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特表2024-529119抗ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣ二重特異性抗体およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-01
(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣ二重特異性抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/24 20060101AFI20240725BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240725BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240725BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240725BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240725BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240725BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240725BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240725BHJP
【ＦＩ】
C07K16/24 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P27/02
A61P3/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508417
(86)(22)【出願日】2022-08-11
(85)【翻訳文提出日】2024-04-08
(86)【国際出願番号】 CN2022111717
(87)【国際公開番号】W WO2023016516
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】202110932078.7
(32)【優先日】2021-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519274183
【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100225598
【弁理士】
【氏名又は名称】桐島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】リー イーミン
(72)【発明者】
【氏名】フー スーイー
(72)【発明者】
【氏名】チェン ピンリャン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ ショアイシアン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085CC23
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＶＥＧＦＣと特異的に結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドおよびその構築物に関し、特に抗ＶＥＧＦＣ／ＶＥＧＦＡ二重特異性結合タンパク質に関する。本発明は、また、上記ポリペプチドとタンパク質をコードするポリヌクレオチド、発現ベクターと宿主細胞、およびその医薬組成物、ならびに血管新生関連疾患を治療する方法および使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＶＥＧＦＣと特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）ポリペプチドであって、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる下記の式で示されるＶＨＨドメイン：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含み、
ここで、前記ＶＨＨドメインは、
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｉｉ）配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｉｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ３、あるいは
（ｉｖ）配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２、および配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ３、
を含む、前記ポリペプチド。
【請求項2】
前記ＶＨＨドメインは、（ｉ）配列番号４、８、１２、１６、２０および２４から選ばれるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２０のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号２４のアミノ酸配列、あるいは
（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｉｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列に対して少なくとも１個～３０個、１個～２０個、１個～１５個、１個～１０個、または１個～５個のアミノ酸変化（例えば、置換、欠失および／または挿入、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）のアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ＶＨＨドメインはヒト化されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記単一ドメイン抗体ポリペプチドは、前記ＶＨＨドメインからなる単鎖抗体ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項5】
少なくとも１つの請求項１に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチドを含むタンパク質であって、例えば、融合タンパク質またはキメラポリペプチドであり、好ましくは、前記タンパク質はＶＨＨ－Ｆｃ抗体である、前記タンパク質。
【請求項6】
二重特異性結合タンパク質であって、（ｉ）ヒトＶＥＧＦＣと特異的に結合する第１の抗原結合成分と、
（ｉｉ）ヒトＶＥＧＦＡと特異的に結合する第２の抗原結合成分と、
を含み、
ここで、前記第１の抗原結合成分は、請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチドを含み、かつ
前記二重特異性結合タンパク質は、ＶＥＧＦＡとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制するとともに、ＶＥＧＦＣとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制する、
前記二重特異性結合タンパク質。
【請求項7】
前記第１の抗原結合成分は、リンカーを介して前記第２の抗原結合成分に連結され、好ましくは、前記リンカーは、Ｇ（Ｇ４Ｓ）ｎまたは（Ｇ４Ｓ）ｎアミノ酸配列を含み、ｎ＝１、２、３、４もしくは５の整数であり、好ましくはｎ＝２、３もしくは４である、請求項６に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項8】
前記第２の抗原結合成分は、抗ＶＥＧＦＡ抗体（例えば、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ）２抗体、単一ドメイン抗体およびナノボディ）、ＶＥＧＦ－Ａ トラップ分子、またはＶＥＧＦＡ結合ドメインを含むＦｃ融合タンパク質から選ばれる、請求項６または７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項9】
前記第２の抗原結合成分は、前記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを含むＦｃ融合タンパク質であり、好ましくは、ヒトＩｇＧ ＦｃのＮ末端と融合したＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン、例えば、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２受容体由来のＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを含み、好ましくは、前記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項10】
ＶＥＧＦＡに結合する前記単一ドメイン抗体ポリペプチドは、前記Ｆｃ融合ポリペプチドのＣ末端に連結される、請求項９に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項11】
前記タンパク質は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖は、同じであるとともに、それぞれ配列番号４０～４１および４４～４７から選ばれるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖は、同じであるとともに、それぞれ配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項12】
前記第２の抗原結合成分は、ＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬからなる抗ＶＥＧＦ－Ａ Ｆａｂ抗体を含み、好ましくは、前記ＶＨは配列番号３４～３６のＨＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号３７～３９のＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、前記ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含み、
さらに好ましくは、前記Ｆａｂ断片は配列番号２８および配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項６または７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項13】
前記単一ドメイン抗体ポリペプチドは、前記Ｆａｂ抗体のＶＨ－ＣＨ１および／またはＶＬ－ＣＬのＣ末端に連結され、好ましくはリンカーを介して連結される、請求項１２に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項14】
前記タンパク質は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、前記第１のポリペプチド鎖は、前記Ｆａｂ抗体のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端と融合した前記単一ドメイン抗体ポリペプチドを含み、かつ
前記第２のポリペプチド鎖は、前記Ｆａｂ抗体のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端と融合した前記単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む、請求項１３に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項15】
前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖は、－配列番号４２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号４８のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号５０のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号５１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
から選ばれ、
好ましくは、前記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項16】
請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチド、請求項５に記載のタンパク質または請求項６～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項18】
請求項１７に記載のベクターをトランスフェクションした、宿主細胞。
【請求項19】
請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチド、請求項５に記載のタンパク質または請求項６～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質を産生する方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養することと、産生された単一ドメイン抗体ポリペプチドまたは二重特異性結合タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項20】
請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチド、請求項５に記載のタンパク質または請求項６～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容されるベクターと、を含む、医薬組成物。
【請求項21】
血管新生関連疾患を治療する方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチド、請求項５に記載のタンパク質もしくは請求項６～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質またはその医薬組成物を、対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項22】
前記疾患は固形腫瘍、好ましくは黒色腫であり、ここで、前記二重特異性結合タンパク質の投与により、腫瘍内の血管新生および／または腫瘍の増殖が抑制される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記疾患は眼疾患であり、好ましくは加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞および角膜血管新生である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
請求項１～４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体ポリペプチド、請求項５に記載のタンパク質あるいは請求項６～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質の、対象において疾患を治療および／または予防するための薬物を調製するため、ならびに／もしくは疾患を診断する診断ツールを調製するための使用であって、ここで、前記疾患は、好ましくは血管新生関連疾患であり、例えば固形腫瘍および眼疾患である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＶＥＧＦＣと特異的に結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドおよびその構築物に関し、特に抗ＶＥＧＦＣ／ＶＥＧＦＡ二重特異性結合タンパク質に関する。本発明は、また、上記ポリペプチドとタンパク質をコードするポリヌクレオチド、発現ベクターと宿主細胞、およびその医薬組成物、ならびに血管新生関連疾患を治療する方法および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、成人における健康時と疾患時の血管の発達と血液およびリンパ管の機能の主要な調節因子である。現在、ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦＡ（ＶＥＧＦＡ１６５とも呼ばれる）、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）という構造的に関連する５つの因子からなることが知られている。ＶＥＧＦファミリーメンバーは、主にホモ二量体ポリペプチドの形態で存在し、関連するＶＥＧＦ受容体と結合することにより、シグナル伝達を誘導し、対応する生物学的効果を引き出す。
【0003】
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）は、血管新生サイトカインとして、２つの高親和性膜貫通型チロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２）との相互作用により、正常および異常な血管新生過程に関与する。現在、血管新生に関連する疾患が改善されるように、ＶＥＧＦ－Ａ経路を阻害するためのさまざまな方法が提案されている。提案されたＶＥＧＦ－Ａ阻害剤／拮抗剤は、ＶＥＧＦ－Ａを標的とする中和抗体、およびＶＥＧＦ－Ａとその正常な受容体の結合を妨げる可溶性デコイ受容体とトラップ分子を含む。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体であるｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ）は、結腸直腸癌、乳癌および肺癌を治療するために承認された。Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（ラニビズマブ、商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）は、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂと同じ親マウス抗体由来のモノクローナル抗体断片であり、親分子よりも遥かに小さいとともに、親和性成熟により、より強いＶＥＧＦ－Ａ結合特性を提供する（ＷＯ９８／４５３３１）。Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂは、湿性加齢黄斑変性症を治療するために承認された。Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（アフリベルセプトとも呼ばれ、ＶＥＧＦＡ－トラップ、商品名Ｅｌｙｅａ）は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２に由来するリガンド結合ドメインと、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域とを融合することにより形成された組換え融合タンパク質であり、加齢黄斑変性症などの血管新生関連網膜疾患を治療するために承認され、かつ臨床試験において固形腫瘍の治療のために使用されている。
【0004】
血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ－Ｃ）は、リンパ管新生関連サイトカインとして同定され、チロシンキナーゼ受容体であるＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３を介して作用する。ＶＥＧＦ－Ｃは、血管内皮細胞上のＶＥＧＦＲ２に結合することにより、血管新生過程に関与する。さらに、ＶＥＧＦ－Ｃは、受容体ＶＥＧＦＲ３に結合することにより、リンパ管新生およびリンパ内皮細胞の増殖と遊走を刺激する。ＶＥＧＦＲ３は、構造的にＶＥＧＦＲ１および２に類似しているが、ＶＥＧＦ－Ａとは結合しない。ＶＥＧＦＲ３は、リンパ管細胞に加えて血管内皮細胞にも高く発現していることが見出された。ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦＲ３シグナル伝達経路の阻害は、さまざまな転移性腫瘍モデルにおいて腫瘍のリンパ管新生および転移を抑制するために提案された。さらに、現在、脈管新生関連網膜症の治療のために、Ｏｐｔｈｅａ社によって開発されたＯＰＴ－０３２（ＶＥＧＦＲ３由来のリガンド細胞外ドメインから構築されたＶＥＧＦＣ／Ｄ阻害剤）などのＶＥＧＦ－Ｃ トラップ分子が開発された。
【0005】
多くの疾患過程では、脈管新生の発生に関連することが同定され、上記疾患過程は、例えば、癌、自己免疫疾患および網膜症などを含む。血管とリンパ管の増殖におけるＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃの役割を考えて、脈管新生関連疾患、例えば、腫瘍の増殖および転移において、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－Ｃは、互いに相乗的な促進効果を有し得ることが提案されている。従って、本分野には、新たな抗脈管新生分子、特にＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃの両方を同時に標的とすることができる二重特異性分子を開発する必要がある。そのような二重特異性分子は、血管内皮増殖因子ＡおよびＣの両方を同時に阻害して脈管新生関連疾患の進行を抑制することに寄与することになる。独立した抗ＶＥＧＦ－Ａ分子と抗ＶＥＧＦ－Ｃ分子の併用と比べて、そのような二重特異性分子は、投与にも利点をもたらすことになる。現在、眼疾患の治療において、アフリベルセプト、ラニビズマブおよびコンベルセプトなどの独立した抗ＶＥＧＦ－Ａ分子の多くには限界があり、つまり、注射液剤型として、硝子体内投与が必要で、投与し難く、これによって、患者のコンプライアンスが悪く、治療負担が大きくなる。従って、この併用薬の代わりに、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃに同時に強力かつ特異的に結合して中和する二重特異性分子を設計することが有利である。
【発明の概要】
【0006】
上記の需要を満たすために、本発明者は、鋭意研究の結果、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングに基づき、ヒト化および親和性成熟により、新たな高親和性抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメインｓｃＡｂ抗体ポリペプチドを提供し、かつ上記単一ドメイン抗体ポリペプチドを構成要素として利用し、抗ＶＥＧＦ－Ａ分子と結合して、優れたＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦ－Ｃ二重拮抗活性および抗脈管新生効果を有する二重特異性分子を構築して産生した。
【0007】
従って、一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ｃと特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供する。一実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメイン抗体は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という式を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、上記ＣＤＲ１～３は、それぞれ、
（１）配列番号１、２および３で示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号９、１０および１１で示されるアミノ酸配列、
（３）配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列、ならびに
（４）配列番号２１、２２および２３で示されるアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
（１）配列番号１、２および３で示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号９、１０および１１で示されるアミノ酸配列、
（３）配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列、ならびに
（４）配列番号２１、２２および２３で示されるアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0008】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも本発明の単一ドメイン抗体を含むタンパク質を提供し、好ましくは、上記タンパク質は、融合タンパク質またはキメラポリペプチド、例えば、ＶＨＨ－Ｆｃ抗体である。
【0009】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）ヒトＶＥＧＦＣと特異的に結合する第１の抗原結合成分と、
（ｉｉ）ヒトＶＥＧＦＡと特異的に結合する第２の抗原結合成分と、
を含む二重特異性結合タンパク質を提供する。
ここで、上記第１の抗原結合成分は、本発明の単一ドメイン抗体ポリペプチドを含み、かつ
上記二重特異性結合タンパク質は、二重拮抗活性を有し、ＶＥＧＦＡとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制するとともに、ＶＥＧＦＣとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制する。
（ｉ）ヒトＶＥＧＦＣと特異的に結合する第１の抗原結合成分と、
（ｉｉ）ヒトＶＥＧＦＡと特異的に結合する第２の抗原結合成分と、
を含む二重特異性結合タンパク質を提供する。
ここで、上記第１の抗原結合成分は、本発明の単一ドメイン抗体ポリペプチドを含み、かつ
上記二重特異性結合タンパク質は、二重拮抗活性を有し、ＶＥＧＦＡとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制するとともに、ＶＥＧＦＣとそのＶＥＧＦ受容体の結合を抑制する。
【0010】
さらなる態様において、本発明は、本発明の分子（単一ドメイン抗体ポリペプチド、タンパク質または二重特異性結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および本発明の分子を含む医薬組成物、薬物組合せと試薬キットを提供する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、本発明の分子（単一ドメイン抗体ポリペプチド、タンパク質または二重特異性結合タンパク質）により疾患を予防および／または治療する使用を提供し、上記疾患は、例えば、腫瘍および眼疾患などの脈管新生関連疾患である。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、また、本発明の分子（単一ドメイン抗体ポリペプチド、タンパク質または二重特異性結合タンパク質）の診断的使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1-1】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣと受容体ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３の結合を阻害するＥＬＩＳＡ実験を示す。Ａ：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨのＶＥＧＦＲ２阻害実験、Ｂ：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨのＶＥＧＦＲ３阻害実験。
【図1-2】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣと受容体ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３の結合を阻害するＥＬＩＳＡ実験を示す。Ｃ：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣヒト化ＶＨＨのＶＥＧＦＲ３阻害実験、Ｄ：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ親和性成熟ＶＨＨのＶＥＧＦＲ３阻害実験。
【図2】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲレポーター分子の活性化を阻害する実験を示す。
【図3】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣ誘導性のＢａｆ３－ＦＬＴ４の増殖を阻害する実験を示す。
【図4】ヒト化ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲレポーター分子の活性化を阻害する実験を示す。
【図5】ヒト化ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣ誘導性のＢａｆ３－ＦＬＴ４の増殖を阻害する実験を示す。
【図6】親和性成熟分子ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲレポーター分子の活性化を阻害する実験を示す。
【図7】親和性成熟ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によりＶＥＧＦ－Ｃ誘導性のＢａｆ３－ＦＬＴ４の増殖を阻害する実験を示す。
【図8】二重特異性抗体分子によりＶＥＧＦＡ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤレポーター分子の活性化を阻害する実験を示す。
【図9】二重特異性抗体分子によりＶＥＧＦＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒの活性化を阻害する実験を示す。
【図10】二重特異性抗体分子によりＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４の増殖を抑制する実験を示す。
【図11】二重特異性抗体分子によりＶＥＧＦＡ＋Ｃ誘導性のＨＵＶＥＣの増殖を抑制する実験を示す。
【図12】二重特異性抗体分子によりＶＥＧＦＡ＋Ｃ誘導性のＨＵＶＥＣ管腔形成を抑制する実験を示す。Ａ：管腔形成画像、Ｂ：管腔形成の統計結果。
【図13】二重特異性抗体分子によりＡ３７５皮下腫瘍モデル血管新生を抑制する実験を示す。Ａ：Ａ３７５腫瘍質量の統計、Ｂ：Ａ３７５腫瘍体積の統計、Ｃ：Ａ３７５腫瘍ＣＤ３１の染色画像。
【図14】二重特異性抗体分子によりレーザー誘導性のＣＮＶを抑制する実験を示す。
【図15】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によりレーザー誘導性の脈絡膜血管新生を抑制する眼底造影画像を示す。
【図16】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によりレーザー誘導性の網膜肥厚を抑制するＯＣＴ画像を示す。
【図17】ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によりレーザー誘導性の脈絡膜血管新生モデルの病理学的変化を抑制することを示す。
【図18】ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン－Ｆｃ融合タンパク質および抗ＶＥＧＦ－Ａ Ｆａｂ抗体を利用し、抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨ抗体を構成要素として組み合わせて、構築した２種類の二重特異性抗体の構造模式図を示す。
【図19】本発明の抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨ単一ドメイン抗体のＣＤＲ１～３配列およびＶＨＨ配列を示す。
【発明の詳細な説明】
【0014】
特に断らない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の当業者に一般的に理解された意味を有する。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許または他の参照文献は、引用により全体として組み込まれている。また、本明細書に記載の材料、方法および例は、単に説明するためであり、制限するものではない。本発明の他の特徴、目的および利点は、本明細書と図面から、かつ添付された特許請求の範囲から明らかになる。
【0015】
定義
「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。
「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。
【0016】
本明細書に用いられるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。
【0017】
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、さまざまな構造の天然抗体および人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、全長抗体および抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【0018】
「完全抗体」または「全長抗体」という用語は、本明細書において互換的に使用可能であり、天然の免疫グロブリン分子構造を有する抗体分子を指す。一般的な４鎖ＩｇＧ抗体である場合、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）を含む。重鎖のみを有して軽鎖を欠いた重鎖抗体である場合、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重鎖（Ｈ）を含む。
【0019】
一般的な４鎖ＩｇＧ抗体では、全長抗体重鎖は、一般的に重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなり、ここで、重鎖定常領域は、少なくとも３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。全長抗体軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなり、ここで、軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。それぞれの重鎖可変領域ＶＨおよびそれぞれの軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列される。
【0020】
重鎖抗体では、全長抗体重鎖は、一般的に重鎖可変領域（本明細書においてＶＨＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ドメインＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれのＶＨＨは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列される。
【0021】
