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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】発現量が増加した改変型ＨＬＡ－Ｂ５７
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20240725BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240725BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240725BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240725BHJP
C07K 14/74 20060101ALI20240725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240725BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240725BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240725BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240725BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240725BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C
C07K19/00 ZNA
C12N15/12
C12N15/62 Z
C07K16/00
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K14/74
A61P35/00
A61P1/00
A61P11/00
A61P35/02
A61P7/00
A61K47/64
A61K39/395 E
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K45/00
A61K39/395 U
A61K38/17 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507935
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-02
(86)【国際出願番号】 EP2022072131
(87)【国際公開番号】W WO2023012348
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21190004.8
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21190005.5
(32)【優先日】2021-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21207324.1
(32)【優先日】2021-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524048807
【氏名又は名称】イムノス セラピューティクス アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】マロカン ベラウンザラン，オシリス
(72)【発明者】
【氏名】レナー，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ヴォクト，ローレンツ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG31
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076CC14
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC27
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA41
4C084DC50
4C084NA05
4C084ZA51
4C084ZA59
4C084ZA66
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB36
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA86
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を得る方法を提供し、前記融合タンパク質は、高められた安定性及び発現を付与する少なくとも１個又は２個のアミノ酸置換を有する変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。本発明はまた、がんなどの医学的症状の治療に使用するための、単離されたＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質、又は前記ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質をコードするベクター、又は核酸を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドに１個又は２個のアミノ酸置換を導入することによって得られるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、ａ． ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｉ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドが４６位のグルタミン酸（Ｅ）及び９７位のアルギニン（Ｒ）を特徴とするＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドである、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｉｉ． 免疫グロブリン（Ｉｇ）断片結晶化可能領域（Ｆｃ）ポリペプチド、特にアイソタイプＧ Ｉｇ（ＩｇＧ）Ｆｃ、より特にアイソタイプ４ ＩｇＧ（ＩｇＧ４）Ｆｃ；
を含む、前記核酸配列、及び
ｂ． β２－ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質をコードする核酸配列；
を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、導入することであって、
ここでそれぞれの核酸配列は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下にあることと、
次いで、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列とβ２ｍタンパク質をコードする核酸配列とが発現する条件下で細胞を培養して、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供することと、
を含む、前記方法。
【請求項2】
ＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法であって、以下の工程：ａ． アミノ酸置換工程において、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドにおいて４６位のアミノ酸をＥで置換し、及び／又は９７位のアミノ酸をＲで置換することにより、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供する工程；及び
ｂ． 発現工程において：
ｉ． 前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ Ｆｃポリペプチドとを含むＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｉｉ． β２ｍタンパク質、
をコードする核酸配列を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、導入する工程であって、
ここで両方の核酸配列は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下にあり、これによりＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供する、前記工程
を含む、前記方法。
【請求項3】
天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドは：ｉ． ４６位のＡ、及び
ｉｉ． ９７位のＶ；
を特徴とし、
特に変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ＨＬＡ融合タンパク質は：ａ． 請求項１～３のいずれか１項に規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
ｃ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間に切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号０１９の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
単離されたＨＬＡ融合タンパク質であって：ａ．変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドの変異体であり；かつ
－ ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、
前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｂ．Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、さらにより特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
を含む、前記単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【請求項6】
－ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなり；及び／又は－ Ｉｇ Ｆｃポリペプチドは、配列番号００４の配列を含む、又は本質的にそれからなり、かつ
－ 任意に、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇ Ｆｃポリペプチドとは、ペプチドリンカーによって結合され、特にペプチドリンカーは５～２０アミノ酸長であり、より特にペプチドリンカーは配列番号００３の配列を含む、又は本質的にそれからなる、
請求項５に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【請求項7】
ＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５と指定される配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法、又は請求項５若しくは６に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【請求項8】
単離されたＨＬＡは、第１の単量体及び第２の単量体を含む二量体の形態であり、かつ－ 前記第１の単量体は、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；かつ
－ 前記第２の単量体は、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；
－ 特に、前記第１の単量体と第２の単量体とは同一である、
請求項５～７のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ。
【請求項9】
前記ＨＬＡ融合タンパク質は、前記天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドを含む等価なＨＬＡ融合タンパク質と比較して、ＬＩＬＲＢ２への結合が改善されている、請求項１～４、又は７のいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法、又は請求項５～８のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【請求項10】
ＨＬＡ融合タンパク質はペプチドエピトープと会合していない、請求項１～４、７、又は９のいずれか１項に記載の方法、又は請求項５～９のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【請求項11】
請求項５～１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質をコードする単離された核酸、特に配列番号０１６の配列を含む単離された核酸、特に配列番号００６の配列を含む、又は本質的にそれからなる単離された核酸。
【請求項12】
細胞において、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞において、作動可能なプロモーター配列の制御下にある、請求項１１に記載の核酸を含む核酸発現ベクター。
【請求項13】
請求項５～１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、又は請求項１１に記載の単離された核酸、又は請求項１２に記載のベクター、を含む細胞。
【請求項14】
請求項１～４、７、９、又は１０のいずれか１項に規定される方法から得られるＨＬＡ融合タンパク質、請求項５～１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、請求項１１に記載の核酸、又は請求項１２に記載の核酸発現ベクター、を含む悪性新生物疾患の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項15】
悪性新生物疾患は結腸がん又は肺がんである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
悪性新生物疾患は、血液がん、特に白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項17】
－ 医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に、投与され、－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数（高い親和性）で結合可能であり、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害剤は、全身投与用の剤形で提供される、
請求項１４～１６のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項18】
悪性新生物疾患の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤であって、チェックポイント阻害剤は、請求項１～４、７、９、又は１０のいずれか１項に記載の方法から得られるＨＬＡ融合タンパク質、請求項５～１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、請求項１１に記載の核酸、又は請求項１２に記載の核酸発現ベクター、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物、と組み合わせて投与され、－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数（高い親和性）で結合可能であり、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害剤は、全身投与用の剤形で提供される、
前記チェックポイント阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２０２１年８月５日に出願された欧州出願（ＥＰ）第２１１９０００４．８号及び欧州出願（ＥＰ）第２１１９０００５．５号、並びに２０２１年１１月９日に出願された欧州出願（ＥＰ）第２１２０７３２４．１号による優先権を主張する。
【0002】
本発明は、医薬品を製造する目的で、哺乳動物細胞株からの発現を増加させるＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの改変に関する。
【背景技術】
【0003】
古典的なＭＨＣ－Ｉ分子（ヒトではＨＬＡ－Ｉとしても知られている）は、３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）を持つ膜結合型重鎖が、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）軽鎖と、任意にペプチド結合クレフトに会合している小さなペプチドと、非共有結合的に結合してなる、二量体又は三量体構造である。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子は、β２ｍを欠く遊離重鎖に解離することもある（Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３）。
【0004】
本発明者らは以前に、ＨＩＶ感染における特定の免疫相関に関連するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖を、有望な免疫調節医薬品として同定した（国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）参照）。単離されたＨＬＡ－Ｂ５７重鎖融合分子を得るためには、まずＨＬＡ重鎖をβ２ｍと共発現させなければならない。一旦上清から精製されると、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体は分離することができ、単離されたＨＬＡ鎖は精製され、リフォールディングに供される。しかし、β２ｍ－非会合ＨＬＡ－Ｂ５７は、望ましい免疫調節資質を持つ一方で、工業的な生産量への製造のスケールアップには課題がある。ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は溶液中でオリゴマー及び凝集体を形成するため、細胞生存率が低下し、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体及び誘導され単離された２ｍ－非会合ＨＬＡ重鎖融合タンパク質の両方の収量が低くなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の技術状態に基づき、本発明の目的は、高収率組換えタンパク質発現に適し、所望の免疫調節特性を特徴とする、薬学的に活性なＨＬＡ－Ｂ５７重鎖を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、本明細書の従属請求項、実施例、図及び一般的説明に記載されたさらに有利な実施形態を伴う。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、β２ｍ結合パートナーなしのＨＬＡ－Ｂ５７：０１のトポロジー構造を示す。変異した残基Ａ４６ＥとＶ９７Ｒとは球形として強調表示されている。細胞外ドメインの３つのアルファドメイン（α１、α２、α３）は、表示した異なるグレーの色調で色分けされている。
【図2】図２は、多様なＨＬＡ分子（ＨＬＡ－Ｂ５７：０１：配列番号００１；ＨＬＡ－Ｂ２７：０５：配列番号００７；ＨＬＡ－Ｂ２７：０６：配列番号００８；ＨＬＡ－Ｂ５８：０１：配列番号００９；ＨＬＡ－ＣＷ０８：配列番号０１０；ＨＬＡ－ＣＷ１４：配列番号０１１）の細胞外ドメインに存在するグルタミン酸（Ｅ）及びアルギニン（Ｒ）アミノ酸が、ＣＨＯシステムでの一過性トランスフェクションを用いた発現の増加と相関していることを示している。ＨＬＡ－Ｂ５７のＡ４６ＥとＶ９７Ｒのアミノ酸置換が強調表示されている。
【図3】図３は、細胞生存率（Ａ）及び発現タンパク質力価（Ｂ）に基づくＨＬＡ Ｂ５７．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ３９、ＤＧＣ８－Ｔ６４、及びＤＧＣ８－７３）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ（ＤＧＣ８－Ｔ５４、ＤＧＣ８－Ｔ７５、及びＤＧＣ８－９１）の発現細胞クローンの選択を示す。結果は、非変異型ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ細胞の生存率及び力価は、すべてのクローンにおいてＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍより有意に低いことを示す。
【図6-1】図６は、３段階で精製したＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。ＣＨＯ上清（Ａ）からアフィニティー精製（Ｂ）の２つの方法に分枝する。β２ｍ非会合コンフォーマーの精製は、β２ｍ除去のための追加工程を経てからＳＥＣで行われ（Ｃ）、β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７の精製は直接ＳＥＣで行われる（Ｄ）。結果は、ＨＬＡ－Ｂ５７のβ２ｍ非会合コンフォーマーは、両方の構築物から精製できることが示された。ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍには多量の高分子量（ＨＭＷ）種、及び低分子量種（ＬＭＷ）もまた有し、単量体含有量の減少を伴うが、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍではＨＭＷ、ＬＷＭの減少、及び単量体の高含有を有する。
【図6-2】図６は、３段階で精製したＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。ＣＨＯ上清（Ａ）からアフィニティー精製（Ｂ）の２つの方法に分枝する。β２ｍ非会合コンフォーマーの精製は、β２ｍ除去のための追加工程を経てからＳＥＣで行われ（Ｃ）、β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７の精製は直接ＳＥＣで行われる（Ｄ）。結果は、ＨＬＡ－Ｂ５７のβ２ｍ非会合コンフォーマーは、両方の構築物から精製できることが示された。ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍには多量の高分子量（ＨＭＷ）種、及び低分子量種（ＬＭＷ）もまた有し、単量体含有量の減少を伴うが、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍではＨＭＷ、ＬＷＭの減少、及び単量体の高含有を有する。
【図8】図８は、ＨＬＡ－Ｂ５７のアミノ酸置換がＬＩＬＲＢ２との結合を増加させることを示す。ＥＬＩＳＡ法によるＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏ β２ｍ、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏ β２ｍとの結合親和性の定量的推定。ここで、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏ β２ｍのＥＣ５０は２１ｎＭであり、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏ β２ｍのＥＣ５０は８．３ｎＭである。
【図9】図９は、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏ β２ｍとＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏ β２ｍがＴ細胞の殺傷能力を高めることを示す。Ｔ細胞を化合物で治療したＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞とＥ：Ｔ（エフェクター細胞：Ｔ細胞）１：１の比率で細胞接触的にインキュベートした。（Ａ）プレーティング後７日目に撮影した代表的な細胞ペレット。（Ｂ）フローサイトメトリーを使用して測定した、漸増されるＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏβ２ｍ又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍ及びコントロールによる刺激後５日目の共培養から得られたがん細胞の数。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、多重比較補正あり）。
【図10】図１０は、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏβ２ｍとＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍとが、貪食能の増強を伴うＭ１表現型へのマクロファージの極性化を誘導することを示す。ヒト初代単球を単離し、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏβ２ｍ若しくはＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍの化合物又はコントロールとインキュベートし、６～７日後にフローサイトメトリーを用いてＭ１及びＭ２マクロファージのマーカーを評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、多重比較補正あり）。
【図11-1】図１１は、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏβ２ｍとＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍとはマクロファージによるがん細胞の貪食を誘導する。複数のがん細胞株（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞白血病、Ａ５４９肺がん、ＨＣＴ－１１６結腸がん）を、化合物で６～７日間、前治療したマクロファージとインキュベートし、共培養１６時間後にフローサイトメトリーを用いて貪食を評価した。（Ａ）コントロールと比較した、ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏβ２ｍ又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍで治療したがん細胞の貪食を示す代表的フローサイトメトリーブロット。
【図11-2】（Ｂ）貪食の割合。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、多重比較補正あり）。
【発明を実施するための形態】
【0010】
発明の概要
本発明の第１の態様は、有利な製造及び免疫調節資質を特徴とする、ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を得る方法に関する。この方法は、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインに少なくとも１個、又は２個のアミノ酸置換を導入することを含む。得られた変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを安定化ポリペプチドに結合させて、細胞培養で高発現する改変型変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を得る。本発明によって天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド配列で同定される重要なアミノ酸残基は、４６位のアラニン（Ａ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換、及び／又は９７位のバリン（Ｖ）又はトリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換である。本明細書で言及する前記及び任意の他のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの位置番号は、天然に存在する全長ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインが始まるグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）モチーフを、それぞれ１位、２位及び３位に割り当てることによって順次定義される。
