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特表2024-529098潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質及びこれを含む潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質及びこれを含む潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 14/485 20060101AFI20240725BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240725BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20240725BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240725BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
C07K14/485 ZNA
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61K38/18
A61P1/04
A61P29/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508073
(86)(22)【出願日】2022-10-12
(85)【翻訳文提出日】2024-02-08
(86)【国際出願番号】 KR2022015344
(87)【国際公開番号】W WO2023080460
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】10-2021-0151300
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518160702
【氏名又は名称】ネクセル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100201329
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 真二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100167601
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 信之
(74)【代理人】
【識別番号】100220917
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 忠大
(72)【発明者】
【氏名】ハン、チュンソン
(72)【発明者】
【氏名】ウー、ドンフン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ミンギョン
(72)【発明者】
【氏名】パク、チャンヒョク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジョンチュル
(72)【発明者】
【氏名】キム、チャングン
(72)【発明者】
【氏名】キム、グクド
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジェフン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084CA53
4C084DB53
4C084MA55
4C084MA59
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA66
4C084ZB11
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み換えられた潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質であって、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなり、予防又は治療対象に投与されることで、発病した潰瘍性大膓炎の予防或いは治療が期待できる。なお、本発明は、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなるように乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み換えられた潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質を有効成分として含む薬学組成物に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳脂防球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組換えタンパク質であって、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項2】
前記組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることを特徴とする、請求項１に記載の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項3】
前記組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることを特徴とする、請求項１に記載の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項4】
前記組換えタンパク質は、予防又は治療対象の血中インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）濃度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることを特徴とする、請求項１に記載の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項5】
前記組換えタンパク質は、予防又は治療対象の潰瘍性大膓炎によって誘発される体重減少程度及び大腸長さの縮小程度を、非投与状況に比べて減少させることを特徴とする、請求項１に記載の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項6】
前記組換えタンパク質は、病変内投与、血管内投与、皮下投与、鼻腔内投与又は腹腔内投与用に剤形化されることを特徴とする、請求項１に記載の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項による潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質を有効成分として含む潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項による潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項による潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質及びこれを含む潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物をはじめとする様々な用途としての関連実施形態に関する。
【背景技術】
【0002】
潰瘍性大膓炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）は、大腸に炎症が発生して粘膜と粘膜下層を炎症細胞が侵犯する形態で現れるが、その代表症状として血便症状があり、さらには、下痢、粘液便、腹痛、我慢できない便意、しぶり腹などのような症状をはじめとして体重減少、発熱、食欲不振、全身衰弱、吐き気、嘔吐などの全身症状まで現れることがある。
正常な大腸組織は、粘膜、粘膜下組織、筋肉層、漿膜に分けられているが、潰瘍性大膓炎の発生によって粘膜と粘膜下組織で病理学的な変化が発生し、正確な原因は未だ知られていないが、環境的要因、遺伝的要因に加え、腸内に正常に存在する細菌に対する身体の過度な免疫反応などが主な発病要因とされている慢性再発性疾患である。
このような潰瘍性大膓炎は、従来、米国やヨーロッパのように主に肉食をする地域で発病率が高く、米国では毎年百万人程度の患者が発生する疾患であったが、最近では、韓国を含めてアジア地域でも患者数が益々増え、２０２０年傷病コードＫ５１の韓国内潰瘍性大膓炎の入院及び外来診療患者は２０１０年に比し約１．７倍増加しており、療養給与費用も２０１０年に比し３倍以上増加して１，６３２億ウォン程度に至っている。