抗体の「抗原結合断片」という用語は、完全抗体または全長抗体のアミノ酸残基数よりも少ない完全抗体または全長抗体の一部もしくは断片であるが、抗原に結合するか、または全長抗体（すなわち、抗原結合断片の由来する全長抗体）と競合して抗原に結合することができる。組換えＤＮＡ技術により、または酵素もしくは化学的手段により完全な抗体を切断して抗原結合断片を調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディを含むが、これらに限定されない。例えば、パパインで全長抗体を消化することによりＦａｂ断片を得ることができる。また、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で完全抗体を消化して産生されたＦ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’の二量体であり、二価の抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、中性条件でヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊することにより還元されることができ、これによってＦ（ａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、基本的にヒンジ領域を有するＦａｂ断片である。Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームＶＬとＶＨドメインからなる。Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは、独立した遺伝子によりコードされることができるが、組換え法により、合成連結ペプチドを利用してこの２つのドメインを１本のタンパク質鎖として産生されるように連結し、かつ上記１本のタンパク質鎖においてＶＬ領域およびＶＨ領域がペアリングすることで単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することもできる。
【0022】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。例えば、重鎖抗体がラクダ科の重鎖抗体に由来する場合、単一のＶＨドメインは、抗原結合特異性を十分に付与することができる。天然重鎖抗体のＶＨＨは、天然ＩｇＧ抗体の重鎖可変領域ＶＨと同様に、類似の構造を有し、すなわち、４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むとともに、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という構造を有する。
【0023】
抗体の「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」、「ＣＤＲ」または「超可変領域」は、抗体可変ドメイン（ＶＨまたはＶＨＨ）における、配列において超可変であるとともに構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から順に番号付けされ、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とも呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、当該分野で公知のさまざまな方案によってそのＣＤＲ配列を決定することができ、例えば、抗体の３次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（国際免疫遺伝学情報システム、ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎフォーマットｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８～２５６（２０１１））などである。
【0024】
以下は、ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＩＭＧＴ方案で定義されたＣＤＲの領域範囲である。
【表1】
【0025】
特に断りのない限り、本発明において、「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」という用語は、上記いずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列をカバーする。
【0026】
ＣＤＲは、参照ＣＤＲ配列と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて決定されてもよい。特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。
【0027】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、少なくとも一部の定常領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つまたは３つの定常ドメイン、すなわち、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび選択的なＣＨ４ドメインを含む。例えば、天然抗体において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ類抗体の２本の重鎖に由来する第２および第３の定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、またはＩｇＭおよびＩｇＥ類抗体の２本の重鎖に由来する第２、第３および第４の定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン）を含む。本明細書において特に断りのない限り、Ｆｃ領域または重鎖定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に基づいて番号が付けられる。本明細書において、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ断片」という用語は、免疫グロブリンの重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬ、および重鎖定常領域ＣＨ１と軽鎖定常領域ＣＬを含まないが、場合によっては、重鎖定常領域のＮ末端にあるヒンジ領域を含める。
【0028】
「キメラ抗体」という用語は、（ａ）定常領域またはその一部を変更、置換もしくは交換することによって、抗原結合部位が、異なるもしくは変化したタイプ、エフェクター機能および／または生物種供給源を有する定常領域に連結され、もしくはキメラ抗体に新しい性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物）などに連結され、あるいは（ｂ）可変領域もしくはその一部を、異なるもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域によって変更、置換もしくは交換させた抗体分子を指す。例えば、ラクダ重鎖抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンに由来する定常領域に変更することによって修飾することができる。ヒト定常領域に変更したため、当該キメラ抗体は、その抗原認識における特異性を保持するとともに、元のラクダ抗体と比べて、ヒトにおいて低下した抗原性を有することができる。
【0029】
本明細書に用いられるように、「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（例えば、アルパカモノクローナル抗体）の抗原特異性反応性を保持するとともに、治療剤としてヒトに投与する場合に免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒト抗原結合部位を保持し、抗体の残りの部分をそれらに対応するヒト由来の部分に置き換える（すなわち、定常領域および可変領域における結合に関与しない部分をヒト抗体の対応する部分に置き換える）ことによって実現することができる。
【0030】
本明細書に用いられるように、「融合タンパク質」と「キメラポリペプチド」という用語は、互換的に使用可能であり、少なくとも２つの異種ポリペプチド配列が任意にリンカーを介して融合されることによって形成されたさらに大きなポリペプチドを指す。融合タンパク質は、組換え発現によって産生されることができる。
【0031】
「異種」という用語は、融合タンパク質またはキメラポリペプチドに関わる場合、上記融合タンパク質またはキメラポリペプチドが２つ以上のサブ配列を含み、これらのサブ配列が自然界において同一のタンパク質またはポリペプチドに存在しないことを意味する。
【0032】
「組換え」という用語は、本明細書においてポリペプチドまたはタンパク質が生体宿主により産生されることを指す。上記宿主は、哺乳動物発現系、昆虫細胞発現系、酵母発現系および細菌発現系から選ばれてもよいが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明のポリペプチド／タンパク質は、原核生物（例えば、大腸菌細胞）または真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において発現して産生された組換えポリペプチド／タンパク質である。
【0033】
本明細書に用いられるように、「単一特異性」という用語は、１つまたは複数の抗原結合部位を有するポリペプチド／タンパク質分子を指し、上記部位のそれぞれは、同じ抗原の同じエピトープと結合する。本明細書に用いられるように、「多重特異性」という用語は、異なるエピトープ（同じ抗原上の異なるエピトープまたは異なる抗原上の異なるエピトープ）に結合する少なくとも２つの抗原結合部位を有するポリペプチド／タンパク質分子を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体を含む単一特異性結合分子を提供し、いくつかの実施形態において、上記分子は一価であり、例えば、単一のＶＨＨドメインのみを有する単一のＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドであり、別のいくつかの実施形態において、上記分子は多価であり、例えば、Ｆｃ領域の二量体化により２つのＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドから形成される重鎖抗体である。いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性結合分子を提供し、上記分子の２つの抗原結合特異性は、それぞれ抗原ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃ、特に、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＶＥＧＦＣを標的とし、好ましくは、その中の少なくとも１つの抗ＶＥＧＦ－Ｃ特異性が、本発明の単一ドメイン抗体により提供される。
【0034】
本明細書に用いられるような「抗原結合部位」と「抗原結合ドメイン」という用語は、互換的に使用可能であり、分子における標的抗原と実際に結合する領域を示す。抗原結合部位の例としては、例えば、抗体の可変ドメイン、受容体の細胞外リガンド結合ドメインなどを含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の二重特異性結合タンパク質のためのＶＥＧＦＣ抗原結合部位は、抗ＶＥＧＦＣ重鎖抗体の可変ドメイン（すなわち、「ＶＨＨ」）によって提供され、本発明の二重特異性結合タンパク質のためのＶＥＧＦＡ抗原結合部位は、抗ＶＥＧＦＡ抗体のペアリングされた重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）によって提供され、またはＶＥＧＦＡに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインのポリペプチド断片によって提供され、または人工リガンド「トラップ」分子によって提供される。
【0035】
本明細書に用いられるように、リガンド「トラップ」分子という用語は、受容体のリガンド相互作用細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である。現在、ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣを含むＶＥＧＦリガンドを「捕捉」する種々のトラップ分子が既に開発された。これらのトラップ分子は、細胞外環境における対応するリガンドに結合してその濃度を低下させるために使用可能である。一実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦＡ成分は、ＶＥＧＦＡを「捕捉」するＦｃ融合タンパク質形態のトラップ分子を含む。当該トラップ分子は、天然ＶＥＧＦＡ細胞受容体と競合してＶＥＧＦＡに結合することにより、ＶＥＧＦＡ誘導性のシグナル伝達を抑制することができる。一実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質形態のトラップ分子は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。当該ＶＥＧＦＡ－トラップ分子は、ＶＥＧＦ受容体１および２からの細胞外リガンド結合ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合することによって形成され、完全にヒトに由来するアミノ酸を有することで、人体における分子の免疫原性を最小限に抑える。
【0036】
本明細書に用いられるように、「ＶＥＧＦＡ」または「ＶＥＧＦ－Ａ」という用語は、血管内皮増殖因子Ａ（例えば、登録番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５６９２でのヒトＶＥＧＦＡタンパク質）を指す。ＶＥＧＦＡは、受容体ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１とも呼ばれる）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲとも呼ばれる）に結合する。本明細書において、「ＶＥＧＦＡに対する抗原結合特異性」とは、ヒトＶＥＧＦＡに特異的に結合する分子中の結合部位または結合ドメインを指す。
【0037】
「ＶＥＧＦＣ」または「ＶＥＧＦ－Ｃ」という用語は、血管内皮増殖因子Ｃ（例えば、登録番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４９７６７でのヒトＶＥＧＦＣタンパク質）を指す。ＶＥＧＦＣは、受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲとも呼ばれる）およびＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４とも呼ばれる）に結合する。本明細書において、「ＶＥＧＦＣに対する抗原結合特異性」とは、ヒトＶＥＧＦＣに特異的に結合する分子中の結合部位または結合ドメインを指す。一実施形態において、バイオレイヤー干渉技術で検出されると、本発明の分子におけるＶＥＧＦＣに結合するＶＨＨ抗原結合部位は、ヒトＶＥＧＦＣに対して高い親和性結合活性、例えば、約１ｎＭ～１０ｎＭの一価結合親和性ＫＤ値、または約０．１ｎＭ～０．７ｎＭの二価結合親和性を有する。
【0038】
「抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分」は、本明細書においてＶＥＧＦ－Ｃタンパク質に結合可能なポリペプチドを指す。例えば、抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、本発明のＶＨＨドメインを含むポリペプチドであってもよい。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、ＶＥＧＦ－Ｃに結合する単一ドメイン抗体である。さらなる実施形態において、抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、配列番号４、８、１２、１６、２０および２４で示されるアミノ酸配列から選ばれるＶＨＨドメインの３つのＣＤＲ配列を含み、ここで、上記ＣＤＲ配列はＫａｂａｔに従って定義され、またはＣｈｏｔｈｉａに従って定義され、あるいは、ここで、ＣＤＲ１はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組み合わせに従って定義され、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＫａｂａｔに従って定義される。
【0039】
「抗ＶＥＧＦ－Ａ成分」は、本明細書においてＶＥＧＦ－Ａタンパク質に結合可能なポリペプチドを指す。例えば、抗ＶＥＧＦ－Ａ成分は、ＶＥＧＦＡ受容体細胞外ドメインポリペプチドと、そのＣ末端に融合したＦｃ部分とを含むキメラポリペプチド／融合タンパク質であってもよく、重鎖および軽鎖を含む抗ＶＥＧＦＡ抗体、例えば、Ｆａｂ抗体または他の全長抗体の断片であってもよい。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ－Ａ成分は、Ｆｃ融合タンパク質形態のトラップ分子によって提供され、かつＦｃ領域の二量体化により二量体を形成する。別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ－Ａ成分は、Ｆａｂ形態の抗ＶＥＧＦＡ抗体によって提供され、ここで、Ｆａｂの重鎖（すなわち、重鎖定常領域を含むポリペプチド鎖）とＦａｂの軽鎖（すなわち、軽鎖定常領域を含むポリペプチド鎖）はペアリングして二量体を形成する。
【0040】
「Ｆａｂ断片」、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ抗体」は、本明細書において互換的に使用可能であり、２つのポリペプチド鎖からなり、免疫グロブリン重鎖可変ドメインＶＨ、重鎖定常ドメインＣＨ１、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む免疫グロブリン断片を指すためであり、ここで、一方のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶＨと、ＣＨ１およびＣＬから選ばれる１つの定常領域とを含み、他方のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶＬと、ＣＬおよびＣＨ１から選ばれる別の定常領域とを含み、ここで、上記ＶＨドメインおよびＶＬドメインはペアリングして抗原結合部位を形成する。本明細書において、Ｆａｂの一方のポリペプチド鎖には、ＣＬに連結されるＶＨが含まれるとともに、他方のポリペプチド鎖には、ＣＨ１に連結されるＶＬが含まれる場合、当該Ｆａｂは、ｃｒｏｓｓＦａｂとも呼ばれる。
【0041】
本明細書において、重鎖定常領域ＣＨ１を含むＦａｂポリペプチド鎖はＦａｂ重鎖とも呼ばれ、それに応じて、軽鎖定常領域ＣＬを含むＦａｂポリペプチド鎖はＦａｂ軽鎖とも呼ばれる。従って、１つのＦａｂ抗体では、Ｆａｂ重鎖においてＣＨ１はＶＨまたはＣＬに連結可能であり、Ｆａｂ軽鎖においてＣＬはＶＬまたはＶＨにに連結可能であり、ただし、上記ＶＨとＶＬは、ペアリングして標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができることが条件となる。
【0042】
「ＶＨＨドメイン」という用語は、本明細書において、軽鎖を欠いた重鎖抗体（本明細書において、ＨｃＡｂ抗体と呼ばれる場合もある）から誘導された重鎖可変ドメインを指すためであり、単一可変ドメイン断片またはナノボディとも呼ばれる。従って、ＶＨＨドメインは４鎖免疫グロブリンの一般的なＶＨドメインとは異なり、抗原結合部位を形成するために、軽鎖可変ドメインとペアリングする必要がない。このようなＶＨＨドメイン分子は、ラクダ科の種（例えば、ラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）で産生された抗体から誘導されてもよい。ラクダ科以外の種も天然の軽鎖欠如重鎖抗体を産生することができ、このようなＶＨＨも本発明の範囲内にある。場合によっては、ＶＨＨドメインの治療的使用は、その免疫原性を低下させることが望ましい。従って、好ましくは、一実施形態において、本発明に使用されるＶＨＨドメインは、ヒト化ＶＨＨドメインまたはそのさらなる配列最適化形態（例えば、結合親和性を増加させる親和性成熟形態）である。
【0043】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、本明細書において、単一の可変抗体ドメイン、例えば、ＶＨＨもしくは単一のＶＨまたは単一のＶＬにより、標的抗原を認識して、それに結合する抗体ポリペプチドを指すためである。単一ドメイン抗体の単一可変抗体ドメインは、別の抗体可変ドメインとペアリングすることなく、標的抗原を認識して、それに結合することができる。本明細書において、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ単一ドメイン抗体とも呼ばれる。本発明に使用されるＶＨＨ単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物、例えば、アルパカ、またはそのヒト化形態もしくは配列最適化形態に由来することが好ましい。いくつかの実施形態において、本発明のＶＨＨ単一ドメイン抗体は、単一のＶＨＨドメインから構成されるかまたは基本的に構成される一価の単一特異性ポリペプチド分子である。
【0044】
本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、より大きなポリペプチド／タンパク質に含まれてもよい。挙げられ得る本発明の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド／タンパク質の例としては、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）、例えば、ラクダ科動物（ラマ、ラクダ、特にアルパカ）由来のフレームワーク領域および／または重鎖定常領域を有する重鎖抗体、そのヒト化形態もしくはその配列最適化形態（親和性成熟形態）、あるいはその断片（例えば、定常領域の少なくとも一部を含む断片）；当該重鎖抗体由来のＶＨＨドメインを構成要素として形成した融合タンパク質、例えば、（一部の）免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）との融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明のＶＨＨドメインは、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と融合してＶＨＨ－Ｆｃ抗体を形成する。
【0045】
本明細書において、「フレキシブル連結ペプチド」、「連結ペプチド」または「リンカー」という用語は、アミノ酸からなる短いアミノ酸配列、例えば、単独でもしくは組み合わせて使用されるグリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）および／またはトレオニン残基（Ｔ）、あるいは免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を指す。一実施形態において、連結ペプチドは、５～５０アミノ酸長、例えば、１０、１５、２０、２５もしくは３０アミノ酸長を有する。一実施形態において、連結ペプチドはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６もしくは７の整数である。一実施形態において、連結ペプチドはアミノ酸配列ＴＳ（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６もしくは７の整数である。一実施形態において、連結ペプチドはアミノ酸配列Ｇ（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６もしくは７の整数である。さらなる実施形態において、連結ペプチドは、免疫グロブリンに由来するヒンジ領域であり、例えば、「ＣＰＰＣ」を含むヒンジ領域のアミノ酸配列、例えば、アミノ酸配列「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」または「ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」である。本発明の抗体分子の各ドメインへの連結に使用可能な連結ペプチドは、例えば、ＧＧＧ、ＤＧＧＧＳ、ＴＧＥＫＰ、ＧＧＲＲ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＧＧＲＲＧＧＧＳ、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ、およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧというアミノ酸配列であってもよいが、これらに限定されない。あるいは、コンピュータプログラムを使用してタンパク質およびペプチドの３次元構造をシミュレーションするか、またはファージディスプレイ法によって適切なフレキシブル連結ペプチドを合理的に設計してもよい。
【0046】
本明細書に用いられるように、「結合」または「特異的に結合」という用語は、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ不要または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗原結合部位の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または本分野で公知の一般的な結合測定法により測定することができる。
【0047】
「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー同士間の相互作用を反映する固有結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができ、解離定数は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎ）の比である。親和性は、本分野で公知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法の１つは、本明細書におけるＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学的結合測定法である。
【0048】
アミノ酸配列の「同一性百分率（％）」とは、候補配列を本明細書に示される具体的なアミノ酸配列とアラインメントし、かつ必要に応じて最大の配列同一性百分率を実現するためにギャップを導入した後、また、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮されない場合、本明細書に示される具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基の、候補配列における百分率を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体分子の変異体を考慮し、上記変異体は、本明細書に具体的に開示された抗体分子およびその配列に対して相当の同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。上記変異体は、保存的修飾を含んでもよい。
【0049】
ポリペプチド配列について、「保存的修飾」は、ポリペプチド配列の置換、欠失または添加を含むが、ポリペプチド配列の所望の機能的活性を実質的に変化させない。例えば、保存的置換は、あるアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸への置換をもたらすことが多い。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、本分野でよく知られているものである。以下、互いに保存的置換となる８群のアミノ酸：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられている。いくつかの実施形態において、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む本発明の抗体分子もしくは結合タンパク質分子の標的抗原結合特性に顕著な影響または変化を与えないアミノ酸修飾を指すためである。例えば、保存的に修飾された変異体は、親抗体または結合タンパク質に対して、標的抗原への少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくはそれ以上、例えば、１００％～１１０％もしくはそれ以上の結合親和性を保持する。
【0050】
「宿主細胞」という用語は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、初代より形質転換された細胞およびそれらより誘導された子孫を含む。宿主細胞は、本発明の抗体分子の産生に使用可能な任意のタイプの細胞系であってもよく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核細胞と、大腸菌細胞などの原核細胞とを含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物または培養された植物組織もしくは動物組織の内部の細胞を含む。
【0051】
「発現ベクター」という用語は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指し、発現すべきヌクレオチド配列に効果的に連結された発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現するために十分なシス作用要素を含み、発現のための別の要素は、宿主細胞により提供されるか、またはインビトロ発現系にあるものであってもよい。発現ベクターは、本分野で公知の全てのものを含み、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、ヌードなるものまたはリポソームに含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。
【0052】
「個体」または「対象」という用語は、互換的に使用可能であり、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、乳牛、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、個体はヒトを指す。
【0053】
「治療」という用語は、治療を受けている個体における疾患の自然的過程を変えようとする臨床的介入を指す。所望の治療効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の如何なる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、病状の進行速度の低減、病的状態の改善または緩和、および予後の緩和または改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の発症を遅延させるため、または疾患の進行を低下させるためのものである。
【0054】
「抗腫瘍作用」または「腫瘍抑制作用」という用語は、さまざまな手段により表示できる生物学的効果を指し、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少または腫瘍細胞の生存率の減少を含むが、これらに限定されない。「腫瘍」および「癌」という用語は、本明細書において互換的に使用され、さまざまな固形腫瘍を包含する。
【0055】
本明細書において、「脈管新生関連疾患」という用語は、疾患の発症、進行および／または経過が脈管新生（血管新生、リンパ管新生、および／または両方を含む）に関わる疾患、病症および／または病状を指す。そのような疾患、病症または病状は、ＶＥＧＦ－ＣもしくはＶＥＧＦ－Ａまたはその両方の生物活性の阻害から利益を得る。
【0056】
以下、本発明の各態様について詳しく説明する。
Ｉ．単一ドメイン抗体ポリペプチドおよびその誘導体
単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量およびわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。分子サイズが小さいため、単一ドメインモノクローナル抗体は、一般的な４鎖抗体と比べて、高い安定性と溶解性、および隠れた抗原部位を認識できるという利点を有する。さらに、単一ドメイン抗体は、調製においても一般的な４鎖抗体よりも安価であり、大腸菌においてより高い発現レベルで容易に発現・精製することができる。別々の分子としての使用に加え、単一ドメイン抗体は、多重特異性分子の構築に適する構成要素でもある。
Ｉ．単一ドメイン抗体ポリペプチドおよびその誘導体
単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量およびわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。分子サイズが小さいため、単一ドメインモノクローナル抗体は、一般的な４鎖抗体と比べて、高い安定性と溶解性、および隠れた抗原部位を認識できるという利点を有する。さらに、単一ドメイン抗体は、調製においても一般的な４鎖抗体よりも安価であり、大腸菌においてより高い発現レベルで容易に発現・精製することができる。別々の分子としての使用に加え、単一ドメイン抗体は、多重特異性分子の構築に適する構成要素でもある。
【0057】
鋭意研究の結果、本発明は、一態様において単一ドメイン抗体およびその誘導体を提供する。本発明の単一ドメイン抗体は、ヒトＶＥＧＦＣと特異的に結合し、好ましくは、それと受容体の結合およびそれにより誘導されるシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体は、
（ｉ）高親和性でヒトＶＥＧＦ－Ｃ（ｈＶＥＧＦ－Ｃ）に結合することであって、好ましくは、バイオレイヤー干渉技術で測定し、例えば、実施例３に記載の方法で測定すると、一価結合親和性のＫＤ値が約１ｎＭ～１０ｎＭ、例えば、約５ｎＭ～６ｎＭであり、二価結合親和性のＫＤ値が約０．１ｎＭ～１ｎＭの間にあり、例えば、約０．６ｎＭであること、
（ｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃと受容体ＶＥＧＦＲ２の結合を阻害することであって、好ましくは、ＥＬＩＳＡ測定法、例えば、実施例４に記載の方法で測定すると、結合を阻害するＩＣ５０値が約０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、より好ましくは約０．０１ｎＭ～０．０５ｎＭであること、
（ｉｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃと受容体ＶＥＧＦＲ３の結合を阻害することであって、好ましくは、ＥＬＩＳＡ測定法、例えば、実施例４に記載の方法で測定すると、結合を阻害するＩＣ５０値が約０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、より好ましくは約０．０１ｎＭ～０．０５ｎＭであること、
（ｉｖ）ＶＥＧＦＣ－ＣとＶＥＧＦＲ２の結合により仲介されるシグナル伝達経路の活性化を抑制することであって、好ましくは、受容体－レポーター分子系、例えば、実施例５に記載の方法で測定すること、
（ｖ）ＶＥＧＦＣ－ＣとＶＥＧＦＲ３の結合により仲介されるシグナル伝達経路の活性化を抑制すること、
（ｖｉ）ＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ２の結合により誘導される血管内皮関連活性、例えば、血管内皮細胞の生存、増殖および／または遊走、血管新生および／または血管漏出を抑制すること、ならびに
