。

【0062】

１．ウイルスタンパク質のＮ末端にデグロンを導入して、構築されたウイルスベクターは、「ウイルスタンパク質名称－Ｎ－デグロン名称」と命名された。

【0063】

２．ウイルスタンパク質のＣ末端にデグロンを導入して、構築されたウイルスベクターは、「ウイルスタンパク質名称－Ｃ－デグロン名称」と命名された。

【0064】

３．ウイルスタンパク質のコード領域内にデグロンを導入して構築されたウイルスベクターは、「ウイルスタンパク質名称－導入サイトと隣り合う上流アミノ酸の名称およびアミノ酸の番号－デグロン名称」と命名された。

【0065】

構築された組換えプラスミドは、以下の通りである。

【0066】

ＰＢ２－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｒ７０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｉ１７６－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｖ４５７－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｎ５１０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｙ５３１－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ａ６２３－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｄ６８０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｅ７００－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｄ７０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｄ２９５－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｒ３２７－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｒ４３０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｆ４９０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｔ５６６ Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｎ６２６－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｇ７１０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｄ２９４－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｎ３５０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｅ３７２－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｌ４２５－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｈ５１０－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ａ５５３－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｅ６０４－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｓ６２４－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｇ１２６－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｎ２４７－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ －Ｒ３１７－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ －Ｖ３５３－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ －Ａ３６６－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｑ４０９－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｅ４６５－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｍ４８１－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＰ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ａ３３－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｖ６８－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｄ８９－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｒ１０５－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｍ１３５－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｑ１６４－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｈ２２２－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ａ２３９－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｍ２－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＥＰ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ａ７６－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ａ８２－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ｈ１０１－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ａ１２２－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ｔ１５１－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ｌ１６３－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＳ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＨＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＨＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＮＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ１、ＰＢ２－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｒ７０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｉ１７６－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｖ４５７－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｎ５１０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｙ５３１－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ａ６２３－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｄ６８０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｅ７００－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ２－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｄ７０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｄ２９５－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｒ３２７－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｒ４３０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｆ４９０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｔ５６６ Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｎ６２６－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｇ７１０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＢ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｄ２９４－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｎ３５０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｅ３７２－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｌ４２５－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｈ５１０－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ａ５５３－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｅ６０４－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｓ６２４－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＰＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｇ１２６－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｎ２４７－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｒ３１７－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｖ３５３－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ａ３６６－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｑ４０９－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｅ４６５－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｍ４８１－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＰ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ａ３３－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｖ６８－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｄ８９－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｒ１０５－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｍ１３５－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｑ１６４－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｈ２２２－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ａ２３９－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、Ｍ２－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＥＰ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ａ７６－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ａ８２－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ｈ１０１－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ａ１２２－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ｔ１５１－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ｌ１６３－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＳ１－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＨＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＨＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２、ＮＡ－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ２およびＮＡ－Ｃ－Ｄｅｇｒｏｎ２。

【0067】

そのうち、Ｄｅｇｒｏｎ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、コードヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１、Ｄｅｇｒｏｎ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、コードヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２に示すとおりである。

【0068】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１：ＧＣＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＣＣＡ、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２：ＧＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＧ。

【0069】

実施例２
本実施例は、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスを提供する。前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスは、以下の方法によって調製される。

【0070】

（１）タンパク質分解系欠損の哺乳動物細胞系を構築した。

【0071】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト技術を用いて、細胞系におけるタンパク質分解系の要素をノックアウトした。

【0072】

（２）組換えベクターを前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得た。

【0073】

実施例１における組換えベクターを用いて対応する野生型プラスミドを代替し、他の１１種のプラスミドとともに、タンパク質分解系欠損の哺乳動物細胞系に共トランスフェクトし（例：組換えベクターＰＢ２－Ｎ－Ｄｅｇｒｏｎ１を用いてプラスミドＢｅｎ１を代替し、他の１１種のプラスミドとともに共トランスフェクトし）、各プラスミドの添加量が０．２μｇであり、トランスフェクトされた細胞を、０．５％のＦＢＳ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－トリプシンを含むＤＭＥＭ培地に培養した。

【0074】

トランスフェクト化４日後、宿主細胞を完全に病変または９０％以上病変させた後、上清を収集し、新たなタンパク質分解系欠損の細胞に感染した。培地は、０．５％のＦＢＳ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－トリプシンを含むＤＭＥＭ培地である。タンパク質分解系阻害剤を添加し、感染４日後、宿主細胞を完全に病変させた後、上清を収集した。

