特表 2024-529182 耐塩性植物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】耐塩性植物

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20240725BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20240725BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20240725BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240725BHJP

   A01H 6/20 20180101ALI20240725BHJP

   A01H 6/54 20180101ALI20240725BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20240725BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20240725BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240725BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A

A01H6/46

A01H5/10

C12N15/09 110

A01H6/20

A01H6/54

C12N15/29

C12N15/52 Z

C12N15/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531567

(86)(22)【出願日】2022-08-04

(85)【翻訳文提出日】2024-04-04

(86)【国際出願番号】 EP2022072021

(87)【国際公開番号】W WO2023012312

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】2111268.5

(32)【優先日】2021-08-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2111563.9

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524049055

【氏名又は名称】アロラ イノベーションズ インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】524049066

【氏名又は名称】ヤング ルーク

(71)【出願人】

【識別番号】524049077

【氏名又は名称】ホーンビー ローリー ジェームス

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100162422

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 将

(72)【発明者】

【氏名】ヤング ルーク

(72)【発明者】

【氏名】ホーンビー ローリー ジェームス

(57)【要約】

本発明は、耐塩性である改変植物、これらの植物の作成方法、及びこれらの植物の使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変植物であって、少なくとも３つの目的遺伝子を含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記改変植物が、前記ゲノム改変のない同種の植物と比較して耐塩性が増加している、前記改変植物。

【請求項2】

前記少なくとも３つの目的遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子であって、細胞膜イオントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする遺伝子であって、プロテインキナーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子であって、液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする遺伝子であって、カリウムトランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び
（ｇ）抗酸化物質をコードする遺伝子であって、抗酸化物質をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、
からなる群より選択される、請求項１に記載の改変植物。

【請求項3】

改変植物であって、少なくとも３つの目的遺伝子を含み、前記目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、
前記細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、かつ前記抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変植物。

【請求項4】

前記細胞内イオン濃度を制御する前記細胞膜タンパク質及び／または前記液胞膜タンパク質が、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、または水素輸送ピロホスファターゼである、請求項３に記載の改変植物。

【請求項5】

前記改変植物が、さらに、プロテインキナーゼをコードする遺伝子を含み、任意に、前記プロテインキナーゼが、セリン／スレオニンキナーゼである、請求項３または請求項４に記載の改変植物。

【請求項6】

前記抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質である、請求項２～５のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項7】

前記改変植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの目的遺伝子を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項8】

前記抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質を含む、請求項７に記載の改変植物。

【請求項9】

前記改変植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも３つの目的遺伝子を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項10】

（ａ）前記細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または
（ｂ）前記細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３であり、及び／または
（ｃ）前記プロテインキナーゼが、ＳＯＳ２であり、及び／または
（ｄ）前記液胞水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａであり、及び／または
（ｅ）前記液胞イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または
（ｆ）前記カリウムトランスポーターが、ＨＫＴ１であり、及び／または
（ｇ）前記抗酸化物質（複数可）が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１である、請求項２～９のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項11】

（ａ）前記ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）前記ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）前記ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｄ）前記ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｅ）前記ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｆ）前記ＨＫＴ１が、ＯｓＨＫＴ１であり、任意に、前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
（ｇ）前記ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｈ）前記ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｉ）前記ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の改変植物。

【請求項12】

少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネであって、前記目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子、液胞イオントランスポーターをコードする遺伝子、カリウムトランスポーターをコードする遺伝子、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、液胞イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、カリウムトランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、かつ抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項13】

改変イネであって、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項14】

改変イネであって、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；かつＯｓＳＯＤＡ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項15】

前記改変植物が、少なくとも７つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも７つの目的遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子であって、細胞膜イオントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする遺伝子であって、プロテインキナーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子であって、液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする遺伝子であって、カリウムトランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び
（ｇ）抗酸化物質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項16】

前記改変植物が、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも８つの目的遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子であって、細胞膜イオントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする遺伝子であって、プロテインキナーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子であって、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子であって、液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする遺伝子であって、カリウムトランスポーターをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｇ）第１の抗酸化物質をコードする遺伝子であって、第１の抗酸化物質をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、
（ｈ）第２の抗酸化物質をコードする遺伝子であって、第２の抗酸化物質をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、
を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項17】

（ａ）前記細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または
（ｂ）前記細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３であり、及び／または
（ｃ）前記プロテインキナーゼが、ＳＯＳ２であり、及び／または
（ｄ）前記液胞水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａであり、及び／または
（ｅ）前記液胞イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または
（ｆ）前記カリウムトランスポーターが、ＨＫＴ１であり、及び／または
（ｇ）前記抗酸化物質（複数可）が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１である、請求項１５～１６のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項18】

（ａ）前記ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）前記ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）前記ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｄ）前記ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｅ）前記ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｆ）前記ＨＫＴ１が、ＯｓＨＫＴ１であり、任意に、前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
（ｇ）前記ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｈ）前記ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｉ）前記ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、前記ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の改変植物。

【請求項19】

改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；かつＯｓＳＯＤ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項20】

改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；かつＯｓＳＯＤ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項21】

改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；かつＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項22】

改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；かつＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする前記遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項23】

前記改変植物が、さらに、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている少なくとも１つの追加の目的遺伝子を含み、（エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）前記少なくとも１つの追加の目的遺伝子が、
（ａ）シトクロムｐ４５０（Ｐ４５０）、及び／または
（ｂ）酸素発生複合体、及び／または
（ｃ）スクロースリン酸シンターゼ、及び／または
（ｄ）ピロリンカルボン酸シンターゼ
であるタンパク質をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項24】

前記酸素発生複合体が、前記タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱから形成される、請求項２３に記載の改変植物。

【請求項25】

前記酸素発生複合体が、前記タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ、及びＰｓｂＶから形成される、請求項２３または請求項２４に記載の改変植物。

【請求項26】

前記スクロースリン酸シンターゼが、スクロースリン酸シンターゼ１、スクロースリン酸シンターゼ２、またはスクロースリン酸シンターゼ３である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項27】

前記ピロリンカルボン酸シンターゼが、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１、またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２である、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項28】

前記改変植物が、さらに、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されているＯＳＫ１をコードする目的遺伝子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項29】

前記改変植物が、ＰＥＲＫ１３をコードする目的遺伝子を含有しないか、または前記目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されていない、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項30】

前記エンハンサーエレメントが、同じポリヌクレオチド配列を有するか、または前記エンハンサーエレメントが、異なるポリヌクレオチド配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項31】

前記エンハンサーエレメントが、野生型植物における前記目的遺伝子の前記発現レベルと比較して、前記目的遺伝子の前記発現レベルを変化させる、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項32】

前記植物の少なくとも１つの発育段階中の前記植物の少なくとも一部において、前記エンハンサーエレメントが、野生型植物における前記目的遺伝子の前記発現レベルと比較して、前記目的遺伝子の前記発現レベルを増加または減少させ、任意に、前記エンハンサーエレメントが、野生型植物における前記目的遺伝子の前記発現レベルと比較した、前記目的遺伝子の前記発現レベルを増加させる、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項33】

前記エンハンサーエレメントが、前記根、苗条、葉、種子、または茎における前記目的遺伝子の前記発現レベルを変化させる、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項34】

前記エンハンサーエレメントが、前記根における前記目的遺伝子の前記発現レベルを変化させる、請求項３３に記載の改変植物。

【請求項35】

発芽中に、前記植物の成長時、前記植物の開花時、及び／または、前記植物の結実時に、前記エンハンサーエレメントが、前記目的遺伝子の前記発現レベルを変更させる、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項36】

前記エンハンサーエレメントが、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項37】

前記エンハンサーエレメントが、前記目的遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の１５０～５００ヌクレオチド以内にある、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項38】

エンハンサーエレメントが、根特異的プロモーターを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項39】

前記目的遺伝子の全てが、根特異的プロモーターを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、請求項３８に記載の改変植物。

【請求項40】

前記エンハンサーエレメントが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項41】

前記目的遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、請求項４０に記載の改変植物。

【請求項42】

前記エンハンサーエレメントが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせ由来のプロモーターエレメントの少なくとも６ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項43】

前記目的遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、またはオーキシンのプロモーター配列由来のプロモーターエレメントを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、請求項４２に記載の改変植物。

【請求項44】

前記エンハンサーエレメントが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、もしくはＣＡＡＴのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項45】

前記目的遺伝子の全てが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＣＡＡＴのプロモーター配列を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、請求項４４に記載の改変植物。

【請求項46】

前記エンハンサーエレメントが、配列番号１０～１８のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項47】

（ａ）前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｂ）前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｃ）前記ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｄ）前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｅ）前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｆ）前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｇ）前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｈ）前記ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号１７を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｉ）前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項48】

改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、前記８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
前記ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、前記ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、かつ前記ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、前記改変イネ。

【請求項49】

各目的遺伝子が、別個のタンパク質をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項50】

前記改変植物が、被子植物である、先行請求項のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項51】

前記改変植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項５０に記載の改変植物。

【請求項52】

前記改変植物が、穀物である、請求項５０または請求項５１に記載の改変植物。

【請求項53】

前記改変植物が、トウモロコシ、イネ、ダイズ、サトウキビ、ヤエナリ、キヌア、オオムギ、オートムギ、ライムギ、モロコシ、またはコムギである、請求項５２に記載の改変植物。

【請求項54】

改変植物が、改変イネである、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の改変植物。

【請求項55】

前記改変植物が、野菜作物である、請求項５０または請求項５１に記載の改変植物。

【請求項56】

前記改変植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｇｌｙｃｉｎｅ属、またはＳｏｊａ属に由来する、請求項５５に記載の改変植物。

【請求項57】

請求項１～５６のいずれか１項に記載の改変植物の植物部位。

【請求項58】

前記植物部位が、細胞、種子、葉、苗条、茎、または根である、請求項５７に記載の植物部位。

【請求項59】

前記植物部位が、種子である、請求項５７に記載の植物部位。

【請求項60】

前記植物部位が、細胞である、請求項５７に記載の植物部位。

【請求項61】

請求項６０に記載の１つ以上の植物細胞を含む、多細胞構造体。

【請求項62】

前記多細胞構造体が、カルスである、請求項６１に記載の多細胞構造体。

【請求項63】

請求項１～６２に記載の改変植物、植物部位、または多細胞構造体の作成方法であって、前記方法が、
ｉ）請求項１～５６に記載の改変植物において定義される少なくとも２つのエンハンサーエレメントを、植物の細胞に導入するステップであって、前記エンハンサーエレメントが、前記目的遺伝子に作動可能に連結されているように、前記植物の前記細胞の前記ゲノムに組み込まれ、及び
ｉｉ）前記細胞を再生して、前記細胞から改変植物、植物部位、または多細胞構造体を形成するステップ
を含む、前記方法。

【請求項64】

前記エンハンサーエレメントが、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションで前記細胞に導入される、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記方法が、
（ａ）種子からカルス形成を誘導すること、
（ｂ）請求項１～７７に記載の改変植物において定義される前記エンハンサーエレメント、２つ以上のガイドＲＮＡ、及び１つ以上のヌクレアーゼをマイクロキャリア上に沈殿させること、
（ｃ）微粒子銃を使用して前記マイクロキャリアで前記カルスを形質転換して、形質転換カルスを生成することであって、前記エンハンサーエレメントが、前記目的遺伝子に作動可能に連結されているように、前記改変植物、前記植物部位、または前記多細胞構造体のゲノムに組み込まれ、
（ｄ）前記形質転換カルスを回収して、請求項６１または請求項６２に記載の多細胞構造体を生成すること
を含む、請求項６３～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記多細胞構造体が、改変植物に再生される、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ポリヌクレオチド配列が、前記植物の前記ゲノムに安定して組み込まれる、請求項６５または請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、任意に、前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記改変植物、前記植物部位、または前記多細胞構造体が、相同組み換えを含むプロセスで生成されない、及び／または本質的に生物学的なプロセスで生成されない、請求項１～６２に記載の改変植物、植物部位、または多細胞構造体。

【請求項70】

請求項５９に記載の種子から得られた小麦粉、全粒粉、デンプン、または他の生成物を生成する方法。

【請求項71】

動物飼料としての、または動物消費用飼料もしくはヒト摂取用食品を生成するための、請求項１～５６のいずれか１項に記載の改変植物、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の植物部位、または請求項６１もしくは請求項６２に記載の多細胞構造体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、耐塩性となるように設計される植物に関する。

【背景技術】

【0002】

土壌塩類濃度は、干ばつを除いて、農業における最も深刻な問題の１つである。世界の耕作地の約２０％及び灌漑地のほぼ半分が、塩類濃度により影響を受け、これは、世界中で植物の成長及び生産性を制限する農業生産に対する深刻な脅威となっている［１］。塩類土壌から過剰な塩類が吸収されると、根及び苗条の両方の成長が阻害され、生殖活動が低下し、植物の生存能力に影響を与える。その結果、塩類濃度は、世界的に作物栽培の地理的範囲における主要な制約のうちの１つであり、特定の作物の成長を妨げるものではないにもかかわらず、作物の生産性に大きな影響を与える。さらに、過剰な灌漑、不好適な排水、または回収される水の使用の結果として塩類の蓄積は、リスクのある既存の農業地域にあり、特に、気候変動が乾燥／半乾燥地域での灌漑需要を増加させる。

【0003】

過剰な塩類濃度は、植物に２つのストレス要因を課する：１つは土壌の浸透圧の上昇による水の入手可能性の低減から生じる浸透圧成分、及び、Ｋ⁺／Ｎａ⁺比の変化を引き起こし、細胞質内のＮａ⁺及びＣｌ^-の濃度を増加させる、溶質の不均衡によるイオンストレス。ナトリウム毒性は、主に、Ｎａ⁺及びＫ⁺イオンの植物のトランスポーター及び酵素との類似性により引き起こされる。植物細胞は、通常、細胞質内で高いＫ⁺／Ｎａ⁺比を維持し、比較的高いＫ⁺は、１００～２００ｍＭのオーダーで、低いＮａ⁺は、約１～１０ｍＭである［１］。

【0004】

食用作物の自然な遺伝的変異により、交配方策による耐塩性の強化の機会が限られるようになる。ライムギ及びオオムギなどの比較的耐塩性のある作物であっても、塩類濃度閾値（ＥＣ）が海水などの塩水源よりもはるかに低い。交配されるべき植物種が、一般に同じ属または密接に関連した属に存在するはずであるので、生来耐塩性の植物のレパートリーの制限は、交配方策の適用可能性も制限する。

【0005】

プログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ＣｐｆＩ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が出現すると、植物種で正確なゲノム編集を行う能力が向上しているが、耐塩性を達成するための遺伝子編集の正確な遺伝子数及び同一性は、明確ではない。

【0006】

耐塩性のトランスジェニック植物を作成する以前の試みは、少数の遺伝子のみを発現する方策を採用している。例えば、ＥＰ３４０９１０５は、ＰＥＲＫ１３（プロリン富化エクステンシン様受容体キナーゼ１３）の機能を阻害して耐塩性植物を生成することを示唆していた。Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｓｅｓｕｖｉｕｍ ｐｏｒｔｕｌａｃａｓｔｒｕｍのＳＯＳ１及びＡＨＡ遺伝子を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに導入することにより、耐塩性を改善することを示唆していた［２］。ＳＯＳ１遺伝子及びＡＨＡ遺伝子は、双方ともに、細胞膜タンパク質をコードする。それ故、この方策は、細胞膜タンパク質のみを用いて、細胞内イオン濃度を制御することに集中した。Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．は、様々な耐塩性トランスジェニック植物について議論する［３］が、イオントランスポーターをコードする遺伝子のみを発現するように、これらを設計した。イオントランスポーターの発現を変化させることにより耐塩性植物を生成するさらなる例が、Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（ナトリウム／水素アンチポーター遺伝子を含んでいたトランスジェニックタバコを生成した）により提供される［４］。