（ｖｉｉ）ＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ３の結合により誘導される血管内皮細胞および／またはリンパ管内皮細胞の生存および／または増殖を抑制すること、
から選ばれるいずれか１つまたは複数の生物学的活性を有する。
（ｉ）高親和性でヒトＶＥＧＦ－Ｃ（ｈＶＥＧＦ－Ｃ）に結合することであって、好ましくは、バイオレイヤー干渉技術で測定し、例えば、実施例３に記載の方法で測定すると、一価結合親和性のＫＤ値が約１ｎＭ～１０ｎＭ、例えば、約５ｎＭ～６ｎＭであり、二価結合親和性のＫＤ値が約０．１ｎＭ～１ｎＭの間にあり、例えば、約０．６ｎＭであること、
（ｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃと受容体ＶＥＧＦＲ２の結合を阻害することであって、好ましくは、ＥＬＩＳＡ測定法、例えば、実施例４に記載の方法で測定すると、結合を阻害するＩＣ５０値が約０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、より好ましくは約０．０１ｎＭ～０．０５ｎＭであること、
（ｉｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃと受容体ＶＥＧＦＲ３の結合を阻害することであって、好ましくは、ＥＬＩＳＡ測定法、例えば、実施例４に記載の方法で測定すると、結合を阻害するＩＣ５０値が約０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、より好ましくは約０．０１ｎＭ～０．０５ｎＭであること、
（ｉｖ）ＶＥＧＦＣ－ＣとＶＥＧＦＲ２の結合により仲介されるシグナル伝達経路の活性化を抑制することであって、好ましくは、受容体－レポーター分子系、例えば、実施例５に記載の方法で測定すること、
（ｖ）ＶＥＧＦＣ－ＣとＶＥＧＦＲ３の結合により仲介されるシグナル伝達経路の活性化を抑制すること、
（ｖｉ）ＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ２の結合により誘導される血管内皮関連活性、例えば、血管内皮細胞の生存、増殖および／または遊走、血管新生および／または血管漏出を抑制すること、ならびに
（ｖｉｉ）ＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ３の結合により誘導される血管内皮細胞および／またはリンパ管内皮細胞の生存および／または増殖を抑制すること、
から選ばれるいずれか１つまたは複数の生物学的活性を有する。
【0058】
構造的には、他の通常の抗体と同様に、本発明のｓｄＡｂはモジュール構造を有し、ここで、ＶＨＨ可変領域配列は、３つのＣＤＲと、高度に保存的な４つのフレームワーク領域とを含むとともに、一般的にＦＲ１－ＣＤＲ－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という式で示される構造を有し、式中、ＦＲ１～ＦＲ４はフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は相補性決定領域１～３を指す。ＶＨＨ可変領域中のＣＤＲ配列は、「定義」部分に記載された任意のＣＤＲ定義案に従って決定することができ、好ましくは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａまたはその組み合わせによってｓｄＡｂ可変領域配列における３つのＣＤＲの境界を定義することができる。
【0059】
いくつかの実施形態において、本発明は、原核宿主細胞に、例えば、大腸菌に発現して単離される単一ドメイン抗体を提供する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明は、真核宿主細胞に、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞または２９３細胞に発現して単離される単一ドメイン抗体を提供する。
【0060】
いくつかの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物（例えば、アルパカ）の免疫化によって産生されたラクダ科重鎖抗体由来のＣＤＲアミノ酸配列および／またはフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ラクダ科重鎖抗体由来の本発明の単一ドメインモノクローナル抗体は、例えば、ヒトアミノ酸配列（すなわち、ヒト抗体）または他の非ラクダ科哺乳類種由来のフレームワーク領域および／または定常領域配列が含まれるように工学的に操作されてもよい。例えば、上記抗体には、ヒトまたは非ヒト霊長類由来のフレームワーク領域、一部もしくは全ての重鎖定常領域（例えば、別個のＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３領域、またはその任意の組み合わせ、例えば、ＣＨ２－ＣＨ３領域）、免疫グロブリンＦｃ領域またはその断片、および／またはヒンジ領域もしくは一部のヒンジ領域が含まれてもよい。一実施形態において、工学的に操作された抗体の特性（例えば、親和性）をさらに改善するために、工学的に操作された抗体において、１つまたは複数の位置（例えば、フレームワーク領域）で、復帰変異により、親ラクダ抗体において対応する位置にあるラクダアミノ酸残基を導入することができる。
【0061】
一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、ヒト化されたものである。ヒト化は、非ヒト由来の天然ＶＨＨ配列（例えば、ラクダ科動物またはアルパカ免疫由来のＶＨＨ配列）中の１つまたは複数のアミノ酸残基、特にフレームワーク領域配列を、ヒト由来の通常の抗体の重鎖ＶＨの対応する位置の残基で置換することにより達成することができる。単一ドメインモノクローナル抗体をヒト化する方法は、本分野においてよく知られているものである。典型的には、ヒト化置換は、単一ドメイン抗体の有利な結合特性が保持されるように行われる。適切なヒト化残基変異または変異の組み合わせを決定・選択するために、ヒト化単一ドメイン抗体の生物学的特性、例えば、結合親和性などを確認するための試験は、本分野においてよく知られている。
【0062】
いくつかの実施形態において、本発明のヒト化単一ドメイン抗体は、
（１） 親単一ドメイン抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーからスクリーニングされたラクダＶＨＨ抗体）のＣＤＲループ構造を決定するステップと、
（２） ヒト生殖細胞系列配列データベースにおいて各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つけるステップと、
（３） 重鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングするステップと、
（４） キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築するステップと、
（５） 配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定するステップと、
（６） 重要であると決定された配列位置で復帰変異を行う（入力アミノ酸タイプに戻す）ステップと、
（７） リスク部位のアミノ酸を最適化するステップと、
（８） ヒト化抗体を得て、任意に抗体ＶＨＨ配列をシーケンシングするステップと、
を含む方法により得ることができる。
（１） 親単一ドメイン抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーからスクリーニングされたラクダＶＨＨ抗体）のＣＤＲループ構造を決定するステップと、
（２） ヒト生殖細胞系列配列データベースにおいて各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つけるステップと、
（３） 重鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングするステップと、
（４） キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築するステップと、
（５） 配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定するステップと、
（６） 重要であると決定された配列位置で復帰変異を行う（入力アミノ酸タイプに戻す）ステップと、
（７） リスク部位のアミノ酸を最適化するステップと、
（８） ヒト化抗体を得て、任意に抗体ＶＨＨ配列をシーケンシングするステップと、
を含む方法により得ることができる。
【0063】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、本発明の単一ドメイン抗体の機能的変異体を提供する。上記機能的変異体は、本発明のよく知れている方法により、例えば、ランダムまたは部位特異的変異誘発により、変異を本発明の例示的な単一ドメイン抗体のコード核酸配列、例えば、ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列に導入し、その後、所望の特性を保持した変異体をスクリーニングする（例えば、ファージディスプレイライブラリースによってクリーニングする）ことにより、機能的変異体を得ることができる。典型的に、機能的変異体は、親単一ドメイン抗体（またはＶＨＨドメイン）と顕著な配列同一性を保持する。好ましくは、機能的変異体は、親単一ドメイン抗体（またはＶＨＨドメイン）の所望の生物学的特性を保持し、例えば、親の生物学的活性と比べて、変異体は相当（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、好ましくは９０％以上）の生物活性、または改善された生物活性（例えば、１１０％～１５０％もしくはそれ以上）を有する。上記所望の生物学的特性は、例えば、標的抗原結合親和性（例えば、ＫＤ値で計測）、標的抗原と受容体の結合を阻害する活性（例えば、ＩＣ５０値で計測）、標的抗原誘導性のシグナル伝達経路の活性化を阻害する抑制活性（例えば、ＩＣ５０値で計測）、インビトロまたはインビボ実験における血管新生および／または血管漏出への阻害、インビトロまたはインビボ実験における腫瘍の増殖／生存への抑制を含むが、これらに限定されない。
【0064】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体ポリペプチドの親和性変異体を提供する。好ましくは、上記親和性変異体は、その由来する親単一ドメイン抗体に対するアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸変化を示し、ここで、親和性変異体は、親抗体に比べて標的抗原への結合親和性が変化される。典型的に、親和性変異体は、親よりも優れる改善された抗原結合親和性を示す。上記改善は、低いＫＤ値、より速い解離速度、または標的抗原の非ヒト種相同タンパク質との交差反応性の増加（もしくは低減）であってもよいが、これらに限定されない。親和性変異体は、親に比べてＣＤＲに１つまたは複数のアミノ酸残基置換を有することが多い。当該置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。一実施形態において、本発明の親和性変異体は、親と比べてＣＤＲ１～３に合計で１０個以下、６個以下、または１個～５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、親和性変異体は、親と比べてＣＤＲ２に変異が導入される。別の実施形態において、親和性変異体は、親と比べてＣＤＲ２およびＣＤＲ３に変異が導入される。親和性変異体は、変異ＣＤＲ、大腸菌変異誘発株の使用、ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイなどを含む、本分野で知られている種々の親和性成熟方法によって得ることができる。
【0065】
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」（本明細書において、超可変領域「ＨＶＲ」と互換的に使用可能である）は、抗体可変領域において主に抗原エピトープとの結合を担当するアミノ酸領域である。本明細書において、単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインのＣＤＲは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号付けされる。いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体を提供し、ここで、上記抗体は、以下のＣＤＲ配列：
（ｉ）配列番号４のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｉ）配列番号８のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｉｉ）配列番号１２のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｖ）配列番号１６のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｖ）配列番号２０のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、および
（ｖｉ）配列番号２４のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
を有するＶＨＨドメインを含む。
（ｉ）配列番号４のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｉ）配列番号８のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｉｉ）配列番号１２のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｉｖ）配列番号１６のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
（ｖ）配列番号２０のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、および
（ｖｉ）配列番号２４のＶＨＨ配列の３つのＣＤＲ配列、
を有するＶＨＨドメインを含む。
【0066】
好ましくは、ＣＤＲ配列はｋａｂａｔに従って定義され、もしくはＣｈｏｔｈｉａに従って定義され、または、ＣＤＲ１はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組み合わせに従って定義され、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＫａｂａｔｃに従って定義され、
あるいは、
あるいは、
【0067】
ここで、上記抗体は、上記（ｉ）～（ｖｉ）から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列の変異体を含み、例えば、上記（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つのＣＤＲ配列に対して、上記変異体は、１個～８個、１個～５個、または１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個のアミノ酸変化、好ましくは保存的アミノ酸置換を有する。
【0068】
いくつかの実施形態において、本発明は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という式で示されるＶＨＨドメインを含む抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体を提供し、式中、
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
（ｉｉ）ＣＤＲ１は配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、または、
（ｉｖ）ＣＤＲ１は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
あるいは、
ここで、上記抗体は、上記（ｉ）～（ｖｉ）から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列の変異体を含み、例えば、上記（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つのＣＤＲ配列に対して、上記変異体は、１個～８個、１個～５個、または１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個のアミノ酸変化、好ましくは保存的アミノ酸置換を有する。
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
（ｉｉ）ＣＤＲ１は配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、または、
（ｉｖ）ＣＤＲ１は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、
あるいは、
ここで、上記抗体は、上記（ｉ）～（ｖｉ）から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列の変異体を含み、例えば、上記（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つのＣＤＲ配列に対して、上記変異体は、１個～８個、１個～５個、または１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個のアミノ酸変化、好ましくは保存的アミノ酸置換を有する。
【0069】
好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という式で示されるＶＨＨドメインを含み、式中、ＣＤＲ１は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0070】
より好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という式で示されるＶＨＨドメインを含み、式中、ＣＤＲ１は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲ２は配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつＣＤＲ３は配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0071】
単一ドメイン抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、単一ドメイン抗体における抗原結合に関与する領域である。単一ドメイン抗体における重鎖可変ドメインは、本明細書においてＶＨＨドメインとも呼ばれる。本分野で既知のように、ＶＨＨ可変領域中の１つまたは複数の残基を修飾し、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域に対して、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域に対して残基の修飾、特に保存的残基の置換を行うことができるが、修飾された抗体は、依然として、変化前の抗体分子の少なくとも１つの生物学的特性（例えば、抗原結合能力）を基本的に保持する。
【0072】
例えば、ＣＤＲ領域の残基を変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することができる。インビトロまたはインビボアッセイにおいて、変異後の抗体の抗原結合特性または他の機能特性を評価することができる。好ましくは、保存的置換が導入される。好ましくは、ＣＤＲ領域に導入される残基変化は、１個、２個、３個、４個または５個を超えない。さらに、フレームワーク領域の残基を変異させることで、例えば、抗体の特性を改善するができる。例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列残基に「復帰変異」してもよい。
【0073】
ＣＤＲ移植は、本分野で既知のもう１つの抗体可変領域修飾方法である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体－抗原相互作用を担当するため、既知の抗体の特性をシミュレーションする組換え抗体変異体を構築することができる。当該抗体変異体において、既知の抗体からのＣＤＲ配列は、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク領域に移植される。従って、一実施形態において、本発明は、図１９中の例示的なＶＨＨ単一ドメイン抗体の１つの重鎖可変領域由来のＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク領域配列を有する抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体に関する。生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースから、または公開文献に報告されたＶＥＧＦＣ抗体配列から、置換のためのフレームワーク領域配列を得ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから、ヒト重鎖可変領域遺伝子をコードする生殖細胞系列ＤＮＡを得ることができる。抗体タンパク質配列とデータベースにおけるタンパク質配列は、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴなどの配列類似性検索ツールにより比較することができる。好ましくは、置換のためのフレームワーク配列は、変化のために選択された本発明の抗体のフレームワーク配列と構造的類似性を有し、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の配列同一性を有するフレームワーク配列である。いくつかの実施形態において、実施例７の方法に従って抗体のヒト化を行うことができる。
【0074】
従って、一実施形態において、本発明は、配列番号４、８、１２、１６、２０および２４から選ばれるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体を提供する。
【0075】
別の実施形態において、本発明は抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体を提供し、上記抗体は、
（ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｉ）配列番号８で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｖ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｖｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含む。
（ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｉ）配列番号８で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｉｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｖ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含み、あるいは
（ｖｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列のＶＨＨ配列またはその変異体を含む。
【0076】
ここで、上記変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨＨ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の３つの領域において）、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。一実施形態において、変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨＨ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の３つの領域において）、少なくとも１個かつ３０個以下、１０個、または５個、４個、３個、２個、１個もしくは０個のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含む。好ましくは、変異体と参照ＶＨＨ配列の違いは、ＣＤＲ領域にはない。
【0077】
好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなる。
【0078】
ＩＩ．融合タンパク質／キメラポリペプチド
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、上記ポリペプチドは、本発明の単一ドメインモノクローナル抗体またはＶＨＨドメインと、そのＮ末端もしくはＣ末端もしくはＮ末端およびＣ末端に連結される他のペプチド／ポリペプチド配列とを含む。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、上記ポリペプチドは、本発明の単一ドメインモノクローナル抗体またはＶＨＨドメインと、そのＮ末端もしくはＣ末端もしくはＮ末端およびＣ末端に連結される他のペプチド／ポリペプチド配列とを含む。
【0079】
いくつかの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメイン（例えば、ラクダＶＨＨドメインまたはそのヒト化形態）を、ヒト抗体の定常領域、例えば、Ｆｃ領域に連結することで、ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドを産生することができる。一実施形態において、上記ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、本発明の単一ドメイン抗体と、そのＣ末端にあるＦｃ部分とを含む。
【0080】
さらなる実施形態において、上記ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、ラクダ科動物由来のＦｃ部分を含む。一実施形態において、アルパカなどの上記ラクダ科動物の免疫化により、ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドを産生して単離する。ラクダ科動物の免疫化、および産生された標的抗原に対するＶＨＨ抗体の単離のために、本分野では種々の方法が知られている。
【0081】
さらなるいくつかの実施形態において、上記ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、ヒトまたは非ヒト霊長類由来のＦｃ部分を含む。さらなる実施形態において、上記ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、例えば、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列のＦｃ領域を含む。
【0082】
一実施形態において、本発明によるＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、連結ペプチド、例えば、ヒンジ領域を介して単一ドメインモノクローナル抗体のＣ末端に融合したＦｃ部分を含む。
【0083】
さらなる実施形態において、本発明によるＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分を介して、Ｆｃ部分を含む別のポリペプチド鎖（例えば、同じまたは異なる別のＶＨＨ－Ｆｃポリペプチド）と二量体化することができる。従って、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドを含むホモまたはヘテロ多量体タンパク質も提供する。一好ましい実施形態において、好ましくは、上記タンパク質は、２つの同じＶＨＨ－Ｆｃポリペプチド鎖がペアリングして形成した重鎖抗体を含む。
【0084】
上記ＶＨＨ－Ｆｃポリペプチドおよび重鎖抗体に加え、本発明は、少なくとも１つの本発明による単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む他の融合タンパク質／キメラポリペプチドも提供する。
【0085】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質／キメラポリペプチドは、１つの本発明による単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインを含む。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質／キメラポリペプチドは、複数の本発明による単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインを含む。本発明による融合タンパク質は、単一特異性のものであってもよく、または多重特異性のものであってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質／キメラポリペプチドは、ＶＥＧＦＣに対する特異性のみを含む。さらなる実施形態において、本発明の融合タンパク質／キメラポリペプチドは、ＶＥＧＦＣに対する本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメイン（１つまたは複数）を含むことに加え、別の抗原に対する特異性、例えば、ＶＥＧＦＡに対する特異性も含む。
【0086】
当業者に理解されるように、融合タンパク質中の各構成要素は、それぞれその所望の機能が発揮されるように、操作可能に連結される。一実施形態において、融合タンパク質の構成要素同士は、直接連結されてもよく、または連結ペプチドもしくはリンカーを介して連結されてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含むか、またはフレキシブルアミノ酸配列、例えば、グリシンとセリンからなる配列、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６もしくは７、好ましくは２、３もしくは４である。
【0087】
ＩＩＩ．二重特異性結合分子
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）ＶＥＧＦ－Ｃと特異的に結合する第１の抗原結合成分と、
（ｉｉ）ＶＥＧＦ－Ａと特異的に結合する第２の抗原結合成分と、
を含む抗ＶＥＧＦＣ／ＶＥＧＦＡ二重特異性結合分子を提供する。
本発明の二重特異性分子は、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃに対する二重拮抗活性を提供する。
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）ＶＥＧＦ－Ｃと特異的に結合する第１の抗原結合成分と、
（ｉｉ）ＶＥＧＦ－Ａと特異的に結合する第２の抗原結合成分と、
を含む抗ＶＥＧＦＣ／ＶＥＧＦＡ二重特異性結合分子を提供する。
本発明の二重特異性分子は、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃに対する二重拮抗活性を提供する。
【0088】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、
（ｉ）ｈＶＥＧＦ－Ａ単独で誘導されるＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害することであって、好ましくは、ＫＤＲレポーターアッセイ、例えば、実施例１０に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、例えば、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭ～１ｎＭ、例えば、０．６ｎＭ、または約１ｎＭ～３ｎＭ、例えば約１ｎＭであること、
（ｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃ単独で誘導されるＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害することであって、好ましくは、ＫＤＲレポーターアッセイ、例えば、実施例１０に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．１ｎＭ～１ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭ～０．６ｎＭであること、
（ｉｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃ誘導性のリンパ管細胞増殖を抑制することであって、好ましくは、細胞増殖アッセイ、例えば、実施例１１に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．０１ｎＭ～０．５ｎＭ、例えば、約０．１ｎＭ～０．５ｎＭであること、
（ｉｖ）ｈＶＥＧＦ－ＣとｈＶＥＧＦ－Ａにより共誘導される内皮細胞の生存および増殖を抑制し、抑制レベルが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは約１００％に達することであって、好ましくは、細胞増殖アッセイ、例えば、実施例１２に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭであること、
（ｖ）ｈＶＥＧＦ－ＣとｈＶＥＧＦ－Ａにより共誘導される血管構造新生を抑制し、抑制レベルが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは約１００％に達することであって、好ましくは、内皮細胞管腔形成試験、例えば、実施例１３に記載の方法により抑制活性を測定することで決定可能であること、
（ｖｉ）腫瘍（例えば、固形腫瘍、例えば黒色腫）の血管新生を抑制すること、
（ｖｉｉ）腫瘍（例えば、固形腫瘍、例えば黒色腫）の増殖を抑制することであって、例えば、腫瘍担持動物モデル、例えば、実施例１４に記載の腫瘍担持動物モデルにおいて、単剤投与による腫瘍抑制率が５０％以上に達すること、ならびに
（ｖｉｉｉ）血管新生関連眼疾患の発症および／または進行を抑制し、例えば、血管新生のレベルの低下、血管漏出の低減、血管新生による眼底網膜の浮腫および／または肥厚の抑制であること、
から選ばれるいずれか１つまたは複数の生物学的活性を有する。
（ｉ）ｈＶＥＧＦ－Ａ単独で誘導されるＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害することであって、好ましくは、ＫＤＲレポーターアッセイ、例えば、実施例１０に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、例えば、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭ～１ｎＭ、例えば、０．６ｎＭ、または約１ｎＭ～３ｎＭ、例えば約１ｎＭであること、
（ｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃ単独で誘導されるＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害することであって、好ましくは、ＫＤＲレポーターアッセイ、例えば、実施例１０に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．１ｎＭ～１ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭ～０．６ｎＭであること、