本発明の第１の態様は、有利な製造及び免疫調節資質を特徴とする、ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を得る方法に関する。この方法は、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインに少なくとも１個、又は２個のアミノ酸置換を導入することを含む。得られた変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを安定化ポリペプチドに結合させて、細胞培養で高発現する改変型変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を得る。本発明によって天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド配列で同定される重要なアミノ酸残基は、４６位のアラニン（Ａ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換、及び／又は９７位のバリン（Ｖ）又はトリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換である。本明細書で言及する前記及び任意の他のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの位置番号は、天然に存在する全長ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインが始まるグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）モチーフを、それぞれ１位、２位及び３位に割り当てることによって順次定義される。
【0011】
本発明の別の態様は、上記のとおり天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７アミノ酸配列の細胞外ドメインに基づくが、天然に存在する配列とは同様でなく、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とし、ＩｇＧ Ｆｃ部分に連結されている変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む、単離されたＨＬＡ融合タンパク質である。
【0012】
本発明のさらなる態様は、悪性新生物疾患を治療する目的で医薬として使用するための、上記で規定される単離されたＨＬＡ融合タンパク質、又は前記ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸、又は核酸発現ベクターを含む医薬組成物に関する。本発明による医薬組成物は、本発明の化合物の少なくとも１つと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む。
【0013】
用語と定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
【0014】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。このように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその類似の形態、並びにその文法的同等な用語は、「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「それからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図及び理解される。
【0015】
値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載の値若しくは介在値は、記載の範囲の具体的に除外される制限を受けて本開示内に包含されると理解される。記載の範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。
【0016】
本明細書において、値又はパラメーターの「約（ａｂｏｕｔ）」という言及は、その値又はパラメーターそれ自体に向けられる変動を含む（及び記述する）。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）Ｘ」と言及する記述には、「Ｘ」という記述も含まれる。
【0017】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ｏｒ（又は）」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。
【0018】
本明細書で使用される「及び／又は」は、指定された２つの特徴又は構成要素の各々を、他方の特徴又は構成要素と共に、又は他方の特徴又は構成要素なしに、具体的に記載したものとみなされる。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの表現で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ（単独）」、及び「Ｂ（単独）」を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの表現で使用される「及び／又は」という用語は、以下の各態様を包含することを意図している：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
【0019】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準的な手法が、分子学的、遺伝学的及び生化学的手法（一般に以下を参照。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法に用いられる。
【0020】
本明細書の文脈における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続されている直鎖を形成する５０以上のアミノ酸からなる分子を指す。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に見出される）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表すこともある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として本明細書に開示される。
【0021】
アミノ酸残基の配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ記載される。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編．ｐ．２１）。アミノ酸配列の位置を示す小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を意味する。配列はアミノ末端からカルボキシ末端に向かって左から右に記載される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基の配列は、以下のように３文字又は１文字のコードのいずれかで表記される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【0022】
「遺伝子発現」又は「発現」という用語、或いは「遺伝子産物」という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成又はペプチド若しくはポリペプチドの生成のプロセス－及びその産物－のいずれか、又は両方を指す場合があり、それぞれ転写及び翻訳とも呼ばれ、又は遺伝情報の処理を調節してポリペプチド産物をもたらす中間プロセスのいずれかを指す。「遺伝子発現」という用語はまた、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば調節ＲＮＡ又は構造的（例えば、リボソーム）ＲＮＡの転写及びプロセシングにも適用される。発現ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。発現は、転写及び翻訳、すなわち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の両方のレベルで評価することができる。
【0023】
本明細書の文脈における「核酸発現ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルスゲノム、又はＲＮＡに関し、これらは、目的の特定の遺伝子を標的細胞にトランスフェクト（プラスミド又はＲＮＡの場合）又は形質導入（ウイルスゲノムの場合）するため、或いは－トランスフェクトされるＲＮＡ構築物の場合－トランスフェクトされたｍＲＮＡから対応する目的のタンパク質を翻訳するために使用される。転写とそれに続く翻訳のレベルで作動するベクターの場合、目的の遺伝子はプロモーター配列の制御下にあり、プロモーター配列は標的細胞内で作動可能であるため、目的の遺伝子は構成的に、或いは刺激に応答して、或いは細胞の状態に依存して転写される。特定の実施形態では、ウイルスゲノムはカプシドに封入され、ウイルスベクターとなり、標的細胞を形質導入することができる。
【0024】
本明細書の文脈において、「配列同一性」及び「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、整列される２つの配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメーターを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較用の配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。
【0025】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：期待閾値：３；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大マッチ：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）。核酸配列の比較のそのような一例として、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがある：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；ククエリ範囲内の最大マッチ：０；マッチ／ミスマッチスコア：１．－２；ギャップコスト：Ｌｉｎｅａｒ。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、それぞれタンパク質及び核酸の比較のために上記で特定されるデフォルトパラメータを使用して得られた値を指す。
【0026】
パーセンテージを指定しない同一配列への言及は、１００％同一配列（すなわち同じ配列）の意味を含む。
【0027】
本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、本発明によるするＨＬＡ融合タンパク質を指す。特定の実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、局所投与、非経口投与、又は注射投与に適した形態で提供される。
【0028】
本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に知られているように、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、色素など、及びその組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。
【0029】
本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）の「治療する」又は「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を緩和すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、阻止するか、又は軽減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、患者が識別できない可能性のあるものも含めて、少なくとも１つの身体的パラメーターを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」とは、身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下の本明細書で特に説明しない限り、当技術分野で一般的に知られている。
【0030】
本明細書の文脈において、「ペプチドリンカー」又は「アミノ酸リンカー」という用語は、一本鎖のポリペプチドを生成するために２つのポリペプチドを接続するために使用される可変長のポリペプチドを意味する。本明細書で規定する本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、実施例においてＨＬＡ融合タンパク質を提供するために変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを安定化ペプチドと連結するために使用される、柔軟でグリシンに富むペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号００３）である。
【0031】
本明細書の文脈における「ヒト白血球抗原」、「ＨＬＡ」、「ＨＬＡ重鎖」、又は「ＨＬＡアルファ鎖」という用語は、第６染色体上のクラスＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原遺伝子ファミリーによってコードされるタンパク質のファミリーに関する。ＨＬＡ重鎖は単量体であることが可能であり、又はβ２ｍ軽鎖と非共有結合的に結合した３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）を有する重鎖を含む二量体構造の一部を形成することが可能であり、又は任意に、ペプチド結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）に低分子ペプチドが会合した三量体構造を形成することが可能である。
【0032】
「天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７（ＨＬＡ－Ｂ＊５７、Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｂ５７、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド）」という用語は、特に、多数の類似タンパク質をコードする遺伝子のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂ５７サブファミリーの産物を指す。ＨＬＡ－Ｂ５７ファミリーは現在、特有の核酸配列を持つ２２１の既知のアレル（ａｌｌｅｌｅ）と、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１～ＨＬＡ－Ｂ＊５７：１４１と番号付けされた数十の特有のタンパク質配列を包含する（これらの配列は既知であり、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所免疫多型データベース、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ．ら，２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ１２３４，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌによって提供されるＭＧＴ／ＨＬＡアレルクエリフォームに検索語「Ｂ＊５７」を入力することによって検索することができる）。全長の「天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７」は、α１、α２及びα３ドメインを含む細胞外ドメイン、連結ペプチド領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ＨＬＡ重鎖ポリペプチド配列に関する本明細書の文脈における「変異体（変異型）」という用語は、天然に存在するＨＬＡポリペプチド配列と異なる少なくとも１つのアミノ酸残基を有するポリペプチドを指す。例えば、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、由来する本来の天然に存在するヒトタンパク質配列とは異なるように、１個又は複数個のアミノ酸置換が導入されている。
【0033】
本明細書の文脈において、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに適用される「細胞外ドメイン」という用語は、少なくともα１、α２、及びα３ドメインを含むＨＬＡ－Ｂ５７重鎖タンパク質の細胞外部分を指す。
【0034】
本明細書の文脈において、「ＨＬＡ融合タンパク質」又は「ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質」という用語は、野生型又は変異型のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドが、安定化Ｆｃポリペプチドドメインに、任意にペプチドリンカーによって、結合されてなる、又は本質的にそれからなる、ポリペプチドを指す。本発明に係る「ＨＬＡ融合タンパク質は、本明細書中で規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含み、本明細書の実施例においてＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）と呼ばれることもある。この用語には、細胞培養から分泌されるβ２－ミクログロブリンポリペプチドと複合化しているＨＬＡ融合タンパク質とβ２－ミクログロブリンから分離されている精製したＨＬＡ融合タンパク質の両方を包含する。「ＨＬＡ融合タンパク質」という用語には、安定化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに結合した単一のＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む単量体形態、又は第１のＨＬＡ融合タンパク質単量体と第２のＨＬＡ融合タンパク質単量体が、例えばＩｇ Ｆｃドメインの会合を介して会合することにより形成される二量体の両方を包含する。
【0035】
本明細書の文脈において、「β２－ミクログロブリンタンパク質（β２ｍタンパク質、β２ｍ、Ｂ２ｍ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ軽鎖）」という用語は、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体のベータ（β）鎖を指し、軽鎖としても知られている。「β２－ミクログロブリンタンパク質」という用語は、第１に、分泌シグナル、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６１７６９の配列、又は配列番号０１４の配列を含む処理前のβ２－ミクログロブリンタンパク質を包含し、第２に、ポリペプチドが細胞から輸送される際にタンパク質の分泌シグナル部分が切断によって除去されているタンパク質の分泌後形態を包含する。
【0036】
本明細書の文脈において、「β２ｍ非会合」ＨＬＡ重鎖という用語は、本発明によるβ２ｍ分子との会合を欠くＨＬＡ重鎖分子、特にＨＬＡ融合タンパク質を指す。本明細書で使用される組換えタンパク質製造プロセスによりＨＬＡ融合タンパク質のβ２ｍ－非会合ＨＬＡ重鎖を得るには、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含む分子を哺乳動物細胞内でβ２ｍタンパク質と共に発現させ、ＨＬＡ：β２ｍ複合体が得られる。β２ｍの存在は、化合物の後に続く接尾辞「．β２ｍ」によって示される場合もある。次いで、β２ｍを酸性条件下で分離した後に、β２ｍ遊離ＨＬＡ融合タンパク質をサイズ排除法によって精製する。本明細書の文脈において、「ＨＬＡ－Ｂ５７非β２ｍ（ＨＬＡ－Ｂ５７．ｎｏ β２ｍ）」又は「ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．ｎｏ β２ｍ」という用語は、それぞれＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結された非変異型、及び変異型のＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含むＨＬＡ融合タンパク質を指し（ここで（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）は、本発明による変異型ＨＬＡポリペプチドの存在を示す）、これはβ２ｍタンパク質から分離されている。
【0037】
本明細書の文脈において、「分泌シグナル」、「分泌シグナルペプチド」又は「シグナル配列」という用語は、ポリペプチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を開始するＮ末端リーダー配列を指し、通常、約６～３０アミノ酸長である。まれに、分泌シグナルがポリペプチドのＣ末端に配置されることがある。分泌シグナルは、標的化シグナル、局在化シグナル、トランジットペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドと呼ばれることもある。細胞からのポリペプチドの効率的な分泌を可能にする分泌シグナルは当技術分野でよく知られており、細胞に基づくポリペプチド製造システムにおいてポリペプチドの上清への排出を促進し、細胞上清からポリペプチドを精製できるようにするために、組換えタンパク質のＯＲＦに含めることができる。分泌シグナルをコードするｍＲＮＡが翻訳されると、ｍＲＮＡ－リボソーム複合体の小胞体（ＥＲ）内のチャネルタンパク質への移行を媒介する細胞質タンパク質によって認識される。分泌シグナルペプチドを含む新しく合成されたポリペプチドは、チャネルタンパク質を介して小胞体内腔に移行し、細胞の分泌経路に入る。本発明に係る特有の使用のシグナル配列は、翻訳後に最終ポリペプチド産物から切断されるものであり、例えば配列番号０１９のような例で使用されるもの、又は配列番号０２０内に含まれるものである。
【0038】
本明細書の文脈では、「抗体」という用語は、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）、その任意の抗原－結合断片又は単鎖、及び関連若しくは由来構築物を含むがこれに限定されない全抗体に関する。全抗体とは、ジスルフィド結合で相互に連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。ＩｇＧの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分を含み、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。同様に、この用語は、いわゆるナノボディ又は単一のドメイン抗体、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を包含する。
【0039】
本明細書の文脈において、「免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）領域」又は「Ｉｇ Ｆｃ」という用語は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される抗体若しくは免疫グロブリン（Ｉｇ）の画分を指す。Ｉｇ Ｆｃは、単量体、又はジスルフィド結合によって共有結合した２つのＩｇ Ｆｃからなる二量体の両方を含む。本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の文脈において、ジスルフィド結合は、それぞれがＩｇ Ｆｃドメインを含む２つのＨＬＡ融合タンパク質分子を結合し得る。ＨＬＡ融合タンパク質にＩｇ Ｆｃが存在することで、溶解度、安定性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）、半減期を向上し、技術的な観点からは、哺乳動物系でのコスト効率の良い生産及び精製（プロテインＡ又はＧ精製）が容易になる。
【0040】
本明細書の文脈での「抗体様分子」という用語は、別の分子又は標的に高い親和性／Ｋｄ≦１０Ｅ－８ｍｏｌ／ｌで特異的に結合できる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的な結合と同様にその標的に結合する。「抗体様分子」という用語には、リピートタンパク質を包含し、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｚuｒｉｃｈ）、高特異性及び高親和性の標的タンパク質結合を示す改変抗体模倣タンパク質（米国特許出願公開第２０１２１４２６１１、米国特許出願公開第２０１６２５０３４１、米国特許出願公開第２０１６０７５７６７及び米国特許出願公開第２０１５３６８３０２を参照。これらすべては参照により本書に組み込まれる）などがある。抗体様分子という用語は、さらに、アルマジロリピートタンパク質由来のポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質由来のポリペプチド、及びテトラトリコペプチドリピートタンパク質由来のポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。抗体様分子という用語は、さらに、プロテインＡドメイン、フィブロネクチンドメインＦＮ３、コンセンサスフィブロネクチンドメイン、リポカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０００，１４８２（１－２）：３３７－５０参照）、ジンクフィンガータンパク質由来のポリペプチド（Ｋｗａｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２００３，１１（７）：８０３－８１３参照）、Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２）若しくはＳｒｃホモロジードメイン３（ＳＨ３）、ＰＤＺドメイン、ガンマクリスタリン、ユビキチン、システインノットポリペプチド若しくはノッティン、シスタチン、Ｓａｃ７ｄ、三重らせんコイルドコイル（アルファ体としても知られている）、クニッツドメイン若しくはクニッツ型プロテアーゼ阻害剤、及び糖結合モジュール３２－２に由来する、特異的結合性ポリペプチドを包含する。
【0041】
「アルマジロリピートタンパク質」という用語は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する一対のアルファヘリックスによって特徴づけられるものである。
【0042】
本明細書の文脈における「ヒト化ラクダ抗体」という用語は、重鎖又は重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）のみからなり、かつそのアミノ酸配列はヒトで自然に産生される抗体との類似性が増大するように改変され、その結果、ヒトに投与した場合に免疫原性の低下を示す抗体を指す。ラクダ抗体をヒト化するための一般的な戦略は、以下に示されている：Ｖｉｎｃｋｅら、「Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ ａ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９年１月３０日；２８４（５）：３２７３－３２８４、及び米国特許出願公開第２０１１１６５６２１。