また、潰瘍性大膓炎の標準薬物治療剤として５－アミノサルチル酸（５－ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，５－ＡＳＡ）、及び生物学的製剤が使用されているが、患者の２０％～４０％が薬物治療に失敗したり副作用によって大腸切除術を受けることになる。
これと関連して、潰瘍性大膓炎治療用薬学組成物の従来技術として大韓民国登録特許公報第１０－２３１９０７８号の「潰瘍性大膓炎の治療用医薬組成物」（特許文献１）がある。
正常な大腸組織は、粘膜、粘膜下組織、筋肉層、漿膜に分けられているが、潰瘍性大膓炎の発生によって粘膜と粘膜下組織で病理学的な変化が発生し、正確な原因は未だ知られていないが、環境的要因、遺伝的要因に加え、腸内に正常に存在する細菌に対する身体の過度な免疫反応などが主な発病要因とされている慢性再発性疾患である。
このような潰瘍性大膓炎は、従来、米国やヨーロッパのように主に肉食をする地域で発病率が高く、米国では毎年百万人程度の患者が発生する疾患であったが、最近では、韓国を含めてアジア地域でも患者数が益々増え、２０２０年傷病コードＫ５１の韓国内潰瘍性大膓炎の入院及び外来診療患者は２０１０年に比し約１．７倍増加しており、療養給与費用も２０１０年に比し３倍以上増加して１，６３２億ウォン程度に至っている。
また、潰瘍性大膓炎の標準薬物治療剤として５－アミノサルチル酸（５－ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，５－ＡＳＡ）、及び生物学的製剤が使用されているが、患者の２０％～４０％が薬物治療に失敗したり副作用によって大腸切除術を受けることになる。
これと関連して、潰瘍性大膓炎治療用薬学組成物の従来技術として大韓民国登録特許公報第１０－２３１９０７８号の「潰瘍性大膓炎の治療用医薬組成物」（特許文献１）がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、上記問題点を解決するために案出されたものであり、本発明の目的は、潰瘍性大膓炎の発病を遅延させるか、疾患を治療できる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質及びこれを有効成分として含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
上記の目的を達成するために、本発明に係る潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組換えタンパク質で、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる。
ここで、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内の粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
なお、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象の血中インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）濃度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象の潰瘍性大膓炎によって誘発される体重減少程度及び大腸長さの縮小程度を、非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、病変内投与、血管内投与、皮下投与、鼻腔内投与又は腹腔内投与用に剤形化されてよい。
一方、上記の目的を達成するために、本発明に係る潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質を有効成分として含む。
そして、上記の目的を達成するために、本発明は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子を他の態様として提供する。
また、上記の目的を達成するために、本発明は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターをさらに他の態様として提供する。
ここで、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内の粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
なお、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象の血中インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）濃度を、前記組換えタンパク質の非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、予防又は治療対象の潰瘍性大膓炎によって誘発される体重減少程度及び大腸長さの縮小程度を、非投与状況に比べて減少させることができる。
また、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質は、病変内投与、血管内投与、皮下投与、鼻腔内投与又は腹腔内投与用に剤形化されてよい。
一方、上記の目的を達成するために、本発明に係る潰瘍性大膓炎予防又は治療用組成物は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質を有効成分として含む。
そして、上記の目的を達成するために、本発明は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子を他の態様として提供する。
また、上記の目的を達成するために、本発明は、乳脂肪球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの組み替えられた配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列からなる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターをさらに他の態様として提供する。
【発明の効果】
【0005】
本発明によれば、次のような効果がある。
第一に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質の投与により、予防又は治療対象に発病した潰瘍性大膓炎の予防或いは治療を期待することができる。
第二に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を顕著に下げることができる。
第三に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を顕著に下げることができる。
第四に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象の血中インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）濃度を顕著に下げることができる。
第五に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象の潰瘍性大膓炎によって誘発される体重減少程度及び大腸長さの縮小程度を顕著に下げることができる。
第一に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質の投与により、予防又は治療対象に発病した潰瘍性大膓炎の予防或いは治療を期待することができる。
第二に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を顕著に下げることができる。
第三に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を顕著に下げることができる。
第四に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象の血中インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）濃度を顕著に下げることができる。
第五に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質により、予防又は治療対象の潰瘍性大膓炎によって誘発される体重減少程度及び大腸長さの縮小程度を顕著に下げることができる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の第１実施例に係るアミノ酸配列を示す。
【図2】図５に示すバックボーンベクター（Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ）の構造内に挿入可能であり、本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の第１実施例に係るアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す。