【0075】

上清を遠心処理し、０．４μｍの濾膜を通過して細胞砕片を除去し、パッケージング生成物に対してタンパク質分解系欠損依存性の検出、およびパッケージング生成物の不活化のタンパク質分解系に対する依存性の検出を行い、タンパク質分解系欠損依存性を維持している突然変異体を保留して組換えウイルスとする。

【0076】

組換えベクターと同様な方式に応じて、調製された組換えウイルスを命名した。

【0077】

実施例３
前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルス（下記表２に示された）について、調製効率および細胞レベルにおける安全性の評価

【表2-1】

【表2-2】

【0078】

（１）デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの調製効率
デグロン含有組換えインフルエンザウイルス、野生型インフルエンザウイルスを、それぞれＥ３ユビキチンリガーゼがノックアウトされた細胞系（ＭＯＩ＝０．０１）に感染し、４８時間培養した後、細胞の上清を収集し、そのうちのウイルス力価を測定した。デグロン含有組換えインフルエンザウイルスと野生型ウイルス力価を比較することにより、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの調製効率を判定した。本実施例において、Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｄｅｇｒｏｎ２、およびこれらの組合せを含む毒株を例として、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの調製効率を示した。その結果（図１）から分かるように、ＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼがノックアウトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、すべてのＤｅｇｒｏｎ１を含む組換えインフルエンザ毒株の力価は野生型インフルエンザウイルスＷＳＮの力価に匹敵し、β－ＴｒＣＰ Ｅ３ユビキチンリガーゼがノックアウトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、すべてのＤｅｇｒｏｎ２を含む組換えインフルエンザ毒株の力価は野生型インフルエンザウイルスＷＳＮの力価に匹敵し、同時に複数のＤｅｇｒｏｎ１および／またはＤｅｇｒｏｎ２を含む組換えインフルエンザ株の力価は野生型インフルエンザウイルスＷＳＮの力価に匹敵した。それらの結果は、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスが高い調製効率を有することを示した。

【0079】

（２）デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの細胞レベルにおける安全性
デグロン含有組換えインフルエンザウイルス、野生型インフルエンザウイルスの正常なＭＤＣＫ細胞における生長曲線を考察することにより、毒株の安全性を判断した。毒株の安全性についての判断標準は以下の通りである。毒株は、野生型ウイルスと比べて、正常なＭＤＣＫ細胞系において複製能が弱め、ひいては複製しないと（ウイルス力価が野生型ウイルス力価よりも低い）、該毒株が安全であることを示した。本実施例において、Ｄｅｇｒｏｎ１、Ｄｅｇｒｏｎ２、及びこれらの組合せを含む毒株を例として、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの安全性を示した。生長曲線に基づいて検出するステップは、以下の通りである。

【0080】

調製されたデグロン含有組換えインフルエンザウイルスおよび野生型インフルエンザウイルスを、ＭＯＩ＝０．００１の比率で正常なＭＤＣＫ細胞系に感染した。感染後の２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９６ｈで、ｑＰＣＲで細胞におけるウイルス力価を検出することで、ウイルスの細胞における複製能を検出した。その結果（図２）から分かるように、正常なＭＤＣＫ細胞系において、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスは、野生型インフルエンザウイルスと比べ、複製能が弱め、ひいては複製に欠損があった。この結果は、調製されたデグロン含有組換えインフルエンザウイルスが細胞レベルにおける安全性を有することを示した。

【0081】

実施例４
デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの弱毒化メカニズムの検証
デグロン含有組換えインフルエンザウイルス、野生型インフルエンザウイルスを、それぞれ正常なＭＤＣＫ細胞系（ＭＯＩ＝０．１）に感染した。培地にそれぞれ５０ｎＭおよび１００ｎＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２を補充し、ＤＭＳＯ（ウイルスと同じ希釈比率である）をコントロールとした。４８ｈ感染した後、細胞サンプルを収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔを用いてウイルスタンパク質発現レベルを検出した。

【0082】

試験結果（図３）から分かるように、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスを正常なＭＤＣＫ細胞に感染した後、大量複製できないため、少ないウイルスタンパク質Ｍ１のシグナルを検出した。細胞のプロテアソーム系が阻害された後、ウイルスタンパク質Ｍ１のシグナルが増加した。そのため、プロテアソーム系が阻害された後、ウイルスの複製能が補強されることを示した。タンパク質加水分解標的分子の導入が細胞のプロテアソームのウイルスタンパク質に対する分解を媒介して、ウイルスの複製能を阻害できることが証明された。それは、前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの設計原理と合致した。