【0043】
本明細書において、「チェックポイント阻害剤」という用語は、免疫チェックポイント機構として当該技術分野で知られている、免疫細胞の活性化、及び特にＴ細胞の活性化、を制限する阻害性シグナル伝達カスケードを破壊することができるがん免疫療法剤、特に「チェックポイント阻害抗体」又は「抗体様分子」、例えば、抗体断片、ダイアボディ、単鎖可変抗体断片を包含する。「チェックポイント阻害剤」の例としては、例えば、ＣＴＬＡ－４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４１０）、ＰＤ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６）、ＰＤ－Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＺＰＲ３）、ＶＩＳＴＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ７Ｍ９）、ＴＩＧＩＴ（ＵｎｉｐｒｏｔＱ４９５Ａ１）、又はＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＴＤＱ０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１）、ＣＤ４０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０９ＬＬ４）、ＣＤ２７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６８４１）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＵｎｉｐｒｏｔＰ４３４８９）、ＮＫＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６７１５）、ＣＤ８６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４２０８１）、ＣＤ８０（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３３６８１）、又はＬＡＧ－３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８６２７）、に特異的に結合する抗体、抗体様分子、又は天然リガンドレセプターが挙げられる。
【0044】
「がん」及び「悪性新生物疾患」という用語は、本明細書では同義に用いられる。本明細書に開示された態様及び実施形態のいずれかの特定の代替物は、固形腫瘍の治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。本明細書に開示される態様及び実施形態のいずれかの他の代替物は、骨髄性白血病又は顆粒球性白血病、特にＡＭＬ、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、又はリンパ芽球性白血病及びリンパ腫、真性多血症又は赤血球減少症などの液体がんの治療における本発明の組み合わせの使用に向けられる。
【0045】
本発明の詳細な説明
ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質の改良された製造方法
本発明の第１の態様は、改良された哺乳動物細胞システム発現特性を有するＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を製造するための方法に関し、前記ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質は、安定化ポリペプチドに結合した変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。この方法は、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインの特定のアミノ酸を改変し、所望の免疫調節資質を保持しながら、安定性が向上し、溶液中で凝集体を形成する傾向が少なく、発現力価が高いため製造が容易な変異体を提供するものである。
ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質の改良された製造方法
本発明の第１の態様は、改良された哺乳動物細胞システム発現特性を有するＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を製造するための方法に関し、前記ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質は、安定化ポリペプチドに結合した変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。この方法は、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインの特定のアミノ酸を改変し、所望の免疫調節資質を保持しながら、安定性が向上し、溶液中で凝集体を形成する傾向が少なく、発現力価が高いため製造が容易な変異体を提供するものである。
【0046】
いくつかの実施形態において、本発明のこの態様による方法は、細胞に、安定化ポリペプチドに融合した天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むポリペプチドをコードする核酸配列を導入することを含み、ここで、前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチド（ただし、それが由来する天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドではない）は、４６位のグルタミン酸（Ｅ）を特徴とする。本発明によるアミノ酸位置の番号付けは、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの最初のグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）モチーフをそれぞれ１位、２位、３位に割り当てることによって順次定義される。言い換えれば、分泌シグナルペプチドはこの番号付けに含まれない。
【0047】
いくつかの実施形態において、本発明のこの態様による方法は、安定化ポリペプチドに融合した天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入することを含む。この実施形態によれば、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチド（ただし、それが由来する天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドではない）は、９７位のアルギニン（Ｒ）を特徴とする。
【0048】
本発明による方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列は：
－ 全長の細胞外ドメインを含み、かつ
－ ４６位のＥ、及び／又は９７位のＲを特徴としない、
任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外部分と同一である変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをコードする。
－ 全長の細胞外ドメインを含み、かつ
－ ４６位のＥ、及び／又は９７位のＲを特徴としない、
任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外部分と同一である変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをコードする。
【0049】
本発明の別の態様は、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供するために、第１の工程として、任意の天然に存在する全長ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインにアミノ酸置換を導入することを含む、ＨＬＡ融合タンパク質の製造方法である。これは、ＨＬＡ－Ｂ５７の配列によっては、４６位のＥをコードするアミノ酸置換（Ａ４６Ｅ）、及び／又は９７位のＲをコードするアミノ酸置換（Ｖ９７Ｒ又はＷ９７Ｒ）を導入することを伴う。本発明のこの態様に従う方法は、安定化ポリペプチドに結合した前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含むＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入する、第２の工程を含む。
【0050】
本発明の第１の態様、又は第２の態様に従うＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法は、ＨＬＡ融合タンパク質の、ＨＬＡ．β２ｍとも呼ばれるＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体の形態での発現レベル及び分泌を増加させるために、β２ｍポリペプチド配列をコードする核酸を同じ細胞に導入することを含む。ＨＬＡ．β２ｍはさらに解離することができ、β２ｍを欠く単離されたＨＬＡ分子が得られる。本発明のこれらの態様による、ＨＬＡ融合タンパク質、及びβ２ｍポリペプチドをコードする核酸は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下にある。その後、ＨＬＡ－Ｂ５７とβ２ｍとをコードする核酸配列が発現する条件下で細胞を培養し、ＨＬＡ．β２ｍ複合体が得られる。本発明による方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、β２ｍ分子と３：５～７：５、より特に４：５～６：５のモル比で会合している。換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質及びβ２ｍポリペプチドは、１：１の比率、又はそれに近い比率で存在する。
【0051】
本発明の第１又は第２の態様の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに結合される安定化ポリペプチドは、Ｉｇ Ｆｃポリペプチドである。より特定の実施形態では、安定化ペプチドはＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである。なおより特定の実施形態では、安定化ペプチドはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである。さらにより特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである。本発明者らが実施可能と考える他の実施形態では、安定化ポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、又はヒト血清アルブミンなどのアルブミンポリペプチドである。本発明者らが実施可能と考える他の実施形態では、安定化ポリペプチドはＰＥＧ含有化合物である。
【0052】
本発明によるＨＬＡ重鎖融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、得られたＨＬＡ融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ’末端からＣ’末端に：
ｉ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、
ｉｉ． ５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に、配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、及び
ｉｉｉ．安定化ポリペプチド、
を含む。
ｉ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、
ｉｉ． ５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に、配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、及び
ｉｉｉ．安定化ポリペプチド、
を含む。
【0053】
本発明によるＨＬＡ重鎖融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列、及びβ２ｍ核酸配列は、単一の核酸ベクター分子上（例えば、単一のプラスミド上）に存在する。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列、及びβ２ｍ核酸配列は、異なる核酸ベクター分子上に存在する（例えば、２つの異なるプラスミドから発現される）。このような実施形態において、β２ｍの核酸配列を含む核酸ベクターに対するＨＬＡ融合タンパク質の核酸配列を含む核酸ベクターの最適な比率は、実施例の図３に示されるとおり、１以上２以下であり、特にモル比は１超過２未満である。
【0054】
上記で規定した本発明によるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のいくつかの実施形態において、該方法は以下のさらなる工程を含む：
ａ． β２ｍタンパク質と会合しているＨＬＡ融合タンパク質、換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体が、細胞の上清から精製される、精製工程；及び／又は
ｂ． 単離ＨＬＡ融合タンパク質が単離β２ｍタンパク質から分離するような条件下で、精製されたＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体が解離する、解離工程。
ａ． β２ｍタンパク質と会合しているＨＬＡ融合タンパク質、換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体が、細胞の上清から精製される、精製工程；及び／又は
ｂ． 単離ＨＬＡ融合タンパク質が単離β２ｍタンパク質から分離するような条件下で、精製されたＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体が解離する、解離工程。
【0055】
工程ａでは、β２ｍタンパク質と会合しているＨＬＡ融合タンパク質を提供し、工程ｂでは、β２ｍタンパク質から解離したＨＬＡ融合タンパク質、すなわち、図１２でｉｎ ｖｉｖｏでの投与時に腫瘍増殖に拮抗することが示されたβ２ｍが遊離したポリペプチド、を提供するであろう。実施例で提供されるデータは、本発明のこの態様による精製工程の一例を示しており、そこでは、β２ｍタンパク質（ＨＬＡ：β２ｍ又はＨＬＡ融合タンパク質：β２ｍタンパク質複合体とも呼ばれる）と会合している変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質を単離するために、ｐＨ ２．８のＩｇＧ溶出緩衝液を用いた最初の溶出の後の細胞上清からのＩｇＧ４ポリペプチドを含むＨＬＡ融合タンパク質を捕捉するためにプロテインＧセファロースが使用される。
【0056】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによる単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のいくつかの実施形態において、β２ｍ－非会合コンフォーマーを提供するために、さらなる解離工程が実施される。これは、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質：β２ｍタンパク質複合体を酸性条件、特にｐＨ ３程度にさらすことによって達成され得、サイズ排除クロマトグラフィーによってβ２ｍタンパク質からβ２ｍ－非会合コンフォーマーＨＬＡ融合タンパク質を分離することができる。本方法のいくつかの実施形態において、本方法は、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体からのβ２ｍの解離の後に、精製されたＨＬＡ融合タンパク質を生理的ｐＨにもたらし、タンパク質の正しいフォールディングを可能にする、脱塩工程をさらに含み得る。
【0057】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの塩基配列を形成するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの天然に存在する細胞外ドメインは、４６位のＡを特徴とする。この実施形態は、４６位が予め（既に）Ｅであるもの（例えば、ＨＬＡ－Ｂ５７：１６、ＨＬＡ－Ｂ５７：４５、ＨＬＡ－Ｂ５７：５１、又はＨＬＡ－Ｂ５７：６９）を除く、変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを作製するための出発点としてのいずれのＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の使用を包含する。言い換えれば、天然に存在する配列から変異型配列を得るために、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインの指示される部位に、少なくとも１つ（Ａ４６Ｅ）、場合によっては２つのアミノ酸置換（Ａ４６Ｅと、Ｖ９７Ｒ又はＷ９７Ｒのいずれかとの両方）が導入される。
【0058】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の別の実施形態では、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインは、９７位のＶを特徴とする。これは、９７位が予めＲであるもの（例えば、ＨＬＡ－Ｂ５７：０５、ＨＬＡ－Ｂ５７：８２、ＨＬＡ－Ｂ５７：８３、ＨＬＡ－Ｂ５７：１１８、又はＨＬＡ－Ｂ５７：１３１）、又は９７位がＷであるもの（ＨＬＡ－Ｂ５７：１１）を除く、いずれのＨＬＡ－Ｂ５７重鎖を包含する。これらの実施形態では、天然に存在する配列から変異型配列を得るために、少なくとも１つ（Ｖ９７Ｒ）、場合によっては２つのアミノ酸置換（Ｖ９７ＲとＡ４６Ｅの両方）が指示される部位に導入される。
【0059】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の他の実施形態では、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインは、４６位のＡと、９７位のＶ又はＷのいずれかとを特徴とする。言い換えれば、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ハプロタイプは、４６位が予めＥであるもの（例えば、ＨＬＡ－Ｂ５７：１６、ＨＬＡ－Ｂ５７：４５、ＨＬＡ－Ｂ５７：５１、ＨＬＡ－Ｂ５７：６９）、又は９７位が予めＲであるもの（例えば、ＨＬＡ－Ｂ５７：０５、ＨＬＡ－Ｂ５７：８２、ＨＬＡ－Ｂ５７：８３、ＨＬＡ－Ｂ５７：１１８、又はＨＬＡ－Ｂ５７：１３１）を除く、いずれのＨＬＡ－Ｂ５７重鎖であり得る。これらの実施形態では、天然に存在する配列から変異型配列を得るために、２つのアミノ酸置換、Ａ４６Ｅと、Ｖ９７Ｒ又はＷ９７Ｒのいずれかとを指示される部位に導入して変異型配列が得られる。
【0060】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、２つのアミノ酸置換Ａ４６Ｅ及びＶ９７Ｒは、４６位のＡ及び９７位のＶの両方を特徴とする任意のＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインの天然に存在するポリペプチド配列に導入される。この実施形態は、４６位が予めＥであるもの（例えば、ＨＬＡ－Ｂ５７：１６、ＨＬＡ－Ｂ５７：４５、ＨＬＡ－Ｂ５７：５１、又はＨＬＡ－Ｂ５７：６９）、又は９７位が予めＲであるもの（ＨＬＡ－Ｂ５７：０５、ＨＬＡ－Ｂ５７：８２、ＨＬＡ－Ｂ５７：８３、ＨＬＡ－Ｂ５７：１１８、ＨＬＡ－Ｂ５７：１３１）、又は９７位がＷであるもの（ＨＬＡ－Ｂ５７：１１）を除く、融合タンパク質の変異型ＨＬＡポリペプチドドメインを得るための出発点としてのいずれのＨＬＡ－Ｂ５７ハプロタイプの使用を包含する。
【0061】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のさらなる特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質の変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド部分は、配列番号００２の配列を含む。言い換えれば、本実施形態によるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法は、β２ｍタンパク質をコードする核酸、及びＨＬＡ融合タンパク質（ＩｇＧ４ Ｆｃ分子に結合した変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含むもの）をコードする核酸を細胞に導入することを含み、ここで、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲをコードするアミノ酸置換を除いて、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７：０１の配列番号００１の配列と同一である。この細胞を、両タンパク質の発現に適した条件下で培養し、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体が得られる。
【0062】
本発明の第１又は第２の態様のいずれかによるＨＬＡ融合タンパク質を得るための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号０１５の配列を含むポリペプチド配列をコードし、この融合タンパク質は、哺乳動物細胞からの分泌後に見出されるとおり、分泌シグナルを欠いている。ＨＬＡ融合タンパク質を得るための方法のより特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号００５、又は配列番号０２０の配列を含むＨＬＡ融合タンパク質ポリペプチド配列をコードし、ここで、ＨＬＡ融合ポリペプチド配列は、本発明者らが細胞からのＨＬＡ融合タンパク質の効率的な分泌を促進するために見出した２つの分泌シグナルのうちの１つが先行している。本方法のさらにより特定の実施形態において、核酸は、本質的に配列番号００５からなるＨＬＡポリペプチドをコードする。
【0063】
ＨＬＡ融合タンパク質を得る方法のいくつかの実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号０１６の配列を含み、好ましくは、これは分泌シグナル配列をコードする付加的な核酸を伴う。
【0064】
ＨＬＡ重鎖融合タンパク質を製造するための方法のさらなる特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列は分泌シグナルをコードする。これは、さらにより特定の実施形態では、コードされた変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド配列に対してＮ末端に位置する、１６～３０アミノ酸長の分泌シグナルをコードする。さらにより特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列によってコードされる分泌シグナルは、配列番号０１９の配列を有する。
【0065】
ＨＬＡ融合タンパク質を得るための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列は、ＨＬＡ融合タンパク質に先行する有用な分泌シグナルをコードする配列番号００６の配列を含む。ＨＬＡ融合タンパク質を得るための方法のより特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列は、本質的に配列番号００６の配列からなる。ＨＬＡ融合タンパク質の核酸配列によってコードされる分泌シグナルは、細胞から分泌される過程の間で切断によって除去される。
【0066】
上記で規定したＨＬＡ融合タンパク質を得るための方法のいずれか１つの態様のいくつかの実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質を産生する細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。実施例で示したとおりＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のより特定の実施形態では、組換え融合タンパク質産物を発現させるためにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が使用されるが、本発明者らは、昆虫細胞などの他の細胞の種類、又は特に他の哺乳動物細胞の種類が、本発明によるＨＬＡ融合タンパク質を適切に製造し得ると予測している。
【0067】
改良された高収率ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質
本発明の次の態様は、第１に、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメイン（変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの用語の定義に従って規定されるもの）から少なくとも１個又は２個のアミノ酸が異なる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む単離されたＨＬＡ融合タンパク質である。前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とし、ここで、アミノ酸残基は、細胞外アルファ１ドメインのＮ末端領域に位置するＧ、Ｓ、Ｈモチーフから番号付けされる（「変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド」の用語の定義において規定されるアミノ酸番号付けを使用する）。第２に、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は安定化ポリペプチド、例えばＩｇ Ｆｃを含む。特定の実施形態では、安定化ポリペプチドはＩｇＧ Ｆｃである。さらにより特定の実施形態では、安定化ペプチドはＩｇＧ４ Ｆｃである。さらにより特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号００４と指定されたポリペプチド配列を有する、所望の薬学的資質を有するＩｇＧ４ Ｆｃである。
本発明の次の態様は、第１に、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメイン（変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの用語の定義に従って規定されるもの）から少なくとも１個又は２個のアミノ酸が異なる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む単離されたＨＬＡ融合タンパク質である。前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とし、ここで、アミノ酸残基は、細胞外アルファ１ドメインのＮ末端領域に位置するＧ、Ｓ、Ｈモチーフから番号付けされる（「変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド」の用語の定義において規定されるアミノ酸番号付けを使用する）。第２に、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は安定化ポリペプチド、例えばＩｇ Ｆｃを含む。特定の実施形態では、安定化ポリペプチドはＩｇＧ Ｆｃである。さらにより特定の実施形態では、安定化ペプチドはＩｇＧ４ Ｆｃである。さらにより特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号００４と指定されたポリペプチド配列を有する、所望の薬学的資質を有するＩｇＧ４ Ｆｃである。