【0007】

当該技術分野では、例えば、海中で、高塩類濃度でも成長し得る耐塩性植物を提供することが求められている。

【発明の概要】

【0008】

本発明者らは、効率よく、耐塩性を改善している植物を設計及び生成している。塩類ストレスを制御するための複数の異なる機序を含有するように、これらの植物を改変した。これは、植物の塩類濃度に対する耐性を高める。結果として、耐塩性植物が本明細書で開示される。植物はトランスジェニック植物であってもよく、及び／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている目的遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子、及び／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている目的遺伝子は、本明細書に開示されるような複数の機序に影響を与えることにより耐塩性の改善をもたらす。

【0009】

本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物を提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0010】

本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物も提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0011】

本発明は、少なくとも３つの目的遺伝子を含む改変植物も提供し、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、改変植物が、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して耐塩性が増加している。

【0012】

本発明は、少なくとも３つの目的遺伝子を含む改変植物も提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0013】

本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子、液胞イオントランスポーターをコードする遺伝子、カリウムトランスポーターをコードする遺伝子、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、液胞イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、カリウムトランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0014】

本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯＳＡＨＡ３をコードし、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0015】

本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0016】

本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＡＨＡ３をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0017】

本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0018】

本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0019】

本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0020】

本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子はエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子はエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0021】

本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネも提供し、８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。そのような改変イネも提供され、この段落で定義された配列が、例えば、特定された配列のいずれかまたは全てが、特定の配列番号と少なくとも９５％の配列同一性を有するように変化する。

【0022】

本発明は、本明細書に開示の改変植物のいずれかの植物部位も提供する。

【0023】

本発明は、請求項１～８２に記載の改変植物、植物部位、または多細胞構造を作成する方法も提供し、方法が、以下を含む：
ｉ）請求項１～７７に記載の改変植物において定義される少なくとも２つのエンハンサーエレメントを、植物の細胞に導入するステップ（エンハンサーエレメントが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように植物の細胞のゲノムに組み込まれる）、及び
ｉｉ）細胞を再生して、細胞から改変植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ。本発明は、本明細書に開示の植物の種子から得られる小麦粉、全粒粉、デンプン、または他の生成物を生成する方法も提供する。

【0024】

本発明は、動物飼料として、または動物消費用飼料もしくは人間消費用食品を生成するための、本明細書に開示の改変植物または植物部位の使用も提供する。

【0025】

本発明者らは、効率よく、植物の塩類濃度に対する耐性を集合的に増加させる塩類ストレスを制御するための複数の異なる機序を含有する耐塩性を改善している植物を設計及び生成している。このアプローチは、上の段落で提示されるように、改変植物を用いて達成することができるが、以下の段落で提示されるように、トランスジェニック植物を用いて達成することもできる。これらのアプローチは、個別にまたは組み合わせて使用することができ、この全てが本明細書に開示される。例えば、導入遺伝子を定義する以下の実施形態は、改変植物における対応する目的遺伝子も定義し得る。本明細書に定義されるトランスジェニック植物は、本明細書にも定義されるエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている対応する目的遺伝子で置換された本明細書に定義される導入遺伝子のいずれか１つまたは複数を有し得る。

【0026】

本発明は、少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供し、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質は、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、またはプロテインキナーゼであり得る。さらなる実施形態では、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼは、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり得る。いくつかの実施形態では、細胞膜イオントランスポーターは、ＳＯＳ１であり得る。ＳＯＳ１は、ＯｓＳＯＳ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子は、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＡＨＡ３であり得る。ＡＨＡ３は、ＯｓＡＨＡ３であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子は、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0027】

イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼが、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり得る。いくつかの実施形態では、液胞膜イオントランスポーターは、ＮＨＸ１であり得る。ＮＨＸ１は、ＯｓＮＨＸ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子は、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＶＨＡ－Ａであり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ－Ａは、ＯｓＶＨＡ－Ａであり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子は、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、セリン／スレオニンキナーゼは、ＳＯＳ２であり得る。ＳＯＳ２は、ＯｓＳＯＳ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子は、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質であり得る。トランスジェニック植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含み得る。例えば、トランスジェニック植物は、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも３つの導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、抗酸化物質（複数可）は、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１を含む。ＳＯＤＡ１は、ＯｓＳＯＤＡ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＳＯＤ２は、ＯｓＳＯＤ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子は、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＳＯＤＣＣ１は、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子は、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0030】

本発明は、少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物も提供し、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり得る。いくつかの実施形態では、細胞膜イオントランスポーターは、ＳＯＳ１であり得る。ＳＯＳ１は、ＯｓＳＯＳ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子は、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＡＨＡ３であり得る。ＡＨＡ３は、ＯｓＡＨＡ３であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子は、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質は、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり得る。

【0032】

いくつかの実施形態では、液胞膜イオントランスポーターは、ＮＨＸ１であり得る。ＮＨＸ１は、ＯｓＮＨＸ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子は、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＶＨＡ－Ａであり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ－Ａは、ＯｓＶＨＡ－Ａであり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子は、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、さらに、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子及び／または抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、セリン／スレオニンキナーゼは、ＳＯＳ２であり得る。ＳＯＳ２は、ＯｓＳＯＳ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子は、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質であり得る。特定の実施形態では、抗酸化物質は、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＣＣ１のいずれか１つを含む。ＳＯＤＡ１は、ＯｓＳＯＤＡ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＳＯＤ２は、ＯｓＳＯＤ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子は、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＳＯＤＣＣ１は、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり得る。いくつかの実施形態では、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子は、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0035】

本発明は、少なくとも３つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物も提供し、トランスジェニック植物が、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して耐塩性が増加している。

【0036】

本発明は、少なくとも３つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物も提供し、少なくとも３つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、及び抗酸化物質をコード化する導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質及び／または液胞膜タンパク質は、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、または水素輸送ピロホスファターゼであり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、さらに、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子を含む。プロテインキナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、セリン／スレオニンキナーゼは、ＳＯＳ２であり得る。

【0037】

本発明は、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする導入遺伝子を含む。本発明は、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネも提供し、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする導入遺伝子を含み、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも７つの導入遺伝子を含み、少なくとも７つの導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする導入遺伝子、カリウムトランスポーターをコードする導入遺伝子、及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物が、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする導入遺伝子、カリウムトランスポーターをコードする導入遺伝子、第１の抗酸化物質をコードする導入遺伝子、及び第２の抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞膜イオントランスポーターは、ＳＯＳ１であり得る。特定の実施形態では、ＳＯＳ１は、ＯｓＳＯＳ１であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子は、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＡＨＡ３であり得る。特定の実施形態では、ＡＨＡ３は、ＯｓＡＨＡ３であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子は、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼは、ＳＯＳ２であり得る。特定の実施形態では、ＳＯＳ２は、ＯｓＳＯＳ２であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子は、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、液胞水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＶＨＡ－Ａであり得る。特定の実施形態では、ＶＨＡ－Ａは、ＯｓＶＨＡ－Ａであり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子は、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、液胞イオントランスポーターは、ＮＨＸ１であり得る。特定の実施形態では、ＮＨＸ１は、ＯｓＮＨＸ１であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子は、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、カリウムトランスポーターは、ＨＫＴ１であり得る。特定の実施形態では、ＨＫＴ１は、ＯｓＨＫＴ１であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子は、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗酸化物質は、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１である。特定の実施形態では、ＳＯＤＡ１は、ＯｓＳＯＤＡ１であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＳＯＤ２は、ＯｓＳＯＤ２であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子は、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＳＯＤＣＣ１は、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり得る。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子は、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0040】

本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードする導入遺伝子を含む。さらなる態様では、本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードする導入遺伝子を含み；ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0041】

本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含む。別の態様では、本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含み；ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、さらに、少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含み、少なくとも１つの追加の導入遺伝子が、シトクロムｐ４５０（Ｐ４５０）、酸素発生複合体、スクロースリン酸シンターゼ、及び／またはピロリンカルボン酸シンターゼであり得るタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、酸素発生複合体は、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱから形成することができる。他の実施形態では、酸素発生複合体は、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ、及びＰｓｂＶから形成することができる。他の実施形態では、スクロースリン酸シンターゼは、スクロースリン酸シンターゼ１、スクロースリン酸シンターゼ２、またはスクロースリン酸シンターゼ３であり得る。いくつかの実施形態では、ピロリンカルボン酸シンターゼは、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１、またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２であり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、さらに、ＯＳＫ１をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰＥＲＫ１３をコードする導入遺伝子を含有しない。

【0043】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子の全てが、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、導入遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の１５０～５００ヌクレオチド以内にあり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、根特異的プロモーターであり得る。特定の実施形態では、導入遺伝子の全てが、根特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含むプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせ由来のプロモーターエレメントの少なくとも６ヌクレオチドを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、またはオーキシンのプロモーター配列由来のプロモーターエレメントを含むプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、もしくはＣＡＡＴのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＣＡＡＴのプロモーター配列を含むプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、配列番号１０～１８のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、各導入遺伝子は、別個のタンパク質をコードし得、すなわち、トランスジェニック植物に導入された各タンパク質が、別個の導入遺伝子にコードされる。

【0045】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、被子植物であり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、穀物であり得る。さらに特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、サトウキビ、ヤエナリ、キヌア、オオムギ、オートムギ、ライムギ、モロコシ、またはコムギであり得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、トランスジェニックイネであり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は，野菜作物であり得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｇｌｙｃｉｎｅ属、またはＳｏｊａ属に由来し得る。

【0046】

本発明は、本発明によるトランスジェニック植物の植物部位も提供する。いくつかの実施形態では、植物部位は、細胞、種子、葉、苗条、茎、または根であり得る。特定の実施形態では、植物部位は、種子または細胞であり得る。本発明は、本発明による１つ以上の植物細胞を含む多細胞構造も提供する。いくつかの実施形態では、多細胞構造は、カルスであり得る。

【0047】

本発明は、本発明によるトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造の作成方法を提供し、方法は、以下を含む：ｉ）本発明によるトランスジェニック植物において定義される少なくとも２つの導入遺伝子を植物の細胞に導入するステップ（導入遺伝子が、植物の細胞のゲノムに組み込まれる）、及び、ｉｉ）細胞を再生して、細胞からトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションで細胞に導入される。いくつかの実施形態では、方法は、以下を含む：（ａ）種子からのカルス形成を誘導すること；（ｂ）ポリヌクレオチド配列、ガイドＲＮＡ、及びヌクレアーゼをマイクロキャリア上に沈殿させることであって、ポリヌクレオチド配列が、本明細書に記載の少なくとも２つの導入遺伝子を含む）；（ｃ）微粒子銃を使用して、マイクロキャリアでカルスを形質転換して、形質転換カルスを生成することであって、ポリヌクレオチド配列が、トランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造のゲノムに組み込まれ；（ｄ）形質転換カルスを回収して、本発明による多細胞構造を生成すること。いくつかの実施形態では、多細胞構造は、トランスジェニック植物に再生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、植物のゲノムに安定して組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、任意に、ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはプラスミドであり、任意に、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。

【0048】

いくつかの実施形態では、本発明によるトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造は、相同組み換えを含むプロセスにより生成されず、及び／または本質的に生物学的なプロセスで生成されない。

【0049】

本発明は、本発明による種子から得られる小麦粉、全粒粉、デンプン、または他の生成物を生成する方法も提供する。本発明は、動物飼料として、または動物消費用飼料もしくはヒト摂取用食品を生成するための、本発明によるトランスジェニック植物、その一部、または多細胞構造の使用も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】切断部位及び遺伝子挿入の位置を含む、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の機序。インサートは、オーバーハングに対応する配列と、選択された遺伝子の発現を指示する所望のプロモーターベースの配列を含む。

【図2】２，４－Ｄ及びＢＡＰの濃度が異なるイネ異種ＴＨ３－５、Ｔｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ、ＭＨＣ２、及びＨａ Ｐｈａｔ３のカルス誘導率。各処置における濃度が、表１２にまとめられる。

【図3A】Ｊａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａのイネ品種の分析。発芽したＪａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａイネ品の品種由来の種子の割合を示す。

【図3B】Ｊａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａのイネ品種の分析。２，４－Ｄ及びＢＡＰの濃度が異なるイネ品種のカルス誘導率を示す。各処置における濃度が、表１２にまとめられる。

【図3C】Ｊａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａのイネ品種の分析。同じ処理を行ったイネ品種の苗条の発育を示す。バーの順序は、左から右で、Ｊａｃａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａの繰り返しであり、各セットの間にスペースがある。

【図4】２，４－Ｄ及びＢＡＰの濃度が異なるイネ品種「ハヤユキ」のカルス誘導率。各処置における濃度が、表１３にまとめられる。

【図5A】本発明による改変植物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。葉における４つの目的遺伝子の発現を示す。

【図5B】本発明による改変植物のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。根における４つの目的遺伝子の発現を示す。ＷＴは、野生型植物を表す。遺伝子型１、６、９、及び１０は、本発明による４つの異なる改変植物であり、目的遺伝子は、ＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＨＫＴ１、及びＳＯＤＡ１である。バーの順序は、左から右で、ＮＨＸ１；ＳＯＳ１、ＨＫＴ１、及びＳＯＤＡ１の繰り返しであり、各セットの間にスペースがある。

【図6】ＤＮＡインサートの５’末端及び３’末端に追加された配列。５’インサート内のプロモーター配列は、下線が引かれている。

【図7】植物のライフサイクル全体にわたるホルモンの分布。特定のホルモンの存在は、色付きのボックスで示される。

【図8】収量対塩類濃度（ＥＣｅ）プロットの例。

【図9A】本発明による改変植物におけるＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子発現は、参照遺伝子であるアクチン－３と野生型植物の両方に対するものである。正値は、発現の上方調節を示し、負値は、遺伝子発現の下方調節を示す。改変植物毎にグループ化された正規化された遺伝子発現を示す。データは、グループ化されていない。バーの順番は、左から右で、以下の通りである：植物Ａ（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｂ（ＮＨＸ１、Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｃ（ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｄ（ＮＨＸ１、Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｅ１（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｆ（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２、ｓｐａｃｅ、Ｐｌａｎｔ Ｇ－Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｉ（ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物１（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物９（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、野生型（ＮＨＸ１；ＯｓＶＨＡ－Ａ；ＳＯＳ１；ＳＯＤ２；ＯｓＡＨＡ３；ＨＫＴ１；ＳＯＤＡ１；及びＯｓＳＯＤ２）。