【図3】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の第２実施例に係るアミノ酸配列を示す。
【図4】図５に示すバックボーンベクターの構造内に挿入可能であり、本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の第２実施例に係るアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示す。
【図5】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）をコードする遺伝子が挿入されたバックボーンベクターの構造を示す。
【図6】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの作製過程を示す模式図である。
【図7】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの大腸組織内粘膜の陰窩損傷及び炎症細胞浸潤程度を分析した結果を示す。
【図8】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの体重変化様相及び差異を比較したグラフである。
【図9】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの大腸長さ変化様相及び差異を比較したグラフである。
【図10】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの作製過程を示す模式図である。
【図11】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの大腸組織内粘膜の陰窩損傷及び炎症細胞浸潤程度を分析した結果を示す。
【図12】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの体重変化様相及び差異を比較したグラフである。
【図13】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの大腸長さ変化様相及び差異を比較したグラフである。
【図14】本発明の潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証のために設計された動物実験モデルの血中インターロイキン－６（ＩＬ－６）濃度変化様相及び差異を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明の好ましい実施例について添付の図面を参照してより具体的に説明する。ただし、周知の技術的部分については、簡潔な説明のために説明を省略又は圧縮するものとする。
【0008】
１．潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）に関する説明
本発明に係る潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）が収得される過程及び収得されたタンパク質の構造的特徴について、以下、図１～図５を参照して詳細に説明する。
本発明に係る潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）が収得される過程及び収得されたタンパク質の構造的特徴について、以下、図１～図５を参照して詳細に説明する。
【0009】
（１）潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の収得
まず、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現過程を説明すると、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質構造改良のためにＯｒｉｇｅｎｅ社のＭＦＧ－Ｅ８（ＮＭ＿００５９２８）ヒトｃＤＮＡクローン（Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＧ２１７１６３）を購入し、これを鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いてＰＣＲを行い、図２又は図４に示すようなＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を得た。
その後、図５に示すような構造の哺乳動物細胞用発現ベクター（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＬＧＣＦベクターのＨｉｎｄIII及びＳａｌＩ制限酵素部位（図５のＡ部位）に、ＰＣＲ増幅によって得た図２又は図４のＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を挿入するクローニングを行った。
その後、プラスミドＤＮＡを抽出してＨＥＫ２９３細胞に形質導入（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２日後に培養液を集めてＦＬＡＧ樹脂（ｒｅｓｉｎで）免疫沈降反応（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＩＰ）させ、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現を確認したし、意図したＮＰ－０１１塩基配列（図２又は図４のような配列番号２又は配列番号４の塩基配列）が挿入されたコロニーを選別し、それを大量生産及び精製に利用する。
次に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の大量生産過程を説明すると、発現を確認したプラスミドＤＮＡをＭａｘｉ ｐｒｅｐで多量確保した後、ＨＥＫ２９３細胞を準備して大量のプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）に該当する組換えタンパク質の大量生産を行うことができる。
次に、選別されたコロニーは５０ｍＬ規模のフラスコ培養後にＮＰ－０１１発現を検証して生産性の最も高いクローンを選定したし、５Ｌ規模の流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）培養（ｐＨ ６．０）で７日培養して一次的に回収した培養液を、Ｑ－セファロースカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて不純タンパク質を除去し、二次的にＳｐ－セファロースカラムを用いてＮＰ－０１１タンパク質のみを吸着して純度９５％以上に精製する過程により、遠心分離ベースで純粋なＮＰ－０１１を精製する。
このような精製過程は、それぞれのタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ遺伝子が発現しているため、ＦＬＡＧアフィニティー樹脂を用いて標的タンパク質のみを結合させた後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄して標的タンパク質以外のタンパク質を除去することができる。
その後、溶出緩衝液（Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて純粋な標的タンパク質のみを抽出した後、最終的に得たタンパク質の確認のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で標的タンパク質の生産及び純度を確認することができる。
このような乳脂防球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現のためのクローニング、大量生産及び精製などのために前述した一連の具体的過程は、それに限定されず、後述する組換えタンパク質の具体的なアミノ酸配列構造（配列番号１（図１）又は配列番号３（図３））の構築のために当業界における技術者に公知されて自明なレベルの技術を用いて様々な方式によって具現可能である。
例えば、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）のクローニングに用いられる発現ベクターの構造、形質転換対象、生産条件及び形態、精製条件及び形態などの技術は、様々に実施可能である。
なお、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現と関連して、発現ベクターにクローニングされるＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造も、配列番号２（図２）又は配列番号４（図４）の構造を基本とするが、実施によって、特定シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする特定ＤＮＡ塩基配列がさらにＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）に連結される形態で実施されてもよい。