【0068】
本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、それは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とするように、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの細胞外部分に、「ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質の改良された製造方法」の項で規定された態様又は実施形態のいずれか１つによる方法に従ってアミノ酸置換を導入することによって得られる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。
【0069】
特定の実施形態において、本発明の単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００２の配列を含む変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。より特定の実施形態において、本発明の単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００２と指定される配列から本質的になる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む。
【0070】
本発明による単離されたＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質のさらなる特定の実施形態において、それは本質的に、ペプチドリンカーによって結合された変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド及び安定化ポリペプチドからなる。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、５～２０のアミノ酸長である。より特定の実施形態において、この結合性ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0071】
なおさらに特定の実施形態では、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５と指定される配列を含む。さらにより特定の実施形態では、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５と指定された配列を有するポリペプチドから本質的になる。
【0072】
単離されたＨＬＡ融合タンパク質の特定の実施形態において、それはβ２ｍ分子と３：５～７：５のモル比、より特に４：５～６：５のモル比で会合している。換言すれば、ＨＬＡ融合タンパク質とβ２ｍポリペプチドとは、１：１の比率、又はそれに近い比率で存在する。
【0073】
変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド
全長の細胞外ドメインを含む天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖はすべて、４６位のアラニン（Ａ）、及び／又は９７位のバリン（Ｖ）又はトリプトファン（Ｗ）のいずれかを特徴とする。ＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質ファミリーの配列は、免疫多型データベース（ＩＢＤ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ．ら、２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ１２３４）のアレルリソースに検索語「Ｂ＊５７」を入力することで検索できる。多くのものは４６位のＡ、及び９７位のＶ若しくはＷを特徴とする。したがって、本発明の第１及び第２の態様による方法は、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供するために、１つ又は２つのいずれかのアミノ酸置換を本来のタンパク質配列に導入することを含み得る。実施例に示した図において、第１に、β２ｍタンパク質と複合化しているＩｇＧ４ Ｆｃに融合した変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの複合体として、及びβ２ｍタンパク質から切り離されたβ２ｍ非会合コンフォーマー変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質として、の本発明によるこのようなＨＬＡ融合タンパク質の製造は、未改変のＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１配列の同一構造体と比較した場合に、Ｅ４６位及びＲ９７位のアミノ酸置換により改善される。
全長の細胞外ドメインを含む天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖はすべて、４６位のアラニン（Ａ）、及び／又は９７位のバリン（Ｖ）又はトリプトファン（Ｗ）のいずれかを特徴とする。ＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質ファミリーの配列は、免疫多型データベース（ＩＢＤ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ．ら、２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ１２３４）のアレルリソースに検索語「Ｂ＊５７」を入力することで検索できる。多くのものは４６位のＡ、及び９７位のＶ若しくはＷを特徴とする。したがって、本発明の第１及び第２の態様による方法は、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供するために、１つ又は２つのいずれかのアミノ酸置換を本来のタンパク質配列に導入することを含み得る。実施例に示した図において、第１に、β２ｍタンパク質と複合化しているＩｇＧ４ Ｆｃに融合した変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの複合体として、及びβ２ｍタンパク質から切り離されたβ２ｍ非会合コンフォーマー変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質として、の本発明によるこのようなＨＬＡ融合タンパク質の製造は、未改変のＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１配列の同一構造体と比較した場合に、Ｅ４６位及びＲ９７位のアミノ酸置換により改善される。
【0074】
天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の、コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド相互作用に必要とされない特定のドメイン、細胞内ドメイン、及び膜貫通ドメインは、本明細書中の本発明のいずれか１つの態様によるＨＬＡ融合タンパク質には存在しない。本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、アルファ１、２及び３ドメインを含む天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質配列の細胞外部分のコア構造を含む。これは、この部分が融合タンパク質に標的細胞上の表面分子と相互作用する能力を付与するためである。
【0075】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質中に含まれるＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインを含み、これらの領域は、本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節効果を媒介するレセプターリガンド相互作用に必須である。
【0076】
本発明に係るＨＬＡ融合タンパク質若しくは単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のより特定の実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドタンパク質変異体は、天然に存在するＨＬＡ重鎖タンパク質のアルファ１、２及び３ドメインであるが、Ｃ末端イソロイシン－バリンジペプチドを除き、それより細胞外ドメインのスレオニン－バリン－プロリン残基が先行し、それは「連結ペプチド」と注釈又は参照されることがある膜貫通ドメインに先行するＨＬＡ－Ｂ５７領域内にある。
【0077】
ＨＬＡ－Ｂ５７は、キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）及び白血球免疫グロブリン様レセプター（ＬＩＬＲ）といったリガンドと、膜貫通領域から離れた領域を介して相互作用することが構造データから示唆されている。膜に近いアミノ酸は、一般的にレセプターと相互作用しない。さらに、本発明者らは、先行する段落で特定される天然に存在するＨＬＡ重鎖配列の細胞外ドメインの５Ｃ末端アミノ内に疎水性アミノ酸が多く含まれることが、タンパク質の凝集傾向といった望ましくない性質を組換え融合タンパク質に導入する可能性が高く、その結果、下流の生産工程における産生、精製、安定性及び毒性に影響を及ぼす可能性があると推測している。
【0078】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１～ＨＬＡ－Ｂ＊５７：１４１の任意のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインポリペプチド（完全な細胞外ドメイン配列を欠くトランケーション（短縮）型アレルを除く）から誘導される。天然に存在するポリペプチドにおける細胞外ドメインの（Ｇ、Ｓ、Ｈモチーフから数えて）４６位をＥとし、９７位のアミノ酸をＲとするアミノ酸置換により、本発明による変異型ＨＬＡ重鎖ポリペプチド、又は融合タンパク質が得られる。配列番号００１に加えて、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、又はＨＬＡ融合タンパク質を構築するための出発点として機能し得る、「変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド」の用語の定義で規定されるポリペプチドの細胞外部分の必要なアルファ１、２、及び３ドメインを含む適切な天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖タンパク質配列は、公開配列リポジトリで見出すことができる。これらには、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ研究所のＩＰＤデータベース（「用語と定義」の項の「ＨＬＡ－Ｂ５７」の用語の定義で引用される）から検索され得る、以下の表の第１列のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖から選択される配列が含まれるが、これらに限定されない：
【0079】
【表1】
【0080】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の他の実施形態では、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥと９７位のＲを特徴とすることの他に、「連結ペプチド」領域の前でトランケーションされる、完全長の細胞外ドメインを含む任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインと同一であり、そして細胞外ドメインに続くＨＬＡ－Ｂ５７重鎖のこの領域は、膜貫通ドメインに先行する。
【0081】
特定の実施形態において、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質は、分泌シグナル、例えば、シグナルペプチドとして注釈付けされるほとんどの天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに存在する最初の２４個のアミノ酸、又は配列番号０１９など、効率的にＨＬＡ融合タンパク質を分泌するように設計される代替の分泌シグナルをさらに含み得る。
【0082】
さらに、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質の特定の実施形態において、天然のＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の細胞外ドメインのアルファ１、アルファ２及びアルファ３ドメインへのＣ末端には、アルファ３ドメインと膜貫通ドメインとを結合するＨＬＡ－Ｂ５７「連結ペプチド」領域の最初の６残基が存在し得、これは、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドのほとんどの天然に存在する全長の変異体において見出される。
【0083】
本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、上記のとおり天然のＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド配列の細胞外ドメインにアミノ酸改変を導入することによって得ることができる。本明細書で使用される用語における前記「変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド」は、ＨＬＡ－Ｂ５７リガンドとの相互作用に必要な天然ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド配列の細胞外ドメインの部分の変異体を含む、又はそれからなり、特に天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の少なくともアルファ１、アルファ２及びアルファ３ドメインを含む。
【0084】
本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、さらに以下を特徴とする：
－ アミノ酸残基４６位のグルタミン酸（Ｅ）、及び
－ アミノ酸残基９７位のアルギニン（Ｒ）。
－ アミノ酸残基４６位のグルタミン酸（Ｅ）、及び
－ アミノ酸残基９７位のアルギニン（Ｒ）。
【0085】
本明細書で使用するＨＬＡ－Ｂ５７のアミノ酸番号付けは、配列番号００１の配列を有する天然に存在する、又は変異体ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの最初のＧ、Ｓ、Ｈモチーフをそれぞれ１位、２位及び３位に割り当てることで順次に定義される。
【0086】
特定の実施形態において、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、任意にさらに以下を含む：
－ 分泌シグナル、例えばシグナルペプチドとして注釈付けされるほとんどの天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに存在する最初の２４個のアミノ酸、又は配列番号０１９などの効率的にＨＬＡ融合タンパク質を分泌するように設計される代替的な分泌シグナル、及び／又は
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の変異型細胞外ドメインのアルファ１、アルファ２及びアルファ３ドメインへのＣ末端であり、アルファ３ドメインと膜貫通ドメインを結合するＨＬＡ－Ｂ５７「連結ペプチド」領域の最初の６残基であり、天然に存在する全長ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに存在するもの。
－ 分泌シグナル、例えばシグナルペプチドとして注釈付けされるほとんどの天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに存在する最初の２４個のアミノ酸、又は配列番号０１９などの効率的にＨＬＡ融合タンパク質を分泌するように設計される代替的な分泌シグナル、及び／又は
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の変異型細胞外ドメインのアルファ１、アルファ２及びアルファ３ドメインへのＣ末端であり、アルファ３ドメインと膜貫通ドメインを結合するＨＬＡ－Ｂ５７「連結ペプチド」領域の最初の６残基であり、天然に存在する全長ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドに存在するもの。
【0087】
本発明による「変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド」は以下を欠く、又はその核酸配列は以下をコードしない：
－ 膜貫通ドメイン、及び
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の細胞内ドメイン。
－ 膜貫通ドメイン、及び
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列の細胞内ドメイン。
【0088】
特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは以下を欠き、又はその核酸配列は以下をコードしない：アルファ３ドメイン及び膜貫通ドメインに結合するほとんどの天然の全長ＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列に存在する細胞外ドメインの「連結ペプチド」領域の、最後の３～１１残基、特に最後の５残基。
【0089】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とすることに加えて、「連結ペプチド」領域の少なくとも３、４、５、又は６個のアミノ酸残基の前でトランケーションされる、全長の細胞外ドメインを含む任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインと同一である。
【0090】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法のより特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドは、全長の細胞外ドメインを含む任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外ドメインと同一であるが、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とすることに加えて、「連結ペプチド」領域の５個のＣ末端アミノ酸残基を欠いている。
【0091】
特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とすることの他に、細胞外ドメインのアルファ１ドメインのＧＳＨモチーフから数えて、任意の天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドの細胞外部分をコードする最初の２８０個のアミノ酸と同一である。
【0092】
本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質の別の実施形態において、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、１個の異なるアミノ酸残基（ここで１個の異なるアミノ酸残基は４６位又は９７位ではない）以外に、例えば配列番号００２など、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの変異体の細胞外ドメインと同一の配列を含む。換言すれば、４６位及び／又は９７位の１個、場合によっては２個のアミノ酸置換に加えて、本実施形態による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、それが由来する天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７分子と比較して、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。この実施形態によれば、得られるＨＬＡ融合タンパク質は、本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質のすべての以前の実施形態と少なくとも類似の、又は改良された生物学的機能を有する。特に、ＨＬＡ融合タンパク質の機能は、本明細書の実施例で示される手段及び方法によって、すなわち、４６位及び９７位のアミノ酸置換を欠く類似の構築物（Ａ４６及びＶ９７／Ｗ９７を特徴とするもの）との比較によって特徴づけることができる。ＨＬＡ融合タンパク質は、哺乳動物細胞の上清中で測定される組換えＨＬＡ融合タンパク質力価が同等のコントロールＨＬＡ融合タンパク質と比較して少なくとも２倍増加することによって特徴づけられ、すなわちＡ４６、及びＶ９７／Ｗ９７を特徴とするＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含み、さらなる変異体の改変を欠いてなる融合タンパク質と比較して力価が高められる。重要なことは、４６位と９７位以外のＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドに付加的な変異を含む変異体も、野生型ＨＬＡ－Ｂ５７配列を含む可溶性ＨＬＡ重鎖の有利な免疫原性資質を保持しなければならないことである。これは、β２ｍを欠く変異型ＨＬＡ－Ｆｃ構築物のＬＩＬＲＢ２への結合を測定することによって確認することができ、実施例の図８で野生型ＨＬＡ－Ｂ５７に基づく融合タンパク質について示されるとおり、結合が（≦）約２１ｎＭ以下のＥＣ５０を特徴とすることを確認することである。
【0093】
実施例に示した図２及び図７のデータにより、Ａ４６Ｅ及びＶ９７Ｒを有する多様なＨＬＡ重鎖構造が、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドと比較して、細胞株によるＨＬＡ重鎖発現のより高い収率と相関することが示される。図３～図７は、天然のＨＬＡ－Ｂ５７：０１（配列番号００１）重鎖ポリペプチドの細胞外部分の２つのアミノ酸を変換すること（Ａ４６ＥとＶ９７Ｒ）により、収率が大幅に改善され、ＨＬＡ Ｉｇ Ｆｃ融合タンパク質（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ）と複合化したβ２ｍ、及びまたβ２ｍを欠くＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）β２ｍ－非会合コンフォーマー（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍ）の凝集が減少することを示している。アミノ酸置換は、細胞生存率、生産力価を増加させ、かつ高分子量及び低分子量の種を減少させる。このことは、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含むＨＬＡ融合タンパク質のＨＬＰＣ分析において単一ピークが優勢であることによって示されるためである。重要なことは、これらのアミノ酸置換は、ＨＬＡβ２ｍ非会合コンフォーマー（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍ）のＬＩＬＲＢ２への結合を損なわず（図８）、またＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍ）がＣＤ８ Ｔ細胞の殺傷能又はＭ１マクロファージの極性能若しくは貪食能を増大させる能力も損なわないことである（図９～１１）。このことから、４６位と９７位は、得られるＨＬＡ融合タンパク質の免疫調節特性を損なわないことが確認される。さらに、β２ｍを解離しているＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）．ｎｏβ２ｍは、ｉｎ ｖｉｖｏで結腸がんマウスモデルを用いて実証されるとおり、強力な免疫調節作用及び抗がん治療効果を有する（図１２）。
【0094】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡを製造するための方法の特定の実施形態において、変異型ＨＬＡ融合タンパク質由来のβ２ｍ－非会合コンフォーマーは、由来する天然に存在するＨＬＡ重鎖ペプチドを含む等価化合物と比較して、ＬＩＬＲＢ２（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８Ｎ４２３）への結合が改善されている。言い換えれば、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ，Ｖ９７Ｒ）融合タンパク質とＬＩＬＲＢ２の結合飽和は、由来する天然に存在するＨＬＡ重鎖ペプチドを含む等価の構築物と比較して、より低い濃度で達成することができる。本発明によるＬＩＬＲＢ２の結合飽和とは、特に酵素結合イムノアッセイを用いた測定を意味し、そこではＨＬＡ融合タンパク質が固定化ビオチン化ＬＩＬＲＢ２に対して漸増され、抗Ｉｇ二次抗体により検出される。他の特定の実施形態において、β２ｍ－非会合コンフォーマーＨＬＡ融合タンパク質に組み込まれた前記変異型ＨＬＡ重鎖は、ＬＩＬＲＢ２レセプターに、（≦）約２１ｎＭ未満、特に≦約１５ｎＭ、より特に≦約１０ｎＭのＥＣ５０で結合し、これはＬＩＬＲＢ２結合飽和の約２倍超過の増加を示す。
【0095】
ペプチドの安定化及び連結
本方法のいずれかの態様によるＨＬＡ融合タンパク質、又は上記に規定された本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、融合タンパク質のＨＬＡ－Ｂ５７部分に発現及び精製の間の安定性を付与する追加のポリペプチドを含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解及びオリゴマー化を減少させ、融合タンパク質を発現する細胞の生存率を増加させることにより、収率及び溶解度を増加させる。
本方法のいずれかの態様によるＨＬＡ融合タンパク質、又は上記に規定された本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、融合タンパク質のＨＬＡ－Ｂ５７部分に発現及び精製の間の安定性を付与する追加のポリペプチドを含む。ＨＬＡ融合タンパク質の安定化部分の存在は、ＨＬＡ融合タンパク質の分解及びオリゴマー化を減少させ、融合タンパク質を発現する細胞の生存率を増加させることにより、収率及び溶解度を増加させる。
【0096】
ＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質の安定化ポリペプチドはヒトＩｇ Ｆｃポリペプチドである。特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質の安定化ペプチドはアイソタイプＩｇＧ Ｆｃである。ＩｇＧ Ｆｃ安定化ペプチドドメインは、プロテインＡ又はＧでコーティングした表面への吸収を可能にすることにより、ＨＬＡ融合タンパク質の精製時にさらなる利点をもたらす。Ｆｃ部分はまた、分子のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長する可能性もある。本発明者らは、Ｉｇ Ｆｃの代わりに機能性ＨＬＡポリペプチドに結合させる場合に同様の利点をもたらす可能性のある代替物質はウシ血清アルブミンであり得ると考えている。本発明者らのこれまでの研究により、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン分子もまた安定化ポリペプチドとして機能し得ることが確立されている。また、ＰＥＧ化は循環中のタンパク質の半減期を延長可能であり、したがって別の適した安定化ポリペプチドであることが知られている。
【0097】