（ｉｉｉ）ｈＶＥＧＦ－Ｃ誘導性のリンパ管細胞増殖を抑制することであって、好ましくは、細胞増殖アッセイ、例えば、実施例１１に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．０１ｎＭ～０．５ｎＭ、例えば、約０．１ｎＭ～０．５ｎＭであること、
（ｉｖ）ｈＶＥＧＦ－ＣとｈＶＥＧＦ－Ａにより共誘導される内皮細胞の生存および増殖を抑制し、抑制レベルが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは約１００％に達することであって、好ましくは、細胞増殖アッセイ、例えば、実施例１２に記載の方法により抑制活性のＩＣ５０値を測定することで決定可能であり、ここで、上記ＩＣ５０値は、０．１ｎＭ～０．５ｎＭ、例えば、約０．２ｎＭであること、
（ｖ）ｈＶＥＧＦ－ＣとｈＶＥＧＦ－Ａにより共誘導される血管構造新生を抑制し、抑制レベルが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは約１００％に達することであって、好ましくは、内皮細胞管腔形成試験、例えば、実施例１３に記載の方法により抑制活性を測定することで決定可能であること、
（ｖｉ）腫瘍（例えば、固形腫瘍、例えば黒色腫）の血管新生を抑制すること、
（ｖｉｉ）腫瘍（例えば、固形腫瘍、例えば黒色腫）の増殖を抑制することであって、例えば、腫瘍担持動物モデル、例えば、実施例１４に記載の腫瘍担持動物モデルにおいて、単剤投与による腫瘍抑制率が５０％以上に達すること、ならびに
（ｖｉｉｉ）血管新生関連眼疾患の発症および／または進行を抑制し、例えば、血管新生のレベルの低下、血管漏出の低減、血管新生による眼底網膜の浮腫および／または肥厚の抑制であること、
から選ばれるいずれか１つまたは複数の生物学的活性を有する。
【0089】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、脈管新生関連疾患、例えば、癌（例えば、固形腫瘍）および眼疾患（例えば、黄斑変性ＡＭＤ）の治療に使用可能な抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供する。
【0090】
本発明による抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子の抗ＶＥＧＦＣ成分は、上記任意の本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体ポリペプチド、または本発明による任意の抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインを含むことができる。好ましくは、上記抗ＶＥＧＦＣ成分は、本発明による抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインを含むかまたはそれからなり、より好ましくは、上記ＶＨＨドメインはヒト化ＶＨＨドメインである。一実施形態において、上記ＶＨＨドメインは、それぞれ配列番号１、２および３で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、一実施形態において、上記ＶＨＨドメインは配列番号９、１０および１１で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、一好ましい実施形態において、上記ＶＨＨドメインは配列番号１７、１８および１９で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、さらなる好ましい実施形態において、上記ＶＨＨドメインは配列番号２１、２２および２３で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、上記ＶＨＨドメインは、（ｉ）配列番号４、８、１２、１６、２０もしくは２４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列に対して少なくとも１個～３０個、１個～２０個、１個～１５個、１個～１０個、もしくは１個～５個のアミノ酸変化（例えば、置換、欠失および／または挿入、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列から選ばれるものを含む。一好ましい実施形態において、上記ＶＨＨドメインは、配列番号２０もしくは２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子は、少なくとも１つ、例えば、２つまたはそれ以上（好ましくは２つ）の本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインを含む。
【0091】
本発明による抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子の抗ＶＥＧＦＡ成分は、ＶＥＧＦＡ結合ドメインを含む任意の分子により提供可能であり、例えば、抗ＶＥＧＦＡ抗体、例えば、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ）２抗体、単一ドメイン抗体とナノボディ；抗ＶＥＧＦＡ トラップ分子、例えば、ＶＥＧＦＡ受容体ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインを含むトラップ分子、ＶＥＧＦＡ受容体ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインを含むトラップ分子、またはＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインを含むトラップ分子；およびＶＥＧＦＡ結合ドメインと免疫グロブリンのＦｃ部分の融合タンパク質またはキメラポリペプチドであるが、これらに限定されない。本発明による二重特異性抗体分子において、抗ＶＥＧＦＣ成分は、抗ＶＥＧＦＡ成分のＣ末端またはＮ末端に連結または融合される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦＣ成分は、直接的に、または、好ましくはリンカー配列を介して、抗ＶＥＧＦＡ成分のＮ末端もしくはＣ末端、好ましくはＣ末端に共有結合可能である。いくつかの実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ成分は、ヒトＶＥＧＦＡに結合してＶＥＧＦＡとその受容体ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２の結合ならびにそれで誘導されるシグナル伝達を抑制する。
【0092】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ成分は、ＶＥＧＦＡ結合ドメインを含むＦｃキメラポリペプチドにより提供され、それにより、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は、Ｆｃ融合タンパク質形態のＶＥＧＦＡ結合ドメインを含む。別のいくつかの好ましい実施形態において、抗ＶＥＧＦＡ成分は、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体により提供され、それにより、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は、Ｆａｂ抗体形態のＶＥＧＦＡ結合ドメインを含む。抗ＶＥＧＦＡ成分がＦｃ融合タンパク質である実施形態において、好ましくは、ＶＥＧＦＡ結合ドメインはＦｃ部分のＮ末端またはＣ末端にあってもよく、かつ抗ＶＥＧＦＣ成分はＦｃ部分の対向端に連結される。抗ＶＥＧＦＡ成分がＦａｂ抗体である実施形態において、好ましくは、抗ＶＥＧＦＣ成分はＦａｂ抗体のＣ末端に連結される。
【0093】
いくつかの実施形態において、本発明による本発明の二重特異性結合タンパク質は、抗ＶＥＧＦＡ成分と抗ＶＥＧＦＣ成分を連結するリンカーを含んでもよい。一実施形態において、リンカーは、約６～約３０アミノ酸長さ、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０アミノ酸長のペプチドである。好ましくは、リンカーは、Ｇ（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ（Ｇ４Ｓ）ｎアミノ酸配列を含み、ｎ＝１、２、３、４もしくは５の整数、好ましくはｎ＝２、３もしくは４である。
【0094】
Ｆｃ融合タンパク質形態の二重特異性結合分子
いくつかの実施形態において、それに従って、本発明は、抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記結合分子はＦｃ融合タンパク質形態の抗ＶＥＧＦＡ成分および抗ＶＥＧＦＣ成分を含み、ここで、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを含み、かつ上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、本発明に記載される任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメイン抗体ポリペプチド、特に本発明に記載される任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインからなるＶＨＨ単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。一実施形態において、上記抗ＶＥＧＦＣ成分は、抗ＶＥＧＦＡ成分のＦｃ領域を介してそれに連結され、好ましくは共有結合され、より好ましくはリンカーを介して連結される。さらなる実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインと上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインは、それぞれＦｃ領域の両端に位置する。いくつかの好ましい実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインはＦｃ領域のＮ末端に位置し、かつ上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインはＦｃ領域のＣ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、それに従って、本発明は、抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記結合分子はＦｃ融合タンパク質形態の抗ＶＥＧＦＡ成分および抗ＶＥＧＦＣ成分を含み、ここで、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを含み、かつ上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、本発明に記載される任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメイン抗体ポリペプチド、特に本発明に記載される任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインからなるＶＨＨ単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。一実施形態において、上記抗ＶＥＧＦＣ成分は、抗ＶＥＧＦＡ成分のＦｃ領域を介してそれに連結され、好ましくは共有結合され、より好ましくはリンカーを介して連結される。さらなる実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインと上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインは、それぞれＦｃ領域の両端に位置する。いくつかの好ましい実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインはＦｃ領域のＮ末端に位置し、かつ上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインはＦｃ領域のＣ末端に位置する。
【0095】
一実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインは、ＶＥＧＦ－Ａ結合性ポリペプチドである。さらなる実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合性ポリペプチドは、ＶＥＧＦＡ受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２に由来する細胞外ＶＥＧＦＡ結合ドメインを含む。一実施形態において、上記ＶＥＧＦＡ結合性ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇドメインに遺伝子的に融合されるＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇドメインを含む。一実施形態において、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合性ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。好ましくは、上記ＶＥＧＦ－Ａ結合性ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0096】
一実施形態において、上記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。
【0097】
一実施形態において、ＶＥＧＦＡ結合性ポリペプチドおよびＦｃ領域を含む抗ＶＥＧＦＡ成分は、配列番号２５のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。
【0098】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子は、Ｆｃ領域の二量体化作用により二量体を形成する。
【0099】
一好ましい実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子では、本発明による抗ＶＥＧＦＡ結合ポリペプチドおよび本発明による抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインは、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端に融合され、かつ、それで形成された融合ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域の二量体化により二量体を形成する。従って、一好ましい実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、それぞれ、本発明による抗ＶＥＧＦＡ結合ポリペプチドと本発明による抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインがそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端に融合して形成された融合ポリペプチドを含み、ここで、上記第１のポリペプチド鎖と２のポリペプチド鎖は、同じであっても異なってもよい。好ましくは、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は同じであり、本発明の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含むホモ二量体タンパク質である。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は同じであり、それぞれ、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＥＧＦ－Ａ結合性ポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は同じであり、それぞれ、配列番号４、８、１２、１６、２０もしくは２４のアミノ酸配列から選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインを含み、好ましくは、上記ＶＨＨドメインは、配列番号１～３、配列番号９～１１、配列番号１７～１９または配列番号２１～２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含み、より好ましくは、上記ＶＨＨドメインは、配列番号４、８、１２、１６、２０もしくは２４から選ばれるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は同じであり、それぞれ、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ領域を含む。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は同じであり、かつここで、本発明による抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインは、リンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合される。一実施形態において、リンカーは、Ｇ（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ（Ｇ４Ｓ）ｎアミノ酸配列を含み、ｎ＝１、２、３、４もしくは５の整数、好ましくはｎ＝２、３もしくは４である。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は、同じであるとともに、それぞれ配列番号４０～４１および４４～４７から選ばれるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は、同じであるとともに、それぞれ配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む。
【0100】
Ｆａｂ抗体形態の二重特異性結合分子
さらなるいくつかの実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記結合分子はＦａｂ抗体形態の抗ＶＥＧＦＡ成分および抗ＶＥＧＦＣ成分を含み、ここで、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は、ペアリングしてＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを形成する重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、それらはそれぞれ、免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１および軽鎖定常領域ＣＬと融合することで抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体を形成する。さらなるいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦＣ成分は、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体のＣＨ１および／またはＣＬ定常領域Ｃ末端により、Ｆａｂ抗体形態の抗ＶＥＧＦＡ成分に連結され、好ましくは共有結合され、より好ましくはリンカーを介して連結される。さらなる実施形態において、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、それぞれＣＨ１定常領域およびＣＬ定常領域のＣ末端に、それぞれ１つの抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分に連結される。好ましくは、上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、本発明に記載の任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメイン抗体ポリペプチド、特に本発明に記載の任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインからなるＶＨＨ単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
さらなるいくつかの実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記結合分子はＦａｂ抗体形態の抗ＶＥＧＦＡ成分および抗ＶＥＧＦＣ成分を含み、ここで、上記抗ＶＥＧＦＡ成分は、ペアリングしてＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインを形成する重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、それらはそれぞれ、免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１および軽鎖定常領域ＣＬと融合することで抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体を形成する。さらなるいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦＣ成分は、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体のＣＨ１および／またはＣＬ定常領域Ｃ末端により、Ｆａｂ抗体形態の抗ＶＥＧＦＡ成分に連結され、好ましくは共有結合され、より好ましくはリンカーを介して連結される。さらなる実施形態において、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、それぞれＣＨ１定常領域およびＣＬ定常領域のＣ末端に、それぞれ１つの抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分に連結される。好ましくは、上記抗ＶＥＧＦ－Ｃ成分は、本発明に記載の任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ単一ドメイン抗体ポリペプチド、特に本発明に記載の任意の抗ＶＥＧＦ－Ｃ ＶＨＨドメインからなるＶＨＨ単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
【0101】
本発明による二重特異性結合分子のいくつかの実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、重鎖可変領域ＶＨおよび免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１が連結して形成されるＦａｂ重鎖と、軽鎖可変領域ＶＬおよび免疫グロブリン定常領域ＶＬから形成されるＦａｂ軽鎖とを含む。別の実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、重鎖可変領域ＶＨおよび免疫グロブリン定常領域ＶＬが連結して形成されるＦａｂ軽鎖と、上記軽鎖可変領域ＶＬおよび免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１が連結して形成されるＦａｂ重鎖とを含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、ここで、上記ＶＨは配列番号３４～３６のＨＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは配列番号３７～３９のＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であり、好ましくはヒト化抗体である。さらなる実施形態において、上記ＶＥＧＦ Ｆａｂ抗体は、重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、ここで、上記ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは、配列番号３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
【0103】
さらなるいくつかの実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＣＨ１定常領域を含む。別の実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬを含む。一実施形態において、上記抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖ＣＨ１定常領域を含む。さらなる実施形態において、上記抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＬ定常領域を含む。
【0104】
いくつかの実施形態において、好ましくは、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、本発明によるＶＨおよびＣＨ１からなるＦａｂ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１鎖）と、本発明によるＶＬおよびＣＬからなるＦａｂ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ鎖）とを含む。より好ましくは、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦａｂ重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦａｂ軽鎖とを含む。より好ましくは、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【0105】
本発明による二重特異性結合分子のさらなるいくつかの実施形態において、本発明による抗Ｆａｂ抗体は、ＣＨ１およびＣＬのＣ末端でそれぞれ、本発明の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体または本発明の抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインに、直接的に、または好ましくはリンカーを介して連結される。従って、一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、上記第１のポリペプチド鎖は、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体のＦａｂ重鎖と、そのＣＨ１のＣ末端に連結される抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインとを含み、第２のポリペプチド鎖は、本発明による抗ＶＥＧＦＡ Ｆａｂ抗体のＦａｂ軽鎖と、そのＣＬのＣ末端に連結される抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨドメインとを含む。好ましくは、上記Ｆａｂ重鎖はＶＨおよびＣＨ１からなり（ＶＨ－ＣＨ１）、上記Ｆａｂ軽鎖はＶＬおよびＣＬからなる（ＶＬ－ＣＬ）。
【0106】
一好ましい実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、第１のポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端へＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨを含み、かつ第２のポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端へＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨを含み、ここで、上記ＶＨＨは本発明の抗ＶＥＧＦＡ ＶＨＨドメインであり、上記ＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬがペアリングして本発明の抗ＶＥＧＦ－Ａ Ｆａｂ抗体を形成し、任意に、ここで、ＣＨ１およびＣＬは、リンカーを用いることなく、ＶＨＨドメインに直接連結されてもよい。いくつかの実施形態において、上記ＶＨＨドメインは、配列番号４、８、１２、１６、２０もしくは２４のアミノ酸配列から選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含み、好ましくは、上記ＶＨＨドメインは、配列番号１～３、配列番号９～１１、配列番号１７～１９または配列番号２１～２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、より好ましくは、上記ＶＨＨドメインは、配列番号４、８、１２、１６、２０もしくは２４から選ばれるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなり、さらに好ましくは、上記ＶＨＨドメインは、配列番号２０または２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号３４～３６のＨＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは配列番号３７～３９のＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記ＶＨおよびＶＬはヒト化されたものであり、より好ましくは、上記ＶＨは、配列番号２９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは、配列番号３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、上記ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、かつ上記ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＣＨ１定常領域を含む。別の実施形態において、上記ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬを含む。一実施形態において、上記ＣＨ１は、配列番号３０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、上記ＣＬは、配列番号３３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、Ｇ（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ（Ｇ４Ｓ）ｎアミノ酸配列を含み、ｎ＝１、２、３、４もしくは５の整数、好ましくはｎ＝２、３もしくは４である。
【0107】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子を提供し、ここで、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、
－配列番号４２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号４８のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号５０のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号５１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
から選ばれ、
一好ましい実施形態において、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４２のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４３のアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号５０のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号５１のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
－配列番号４２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号４８のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号４９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
－配列番号５０のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、および配列番号５１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、
から選ばれ、
一好ましい実施形態において、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４２のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４３のアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、または、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号５０のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号５１のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ上記第２のポリペプチド鎖は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【0108】
本発明は、また、本発明の単一ドメイン抗体、融合タンパク質と二重特異性結合分子を含む免疫複合体（例えば、毒素または化学小分子に結合）、および医薬組成物ならびに薬物組合せを提供する。医薬組成物または薬物組合せにおいて、本発明の単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性結合分子は、別の治療剤、例えば、本発明の単一ドメイン抗体、融合タンパク質と二重特異性結合分子の予想使用に利用可能な別の治療剤、例えば、化学療法剤、放射線治療剤、抗血管新生分子、免疫抑制薬、抗線維化薬、神経保護薬および腫瘍抑制分子を含んでもよい。
【0109】
ＩＶ．ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主
本発明は、上記任意の本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性結合分子）をコードする核酸を提供する。上記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または２９３細胞）から選ばれる。別の実施形態において、宿主細胞は原核のものである。
本発明は、上記任意の本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性結合分子）をコードする核酸を提供する。上記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または２９３細胞）から選ばれる。別の実施形態において、宿主細胞は原核のものである。
【0110】