まず、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現過程を説明すると、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質構造改良のためにＯｒｉｇｅｎｅ社のＭＦＧ－Ｅ８（ＮＭ＿００５９２８）ヒトｃＤＮＡクローン（Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＧ２１７１６３）を購入し、これを鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いてＰＣＲを行い、図２又は図４に示すようなＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を得た。
その後、図５に示すような構造の哺乳動物細胞用発現ベクター（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＬＧＣＦベクターのＨｉｎｄIII及びＳａｌＩ制限酵素部位（図５のＡ部位）に、ＰＣＲ増幅によって得た図２又は図４のＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を挿入するクローニングを行った。
その後、プラスミドＤＮＡを抽出してＨＥＫ２９３細胞に形質導入（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２日後に培養液を集めてＦＬＡＧ樹脂（ｒｅｓｉｎで）免疫沈降反応（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＩＰ）させ、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現を確認したし、意図したＮＰ－０１１塩基配列（図２又は図４のような配列番号２又は配列番号４の塩基配列）が挿入されたコロニーを選別し、それを大量生産及び精製に利用する。
次に、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の大量生産過程を説明すると、発現を確認したプラスミドＤＮＡをＭａｘｉ ｐｒｅｐで多量確保した後、ＨＥＫ２９３細胞を準備して大量のプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）に該当する組換えタンパク質の大量生産を行うことができる。
次に、選別されたコロニーは５０ｍＬ規模のフラスコ培養後にＮＰ－０１１発現を検証して生産性の最も高いクローンを選定したし、５Ｌ規模の流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）培養（ｐＨ ６．０）で７日培養して一次的に回収した培養液を、Ｑ－セファロースカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて不純タンパク質を除去し、二次的にＳｐ－セファロースカラムを用いてＮＰ－０１１タンパク質のみを吸着して純度９５％以上に精製する過程により、遠心分離ベースで純粋なＮＰ－０１１を精製する。
このような精製過程は、それぞれのタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ遺伝子が発現しているため、ＦＬＡＧアフィニティー樹脂を用いて標的タンパク質のみを結合させた後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄して標的タンパク質以外のタンパク質を除去することができる。
その後、溶出緩衝液（Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて純粋な標的タンパク質のみを抽出した後、最終的に得たタンパク質の確認のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で標的タンパク質の生産及び純度を確認することができる。
このような乳脂防球ＥＧＦ因子－８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ８，ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現のためのクローニング、大量生産及び精製などのために前述した一連の具体的過程は、それに限定されず、後述する組換えタンパク質の具体的なアミノ酸配列構造（配列番号１（図１）又は配列番号３（図３））の構築のために当業界における技術者に公知されて自明なレベルの技術を用いて様々な方式によって具現可能である。
例えば、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）のクローニングに用いられる発現ベクターの構造、形質転換対象、生産条件及び形態、精製条件及び形態などの技術は、様々に実施可能である。
なお、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質に基づいて組み替えられて備えられる潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の発現と関連して、発現ベクターにクローニングされるＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造も、配列番号２（図２）又は配列番号４（図４）の構造を基本とするが、実施によって、特定シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする特定ＤＮＡ塩基配列がさらにＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）に連結される形態で実施されてもよい。
【0010】
（２）潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の構造
前述した、組換えタンパク質のクローニング、分離、生産、精製などの過程を経て最終的に備えられる乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、下記の配列目録内の配列番号１（図１）又は配列番号３（図３）に示すようなアミノ酸配列構造を備える。
特徴的には、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質の構造的構成であるＥＧＦ用ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインのうち、ＥＧＦ様ドメイン及びＣ１ドメインを含む構造として組み替えられる。
言い換えると、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、「ＥＧＦ様ドメイン＋Ｃ１ドメイン」のアミノ酸配列をなすことを基本構造としており、構造上、Ｃ２ドメインが排除されることを特徴とする。
より具体的には、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）が下記の配列目録内の配列番号１（図１）又は配列番号３（図３）として実施されることは、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質が遺伝子のＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）が同一であるが、単一核酸塩基多型現象（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）の変異によって様々なバージョンが存在するためである。
実際に、ＮＣＢＩのヒトゲノム配列（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）情報がアップデートされ、且つヨーロッパのタンパク質データベース（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ）であるＵｎｉＰｒｏｔＢＫにおいて乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）のオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）配列情報とやや異なる配列情報がアップデートされたし、Ｌを開始コドンにして配列番号１の５３番目のアミノ酸であるＭがＬに修正されている。