本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は単離されたＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質はＩｇＧ４ポリペプチドを含む。より特定の実施形態では、ＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００４の配列を有する改変ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ．ｄｋ分子を含む。これはＩｇＧ４のヒンジ領域の変異を特徴とし、本来のＩｇＧ４抗体の２２８位のプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換されており、及びｄＫは本来のＩｇＧ４配列上の最後のアミノ酸であるリジン（Ｋ）の欠失を示す。これらの変化により、ＩｇＧ４フォーマットは安定化し、異種性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が少なくなる。どちらの変化もよく確立されており、及び多様なＦｃ構築物において一般的に使用される。
【0098】
特定の実施形態において、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、第１の単量体及び第２の単量体を含む二量体であり、各単量体は、他の単量体とは独立して、Ｉｇ Ｆｃ部分に融合したＨＬＡ重鎖ポリペプチドを含み、Ｉｇ Ｆｃ部分はジスルフィド結合を介して会合し得る。
【0099】
ＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法の特定の実施形態では、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、長さが５、１０、１５、２０、或いは５０残基のアミノ酸の短い配列である、ペプチドリンカーによって、単一のポリペプチド鎖の一部としてＩｇＧポリペプチドと結合する。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、セリン残基及びグリシン残基に富む非免疫原性配列である。より特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号００３の配列を有する。
【0100】
ヒト細胞の小胞体で発現する天然ＨＬＡ分子は、細胞表面への輸送及び表示を受ける前に、ペプチドエピトープと会合する。本発明に係る医薬組成物の特定の実施形態において、ＨＬＡポリペプチドは、ペプチドエピトープと会合しない。すなわち、ＨＬＡポリペプチドのアルファ１ドメイン及びアルファ２ドメインによって形成される抗原結合溝、又は抗原結合クレフトには、小さな抗原性ペプチドは結合しない。ペプチドがＨＬＡクラス分子に結合すると、そのコンフォメーションが変化し、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２といった結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼす可能性があると考えられている。本発明に係るＢ２ｍポリペプチドに会合し、さらにペプチドエピトープに結合していない、ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドの結合親和性及び免疫調節効果は、例えば図１２に示される。
【0101】
ＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法、又は本発明による単離されたＨＬＡ融合タンパク質の別の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質は、さらにペプチドエピトープ断片を含む。
【0102】
核酸
本発明の別の態様により、上記に記載された本発明の態様又は実施形態のいずれか１つによる単離されたＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸が提供され、ここで、ＨＬＡ融合タンパク質のコードされた変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド部分は、Ｅ４６、及びＲ９７を特徴とする。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号０１６の配列を含む。特定の実施形態では、核酸はまた、ＨＬＡ融合タンパク質の効率的な精製を可能にするために、細胞の分泌を可能にする分泌シグナルもコードする。他の特定の実施形態において、単離された融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号００６と指定される配列を含み、分泌シグナルをさらにコードする。より特定の実施形態では、それは本質的に配列番号００６からなる。
本発明の別の態様により、上記に記載された本発明の態様又は実施形態のいずれか１つによる単離されたＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸が提供され、ここで、ＨＬＡ融合タンパク質のコードされた変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド部分は、Ｅ４６、及びＲ９７を特徴とする。特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号０１６の配列を含む。特定の実施形態では、核酸はまた、ＨＬＡ融合タンパク質の効率的な精製を可能にするために、細胞の分泌を可能にする分泌シグナルもコードする。他の特定の実施形態において、単離された融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号００６と指定される配列を含み、分泌シグナルをさらにコードする。より特定の実施形態では、それは本質的に配列番号００６からなる。
【0103】
本発明のさらなる態様には、上記で規定した核酸と、細胞内で作動可能なプロモーター配列とを含む核酸発現ベクターが含まれる。特定の実施形態では、プロモーターは真核細胞での発現に適している。より特定の実施形態では、哺乳動物細胞用のプロモーターが使用される。
【0104】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の以前の態様によるＨＬＡ融合タンパク質、又はＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸を含む単離された細胞である。本発明のこれらの態様は、ＨＬＡ融合タンパク質のためのＤＮＡ又はＲＮＡに基づく送達システム、又はＨＬＡ融合タンパク質を発現する細胞の移入を包含する。
【0105】
医薬組成物及び投与
実施例に示したデータにより、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１ポリペプチドの細胞外ドメインのＡ４６及びＶ９７が、標的化アミノ酸置換によりＥ４６及びＲ９７により置換された、本発明による変異型ＨＬＡ融合タンパク質が、ＬＩＬＲＢ２に結合し、ＣＤ８ Ｔ細胞の殺傷能力を増大させ、かつｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍免疫応答を誘発することが示される。本発明により提供される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、Ｔ細胞殺傷、マクロファージ活性化及び貪食、並びにｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を含む、分子の免疫調節効果を維持しながら、前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む得られるＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるという点で有利である（図９～図１２）。
実施例に示したデータにより、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１ポリペプチドの細胞外ドメインのＡ４６及びＶ９７が、標的化アミノ酸置換によりＥ４６及びＲ９７により置換された、本発明による変異型ＨＬＡ融合タンパク質が、ＬＩＬＲＢ２に結合し、ＣＤ８ Ｔ細胞の殺傷能力を増大させ、かつｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍免疫応答を誘発することが示される。本発明により提供される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、Ｔ細胞殺傷、マクロファージ活性化及び貪食、並びにｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を含む、分子の免疫調節効果を維持しながら、前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを含む得られるＨＬＡ融合タンパク質の収率を増加させるという点で有利である（図９～図１２）。
【0106】
本発明の１つの態様は、悪性新生物疾患の治療に使用するための、本明細書で規定される少なくとも１つのＨＬＡ融合タンパク質、又はＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、本明細書に記載されるような少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
【0107】
特定の実施形態において、医薬ＨＬＡ融合タンパク質製剤が使用される悪性新生物疾患は、固形がんである。より特定の実施形態では、固形がんは肺がん、又は転移性肺がんである。他の特定の実施形態では、がんは結腸直腸がん、又は転移性結腸がんである。
【0108】
他の特定の実施形態では、医薬ＨＬＡ融合タンパク質製剤は、血球由来のがんを治療するために使用される。より特定の実施形態では、これは、Ｔ細胞白血病の治療に用いられる。
【0109】
本発明の特定の実施形態において、本発明のＨＬＡ融合タンパク質は、薬物の制御が容易な投与量を提供し、患者に明快で取り扱いが容易な製品を提供するために、一般的に医薬剤形に製剤化されている。
【0110】
本発明のＨＬＡ融合タンパク質の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与様式及び投与経路；レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質及び程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果などの既知の因子によって変化する。特定の実施形態において、本発明のＨＬＡ融合タンパク質は、１日１回投与してもよいし、１日の総投与量を１日に２回、３回、又は４回の用量に分けて投与してもよい。
【0111】
医薬組成物を調製するための多くの手順及び方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。
【0112】
併用医薬
本発明の別の態様は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与するために製剤化された、本発明による変異型ＨＬＡ融合タンパク質、又は前記ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物である。本発明者らは以前、ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質化合物がチェックポイント阻害剤の効果を増強することを見出しており、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドに基づく同様の分子を併用投与すれば、実施例で試験したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでこの分子が同様の免疫調節作用を示すことから、同様の効果が得られると考えている。
本発明の別の態様は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与するために製剤化された、本発明による変異型ＨＬＡ融合タンパク質、又は前記ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物である。本発明者らは以前、ＨＬＡ－Ｂ５７ ＩｇＧ４融合タンパク質化合物がチェックポイント阻害剤の効果を増強することを見出しており、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖ポリペプチドに基づく同様の分子を併用投与すれば、実施例で試験したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでこの分子が同様の免疫調節作用を示すことから、同様の効果が得られると考えている。
【0113】
本発明の別の態様は、本発明によるＨＬＡ融合タンパク質、又は核酸、又は融合タンパク質をコードするベクターと組み合わせて投与するために製剤化された、悪性新生物疾患の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤である。
【0114】
本発明によるチェックポイント阻害剤は、免疫細胞の活性化、特にＴ細胞の活性化を制限する阻害性シグナル伝達カスケードを破壊することができる。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数（高い親和性）でＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のいずれかに結合可能な抗体断片、又は抗体様分子である。
【0115】
本明細書の文脈において、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：［主に２つの］異なる成分からなる複合体が、可逆的にその（２つの）構成成分に解離する傾向を測定する、平衡定数を意味する。この複合体は、例えば、抗体Ａｂと抗原Ａｇとから構成される抗体抗原複合体ＡｂＡｇとすることができる。ＫＤは、モル濃度［ｍｏｌ／Ｌ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分が占有される［Ａｂ］の濃度に相当し、言い換えれば、未結合の［Ａｂ］の濃度が［ＡｂＡｇ］複合体の濃度と等しいことに相当する。解離定数は、以下の式により算出することができる：
［Ａｂ］：抗体の濃度、［Ａｇ］：抗原の濃度、［ＡｂＡｇ］：抗体－抗原複合体の濃度
【数1】
【0116】
特に、チェックポイント阻害剤は、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンド、非アゴニストＰＤ－１リガンド、非アゴニストＰＤ－Ｌ１リガンド、又は非アゴニストＰＤ－Ｌ２リガンドであり、これらはＴ細胞表面のＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２にそれぞれ結合する場合にＴ細胞の活性の減衰をもたらさない。いくつかの実施形態において、本発明で使用される非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４に結合した場合に、ＣＴＬＡ－４とその結合パートナーであるＣＤ８０及び／又はＣＤ８６との相互作用を立体的にブロックすることができ、本発明で使用される非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１に結合した場合に、ＰＤ－１とその結合パートナーであるＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用を立体的にブロックすることができる。
【0117】
特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、１０－７ｍｏｌ／Ｌ、特に１０－８ｍｏｌ／Ｌ、さらには１０－９ｍｏｌ／Ｌの、ＫＤ値で表される最小の親和性を示す解離定数でＣＴＬＡ－４に結合する能力を介して阻害性シグナル伝達カスケードを破壊し、それぞれの標的の生物学的活性を阻害する。本発明の意味における非アゴニストＰＤ－１リガンド又は非アゴニストＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）リガンドとは、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌ、特に１０－８ｍｏｌ／Ｌ又はさらには１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数でＰＤ－１（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）に結合することができ、それぞれの標的の生物学的活性を阻害する分子を指す。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は抗体、より特にＰＤ－１に特異的な抗体であり、これはＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害してＴ細胞応答を増強する。
【0118】
併用治療のための医薬組成物の特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、臨床的に利用可能な抗体薬物である、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）、トレメリムマブ（ＣＡＳ番号７４５０１３－５９－６）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号９４６４１４－９４－４）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．ＣＡＳ番号１３７４８５３－９１－４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０－４２－３）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ；ＣＡＳ番号１３８０７２３－４４－３）、アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ；ＣＡＳ番号１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ；ＣＡＳ番号１４２８９３５－６０－７）、及びセミピリマブ（Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ；ＣＡＳ番号１８０１３４２－６０－８）から選択されるチェックポイント阻害抗体である。
【0119】
特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、４－１ＢＢタンパク質に対しての特異的な結合を特徴とする。特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ウトミルマブ（ＣＡＳ番号１４１７３１８－２７－４）、又はウレルマブ（ＣＡＳ番号９３４８２３－４９－１）から選択される臨床的に利用可能な抗体医薬である。
【0120】
本発明者らによる国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）における以前の開示は、可溶性ＨＬＡ重鎖ペプチドが、単独で、又はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び４－１ＢＢに特異的に結合することを特徴とするチェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、複数の腫瘍モデルにおいて腫瘍負荷を低減することを示している。
【0121】
抗体断片は、抗体のＦａｂドメイン又は可変断片（Ｆｖ）ドメインであってもよいし、或いは単鎖抗体断片（抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をペプチドリンカーで連結してなる融合タンパク質）であってもよい。この阻害剤はまた、重鎖又は軽鎖からの単離された可変ドメインからなる、単一ドメイン抗体であってもよい。さらに、抗体は、ラクダ科動物に見られる抗体のように、重鎖のみからなる重鎖抗体であってもよい。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、チューリッヒ）などのリピートタンパク質であってもよい。
【0122】
特定の実施形態において、併用療法は、２種の異なる剤形を含み、例えば、ＨＬＡ融合タンパク質が、例えば固形腫瘍への皮下注入又は腫瘍内注入による、腫瘍内送達又は腫瘍近傍の局所送達のための剤形として提供され、前記チェックポイント阻害剤が、特に静脈注入による、全身送達のための剤形として提供される。しかしながら、前記チェックポイント阻害剤と前記ＨＬＡ融合タンパク質とは、２つの類似の投与形態で送達することもできる。
【0123】
併用投与は、チェックポイント阻害剤とＨＬＡ融合タンパク質とを一緒に、或いは別々の製剤で同時に投与すること、或いは第１の物質を、第２の物質を投与する直前に、例えばその前の週に、或いは第２の物質を投与する直後に、例えばその後の週に、投与することを包含する。いくつかの実施形態では、この２剤の併用投与とは、１剤を２剤の投与の前に、特に２剤の投与前の月に投与することを指す。他の実施形態では、１剤の後に、特に数週間以内に、或いはその後１ヵ月に２剤を投与する。他の特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤とＨＬＡ融合タンパク質とは、重複する投与計画で投与される。
【0124】
本発明はさらに、本発明によるＨＬＡ融合タンパク質と、チェックポイント阻害剤とを含む医薬組成物を包含する。
【0125】
本発明はさらに、チェックポイント阻害剤を最近投与された、又は投与される予定の患者を治療するために使用するＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物を包含する。
【0126】
本発明はさらに、最近ＨＬＡ融合タンパク質を投与された、又は投与される予定の患者を治療するために使用するチェックポイント阻害剤を含む医薬組成物を包含する。
【0127】
医療、剤形、製造方法
特定の態様及び実施形態において、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、種々の形態のがんの治療に使用するために提供される。
特定の態様及び実施形態において、本発明による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、種々の形態のがんの治療に使用するために提供される。
【0128】
ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の特定の実施形態では、液状がん、血液がんの一種を治療するために使用するために提供される。本発明者らは、本発明に係る医薬組成物によって誘導される特徴的なＴ細胞の排出、及び血液がん細胞をＴ細胞へ循環するアクセス性、及びマクロファージの活性化は、この併用が有効である可能性が高いことを意味すると考えている。特にそのような実施形態において、医薬組成物は、本明細書においてＪｕｒｋａｔ細胞でモデル化されるようなＴ細胞白血病と診断された患者に使用するために提供される。他の特定の実施形態において、医薬組成物は、ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞株によってモデル化されるような多発性骨髄腫と診断された患者に使用するために提供される。
【0129】
他の特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物は、固形がん、又は固形がんの転移と診断された患者に使用するために提供される。いくつかの特定の実施形態において、医薬組成物は、肺がんと診断された患者に使用するためのものである。特定の実施形態では、肺がんは非小細胞肺がんの形態である。他の特定の実施形態では、肺がんは小細胞肺がん又はがん腫の形態である。いくつかの特定の実施形態において、ＨＬＡ融合タンパク質、又は免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、結腸がんと診断された患者に使用するためのものである。特定の実施形態では、転移性結腸がんである。
【0130】
チェックポイント阻害剤に加えて本発明に係る医薬組成物の投与に関する本発明の態様のいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害療法が単剤療法、又は併用療法として承認されている悪性疾患、又はがんの一形態における使用のために提供される。特定の実施形態において、併用療法は結腸がん、特に転移性結腸がんの患者に使用するためのものである。さらに特定の実施形態では、がんは膵臓がんである。なおさらに特定の実施形態では、がんは乳がんである。
【0131】
本発明は、さらに別の態様として、がんの一形態の治療又は再発防止のための医薬の製造方法における使用のための、上記で詳細に規定したＨＬＡ融合タンパク質、又はＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の使用を包含する。別の代替的な態様は、上記で詳細に規定したようなＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物の有効量を投与することにより、悪性新生物疾患の一形態と診断された患者を治療する方法である。本発明はさらに、本発明によるＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物と、チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物とのがん患者への共投与を包含する。本発明はさらに、チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物を既に投与されている患者に、本発明によるＨＬＡ融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを包含する。
【0132】
剤形は、皮下注射、静脈注射、肝内注射、筋肉内注射などの非経口投与であってもよい。任意に、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0133】
本発明は、さらに以下の項目を包含する：
【0134】
項目Ａ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖にアミノ酸置換を導入することによって得られるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、
ａ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むポリペプチドをコードするＨＬＡ核酸配列であって、変異体ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位にＥを有し、かつ９７位にＲを有し、位置番号は、配列番号００１を有するＨＬＡ－Ｂ５７：０１重鎖のＧＳＨモチーフをそれぞれ１位、２位及び３位に割り当てることによって順次定義される、前記ＨＬＡ核酸配列、及び
ｂ． β２ｍタンパク質をコードするβ２ｍ核酸配列、
を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、前記細胞中で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することを含み、
かつＨＬＡ及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
ａ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体を含むポリペプチドをコードするＨＬＡ核酸配列であって、変異体ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位にＥを有し、かつ９７位にＲを有し、位置番号は、配列番号００１を有するＨＬＡ－Ｂ５７：０１重鎖のＧＳＨモチーフをそれぞれ１位、２位及び３位に割り当てることによって順次定義される、前記ＨＬＡ核酸配列、及び
ｂ． β２ｍタンパク質をコードするβ２ｍ核酸配列、
を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、前記細胞中で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することを含み、