一態様において、本発明は、上記任意の抗ＶＥＧＦＣ単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインをコードする核酸を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、上記核酸によりコードされたポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦＣ抗原結合能力を示すことができる。いくつかの実施形態において、上記核酸は、インフレームにおいて別のペプチド／ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結されることで、適切な発現ベクターから発現される場合、上記単一ドメイン抗体もしくはＶＨＨドメインと別のペプチド／ポリペプチドとを含む融合タンパク質またはキメラポリペプチドを産生する。産生および精製を容易にするために、単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、Ｎ末端で分泌シグナルペプチド、および／または精製に寄与するタグペプチド、例えば、ヘキサヒスチジンタグと融合してもよい。単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、Ｃ末端で免疫グロブリンのＦｃ部分と融合してＶＨＨ－Ｆｃ抗体を形成してもよい。
【0111】
さらなる態様において、本発明は、上記任意の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性結合分子をコードする核酸を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、上記核酸によりコードされたポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＶＥＧＦＣ抗原結合能力を示すことができる。一実施形態において、二重特異性抗体分子の第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸は、同じベクターにあってもよく、または異なるベクターにあってもよい。さらなる実施形態において、二重特異性抗体分子の第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸は、同じまたは異なる宿主細胞を導入することで発現することができる。従って、いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子の産生方法は、上記分子の第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖の発現に適する条件下で、上記第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、本発明の二重特異性結合分子を産生するステップを含む。
【0112】
当業者に明らかなように、遺伝暗号の退化性のため、それぞれの抗体またはポリペプチドアミノ酸配列は、複数種の核酸配列によってコードすることができる。
【0113】
本発明の分子をコードする核酸配列は、本分野でよく知られている方法を利用し、例えば、新規固相ＤＮＡ合成により、またはＰＣＲ増幅により産生することができる。
【0114】
一実施形態において、本発明の核酸を含む１つまたは複数のベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、原核発現ベクターまたは真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。
【0115】
一実施形態において、１種または複数種の本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書に用いられるように、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体分子が産生されるように工学的に操作可能な任意の種類の細胞系を指す。本発明の抗体分子の発現を複製およびサポートするのに適する宿主細胞は、本分野でよく知られているものである。必要に応じて、このような細胞は、特定の発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、臨床応用に十分な量の本発明の分子が得られるように、大規模な発酵槽に接種するためにベクター含有細胞を大量に培養することができる。適切な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物、糸状真菌もしくは酵母などの真核微生物、または、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などのさまざまな真核細胞を含む。懸濁培養に適する哺乳動物細胞株を利用することができる。利用可能な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ２９３または２９３Ｆ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などが含まれる。タンパク質の産生に適する哺乳動物宿主細胞株についての概説は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５～２６８（２００３）が参照される。一好ましい実施形態において、上記宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞である。
【0116】
Ｖ．本発明の分子の産生および精製
さらなる態様において、本発明は、本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性結合分子）を産生するための方法を提供し、上記方法は、上記分子のポリペプチド鎖を発現するのに適する条件下で上記ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、上記ポリペプチド鎖を上記分子になるように組み立てるのに適する条件下でポリペプチド鎖を組み立てて上記分子を産生することとを含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性結合分子）を産生するための方法を提供し、上記方法は、上記分子のポリペプチド鎖を発現するのに適する条件下で上記ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、上記ポリペプチド鎖を上記分子になるように組み立てるのに適する条件下でポリペプチド鎖を組み立てて上記分子を産生することとを含む。
【0117】
組換え産生のために、本発明の分子のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞においてさらにクローニングおよび／または発現されるように、１つまたは複数のベクターに挿入することができる。当業者によく知られている方法により発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。本発明の１種または複数種のポリヌクレオチドを含む、発現のための発現ベクターが調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションまたは導入することができる。この目的を達成させるために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルスの形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、リポソームに基づくトランスフェクションまたは他の一般的な技術のようなさまざまな技術を利用することができる。
【0118】
本明細書に記載の通り調製された抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の従来技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの因素にも依存し、かつそれらは当業者にとって明らかである。
【0119】
一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体またはＶＨＨドメインは、細菌、例えば大腸菌において産生可能である。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、細菌のペリプラズム内で発現された後、本分野で既知の方法で単離され、かつ任意にさらに精製されることができる。さらに、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、融合ポリペプチドおよび二重特異性分子は、真核細胞において発現されてもよい。一実施形態において、上記細胞は２９３細胞であり、発現された後、例えば、タンパク質Ａカラムによって単離・精製される。
【0120】
よく知られている種々の分析方法のいずれか１つにより、本発明の抗体分子の純度を決定することができ、上記よく知られている分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。本分野で知られている種々の測定法により、本明細書に提供される抗体分子の物理的／化学的特性および／または生物学的活性を同定、スクリーニングもしくは特性評価することができる。
【0121】
ＶＩ．測定法
本分野で既知の種々の測定法により、本明細書に提供される分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性分子）についてその物理的／化学的特性および／または生物学的活性を同定、スクリーニングもしくは表現特性評価することができる。
本分野で既知の種々の測定法により、本明細書に提供される分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質および二重特異性分子）についてその物理的／化学的特性および／または生物学的活性を同定、スクリーニングもしくは表現特性評価することができる。
【0122】
本発明の分子のヒトＶＥＧＦＡおよび／またはヒトＶＥＧＦＣへの結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットのような本分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示される例示的な方法により測定することができる。例えば、組換えＶＥＧＦＡおよび／またはヒトＶＥＧＦＣタンパク質を使用し、光干渉による生体測定法で分子の結合ダイナミクス（例えば、ＫＤ値）を測定することができる。いくつかの実施形態において、光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定）、例えば、実施例３に示される方法により、温度３０℃で、分子のヒトＶＥＧＦＡおよび／またはヒトＶＥＧＦＣへの結合平衡解離定数、例えば、一価結合親和性または二価結合親和性を測定する。
【0123】
本発明の分子のＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ拮抗／抑制活性は、本分野で既知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ阻害試験、受容体蛍光レポーター分子活性化試験、細胞増殖試験、または本明細書の実施例に開示された例示的な方法により測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ阻害試験、例えば、実施例４に示される方法により、ヒトＶＥＧＦＡおよび／またはヒトＶＥＧＦＣとその関連受容体の結合を阻害する分子の阻害活性を測定することができる。細胞ベースの受容体レポーターアッセイ、例えば、実施例５または１０に記載の方法により、例えば、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞で、分子による、ｈＶＥＧＦ－Ａ単独もしくはｈＶＥＧＦ－Ｃ単独またはその組み合わせで誘導されたＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化への阻害を測定してもよい。細胞増殖アッセイ、例えば、ＣＣＫ－８試験、例えば、実施例６または１１に記載の方法により、リンパ球または内皮細胞で、分子による、ｈＶＥＧＦ－Ａ単独もしくはｈＶＥＧＦ－Ｃ単独またはその組み合わせで誘導された細胞の生存および／または増殖へのインビトロでの抑制を測定してもよい。
【0124】
本発明の分子の抗血管新生作用は、本分野で既知の方法、例えば、インビトロ試験および／またはインビボ動物実験により測定することができる。例えば、インビトロ内皮細胞管腔形成実験、例えば、実施例１３に示される方法により、ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣを用いてヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管腔形成を誘導し、分子によるＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣ誘導性の初代細胞管腔形成への抑制作用を検出してもよい。例えば、腫瘍担持マウスモデルにおいて、例えば、実施例１４に示される方法に従って、分子の抗血管新生および／または抗腫瘍作用を検出してもよい。あるいは、選択的には、例えば、レーザー誘導性の脈絡膜血管新生動物モデルを使用し、分子投与後に、例えば、眼底カラー写真撮影、フルオレセイン眼底血管造影、光干渉断層撮影により、分子の脈絡膜血管新生への抑制状況を観察してもよい。
【0125】
ＶＩＩ．医薬組成物、薬物組合せおよび試薬キット
一態様において、本発明は、医薬組成物などの組成物を提供し、上記組成物は、薬学的に許容可能なベクターとともに調製された本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質または二重特異性分子）を含む。本明細書に用いられるように、「薬学的に許容可能なベクター」は、生理学的に適合性がある溶剤、分散媒体、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかまたはその全てを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入）に適する。一実施形態において、本発明の分子は、注射投与に適する医薬組成物として調製される。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、腹腔内注射に適する医薬組成物として調製される。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の分子は、眼注射投与（例えば、硝子体注射投与）に適する医薬組成物として調製される。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、医薬組成物中の唯一の活性成分である。別のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体分子と、１種以上の治療剤とを含んでもよい。
一態様において、本発明は、医薬組成物などの組成物を提供し、上記組成物は、薬学的に許容可能なベクターとともに調製された本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質または二重特異性分子）を含む。本明細書に用いられるように、「薬学的に許容可能なベクター」は、生理学的に適合性がある溶剤、分散媒体、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかまたはその全てを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入）に適する。一実施形態において、本発明の分子は、注射投与に適する医薬組成物として調製される。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、腹腔内注射に適する医薬組成物として調製される。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の分子は、眼注射投与（例えば、硝子体注射投与）に適する医薬組成物として調製される。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、医薬組成物中の唯一の活性成分である。別のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体分子と、１種以上の治療剤とを含んでもよい。
【0126】
別の態様において、本発明はまた、本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質または二重特異性分子）と、１種以上の治療剤とを含む薬物組合せを提供する。
【0127】
本発明の医薬組成物および薬物組合せに適用される治療剤は、（ｉ）抗血管新生薬、（ｉｉ）免疫抑制薬、（ｉｉｉ）抗線維化薬、（ｉｖ）神経保護剤、および（ｖ）腫瘍抑制作用を有する薬物、というクラスから選ばれるいずれか１つの治療剤であってもよい。
【0128】
本発明の組成物は、さまざまな形態であってもよい。これらの形態は、液体、半固体と固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤と注入用溶液剤）、分散体剤または懸濁剤、リポソーム剤および坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療的使用によって決定される。一般的な好ましい組成物は、注射用溶液剤または注入用溶液剤の形態である。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射である。一好ましい実施形態において、抗体分子は、静脈内注入または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、抗体分子は、筋肉内、腹腔内または皮下注射により投与される。
【0129】
本明細書に用いられるような「非経口投与」および「非経口方式投与」という語句は、経腸投与および局所投与以外の投与モードを指し、一般的に注射により投与され、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、経気管、皮下注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【0130】
治療用組成物は、一般的に滅菌であるとともに、調製と貯蔵条件において安定であるべきである。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソームまたは凍結乾燥形態に調製することができる。活性化合物（すなわち、抗体分子）を所定の量で適切な溶剤に加えてから、ろ過して消毒することにより、滅菌された注射用溶液剤を調製することができる。一般的に、上記活性化合物を滅菌溶媒に加えることによって分散体を調製し、上記滅菌溶媒は、基礎的分散媒体と他の成分を含む。レシチンなどのコーティング剤を用いることができる。分散体である場合は、界面活性剤を用いることで溶液剤の適切な流動性を維持することができる。吸収を遅延する物質、例えば、モノステアレートとゼラチンを組成物に含ませることにより、注射用組成物の吸収を延長させることができる。
【0131】
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の分子を含んでもよい。「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、病状、個体の年齢、性別と体重などの多くの要因によって変化することができる。治療有効量は、毒性または有害作用が治療による有益な効果に及ばないような任意の量である。未治療の対象と比べ、「治療有効量」は、好ましくは測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖率）を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、また一層好ましくは少なくとも約８０％抑制する。測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍体積）に対する本発明の分子の抑制能力は、ヒト腫瘍における効果を示す動物モデルシステムにおいて評価することができる。
【0132】
「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防的用量は対象において疾患の早期より前または疾患の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。
【0133】
本明細書に記載の抗体分子を含む試薬キットも、本発明の範囲内にある。試薬キットは、１つまたは複数の他の要素を含んでもよく、例えば、取扱説明書、マーカーまたはカップリングのための試薬などの他の試薬、薬学的に許容可能なベクター、および対象への投与のための装置または他の材料を含む。
【0134】
ＶＩＩＩ．本発明の分子の使用および方法
一態様において、本発明は、本発明の分子のインビボ・インビトロでの使用および適用方法を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の分子のインビボ・インビトロでの使用および適用方法を提供する。
【0135】
いくつかの実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明の分子をインビボおよび／またはインビトロで、
－ＶＥＧＦＡ抗原および／またはＶＥＧＦＣ抗原との結合、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣと、その関連受容体、例えばＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３との結合への阻害、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性のＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３細胞シグナル伝達の活性化への抑制、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性の血管内皮細胞の生存、増殖および／または遊走への抑制、
－ＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ球の生存および／または増殖への抑制、
－ＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ管新生およびリンパ内皮細胞の増殖と遊走への抑制、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性の血管新生および／または血管漏出への抑制、
－腫瘍の血管新生および／または増殖および／または転移への抑制、
に適用することに関する。
－ＶＥＧＦＡ抗原および／またはＶＥＧＦＣ抗原との結合、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣと、その関連受容体、例えばＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３との結合への阻害、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性のＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３細胞シグナル伝達の活性化への抑制、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性の血管内皮細胞の生存、増殖および／または遊走への抑制、
－ＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ球の生存および／または増殖への抑制、
－ＶＥＧＦＣ誘導性のリンパ管新生およびリンパ内皮細胞の増殖と遊走への抑制、
－ＶＥＧＦＡおよび／またはＶＥＧＦＣ誘導性の血管新生および／または血管漏出への抑制、
－腫瘍の血管新生および／または増殖および／または転移への抑制、
に適用することに関する。
【0136】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子または本発明の抗体分子を含む医薬組成物は、個体において疾患を治療および／または予防する薬物として使用され、あるいは疾患の診断ツールとして使用され、好ましくは、上記個体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【0137】
いくつかの実施形態において、本発明は、血管新生関連疾患を治療する方法であって、対象に本発明の分子（単一ドメイン抗体ポリペプチドもしくはその融合タンパク質、または二重特異性結合タンパク質）またはその医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記疾患は固形腫瘍、好ましくは黒色腫であり、ここで、上記二重特異性結合タンパク質の投与により、腫瘍内の血管新生および／または腫瘍の増殖が抑制される。別のいくつかの実施形態において、上記疾患は眼疾患、好ましくは加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞および角膜血管新生である。
【0138】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象において疾患を治療および／または予防する薬物を調製するため、ならびに／もしくは疾患を診断する診断ツールを調製するための本発明の単一ドメイン抗体ポリペプチドまたはその融合タンパク質あるいは本発明の二重特異性結合分子の使用を提供し、ここで、上記疾患は、好ましくは血管新生関連疾患であり、例えば固形腫瘍および眼疾患である。
【0139】
任意の上記実施形態にも、１種または複数種の別の活性剤、例えば、化学療法剤および／または癌治療剤もしくは抗血管新生療法は、さらに本発明の単一ドメイン抗体ポリペプチドまたは二重特異性結合タンパク質と併用投与することができる。併用投与の形態は、同時投与、並行投与、または任意の順番での逐次投与であってもよい。
【0140】
さらなる態様において、本発明はまた、インビトロまたはインビボで、生体試料、例えば、血清、精液、尿または組織生検試料（例えば、過剰増殖性または癌性の病巣に由来）における関連抗原の存在を検出する診断方法を提供する。当該診断方法は、（ｉ）相互作用の発生を許容する条件下で、試料（および任意に、対照試料）を（標識または非標識の）本発明の分子（単一ドメイン抗体、融合タンパク質もしくは二重特異性結合分子）と接触させるか、または対象に上記抗体分子を投与することと、（ｉｉ）上記分子と試料（および任意に、対照試料）との間での複合物の形成を検出することとを含む。複合物の形成は、関連抗原の存在を表し、場合によっては、本明細書に記載の治療および／または予防の適合性または必要性を示すことができる。
【実施例】
【0141】
実施例１．ファージ免疫ライブラリーの調製
アルパカの免疫または合成ライブラリーの構築
１．１ 健康な成体アルパカ（成都ＮＢＢＩＯＬＡＢ社）２頭を選択し、組換えタンパク質抗原ヒトＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）０．５ｍｇとフロイントアジュバントを１：１の比率で均一に混合し、背中皮下多点注射の方式でアルパクを合計４回免疫化し、免疫間隔を２週間とした。
１．２ アルパカ末梢血５０ｍＬを採取し、リンパ球を単離し、生細胞２．５×１０７個あたり１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬（ＴＨＥＲＭＯ社）を加え、クロロホルム／イソプロピルアルコール沈殿法により全ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮＡをテンプレートとして取り、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写試薬キット（Ｔａｋａｒａ社）を用いて逆転写を行った。ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によりＶＨＨをコードする核酸を産生した後、Ｆｌａｇタグおよびヘキサヒスチジンタグ付きのＶＨＨ断片とファージｇｐＩＩＩタンパク質との融合ポリペプチドを発現してディスプレイするファージディスプレイベクターを挿入し、ディスプレイベクターで大腸菌ＴＧ１コンピテント細胞を形質転換し、ＶＨＨ抗体ライブラリーを構築して産生した。
簡単に言えば、ｃＤＮＡをテンプレートとして、１回目のＰＣＲ反応および２回目のＰＣＲ反応を行った（具体的な方法は、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ Ｊｕｌｙ ３１；３２４（１－２）：１３～２５を参照）。ｐＣ３－ＨＦベクターと２回目のＰＣＲの産物をそれぞれＳａｃＩとＳａｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）により二重酵素切断し、酵素切断産物にＴ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を加えて反応させ、ＴＧ１コンピテント細胞を電気的形質転換し、ＶＨＨ抗体ライブラリーを構築し、菌液を－８０℃で凍結保存した。
蘇生した菌液を１００ｍＬのＹＴ－ＡＧ培地（上海Ｓａｎｇｏｎ社）に接種し、ヘルパーファージを加えて感染させ、２×ＹＴ－ＡＫ培地（上海Ｓａｎｇｏｎ社）で菌体を再懸濁し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養上清を収集し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿法を用いて組換えファージを調製した。
１．３ 組換えファージをビオチン標識抗原ＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）によりパニング実験を３回行った。各チューブに５０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２８０磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ社）および適量のビオチン標識抗原を加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした後、１×１０１２のｃｆｕ組換えファージを加えて室温で１ｈインキュベートした。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳＴに加えて１０回洗浄し、各回の洗浄時間が５ｍｉｎであった。最後に、ｐＨ２．５のグリシン緩衝液０．５ｍＬを加え、抗原結合の組換えファージを溶離し、ＴＧ１に感染させて一晩培養し、ヘルパーファージで感染させ、組換えファージを調製して次回のパニング実験に供し、そして陽性ＶＨＨを含むＴＧ１細菌クローンを同定した。
１．４ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡにより結合活性を検出し、クローンのシーケンシングを行った。
予めＶＥＧＦＣ抗原（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を取り、ＰＢＳ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃の冷蔵庫で一晩置いた。抗原でコーティングされたプレートをＰＢＳＴにより３回洗浄し、ブロッキング剤を３００μＬ／ウェルまで加え、室温で１ｈ静置してブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤８０μＬ＋上記１．３で同定した陽性ＶＨＨのＴＧ１菌の発現上清２０μＬを加え、室温で１ｈ振とうした。
ＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤を加えて希釈したＡｎｔｉ－Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で４０ｍｉｎ振とうした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ発色液を１００μＬ／ウェルまで加え、光を避けて５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ発色させた。さらに１００μＬ／ウェルの停止液を加えた。マイクロプレートリーダーで値を読み取り、ＯＤ４５０ｎｍ吸光値を測定した。読取値が０．５より大きい細菌クローンを選択してシーケンシングのためにＧＥＮＥＷＩＺ社へ送り、各対応するＶＨＨ配列を含むＴＧ１菌モノクローンを選択してグリセリンを加え、－８０℃の冷蔵庫で凍結した。
アルパカの免疫または合成ライブラリーの構築
１．１ 健康な成体アルパカ（成都ＮＢＢＩＯＬＡＢ社）２頭を選択し、組換えタンパク質抗原ヒトＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）０．５ｍｇとフロイントアジュバントを１：１の比率で均一に混合し、背中皮下多点注射の方式でアルパクを合計４回免疫化し、免疫間隔を２週間とした。
１．２ アルパカ末梢血５０ｍＬを採取し、リンパ球を単離し、生細胞２．５×１０７個あたり１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬（ＴＨＥＲＭＯ社）を加え、クロロホルム／イソプロピルアルコール沈殿法により全ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮＡをテンプレートとして取り、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写試薬キット（Ｔａｋａｒａ社）を用いて逆転写を行った。ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によりＶＨＨをコードする核酸を産生した後、Ｆｌａｇタグおよびヘキサヒスチジンタグ付きのＶＨＨ断片とファージｇｐＩＩＩタンパク質との融合ポリペプチドを発現してディスプレイするファージディスプレイベクターを挿入し、ディスプレイベクターで大腸菌ＴＧ１コンピテント細胞を形質転換し、ＶＨＨ抗体ライブラリーを構築して産生した。
簡単に言えば、ｃＤＮＡをテンプレートとして、１回目のＰＣＲ反応および２回目のＰＣＲ反応を行った（具体的な方法は、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ Ｊｕｌｙ ３１；３２４（１－２）：１３～２５を参照）。ｐＣ３－ＨＦベクターと２回目のＰＣＲの産物をそれぞれＳａｃＩとＳａｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）により二重酵素切断し、酵素切断産物にＴ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を加えて反応させ、ＴＧ１コンピテント細胞を電気的形質転換し、ＶＨＨ抗体ライブラリーを構築し、菌液を－８０℃で凍結保存した。
蘇生した菌液を１００ｍＬのＹＴ－ＡＧ培地（上海Ｓａｎｇｏｎ社）に接種し、ヘルパーファージを加えて感染させ、２×ＹＴ－ＡＫ培地（上海Ｓａｎｇｏｎ社）で菌体を再懸濁し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養上清を収集し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿法を用いて組換えファージを調製した。