【図9B】本発明による改変植物におけるＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子発現は、参照遺伝子であるアクチン－３と野生型植物の両方に対するものである。正値は、発現の上方調節を示し、負値は、遺伝子発現の下方調節を示す。改変植物毎にグループ化された正規化された遺伝子発現を示す。データは、生物学的試料毎にグループ化されている。バーの順番は、左から右で、以下の通りである：植物Ａ（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｂ（ＮＨＸ１、Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｃ（ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｄ（ＮＨＸ１、Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｅ１（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｆ（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２、ｓｐａｃｅ、Ｐｌａｎｔ Ｇ－Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物Ｉ（ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物１（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、植物９（Ｏｓ－ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２）、スペース、野生型（ＮＨＸ１；ＯｓＶＨＡ－Ａ；ＳＯＳ１；ＳＯＤ２；ＯｓＡＨＡ３；ＨＫＴ１；ＳＯＤＡ１；及びＯｓＳＯＤ２）。

【図9C】本発明による改変植物におけるＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子発現は、参照遺伝子であるアクチン－３と野生型植物の両方に対するものである。正値は、発現の上方調節を示し、負値は、遺伝子発現の下方調節を示す。目的遺伝子毎にグループ化された正規化された遺伝子発現を示す。対応する目的遺伝子を含む改変植物が表８にまとめられる。バーの順序は、左から右で、植物Ａ、植物Ｂ、植物Ｃ、植物Ｄ、植物Ｅ１、植物Ｆ、植物Ｇ、植物Ｉ、植物１、植物９、及び野生型の繰り返しである。

【図10A】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ａの散布図である。

【図10B】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｂの散布図である。

【図10C】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｃの散布図である。

【図10D】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｄの散布図である。

【図10E】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｅ１の散布図である。

【図10F】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｆの散布図である。

【図10G】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｉの散布図である。

【図10H】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物Ｇの散布図である。

【図10I】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物１の散布図である。

【図10J】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変植物の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変植物９の散布図である。対応する目的遺伝子を含む改変植物が表８にまとめられる。

【図11】塩類培地で成長した野生型（ＷＴ）及び改変イネ植物の画像。対応する目的遺伝子を含む改変植物が表８にまとめられる。

【図12A】塩類培地で成長した野生型（ＷＴ）及び改変カルスの画像。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図12B】塩類培地で成長した野生型（ＷＴ）及び改変カルスの画像。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図12C】塩類培地で成長した野生型（ＷＴ）及び改変カルスの画像。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図13】本発明による改変カルスにおけるＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子発現は、参照遺伝子であるアクチン－３と野生型植物の両方に対するものである。正値は、発現の上方調節を示し、負値は、遺伝子発現の下方調節を示す。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。バーの順序は、左から右で、ＳＯＳ１；ＳＯＤ２；ＨＫＴ１；ＮＨＸ１；ＯｓＡＨＡ３；ＯｓＶＨＡ－Ａ；及びＳＯＤＡ１の繰り返しであり、各セット間にスペースがある。

【図14】０、２、４、６、８、１０、１２．５、及び１５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む培地中で成長した場合の野生型カルスにおける、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子発現は、参照遺伝子であるアクチン－３と野生型植物の両方に対するものである。正値は、発現の上方調節を示し、負値は、遺伝子発現の下方調節を示す。バーの順序は、左から右で、ＨＫＴ１；ＮＨＸ１；ＯｓＡＨＡ３；ＯｓＶＨＡ－Ａ；ＳＯＤＡ１；ＳＯＳ１；及びＳＯＤ２の繰り返しであり、各セットの間にスペースがある。

【図15A】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15B】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15C】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15D】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15E】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15F】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15G】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15H】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15I】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15J】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15K】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15L】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15M】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15N】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図15O】野生型植物（ＷＴ）に対する本発明による改変カルスの正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。プロットの設定は、倍率変化の閾値２．００を含み、各試料は、２つの複製を含有する。改変カルスの目的遺伝子は、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、及びＯｓＳＯＳ２である。

【図16A】種子を生成している３つの改変イネの画像。改変植物は、以下の目的遺伝子：ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれかを含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。（Ａ）画像の左側の大きな植物は、Ｔｒｏｕｎｇ Ｇｉａｎｇイネ品種である本発明による改変植物であるが、右側の２つの植物は、ハヤユキイネ品種由来の本発明による改変植物である。

【図16B】種子を生成している３つの改変イネの画像。改変植物は、以下の目的遺伝子：ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれかを含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。（Ｂ）ハヤユキイネ品種の２つの改変イネの詳細画像である。

【図16C】種子を生成している３つの改変イネの画像。改変植物は、以下の目的遺伝子：ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれかを含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。（Ｃ）ハヤユキイネ品種の改変イネの穂及び種子を示す画像である。

【図16D】種子を生成している３つの改変イネの画像。改変植物は、以下の目的遺伝子：ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれかを含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。（Ｄ）Ｔｒｏｕｎｇ Ｇｉａｎｇイネ品種の改変イネの画像である。

【図16E】種子を生成している３つの改変イネの画像。改変植物は、以下の目的遺伝子：ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれかを含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。（Ｃ）Ｔｒｏｕｎｇ Ｇｉａｎｇイネ品種の改変イネの穂及び種子を示す画像である。

【図17】実生１３及び１４のＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤＣＣ１、及びＯｓＳＯＤ２の遺伝子発現を示す棒グラフ。実生１３及び１４は、ハヤユキイネ品種の改変イネから採取された種子から成長した。これらの実生は、野生型イネと比較して正規化された、本発明による改変植物から得られた種子から成長させた。

【図18】野生型イネに対して正規化された実生１３及び１４の正規化された遺伝子発現をマッピングする散布図。バーは、遺伝子発現の４倍の増加を表す。

【発明を実施するための形態】

【0051】

定義
別途具体的な明示のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、植物分子生物学、タンパク質化学、及び生化学）により一般に理解されるのと同じ意味を有するものと解釈されるべきである。

【0052】

本明細書で使用される場合、「培地」という用語は、一般に、植物を成長させるために使用することができる固体、半固体、または液体の形態の天然または人工の物質を指す。本開示で使用することができる好適な種類の培地の例としては、土壌、人工、または非土壌の鉢植え混合物、水（例えば、水耕栽培形式用）、及び寒天が挙げられる。

【0053】

本明細書で使用される「塩類濃度」は、一般に、土壌または水中の可溶性塩の尺度を指す。本明細書で使用される「塩」は、一般に、カチオン、例えば、ナトリウム（Ｎａ⁺）、カリウム（Ｋ⁺）、マグネシウム（Ｍｇ²⁺）、またはカルシウム（Ｃａ²⁺）と、アニオン、例えば、塩化物（Ｃｌ^-）、重炭酸塩（ＨＣＯ₃ ^-）、炭酸塩（ＣＯ₃ ^2-）、または硫酸塩（ＳＯ₄ ^2-）から構成される任意の分子を指す。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、地下水及び土壌に最も一般的な塩類である。土壌（または別の成長培地）の塩類濃度は、（ａ）グラム／リットル（ｇ／Ｌ）単位の培地の塩類濃度として、または、（ｂ）電気伝導度（ＥＣ、デシジーメンス／メートル（ｄＳ／ｍ）もしくは同等の単位のミリモース／センチメートル（ｍｍｈｏｓ／ｃｍ）もしくはミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ））の単位で、表すことができる。土壌の場合、塩類濃度は、植物の根域から採取され、時間と深さで平均化された飽和土壌ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）の単位で測定することができる。土壌ペースト抽出物は、水分飽和点まで引き上げられた土壌試料である（例えば、ＵＳＤＡを参照）。塩類及びアルカリ性土壌の診断及び改善。Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．６０．（１９５４）（参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、電気伝導度は、飽和土壌ペースト抽出物から真空抽出され、濾過された水抽出物について測定される。

【0054】

ＵＳＤＡの塩類濃度検査室によれば、「塩類濃度」は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）が４ｄＳ／ｍ以上である培地として定義することができ、「軽度の塩類濃度」（または培地）は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）が４～８であるものとし定義することができ；中等度の塩類濃度は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）が８～１６であるものとして定義することができ；重度の塩類濃度は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）が１６より大きいものとして定義することができ；海水の塩類濃度が３０ｇ／Ｌであり、ＥＣが５０ｄＳ／ｍであってよい。しかし、４ｄＳ／ｍ未満の塩類濃度レベルでは、植物に影響が生じ得；いわゆる感受性の高い植物は、０．７５～１．５ｄＳ／ｍで成長の問題を示し得；多くの植物は、それでもなお、１．５～３．０ｄＳ／ｍで成長速度の低下を経験し得る。

【0055】

耐塩性は、塩類ストレス、例えば、イオンストレス（例えば、ＬｉＣｌ濃度に対する耐性の増加により、試験することができる）及び／または浸透圧ストレス（例えば、ポリエチレングリコール濃度に対する耐性の増加により、試験することができる）を引き起こすように組み合わせる個々の物理化学的ストレスに対する耐性により明示することができる。塩類濃度が植物に及ぼす一般的な影響は、成長速度の低減であり、それにより、葉が小さくなり、背丈が低くなり、葉の数が減り、及び／または収量が減少する。従って、いくつかの実施形態では、耐塩性は、植物全体の収量、質量、長さ、もしくは成長速度を参照することにより、または、植物の特定の部分（例えば、根、葉、苗条、及び／または種子）の収量、質量、長さ、もしくは成長速度により、評価することができる。例えば、植物の耐塩性は、塩類濃度の範囲にわたる収量の低下の関数として記載することができる。他の実施形態では、植物の耐塩性は、２つのパラメータ、閾値（ＥＣ_t）、最大予想収量（Ｙ_max）の初期の大幅な低減を引き起こすことが予想される電気伝導度、及び傾き（複数可）を使用して記載することができる。図８は、収量 対 塩類濃度プロットの例の図を示し、これは、塩類濃度閾値（ＥＣ_t）、Ｙ_max、及び傾き（複数可）を示す。ＥＣ_tに関しては、ＥＣｔが０．９ｄＳ／ｍ以下の植物は、塩類感受性があると考えることができ、ＥＣ_tが０．９より大きく最大１．４ｄＳ／ｍの植物は、中等度の感受性があると考えることができ、ＥＣ_tが１．４より大きく最大２．５ｄＳ／ｍの植物は、中等度の耐性があると考えられることができ、ＥＣ_tが２．５ｄＳ／ｍより大きい植物は、中程度の耐性があると考えることができる。他の実施形態では、耐塩性は、収率が５０％低減する（Ｃ₅₀）飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）の単位で表すことができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結されている」という用語は、一般に、プロモーター配列内の調節エレメントが、ポリヌクレオチド配列の調節活性に影響を与え得るように、プロモーター配列またはエンハンサー配列が、転写可能または翻訳可能ポリヌクレオチド配列（すなわち、導入遺伝子または目的遺伝子）に対して位置していることを意味する。例えば、転写プロモーター活性を有するプロモーターは、任意の距離に、例えば、遺伝子の近傍に、または遺伝子から最大数千ヌクレオチド離れて、及び遺伝子の上流または下流に配置することができ、これは、最小のプロモーターエレメント、及び転写されるべきポリヌクレオチド配列であり得、依然として、コードされたレポーター分子の発現レベルに対して検出可能な影響を発揮する。

【0057】

別途指示のない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者らに周知の標準的な手順である。そのような手法は、以下の出典の文献全体に記載及び説明されている：Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）。

【0058】

「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味を明示的にサポートすると解釈されるものとする。

【0059】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、反対の記載がない限り、指定値の±１０％、±５％、±１％、または±０．５％を指す。

【0060】

本明細書で使用される場合、「含む」という動詞及びその活用形は、その単語に続く項目が含まれるが、特に、言及されていない項目が除外されることを意味する非限定的な意味で使用される。さらに、「からなる」という動詞は、必要に応じて、本明細書で定義される生成物が、具体的に特定されたもの以外の追加の構成要素（複数可）を含んでもよく、該追加の構成要素（複数可）が本発明の固有の特徴を変更しないことを意味する「から本質的に構成される」で置き換えられ得る。さらに、本明細書で定義される方法は、具体的に特定されたもの以外の追加のステップ（複数可）を含んでもよく、該追加のステップ（複数可）は、本発明の独特の特徴を変更しない。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈上、エレメントが１つだけ存在することを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。

【0061】

定義されたポリペプチドに関して、上で提供されたものより高い同一性％の数値は、さらなる特定の実施形態を包含することが理解されるであろう。従って、適用可能な場合、最小同一性％の数値に照らして、ポリペプチドは、指定された関連配列番号と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0062】

２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性パーセントに基づくことができる。本明細書において「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的で、最大レベルの同一性を得るように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインし、類似性／同一性を評価するための多数の方法、例えば、クラスター法が当該技術分野で既知であり、類似性が、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズム、ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＦＡＳＴＡに基づいている。これらのプログラムのいずれかを使用する場合、最高の配列類似性がもたらされる設定が選択され得る。

【0063】

例示的な方法は、参考文献［５］のセクション７．７．１８に記載されている。アライメントは、５または１２のギャップオープンペナルティ及び２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いたアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムで決定され得る。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献［６］に開示されている。別の実施形態では、ポリペプチドの同一性パーセンテージは、ギャップ生成ペナルティ＝５、及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３でのＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）で決定することができる。クエリ配列は、少なくとも１５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。クエリ配列は、少なくとも５００アミノ酸長であってよく、ＧＡＰ分析は、少なくとも５００アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。クエリ配列は、少なくとも７５０アミノ酸長であってよく、ＧＡＰ分析は、少なくとも７５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。クエリ配列は、少なくとも９００アミノ酸長であってよく、ＧＡＰ分析は、少なくとも９００アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。ＧＡＰ分析は、２つの配列を全長にわたってアラインし得る。

【0064】

本明細書で名詞として使用される「植物」という用語は、植物全体を指し、植物界の任意のメンバーを指すが、形容詞として使用される場合、植物、例えば、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単細胞（例えば、花粉）、種子、植物細胞などに存在するか、それから得られるか、それから由来するか、またはそれに関連する任意の物質を指す。苗木ならびに根及び苗条が出た発芽した種子も、「植物」の範囲に含まれる。本明細書で使用される「植物部位」という用語は、植物から得られ、植物のゲノムＤＮＡを含む１つ以上の植物組織または器官を指す。植物部位は、栄養構造（例えば、葉、茎）、根、花の器官／構造、種子（胚、子葉、及び種皮を含む）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）、細胞及びそれの子孫を含む。本明細書で使用される「植物細胞」という用語は、植物からまたは植物内で得られる細胞を指し、プロトプラストまたは植物由来の他の細胞、配偶子生成細胞、及び植物全体に再生する細胞を含む。植物細胞は、培養細胞であってよい。「植物組織」は、植物内の分化した、または植物から得られた組織（「外植片」）、または未熟もしくは成熟した胚、種子、根、苗条、果実、塊茎、花粉、隆起組織、例えば、樹冠、培養中の植物細胞の様々な形態の集合体、例えば、カルスに由来する未分化組織を意味する。種子内または種子由来の例示的な植物組織は、子葉、胚、及び胚軸である。従って、本発明は、植物及び植物部位、ならびにこれらを含む生成物を含む。

【0065】

本明細書で使用される場合、「種子」という用語は、植物から収穫の準備ができているか、もしくは収穫されている、例えば、通常野外で商業的に収穫される植物の「成熟種子」、または、受精後、種子の休眠が確立される前、及び収穫前の植物で生じる「発育中の種子」を指す。