【0083】

実施例５
デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの動物レベルにおける安全性の評価
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて、前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの動物レベルにおける安全性を評価した。同時にＤｅｇｒｏｎ１およびＤｅｇｒｏｎ２を含む組換え毒株（Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株と命名される）を代表として、ウイルスの安全性を評価した。

【0084】

安全性の評価の具体的なステップは、以下の通りである。

【0085】

（ａ）３０匹の７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３群に分け、各群１０匹とした。

【0086】

（ｂ）第１の群は、各マウスにＤＭＥＭを点鼻接種し、第２の群は、各マウスに１０^５ ＴＣＩＤ_５０ Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株を点鼻接種し、第３の群は、各マウスに１０^５ ＴＣＩＤ_５０野生型ＷＳＮインフルエンザウイルスを点鼻接種した。

【0087】

（ｃ）接種の３日後、各群より５匹のマウスを取り、その肺組織を採取し、そのうちのウイルス力価を検出した。

【0088】

（ｄ）続いて各群の残りの５匹のマウスの体重および死亡の状況を観察し、監視し、１４日間持続した。

【0089】

その結果（図４）から分かるように、野生型ＷＳＮインフルエンザウイルスは、マウスの肺において高度複製できて、マウスの体重の明らかな低下、およびマウスの死亡を引き起こす。ところが、マウスの肺における前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルス力価が検出限界以下にあり、マウスの体重の低下を引き起こすことなく、マウスの死亡を引き起こすこともない。そのため、前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンは、良好な安全性を有する。

【0090】

実施例６
デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンの動物レベルにおける免疫原性および保護性についての考察
前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスの動物レベルにおける免疫原性および保護性を評価した。不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）をコントロールとして（不活化インフルエンザウイルスワクチンは、発明者が中国薬典に提供された方法に従って、同種のインフルエンザウイルス粒子を用いて調製されたものである）、同時にＤｅｇｒｏｎ１およびＤｅｇｒｏｎ２を含む組換え毒株（Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株と命名される）を代表として、デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンの免疫原性および保護性を評価した。

【0091】

免疫原性および保護性を考察する具体的なステップは、以下の通りである。

【0092】

（１）６０匹の７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３群に分け、各群２０匹とした。

【0093】

（２）第１の群は、各マウスにＤＭＥＭを点鼻接種し、第２の群は、各マウスに１０^５ ＴＣＩＤ_５０ Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株を点鼻接種し、第３の群は、各マウスに１０^５ ＰＦＵ不活化インフルエンザワクチンＩＩＶを点鼻接種した。

【0094】

（３）接種の１週後、各群より５匹のマウスを取り、その肺組織および脾臓を採取し、そのうちのＴ細胞の免疫反応を検出した。

【0095】

（４）接種の３週後、各群より５匹のマウスを取り、採血し、それぞれ凝血抑制（ＨＩ）試験、中和（ＮＴ）抗体検出およびＥＬＩＳＡ検出に使用し、そのうちの抗体免疫反応を検出した。

【0096】

（５）接種の３週後、各群は、マウスに２×１０^５ ＴＣＩＤ_５０の野生型ＷＳＮインフルエンザウイルスを点鼻接種した。

【0097】

（６）野生型ＷＳＮインフルエンザウイルスの接種の３日後、各群より５匹のマウスを取り、その肺組織を採取し、そのうちのウイルス力価を検出した。

【0098】

（７）続いて各群の残りの５匹のマウスの体重および死亡の状況を観察し、監視し、１４日間持続した。

【0099】

この結果（図５）から分かるように、Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株は、動物の体内で高レベルの凝血抑制抗体価、中和抗体価、ａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＧ、ａｎｔｉ－ＨＡ ＩｇＧ、ａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＡなどを誘導することができる。Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株により誘導された凝血抑制抗体、中和抗体、ａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＧ、ａｎｔｉ－ＨＡ ＩｇＧおよびａｎｔｉ－ＮＰ ＩｇＡレベルは、顕著に不活化インフルエンザワクチンにより誘導された抗体レベルよりも高い。Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株の接種により、完全な免疫保護を提供することができ、例えば、マウスの肺におけるウイルス力価を検出限界以下に抑制することができ、マウスがすべて生きておりかつ体重が不変である。ところが、不活化ワクチンの接種により、有限な免疫保護効果しか提供することができず、例えば、マウスの肺において高レベルの野生型インフルエンザウイルスの複製が依然として存在し、マウスの一部が生きてかつ体重が明らかに低下した。これらのデータから分かるように、Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株ワクチンによる保護は、顕著に不活化インフルエンザワクチンよりも優れる。そのため、前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンは、より優れた免疫原性および保護効果を有する。