要するに、配列番号３の５３番目のアミノ酸が、図３に下線部分のようにＬに修正されている点は、図４の下線部分のようにＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造上、ＤＮＡ塩基配列のうち配列番号３の５３番目のアミノ酸Ｌに対応するトリプレットコードが「ＡＴＧ」から「ＣＴＧ」へとＳＮＰ変異によって変換されているためである。
これにより、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、ＳＮＰ変異による様々なバージョンの全てを基準とするが、構造上、「Ｃ２ドメイン」が排除され、「ＥＧＦ様ドメイン＋Ｃ１ドメイン」のアミノ酸配列をなすことが好ましい。
このような本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、潰瘍性大膓炎予防又は治療用に用いられる薬学的組成物の主要有効成分として用いられてよい。
なお、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）及びこれを主要有効成分とする薬学的組成物は、病変内投与、血管（動脈、静脈など）内投与、皮下投与、鼻腔内投与、腹腔内投与又は特定組織（肺組織）内投与用に剤形化されてよい。
一方、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、前述した組換えタンパク質の発現と関連して、発現ベクターにクローニングされるＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造的実施形態の範囲に対応し、実施によって特定シグナルペプチド構造がさらに連結されてもよい。
例えば、特定シグナルペプチド構造は、「ＭＰＲＰＲＬＬＡＡＬＣＧＡＬＬＣＡＰＳＬＬＶＡ」のようなアミノ酸配列を備えてＥＧＦ様ドメイン先端に連結される形態で実施可能であるが、これに限定されるものではない。
前述した、組換えタンパク質のクローニング、分離、生産、精製などの過程を経て最終的に備えられる乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、下記の配列目録内の配列番号１（図１）又は配列番号３（図３）に示すようなアミノ酸配列構造を備える。
特徴的には、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、ＭＦＧ－Ｅ８タンパク質の構造的構成であるＥＧＦ用ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインのうち、ＥＧＦ様ドメイン及びＣ１ドメインを含む構造として組み替えられる。
言い換えると、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、「ＥＧＦ様ドメイン＋Ｃ１ドメイン」のアミノ酸配列をなすことを基本構造としており、構造上、Ｃ２ドメインが排除されることを特徴とする。
より具体的には、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）が下記の配列目録内の配列番号１（図１）又は配列番号３（図３）として実施されることは、乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質が遺伝子のＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）が同一であるが、単一核酸塩基多型現象（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）の変異によって様々なバージョンが存在するためである。
実際に、ＮＣＢＩのヒトゲノム配列（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）情報がアップデートされ、且つヨーロッパのタンパク質データベース（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ）であるＵｎｉＰｒｏｔＢＫにおいて乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）のオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）配列情報とやや異なる配列情報がアップデートされたし、Ｌを開始コドンにして配列番号１の５３番目のアミノ酸であるＭがＬに修正されている。
要するに、配列番号３の５３番目のアミノ酸が、図３に下線部分のようにＬに修正されている点は、図４の下線部分のようにＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造上、ＤＮＡ塩基配列のうち配列番号３の５３番目のアミノ酸Ｌに対応するトリプレットコードが「ＡＴＧ」から「ＣＴＧ」へとＳＮＰ変異によって変換されているためである。
これにより、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、ＳＮＰ変異による様々なバージョンの全てを基準とするが、構造上、「Ｃ２ドメイン」が排除され、「ＥＧＦ様ドメイン＋Ｃ１ドメイン」のアミノ酸配列をなすことが好ましい。
このような本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、潰瘍性大膓炎予防又は治療用に用いられる薬学的組成物の主要有効成分として用いられてよい。
なお、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）及びこれを主要有効成分とする薬学的組成物は、病変内投与、血管（動脈、静脈など）内投与、皮下投与、鼻腔内投与、腹腔内投与又は特定組織（肺組織）内投与用に剤形化されてよい。
一方、本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）は、前述した組換えタンパク質の発現と関連して、発現ベクターにクローニングされるＤＮＡ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の構造的実施形態の範囲に対応し、実施によって特定シグナルペプチド構造がさらに連結されてもよい。
例えば、特定シグナルペプチド構造は、「ＭＰＲＰＲＬＬＡＡＬＣＧＡＬＬＣＡＰＳＬＬＶＡ」のようなアミノ酸配列を備えてＥＧＦ様ドメイン先端に連結される形態で実施可能であるが、これに限定されるものではない。
【0011】
２．潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）の効果検証試験結果に関する説明
本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）と関連して、当該組換えタンパク質に起因する潰瘍性大膓炎予防又は治療の効果レベル検証を実験によって確認したし、当該実験は、当業界における技術者らに自明な手段による性質などを定義するための目的で下記の実験方法を用いた。
本発明の乳脂防球ＥＧＦ因子－８（ＭＦＧ－Ｅ８）タンパク質ベースの潰瘍性大膓炎予防又は治療用組換えタンパク質（ＮＰ－０１１）と関連して、当該組換えタンパク質に起因する潰瘍性大膓炎予防又は治療の効果レベル検証を実験によって確認したし、当該実験は、当業界における技術者らに自明な手段による性質などを定義するための目的で下記の実験方法を用いた。
【0012】
（１）潰瘍性大膓炎動物モデルの作製及び実験設計
まず、ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）を用いて潰瘍性大膓炎が誘導されたネズミに該当する動物モデルは、血便、体重減少、大腸の縮小及び粘膜潰瘍などが発生し、組織学的に大腸上皮細胞に損傷を誘発して上皮層の腸腺が炎症無しに落ち、粘膜内に様々な免疫物質の量が増加して腸管の炎症を誘発することから、ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）は実験動物モデルの作製に広く用いられている。
具体的には、９週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに２％ ＤＳＳを自由に摂取させ、一般的なＤＳＳ誘導大膓炎モデルにおいて１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスが１日に５ｍｌの水分を摂取すると仮定して実験を行うので、同じ方法で２％ ＤＳＳ含有の水を提供する。
７日間は何ら処理せずに２％ ＤＳＳ含有の水のみを摂取させ、７日から１１日までの５日間、２％ ＤＳＳ含有の水を提供すると同時に、ＮＰ－０１１タンパク質をはじめとする様々な比較対象物質を様々な濃度で微静脈注射して潰瘍性大膓炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）誘導動物モデルを作製する。