【0066】

エンハンサーエレメントは、野生型植物における目的遺伝子の発現レベルと比較して、目的遺伝子の発現レベルを変化させることが可能な調節エレメント（複数可）を含むか、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列である。例えば、エンハンサーエレメントは、野生型植物と比較して、目的遺伝子の発現レベルを増加させ得る。エンハンサーエレメントは、常に、または植物のライフサイクルの１つ以上の段階で、例えば、植物が発芽する時に、目的遺伝子の発現レベルを変更し得る。エンハンサーエレメントは、野生型植物と比較して、植物内の異なる位置で目的遺伝子の発現をもたらし得る。

【0067】

エンハンサーエレメントは、植物ゲノムに天然に存在する調節エレメント（複数可）を含み得、または植物ゲノムに天然に存在しない調節エレメントを含有し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、同じ種の植物細胞、または異なる種の別の植物細胞、または非植物源、または合成配列から得られるか、またはそれらに由来するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、エンハンサーエレメントは、対応する目的遺伝子について植物ゲノムに天然に存在するプロモーター配列ではない。

【0068】

エンハンサーエレメントは、遺伝子工学を含む植物形質転換法で植物のゲノムに組み込まれ、すなわち、エンハンサーエレメントは、本質的に生物学的な手段、例えば、交配、異種交配、または品種改良で植物のゲノムに組み込まれない。そのようなゲノム改変の結果として、改変植物は、関連野生型植物とは異なり、野生型植物に天然には見られない形質を有する。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント（複数可）は、植物のゲノムに安定して組み込まれる。

【0069】

「目的遺伝子」、「遺伝子」、及び「遺伝子」という用語は、植物のゲノム内に天然に存在するポリヌクレオチド配列を指し、すなわち、それは、植物内の内因性遺伝子である。

【0070】

「導入遺伝子」という用語は、遺伝子工学を含む植物形質転換法により植物のゲノムに組み込まれているポリヌクレオチド配列を指す。すなわち、導入遺伝子は、本質的に生物学的な手段、例えば、交配、異種交配、または品種改良により植物のゲノムに組み込まれない。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック」という用語は、導入遺伝子を含むことを意味し、例えば、「トランスジェニック植物」は、そのゲノム中に導入遺伝子を含む植物を指し、「トランスジェニック形質」は、植物ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の存在により伝達または付与される特徴または表現型を指す。導入遺伝子は、同じ種の植物細胞、または異なる種の別の植物細胞、または非植物源、または合成配列から得られるか、またはそれらに由来するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなゲノム変化の結果として、トランスジェニック植物は、関連する野生型植物とは異なり、トランスジェニック形質は、野生型植物には天然には見られない形質となる。

【0071】

トランスジェニック植物の導入遺伝子がトランスジェニック植物と同じ種の植物細胞から得られるか、またはそれに由来する場合、野生型植物と比較して遺伝子の余分なコピーが植物ゲノムに存在し、すなわち、トランスジェニック植物が、内因性遺伝子と、導入遺伝子である遺伝子の余分なコピーを含むことを、導入遺伝子の存在は意味する。遺伝子の追加のコピーは、内因性植物プロモーターまたは内因性プロモーターとは異なる人工プロモーターに作動可能に連結され得る。人工プロモーターが存在すると、野生型植物と比較した場合に異なる導入遺伝子の発現レベルまたは発現パターンが生じ得る。例えば、導入遺伝子の発現レベルは、野生型植物と比較して増加または減少し得る。遺伝子の追加のコピーが、植物のライフサイクルのある時点、例えば、植物が発芽する時に、遺伝子の発現の変更をもたらし得る。遺伝子の追加のコピーが、内因性遺伝子と比較して植物内の異なる場所で遺伝子の発現をもたらし得る。特定の実施形態では、導入遺伝子は、植物のゲノムに安定して組み込まれる。

【0072】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、導入遺伝子及びエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている目的遺伝子を含み得る。導入遺伝子または目的遺伝子は、本明細書に記載の任意の導入遺伝子または目的遺伝子であり得る。導入遺伝子または目的遺伝子は、同じタンパク質をコードし得るか、または異なるタンパク質をコードし得る。例えば、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子、及び抗酸化物質をコードする目的遺伝子を含んでもよく、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0073】

本明細書で引用される全ての特許及び文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0074】

発明の開示
本明細書に開示の改善された耐塩性は、本明細書に開示のトランスジェニック植物及び／または本明細書に開示の改変植物の作成を含む、多くの経路により達成することができる。改善された耐塩性は、本明細書に開示のように達成される、野生型と比較して増加した遺伝子及び／または導入遺伝子発現により提供することができる。例えば、野生型と比較して増加した発現は、本明細書に開示の導入遺伝子（複数可）及び／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている目的遺伝子を使用することにより達成され得る。

【0075】

導入遺伝子及び目的遺伝子
本発明は、植物の耐塩性が増加するように、目的遺伝子に作動可能に連結されているエンハンサーエレメントを有するように特に設計された改変植物を提供する。例えば、本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物を提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0076】

導入遺伝子を挿入するよりも、目的遺伝子に作動可能に連結されているように、短いエンハンサーエレメントを植物のゲノムに挿入することが有利であることを、発明者らは確認している。本発明による改変植物を生成するためのこの方法は、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡのより少ない量しか必要とせず、これは、植物への侵襲性が低いことを意味する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明の改変植物で観察される耐塩性の改善が、植物ゲノムに挿入されているＤＮＡの量の減少によるものであり得ると、本発明者らは考えている。さらに、導入遺伝子全体をゲノムに挿入するのではなく遺伝子編集されている植物は、より短期間の規制認可を要求する。

【0077】

本発明は、植物が耐塩性を増加させるように、導入遺伝子を含むように特別に設計され、遺伝子改変されているトランスジェニック植物を提供する。例えば、本発明は、少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供し、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。

【0078】

本発明は、目的遺伝子に作動可能に連結されているエンハンサーエレメントを含み、その結果、植物が耐塩性を増加させるように、特に設計され、遺伝子改変されている改変植物も提供する。例えば、本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物を提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0079】

導入遺伝子を使用するアプローチとエンハンサーエレメントに連結されている目的遺伝子を使用するアプローチは、双方ともに、導入遺伝子及び／または目的遺伝子の発現を増加させるという同じ結果に至る経路であり得る。従って、本明細書に開示の導入遺伝子及び目的遺伝子にコードされるタンパク質は、同じであってよい。

【0080】

酸化防止剤
細胞内のナトリウム濃度が増加すると、ナトリウムイオンが、代謝反応を妨げ、過酸化水素、ＯＨ^-、及び酸素などの活性酸素種及びラジカルの増加を引き起こす。これらの活性酸素種及びラジカルは、ＤＮＡを損傷するなどの細胞内に様々な悪影響を与え得る。抗酸化物質は、活性酸素種及びラジカルを生成する酸化を抑制する化合物である。過剰なレベルの塩化物イオンも、活性酸素種及びラジカルの増加につながり得る。本発明者らは、有利には、トランスジェニック植物において抗酸化物質をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を発現させると、トランスジェニック植物の耐塩性が増加させることを確認している。本発明者らは、有利には、改変植物において抗酸化物質をコードする目的遺伝子にエンハンサーエレメントを作動可能に連結すると、改変植物の耐塩性が増加することを確認した。

【0081】

抗酸化物質は、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質であり得る。いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤＡ）である。いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）である。いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、細胞質スーパーオキシダーゼジスムターゼ（ＳＯＤＣＣ１）である。

【0082】

いくつかの実施形態では、ＳＯＤＡ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＳＯＤＡ１（ＯｓＳＯＤＡ１）である。ＯｓＳＯＤＡ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ４３１２１または配列番号９２のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、Ｑ４３１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または導入遺伝子は、Ｑ４３１２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、ＳＯＤ２は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＳＯＤ２（ＯｓＳＯＤ２）である。ＯｓＳＯＤ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１０ＰＷ４または配列番号９３のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、Ｑ１０ＰＷ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または導入遺伝子は、Ｑ１０ＰＷ４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＳＯＤＣＣ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＳＯＤＣＣ１（ＯｓＳＯＤＣＣ１）である。ＯｓＳＯＤＣＣ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０ＤＲＶ６または配列番号９４のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子もしくは目的遺伝子が、Ｑ０ＤＲＶ６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ０ＤＲＶ６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの導入遺伝子、少なくとも３つの導入遺伝子、少なくとも４つの導入遺伝子、または少なくとも５つの導入遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含み得る。抗酸化物質は、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質であり得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、ミトコンドリア抗酸化物質をコードする導入遺伝子及び細胞質抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む少なくとも２つの導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ及び／またはＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼであり得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、２つの抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む少なくとも２つの導入遺伝子を含み得、２つの抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１及びＳＯＤ２；ＳＯＤＡ１及びＳＯＤＣＣ１；またはＳＯＤ２及びＳＯＤＣＣ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含む少なくとも３つの導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、ＯｓＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含む少なくとも３つの導入遺伝子を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、改変植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの目的遺伝子、少なくとも３つの目的遺伝子、少なくとも４つの目的遺伝子、または少なくとも５つの目的遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、改変植物は、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの目的遺伝子を含み得る。抗酸化物質は、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質であり得る。特定の実施形態では、改変植物は、ミトコンドリア抗酸化物質をコードする目的遺伝子及び細胞質抗酸化物質をコードする目的遺伝子を含む、少なくとも２つの目的遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、抗酸化物質は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ及び／またはＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼであり得る。特定の実施形態では、改変植物は、２つの抗酸化物質をコードする目的遺伝子を含む、少なくとも２つの目的遺伝子を含み得、２つの抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１及びＳＯＤ２；ＳＯＤＡ１及びＳＯＤＣＣ１；またはＳＯＤ２及びＳＯＤＣＣ１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、改変植物は、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＣＣ１をコードする目的遺伝子を含む、少なくとも３つの目的遺伝子を含む。特定の実施形態では、改変植物は、ＯｓＳＯＤＡ１、ＯｓＳＯＤ２、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする目的遺伝子を含む、少なくとも３つの目的遺伝子を含む。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0087】

細胞内イオン濃度を制御し得るタンパク質
細胞内イオン濃度を制御し得るタンパク質は、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、またはプロテインキナーゼを含む。

【0088】

植物は、低い細胞質ナトリウム濃度を維持するために２つの方策を使用する。ナトリウムは、細胞質からアポプラストまたは細胞外空間に排除することができる。あるいは、ナトリウムは、液胞に輸送され得、そこに蓄えられ、これは、ナトリウム区画化として既知である。細胞質ナトリウム濃度を低減させるための細胞膜及び液胞膜の両方の機序を利用すると、改変植物のストレス耐性を有利に増加させ得ることを、本発明者らは確認した。本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物を提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0089】

本発明は、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物も提供する。

【0090】

イオントランスポーター
イオントランスポーターは、イオン勾配を介して、または様々な供給源（アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、太陽光、及び他の酸化還元反応を含む）からのエネルギーを積極的に使用して、イオン、例えば、ナトリウムまたはカリウムを膜を越えて輸送し得る。本発明に使用されるイオントランスポーターは、活性イオントランスポーターであってよい。活性イオントランスポーターは、濃度勾配に逆らって植物細胞の細胞質からイオンを除去することが可能である。

【0091】

細胞膜に結合したナトリウム／水素アンチポーターは、細胞からナトリウムを排除するように作用する。ＳＯＳ１（塩類過敏症１）は、細胞質から過剰なナトリウムを押し出す細胞膜のナトリウム／水素アンチポーターである。ここで、いくつかの種の研究は、ＳＯＳ１が単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む高等植物で保存されていることを示している［７］。ＳＯＳ１は、また、植物の耐塩性に必須であることも以前に確認されている［８］。

【0092】

ナトリウムの区画化は、液胞またはアポプラストで生じ得る。植物の液胞は、植物のストレス応答において中心的な役割を果たす。植物細胞の総体積の８０％超を占め得る中心液胞は、液胞膜により周囲の細胞質から分離されており、液胞膜は、幅広いポンプ、キャリア、イオンチャネル、及び受容体を通して細胞質へ、及び細胞質から無機及び有機溶質の通過を制御する［１］。ＮＨＸ１（Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター１）は、液胞膜（液胞）のナトリウム／水素イオンエクスチェンジャーである。

【0093】

いくつかの実施形態では、イオントランスポーターは、ナトリウム／水素アンチポーターである。いくつかの実施形態では、イオントランスポーターは、細胞膜ナトリウム／水素アンチポーター、例えば、ＳＯＳ１である。いくつかの実施形態では、イオントランスポーターは、ナトリウム／水素イオンエクスチェンジャーである。いくつかの実施形態では、イオントランスポーターは、液胞膜ナトリウム／水素イオンエクスチェンジャー、例えば、ＮＨＸ１である。エンハンサーエレメントを使用して細胞膜イオントランスポーターと組み合わせて液胞膜イオントランスポーターの発現を変化させると、ナトリウムが細胞質から排除され区画化され得るので、耐塩性を有利に高め得ることを、本発明者らは確認している。

【0094】

それ故、特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも２つの目的遺伝子を含み得、目的遺伝子が、細胞膜ナトリウム／水素アンチポーターをコードする遺伝子、及び液胞膜ナトリウム／水素イオンエクスチェンジャーをコードする遺伝子を含み、細胞膜ナトリウム／水素アンチポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結され、液胞膜ナトリウム／水素イオンエクスチェンジャーをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。例えば、改変植物は、ＳＯＳ１及びＮＨＸ１をコードする遺伝子を含んでもよい。

【0095】

特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも２つの導入遺伝子を含み得、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞膜ナトリウム／水素アンチポーターをコードする導入遺伝子及び液胞膜ナトリウム／水素イオンエクスチェンジャーをコードする導入遺伝子を含む。例えば、トランスジェニック植物は、ＳＯＳ１及びＮＨＸ１をコードする導入遺伝子を含んでもよい。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＳＯＳ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＳＯＳ１（ＯｓＳＯＳ１）である。ＯｓＳＯＳ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＩＣＮ３；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ７ＸＢＦ９；配列番号９５；及び／または配列番号９６のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ５ＩＣＮ３及び／またはＱ７ＸＢＦ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ５ＩＣＮ３及び／またはＱ７ＸＢＦ９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＮＨＸ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＮＨＸ１（ＯｓＮＨＸ１）である。ＯｓＮＨＸ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＳＸＪ８；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＶＶＡ７；配列番号９７；及び／または配列番号９８のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８及び／またはＱ６ＶＶＡ７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８及び／またはＱ６ＶＶＡ７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0098】

高親和性カリウムトランスポーター（ＨＫＴ）は、植物細胞の細胞膜を通過するカチオン輸送を促進する重要なクラスの膜内在性タンパク質に属する。ＨＫＴ１（高親和性カリウムトランスポーター１）は、カリウム及びナトリウムを植物の木部から外へ輸送し、細胞の細胞質に戻す。ＨＫＴ１は、わずかに大きな活性部位があり、これにより、ナトリウムの輸送により適するようになる。ＨＫＴ１は、強力なナトリウムトランスポーターであるので、導入遺伝子または目的遺伝子であり得る。本発明の改変またはトランスジェニック植物にそれが含まれると、根のかなりの塩類レベルを固定し、植物の輸送系、それ故、植物の残部に塩類が入るのを防ぐことである。いくつかの実施形態では、イオントランスポーターは、高親和性カリウムトランスポーターである。特定の実施形態では、イオントランスポーターは、細胞膜高親和性カリウムトランスポーター、例えば、ＨＫＴ１である。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＨＫＴ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＨＫＴ１（ＯｓＨＫＴ１）である。ＯｓＨＫＴ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｄ９Ｓ３または配列番号９９のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、Ｑ０Ｄ９Ｓ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または導入遺伝子は、Ｑ０Ｄ９Ｓ３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0100】