１．３ 組換えファージをビオチン標識抗原ＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）によりパニング実験を３回行った。各チューブに５０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２８０磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ社）および適量のビオチン標識抗原を加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした後、１×１０１２のｃｆｕ組換えファージを加えて室温で１ｈインキュベートした。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳＴに加えて１０回洗浄し、各回の洗浄時間が５ｍｉｎであった。最後に、ｐＨ２．５のグリシン緩衝液０．５ｍＬを加え、抗原結合の組換えファージを溶離し、ＴＧ１に感染させて一晩培養し、ヘルパーファージで感染させ、組換えファージを調製して次回のパニング実験に供し、そして陽性ＶＨＨを含むＴＧ１細菌クローンを同定した。
１．４ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡにより結合活性を検出し、クローンのシーケンシングを行った。
予めＶＥＧＦＣ抗原（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を取り、ＰＢＳ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃の冷蔵庫で一晩置いた。抗原でコーティングされたプレートをＰＢＳＴにより３回洗浄し、ブロッキング剤を３００μＬ／ウェルまで加え、室温で１ｈ静置してブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤８０μＬ＋上記１．３で同定した陽性ＶＨＨのＴＧ１菌の発現上清２０μＬを加え、室温で１ｈ振とうした。
ＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤を加えて希釈したＡｎｔｉ－Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で４０ｍｉｎ振とうした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ発色液を１００μＬ／ウェルまで加え、光を避けて５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ発色させた。さらに１００μＬ／ウェルの停止液を加えた。マイクロプレートリーダーで値を読み取り、ＯＤ４５０ｎｍ吸光値を測定した。読取値が０．５より大きい細菌クローンを選択してシーケンシングのためにＧＥＮＥＷＩＺ社へ送り、各対応するＶＨＨ配列を含むＴＧ１菌モノクローンを選択してグリセリンを加え、－８０℃の冷蔵庫で凍結した。
【0142】
実施例２．原核抗体の産生および精製
上記の得られた陽性ＶＨＨ含有のＴＧ１モノクローンを用いて発現・精製してＶＨＨ抗体タンパク質を得た。
実施例１で同定されたＶＨＨ発現プラスミド含有のＴＧ１菌を８００ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００値が０．５～０．６になるまで培養した。菌液に１ｍＭのＩＰＴＧを加えてＶＨＨ断片の発現を誘導し、２８℃、２００ｃｐｍで一晩培養した。培養上清を収集し、遠心分離してから１５ｍＬのＰＢ＋１ｍｇ／ｍＬのポリミキシンを加えて再懸濁し、細菌のペリプラズムを溶解し、再び遠心分離し、０．２２μｍのろ過膜でろ過した。ペリプラズム溶解液を１ｍＬのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラムに流し、ＰＢＳを加えて２回洗浄し、０．５Ｍのイミダゾールを加えて標的タンパク質を溶離し、紫外線法によりタンパク質の濃度を測定した。溶離した標的タンパク質は紫外線法によりタンパク質の濃度を測定し、複数のチューブに分注して－４０度の冷蔵庫で保存した。
アルパカＶＨＨライブラリーでスクリーニングして、以下のＨＣＤＲモチーフ：
ＨＣＤＲ１：ＧＳＸＦＳＸＹＡＭＧ、
ＨＣＤＲ２：ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ、
ＨＣＤＲ３：ＸＷＲＧＳＤＰＥＮＹ、
を共有する２つの抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体（ＬＡ４９Ｇ９およびＬＡ６３Ｇ１２）を得た。
得られたこの２つのＶＨＨ抗体を基にして、ヒト化ＶＨＨ抗体（ＬＡ４９Ｇ９．２とＬＡ６３Ｇ１２．１）および親和性成熟のヒト化ＶＨＨ抗体（ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１とａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９）を産生した。
本発明のＶＨＨ抗体のＣＤＲアミノ酸配列とＶＨＨアミノ酸配列、および配列番号は、配列表および図１９を参照されたい。
以下の実施例のＶＨＨ抗体生物活性検出実験において、ヒト化ＬＡ４９Ｇ９．２およびＬＡ６３Ｇ１２．１分子関連実験は、二量体化ＶＨＨ－Ｆｃ抗体を使用して行い、残りはＶＨＨ単一ドメイン抗体を使用して行った。
上記の得られた陽性ＶＨＨ含有のＴＧ１モノクローンを用いて発現・精製してＶＨＨ抗体タンパク質を得た。
実施例１で同定されたＶＨＨ発現プラスミド含有のＴＧ１菌を８００ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００値が０．５～０．６になるまで培養した。菌液に１ｍＭのＩＰＴＧを加えてＶＨＨ断片の発現を誘導し、２８℃、２００ｃｐｍで一晩培養した。培養上清を収集し、遠心分離してから１５ｍＬのＰＢ＋１ｍｇ／ｍＬのポリミキシンを加えて再懸濁し、細菌のペリプラズムを溶解し、再び遠心分離し、０．２２μｍのろ過膜でろ過した。ペリプラズム溶解液を１ｍＬのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラムに流し、ＰＢＳを加えて２回洗浄し、０．５Ｍのイミダゾールを加えて標的タンパク質を溶離し、紫外線法によりタンパク質の濃度を測定した。溶離した標的タンパク質は紫外線法によりタンパク質の濃度を測定し、複数のチューブに分注して－４０度の冷蔵庫で保存した。
アルパカＶＨＨライブラリーでスクリーニングして、以下のＨＣＤＲモチーフ：
ＨＣＤＲ１：ＧＳＸＦＳＸＹＡＭＧ、
ＨＣＤＲ２：ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ、
ＨＣＤＲ３：ＸＷＲＧＳＤＰＥＮＹ、
を共有する２つの抗ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体（ＬＡ４９Ｇ９およびＬＡ６３Ｇ１２）を得た。
得られたこの２つのＶＨＨ抗体を基にして、ヒト化ＶＨＨ抗体（ＬＡ４９Ｇ９．２とＬＡ６３Ｇ１２．１）および親和性成熟のヒト化ＶＨＨ抗体（ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１とａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９）を産生した。
本発明のＶＨＨ抗体のＣＤＲアミノ酸配列とＶＨＨアミノ酸配列、および配列番号は、配列表および図１９を参照されたい。
以下の実施例のＶＨＨ抗体生物活性検出実験において、ヒト化ＬＡ４９Ｇ９．２およびＬＡ６３Ｇ１２．１分子関連実験は、二量体化ＶＨＨ－Ｆｃ抗体を使用して行い、残りはＶＨＨ単一ドメイン抗体を使用して行った。
【0143】
実施例３．バイオレイヤー干渉技術による本発明の抗体と抗原の結合ダイナミクスの測定
バイオレイヤー干渉測定技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、本発明の抗体のヒトＶＥＧＦＣに結合する平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性の測定は、従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ２７０～８）に従って行われた。
実験開始より３０ｍｉｎ前に、試料数に応じて、適切な数のＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）（試料検出用）またはＡＨＱ（Ｐａｌｌ、１５０２０５１）（陽性対照検出用）センサを取ってＳＤ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．０５％）に浸漬した。
１００μＬのＳＤ緩衝液、抗体および抗原（ヒトＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））を取り、９６ウェルの黒色ポリスチレン製のハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５０７６）に加えた。試料の位置に応じてプレートを配置し、センサの位置を選択した。機器は、次のようにパラメータを設定した：Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ～１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのステップを実行し、各ステップの実行時間は試料の結合と解離速度によって決められ、回転速度が４００ｒｐｍ、温度が３０℃であった。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを用いてＫＤ値を分析した。
上記測定法に記載の実験において、抗体の親和性は、表１に示される通りである。
上記試験において、抗体ＬＡ４９Ｇ９、ＬＡ６３Ｇ１２は、ヒトＶＥＧＦＣとの一価ＫＤ値がそれぞれ１．００Ｅ－０８Ｍおよび１．６４Ｅ－０８Ｍであり、親和性成熟の抗体Ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１およびＡｍ６３Ｇ２－５Ｇ８－１８Ｂ９は、結合親和性がさらに向上し、一価ＫＤ値がそれぞれ６．２１Ｅ－０９Ｍおよび５．７０Ｅ－０９Ｍであった。抗体ＬＡ４９Ｇ９、ＬＡ４９Ｇ９．２、ＬＡ６３Ｇ１２およびＬＡ６３Ｇ１２．１は、ヒトＶＥＧＦＣとの二価親和性のＫＤ値がそれぞれ６．１３Ｅ－１０Ｍ、６．４５Ｅ－１０Ｍ、６．５６Ｅ－１０Ｍおよび６．２２Ｅ－１０Ｍであった。
バイオレイヤー干渉測定技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、本発明の抗体のヒトＶＥＧＦＣに結合する平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性の測定は、従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ２７０～８）に従って行われた。
実験開始より３０ｍｉｎ前に、試料数に応じて、適切な数のＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）（試料検出用）またはＡＨＱ（Ｐａｌｌ、１５０２０５１）（陽性対照検出用）センサを取ってＳＤ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．０５％）に浸漬した。
１００μＬのＳＤ緩衝液、抗体および抗原（ヒトＶＥＧＦＣ（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））を取り、９６ウェルの黒色ポリスチレン製のハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５０７６）に加えた。試料の位置に応じてプレートを配置し、センサの位置を選択した。機器は、次のようにパラメータを設定した：Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ～１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのステップを実行し、各ステップの実行時間は試料の結合と解離速度によって決められ、回転速度が４００ｒｐｍ、温度が３０℃であった。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを用いてＫＤ値を分析した。
上記測定法に記載の実験において、抗体の親和性は、表１に示される通りである。
【表2】
【表3】
【0144】
実施例４．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体のＥＬＩＳＡ阻害実験
本発明の抗体によるｈＶＥＧＦＣと受容体ＫＤＲの結合への阻害作用を測定した。
ＳＡ（ストレプトアビジン、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに播いて４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、３％のＢＳＡを加えて１．５ｈブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ－ｂｉｏｔｉｎ（ビオチンで標識したヒトＶＥＧＦＣ）を加え、１．５ｈインキュベートした。予め抗体５０μＬおよびＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ（最終濃度０．２μｇ／ｍＬ、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ（最終濃度０．２μｇ／ｍＬ、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を２０ｍｉｎインキュベートしてから、プレートに加えた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｈｕｍａｎ ＦｃＨＲＰ抗体（１：１００００で希釈、ＢＥＴＨＹＬ）を加えて３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳＯＬＡＲＢＩＯ）により５ｍｉｎ発色させ、停止後、ＯＤ４５０ｎｍを読み取った。
本発明で得られた抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ抗体の阻害結果は、図１に示される通りである。候補分子ＬＡ４９Ｇ９、ＬＡ６３Ｇ１２とヒト化抗体ＬＡ６３Ｇ１２．１および親和性成熟分子Ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１とＡｍ６３Ｇ２－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体は、いずれもＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３との結合を阻害することができ、２つの親和性成熟分子は、陽性対照分子ＯＰＴ－３０２（ＶＥＧＦ－Ｃ－トラップ、配列番号５２）と基本的に相当の阻害ＩＣ５０値を有する。
本発明の抗体によるｈＶＥＧＦＣと受容体ＫＤＲの結合への阻害作用を測定した。
ＳＡ（ストレプトアビジン、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに播いて４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、３％のＢＳＡを加えて１．５ｈブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ－ｂｉｏｔｉｎ（ビオチンで標識したヒトＶＥＧＦＣ）を加え、１．５ｈインキュベートした。予め抗体５０μＬおよびＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ（最終濃度０．２μｇ／ｍＬ、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ（最終濃度０．２μｇ／ｍＬ、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を２０ｍｉｎインキュベートしてから、プレートに加えた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｈｕｍａｎ ＦｃＨＲＰ抗体（１：１００００で希釈、ＢＥＴＨＹＬ）を加えて３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳＯＬＡＲＢＩＯ）により５ｍｉｎ発色させ、停止後、ＯＤ４５０ｎｍを読み取った。
本発明で得られた抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ抗体の阻害結果は、図１に示される通りである。候補分子ＬＡ４９Ｇ９、ＬＡ６３Ｇ１２とヒト化抗体ＬＡ６３Ｇ１２．１および親和性成熟分子Ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１とＡｍ６３Ｇ２－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体は、いずれもＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３との結合を阻害することができ、２つの親和性成熟分子は、陽性対照分子ＯＰＴ－３０２（ＶＥＧＦ－Ｃ－トラップ、配列番号５２）と基本的に相当の阻害ＩＣ５０値を有する。
【0145】
実施例５．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣＶＨＨ抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒの活性化への阻害実験
ＶＥＧＦＣは、関連する受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を活性化し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走などの作用を誘導することができる。本研究は、ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験系を利用し、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ ＣＳ１８１４０１）を用いて、勾配希釈した抗体によるＶＥＧＦＣ活性化関連受容体シグナル伝達経路への阻害作用を検出した。
実験方法については、供給元による説明を参照した：
３日前に実験培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）に交換したＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞を取り出し、古い培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）で、細胞が丸くなって壁から離れるまで細胞を消化し、５ｍＬの希釈培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）で反応を停止させ、細胞を遠心分離管に吸い取り、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、培地を廃棄し、１０ｍＬの希釈培地を加えて細胞を再懸濁し、均一に混合した後に計数し、細胞生存率が９０％以上になるべきである。希釈培地で細胞密度を０．８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μＬ／ウェルで加えた。
２００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）と勾配希釈した被検抗体（本発明のＶＨＨ抗体、陽性対照分子（ＯＰＴ－３０２）および陰性対照抗体（ＩｇＧアイソタイプ対照抗体）を含む）の混合液を調製し、３０ｍｉｎ静置した後、細胞を含む９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて６ｈインキュベートした。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク（ｂｌａｎｋ）対照群と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えないＶＥＧＦ－Ｃ実験群とを同時に設けた。
６ｈインキュベートした９６ウェル白色細胞培養プレートを炭酸ガスのインキュベーターから取り出し、室温まで１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ平衡化した。予め取り出して室温まで平衡化したＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルで加え、室温で光を避けて５ｍｉｎインキュベートした。
多機能マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取り、プレート読み取りモードとして化学発光モードを選択し、プレート読み取りタイプとしてエンドポイント法を選択し、波長を全波長に設定し、列ごとに蛍光を収集し、各列の収集時間は１０００ｍｓであった。
結果は図２に示すように、ＬＡ６３Ｇ１２およびＬＡ４９Ｇ９は、ＶＥＧＦＣ誘導性のＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を完全に抑制することができる。
ＶＥＧＦＣは、関連する受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を活性化し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走などの作用を誘導することができる。本研究は、ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験系を利用し、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ ＣＳ１８１４０１）を用いて、勾配希釈した抗体によるＶＥＧＦＣ活性化関連受容体シグナル伝達経路への阻害作用を検出した。
実験方法については、供給元による説明を参照した：
３日前に実験培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）に交換したＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞を取り出し、古い培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）で、細胞が丸くなって壁から離れるまで細胞を消化し、５ｍＬの希釈培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）で反応を停止させ、細胞を遠心分離管に吸い取り、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、培地を廃棄し、１０ｍＬの希釈培地を加えて細胞を再懸濁し、均一に混合した後に計数し、細胞生存率が９０％以上になるべきである。希釈培地で細胞密度を０．８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μＬ／ウェルで加えた。
２００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）と勾配希釈した被検抗体（本発明のＶＨＨ抗体、陽性対照分子（ＯＰＴ－３０２）および陰性対照抗体（ＩｇＧアイソタイプ対照抗体）を含む）の混合液を調製し、３０ｍｉｎ静置した後、細胞を含む９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて６ｈインキュベートした。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク（ｂｌａｎｋ）対照群と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えないＶＥＧＦ－Ｃ実験群とを同時に設けた。
６ｈインキュベートした９６ウェル白色細胞培養プレートを炭酸ガスのインキュベーターから取り出し、室温まで１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ平衡化した。予め取り出して室温まで平衡化したＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルで加え、室温で光を避けて５ｍｉｎインキュベートした。
多機能マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取り、プレート読み取りモードとして化学発光モードを選択し、プレート読み取りタイプとしてエンドポイント法を選択し、波長を全波長に設定し、列ごとに蛍光を収集し、各列の収集時間は１０００ｍｓであった。
結果は図２に示すように、ＬＡ６３Ｇ１２およびＬＡ４９Ｇ９は、ＶＥＧＦＣ誘導性のＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を完全に抑制することができる。
【0146】
実施例６．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞増殖への抑制実験
本研究は、抗体および組換えヒトＶＥＧＦＣタンパク質を、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３）を過剰発現するＢａＦ３細胞（中国医学科学院基礎医学研究所）であるＢａＦ３－ＦＬＴ４と共インキュベートした。ＣＣＫ－８試薬キット（同仁化学）により生細胞数を検出することで、異なる抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖への抑制作用を反映した。
ＦＬＴ４遺伝子をもつレンチウイルスをＢａＦ３細胞に感染させて、ＦＬＴ４を過剰発現するＢａＦ３細胞であるＢａＦ３－ＦＬＴ４を得た。
ＣＣＫ－８試薬キットの取扱説明書に従って細胞増殖抑制試験を行った。１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を利用して実験培地を調製した。試験抗体（本発明のＶＨＨ抗体、陽性対照分子（ＯＰＴ－３０２）および陰性対照抗体（ＩｇＧアイソタイプ対照抗体）を含む）は、２０μｇ／ｍＬの最大最終濃度を有し、順に１：３で等倍希釈した。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えないＶＥＧＦ－Ｃ実験群とを同時に設けた。試験系において、ｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）は２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有し、ＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞は２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの最終濃度を有する。９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり系１００μＬを用いて、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで７２ｈインキュベートした。
その後、各ウェルに１５μＬのＣＣＫ－８を加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで４ｈインキュベートした。二重波長により吸光度値を測定し、検出波長は４５０ｎｍ、参照波長は６２０ｎｍであった。ＯＤ４５０～ＯＤ６２０値を測定した。
実験結果は、図３に示される通りである。本発明の抗体ＬＡ６３Ｇ１２およびＬＡ４９Ｇ９は、いずれもインビトロでｈＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４生存と増殖を効果的に抑制することができる。
本研究は、抗体および組換えヒトＶＥＧＦＣタンパク質を、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３）を過剰発現するＢａＦ３細胞（中国医学科学院基礎医学研究所）であるＢａＦ３－ＦＬＴ４と共インキュベートした。ＣＣＫ－８試薬キット（同仁化学）により生細胞数を検出することで、異なる抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖への抑制作用を反映した。
ＦＬＴ４遺伝子をもつレンチウイルスをＢａＦ３細胞に感染させて、ＦＬＴ４を過剰発現するＢａＦ３細胞であるＢａＦ３－ＦＬＴ４を得た。
ＣＣＫ－８試薬キットの取扱説明書に従って細胞増殖抑制試験を行った。１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を利用して実験培地を調製した。試験抗体（本発明のＶＨＨ抗体、陽性対照分子（ＯＰＴ－３０２）および陰性対照抗体（ＩｇＧアイソタイプ対照抗体）を含む）は、２０μｇ／ｍＬの最大最終濃度を有し、順に１：３で等倍希釈した。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えないＶＥＧＦ－Ｃ実験群とを同時に設けた。試験系において、ｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）は２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有し、ＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞は２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの最終濃度を有する。９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり系１００μＬを用いて、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで７２ｈインキュベートした。
その後、各ウェルに１５μＬのＣＣＫ－８を加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで４ｈインキュベートした。二重波長により吸光度値を測定し、検出波長は４５０ｎｍ、参照波長は６２０ｎｍであった。ＯＤ４５０～ＯＤ６２０値を測定した。
実験結果は、図３に示される通りである。本発明の抗体ＬＡ６３Ｇ１２およびＬＡ４９Ｇ９は、いずれもインビトロでｈＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４生存と増殖を効果的に抑制することができる。
【0147】
実施例７．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ抗体のヒト化と活性検出およびタンパク質の発現・精製
ＬＡ４９Ｇ９およびＬＡ６３Ｇ１２抗体は、下記のステップによりヒト化された：
（１） ＣＤＲループ構造を決定し、
（２） ヒト生殖細胞系列配列データベースにおいて各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つけ、
（３） 重鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングし、
（４） キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築し、
（５） 配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定し、
（６） 重要であると決定された配列位置で復帰変異を行い（入力アミノ酸タイプに戻す）、
（７） リスク部位のアミノ酸を最適化した。
ヒト化抗体ＬＡ４９Ｇ９．２およびＬＡ６３Ｇ１２．１を得て抗体の配列をシーケンシングした。
２９３細胞でのＶＨＨ単一ドメイン抗体またはＶＨＨ－Ｆｃ抗体のトランスフェクションおよび発現のために、抗ＶＥＧＦＣ抗体をコードする核酸を含むプラスミドを調製した。必要なトランスフェクション体積に応じて、ｅｘｐｉ－２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬであった。最終体積の１／１０のＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１３８３５－０１）をトランスフェクション緩衝液として使用し、適切なプラスミドを加えて、均一に混合した。適切なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）をプラスミドに加え（プラスミドとＰＥＩの割合は２９３Ｆ細胞で１：３である）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートして、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物で細胞を再懸濁した後、３６．５℃、８％のＣＯ２で、２４ｈインキュベートした後、トランスフェクション体積の２％のＦＥＥＤ（Ｓｉｇｍａ）を補充し、３６．５℃、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ２の条件下で培養した。６日目に連続培養し、または細胞活性≦６０％になると、細胞上清を収集して精製した。
精製前に、収集した培地を４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、細胞を廃棄した。次に上清を０．２２μＬのフィルタでろ過した。１０ｍＬの結合緩衝液（リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．０）でＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ５×５ｍＬ、ＧＥ、１１－００３４－９５）を平衡化した。ろ過後の上清を精製カラムに加えて結合緩衝液１５ｍＬで再平衡化した。溶離緩衝液５ｍＬ（クエン酸＋クエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ３．５）を加えて溶離液を収集し、溶離液１ｍＬあたりＴｒｉｓ－ＨＣｌ ８０μＬを加えた。収集した抗体を限外ろ過により濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換し、濃度を検出した。
実施例３～６に記載の方法に従って、ヒト化抗体の活性を測定した。結果は、それぞれ上記の表１と表２および図１、図４と図５に示されている。その結果から明らかなように、ヒト化抗体は、親抗体と相当の抗原ｈＶＥＧＦＣ結合活性およびＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３受容体阻害活性を有し、細胞ベースの試験においてＶＥＧＦＣ誘導性のＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害し（図４）、かつＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ３の結合により誘導されるＢａｆ３－ＦＬＴ４細胞の増殖を阻害した（図５）。
ＬＡ４９Ｇ９およびＬＡ６３Ｇ１２抗体は、下記のステップによりヒト化された：
（１） ＣＤＲループ構造を決定し、
（２） ヒト生殖細胞系列配列データベースにおいて各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つけ、
（３） 重鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングし、
（４） キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築し、
（５） 配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定し、
（６） 重要であると決定された配列位置で復帰変異を行い（入力アミノ酸タイプに戻す）、
（７） リスク部位のアミノ酸を最適化した。
ヒト化抗体ＬＡ４９Ｇ９．２およびＬＡ６３Ｇ１２．１を得て抗体の配列をシーケンシングした。