図６及び図１０に示すように、対照群に該当する「ＮＴＣ」対照群は、０日から続けて水のみを供給し、陽性対照群に該当する「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給した。
また、図６に示すように、実験群に該当する「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、１６０μｇ／ｋｇのＭＦＧ－Ｅ８タンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
次に、図１０に示すように、実験群に該当する「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０μｇ／ｋｇのＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ成分を７日から２日間隔で１日１回、総３回投与した。
また、図１０に示すように、実験群に該当する「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０ｍｇ／ｋｇのＡｄａｌｉｍｕｍａｂ成分を７日目及び１１日目にそれぞれ１日１回、総２回投与した。
次に、図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第１実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、２０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
また、図６及び図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第２実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
最後に、図６及び図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第３実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、３２０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
これによって作製された全ての動物モデルを用いた下記実験は、（株）ネクセル実験動物倫理委員会の承認の下に行われたし、動物管理規定を遵守した。
まず、ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）を用いて潰瘍性大膓炎が誘導されたネズミに該当する動物モデルは、血便、体重減少、大腸の縮小及び粘膜潰瘍などが発生し、組織学的に大腸上皮細胞に損傷を誘発して上皮層の腸腺が炎症無しに落ち、粘膜内に様々な免疫物質の量が増加して腸管の炎症を誘発することから、ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）は実験動物モデルの作製に広く用いられている。
具体的には、９週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに２％ ＤＳＳを自由に摂取させ、一般的なＤＳＳ誘導大膓炎モデルにおいて１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスが１日に５ｍｌの水分を摂取すると仮定して実験を行うので、同じ方法で２％ ＤＳＳ含有の水を提供する。
７日間は何ら処理せずに２％ ＤＳＳ含有の水のみを摂取させ、７日から１１日までの５日間、２％ ＤＳＳ含有の水を提供すると同時に、ＮＰ－０１１タンパク質をはじめとする様々な比較対象物質を様々な濃度で微静脈注射して潰瘍性大膓炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）誘導動物モデルを作製する。
図６及び図１０に示すように、対照群に該当する「ＮＴＣ」対照群は、０日から続けて水のみを供給し、陽性対照群に該当する「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給した。
また、図６に示すように、実験群に該当する「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、１６０μｇ／ｋｇのＭＦＧ－Ｅ８タンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
次に、図１０に示すように、実験群に該当する「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０μｇ／ｋｇのＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ成分を７日から２日間隔で１日１回、総３回投与した。
また、図１０に示すように、実験群に該当する「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０ｍｇ／ｋｇのＡｄａｌｉｍｕｍａｂ成分を７日目及び１１日目にそれぞれ１日１回、総２回投与した。
次に、図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第１実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、２０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
また、図６及び図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第２実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、８０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
最後に、図６及び図１０に示すように、実験群に該当する「ＮＰ－０１１」第３実験群は、０日から７日まで２％ ＤＳＳ含有の水のみを供給した後、７日から１４日までは一般の水を供給したし、３２０μｇ／ｋｇのＮＰ－０１１組換えタンパク質を７日から５日間、１日１回で総５回投与した。
これによって作製された全ての動物モデルを用いた下記実験は、（株）ネクセル実験動物倫理委員会の承認の下に行われたし、動物管理規定を遵守した。
【0013】
（２）潰瘍性大膓炎動物モデルの病症緩和有無の検証－大腸粘膜の損傷関連
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸組織のうち盲腸（ｃｅｃｕｍ）を除去し、基部側（ｐｒｏｘｉｍａｌ）１～２ｃｍ、肛門（ａｎｕｓ）１ｃｍを確保して４％パラホルムアルデヒドで固定した。
続いて、４％パラホルムアルデヒドで固定された組織を、株式会社ケイピーエヌティーに依頼して染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎ）及び病理組織学的検査まで行ったし、病理学的判読は、国際標準毒性病理用語集であるＩＮＨＡＮＤを参考して所見名を決め、各動物モデルグループに大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を測定して比較した。その結果は図７及び下表１の通りである。（参考文献－Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ２０１６；２９（１ Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ－１２４Ｓ）
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸組織のうち盲腸（ｃｅｃｕｍ）を除去し、基部側（ｐｒｏｘｉｍａｌ）１～２ｃｍ、肛門（ａｎｕｓ）１ｃｍを確保して４％パラホルムアルデヒドで固定した。
続いて、４％パラホルムアルデヒドで固定された組織を、株式会社ケイピーエヌティーに依頼して染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎ）及び病理組織学的検査まで行ったし、病理学的判読は、国際標準毒性病理用語集であるＩＮＨＡＮＤを参考して所見名を決め、各動物モデルグループに大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）を測定して比較した。その結果は図７及び下表１の通りである。（参考文献－Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ２０１６；２９（１ Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ－１２４Ｓ）
【0014】
【表1】
【0015】