かつＨＬＡ及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
【0135】
項目Ｂ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖にアミノ酸置換を導入することにより得られるＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、以下をコードする核酸配列：
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、変異体ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、（項目Ａにおいて規定されるとおり）４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃを含む安定化ペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃを含む安定化ポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、
及び
ｂ． β２ｍ核酸配列；
を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、前記細胞中で作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することを含み、
かつＨＬＡ－Ｂ融合タンパク質をコードする核酸配列及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質であって：
ｉ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外ドメインの変異体であって、変異体ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、（項目Ａにおいて規定されるとおり）４６位のＥ及び９７位のＲを特徴とする、前記変異体と；
ｉｉ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃを含む安定化ペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃを含む安定化ポリペプチドと；
を含む、前記ＨＬＡ融合タンパク質、
及び
ｂ． β２ｍ核酸配列；
を、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、前記細胞中で作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することを含み、
かつＨＬＡ－Ｂ融合タンパク質をコードする核酸配列及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
【0136】
項目Ｃ． ＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ． ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の天然に存在する細胞外ドメインにアミノ酸変化を導入することにより、４６位のＥ及び／又は９７位のＲを特徴とする変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供する、アミノ酸置換工程であって、ここでアミノ酸残基は項目Ａで規定されるとおりに番号付けされる、前記工程；
ｂ． 細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に：
ｉ． ａ．による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ Ｆｃポリペプチドとを含むＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｉｉ． β２ｍポリペプチド、
をコードする核酸配列を、前記細胞中で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入する、発現工程、
を含み、
ＨＬＡ－Ｂ５７及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
ａ． ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の天然に存在する細胞外ドメインにアミノ酸変化を導入することにより、４６位のＥ及び／又は９７位のＲを特徴とする変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供する、アミノ酸置換工程であって、ここでアミノ酸残基は項目Ａで規定されるとおりに番号付けされる、前記工程；
ｂ． 細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に：
ｉ． ａ．による変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ Ｆｃポリペプチドとを含むＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｉｉ． β２ｍポリペプチド、
をコードする核酸配列を、前記細胞中で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入する、発現工程、
を含み、
ＨＬＡ－Ｂ５７及びβ２ｍをコードする核酸配列が発現する条件下で前記細胞をインキュベートすることにより、ＨＬＡ重鎖／β２ｍ複合体が得られる、前記方法。
【0137】
項目Ｄ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位のＡ、及び／又は９７位のＶ若しくはＷを特徴とする、項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載の方法。
【0138】
項目Ｅ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位のＥ及び９７位のＲを予め特徴としない、項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載の方法。
【0139】
項目Ｆ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位のＡを特徴とする、項目Ａ～Ｅのいずれか１項に記載の方法。
【0140】
項目Ｇ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、９７位のＶを特徴とする、項目Ａ～Ｆのいずれか１項に記載の方法。
【0141】
項目Ｈ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖は、４６位のＡ、及び９７位のＶ又はＷを特徴とする、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に記載の方法。
【0142】
項目Ｉ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖配列は、配列番号００１である、項目Ａ～Ｈのいずれか１項に記載の方法。
【0143】
項目Ｊ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又はそれからなる、項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載の方法。
【0144】
項目Ｋ． ＨＬＡ融合タンパク質は、Ｎ’からＣ’末端へ：
ａ． 項目Ａ～Ｊのいずれか１項に規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． ペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、及び
ｃ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃを含む安定化ポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃを含む安定化ポリペプチド、さらにより特に配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ポリペプチド、及び
ｄ． 任意に、分泌シグナル、特に配列番号０１９の配列を有する分泌シグナル、
を含む、又はそれから本質的になる、項目Ａ～Ｊのいずれか１項に記載の方法。
ａ． 項目Ａ～Ｊのいずれか１項に規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． ペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、及び
ｃ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇＧ Ｆｃを含む安定化ポリペプチド、より特にＩｇＧ４ Ｆｃを含む安定化ポリペプチド、さらにより特に配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ポリペプチド、及び
ｄ． 任意に、分泌シグナル、特に配列番号０１９の配列を有する分泌シグナル、
を含む、又はそれから本質的になる、項目Ａ～Ｊのいずれか１項に記載の方法。
【0145】
項目Ｌ． ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列及びβ２ｍ核酸配列は、単一の核酸ベクター分子上に存在する、項目Ａ～Ｋのいずれか１項に記載の方法。
【0146】
項目Ｍ． ＨＬＡ融合タンパク質核酸配列及びβ２ｍ核酸配列は、異なる核酸ベクター分子上に存在する、項目Ａ～Ｋのいずれか１項に記載の方法。
【0147】
項目Ｎ． ＨＬＡ－Ｂ５７融合タンパク質核酸配列を含む核酸ベクターと、β２ｍ核酸配列を含む核酸ベクターとの比率が、約１である、項目Ｍに記載の方法。
【0148】
項目Ｏ．
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍ複合体を細胞の上清から精製する、精製工程；
ｂ． 単離ＨＬＡ融合タンパク質が単離β２ｍポリペプチドから分離される条件下で、精製されたＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍ複合体を解離する、解離工程；及び
ｃ． 任意に、単離ＨＬＡ融合タンパク質ポリペプチドを生理的ｐＨにする、脱塩及びリフォールディング工程、
をさらに含む、項目Ａ～Ｎのいずれか１項に記載の方法。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍ複合体を細胞の上清から精製する、精製工程；
ｂ． 単離ＨＬＡ融合タンパク質が単離β２ｍポリペプチドから分離される条件下で、精製されたＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍ複合体を解離する、解離工程；及び
ｃ． 任意に、単離ＨＬＡ融合タンパク質ポリペプチドを生理的ｐＨにする、脱塩及びリフォールディング工程、
をさらに含む、項目Ａ～Ｎのいずれか１項に記載の方法。
【0149】
項目Ｐ． 解離工程が、酸性条件下、特にｐＨ３以下、での処理によって実施される、項目Ｏに記載の方法。
【0150】
項目Ｑ． 安定化ポリペプチドはＩｇＧ Ｆｃを含み、かつ精製工程において、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍ複合体は、プロテインＧと連結した表面によって捕捉される、項目Ａ～Ｐのいずれか１項に記載の方法。
【0151】
項目Ｒ． ＨＬＡ融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現される、項目Ａ～Ｑのいずれか１項に記載の方法。
【0152】
項目Ｓ． 単離されたＨＬＡ融合タンパク質であって：
ａ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外部分の変異体であり、かつ
変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドであって、位置番号は、配列番号００１の配列を有するＨＬＡ－Ｂ５７：０１重鎖のＧ、Ｓ、Ｈモチーフをそれぞれ１位、２位、及び３位に割り当てることによって順次定義される、前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｂ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇ Ｆｃ、より特にＩｇＧ Ｆｃ、さらにより特にＩｇＧ４ Ｆｃ、
を含む、前記単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
ａ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７重鎖の細胞外部分の変異体であり、かつ
変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドであって、位置番号は、配列番号００１の配列を有するＨＬＡ－Ｂ５７：０１重鎖のＧ、Ｓ、Ｈモチーフをそれぞれ１位、２位、及び３位に割り当てることによって順次定義される、前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｂ． 安定化ポリペプチド、特にＩｇ Ｆｃ、より特にＩｇＧ Ｆｃ、さらにより特にＩｇＧ４ Ｆｃ、
を含む、前記単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0153】
項目Ｔ． 単離されたＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ． 項目Ｓに規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、特に、配列番号００２の配列を含む、又はそれから本質的になる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． 配列番号００４を含む、又はそれから本質的になるＩｇＧ４ Ｆｃ
を含み、
特に、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５、又は配列番号０２０（分泌シグナルを含む）、又は配列番号０１５（分泌後の分泌シグナルを欠く）から選択される配列を含む、又はそれから本質的になり、特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５の配列を有するポリペプチドを含む、又はそれから本質的になる、項目Ｓに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
ａ． 項目Ｓに規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、特に、配列番号００２の配列を含む、又はそれから本質的になる変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． 配列番号００４を含む、又はそれから本質的になるＩｇＧ４ Ｆｃ
を含み、
特に、単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号００５、又は配列番号０２０（分泌シグナルを含む）、又は配列番号０１５（分泌後の分泌シグナルを欠く）から選択される配列を含む、又はそれから本質的になり、特にＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５の配列を有するポリペプチドを含む、又はそれから本質的になる、項目Ｓに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0154】
項目Ｕ． 単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５と同一のアミノ酸配列、又は１個の異なるアミノ酸残基の他に配列番号０１５と同一のアミノ酸配列を含む、又はそれからなり、ここで等価な天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７：０１配列を含む単離された融合タンパク質と比較して、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ． 前記ＨＬＡ融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞の生存率が少なくとも３倍増加すること、及び／又は
ｂ． 細胞培養上清中で測定される前記ＨＬＡ融合タンパク質の力価が少なくとも１０倍増加すること、
及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて：
ｃ．マクロファージの細胞表面上のＣＤ６８、ＣＤ２０６及び／又はＣＤ２０９の発現レベルの少なくとも８０％の、特に９０％の、アップレギュレーション、及び／又は
ｄ． 腫瘍細胞のマクロファージ貪食レベルの少なくとも８０％、特に９０％、
を誘導することができること、
及び／又はｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルにおいて：
ｅ． 腫瘍体積の少なくとも２倍、又は特に３倍の減少、
を誘導することができること、
を特徴とする、項目Ｓ又はＴに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
ａ． 前記ＨＬＡ融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞の生存率が少なくとも３倍増加すること、及び／又は
ｂ． 細胞培養上清中で測定される前記ＨＬＡ融合タンパク質の力価が少なくとも１０倍増加すること、
及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて：
ｃ．マクロファージの細胞表面上のＣＤ６８、ＣＤ２０６及び／又はＣＤ２０９の発現レベルの少なくとも８０％の、特に９０％の、アップレギュレーション、及び／又は
ｄ． 腫瘍細胞のマクロファージ貪食レベルの少なくとも８０％、特に９０％、
を誘導することができること、
及び／又はｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルにおいて：
ｅ． 腫瘍体積の少なくとも２倍、又は特に３倍の減少、
を誘導することができること、
を特徴とする、項目Ｓ又はＴに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0155】
項目Ｖ． 項目Ｓ～Ｕのいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸、特に、配列番号０１６の配列（コアＨＬＡ融合タンパク質構造のみ）を含む核酸、特に、配列番号００６（ＨＬＡ融合タンパク質及び分泌シグナル）を含む、又は本質的にそれからなる核酸。
【0156】
項目Ｗ． 細胞において、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞において、作動可能なプロモーター配列の制御下にある、項目Ｖに記載の核酸を含むベクター。
【0157】
項目Ｘ． 項目Ｖに記載の核酸、又は項目Ｗに記載のベクター、又は項目Ｓ～Ｕのいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質を含む細胞。
【0158】
項目Ｙ． 医薬品として使用するため、又は医薬品の製造において使用するため、特にがんを治療するための医薬品として使用するための、項目Ｓ～Ｕのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、又は項目Ｖに記載の核酸。
【0159】
項目Ｚ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドに１個又は２個のアミノ酸置換を導入することによって得られるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に、
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｉ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドが４６位のグルタミン酸（Ｅ）及び９７位のアルギニン（Ｒ）を特徴とするＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドである、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｉｉ． 免疫グロブリン（Ｉｇ）断片結晶化可能領域（Ｆｃ）ポリペプチド、特にアイソタイプＧ Ｉｇ（ＩｇＧ）Ｆｃ、より特にアイソタイプ４ ＩｇＧ（ＩｇＧ４）Ｆｃ；
を含む、前記核酸配列、及び
ｂ． β２－ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質をコードする核酸配列；
を、それぞれが前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入すること、
次いで、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列とβ２ｍタンパク質をコードする核酸配列とが発現する条件下で細胞を培養して、それによりＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供すること、
を含む、前記方法。
ａ． ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｉ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドが４６位のグルタミン酸（Ｅ）及び９７位のアルギニン（Ｒ）を特徴とするＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドである、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド；及び
ｉｉ． 免疫グロブリン（Ｉｇ）断片結晶化可能領域（Ｆｃ）ポリペプチド、特にアイソタイプＧ Ｉｇ（ＩｇＧ）Ｆｃ、より特にアイソタイプ４ ＩｇＧ（ＩｇＧ４）Ｆｃ；
を含む、前記核酸配列、及び
ｂ． β２－ミクログロブリン（β２ｍ）タンパク質をコードする核酸配列；
を、それぞれが前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入すること、
次いで、ＨＬＡ融合タンパク質をコードする核酸配列とβ２ｍタンパク質をコードする核酸配列とが発現する条件下で細胞を培養して、それによりＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供すること、
を含む、前記方法。
【0160】
項目ＡＡ． ＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法であって、以下の工程：
ｃ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドにおいて、４６位のアミノ酸をＥで置換し、及び／又は９７位のアミノ酸をＲで置換することにより、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供する、アミノ酸置換工程；及び
ｄ． 細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に：
ｉ． 前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ Ｆｃポリペプチドとを含むＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｉｉ． β２ｍタンパク質、
をコードする核酸配列を、
前記細胞内で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することにより、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供する、発現工程、
を含む、前記方法。
ｃ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドにおいて、４６位のアミノ酸をＥで置換し、及び／又は９７位のアミノ酸をＲで置換することにより、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドを提供する、アミノ酸置換工程；及び
ｄ． 細胞に、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞に：
ｉ． 前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇＧ Ｆｃポリペプチドとを含むＨＬＡ融合タンパク質、及び
ｉｉ． β２ｍタンパク質、
をコードする核酸配列を、
前記細胞内で両方が作動可能なプロモーター配列の制御下で、導入することにより、ＨＬＡ融合タンパク質／β２ｍタンパク質複合体を提供する、発現工程、
を含む、前記方法。
【0161】
項目ＢＢ． 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドは：
ｉｉｉ． ４６位のＡ、及び
ｉｖ． ９７位のＶ；
を特徴とし、
特に、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目Ｚ又はＡＡに記載の方法。
ｉｉｉ． ４６位のＡ、及び
ｉｖ． ９７位のＶ；
を特徴とし、
特に、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目Ｚ又はＡＡに記載の方法。
【0162】
項目ＣＣ． ＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ． 項目Ｚ～ＢＢのいずれか１項に規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
ｃ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間に切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号０１９の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、項目Ｚ～ＢＢのいずれか１項に記載の方法。
ａ． 項目Ｚ～ＢＢのいずれか１項に規定される変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、
ｂ． ＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、より特に配列番号００４の配列を有するＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
ｃ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃポリペプチドに連結するペプチドリンカー、特に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカー、より特に配列番号００３の配列を有するペプチドリンカー、
を含み、かつ
任意に、ＨＬＡ融合タンパク質は：
ｄ． 分泌シグナル、特に１６～３０アミノ酸長である分泌シグナル、より特に分泌シグナルが細胞から分泌される過程の間に切断により除去される分泌シグナル、さらにより特に配列番号０１９の配列を有する分泌シグナル、
をさらに含む、項目Ｚ～ＢＢのいずれか１項に記載の方法。
【0163】
項目ＤＤ． 単離されたＨＬＡ融合タンパク質は：
ａ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドであり、
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドの変異体であり；かつ
－ ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする；