【0100】

実施例７
デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンの動物レベルにおける交差免疫保護効果についての考察
具体的なステップは、以下の通りである。

【0101】

（１）１０匹の７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３群に分け、各群１０匹とした。

【0102】

（２）第１の群は、各マウスにＤＭＥＭを点鼻接種し、第２の群は、各マウスに１０^５ ＴＣＩＤ_５０ Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株を点鼻接種し、第３の群は、各マウスに１０^５ ＰＦＵ不活化インフルエンザワクチンＩＩＶを点鼻接種した。

【0103】

（３）接種の３週後、各群は、マウスに１０^３ ＴＣＩＤ_５０の野生型Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスを点鼻接種した。

【0104】

（４）野生型Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスの接種の３日後、各群より５匹のマウスを取り、その肺組織を採取し、そのうちのウイルス力価を検出した。

【0105】

（５）続いて各群の残りの５匹のマウスの体重および死亡の状況を観察し、監視し、１４日間持続した。

【0106】

この結果（図６）から分かるように、Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株の接種により、交差免疫保護を提供することができ、例えば、マウスの肺におけるウイルス力価を検出限界以下に抑制することができ、マウスがすべて生きておりかつ体重が不変である。ところが、不活化ワクチンの接種により、交差免疫保護効果を提供することができず、例えば、マウスの肺におけるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスレベルがワクチンが接種されていないものに匹敵し、マウスがすべて死亡し、体重が明らかに低下した。これらのデータから分かるように、Ｄｅｇｒｏｎｓ組換え毒株ワクチンにより提供された交差免疫保護は、顕著に不活化インフルエンザワクチンよりも優れる。そのため、前記デグロン含有組換えインフルエンザウイルスワクチンは、より優れた交差免疫原性および保護効果を有する。

【0107】

要するに、本願では、ウイルスタンパク質にデグロンを導入することにより、調製された組換えウイルスは、宿主細胞におけるタンパク質分解系により識別されて分解され、組換えウイルスの複製能が弱め、ひいては除去されることができる。ただし、前記組換えウイルスは、タンパク質分解系欠損の細胞内に複製することができることで、その大規模生産を実現することができる。前記組換えウイルスは、対応するワクチンまたは医薬品として調製された後、極めて良好な安全性および免疫原性を有し、適用見込みが広い。前記組換えウイルスの調製方法は、適用性が極めて強く、操作が簡単であり、製品の使用および普及を促進することができる。

【0108】

本願は、上記実施例により本願の詳細方法を説明するが、上記詳細方法に限定されるものではなく、即ち、本願は上記詳細方法に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本願に対するいかなる改良、本願の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【配列表】

2024529069000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-02-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種のウイルスタンパク質には、宿主細胞のタンパク質分解系により識別可能なデグロンが少なくとも１つ含まれる、デグロン含有組換えウイルスであって、
前記デグロンは、アミノ酸配列、ポリペプチドまたは構造モチーフのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、デグロン含有組換えウイルス。

【請求項2】

前記タンパク質分解系は、ユビキチン－プロテアソーム系、リソソーム系、オルガネラ加水分解系、細胞膜表面加水分解系またはＣａｓｐａｓｅプロテアーゼ系のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、請求項１に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項3】

前記デグロンの位置は、ウイルスタンパク質のＣ末端、Ｎ末端または中間コード領域のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せにある、請求項１に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項4】

前記デグロンは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１１０で表されるアミノ酸配列のうちのいずれか１種を含む、請求項１に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項5】

前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、新型コロナウイルス、手足口ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、巨大細胞ウイルス、水痘－帯状ヘルペスウイルス、水胞性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、デングウイルス、えぼらウイルス、マールブルグウイルス、ジカウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタウイルス、新型腸管ウイルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄病ウイルス、微小ウイルス、プリオン、天然痘ウイルス、タバコモザイクウイルス、ファージ、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、ノロウイルス、ヒトボカウイルスまたはコロナウイルスのうちのいずれか１種を含み、インフルエンザウイルス、エイズウイルスまたは新型コロナウイルスのうちのいずれか１種であることが好ましい、請求項１に記載のデグロン含有組換えウイルス。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードする、核酸分子。

【請求項7】

核酸分子を含む組換えベクターであって、
前記核酸分子は請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードし、
好ましくは、前記組換えベクターが、請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを発現する、組換えベクター。