プロテインキナーゼ
ＳＯＳ１の機能は、ＳＯＳ２（塩類過敏症２）で調節される。ＳＯＳ２は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＳＯＳ２の構成的発現は、ＳＯＳ１を構成的に活性化し、細胞から外への継続的な塩類輸送を可能にし、耐塩性を高めることが示されている［９］。プロテインキナーゼがイオントランスポーターを活性化し得、これにより、耐塩性の向上がもたらされるので、エンハンサーエレメントを使用して細胞膜イオントランスポーターなどの少なくとも１つのイオントランスポーターの発現を変化させることと組み合わせて、エンハンサーエレメントを使用してプロテインキナーゼの発現を変化させることが有利であり得ることを、本発明者らは確認した。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ、例えば、ＳＯＳ２である。いくつかの実施形態では、ＳＯＳ２は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＳＯＳ２（ＯｓＳＯＳ２）である。ＯｓＳＯＳ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６９Ｑ４７または配列番号１００のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、Ｑ６９Ｑ４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または導入遺伝子は、Ｑ６９Ｑ４７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１００と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、ＳＯＳ１及びＳＯＳ２をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含む。

【0101】

水素輸送ＡＴＰアーゼ及びピロホスファターゼ
ｐＨ勾配が細胞膜及び液胞膜にわたって存在することを確実にするので、改変またはトランスジェニック植物におけるナトリウム／水素アンチポーター及び水素輸送ＡＴＰアーゼ及びピロホスファターゼの発現を変化させることが有利であることを、本発明者らは確認している。ナトリウム／水素トランスポーターは、水素輸送ＡＴＰアーゼ及びピロホスファターゼにより生成されるｐＨ勾配を利用して、細胞質から外にナトリウムを輸送する。それ故、このｐＨ勾配は、細胞質から外へのナトリウム輸送を促進し、それにより改変またはトランスジェニック植物の耐塩性を向上させるのに役立つ。例えば、ＡＨＡファミリーは、細胞膜結合水素輸送ＡＴＰアーゼ（Ｈ＋－ＡＴＰアーゼ）であり、これは、ＡＨＡ１、ＡＨＡ２、及びＡＨＡ３を含む。それらの主な機能は、水素イオンを細胞膜を越えて、細胞から外に輸送することである。これは、電気化学的プロトン勾配、最終的には、プロトンの推進力を生成する。このプロトンの推進力は、電池のように機能する－水素イオンが、細胞から外へ強制的に押し出され、細胞外の水素イオンを細胞内のナトリウムイオンと容易に交換するためのエネルギーを提供する電気化学的勾配を生じる。

【0102】

水素輸送ＡＴＰアーゼ及びピロホスファターゼは、植物細胞の液胞膜の主要成分である［１］。ＶＨＡ－Ａ（液胞Ｈ＋－ＡＴＰアーゼサブユニットＡ１）は、ＡＴＰを分解して水素イオンを液胞内に輸送する液胞ＡＴＰアーゼである。これは、ナトリウムイオンと交換することができる液胞内の大量の水素イオンを増大させることにより、液胞膜全体でＳＯＳ１及びＡＨＡ３サイクルと同様の強力なプロトン推進力を生じる。これは、植物の耐塩性を有利に増加させると考えられる。

【0103】

いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御し得るタンパク質は、水素輸送ＡＴＰアーゼまたは水素輸送ピロホスファターゼである。いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御し得るタンパク質は、水素輸送ＡＴＰアーゼである。いくつかの実施形態では、水素輸送ＡＴＰアーゼは、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼまたは細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼである。

【0104】

特定の実施形態では、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＡＨＡ３である。いくつかの実施形態では、ＡＨＡ３は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＡＨＡ３（ＯｓＡＨＡ３）である。ＯｓＡＨＡ３は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ８Ｌ６Ｉ３または配列番号１０１のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１０１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0105】

特定の実施形態では、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＶＨＡ－Ａである。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ－Ａは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＶＨＡ－Ａ（ＯｓＶＨＡ－Ａ）である。ＯｓＶＨＡ－Ａは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６５１Ｔ８または配列番号１０２のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１０２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0106】

他の実施形態では、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼは、ＶＨＡ－Ｂである。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ－Ｂは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＶＨＡ－Ｂ（ＯｓＶＨＡ－Ｂ）である。ＯｓＶＨＡ－Ｂは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ７ＦＶ２５または配列番号１０３のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ７ＦＶ２５の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ７ＦＶ２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１０３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0107】

特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも２つの目的遺伝子を含み、少なくとも２つの目的遺伝子が、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子及びイオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの目的遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子及び細胞膜イオントランスポーター（例えば、ナトリウムトまたはカリウムトランスポーター）をコードする遺伝子を含む。例えば、目的遺伝子は、ＳＯＳ１及びＡＨＡ３をコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードする。例えば、目的遺伝子は、ＮＨＸ１及びＶＨＡ－Ａをコードし得る。さらなる実施形態では、改変植物は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子、及び液胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子を含む。例えば、目的遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ３、ＮＨＸ１、及びＶＨＡ－Ａをコードし得る。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0108】

特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも２つの導入遺伝子を含み、少なくとも２つの導入遺伝子が、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子及びイオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子及び細胞膜イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードする導入遺伝子を含む。例えば、導入遺伝子は、ＳＯＳ１及びＡＨＡ３をコードし得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードする。例えば、導入遺伝子は、ＮＨＸ１及びＶＨＡ－Ａをコードし得る。さらなる実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、少なくとも４つの導入遺伝子が、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、及び液胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子を含む。例えば、導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ３、ＮＨＸ１、及びＶＨＡ－Ａをコードし得る。

【0109】

本発明の例示的な改変及びトランスジェニック植物
本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含む改変植物を提供し、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。本発明は、少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック植物も提供し、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質は、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、またはプロテインキナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質である。

【0111】

いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子を含む、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上の目的遺伝子を含む。特定の実施形態では、改変植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする６つ以上の目的遺伝子及び抗酸化物質をコードする２つ以上の目的遺伝子を含む、８つ以上の目的遺伝子を含む。この段落及びこのセクション全体の実施形態のそれぞれにおいて、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0112】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上の導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする６つ以上の導入遺伝子及び抗酸化物質をコードする２つ以上の導入遺伝子を含む、８つ以上の導入遺伝子を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする２つ以上の目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする２つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、（ａ）イオントランスポーター及び水素輸送ＡＴＰアーゼ；（ｂ）イオントランスポーター及び水素輸送ピロホスファターゼ；（ｃ）イオントランスポーター及びプロテインキナーゼ；（ｄ）水素輸送ＡＴＰアーゼ及びプロテインキナーゼ；（ｅ）水素輸送ピロホスファターゼ及びプロテインキナーゼ；（ｆ）２つのイオントランスポーター、をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、イオントランスポーター及び水素輸送ＡＴＰアーゼ、またはイオントランスポーター及びプロテインキナーゼをコードする。例えば、導入遺伝子または目的遺伝子は、ＳＯＳ１及びＡＨＡ３；ＳＯＳ１及びＳＯＳ２；またはＮＨＸ１及びＶＨＡ－Ａをコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＡＨＡ３；ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＳＯＳ２；またはＯｓＮＨＸ１及びＯｓＶＨＡ－Ａをコードする。

【0114】

いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞内イオン濃度を制御する２つの細胞膜タンパク質をコードする遺伝子を含む、２つ以上の目的遺伝子を含む。他の実施形態では、改変植物は、細胞内イオン濃度を制御する２つの液胞膜タンパク質をコードする遺伝子を含む、２つ以上の目的遺伝子を含む。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0115】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御する２つの細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、２つ以上の導入遺伝子を含む。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞内イオン濃度を制御する２つの液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、２つ以上の導入遺伝子を含む。

【0116】

細胞膜及び液胞膜の両方の機序を使用して、細胞質ナトリウム濃度を低減させると、植物の耐塩性を有利に高め得ることを、本発明者らは確認した。従って、本発明は、少なくとも２つの導入遺伝子または目的遺伝子を含む、改変及びトランスジェニック植物を提供し、導入遺伝子または目的遺伝子は、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードし、導入遺伝子または目的遺伝子は、細胞内のイオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0117】

例えば、改変植物は、細胞膜イオントランスポーター及び液胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子を含む２つ以上の目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞膜イオントランスポーター及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子を含む２つ以上の目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子を含む２つ以上の目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変植物は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子を含む２つ以上の目的遺伝子を含む。例えば、目的遺伝子は、ＳＯＳ１及びＮＨＸ１；ＡＨＡ３及びＶＨＡ－Ａ；ＳＯＳ１及びＡＨＡ３；またはＮＨＸ１及びＡＨＡ３をコードする。特定の実施形態では、遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＮＨＸ１；ＯｓＡＨＡ３及びＯｓＶＨＡ－Ａ；ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＡＨＡ３；またはＯｓＮＨＸ１及びＯｓＡＨＡ３をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0118】

例えば、トランスジェニック植物は、細胞膜イオントランスポーター及び液胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子を含む２つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞膜イオントランスポーター及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子を含む２つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子を含む２つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子を含む２つ以上の導入遺伝子を含む。例えば、導入遺伝子は、ＳＯＳ１及びＮＨＸ１；ＡＨＡ３及びＶＨＡ－Ａ；ＳＯＳ１及びＡＨＡ３、またはＮＨＸ１及びＡＨＡ３をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＮＨＸ１；ＯｓＡＨＡ３及びＯｓＶＨＡ－Ａ；ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＡＨＡ３；またはＯｓＮＨＸ１及びＯｓＡＨＡ３をコードする。

【0119】

いくつかの実施形態では、改変植物は、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して、改変植物の耐塩性を増加させる少なくとも３つの目的遺伝子を含み得、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して、トランスジェニック植物の耐塩性を増加させる少なくとも３つの導入遺伝子を含み得る。

【0120】

改変植物またはトランスジェニック植物は、少なくとも３つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも３つの目的遺伝子または導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群から独立して選択され得るタンパク質をコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び液胞膜ＡＴＰアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び液胞膜イオントランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び液胞膜イオントランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜ナトリウムトランスポーター、液胞膜ナトリウムトランスポーター、及びカリウムトランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及びプロテインキナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及びプロテインキナーゼをコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0121】

改変植物は、少なくとも３つの目的遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも３つの目的遺伝子を含み、少なくとも３つの目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子；細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子；及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含む。例えば、改変植物は、少なくとも３つの目的遺伝子を含み得、少なくとも３つの目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子；液胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子；及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含む。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0122】

トランスジェニック植物は、少なくとも３つの導入遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも３つの導入遺伝子を含み、少なくとも３つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子；細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子、を含む。例えば、トランスジェニック植物は、少なくとも３つの導入遺伝子を含み得、少なくとも３つの導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子；液胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子；及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。

【0123】

改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも４つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも４つの目的遺伝子または導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群から選択することができるタンパク質をコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0125】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0126】

特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態では、植物の目的遺伝子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＳＯＳ１（細胞膜イオントランスポーター）、ＮＨＸ１（液胞膜イオントランスポーター）、ＨＫＴ１（カリウムトランスポーター）、及びＳＯＤＡ１（抗酸化物質）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含むイネ目的遺伝子を提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0127】

特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜体イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、及び細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子を含む。特定の実施形態では、植物の目的遺伝子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＳＯＳ１（細胞膜イオントランスポーター）、ＮＨＸ１（液胞膜イオントランスポーター）、ＨＫＴ１（カリウムトランスポーター）、及びＡＨＡ３（細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含むイネ目的遺伝子を提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＡＨＡ３をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0128】

特定の実施形態では、改変植物は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、セリンキナーゼ、及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子を含む。特定の実施形態では、植物の目的遺伝子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＳＯＳ１（細胞膜イオントランスポーター）、ＮＨＸ１（液胞膜イオントランスポーター）、ＳＯＳ２（セリンキナーゼ）、及びＶＨＡ－Ａ（液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも４つの目的遺伝子を含むイネ目的遺伝子を提供し、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＳＯＳ２、及びＯｓＶＨＡ－Ａをコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0129】

特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、少なくとも４つの導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＳＯＳ１（細胞膜イオントランスポーター）、ＮＨＸ１（液胞膜イオントランスポーター）、ＨＫＴ１（カリウムトランスポーター）、及びＳＯＤＡ１（抗酸化物質）をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする導入遺伝子を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子または導入遺伝子を含み、目的遺伝子または導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子または導入遺伝子を含み、目的遺伝子または導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び抗酸化物質をコードする。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子または導入遺伝子を含み、目的遺伝子または導入遺伝子が、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び抗酸化物質をコードする。

【0131】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも４つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子または導入遺伝子が、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも５つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも５つの目的遺伝子または導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群より選択され得るタンパク質をコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び少なくとも１つの抗酸化物質をコードする。例えば、遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、及びＳＯＤＡ１をコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。例えば、遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。例えば、遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＨＫＴ１、ＮＨＸ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードし得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも６つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも６つの目的遺伝子または導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群より選択され得るタンパク質をコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。例えば、目的遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。例えば、少なくとも６つの目的遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＨＫＴ１、ＮＨＸ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードする。

【0135】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質をコードし得る。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、プロテインキナーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、及び抗酸化物質をコードする。

【0136】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。例えば、目的遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードする。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、カリウムトランスポーター、液胞膜イオントランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。例えば、６つの目的遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＨＫＴ１、ＮＨＸ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１をコードし得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも７つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも７つの目的遺伝子または導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群より選択され得るタンパク質をコードする遺伝子または導入遺伝子を含む。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質をコードする。例えば、７つの目的遺伝子または導入遺伝子は、（ａ）ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＡ１；（ｂ）ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤＣＣ１；または、（ｃ）ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、及びＳＯＤ２をコードし得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、改変植物は、少なくとも８つの目的遺伝子を含み得、少なくとも８つの目的遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群から独立して選択され得るタンパク質をコードする。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。特定の実施形態では、目的遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び２つの抗酸化物質をコードする。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤＣＣ１をコードする。さらに特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＡＨＡ－３、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする。代替の特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤ２をコードする。さらに特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＡＨＡ－３、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードする。この段落の各実施形態では、目的遺伝子は、本明細書に開示のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0139】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、少なくとも８つの導入遺伝子を含み得、少なくとも８つの導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群より選択され得るタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び２つの抗酸化物質をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤＣＣ１をコードする。さらに特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＡＨＡ－３、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする。代替の特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤ２をコードする。さらに特定の実施形態では、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＡＨＡ－３、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２。

【0140】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、少なくとも９つの目的遺伝子または導入遺伝子を含み得、少なくとも９つの目的遺伝子または導入遺伝子が、独立して、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、プロテインキナーゼ、及び少なくとも１つの抗酸化物質からなる群より選択され得るタンパク質をコードし得る遺伝子または導入遺伝子を含む。これらのコードされたタンパク質は、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、または液胞膜タンパク質であり得る。特定の実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び３つの抗酸化物質をコードする。特定の実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びＳＯＤ２をコードする。