２９３細胞でのＶＨＨ単一ドメイン抗体またはＶＨＨ－Ｆｃ抗体のトランスフェクションおよび発現のために、抗ＶＥＧＦＣ抗体をコードする核酸を含むプラスミドを調製した。必要なトランスフェクション体積に応じて、ｅｘｐｉ－２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬであった。最終体積の１／１０のＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１３８３５－０１）をトランスフェクション緩衝液として使用し、適切なプラスミドを加えて、均一に混合した。適切なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）をプラスミドに加え（プラスミドとＰＥＩの割合は２９３Ｆ細胞で１：３である）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートして、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物で細胞を再懸濁した後、３６．５℃、８％のＣＯ２で、２４ｈインキュベートした後、トランスフェクション体積の２％のＦＥＥＤ（Ｓｉｇｍａ）を補充し、３６．５℃、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ２の条件下で培養した。６日目に連続培養し、または細胞活性≦６０％になると、細胞上清を収集して精製した。
精製前に、収集した培地を４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、細胞を廃棄した。次に上清を０．２２μＬのフィルタでろ過した。１０ｍＬの結合緩衝液（リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．０）でＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ５×５ｍＬ、ＧＥ、１１－００３４－９５）を平衡化した。ろ過後の上清を精製カラムに加えて結合緩衝液１５ｍＬで再平衡化した。溶離緩衝液５ｍＬ（クエン酸＋クエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ３．５）を加えて溶離液を収集し、溶離液１ｍＬあたりＴｒｉｓ－ＨＣｌ ８０μＬを加えた。収集した抗体を限外ろ過により濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換し、濃度を検出した。
実施例３～６に記載の方法に従って、ヒト化抗体の活性を測定した。結果は、それぞれ上記の表１と表２および図１、図４と図５に示されている。その結果から明らかなように、ヒト化抗体は、親抗体と相当の抗原ｈＶＥＧＦＣ結合活性およびＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３受容体阻害活性を有し、細胞ベースの試験においてＶＥＧＦＣ誘導性のＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害し（図４）、かつＶＥＧＦＣとＶＥＧＦＲ３の結合により誘導されるＢａｆ３－ＦＬＴ４細胞の増殖を阻害した（図５）。
【0148】
実施例８．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ ＶＨＨ親和性成熟
ＬＡ６３Ｇ１２．１ヒト化単一ドメイン抗体遺伝子をテンプレートとして選択し、抗原結合領域（ＣＤＲ）にアミノ酸ランダム変異を導入し、ＮＮＫ遺伝暗号を含む縮重プライマー（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）、およびフレームワーク領域特異性プライマーを設計・合成した。オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ）法により抗体変異体遺伝子ライブラリーを増幅した。実施例１と同じ方法でＰＣＲ断片とベクターの酵素切断を行い、連結し、ＴＧ１菌を形質転換し、組換えファージライブラリーを調製し、ファージパニングを３回行い、そして実施例２に従って原核タンパク質の発現を行い、ＥＬＩＳＡによりクローン結合活性の検出およびシーケンシング・分析を行った。最後に、親和性が明らかに向上した２つの変異体を選択し、クローン番号がａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１およびａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９であった。実施例７に従って真核ＶＨＨ単一ドメイン抗体の発現を行った。
親和性成熟ＶＨＨ検出方法は、実施例４、実施例５および実施例６に記載されたように行われた。結果は、それぞれ図１、図６、および図７に示されている。その結果から明らかなように、親和性成熟抗体は、親抗体に比べて抗ＶＥＧＦＣ生物学的活性がさらに向上した。
ＬＡ６３Ｇ１２．１ヒト化単一ドメイン抗体遺伝子をテンプレートとして選択し、抗原結合領域（ＣＤＲ）にアミノ酸ランダム変異を導入し、ＮＮＫ遺伝暗号を含む縮重プライマー（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）、およびフレームワーク領域特異性プライマーを設計・合成した。オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ）法により抗体変異体遺伝子ライブラリーを増幅した。実施例１と同じ方法でＰＣＲ断片とベクターの酵素切断を行い、連結し、ＴＧ１菌を形質転換し、組換えファージライブラリーを調製し、ファージパニングを３回行い、そして実施例２に従って原核タンパク質の発現を行い、ＥＬＩＳＡによりクローン結合活性の検出およびシーケンシング・分析を行った。最後に、親和性が明らかに向上した２つの変異体を選択し、クローン番号がａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１およびａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９であった。実施例７に従って真核ＶＨＨ単一ドメイン抗体の発現を行った。
親和性成熟ＶＨＨ検出方法は、実施例４、実施例５および実施例６に記載されたように行われた。結果は、それぞれ図１、図６、および図７に示されている。その結果から明らかなように、親和性成熟抗体は、親抗体に比べて抗ＶＥＧＦＣ生物学的活性がさらに向上した。
【0149】
実施例９．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体の構築
ＬＡ６３Ｇ１２、ＬＡ６３Ｇ１２．１、ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１およびａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９により抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体を構築し、実施例７に従って２９３細胞において真核タンパク質を発現した。簡単に言えば、
ＶＨＨ単一ドメイン抗体をリンカーによりＶＥＧＦ－トラップ（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ、Ｅｙｌｅａ、アフリベルセプト）のＦｃ領域Ｃ末端に連結して、図１８Ａに示される第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体を構築した。ＶＥＧＦ－トラップは、ヒトＶＥＧＦ受容体１と２由来のＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン部分（配列番号２６）がＣ末端でヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号２７）と融合してなる組換え融合タンパク質（配列番号２５）であり、二量体の形態で、高親和性ＶＥＧＦ＿Ａ結合を提供するとともに、ＶＥＧＦ＿Ａ誘導性のＶＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化を阻害する。
ＶＨＨ単一ドメイン抗体をリンカーにより抗ＶＥＧＦ＿Ａ抗体Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）のＦａｂ部分のＣ末端に連結して、図１８Ｂに示される第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体を構築した。Ｌｕｃｅｎｔｉｓは組換えヒト化ＩｇＧ１ ｋａｐｐａアイソタイプモノクローナル抗体であり、ここで、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド鎖は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ－ＣＬポリペプチド鎖とペアリングしてＦａｂを形成し、ヒトＶＥＧＦ－Ａに結合するとともに、その生物学的活性を抑制する。
以下の表３は、構築された二重特異性抗体およびその組成の一覧である。
ＬＡ６３Ｇ１２、ＬＡ６３Ｇ１２．１、ａｍ６３Ｇ１２－１４Ｂ１１およびａｍ６３Ｇ１２－５Ｇ８－１８Ｂ９により抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体を構築し、実施例７に従って２９３細胞において真核タンパク質を発現した。簡単に言えば、
ＶＨＨ単一ドメイン抗体をリンカーによりＶＥＧＦ－トラップ（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ、Ｅｙｌｅａ、アフリベルセプト）のＦｃ領域Ｃ末端に連結して、図１８Ａに示される第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体を構築した。ＶＥＧＦ－トラップは、ヒトＶＥＧＦ受容体１と２由来のＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン部分（配列番号２６）がＣ末端でヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号２７）と融合してなる組換え融合タンパク質（配列番号２５）であり、二量体の形態で、高親和性ＶＥＧＦ＿Ａ結合を提供するとともに、ＶＥＧＦ＿Ａ誘導性のＶＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化を阻害する。
ＶＨＨ単一ドメイン抗体をリンカーにより抗ＶＥＧＦ＿Ａ抗体Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）のＦａｂ部分のＣ末端に連結して、図１８Ｂに示される第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体を構築した。Ｌｕｃｅｎｔｉｓは組換えヒト化ＩｇＧ１ ｋａｐｐａアイソタイプモノクローナル抗体であり、ここで、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド鎖は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ－ＣＬポリペプチド鎖とペアリングしてＦａｂを形成し、ヒトＶＥＧＦ－Ａに結合するとともに、その生物学的活性を抑制する。
以下の表３は、構築された二重特異性抗体およびその組成の一覧である。
【表4】
【0150】
実施例１０．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＶＥＧＦＡまたはＣ誘導性のＨＥＫ２９３ ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒの活性化への阻害実験
ＶＥＧＦＡまたはＶＥＧＦＣは、関連する受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を活性化し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走などの作用を誘導することができる。本研究は、ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験系を利用し、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ ＣＳ１８１４０１）を用いて、勾配希釈した抗体によるＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣ活性化関連受容体シグナル伝達経路への阻害作用を検出した。実験方法は、基本的に実施例５に記載されたように行われた。簡単に言えば、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（０．８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を含む９６ウェル白色細胞培養プレートを用意した。１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＡ（Ｒ＆Ｄ）または２００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）と勾配希釈した被検抗体の混合液を調製し、３０ｍｉｎ静置した。５０μＬ／ウェルの混合液を、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞を含む９６ウェル白色細胞培養プレートに加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて６ｈインキュベートした。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えない実験群と、ＶＥＧＦＣおよびＩｇＧアイソタイプ対照抗体を加える実験群とを同時に設けた。比較として、抗ＶＥＧＦＡ分子ＩＢＩ３０４（配列番号５３）と二重特異性抗体Ｆａｒｉｃｉｍａｂ（抗Ａｎｇ－２／抗ＶＥＧＦ－Ａ）のＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達経路への阻害活性、および抗ＶＥＧＦ－Ｃ分子ＯＰＴ－３０２のＶＥＧＦ－Ｃシグナル伝達経路への阻害活性も検出した。
６ｈインキュベートした９６ウェル白色細胞培養プレートを炭酸ガスのインキュベーターから取り出し、室温まで１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ平衡化した。予め取り出して室温まで平衡化したＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルで加え、室温で光を避けて５ｍｉｎインキュベートした。
多機能マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取り、プレート読み取りモードとして化学発光モードを選択し、プレート読み取りタイプとしてエンドポイント法を選択し、波長を全波長に設定し、列ごとに蛍光を収集し、各列の収集時間は１０００ｍｓであった。
検出結果は、図８および図９に示されている。試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡおよびａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、いずれもＶＥＧＦＡ（図８）またはＶＥＧＦＣ（図９）誘導性のＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を阻害することができる。
ＶＥＧＦＡまたはＶＥＧＦＣは、関連する受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を活性化し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走などの作用を誘導することができる。本研究は、ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験系を利用し、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ ＣＳ１８１４０１）を用いて、勾配希釈した抗体によるＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣ活性化関連受容体シグナル伝達経路への阻害作用を検出した。実験方法は、基本的に実施例５に記載されたように行われた。簡単に言えば、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（０．８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を含む９６ウェル白色細胞培養プレートを用意した。１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＡ（Ｒ＆Ｄ）または２００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）と勾配希釈した被検抗体の混合液を調製し、３０ｍｉｎ静置した。５０μＬ／ウェルの混合液を、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞を含む９６ウェル白色細胞培養プレートに加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて６ｈインキュベートした。いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えない実験群と、ＶＥＧＦＣおよびＩｇＧアイソタイプ対照抗体を加える実験群とを同時に設けた。比較として、抗ＶＥＧＦＡ分子ＩＢＩ３０４（配列番号５３）と二重特異性抗体Ｆａｒｉｃｉｍａｂ（抗Ａｎｇ－２／抗ＶＥＧＦ－Ａ）のＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達経路への阻害活性、および抗ＶＥＧＦ－Ｃ分子ＯＰＴ－３０２のＶＥＧＦ－Ｃシグナル伝達経路への阻害活性も検出した。
６ｈインキュベートした９６ウェル白色細胞培養プレートを炭酸ガスのインキュベーターから取り出し、室温まで１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ平衡化した。予め取り出して室温まで平衡化したＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに１００μＬ／ウェルで加え、室温で光を避けて５ｍｉｎインキュベートした。
多機能マイクロプレートリーダーにより蛍光値を読み取り、プレート読み取りモードとして化学発光モードを選択し、プレート読み取りタイプとしてエンドポイント法を選択し、波長を全波長に設定し、列ごとに蛍光を収集し、各列の収集時間は１０００ｍｓであった。
検出結果は、図８および図９に示されている。試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡおよびａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、いずれもＶＥＧＦＡ（図８）またはＶＥＧＦＣ（図９）誘導性のＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を阻害することができる。
【0151】
実施例１１．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖への抑制実験
本発明に記載の二重特異性抗体をＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖実験系に使用して、抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖への影響を検出した。実験方法は、基本的に実施例６に記載されたように行われた。
１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を利用して実験培地を調製した。試験抗体は、１０ｎＭの最大最終濃度を有し、順に１：３で等倍希釈した。試験系において、ｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）は２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有し、ＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞は２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの最終濃度を有する。
測定において、いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えない実験群と、ＶＥＧＦＣおよびＩｇＧアイソタイプ対照抗体を加える実験群とを設けた。同時に、比較として、抗ＶＥＧＦ－Ｃ分子ＯＰＴ－３０２によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞増殖への抑制活性も検出した。
検出結果は図１０に示すように、試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、いずれもＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞増殖を抑制することができる。
本発明に記載の二重特異性抗体をＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖実験系に使用して、抗体によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４増殖への影響を検出した。実験方法は、基本的に実施例６に記載されたように行われた。
１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を利用して実験培地を調製した。試験抗体は、１０ｎＭの最大最終濃度を有し、順に１：３で等倍希釈した。試験系において、ｈＶＥＧＦＣ（Ｒ＆Ｄ）は２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有し、ＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞は２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの最終濃度を有する。
測定において、いずれの抗体やＶＥＧＦＣも加えないブランク対照群（ｂｌａｎｋ）と、ＶＥＧＦＣのみを加えるがいずれの抗体も加えない実験群と、ＶＥＧＦＣおよびＩｇＧアイソタイプ対照抗体を加える実験群とを設けた。同時に、比較として、抗ＶＥＧＦ－Ｃ分子ＯＰＴ－３０２によるＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞増殖への抑制活性も検出した。
検出結果は図１０に示すように、試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、いずれもＶＥＧＦＣ誘導性のＢａＦ３－ＦＬＴ４細胞増殖を抑制することができる。
【0152】
実施例１２．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ誘導性のＨＵＶＥＣ増殖への抑制実験
ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣは、血管内皮細胞中のＶＥＧＦＲなどの関連受容体に作用し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走を促進し、さらに血管新生を誘導することができ、本実験は、ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣを併用してヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存と増殖を誘導し、抗体によるＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣ誘導性の初代細胞の生存と増殖への抑制作用を検出した。本実施例は、ＣＣＫ－８によりＨＵＶＥＣの生存と増殖を測定し、具体的な方法としては、１日前に細胞を処理し、２０００ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェル培養プレートに播き、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて２４ｈインキュベートした。細胞が壁に付着した後、５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＡと５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＣおよび／または勾配希釈した抗体を含むかもしくは含まない実験培地（ＤＭＥＭ培地）を調製し、９６ウェルプレート中の内皮細胞培地を置換し、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて７２ｈインキュベートした。実験では、次のように群分けした：
Ｂｌａｎｋ群：ＤＭＥＭ培地
ＶＥＧＦＡ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ
ＶＥＧＦＣ群：ＤＭＥＭ培地＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＩｇＧ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋アイソタイプ対照ＩｇＧ
ＩＢＩ３０４＋ＯＰＴ－３０２群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋ＩＢＩ３０４＋ＯＰＴ－３０２（ＩＢＩ３０４とＯＰＴ－３０２が１：１のモル濃度比で配合）、
二重特異性抗体群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋被検二重特異性抗体。
細胞を実験培地でインキュベートした後、ＣＣＫ－８検出液（同仁化学）を１０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて１２ｈ～２４ｈインキュベートした。多機能マイクロプレートリーダーにより吸光度ＯＤ４５０～ＯＤ６２０の値を読み取った。
上記測定法に記載の実験において、検出結果は、図１１に示される通りである。試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡおよびａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ誘導性のＨＵＶＥＣ細胞の増殖および生存を完全に抑制することができる。
ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣは、血管内皮細胞中のＶＥＧＦＲなどの関連受容体に作用し、血管内皮細胞の生存、増殖および遊走を促進し、さらに血管新生を誘導することができ、本実験は、ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣを併用してヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存と増殖を誘導し、抗体によるＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＣ誘導性の初代細胞の生存と増殖への抑制作用を検出した。本実施例は、ＣＣＫ－８によりＨＵＶＥＣの生存と増殖を測定し、具体的な方法としては、１日前に細胞を処理し、２０００ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェル培養プレートに播き、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて２４ｈインキュベートした。細胞が壁に付着した後、５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＡと５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＣおよび／または勾配希釈した抗体を含むかもしくは含まない実験培地（ＤＭＥＭ培地）を調製し、９６ウェルプレート中の内皮細胞培地を置換し、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて７２ｈインキュベートした。実験では、次のように群分けした：
Ｂｌａｎｋ群：ＤＭＥＭ培地
ＶＥＧＦＡ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ
ＶＥＧＦＣ群：ＤＭＥＭ培地＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＩｇＧ群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋アイソタイプ対照ＩｇＧ
ＩＢＩ３０４＋ＯＰＴ－３０２群：ＤＭＥＭ培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋ＩＢＩ３０４＋ＯＰＴ－３０２（ＩＢＩ３０４とＯＰＴ－３０２が１：１のモル濃度比で配合）、
二重特異性抗体群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋被検二重特異性抗体。
細胞を実験培地でインキュベートした後、ＣＣＫ－８検出液（同仁化学）を１０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて１２ｈ～２４ｈインキュベートした。多機能マイクロプレートリーダーにより吸光度ＯＤ４５０～ＯＤ６２０の値を読み取った。
上記測定法に記載の実験において、検出結果は、図１１に示される通りである。試験されたａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡおよびａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ誘導性のＨＵＶＥＣ細胞の増殖および生存を完全に抑制することができる。
【0153】
実施例１３．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ誘導性のＨＵＶＥＣ管腔形成への抑制実験
ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣは、血管内皮細胞に作用して、血管内皮細胞の管腔様構造の形成を促進し、さらに血管新生構造の形成を誘導することができる。本実験は、ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣを用いてヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成を誘導し、抗体によるＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣ誘導性の初代細胞管腔形成への抑制作用を検出した。
本実施例は、ＨＵＶＥＣの管腔実験によりａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＨＵＶＥＣ管腔形成への抑制を検出し、具体的な方法としては、１日前にｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）を氷上に置いて融解させ、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターに入れて３０ｍｉｎ硬化させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞を処理し、２００００ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェル培養プレートに播き、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて２４ｈインキュベートした。１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＡと５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＶＥＧＦＣおよび／または勾配希釈した抗体を含むかもしくは含まない実験培地（ＥＧＭ２）を調製した。異なる実験培地でＨＵＶＥＣ細胞を再懸濁し、２００００ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェル培養プレートに播き、３７℃、５％炭酸ガスのインキュベーターに入れて２４ｈインキュベートした。実験では、次のように群分けした：
Ｂｌａｎｋ群：ＥＧＭ－２培地
ＶＥＧＦＡ群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ
ＶＥＧＦＣ群：ＥＧＭ－２培地＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ
ＩｇＧ群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋２０ｎＭのアイソタイプ対照ＩｇＧ
ＩＢＩ３０４＋ＯＰＴ－３０２群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋２０ｎＭのＩＢＩ３０４＋２０ｎＭのＯＰＴ－３０２
ＩＥＸ０４－０５６群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋２０ｎＭのＩＥＸ０４－０５６
ＩＥＸ０４－０６７群：ＥＧＭ－２培地＋５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＣ＋２０ｎＭのＩＥＸ０４－０６７。
顕微鏡による撮影画像から管腔数を算出した。検出結果は、図１２に示される通りである。図１２Ａは管腔形成画像を示し、図１２Ｂは管腔形成の統計結果を示す。ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡおよびａｎｔｉ－ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体は、ＶＥＧＦＡ＋ＶＥＧＦＣ誘導性のＨＵＶＥＣ細胞管腔形成を完全に抑制することができる。
【0154】
実施例１４．ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体によるＡ３７５腫瘍血管新生への抑制実験
腫瘍細胞でのＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣの過剰発現は、インビボで血管新生の形成を誘導し、腫瘍の増殖を促進することができる。
本実施例は、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞を３×１０６ｃｅｌｌで各マウスに接種することにより、ｎｕｄｅマウスにおいて本発明の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ抗体の抗血管新生と抗腫瘍作用を測定した。
ヒトｎｕｄｅマウス：
雌のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのｎｕｄｅマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、等級がＳＰＦグレードである。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間飼育して順応させた。
細胞：
ヒトＡ３７５細胞はＡＴＣＣ（ＣＡＴ＃：ＣＲＬ－１６１９）から購入され、取扱説明書に厳密に従って後続きのインビボ実験のために通常の継代培養が行われた。遠心分離して細胞を収集し、滅菌ＰＢＳにおいて細胞を再懸濁して細胞密度を１．５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液をマウスの脇の下に皮下接種してＡ３７５腫瘍担持マウスモデルを確立した。
投与：