【請求項8】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製方法であって、
タンパク質分解系欠損の細胞系を構築することと、
ウイルスタンパク質のコード遺伝子に、デグロンをコードするヌクレオチド配列を導入することと、
組換えベクターを構築し、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得ることと、を含み、そのうち、前記組換えベクターは核酸分子を含み、前記核酸分子は請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードし、
好ましくは、前記タンパク質分解系欠損には、Ｅ３リガーゼノックアウトまたはノックダウン、プロテアソームノックアウトまたはノックダウンのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むユビキチン－プロテアソーム系欠損が含まれ、
好ましくは、前記細胞系には、ＣＨＯ細胞系、Ｖｅｒｏ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系、Ａ５４９細胞系、ＢＨＫ細胞系、ＢＨＫ－２１／ＢＲＳ細胞系、Ｓｐ２／０細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、２９３Ｆ細胞系、ＨｅＬａ細胞系、ＴＺＭ－ｂｌ細胞系、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞系、ＭＲＣ－５細胞系、ＶＭＫ細胞系、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞系、ＨＣＴ－８細胞系、Ｈｕｈ－７細胞系またはＣａｃｏ２細胞系のうちのいずれか１種を含む哺乳動物細胞系が含まれ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系またはＡ５４９細胞系のうちのいずれか１種であることが好ましく、
好ましくは、前記デグロン含有組換えウイルスは、調製過程においてタンパク質分解系阻害剤が添加され、
好ましくは、前記タンパク質分解系阻害剤には、ＭＧ１３２、ＭＧ－３４１またはラクタシスチンのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むプロテアソーム阻害剤が含まれる、調製方法。

【請求項9】

前記調製方法はさらに、前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出するステップを含み、
好ましくは、前記調製方法はさらに、大規模に生産するステップを含み、
好ましくは、前記調製方法は、
タンパク質分解系欠損の哺乳動物細胞系を構築するステップ（１）であって、
遺伝子編集技術により、細胞系におけるタンパク質分解系のキー要素をノックアウトするステップ（１）と、
デグロンを導入したウイルスタンパク質、および前記デグロンの種類、数、および導入サイトを確定し、ウイルスタンパク質のコード遺伝子にデグロンをコードするヌクレオチド配列を導入して、組換えウイルス配列を得るステップ（２）と、
組換えベクターを構築するステップ（３）であって、
ステップ（２）における組換えウイルス配列とプラスミドを連結させて、前記組換えベクターを得るステップ（３）と、
組換えベクターを前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得るステップ（４）であって、
逆遺伝学技術により、ステップ（３）における組換えベクターとウイルスレスキュープラスミドを、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に共トランスフェクトし、タンパク質分解系阻害剤を添加し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得るステップ（４）と、
前記タンパク質分解系欠損の細胞系および修飾されていない細胞系における前記デグロン含有組換えウイルスの複製能、安全性および免疫原性を検出し、大規模に生産するステップと、を含む、請求項８に記載の調製方法。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスの調製システムであって、
タンパク質分解系欠損の細胞系、組換えベクターおよびウイルスレスキュープラスミドを含む、調製システム。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルス、核酸分子、組換えベクター、デグロン含有組換えウイルスの調製方法またはデグロン含有組換えウイルスの調製システムのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せの、ワクチン、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または医薬品の製造における使用であって、
そのうち、前記核酸分子は請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスをコードし、
そのうち、前記組換えベクターは前記核酸分子を含み、
そのうち、前記デグロン含有組換えウイルスの調製方法は、タンパク質分解系欠損の細胞系を構築することと、
ウイルスタンパク質のコード遺伝子に、デグロンをコードするヌクレオチド配列を導入することと、
前記組換えベクターを構築し、前記タンパク質分解系欠損の細胞系に導入し、パッケージングして前記デグロン含有組換えウイルスを得ることと、を含み、
そのうち、前記デグロン含有組換えウイルスの調製システムは、タンパク質分解系欠損の細胞系、組換えベクターおよびウイルスレスキュープラスミドを含む。

【請求項12】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含むワクチンであって、
好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能のない生ワクチン、複製制御可能生ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスワクチンのうちのいずれか１種を含み、
好ましくは、前記ワクチンはさらに、アジュバントおよび補助材料を含む、ワクチン。

【請求項13】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む、腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項14】

請求項１～５のいずれか一項に記載のデグロン含有組換えウイルスを含む医薬品であって、
好ましくは、前記医薬品はさらに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、医薬品。

【国際調査報告】