【0141】

追加の目的遺伝子及び導入遺伝子
いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）、酸素発生複合体、スクロースリン酸シンターゼ、及び／またはピロリンシンターゼをコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。以下のセクションの実施形態のそれぞれにおいて、目的遺伝子は、本明細書に開示されるように、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0142】

シトクロムＰ４５０
シトクロムＰ４５０は、葉のワックス生成の律速段階を触媒する酵素である。この酵素の発現を増加させることにより、葉中のワックスのレベルを増加させることができる。このワックスの増加により、植物の葉の葉肉細胞と空気の間の水分の損失が防止される。塩類レベルの高い海洋空気と葉肉のエアポケット内の水ポテンシャルの間には浸透圧の差が存在する。それ故、シトクロムＰ４５０をコードする導入遺伝子を含めること、またはシトクロムＰ４５０である目的遺伝子を標的とすることにより、改変またはトランスジェニック植物が海洋などの高塩類濃度地域で有利に成長することができることがある。それ故、いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｐ４５０（ＯｓＰ４５０）である。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＦＶＳ９または配列番号１１２を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｐ４５０である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子もしくは目的遺伝子が、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または導入遺伝子が、少なくとも７５％、８０％、８５％を有するアミノ酸配列を含む。、配列番号１１２に対して９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％の配列同一性。

【0143】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物が、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びＰ４５０をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＰ４５０をコードする導入遺伝子を含む。

【0144】

酸素発生複合体
細胞内の多くの場所に水素イオンを送り出すプロセスは、エネルギーを大量に消費し得る。光化学系２加水分解酵素から３つのサブユニット：ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱを構成的に生成すると、植物細胞が利用できるエネルギー量が増加させることにより、トランスジェニック植物の耐塩性を向上させるのに役立ち得る。組み合わせて完全な酵素ユニットを形成する場合、これらのサブユニットが水分子を分解して、水素イオン、電子、及び酸素を生成する。ＰｓｂＵ及びＰｓｂＶは、また、完全な酵素により水の還元のみを可能にするために、このシステムで使用され得る。

【0145】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、酸素発生複合体をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、酸素発生複合体は、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱから形成される。いくつかの実施形態では、酸素発生複合体は、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ、及びＰｓｂＶから形成される。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱをコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ及びＰｓｂＶをコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＰｓｂＯは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰｓｂＯ（ＯｓＰｓｂＯ）である。ＯｓＰｓｂＯは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ５ＪＶ９３または配列番号１０４のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子もしくは導入遺伝子が、Ａ５ＪＶ９３及び／または配列番号１０４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ａ５ＪＶ９３及び／または配列番号１０４と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＰｓｂＰは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰｓｂＰ（ＯｓＰｓｂＰ）である。ＯｓＰｓｂＰは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＸＰ＿００２８７６３７７．１；Ｑ０ＫＩＷ５；配列番号１０５のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子もしくは導入遺伝子が、ＸＰ＿００２８７６３７７．１；Ｑ０ＫＩＷ５；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、ＸＰ＿００２８７６３７７．１；Ｑ０ＫＩＷ５；配列番号１０５と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＰｓｂＱは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰｓｂＱ（ＯｓＰｓｂＱ）である。ＯｓＰｓｂＱは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ８３６４６または配列番号１０６のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子もしくは導入遺伝子が、Ｐ８３６４６及び／または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｐ８３６４６及び／または配列番号１０６と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＵは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰｓｂＵ（ＯｓＰｓｂＵ）である。

【0149】

スクロースリン酸シンターゼ
スクロース及びプロリンなどの浸透圧保護化合物の蓄積は、植物が高塩類濃度に適応するために重要である。スクロースは、ＵＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ、スクロースリン酸シンターゼ、及びスクロースホスファターゼの複合活性を通してヘキソースリン酸から誘導される。スクロースリン酸シンターゼは、スクロース生成の主要な制御点であるように見える［１０］。それ故、高レベルの塩類から保護するために、改変またはトランスジェニック植物においてスクロースリン酸シンターゼを発現させることが有利であることがある。

【0150】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、スクロースリン酸シンターゼをコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、スクロースリン酸シンターゼは、スクロースリン酸シンターゼ１、スクロースリン酸シンターゼ２、またはスクロースリン酸シンターゼ３である。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びスクロースリン酸シンターゼ１をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びスクロースリン酸シンターゼ２をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びスクロースリン酸シンターゼ３をコードする導入遺伝子を含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、スクロースリン酸シンターゼ１は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０ＪＧＫ４または配列番号１１３を有するＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａスクロースリン酸シンターゼ１である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｑ０ＪＧＫ４及び／または配列番号１１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、配列番号１１３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、スクロースリン酸シンターゼ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａスクロースリン酸シンターゼ１である。いくつかの実施形態では、スクロースリン酸シンターゼ２は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａスクロースリン酸シンターゼ２である。いくつかの実施形態では、スクロースリン酸シンターゼ３は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａスクロースリン酸シンターゼ３である。

【0153】

ピロリンシンターゼ
いくつかの植物は、高塩類濃度に応答して高レベルのプロリンを蓄積する。プロリンは、浸透圧保護剤として、酸化還元電位を調節するためのエネルギーの吸収源となることにより、または巨大分子を変性から保護する溶質として、作用すると考えられている。ストレス条件下では、プロリンの蓄積は、主に、デノボ合成によるものである。植物では、プロリンは、グルタミン酸またはオルニチンのいずれかから合成することができるが、塩類ストレス下では、グルタミン酸経路が主な経路である［１１］。デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼは、プロリンの生合成の律速段階を触媒する。この酵素の２つの形態であるデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２があり、これは、異なる細胞及び／または異なる細胞内位置に存在する。それ故、高レベルの塩類から保護するために、改変またはトランスジェニック植物においてデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼを発現させることが有利であることがある。

【0154】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、ピロリンカルボン酸シンターゼをコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ピロリンカルボン酸シンターゼは、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２である。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、目的遺伝子、またはＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２をコードする導入遺伝子を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１である。いくつかの実施形態では、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２である。いくつかの実施形態では、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａデルター１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ０４２２６または配列番号１１４を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子または目的遺伝子が、Ｏ０４２２６及び／または配列番号１１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、配列番号１１４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0156】

ＯＳＫ１
ＯＳＫ１は、スーパーオキシドジスムターゼ（例えば、ＳＯＤＣＣ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＡ１）の発現を調節する。それ故、高レベルの塩類から保護するために、改変またはトランスジェニック植物においてスーパーオキシドジスムターゼと組み合わせてＯＳＫ１を発現させることが有利であることがある。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、さらに、ＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、スーパーオキシドジスムターゼ、例えば、ＳＯＤＣＣ１、ＳＯＤ２、またはＳＯＤＡ１、をコードする目的遺伝子または導入遺伝子と組み合わせて、ＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＣＣ１、ＳＯＤ２、及びＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、ＶＨＡ－Ａ、ＮＨＸ１、ＨＫＴ１、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、ＳＯＤ２、及びＯＳＫ１をコードする目的遺伝子または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＯＳＫ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＺＲＪ１、Ｑ０ＤＧＩ１、Ｑ９ＺＴＦ６、及び／またはＱ８５２Ｑ２のポリペプチド配列を有し得るＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＯＳＫ１（ＯｓＯＳＫ１）である。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子が、Ｑ９ＺＲＪ１、Ｑ０ＤＧＩ１、Ｑ９ＺＴＦ６、もしくはＱ８５２Ｑ２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、Ｑ９ＺＲＪ１、Ｑ０ＤＧＩ１、Ｑ９ＺＴＦ６、及び／またはＱ８５２Ｑ２と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性のアミノ酸配列を含み得る。

【0157】

いくつかの実施形態では、ＯｓＰｓｂＱは、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、及び／または配列番号１１０のポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子または導入遺伝子が、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、及び／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または、導入遺伝子が、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、及び／または配列番号１１０と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0158】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰＥＲＫ１３をコードする導入遺伝子を含有しない。いくつかの実施形態では、改変植物における目的遺伝子は、ＰＥＲＫ１３ではない。

【0159】

プロモーター及びエンハンサーエレメント
プロモーターは、トランスジェニック植物におけるその発現を制御するために、導入遺伝子に作動可能に連結することができる。プロモーターは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドを含み得る。プロモーターは、導入遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端から少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約６００ヌクレオチド、少なくとも約７００ヌクレオチド、少なくとも約８００ヌクレオチド、少なくとも約９００ヌクレオチド、または少なくとも約１０００ヌクレオチド以内に位置し得る。

【0160】

導入遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターは、対応する遺伝子の植物ゲノムに天然に存在するプロモーター配列を含み得る－すなわち、導入遺伝子がＯｓＳＯＳ１の場合、プロモーターは、ＯｓＳＯＳ１に対するイネのゲノムに天然に存在するプロモーター配列を含み得る。あるいは、プロモーターは、特に設計されたプロモーター及び／または人工プロモーターであり得る。プロモーターは、植物内で導入遺伝子の発現レベルを空間的と時間的の両方で制御することができる。例えば、プロモーターは、植物の苗条、葉、種子、または根において導入遺伝子を特異的に発現するように設計することができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、苗条特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、または根特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、根特異的プロモーターであり得る。

【0161】

プロモーターは、植物の発芽時、植物の成熟時、植物の開花時、及び植物の結実時に、種子内で導入遺伝子を特異的に発育するように設計することができる。

【0162】

本明細書に記載のエンハンサーエレメントを内因性耐塩性遺伝子に作動可能に連結することにより内因性耐塩性遺伝子の発現を変化させ得るように、植物を改変することができることを、本発明者らは確認している。これは、耐塩性遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端にエンハンサーエレメントを挿入するか、または、内在性耐塩性遺伝子のイントロン内のオープンリーディングフレームの５’末端の下流にエンハンサーエレメントを挿入することにより達成することができる。エンハンサーエレメントは、改変植物における発現を制御するために、各目的遺伝子に作動可能に連結されている。エンハンサーエレメントは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドを含み得る。

【0163】

エンハンサーエレメントは、耐塩性遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端から少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約６００ヌクレオチド、少なくとも約７００ヌクレオチド、少なくとも約８００ヌクレオチド、少なくとも約９００ヌクレオチド、または少なくとも約１０００ヌクレオチド以内に位置し得る。耐塩性遺伝子は、ＳＯＳ１、ＡＨＡ－３、ＮＨＸ１、ＶＨＡ－Ａ、ＨＫＴ１、ＳＯＳ１、ＳＯＤＣＣ、及び／またはＳＯＤ２であり得る。これらの実施例はこれらの内因性耐塩性遺伝子の発現を変化させると、植物の耐塩性を改善し得ることを示す。いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントを内因性耐塩性遺伝子に作動可能に連結することは、（ａ）植物の種子からカルス形成を誘導すること；（ｂ）微粒子銃を使用して、マイクロキャリアでカルスを形質転換すること；（ｃ）形質転換カルスを生成することであって、ゲノムにエンハンサーエレメント配列を含む少なくとも２つの目的遺伝子がエンハンサーエレメント配列に作動可能に連結されているように、マイクロキャリアが、少なくとも２つの異なるＤＮＡ配列をそこに吸収させていることを含み得る。いくつかの場合では、ＤＮＡ配列は、（ｉ）少なくとも３つの耐塩性遺伝子のそれぞれの５’領域に対応する５’及び３’フランキング相同性アームまたはアダプター；ＤＲＥＢ２Ａ、またはＥＴＨもしくはＡＵＸプロモーター配列を含むエンハンサーエレメント（またはエンハンサーエレメントからの少なくとも５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド）を含む内部配列、を含み得る。次に、そのような手順は、（ｃ）形質転換カルスを成長培地中で回収して、耐塩性が改善された複数の改変植物細胞を含む多細胞構造を生成すること、を含み得る。

【0164】

いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、目的遺伝子のオープンリーディングフレームの５’の上流領域または５’末端に近位のイントロン領域に対する特異性を有するプログラム可能なヌクレアーゼをそこに吸収させている。プログラム可能なヌクレアーゼは、目的遺伝子の５’上流領域または目的遺伝子のオープンリーディングの５’末端に近位のイントロン領域に対するガイドＲＮＡと複合したクラスＩＩ、タイプＩＩまたはクラスＩＩ、タイプＶＣａｓヌクレアーゼを含み得る。プログラム可能なヌクレアーゼは、少なくとも３つの耐塩性遺伝子の５’領域、または目的遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端に近位のイントロン領域に対する特異性を有する転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター及びヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み得る。プログラム可能なヌクレアーゼは、少なくとも３つの耐塩性遺伝子の５’領域、または目的遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端に近位のイントロン領域に対する特異性を有するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含み得る。

【0165】

植物ホルモン（植物ホルモンとしても既知）は、植物の成長及び発育を調節し得るシグナル伝達分子である。植物は、オーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、サイトカイニン、サリチル酸、エチレン、ジャスモン酸塩、ブラシノステロイド、及びペプチドを含む多種多様なホルモンを生成する。いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、ホルモン応答性である。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードし、目的遺伝子は、ホルモン応答性エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードし、目的遺伝子は、ホルモン応答性エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、水素輸送ピロホスファターゼをコードし、目的遺伝子は、ホルモン応答性エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、プロテインキナーゼをコードし、目的遺伝子は、ホルモン応答性エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、抗酸化物質をコードし、目的遺伝子は、ホルモン応答性エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0166】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ホルモン応答性プロモーターである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、イオントランスポーター（例えば、ナトリウムまたはカリウムトランスポーター）をコードし、導入遺伝子は、ホルモン応答性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードし、導入遺伝子は、ホルモン応答性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、水素輸送ピロホスファターゼをコードし、導入遺伝子は、ホルモン応答性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、プロテインキナーゼをコードし、導入遺伝子は、ホルモン応答性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、抗酸化物質をコードし、導入遺伝子は、ホルモン応答性プロモーターに作動可能に連結されている。

【0167】

ホルモン応答性エンハンサーエレメントまたはプロモーターは、アブシジン酸（ＡＢＡ）、エチレン（ＥＴＨ）、ジベレリン（ＧＡ）、及びオーキシン（ＡＵＸ）、またはそれらの任意の組み合わせに応答し得る。いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントまたはプロモーターは、ＤＲＥＢ２Ａ、ＥＴＨ、もしくはＡＵＸプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。エンハンサーエレメントまたはプロモーターは、ＤＲＥＢ２Ａ、ＥＴＨ、またはＡＵＸプロモーターからの少なくとも６ヌクレオチドを含み得る。ＤＲＥＢ２Ａ、ＥＴＨ、及びＡＵＸのシーケンスが表１に示される。

【0168】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、イオントランスポーターをコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、水素輸送ピロホスファターゼをコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、プロテインキナーゼをコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、抗酸化物質をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0169】

特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＳ１をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＳ２をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＮＨＫ１をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＡＨＡ３をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＨＫＴ１をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＶＨＡ－Ａをコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＤＡ１をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＤ２をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、目的遺伝子は、ＳＯＤＣＣ１をコードし、目的遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0170】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、イオントランスポーターをコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、水素輸送ＡＴＰアーゼをコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、水素輸送ピロホスファターゼをコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、プロテインキナーゼをコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、抗酸化物質をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。