前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、さらにより特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
を含む、前記単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
ａ． 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドであり、
－ 天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドの変異体であり；かつ
－ ４６位のＥ、及び９７位のＲを特徴とする；
前記変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチド、及び
ｂ． Ｉｇ Ｆｃポリペプチド、より特にＩｇＧ Ｆｃポリペプチド、さらにより特にＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド、
を含む、前記単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0164】
項目ＥＥ．
－ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなり；及び／又は
－ Ｉｇ Ｆｃポリペプチドは、配列番号００４の配列を含む、又は本質的にそれからなり、かつ
－ 任意に、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇ Ｆｃポリペプチドとは、ペプチドリンカーによって結合され、特に、ペプチドリンカーは５～２０アミノ酸長であり、より特に、ペプチドリンカーは配列番号００３の配列を含む、又は本質的にそれからなる、
項目ＤＤに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
－ 変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドは、配列番号００２の配列を含む、又は本質的にそれからなり；及び／又は
－ Ｉｇ Ｆｃポリペプチドは、配列番号００４の配列を含む、又は本質的にそれからなり、かつ
－ 任意に、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７ポリペプチドとＩｇ Ｆｃポリペプチドとは、ペプチドリンカーによって結合され、特に、ペプチドリンカーは５～２０アミノ酸長であり、より特に、ペプチドリンカーは配列番号００３の配列を含む、又は本質的にそれからなる、
項目ＤＤに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0165】
項目ＦＦ． 単離されたＨＬＡ融合タンパク質は、配列番号０１５で示される配列を含む、又は本質的にそれからなる、項目ＤＤ又はＥＥに記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質。
【0166】
項目ＧＧ． 単離されたＨＬＡは、第１の単量体及び第２の単量体を含む二量体の形態であり；かつ
－ 前記第１の単量体は、項目Ｚ～ＣＣのいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；かつ
－ 前記第２の単量体は、項目Ｚ～ＣＣのいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；
－ 特に、前記第１の単量体と第２の単量体とが同一である、
項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の使用のための単離されたＨＬＡ。
－ 前記第１の単量体は、項目Ｚ～ＣＣのいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；かつ
－ 前記第２の単量体は、項目Ｚ～ＣＣのいずれか１項に記載の方法によって得られる第１のＨＬＡ融合タンパク質、又は項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質を含む、又は本質的にそれからなり；
－ 特に、前記第１の単量体と第２の単量体とが同一である、
項目ＤＤ～ＦＦのいずれか１項に記載の使用のための単離されたＨＬＡ。
【0167】
項目ＨＨ． 前記ＨＬＡ融合タンパク質は、前記天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ドメインポリペプチドを含む等価なＨＬＡ融合タンパク質と比較して、ＬＩＬＲＢ２への結合が改善されている、項目ＤＤ～項目ＧＧのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、又は項目Ｚ～項目ＣＣのいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質を製造するための方法。
【0168】
項目ＩＩ． 項目ＤＤ～ＨＨのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質をコードする単離された核酸、特に配列番号０１６の配列を含む単離された核酸、特に、配列番号００６の配列を含む、又は本質的にそれからなる単離された核酸。
【0169】
項目ＪＪ． 細胞において、特に真核細胞、より特に哺乳動物細胞において、作動可能なプロモーター配列の制御下にある、項目ＩＩに記載の核酸を含む核酸発現ベクター。
【0170】
項目ＫＫ． 項目ＩＩに記載の単離された核酸、又は項目ＪＪに記載の核酸発現ベクター、又は項目ＤＤ～ＨＨのいずれか１項に記載のＨＬＡ融合タンパク質を含む細胞。
【0171】
項目ＬＬ． 項目Ｚ～ＣＣのいずれか１項に規定される方法から得られるＨＬＡ融合タンパク質、項目ＤＤ～ＨＨのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、項目ＩＩに記載の核酸、又は項目ＪＪに記載の核酸発現ベクターを含む、悪性新生物疾患の治療における使用のための医薬組成物。
【0172】
項目ＭＭ．
－ 医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に、投与され、
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと結合することができ、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
項目ＬＬに記載の使用のための医薬組成物。
－ 医薬組成物は、チェックポイント阻害剤の前に、それと組み合わせて、又はその後に、投与され、
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと結合することができ、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
項目ＬＬに記載の使用のための医薬組成物。
【0173】
項目ＮＮ． 悪性新生物疾患の治療に使用するチェックポイント阻害剤であって、
チェックポイント阻害剤は、項目Ｚ～ＣＣ、又はＨＨのいずれか１項に記載の方法から得られるＨＬＡ融合タンパク質、項目ＤＤ～ＨＨのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、項目ＩＩに記載の核酸、又は項目ＪＪに記載の核酸発現ベクターと組み合わせて投与され、
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと結合することができ、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
前記チェックポイント阻害剤。
チェックポイント阻害剤は、項目Ｚ～ＣＣ、又はＨＨのいずれか１項に記載の方法から得られるＨＬＡ融合タンパク質、項目ＤＤ～ＨＨのいずれか１項に記載の単離されたＨＬＡ融合タンパク質、項目ＩＩに記載の核酸、又は項目ＪＪに記載の核酸発現ベクターと組み合わせて投与され、
－ 特にチェックポイント阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体様分子から選択され、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、少なくとも１０－７ｍｏｌ／Ｌの解離定数で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２のうちの１つと結合することができ、かつ
－ 特に前記チェックポイント阻害抗体は、全身投与用の剤形で提供される、
前記チェックポイント阻害剤。
【0174】
本明細書において、単一の分離可能な特徴の代替形態が「実施形態」として記載されている場合、そのような代替形態を自由に組み合わせて、本明細書に開示された発明の別個の実施形態を形成することができると理解されたい。
【0175】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を導き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0176】
材料及び方法
クローンプールの生成
分泌リーダーシグナルが先行するＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ（配列番号０１２）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ（配列番号００６）をコードするＣＤＮＡを発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）に別々にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するこれらのベクター構築物を、ＮＥＯＮトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）により、β２ｍタンパク質（配列番号０１４）をコードする核酸（配列番号０１３）を含むプラスミドと共トランスフェクトした。同じプロセスを使用して、ＨＬＡ－Ａ３０：０１（配列番号０２１）、ＨＬＡ－Ｂ５８：０１（配列番号０２２）、又はＨＬＡ－Ｃｗ０８：０２（配列番号０２３）の細胞外ドメイン、又はＨＬＡ重鎖ポリペプチドの４６位及び９７位における１個又は２個のアミノ酸置換を特徴とする変異型細胞外ドメインを含む代替的な免疫原性ＨＬＡクラスＩ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターを作製した。各ＨＬＡ－Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ドメイン部分にＥ４６アミノ酸残基又はＲ９７残基を付加又は除去するアミノ酸置換の影響を測定するために、以下のとおり導入して改変構築物を作成した：ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ（配列番号０２４）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｉ９７Ｒ（配列番号０２５）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ／Ｉ９７Ｒ（配列番号０２６）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ（配列番号０２７）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ｖ９７Ｒ（配列番号０２８）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ（配列番号０１５）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ（配列番号０２９）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｒ９７Ｖ（配列番号０３０）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０３１）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ（配列番号０３２）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｒ９７Ｖ（配列番号０３３）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０３４）。
クローンプールの生成
分泌リーダーシグナルが先行するＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ（配列番号０１２）及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ（配列番号００６）をコードするＣＤＮＡを発現ベクター（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ）に別々にクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するこれらのベクター構築物を、ＮＥＯＮトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＭＰＫ１００９６）を用いたマイクロポレーション（ＭＰ）により、β２ｍタンパク質（配列番号０１４）をコードする核酸（配列番号０１３）を含むプラスミドと共トランスフェクトした。同じプロセスを使用して、ＨＬＡ－Ａ３０：０１（配列番号０２１）、ＨＬＡ－Ｂ５８：０１（配列番号０２２）、又はＨＬＡ－Ｃｗ０８：０２（配列番号０２３）の細胞外ドメイン、又はＨＬＡ重鎖ポリペプチドの４６位及び９７位における１個又は２個のアミノ酸置換を特徴とする変異型細胞外ドメインを含む代替的な免疫原性ＨＬＡクラスＩ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターを作製した。各ＨＬＡ－Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ドメイン部分にＥ４６アミノ酸残基又はＲ９７残基を付加又は除去するアミノ酸置換の影響を測定するために、以下のとおり導入して改変構築物を作成した：ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ（配列番号０２４）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｉ９７Ｒ（配列番号０２５）、ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ／Ｉ９７Ｒ（配列番号０２６）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ（配列番号０２７）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ｖ９７Ｒ（配列番号０２８）、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ（配列番号０１５）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ（配列番号０２９）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｒ９７Ｖ（配列番号０３０）、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０３１）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ（配列番号０３２）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｒ９７Ｖ（配列番号０３３）、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ（配列番号０３４）。
【0177】
ＣＨＯ－ＤＧ４４スターター細胞を、ＨＬＡ－Ｆｃとβ２ｍプラスミドの比率を変えてトランスフェクトした（４：１、２：１、１：１、１：２）。選択したクローンプールは、標準シェーカーフラスコで、ピューロマイシン及びメトトレキセートを含むＰＢＧ－ＣＤ－Ｃ４添加培地１２５ｍＬ中に、４Ｅ５ ｖｃ／ｍＬの細胞播種密度で培養した。抗生物質で調整された選択圧の後、個々のクローンプールを分析のために選択した。生存率及び生存細胞密度の測定は、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲシステム及びトリパンブルー細胞排除法を用いて行った。力価の定量は、プロテインＡバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、異なる時点（日数）で測定した。
【0178】
ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの精製、及びβ２ｍの除去手順
分泌されたＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍを含有するろ過した上清をアフィニティーカラム精製に使用した。酸性条件下でのタンパク質の精製及びβ２ｍの除去を２段階の精製プロトコールとして行った。第一段階として、上清からＨＬＡ－Ｂ５７＋β２ｍ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）＋β２ｍを捕捉するために、プロテインＧセファロース［（４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）Ｓｉｇｍａ、＃ＧＥ－１７－０６１８－０１）］ビーズを使用した。ロッカーにおいて４度で一晩インキュベートした後、回収したビーズをＰＢＳで洗浄し、続いて標準ＩｇＧ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ２．８）（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＃２１００４）を使用してタンパク質を溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーに基づく精製の第二段階として、酸性条件下でＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）をβ２ｍから分離した。分離には、クエン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ３．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ １０／３００ゲルろ過カラムを使用した。２．０ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を０．５ｍｌ注入したところ、目的の非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（配列番号０１８）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（配列番号０１５）タンパク質のピークは１２．７ｍｌで溶出し、β２ｍのピークは２２．０ｍｌで溶出した。これらの結果は、β２ｍの分離、及び非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の精製は酸性条件下が適していることを実証する。
分泌されたＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍを含有するろ過した上清をアフィニティーカラム精製に使用した。酸性条件下でのタンパク質の精製及びβ２ｍの除去を２段階の精製プロトコールとして行った。第一段階として、上清からＨＬＡ－Ｂ５７＋β２ｍ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）＋β２ｍを捕捉するために、プロテインＧセファロース［（４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）Ｓｉｇｍａ、＃ＧＥ－１７－０６１８－０１）］ビーズを使用した。ロッカーにおいて４度で一晩インキュベートした後、回収したビーズをＰＢＳで洗浄し、続いて標準ＩｇＧ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ２．８）（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＃２１００４）を使用してタンパク質を溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーに基づく精製の第二段階として、酸性条件下でＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）をβ２ｍから分離した。分離には、クエン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ３．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ １０／３００ゲルろ過カラムを使用した。２．０ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を０．５ｍｌ注入したところ、目的の非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（配列番号０１８）、及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（配列番号０１５）タンパク質のピークは１２．７ｍｌで溶出し、β２ｍのピークは２２．０ｍｌで溶出した。これらの結果は、β２ｍの分離、及び非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の精製は酸性条件下が適していることを実証する。
【0179】
ＬＩＬＲＢ２と、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）との相互作用の定量
ＬＩＬＲＢ２と非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）との相互作用の親和性の定量は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて行った。平底のＰｉｅｒｃｅ（商標）ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１５５００）を使用して、ｃ末端ビオチン化抗原分子（ＬＩＬＲＢ２、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３３５）５０μｌをＰＢＳバッファー中の最終濃度５μｇ／ｍｌで固定化した。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用した。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７、又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の連続希釈液（濃度８点：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）を繰り返して（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）適用した（５０μｌ）。検出には、ＴＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８）を用いた。最後に、各ウェルに５０μｌのＴＢＳを加え、及びＡＰＣの励起波長６５０ｎｍ及び発光波長６６０ｎｍで蛍光スキャンを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．２を用い、３種のパラメーターに基づくｌｏｇ（アゴニスト）と反応モデルとを用いて相互作用のＥＣ５０を決定した。
ＬＩＬＲＢ２と非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）との相互作用の親和性の定量は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて行った。平底のＰｉｅｒｃｅ（商標）ストレプトアビジンでコーティングした高結合能９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１５５００）を使用して、ｃ末端ビオチン化抗原分子（ＬＩＬＲＢ２、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３３５）５０μｌをＰＢＳバッファー中の最終濃度５μｇ／ｍｌで固定化した。陰性コントロールとしてＰＢＳ及びＩｇＧアイソタイプを使用した。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７、又はＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の連続希釈液（濃度８点：１０、２．５、１、０．２５、０．１、０．０２５、０．０１、０．００２５μｇ／ｍｌ）を繰り返して（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）適用した（５０μｌ）。検出には、ＴＢＳ（５０μｌ）で１：１００に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１３５－０９８）を用いた。最後に、各ウェルに５０μｌのＴＢＳを加え、及びＡＰＣの励起波長６５０ｎｍ及び発光波長６６０ｎｍで蛍光スキャンを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．２を用い、３種のパラメーターに基づくｌｏｇ（アゴニスト）と反応モデルとを用いて相互作用のＥＣ５０を決定した。
【0180】
抗体染色
フローサイトメトリーはＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。Ｔ細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８は、抗体染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により１：１００の希釈で評価した。マクロファージ上のＨＬＡ－ＤＲ発現は、抗体染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により１：１００の希釈率で評価した。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１：１００の希釈率で用いて、マクロファージ偏光パネルを行った。すべての染色は氷上で２０分間行った後、標準的な方法に従って洗浄し、再懸濁した。
フローサイトメトリーはＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。Ｔ細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８は、抗体染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により１：１００の希釈で評価した。マクロファージ上のＨＬＡ－ＤＲ発現は、抗体染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により１：１００の希釈率で評価した。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１：１００の希釈率で用いて、マクロファージ偏光パネルを行った。すべての染色は氷上で２０分間行った後、標準的な方法に従って洗浄し、再懸濁した。
【0181】
Ｔ細胞殺傷アッセイ