マウスをランダムに群分けした（マウス６匹／群）。腫瘍細胞接種の７日および２１日後、各マウスの腫瘍体積を検出した。投与量および方式は表４に示される通りであり、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を陰性対照として、それぞれ接種後の１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目、１７日目、１９日目に投与し、マウスの腫瘍体積および体重を週２回モニターした。毎回投与する前に体重および腫瘍体積を測定し、接種後の２１日目に相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）である。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積をＶ＝Ｌ×Ｗ２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。
腫瘍抑制率の結果は、図１３Ａと１３Ｂおよび表５に示すように、接種後の２１日目に、ＩＥＸ０４－０５６単剤は、異なる投与量のいずれでも腫瘍抑制効果を示した。接種後の２１日目に１ｍｇ／ｋｇの腫瘍抑制率は５４％、５ｍｇ／ｋｇの腫瘍抑制率はそれぞれ７１％、２５ｍｇ／ｋｇの腫瘍抑制率はそれぞれ７４％であった。従って、本発明のＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣに対する二重特異性結合分子は、腫瘍に明らかな抑制効果を有する。
接種後の７日目および２１日目の腫瘍組織に対して切片およびＣＤ３１（血管内皮マーカー）染色を行ったところ、腫瘍組織における微小血管新生を示した。ＯＣＴ包埋剤で包埋された蝋の塊を凍結ミクロトームにセットし、６μｍの厚さを有する切片に切った。
１. 室温で３０ｍｉｎ放置した後、予冷したアセトンにより４℃で固定し、室温で乾燥させた。
２. ＰＢＳＴにより５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ（ＰＢＳＴ：１ＸＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、
３. パップペンにより円で囲んだ後、１０％のヤギ血清（ＰＢＳＴで希釈）でブロッキングし、各組織に１００μＬ滴下し、室温でブロッキングし、
４. １００μＬの一次抗体ＰＥ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３１を直接滴下して４℃で一晩インキュベートし、
５. 翌日、ＰＢＳＴにより５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ、
６. ＤＡＰＩで細胞核を染色し、各組織に１００μＬ滴下し、光を避けて５ｍｉｎインキュベートし、
７. ＤＡＰＩ染色液を廃棄し、ＰＢＳＴで５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ、
蛍光褪色防止用封入剤（ｐｒｏｌｏｎｇ ｄｉａｍｏｎｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により封入した。その後、全自動定量分析スキャナーで走査した。結果は図１３Ｃに示すように、ＩＥＸ０４－０５６により治療された後、Ａ３７５腫瘍の血管新生は顕著に減少された。
腫瘍細胞でのＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＣの過剰発現は、インビボで血管新生の形成を誘導し、腫瘍の増殖を促進することができる。
本実施例は、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞を３×１０６ｃｅｌｌで各マウスに接種することにより、ｎｕｄｅマウスにおいて本発明の抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ抗体の抗血管新生と抗腫瘍作用を測定した。
ヒトｎｕｄｅマウス：
雌のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのｎｕｄｅマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、等級がＳＰＦグレードである。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間飼育して順応させた。
細胞：
ヒトＡ３７５細胞はＡＴＣＣ（ＣＡＴ＃：ＣＲＬ－１６１９）から購入され、取扱説明書に厳密に従って後続きのインビボ実験のために通常の継代培養が行われた。遠心分離して細胞を収集し、滅菌ＰＢＳにおいて細胞を再懸濁して細胞密度を１．５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液をマウスの脇の下に皮下接種してＡ３７５腫瘍担持マウスモデルを確立した。
投与：
マウスをランダムに群分けした（マウス６匹／群）。腫瘍細胞接種の７日および２１日後、各マウスの腫瘍体積を検出した。投与量および方式は表４に示される通りであり、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）を陰性対照として、それぞれ接種後の１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目、１７日目、１９日目に投与し、マウスの腫瘍体積および体重を週２回モニターした。毎回投与する前に体重および腫瘍体積を測定し、接種後の２１日目に相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）である。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積をＶ＝Ｌ×Ｗ２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。
【表5】
【表6】
１. 室温で３０ｍｉｎ放置した後、予冷したアセトンにより４℃で固定し、室温で乾燥させた。
２. ＰＢＳＴにより５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ（ＰＢＳＴ：１ＸＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、
３. パップペンにより円で囲んだ後、１０％のヤギ血清（ＰＢＳＴで希釈）でブロッキングし、各組織に１００μＬ滴下し、室温でブロッキングし、
４. １００μＬの一次抗体ＰＥ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３１を直接滴下して４℃で一晩インキュベートし、
５. 翌日、ＰＢＳＴにより５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ、
６. ＤＡＰＩで細胞核を染色し、各組織に１００μＬ滴下し、光を避けて５ｍｉｎインキュベートし、
７. ＤＡＰＩ染色液を廃棄し、ＰＢＳＴで５ｍｉｎ／回で３回浸してすすぎ、
蛍光褪色防止用封入剤（ｐｒｏｌｏｎｇ ｄｉａｍｏｎｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により封入した。その後、全自動定量分析スキャナーで走査した。結果は図１３Ｃに示すように、ＩＥＸ０４－０５６により治療された後、Ａ３７５腫瘍の血管新生は顕著に減少された。
【0155】
実施例１５．レーザー誘導性の脈絡膜血管新生の薬効試験
本実験は、カニクイザルのレーザー誘導性の脈絡膜血管新生モデルを利用し、本発明のａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体の抗血管新生作用を測定した。
種属：カニクイザル、等級：普通グレード、年齢：２．５歳～５歳、体重：２．４５ｋｇ～５．５５ｋｇ、平均４．０２ｋｇ、モデリング時の体重：３．３５ｋｇ～４．３５ｋｇ。
本試験は、レーザーを用いてカニクイザルの眼底黄斑の中心窩周辺に光凝固術を行い、眼底の脈絡膜血管新生を誘導して、ヒト脈絡膜血管新生に類似する動物モデルを確立した。光凝固前および光凝固後の２０日目にフルオレセイン眼底血管造影を行い、モデリングの状況を判定した。モデリングに成功したカニクイザル１６匹（雌雄半々）を選択して４群に分け、それぞれモデル対照群、ＩＥＸ０４－０５６群、ＩＥＸ０４－０６７群、Ｅｙｌｅａ＋ＯＰＴ－３０２群であり、１群４匹ずつとした。光凝固後の２１日目に、それぞれ下記の表６中の用量に従って投与し、両眼の硝子体にＩＥＸ０４－０５６、ＩＥＸ０４－０６７またはＥｙｌｅａ＋ＯＰＴ－３０２を注射投与し、モデル対照群には同体積の０．９％の塩化ナトリウム注射液を投与した。各群の動物は、それぞれ投与後の７日、１４日、２１日と２８日目に眼底カラー写真撮影、フルオレセイン眼底血管造影および光干渉断層撮影を行い、試験品による脈絡膜血管新生への抑制状況を観察した。投与後の２９日目に安楽死させた後、両眼を取ってＨＥ染色による組織学的検査を行った。
眼底カラー写真撮影および蛍光造影検査
評価指標：
（１）蛍光スポットの等級付け
モデリング後の蛍光造影によって撮影されたスポットのグレード等級付け基準：
グレード１：スポットに強い蛍光が出ていない；
グレード２：スポットに強い蛍光があるが、フルオレセインの漏出がない；
グレード３：スポットに強い蛍光があり、フルオレセインが軽度に漏出され、漏出がスポットの縁を超えていない；
グレード４：スポットに強い蛍光があり、フルオレセインが顕著に漏出され、漏出がスポットの縁を超えている；
グレード１～４のスポットを統計し、検査するたびに眼底レーザースポットの等級を記録しなければならない。
（２）フルオレセイン漏出面積改善率（％）
フルオレセイン漏出面積改善率（％）＝（投与前フルオレセイン漏出面積－投与後フルオレセイン漏出面積）／投与前フルオレセイン漏出面積×１００％
（３）フルオレセイン漏出面積減少量
フルオレセイン漏出面積減少量＝投与前フルオレセイン漏出面積－投与後フルオレセイン漏出面積
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
評価指標：
（１）眼底網膜肥厚改善率
眼底網膜肥厚改善率（％）＝投与前網膜厚－投与後網膜厚×１００
投与前網膜厚－モデリング前網膜厚
（２）眼底網膜厚減少量
眼底網膜厚減少量＝投与前網膜厚－投与後網膜厚
眼底カラー写真撮影および蛍光造影検査の結果は図１４～図１５に示される通りであり、その結果から明らかなように、本発明の抗体は投与の２８日後に、顕著な抗血管新生作用を示したことで、本発明の抗体がレーザー誘導性の眼底血管新生に明らかな抑制効果を有する（Ｐ＜０．００１）とともに、血管完全性を保護する機能を有することが証明された。ＯＣＴの結果は図１６に示される通りであり、その結果から明らかなように、本発明の抗体は、投与後の１４日～２８日に網膜肥厚を顕著に抑制したこと（Ｐ＜０．０５）で、本発明の抗体が血管新生による網膜の浮腫と肥厚を抑制する機能を有することが証明された。
組織病理学的検査
カニクイザルへの投与の２９日後に、体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し（約３０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、動物の体調によって用量が調整できる）、腹部大動脈または大腿動脈から瀉血して安楽死させ、大局観察を行い、両側の眼球を摘出した。
一部の動物の両眼を、改良したＤａｖｉｄｓｏｎ’ｓ固定液で固定し、パラフィンで包埋して切片にして、レーザーモデリング領域を選択して通常のＨＥ染色などの組織病理学的検査を行った。
本発明の抗体は、病理切片において、抗ＶＥＧＦＡ分子Ｅｙｌｅａと抗ＶＥＧＦＣ分子ＯＰＴ－０３２の併用に比べて、レーザー傷害部位の浮腫、過形成、線維症などの病理変化をより良く改善することができ、より良好な網膜の形態学的改善を示した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
本実験は、カニクイザルのレーザー誘導性の脈絡膜血管新生モデルを利用し、本発明のａｎｔｉ－ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ二重特異性抗体の抗血管新生作用を測定した。
種属：カニクイザル、等級：普通グレード、年齢：２．５歳～５歳、体重：２．４５ｋｇ～５．５５ｋｇ、平均４．０２ｋｇ、モデリング時の体重：３．３５ｋｇ～４．３５ｋｇ。
本試験は、レーザーを用いてカニクイザルの眼底黄斑の中心窩周辺に光凝固術を行い、眼底の脈絡膜血管新生を誘導して、ヒト脈絡膜血管新生に類似する動物モデルを確立した。光凝固前および光凝固後の２０日目にフルオレセイン眼底血管造影を行い、モデリングの状況を判定した。モデリングに成功したカニクイザル１６匹（雌雄半々）を選択して４群に分け、それぞれモデル対照群、ＩＥＸ０４－０５６群、ＩＥＸ０４－０６７群、Ｅｙｌｅａ＋ＯＰＴ－３０２群であり、１群４匹ずつとした。光凝固後の２１日目に、それぞれ下記の表６中の用量に従って投与し、両眼の硝子体にＩＥＸ０４－０５６、ＩＥＸ０４－０６７またはＥｙｌｅａ＋ＯＰＴ－３０２を注射投与し、モデル対照群には同体積の０．９％の塩化ナトリウム注射液を投与した。各群の動物は、それぞれ投与後の７日、１４日、２１日と２８日目に眼底カラー写真撮影、フルオレセイン眼底血管造影および光干渉断層撮影を行い、試験品による脈絡膜血管新生への抑制状況を観察した。投与後の２９日目に安楽死させた後、両眼を取ってＨＥ染色による組織学的検査を行った。
【表7】
評価指標：
（１）蛍光スポットの等級付け
モデリング後の蛍光造影によって撮影されたスポットのグレード等級付け基準：
グレード１：スポットに強い蛍光が出ていない；
グレード２：スポットに強い蛍光があるが、フルオレセインの漏出がない；
グレード３：スポットに強い蛍光があり、フルオレセインが軽度に漏出され、漏出がスポットの縁を超えていない；
グレード４：スポットに強い蛍光があり、フルオレセインが顕著に漏出され、漏出がスポットの縁を超えている；
グレード１～４のスポットを統計し、検査するたびに眼底レーザースポットの等級を記録しなければならない。
（２）フルオレセイン漏出面積改善率（％）
フルオレセイン漏出面積改善率（％）＝（投与前フルオレセイン漏出面積－投与後フルオレセイン漏出面積）／投与前フルオレセイン漏出面積×１００％
（３）フルオレセイン漏出面積減少量
フルオレセイン漏出面積減少量＝投与前フルオレセイン漏出面積－投与後フルオレセイン漏出面積
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
評価指標：
（１）眼底網膜肥厚改善率
眼底網膜肥厚改善率（％）＝投与前網膜厚－投与後網膜厚×１００
投与前網膜厚－モデリング前網膜厚
（２）眼底網膜厚減少量
眼底網膜厚減少量＝投与前網膜厚－投与後網膜厚
眼底カラー写真撮影および蛍光造影検査の結果は図１４～図１５に示される通りであり、その結果から明らかなように、本発明の抗体は投与の２８日後に、顕著な抗血管新生作用を示したことで、本発明の抗体がレーザー誘導性の眼底血管新生に明らかな抑制効果を有する（Ｐ＜０．００１）とともに、血管完全性を保護する機能を有することが証明された。ＯＣＴの結果は図１６に示される通りであり、その結果から明らかなように、本発明の抗体は、投与後の１４日～２８日に網膜肥厚を顕著に抑制したこと（Ｐ＜０．０５）で、本発明の抗体が血管新生による網膜の浮腫と肥厚を抑制する機能を有することが証明された。
組織病理学的検査
カニクイザルへの投与の２９日後に、体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し（約３０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、動物の体調によって用量が調整できる）、腹部大動脈または大腿動脈から瀉血して安楽死させ、大局観察を行い、両側の眼球を摘出した。
一部の動物の両眼を、改良したＤａｖｉｄｓｏｎ’ｓ固定液で固定し、パラフィンで包埋して切片にして、レーザーモデリング領域を選択して通常のＨＥ染色などの組織病理学的検査を行った。
本発明の抗体は、病理切片において、抗ＶＥＧＦＡ分子Ｅｙｌｅａと抗ＶＥＧＦＣ分子ＯＰＴ－０３２の併用に比べて、レーザー傷害部位の浮腫、過形成、線維症などの病理変化をより良く改善することができ、より良好な網膜の形態学的改善を示した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
【0156】
配列表
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１
ＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ２配列 配列番号２
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ３配列 配列番号３
ＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＶＨＨ配列 配列番号４
ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ１配列 配列番号５
ＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ２配列 配列番号６
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ３配列 配列番号７
ＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＶＨＨ配列 配列番号８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ１配列 配列番号９
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ２配列 配列番号１０
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ３配列 配列番号１１
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＶＨＨ配列 配列番号１２
ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１３
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ２配列 配列番号１４
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ３配列 配列番号１５
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＶＨＨ配列 配列番号１６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１７
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１８
ＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１９
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＶＨＨ配列 配列番号２０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ１配列 配列番号２１
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ２配列 配列番号２２
ＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ３配列 配列番号２３
ＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＶＨＨ配列 配列番号２４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ全配列 配列番号２５
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Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン：配列番号２６
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫ
ＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域：配列番号２７
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ラニビズマブＦａｂ ＶＨ－ＣＨ１：配列番号２８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ
ラニビズマブＦａｂ ＶＨ：配列番号２９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ラニビズマブＦａｂ ＣＨ１：配列番号３０
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ラニビズマブＦａｂ ＶＬ－ＣＬ：配列番号３１
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ラニビズマブＦａｂ ＶＬ：配列番号３２
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ラニビズマブＦａｂ ＣＬ：配列番号３３
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ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ１配列番号３４
ＧＹＤＦＴＨＹ
ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ２配列番号３５
ＮＴＹＴＧＥ
ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ３配列番号３６
ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ１配列番号３７
ＱＤＩＳＮＹＬＮ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ２配列番号３８
ＦＴＳＳＬＨＳ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ３配列番号３９
ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ
ＩＥＸ０４－０２６ 配列番号４０
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ＩＥＸ０４－０３７ 配列番号４１
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０３９ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号４２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０３９ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号４３
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０４１ 配列番号４４
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０４２ 配列番号４５
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０４６ 配列番号４６
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０５６ 配列番号４７
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ＩＥＸ０４－０６７ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号４８
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ＩＥＸ０４－０６７ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号４９
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０６９ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号５０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０６９ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号５１
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
陽性対照抗体 抗ＶＥＧＦ－Ｃ（ＶＥＧＦＲ３－トラップ分子）ＯＰＴ－３０２配列番号５２
ＹＳＭＴＰＰＴＬＮＩＴＥＥＳＨＶＩＤＴＧＤＳＬＳＩＳＣＲＧＱＨＰＬＥＷＡＷＰＧＡＱＥＡＰＡＴＧＤＫＤＳＥＤＴＧＶＶＲＤＣＥＧＴＤＡＲＰＹＣＫＶＬＬＬＨＥＶＨＡＱＤＴＧＳＹＶＣＹＹＫＹＩＫＡＲＩＥＧＴＴＡＡＳＳＹＶＦＶＲＤＦＥＱＰＦＩＮＫＰＤＴＬＬＶＮＲＫＤＡＭＷＶＰＣＬＶＳＩＰＧＬＮＶＴＬＲＳＱＳＳＶＬＷＰＤＧＱＥＶＶＷＤＤＲＲＧＭＬＶＳＴＰＬＬＨＤＡＬＹＬＱＣＥＴＴＷＧＤＱＤＦＬＳＮＰＦＬＶＨＩＴＧＮＥＬＹＤＩＱＬＬＰＲＫＳＬＥＬＬＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＶＷＡＥＦＮＳＧＶＴＦＤＷＤＹＰＧＫＱＡＥＲＧＫＷＶＰＥＲＲＳＱＱＴＨＴＥＬＳＳＩＬＴＩＨＮＶＳＱＨＤＬＧＳＹＶＣＫＡＮＮＧＩＱＲＦＲＥＳＴＥＶＩＶＨＥＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＩＢＩ３０４分子配列 配列番号５３
ＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＬＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＡＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１
ＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ２配列 配列番号２
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＣＤＲ３配列 配列番号３
ＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ４９Ｇ９抗体ＶＨＨ配列 配列番号４
ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ１配列 配列番号５
ＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ２配列 配列番号６
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＣＤＲ３配列 配列番号７
ＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ４９Ｇ９．２抗体ＶＨＨ配列 配列番号８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＭＦＳＭＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ１配列 配列番号９
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ２配列 配列番号１０
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＣＤＲ３配列 配列番号１１
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ６３Ｇ１２抗体ＶＨＨ配列 配列番号１２
ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１３
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ２配列 配列番号１４
ＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＣＤＲ３配列 配列番号１５
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ＬＡ６３Ｇ１２．１抗体ＶＨＨ配列 配列番号１６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１７
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１８
ＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＣＤＲ１配列 配列番号１９
ＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹ
ａｍ６３Ｇ１２．１－１４Ｂ１１抗体ＶＨＨ配列 配列番号２０
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＥＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ１配列 配列番号２１
ＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ２配列 配列番号２２
ＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＣＤＲ３配列 配列番号２３
ＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹ
ａｍ６３Ｇ１２．１－５Ｇ８－１８Ｂ９抗体ＶＨＨ配列 配列番号２４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＳＳＧＧＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＴＹＹＲＥＹＤＰＥＭＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ全配列 配列番号２５
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ＶＥＧＦ－Ａ結合ドメイン：配列番号２６
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫ
ＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域：配列番号２７
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ラニビズマブＦａｂ ＶＨ－ＣＨ１：配列番号２８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ
ラニビズマブＦａｂ ＶＨ：配列番号２９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ラニビズマブＦａｂ ＣＨ１：配列番号３０
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ
ラニビズマブＦａｂ ＶＬ－ＣＬ：配列番号３１
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ラニビズマブＦａｂ ＶＬ：配列番号３２
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ラニビズマブＦａｂ ＣＬ：配列番号３３
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ１配列番号３４
ＧＹＤＦＴＨＹ
ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ２配列番号３５
ＮＴＹＴＧＥ
ラニビズマブＦａｂ：ＨＣＤＲ３配列番号３６
ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ１配列番号３７
ＱＤＩＳＮＹＬＮ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ２配列番号３８
ＦＴＳＳＬＨＳ
ラニビズマブＦａｂ：ＬＣＤＲ３配列番号３９
ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ
ＩＥＸ０４－０２６ 配列番号４０
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０３７ 配列番号４１
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０３９ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号４２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０３９ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号４３
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＳＦＳＰＹＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＳＡＴＴＳＧＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＨＷＲＧＳＤＰＥＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＩＥＸ０４－０４１ 配列番号４４
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ＩＥＸ０４－０４２ 配列番号４５
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ＩＥＸ０４－０４６ 配列番号４６
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ＩＥＸ０４－０５６ 配列番号４７
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ＩＥＸ０４－０６７ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号４８
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ＩＥＸ０４－０６７ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号４９
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ＩＥＸ０４－０６９ ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨＨ配列番号５０
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ＩＥＸ０４－０６９ ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨＨ配列番号５１
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陽性対照抗体 抗ＶＥＧＦ－Ｃ（ＶＥＧＦＲ３－トラップ分子）ＯＰＴ－３０２配列番号５２
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ＩＢＩ３０４分子配列 配列番号５３
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【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】