【0171】

特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＳ１をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＳ２をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＮＨＫ１をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＨＡ３をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＨＫＴ１をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＶＨＡ－Ａをコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＤＡ１をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＤ２をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＯＤＣＣ１をコードし、導入遺伝子は、アブシジン酸、エチレン、ジベレリン、及びオーキシン、またはそれらの任意の組み合わせに応答するプロモーターに作動可能に連結されている。

【0172】

いくつかの実施形態では、ホルモン応答性エンハンサーエレメントまたはプロモーターは、一般的な転写促進エレメント（例えば、それからの距離が１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド未満）に近位に調節される。そのような一般的な転写促進エレメントは、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＣＡＡＴ配列を含むが、これらに限定されない。一般的な転写促進エレメントは、表１に概説された配列のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0173】

いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントまたはプロモーターは、ＤＲＥＢ２Ａ、ＧＡ、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡＴＡ、ＴＡＴＡ、ＥＴＨ、ＡＲＥ、Ｅ２Ｆ－１、ＣＡＡＴ、ＴＧＡ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＡＵＸＣＯＭＰの群から選択されるプロモーターエレメントのうちの１つ以上を含み得る。これらのエレメントの配列が表１に示される。エンハンサーエレメントまたはプロモーターで使用することができる他の可能なプロモーターエレメントは、ＰＬＡＣＥデータベース［１２］、及び参考文献［１３］、［１４］、［１５］、［１６］、［１７］、［１８］、［１９］、［２０］、［２１］、［２２］、［２３］、［２４］、［２５］、及び［２６］に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

【表1】

【0174】

ホルモンの分布は、時間の経過とともに植物全体で空間的に変化する。図７は、特定のホルモンの分布が植物のライフサイクルを通じてどのように変化するかを示す。本発明者らは、植物内のホルモンの分布の変化が、目的遺伝子または導入遺伝子の発現を制御するために、利用することができることを見出している。例えば、植物全体の代わりに、特に、植物が塩類ストレスにさらされた場合の根において、目的遺伝子または導入遺伝子を発現するのが有利であることがある。その理由は、植物の残り、または植物の非塩類にさらされた部分における目的遺伝子または導入遺伝子の不必要な発現が、負のエネルギーコストを有することになるからである。

【0175】

例えば、オーキシンは、根の先端で非常に強く発現するが、発現は、根に向かってさらに減少する。オーキシンは、また、根の中心と比較して、根の外縁で多く発現する。このオーキシン分布を使用して、発明者らは、根の先端でＳＯＳ１機序（ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、及びＡＨＡ３）の発現が最も活発になるように誘発し得ることを見出している。これにより、根が塩水を検出すると、ほとんどのＳＯＳ１が生成され、塩水浸漬では、一貫してＳＯＳ１が存在することを見出している。ＳＯＳ１分布に沿って根の先端まで移動し、植物／茎の中心から離れるにつれて、それは、塩類が下に移動するための経路も作成する。いくつかの実施形態では、ＳＯＳ１遺伝子、ＳＯＳ２遺伝子、及び／またはＡＨＡ３遺伝子は、オーキシン応答性プロモーターエレメントを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＳＯＳ１導入遺伝子、ＳＯＳ２導入遺伝子、及び／またはＡＨＡ３導入遺伝子は、オーキシン応答性プロモーターエレメントを含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0176】

植物のライフサイクル全体にわたるホルモンの分布の変化を利用することができ、その結果、特定の酵素が必要ない時に、エネルギーを保存することができる。例えば、抗酸化酵素がジベレリンプロモーターに作動可能に連結されている場合、それらは、発芽から植物の成長の栄養部分及び開花部分を経て発現されるであろう。これは、塩類管理システムが確立されるまで、植物の生育初期から植物に保護をもたらす。

【0177】

複数の目的遺伝子、導入遺伝子は、確実に同時に発現されるように、同じまたは類似のエンハンサーエレメントまたはプロモーターに作動可能に連結させることができる。例えば、改変植物が抗酸化物質をコードする複数の目的遺伝子を含有する場合、各抗酸化物質は、確実にそれらの発現が遍在させるように、同じまたは類似のエンハンサーエレメントに作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、目的遺伝子または抗酸化物質をコードする導入遺伝子は、ＧＡ、ＴＡＴＡ、ＤＲＥＢ２Ａ、及びＥＴＨエレメントを含むか、または配列番号１６～１８の配列を含む同じエンハンサーエレメントまたはプロモーターに作動可能に連結されている。

【0178】

ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、及びＡＨＡ３は、相乗効果群として一緒に機能する。従って、特定の実施形態では、改変植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、及びＡＨＡ３をコードする目的遺伝子を含み、これらの目的遺伝子は、それらが確実に同時に発現されるように同様のエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。従って、特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、及びＡＨＡ３をコードする導入遺伝子を含み、これらの導入遺伝子は、それらが確実に同時に発現されるように同様のプロモーターに作動可能に連結されている。これら３つの遺伝子は、相乗的なグループで作用し、それ故、類似したエンハンサーエレメントまたはプロモーターを使用することが有利である。特定の実施形態では、改変植物は、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、及びＯｓＡＨＡ３をコードする目的遺伝子を含み；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、及びＯｓＡＨＡ３をコードする導入遺伝子を含み；ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0179】

いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、配列番号１０～１８のいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９９％同一性を有する配列、または実質的に同一な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物がＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａである場合、プロモーターは、配列番号１０～１８のいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列、または実質的に同一の配列を有し得る。特定の実施形態では、植物細胞が、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａである場合、プロモーターは、配列番号１０～１８の配列を有する。

【0180】

特定の実施形態では、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡーＡ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／またはＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0181】

特定の実施形態では、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、及び／または、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号１８を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0182】

いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、表２に列挙される配列番号８２～９１のいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列、または実質的に同一の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ種である場合、プロモーターは、表２に列挙される配列番号８２～９１のいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列、または実質的に同一の配列を含み得る。

【0183】

特定の実施形態では、ＢｏＳＯＳ１遺伝子は、配列番号８４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＳ２遺伝子は、配列番号８５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＡＨＡ３遺伝子は、配列番号８６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＶＨＡ－Ａ遺伝子は、配列番号８３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＮＨＸ１遺伝子は、配列番号８２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＨＫＴ１遺伝子は、配列番号８７を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＤＡ１遺伝子は、配列番号８９を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＤ２遺伝子は、配列番号８８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＢｏＣｕＺｎ ＳＯＤ遺伝子は、配列番号９０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／またはＢｏＯＳＫ１遺伝子は、配列番号９１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0184】

特定の実施形態では、ＢｏＳＯＳ１導入遺伝子は、配列番号８４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＳ２導入遺伝子は、配列番号８５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＡＨＡ３導入遺伝子は、配列番号８６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＶＨＡ－Ａ導入遺伝子は、配列番号８３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＮＨＸ１導入遺伝子は、配列番号８２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＨＫＴ１導入遺伝子は、配列番号８７を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＤＡ１導入遺伝子は、配列番号８９を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＳＯＤ２導入遺伝子は、配列番号８８を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＢｏＣｕＺｎ ＳＯＤ導入遺伝子は、配列番号９０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、及び／またはＢｏＯＳＫ１導入遺伝子は、配列番号９１を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【表2-1】

【表2-2】

【0185】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネを提供し、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子は、Ｑ５ＩＣＮ３またはＱ７ＸＢＦ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、Ｑ６９Ｑ４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８またはＱ６ＶＶＡ７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、Ｑ０Ｄ９Ｓ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、Ｑ４３１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、Ｑ１０ＰＷ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0186】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、Ｑ５ＩＣＮ３またはＱ７ＸＢＦ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、Ｑ６９Ｑ４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８またはＱ６ＶＶＡ７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、Ｑ０Ｄ９Ｓ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、Ｑ４３１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、Ｑ１０ＰＷ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号１８を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0187】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネを提供し、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子は、Ｑ５ＩＣＮ３またはＱ７ＸＢＦ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、Ｑ６９Ｑ４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８またはＱ６ＶＶＡ７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、Ｑ０Ｄ９Ｓ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、Ｑ４３１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、Ｑ０ＤＲＶ６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号１７を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0188】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、Ｑ５ＩＣＮ３またはＱ７ＸＢＦ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、Ｑ６９Ｑ４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、Ｑ８Ｌ６Ｉ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、Ｑ６５１Ｔ８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、Ｑ９ＳＸＪ８またはＱ６ＶＶＡ７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、Ｑ０Ｄ９Ｓ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、Ｑ４３１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、Ｑ０ＤＲＶ６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号１７を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0189】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネを提供し、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0190】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも８つの導入遺伝子を含むトランスジェニックイネを提供し、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号１２を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１３を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１４を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１１を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号１０を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号１５を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号１６を含むプロモーターに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号１８を含むプロモーターに作動可能に連結されている。

【0191】

改変植物、改変植物部位、及び改変多細胞構造、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物部位、及びトランスジェニック多細胞構造
改変及びトランスジェニック植物
いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、被子植物であり得る。被子植物は、単子葉被子植物及び双子葉被子植物の両方を含む。単子葉植物の被子植物は、穀物、例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属（サトウキビ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、キビ、オートムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（ライムギ）、モロコシ属（モロコシ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属（コムギ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。双子葉被子植物は、野菜作物、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、ケール）、グリシン（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ－ダイズ）、Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ（ヤエナリ）、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ（キヌア）、Ｓｏｊａ、またはＳｏｌａｎｕｍ（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ－トマト）を含む。

【0192】

特定の実施形態では、改変植物は、改変イネである。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、トランスジェニックイネである。本発明で使用することができる可能なイネ品種は、以下を含む：Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｄｉｃｈｒｏａ、Ｅａｒｌｙ Ｓｕｔａｒｓａｒ、Ｈｕｎａｎ Ｅａｒｌｙ Ｄｗａｒｆ、Ｊａｖａ、Ｋｅｎｄｚｏ、Ｋｏｎｏｓｕ＃２、Ｋｕｒｕｍｉｗａｓｅ、Ｋｗａｎｔｏ Ｗａｓｅ、Ｎｏｖｅｌｌｉ Ｇｉｇａｎｔｅ、Ｏｋｕｒｏ Ｍｏｃｈｉ、Ｐｒｉｍａｎｙｃｈｓｋｉｊ、Ｓｅｎｓｈｏ Ｔａｎｅ、Ｖｅｎｅｒｅ Ｉｔａｌｉａｎ Ｂｌａｃｋ Ｒｉｃｅ、Ｚｈｅ７３３、Ｃｈｏ Ｓｅｕｎ Ｚｏ Ｓａｅｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ｄａｉｄｏ、Ｍａｍｏｒｉａｋａ、Ｄｕｂｏｒｓｋｉａｎ、ユキヒカリ、ハヤユキ、Ｔｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ、ＭＨＣ－２、ＴＨ３－５、Ｈｏ Ｐｈａｔ３。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、イネ品種ハヤユキ、ＴＨ３－５、Ｔｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ、ＭＨＣ２、及びＨａ Ｐｈａｔ３、Ｊａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａである。特定の実施形態では、改変イネは、イネ品種ハヤユキ改変植物である。特定の実施形態では、トランスジェニックイネは、イネ品種ハヤユキトランスジェニック植物である。

【0193】

上述の目的遺伝子または導入遺伝子は、任意の植物種に由来し得る。例えば、目的遺伝子または導入遺伝子は、イネ遺伝子、トウモロコシ遺伝子、サトウキビ遺伝子、オオムギ遺伝子、キビ遺伝子、オートムギ遺伝子、ライムギ遺伝子、モロコシ遺伝子、コムギ遺伝子、ケール遺伝子、ダイズ遺伝子、ヤエナリ遺伝子、キヌア遺伝子、またはトマト遺伝子であってよい。

【0194】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物と同じ種に由来する導入遺伝子を含む。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物中に存在する導入遺伝子のオルソログなどのトランスジェニック植物とは異なる種に由来する導入遺伝子を含む。導入遺伝子が、トランスジェニック植物と同じ種に由来する場合、導入遺伝子としてのその挿入により、遺伝子の追加のコピーが植物内に存在することが可能になり、及び／または、導入遺伝子が、発現レベルまたはパターンが内因性遺伝子の発現パターンまたはレベルとは異なることを可能にする内因性プロモーターとは異なるプロモーターの制御下で挿入される。

【0195】

特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、イネ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックイネである。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、トウモロコシ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、サトウキビ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックサトウキビ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、オオムギ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックオオムギ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、キビ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックキビ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、オートムギ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックオートムギ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ライムギ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックライムギ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、モロコシ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックモロコシ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、コムギ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックコムギ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ケール遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックケール植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ダイズ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックダイズ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ヤエナリ遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックヤエナリ植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、キヌア遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックキヌア植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、トマト遺伝子である導入遺伝子を含むトランスジェニックトマト植物である。

【0196】

改変植物、植物部位、及び多細胞構造は、相同組み換えを伴うプロセスで生成されるものではない。本発明による改変植物、植物部位、及び多細胞構造、ならびに種子は、本質的に生物学的なプロセスで生成されるものではない。トランスジェニック植物、植物部位、及び多細胞構造は、相同組み換えを伴うプロセスで生成されるものではない。本発明によるトランスジェニック植物、植物部位、及び多細胞構造、ならびに種子は、本質的に生物学的プロセスで生成されるものではない。

【0197】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、約１グラム／リットル（ｇ／Ｌ）、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ、約１９ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ、約２２ｇ／Ｌ、約２３ｇ／Ｌ、約２４ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約２６ｇ／Ｌ、約２７ｇ／Ｌ、約２８ｇ／Ｌ、約２９ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約３２ｇ／Ｌ、約３４ｇ／Ｌ、約３６ｇ／Ｌ、約３８ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４２ｇ／Ｌ、約４４ｇ／Ｌ、約４６ｇ／Ｌ、約４８ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。特定の実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、約１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、または３５ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。さらに特定の実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、約３５ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。その理由は、海洋塩類濃度より高いためからである。

【0198】

本発明の改変及びトランスジェニック植物は、同じ種の野生型植物と比較して耐塩性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、野生型植物の成長速度と比較して、特定の塩類濃度またはＥＣｅを有する培地中で高い成長速度を有する。改変またはトランスジェニック植物が成長し得る培地は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）または電気伝導度（ＥＣ）が、少なくとも約１．７デシジーメンス／メートル（ｄＳ／ｍ）、少なくとも約２ｄＳ／ｍ、少なくとも約４ｄＳ／ｍ、少なくとも約６ｄＳ／ｍ、少なくとも約８ｄＳ／ｍ、少なくとも約１０ｄＳ／ｍ、少なくとも約１２ｄＳ／ｍ、少なくとも約１４ｄＳ／ｍ、少なくとも約１６ｄＳ／ｍ、少なくとも約１８ｄＳ／ｍ、少なくとも約２０ｄＳ／ｍ、少なくとも約２２ｄＳ／ｍ、少なくとも約２４ｄＳ／ｍ、少なくとも約２６ｄＳ／ｍ、少なくとも約２８ｄＳ／ｍ、少なくとも約３０ｄＳ／ｍ、少なくとも約３２ｄＳ／ｍ、少なくとも約３４ｄＳ／ｍ、少なくとも約３６ｄＳ／ｍ、少なくとも約３８ｄＳ／ｍ、少なくとも約４０ｄＳ／ｍ、少なくとも約４２ｄＳ／ｍ、少なくとも約４４ｄＳ／ｍ、少なくとも約４６ｄＳ／ｍ、少なくとも約４８ｄＳ／ｍ、または少なくとも約５０ｄＳ／ｍであり得る。いくつかの実施形態では、培地は、液体である（例えば、水耕栽培方策の場合）。いくつかの実施形態では、培地は、固体（例えば、土壌、砂）である。いくつかの実施形態では、培地は、半固体である。