共培養アッセイでは、ヒトＴ細胞を健常人ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８活性剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１１１３１Ｄ）で刺激し、５０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２の存在下で４８時間培養した。その後、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８活性剤から洗浄し、示されたヒト白血病細胞とＵ字底９６ウェルプレートに二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルで混合した。化合物を各ウェルに指示濃度で添加した。白血病細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３４５５７）で製造元の指示に従い共培養前に染色した。異なる白血病細胞株について、プレーティングした細胞数、Ｅ：Ｔ比、共培養期間を試験し、関連図に示した。共培養液を倒立顕微鏡で撮影し、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体で染色し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ａｎａｌｙｚｅｒで解析した。生がん細胞はバイオレット細胞増殖マーカーに対して陽性であり、ｓｙｔｏｘ赤色死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｓ３４８５９）に対して陰性であった。Ｔ細胞とバイオレット染色陽性がん細胞の絶対数は、Ｂｒｉｇｈｔ ｃｏｕｎｔ ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３６５９０）を用いて測定した。
共培養アッセイでは、ヒトＴ細胞を健常人ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８活性剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１１１３１Ｄ）で刺激し、５０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２の存在下で４８時間培養した。その後、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８活性剤から洗浄し、示されたヒト白血病細胞とＵ字底９６ウェルプレートに二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルで混合した。化合物を各ウェルに指示濃度で添加した。白血病細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３４５５７）で製造元の指示に従い共培養前に染色した。異なる白血病細胞株について、プレーティングした細胞数、Ｅ：Ｔ比、共培養期間を試験し、関連図に示した。共培養液を倒立顕微鏡で撮影し、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体で染色し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ａｎａｌｙｚｅｒで解析した。生がん細胞はバイオレット細胞増殖マーカーに対して陽性であり、ｓｙｔｏｘ赤色死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｓ３４８５９）に対して陰性であった。Ｔ細胞とバイオレット染色陽性がん細胞の絶対数は、Ｂｒｉｇｈｔ ｃｏｕｎｔ ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｃ３６５９０）を用いて測定した。
【0182】
マクロファージ貪食フローサイトメトリーに基づくアッセイ
初代ヒトドナー由来単球を健常ドナーのＰＢＭＣから単離し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０９６１）＋５０ｕｇ／ｍｌのｒｈＭＣＳＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃７８０５７．１）で５～７日間培養することによりマクロファージに分化させた。プレーティング後１日目に、化合物を２０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに添加した。プレーティング後５～７日目に、化合物を再びマクロファージに添加し、２種のダウンストリーム実験を行った：１）マクロファージの極性化：極性化研究のために、培養したマクロファージを、化合物による第２の治療後１日目に、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、及びＣＤ２０９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。２）貪食：１２ウェルプレート中の１×１０６のマクロファージに対して標的細胞を０．５×１０６の比率でマクロファージ上にプレーティングし、貪食についてプレーティング後１６時間分析した。標的細胞は、共培養の前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞増殖マーカーで染色したため、フローサイトメトリーによってＨＬＡ－ＤＲで染色されたマクロファージと区別することが可能であった。貪食作用は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０．６．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて解析されるとおり、ＨＬＡ－ＤＲ陽性マクロファージからのバイオレット染色陽性標的細胞の割合として評価した。それぞれの貪食反応は技術的に二重に行った。すべての生物学的複製は独立したヒトマクロファージドナーを示す。
初代ヒトドナー由来単球を健常ドナーのＰＢＭＣから単離し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０９６１）＋５０ｕｇ／ｍｌのｒｈＭＣＳＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃７８０５７．１）で５～７日間培養することによりマクロファージに分化させた。プレーティング後１日目に、化合物を２０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに添加した。プレーティング後５～７日目に、化合物を再びマクロファージに添加し、２種のダウンストリーム実験を行った：１）マクロファージの極性化：極性化研究のために、培養したマクロファージを、化合物による第２の治療後１日目に、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、及びＣＤ２０９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。２）貪食：１２ウェルプレート中の１×１０６のマクロファージに対して標的細胞を０．５×１０６の比率でマクロファージ上にプレーティングし、貪食についてプレーティング後１６時間分析した。標的細胞は、共培養の前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞増殖マーカーで染色したため、フローサイトメトリーによってＨＬＡ－ＤＲで染色されたマクロファージと区別することが可能であった。貪食作用は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０．６．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて解析されるとおり、ＨＬＡ－ＤＲ陽性マクロファージからのバイオレット染色陽性標的細胞の割合として評価した。それぞれの貪食反応は技術的に二重に行った。すべての生物学的複製は独立したヒトマクロファージドナーを示す。
【0183】
Ｉｎ ｖｉｖｏ治療
Ｃ３８腫瘍片を、同系遺伝子雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注入した。大腸の腫瘍が±５０ｍｍ３に達した時点で、動物たちはそれぞれの腫瘍体積の大きさに応じて分配され、動物たちの間で統計学的な差を示さない群に分けられた。腫瘍の直径はノギスを用いて測定し、体積はＤ／２×ｄ２（式中、Ｄ及びｄはそれぞれ腫瘍の最長径及び最短径（ｍｍ）である）の式に従って算出した。細胞の注入時点及び物質の注入の実験計画は以下のように設定した：アイソタイプＩｇＧ４（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；Ｂｉｗｋ＝隔週。
Ｃ３８腫瘍片を、同系遺伝子雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注入した。大腸の腫瘍が±５０ｍｍ３に達した時点で、動物たちはそれぞれの腫瘍体積の大きさに応じて分配され、動物たちの間で統計学的な差を示さない群に分けられた。腫瘍の直径はノギスを用いて測定し、体積はＤ／２×ｄ２（式中、Ｄ及びｄはそれぞれ腫瘍の最長径及び最短径（ｍｍ）である）の式に従って算出した。細胞の注入時点及び物質の注入の実験計画は以下のように設定した：アイソタイプＩｇＧ４（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）（１０ｍｇ／Ｋｇ）隔週×３；Ｂｉｗｋ＝隔週。
【0184】
実施例１：ＨＬＡ配列と発現レベルの相関
ＨＬＡ重鎖非β２ｍ会合Ｉｇ Ｆｃ融合タンパク質の発現プロファイルを医療用に最適化するために、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いた一過性トランスフェクションシステムにおいて、収量の増加に関連する可能性のある残基を同定するために、様々なＨＬＡ重鎖配列のタンパク質配列をアライメントした。この比較から、多様なＨＬＡ分子に存在する特異的なグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）アミノ酸残基は、上清中で測定される組換えタンパク質濃度によって測定される発現の増加と相関していることが示された。このことは、これらのアミノ酸置換の変化が、哺乳類細胞で発現させた場合に、関係するＨＬＡタンパク質の優れた発現レベルを変異型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）に付与している可能性を示唆している（図１及び２）。
ＨＬＡ重鎖非β２ｍ会合Ｉｇ Ｆｃ融合タンパク質の発現プロファイルを医療用に最適化するために、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いた一過性トランスフェクションシステムにおいて、収量の増加に関連する可能性のある残基を同定するために、様々なＨＬＡ重鎖配列のタンパク質配列をアライメントした。この比較から、多様なＨＬＡ分子に存在する特異的なグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）アミノ酸残基は、上清中で測定される組換えタンパク質濃度によって測定される発現の増加と相関していることが示された。このことは、これらのアミノ酸置換の変化が、哺乳類細胞で発現させた場合に、関係するＨＬＡタンパク質の優れた発現レベルを変異型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）に付与している可能性を示唆している（図１及び２）。
【0185】
ＨＬＡ－Ｂ５７ハプロタイプは、免疫表現型との遺伝的連関によって特徴づけられ、免疫グロブリン様レセプターサブファミリーＢメンバー２（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ２：ＬＩＬＲＢ２）を含む自然レセプターに結合することから、ＨＬＡ－Ｂ５７タンパク質配列は、ＨＬＡ融合タンパク質に用いるのに特に望ましいＨＬＡ重鎖構成要素となる。置換変異を天然に存在するＨＬＡ－Ｂ５７：０１タンパク質（配列番号００１）のＨＬＡ－Ｂ５７アルファ１、２、及び３ドメインに基づくＨＬＡ－ＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列に導入し、４６位のＡをＥに、９７位のＶをＲに交換した（図１）。次いで、２つのＨＬＡ融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。これは、２つの異なるＨＬＡ重鎖ポリペプチドの選択肢；野生型ＨＬＡ－Ｂ５７細胞外ポリペプチド（配列番号０１２、ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ）、又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）ポリペプチド（配列番号００６、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ）のいずれかのうちの一方と短いアミノ酸架橋配列により連結されてなるＩｇＧ４ポリペプチドを含む。各構築物を別々に発現ベクターにクローニングした。ＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃを発現するベクター構築物を、ヒトβ２ｍタンパク質をコードする第２のプラスミドを一定範囲の比率で組み合わせてＣＨＯ細胞に共導入した。
【0186】
実施例２：ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの改善された発現
置換アミノ酸残基が組換えＨＬＡ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質の発現又は収量に影響するかどうかを試験するため、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ構築物を発現するＣＨＯ細胞クローンを単離し、サブクローニングし、そして、野生型（ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ）又は変異ＨＬＡ－Ｂ５７（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ）融合タンパク質のいずれかと共に得られたβ２ｍを含む複合体をプロテインＡバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）により評価した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ産生クローンは、ＨＬＡ－Ｂ５７：β２ｍ発現コントロール細胞と比較して、細胞数の増加を示し、上清中に有意に高い力価のＨＬＡ融合タンパク質を産生した（図３）。２つの変異（配列番号０２０）に加えて代替的な分泌シグナルを含む構造でも、同様の組換え融合タンパク質の上清収量が得られた。ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ、及びβ２ｍのＲＮＡレベルは細胞クローン間で同等であったことから、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの高力価発現はＤＮＡコピー数の多さとは相関せず、むしろ新しい構築物の本質的な効率的フォールディング、溶解性、安定性に関連していることが示された（図４）。精製タンパク質のＨＰＬＣ分析から、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物を発現しているクローンの上清では、親型ＨＬＡ－Ｂ５７構築物の上清で高分子量オリゴマーが増加したのに比べ、低分子量のＨＬＡ重鎖／β２ｍ二量体が高い比率で得られたことが示された（図５）。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物の収量の増加はまた、β２ｍ軽鎖と会合していないＨＬＡを含む単量体を精製し、リフォールディングした後でも明らかであった（図６；図７に要約）。
置換アミノ酸残基が組換えＨＬＡ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質の発現又は収量に影響するかどうかを試験するため、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ及びＨＬＡ－Ｂ５７－Ｆｃ構築物を発現するＣＨＯ細胞クローンを単離し、サブクローニングし、そして、野生型（ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ）又は変異ＨＬＡ－Ｂ５７（ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ）融合タンパク質のいずれかと共に得られたβ２ｍを含む複合体をプロテインＡバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）により評価した。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ産生クローンは、ＨＬＡ－Ｂ５７：β２ｍ発現コントロール細胞と比較して、細胞数の増加を示し、上清中に有意に高い力価のＨＬＡ融合タンパク質を産生した（図３）。２つの変異（配列番号０２０）に加えて代替的な分泌シグナルを含む構造でも、同様の組換え融合タンパク質の上清収量が得られた。ＨＬＡ－Ｂ５７．β２ｍ、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍ、及びβ２ｍのＲＮＡレベルは細胞クローン間で同等であったことから、ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）．β２ｍの高力価発現はＤＮＡコピー数の多さとは相関せず、むしろ新しい構築物の本質的な効率的フォールディング、溶解性、安定性に関連していることが示された（図４）。精製タンパク質のＨＰＬＣ分析から、変異型ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物を発現しているクローンの上清では、親型ＨＬＡ－Ｂ５７構築物の上清で高分子量オリゴマーが増加したのに比べ、低分子量のＨＬＡ重鎖／β２ｍ二量体が高い比率で得られたことが示された（図５）。ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）構築物の収量の増加はまた、β２ｍ軽鎖と会合していないＨＬＡを含む単量体を精製し、リフォールディングした後でも明らかであった（図６；図７に要約）。
【0187】
実施例３：ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の免疫調節特性
ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の活性をいくつかのアッセイでＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）の親構造体と比較し、ＨＬＡ ＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡドメインの生物学的活性が２つのアミノ酸の変化の付加によって損なわれないことを確認した。非変異型又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖配列に基づく非β２ｍ会合化合物のＥＬＩＳＡ分析では、２つのアミノ酸置換がＬＩＬＲＢ２への結合を低下させないことが示され、実際に変異型ＨＬＡ融合タンパク質は、ＬＩＬＲＢ２結合飽和度のＥＣ５０値が改善され、より低い値を示した（図８）。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）コンフォーマーの免疫調節効果は、Ｔ細胞の殺傷能力を高める能力を測定するアッセイ（図９）、及び様々な腫瘍細胞株で培養したＭ１マクロファージの極性化（代表的な表面表現型マーカーで測定）及び貪食能力を測定するアッセイ（図１０及び１１）において、アミノ酸置換を欠くコントロールと同等であった。最後に、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ分子は、腹腔内に送達される場合、モデルマウスの結腸がん増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療的免疫賦活作用を示した（図１２）。
ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）の活性をいくつかのアッセイでＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）の親構造体と比較し、ＨＬＡ ＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡドメインの生物学的活性が２つのアミノ酸の変化の付加によって損なわれないことを確認した。非変異型又は変異型ＨＬＡ－Ｂ５７重鎖配列に基づく非β２ｍ会合化合物のＥＬＩＳＡ分析では、２つのアミノ酸置換がＬＩＬＲＢ２への結合を低下させないことが示され、実際に変異型ＨＬＡ融合タンパク質は、ＬＩＬＲＢ２結合飽和度のＥＣ５０値が改善され、より低い値を示した（図８）。非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６／Ｖ９７）コンフォーマーの免疫調節効果は、Ｔ細胞の殺傷能力を高める能力を測定するアッセイ（図９）、及び様々な腫瘍細胞株で培養したＭ１マクロファージの極性化（代表的な表面表現型マーカーで測定）及び貪食能力を測定するアッセイ（図１０及び１１）において、アミノ酸置換を欠くコントロールと同等であった。最後に、非β２ｍ会合ＨＬＡ－Ｂ５７（Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ）－Ｆｃ分子は、腹腔内に送達される場合、モデルマウスの結腸がん増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療的免疫賦活作用を示した（図１２）。
【0188】
実施例４：Ｅ６Ｅ及び９７Ｒを伴うＨＬＡクラスＩ重鎖発現の改善
ヒト集団において異なる免疫表現型に関連する種々のＨＬＡクラスＩ重鎖の最適な組換え発現のための４６Ｅ及び９７Ｒ残基の重要性を確認するために、本発明者らは、ヒト集団において異なる免疫原性効果に関連する追加のＨＬＡクラスＩ重鎖ポリペプチド配列、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５８、及びＨＬＡ－Ｃ０８を含む追加のＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質構築物に対するこれらのアミノ酸置換の影響を測定した（図１３）。ＨＬＡアレル：ＨＬＡ－Ａ３０、Ａ＊３０：０１：０１：０１（配列番号０２１）、ＨＬＡ－Ｂ５７ Ｂ＊５７：０１：０１：０１（配列番号０１８）、ＨＬＡ－Ｂ５８、Ｂ＊５８：０１：０１：０１（配列番号０２２）、及びＨＬＡ－Ｃ０８、Ｃ＊０８：０２：０１：０１（配列番号０２３）について、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡオンラインデータアレル報告機能により提供されたＨＬＡ重鎖タンパク質配列の細胞外ドメインを含む野生型ＨＬＡ ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターを作成した。次に、各ＨＬＡ－Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ドメイン部分にＥ４６アミノ酸残基又はＲ９７残基を付加又は除去するアミノ酸置換の影響を測定するために、以下のとおり導入して改変構築物を作成した：ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ａ３０Ｉ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ／Ｉ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ｖ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ。次いで、野生型及び変異型のＨＬＡ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質とβ２ｍとをコードする核酸発現ベクターを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞によるβ２ｍ会合ＨＬＡ構築物の生産収率を、ＣＨＯ細胞の上清中で、プロテインＡバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて評価した。
ヒト集団において異なる免疫表現型に関連する種々のＨＬＡクラスＩ重鎖の最適な組換え発現のための４６Ｅ及び９７Ｒ残基の重要性を確認するために、本発明者らは、ヒト集団において異なる免疫原性効果に関連する追加のＨＬＡクラスＩ重鎖ポリペプチド配列、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５８、及びＨＬＡ－Ｃ０８を含む追加のＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質構築物に対するこれらのアミノ酸置換の影響を測定した（図１３）。ＨＬＡアレル：ＨＬＡ－Ａ３０、Ａ＊３０：０１：０１：０１（配列番号０２１）、ＨＬＡ－Ｂ５７ Ｂ＊５７：０１：０１：０１（配列番号０１８）、ＨＬＡ－Ｂ５８、Ｂ＊５８：０１：０１：０１（配列番号０２２）、及びＨＬＡ－Ｃ０８、Ｃ＊０８：０２：０１：０１（配列番号０２３）について、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡオンラインデータアレル報告機能により提供されたＨＬＡ重鎖タンパク質配列の細胞外ドメインを含む野生型ＨＬＡ ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸発現ベクターを作成した。次に、各ＨＬＡ－Ｆｃ融合タンパク質のＨＬＡ重鎖細胞外ドメイン部分にＥ４６アミノ酸残基又はＲ９７残基を付加又は除去するアミノ酸置換の影響を測定するために、以下のとおり導入して改変構築物を作成した：ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ａ３０Ｉ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ａ３０Ｅ４６Ａ／Ｉ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ｖ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５７Ａ４６Ｅ／Ｖ９７Ｒ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｂ５８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｒ９７Ｖ、ＨＬＡ－Ｃ０８Ｅ４６Ａ／Ｒ９７Ｖ。次いで、野生型及び変異型のＨＬＡ重鎖ＩｇＧ４融合タンパク質とβ２ｍとをコードする核酸発現ベクターを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞によるβ２ｍ会合ＨＬＡ構築物の生産収率を、ＣＨＯ細胞の上清中で、プロテインＡバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて評価した。
【0189】
これらの結果から、試験したすべての分子において、アミノ酸４６Ｅ残基と９７Ｒ残基との両方を特徴とするＨＬＡ重鎖が最適な組換えタンパク質の収量と関連し、かつＨＬＡ－Ｂ５７重鎖配列にＡ４６ＥとＶ９７Ｒとの両方の置換を導入することで、すべての構築物の中で最も高い収量が得られることが確認された。逆に、野生型ＨＬＡ－Ｂ５７に存在する４６Ａと９７Ｖとの両方をＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ｂ５８、又はＨＬＡ－Ｃ０８に導入する場合、生産収率が著しく低下した。このことから、アミノ酸４６Ｅと９７Ｒとが、ＨＬＡ－Ｆｃ分子を含むＨＬＡ重鎖の安定化と最適な力価の産生にとって重要であることが確認された。
【0190】
【0191】
引用文献：
Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）
Ａｒｏｓａら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ Ｍａｒ；２８（３）：１１５－２３
国際公開（ＷＯ）第２０１７／１５３４３８号（Ａ１）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】