図７及び表１の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、陽性対照群と比較してＭＦＧ－Ｅ８ １６０μｇ／ｋｇ、ＮＰ－０１１ ８０μｇ／ｋｇ、ＮＰ－０１１ ３２０μｇ／ｋｇの順に粘膜の陰窩損傷（Ｃｒｙｐｔ Ｄａｍａｇｅ）程度、炎症細胞の侵襲度（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び炎症細胞の侵襲範囲（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｔ）が減少し、全体的な大腸粘膜の損傷程度を下げていることが確認できる。
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸組織のうち盲腸（ｃｅｃｕｍ）を除去し、基部側（ｐｒｏｘｉｍａｌ）１～２ｃｍ、肛門（ａｎｕｓ）１ｃｍを確保して４％パラホルムアルデヒドで固定した。
続いて、４％パラホルムアルデヒドで固定された組織を株式会社ケイピーエヌティーに依頼して染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎ）及び病理組織学的検査まで行ったし、病理学的判読は、国際標準毒性病理用語集であるＩＮＨＡＮＤを参考して所見名を決め、各動物モデルグループに対して大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ，ｍｕｃｓｏａ）、上皮過剰増殖（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を測定して病変を比較した。その結果は、図１１及び下表２に示す通りである。（参考文献－Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２０１６；２９（１ Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ－１２４Ｓ）
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸組織のうち盲腸（ｃｅｃｕｍ）を除去し、基部側（ｐｒｏｘｉｍａｌ）１～２ｃｍ、肛門（ａｎｕｓ）１ｃｍを確保して４％パラホルムアルデヒドで固定した。
続いて、４％パラホルムアルデヒドで固定された組織を株式会社ケイピーエヌティーに依頼して染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎ）及び病理組織学的検査まで行ったし、病理学的判読は、国際標準毒性病理用語集であるＩＮＨＡＮＤを参考して所見名を決め、各動物モデルグループに対して大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ，ｍｕｃｓｏａ）、上皮過剰増殖（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度を測定して病変を比較した。その結果は、図１１及び下表２に示す通りである。（参考文献－Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２０１６；２９（１ Ｓｕｐｐｌ）：１Ｓ－１２４Ｓ）
【0016】
【表2】
【0017】
図１１及び表２の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、陽性対照群と比較してＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ、ＮＰ－０１１２０μｇ／ｋｇでは同一程度に、その次にＡｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＮＰ－０１１ ８０μｇ／ｋｇ、ＮＰ－０１１ ３２０μｇ／ｋｇの順に大腸（Ｌａｒｇｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織内粘膜のびらん（Ｅｒｏｓｉｏｎ）程度及び上皮過剰増殖（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）程度が減少し、全体的な大腸粘膜の損傷程度を下げていることが確認できる。
（３）潰瘍性大膓炎動物モデルの病症緩和有無の検証－体重変化関連
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に毎日体重を測定したし、薬物投与以前に測定して投与による誤差を減らした。
また、陽性対照群に対比して体重の増加又は減少を分析したし、これと関連した体重変化に対する総合結果は、図８及び下表３に示す通りである。
（３）潰瘍性大膓炎動物モデルの病症緩和有無の検証－体重変化関連
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に毎日体重を測定したし、薬物投与以前に測定して投与による誤差を減らした。
また、陽性対照群に対比して体重の増加又は減少を分析したし、これと関連した体重変化に対する総合結果は、図８及び下表３に示す通りである。
【0018】
【表3】
【0019】
図８及び表３の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、陽性対照群（ＵＣ）と比較して、８日から、ＮＰ－０１１第２実験群及び第３実験群から統計学的に有意味な程度の重さ減少が改善されることを確認した。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に毎日体重を測定したし、薬物投与以前に測定して投与による誤差を減らした。
また、最初体重を基準にして体重の増加又は減少を分析するとともに、陽性対照群に対比して体重の増加又は減少のレベルも分析したし、これと関連した体重変化に対する総合結果は、図１２及び下記の表４及び表５に示す通りである。
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に毎日体重を測定したし、薬物投与以前に測定して投与による誤差を減らした。
また、最初体重を基準にして体重の増加又は減少を分析するとともに、陽性対照群に対比して体重の増加又は減少のレベルも分析したし、これと関連した体重変化に対する総合結果は、図１２及び下記の表４及び表５に示す通りである。
【0020】
【表4】
【0021】
【表5】
【0022】
図１２、表４及び表５の結果から分かるように、陽性対照群（ＵＣ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ、ＮＰ－０１１（２０～８０μｇ／ｋｇ）においていずれも重さ減少が観察されたし、陽性対照群と比較して、ＮＰ－０１１（８０μｇ／ｋｇ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａが同一程度に、その次にＮＰ－０１１（２０μｇ／ｋｇ）、ＮＰ－０１１（３２０μｇ／ｋｇ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂの順に、大膓炎から誘発される重さ減少抑制効果を示すことが確認できる。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
【0023】
（４）潰瘍性大膓炎動物モデルの病症緩和有無の検証－大腸長さ変化関連
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸を摘出して大腸の長さを分析した。その結果は図９の通りである。
具体的には、大腸長さ分析のために、各動物モデルは、最後の投与３日後に、二酸化炭素の漸進的な増加によって安楽死させ、大腸を摘出した。摘出した大腸を長さ測定機構（３０ｃｍの定規）と共に写真を撮り、確保された写真はｉｍａｇｅ Ｊによって数値化した。
図９の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、非投与対照群と比較して、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＰ－０１１（８０、３２０μｇ／ｋｇ）において統計学的に有意味な程度の大腸長さ減少抑制による増加が観察されたし、大腸長さの減少を抑制させる程度は、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群に比べて「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群がより優れていることが確認できる。
ここで、図９に示すそれぞれの箱内の中央の黒色十字架は平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸を摘出して大腸の長さを分析した。その結果は図１３の通りである。
具体的には、大腸長さ分析のために、各動物モデルは、最後の投与３日後に、二酸化炭素の漸進的な増加によって安楽死させ、大腸を摘出した。摘出した大腸を長さ測定機構（３０ｃｍの定規）と共に写真を撮り、確保された写真はｉｍａｇｅ Ｊによって数値化した。
図１３の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、陽性対照群と比較して、ＮＰ－０１１タンパク質濃度別（２０、８０、３２０μｇ／ｋｇ）に大腸長さが統計学的に有意味な程度に増加していることが確認できる。
ここで、図１３に示されたそれぞれの箱内に中央の黒色十字架は、平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸を摘出して大腸の長さを分析した。その結果は図９の通りである。
具体的には、大腸長さ分析のために、各動物モデルは、最後の投与３日後に、二酸化炭素の漸進的な増加によって安楽死させ、大腸を摘出した。摘出した大腸を長さ測定機構（３０ｃｍの定規）と共に写真を撮り、確保された写真はｉｍａｇｅ Ｊによって数値化した。
図９の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、非投与対照群と比較して、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＰ－０１１（８０、３２０μｇ／ｋｇ）において統計学的に有意味な程度の大腸長さ減少抑制による増加が観察されたし、大腸長さの減少を抑制させる程度は、「ＭＦＧ－Ｅ８」実験群に比べて「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群がより優れていることが確認できる。
ここで、図９に示すそれぞれの箱内の中央の黒色十字架は平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
次に、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別に大腸を摘出して大腸の長さを分析した。その結果は図１３の通りである。
具体的には、大腸長さ分析のために、各動物モデルは、最後の投与３日後に、二酸化炭素の漸進的な増加によって安楽死させ、大腸を摘出した。摘出した大腸を長さ測定機構（３０ｃｍの定規）と共に写真を撮り、確保された写真はｉｍａｇｅ Ｊによって数値化した。
図１３の結果から分かるように、潰瘍性大膓炎誘導後に、陽性対照群と比較して、ＮＰ－０１１タンパク質濃度別（２０、８０、３２０μｇ／ｋｇ）に大腸長さが統計学的に有意味な程度に増加していることが確認できる。
ここで、図１３に示されたそれぞれの箱内に中央の黒色十字架は、平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
【0024】
（５）潰瘍性大膓炎動物モデルの病症緩和有無の検証－血中ＩＬ－６濃度関連
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別にヘパリン添加カピラリイチューブ（Ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｂｅ）で採取した血液を氷で３０分間保管し、１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離して血餅（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ）を除外した血清（ｓｅｒｕｍ）を分離して零下８０℃に保管後に、分析のために４℃で徐々に溶かした後、ＰＢＳ（１％ ＢＳＡ）で希釈し、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ－６の血中濃度を測定した。その結果は、図１４に示した通りである。
ここで、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βをはじめとして炎症性疾患を診断する際に広く確認する前炎症性サイトカインで、多くの炎症性疾患と関連したＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通じて信号を送るサイトカインの一つであり、ナイーブＴ細胞をＴｈ１７細胞に分化するために必要であり、このようなＴｈ１７細胞は炎症を発生させ得る。
したがって、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群と比較して「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれが低いＩＬ－６の血中濃度を示し、炎症悪化を抑制することに寄与すると見なされる。
要するに、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれは、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群に対比して統計学的に有意味な程度のＩＬ－６の血中濃度が減少することが、図１４より確認できる。
ここで、図１４に示すそれぞれの箱内に中央の黒色十字架は、平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
本発明に開示の実施例は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく説明するためのものであり、このような実施例によって本発明の技術思想の範囲が限定されることはない。保護範囲は、添付する特許請求の範囲によって解釈されるべきであり、それと同等な範囲内における技術思想はいずれも本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきであろう。
まず、「ＮＴＣ」対照群、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ」実験群、「Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ」実験群、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれに該当する動物モデルを用いて、各動物モデルグループ別にヘパリン添加カピラリイチューブ（Ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｂｅ）で採取した血液を氷で３０分間保管し、１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離して血餅（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ）を除外した血清（ｓｅｒｕｍ）を分離して零下８０℃に保管後に、分析のために４℃で徐々に溶かした後、ＰＢＳ（１％ ＢＳＡ）で希釈し、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ－６の血中濃度を測定した。その結果は、図１４に示した通りである。
ここで、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ－６）は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βをはじめとして炎症性疾患を診断する際に広く確認する前炎症性サイトカインで、多くの炎症性疾患と関連したＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通じて信号を送るサイトカインの一つであり、ナイーブＴ細胞をＴｈ１７細胞に分化するために必要であり、このようなＴｈ１７細胞は炎症を発生させ得る。
したがって、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群と比較して「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれが低いＩＬ－６の血中濃度を示し、炎症悪化を抑制することに寄与すると見なされる。
要するに、「ＮＰ－０１１」第１実験群、「ＮＰ－０１１」第２実験群、及び「ＮＰ－０１１」第３実験群のそれぞれは、「ＵＣ ＣＯＮＴＲＯＬ」対照群に対比して統計学的に有意味な程度のＩＬ－６の血中濃度が減少することが、図１４より確認できる。
ここで、図１４に示すそれぞれの箱内に中央の黒色十字架は、平均を意味し、箱は、それぞれのグループにおいて値の分布を２５％から７５％まで拡張して示している。（＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）
本発明に開示の実施例は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく説明するためのものであり、このような実施例によって本発明の技術思想の範囲が限定されることはない。保護範囲は、添付する特許請求の範囲によって解釈されるべきであり、それと同等な範囲内における技術思想はいずれも本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】