【0199】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、塩類培地中では、非塩類培地中の成長速度と等しいか、またはそれを超える成長速度を有する。塩類培地が、「軽度の塩類濃度」（例えば、飽和ペースト抽出物（ＥＣ_e）または液体ＥＣの電気伝導度が４～８ｄＳ／ｍである）、「中等度の塩類濃度」（例えば、飽和ペースト抽出物（ＥＣ_e）または液体ＥＣが８～１６ｄＳ／ｍ）、または「重度の塩類濃度」（飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）または液体ＥＣが１６ｄＳ／ｍ超であるものとして定義することができる）であり得る。非塩類培地は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）または液体ＥＣが、４ｄＳ／ｍ未満、３ｄＳ／ｍ未満、２ｄＳ／ｍ未満、１．７ｄＳ／ｍ未満、または１．５ｄＳ／ｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、塩類培地中の成長率は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、１５０％、２００％以上である。

【0200】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、特定の閾値塩類濃度（ＥＣｔ）、または高い閾値塩類濃度を有する。いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、閾値塩類濃度が、少なくとも約６ｄＳ／ｍ、少なくとも約６．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約６．７ｄＳ／ｍ、少なくとも約７ｄＳ／ｍ、少なくとも約７．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約８ｄＳ／ｍ、少なくとも約８．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約９ｄＳ／ｍ、少なくとも約９．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１０ｄＳ／ｍ、少なくとも約１０．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１１ｄＳ／ｍ、少なくとも約１１．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１２ｄＳ／ｍ、少なくとも約１２．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１３ｄＳ／ｍ、少なくとも約１３．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１４ｄＳ／ｍ、少なくとも約１４．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１５．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１６ｄＳ／ｍ、少なくとも約１６．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１７ｄＳ／ｍ、少なくとも約１７．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約１８ｄＳ／ｍ、少なくとも約１８．５ｄＳ／ｍ；少なくとも約１９ｄＳ／ｍ、少なくとも約１９．５ｄＳ／ｍ、少なくとも約２０ｄＳ／ｍ、少なくとも約２１ｄＳ／ｍ、少なくとも約２２ｄＳ／ｍ、少なくとも約２３ｄＳ／ｍ、少なくとも約２４ｄＳ／ｍ、少なくとも約２５ｄＳ／ｍ、少なくとも約２６ｄＳ／ｍ、少なくとも約２７ｄＳ／ｍ、少なくとも約２８ｄＳ／ｍ、少なくとも約２９ｄＳ／ｍ、ｏｒ少なくとも約３０ｄＳ／ｍ以上である。いくつかの実施形態では、上昇した閾値塩類濃度は、ゲノム編集のない同じ植物種または栽培品種と比較して評価される。いくつかの実施形態では、閾値塩類濃度は、少なくとも約１ｄＳ／ｍ、少なくとも約２ｄＳ／ｍ、少なくとも約３ｄＳ／ｍ、少なくとも約４ｄＳ／ｍ、少なくとも約５ｄＳ／ｍ、少なくとも約６ｄＳ／ｍ、少なくとも約７ｄＳ／ｍ、少なくとも約８ｄＳ／ｍ、少なくとも約９ｄＳ／ｍ、少なくとも約１０ｄＳ／ｍ、少なくとも約１１ｄＳ／ｍ、少なくとも約１２ｄＳ／ｍ、少なくとも約１３ｄＳ／ｍ、少なくとも約１４ｄＳ／ｍ、または少なくとも約１５ｄＳ／ｍ以上上昇する。

【0201】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、収量対塩類濃度（ＥＣｅ）プロットの特定の傾き（複数可）、または収量対塩類濃度（ＥＣｅ）プロットの減少した傾き（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、減少した傾きは、ゲノム編集のない同じ植物種または栽培品種と比較して評価される。いくつかの実施形態では、傾きは、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約１％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約１．５％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約２．０％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約２．５％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約３．０％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約３．５％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約４．０％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約４．５％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約５．０％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約５．５％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約６．０％、ｄＳ／ｍ当たり少なくとも約８％、またはｄＳ／ｍ当たり少なくとも約１０％以上減少する。収量対塩類濃度（ＥＣｅ）プロットの例が、図８に示され得る。

【0202】

いくつかの実施形態では、改変またはトランスジェニック植物が、成熟植物として特定のデンプン含有量を有するか、または、成熟植物の種子もしくは根が、特定のデンプン含有量を有し得る。いくつかの実施形態では、成熟植物の植物、根、果実、または種子は、少なくとも約２０重量％のデンプン、少なくとも約２５重量％のデンプン、少なくとも約３０重量％のデンプン、少なくとも約３５重量％のデンプン、少なくとも約４０重量％のデンプン、少なくとも約４５重量％のデンプン、少なくとも約５０重量％のデンプン、少なくとも約５６重量％のデンプン、少なくとも約６０重量％のデンプン、少なくとも約６５重量％のデンプン、少なくとも約７０重量％のデンプン、少なくとも約７５重量％のデンプン、もしくは少なくとも約８０重量％のデンプン、またはそれ以上を有し得る。デンプンは、アミロースまたはその誘導体であり得る。

【0203】

改変及びトランスジェニック植物部位
本発明は、本発明の改変またはトランスジェニック植物の部位も提供する。例えば、植物部位は、細胞、種子、葉、苗条、茎、または根であり得る。特定の実施形態では、植物部位は、種子または細胞である。従って、種子などの植物部位は、改変またはトランスジェニック植物について上述したように、目的遺伝子または導入遺伝子の任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、種子は、少なくとも２つの目的遺伝子を含み、第１の遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードし、第２の遺伝子が、抗酸化物質をコードし、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。他の実施形態では、種子は、少なくとも２つの目的遺伝子を含み、第１及び第２の目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードし、第１の目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードし、第２の目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードし、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0204】

他の実施形態では、種子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、種子は、イネ種子であり、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。他の実施形態では、種子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、種子は、イネ種子であり、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＡＨＡ３をコードし、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0205】

例えば、種子は、少なくとも２つの導入遺伝子を含み、第１の導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードし、第２の導入遺伝子が、抗酸化物質をコードする。他の実施形態では、種子は、少なくとも２つの導入遺伝子を含み、第１及び第２の導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードし、第１の導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードし、第２の導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする。他の実施形態では、種子は、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、種子が、イネ種子であり、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする。

【0206】

いくつかの実施形態では、改変イネ種子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0207】

いくつかの実施形態では、改変イネ種子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＡＨＡ３をコードし；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0208】

いくつかの実施形態では、改変イネ種子は、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＳＯＳ２、及びＯｓＶＨＡ－Ａをコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0209】

いくつかの実施形態では、イネ種子は、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0210】

特定の実施形態では、改変イネ種子は、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし；ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0211】

特定の実施形態では、イネ種子は、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし；ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0212】

特定の実施形態では、改変イネ種子は、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0213】

他の実施形態では、イネ種子は、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、種子は、約１グラム／リットル（ｇ／Ｌ）、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ、約１９ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ、約２２ｇ／Ｌ、約２３ｇ／Ｌ、約２４ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約２６ｇ／Ｌ、約２７ｇ／Ｌ、約２８ｇ／Ｌ、約２９ｇ／Ｌ、または約３０ｇ／Ｌ、約３２ｇ／Ｌ、約３４ｇ／Ｌ、約３６ｇ／Ｌ、約３８ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４２ｇ／Ｌ、約４４ｇ／Ｌ、約４６ｇ／Ｌ、約４８ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。特定の実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、約１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、または３５ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。さらに具体的な実施形態では、改変またはトランスジェニック植物は、約３５ｇ／Ｌを超える塩類濃度を有する培地中で成長することが可能である。その理由は、海洋塩類濃度より高いためからである。培地は、飽和ペースト抽出物の電気伝導度（ＥＣ_e）または電気伝導度（ＥＣ）が、少なくとも約１．７デシジーメンス／メートル（ｄＳ／ｍ）、少なくとも約２ｄＳ／ｍ、少なくとも約４ｄＳ／ｍ、少なくとも約６ｄＳ／ｍ、少なくとも約８ｄＳ／ｍ、少なくとも約１０ｄＳ／ｍ、少なくとも約１２ｄＳ／ｍ、少なくとも約１４ｄＳ／ｍ、少なくとも約１６ｄＳ／ｍ、少なくとも約１８ｄＳ／ｍ、少なくとも約２０ｄＳ／ｍ、少なくとも約２２ｄＳ／ｍ、少なくとも約２４ｄＳ／ｍ、少なくとも約２６ｄＳ／ｍ、少なくとも約２８ｄＳ／ｍ、少なくとも約３０ｄＳ／ｍ、少なくとも約３２ｄＳ／ｍ、少なくとも約３４ｄＳ／ｍ、少なくとも約３６ｄＳ／ｍ、少なくとも約３８ｄＳ／ｍ、少なくとも約４０ｄＳ／ｍ、少なくとも約４２ｄＳ／ｍ、少なくとも約４４ｄＳ／ｍ、少なくとも約４６ｄＳ／ｍ、少なくとも約４８ｄＳ／ｍ、または少なくとも約５０ｄＳ／ｍであり得る。いくつかの実施形態では、培地は、液体である（例えば、水耕栽培方策の場合）。いくつかの実施形態では、培地は、固体（例えば、土壌、砂）である。いくつかの実施形態では、培地は、半固体である。いくつかの実施形態では、種子は、少なくとも約２０重量％のデンプン、少なくとも約２５重量％のデンプン、少なくとも約３０重量％のデンプン、少なくとも約３５重量％のデンプン、少なくとも約４０重量％のデンプン、少なくとも約４５重量％のデンプン、少なくとも約５０重量％のデンプン、少なくとも約５６重量％のデンプン、少なくとも約６０重量％のデンプン、少なくとも約６５重量％のデンプン、少なくとも約７０重量％のデンプン、少なくとも約７５重量％のデンプン、もしくは少なくとも約８０重量％のデンプン、またはそれ以上を有し得る。デンプンは、アミロースまたはその誘導体であり得る。

【0215】

多細胞構造
本発明は、本発明の１つ以上の植物細胞を含む多細胞構造を提供する（すなわち、多細胞構造は、改変またはトランスジェニック植物について上述された目的遺伝子または導入遺伝子の任意の組み合わせを有し得る１つ以上の植物細胞を含む）。多細胞構造は、本明細書に記載される１つ以上の植物細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官、植物部位、植物生殖材料、または培養植物組織であり得る。多細胞構造は、本明細書に記載の１つ以上の植物細胞を含む、葉、苗条、種子、カルス、苗木、花、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された芽であり得る。本明細書で使用される場合、「カルス」という用語は、一般に、胚形成カルスなどの再生可能な植物組織を含むことが意図される。本明細書で使用される場合、「苗木」は、一般に、珠芽として使用される若いまたは小さな植物を含む。苗木は、組織培養または細胞培養で無性的に生成され得る。本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された芽」は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた頂端芽及び腋生芽を含む。植物の頂端芽及び腋生芽は、花、葉、または苗条に発育し得る維管束植物の茎にある小さな末端または側方の突起である。植物の芽は、分裂組織から生じ、重なり合った未熟な葉または花弁で構成され得る。多細胞構造は、本明細書に記載の植物に由来する葉、苗条、種子、カルス、苗木、花、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された芽であり得る。多細胞構造は、本明細書に記載の植物に由来する植物全体、植物組織、植物器官、植物部位、植物生殖物質、または培養植物組織であり得る。

【0216】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0217】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＡＨＡ３をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0218】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＳＯＳ２、及びＯｓＶＨＡ－Ａをコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0219】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0220】

特定の実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0221】

特定の実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0222】

特定の実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0223】

他の実施形態では、多細胞構造は、１つ以上の植物細胞を含み、１つ以上の植物細胞が、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0224】

改変植物の生成方法
本発明は、本発明による改変植物、植物部位または多細胞構造を作成する方法を提供し、方法は、ｉ）本明細書に記載の少なくとも２つのエンハンサーエレメントを植物の細胞に導入するステップであって、エンハンサーエレメントが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように、植物の細胞のゲノムに組み込まれ、及びｉｉ）細胞を再生して、細胞から改変植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションにより細胞に導入される。特定の実施形態では、エンハンサーエレメントは、微粒子銃で細胞に導入される。

【0225】

プログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ＣｐｆＩ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、正確なゲノム編集が行われることを可能にする。それ故、特定の実施形態では、本発明による改変植物、植物部位、または多細胞構造を作成する方法は、以下を含む：
（ａ）種子からカルス形成を誘導するステップ、
（ｂ）マイクロキャリア上、本明細書に記載のエンハンサーエレメント、ガイドＲＮＡ、及び１つ以上のヌクレアーゼ（複数可）を沈殿させるステップ、
（ｃ）微粒子銃を使用してマイクロキャリアでカルスを形質転換して、形質転換カルスを生成するステップであって、エンハンサーエレメントが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように、改変植物、植物部位、または多細胞構造のゲノムに組み込まれ、
（ｄ）形質転換カルスを回収して、少なくとも２つの目的遺伝子を含む多細胞構造を生成するステップであって、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている
。

【0226】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、本明細書に記載の１つ以上の植物細胞を含む、改変植物、植物組織、植物器官、植物部位、植物生殖材料、または培養植物組織に再生される。特定の実施形態では、多細胞構造は、改変植物に再生される。いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、植物のゲノムに安定して組み込まれる。

【0227】

いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはプラスミドである。特定の実施形態では、エンハンサーエレメントは、ＤＮＡである。ＤＮＡが細胞外と、細胞質及び核内の両方で安定性が高く、製造中にエラーが発生しにくく、Ｃａｓ切断部位の修復中にエラーが発生しにくいので、ＲＮＡではなくＤＮＡが使用され得る。ＤＮＡがゲノムへの安定した組み込みを提供するので、プラスミドではなくＤＮＡが使用され得る。ＤＮＡは、多くの場合、より小さな挿入で組み込まれ得る、何世代にもわたって検出ないままで、それにより、新しい生物及びその後の世代の永続的な特徴となることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素と組み合わせると、ＤＮＡ挿入は、挿入を宿主ゲノムに安全に組み込み、任意のビヒクルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの組み込み、または切断がゲノムで行われたことを示す任意のサインが顕著に存在しない。はるかに大きなプラスミド構造とは対照的に、これらの小さなＤＮＡ挿入を使用する安全性は、細胞へのプラスミドＤＮＡの導入のいくつかの予測不可能な結果と比較して、挿入／影響を受けた遺伝子の正確な意図された出力を生成する正確及び精密な挿入をもたらす。

【0228】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。

【0229】

いくつかの実施形態では、改変植物、植物部位、または多細胞構造は、相同組み換えを含むプロセスにより生成されず、または本質的に生物学的なプロセスで生成されない。

【0230】

トランスジェニック植物の生成方法
本発明は、本発明によるトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造を作成する方法を提供し、方法は、ｉ）本明細書に記載の少なくとも２つの導入遺伝子を、植物の細胞に導入するステップであって、導入遺伝子が、植物の細胞のゲノムに安定して組み込まれ、及び、ｉｉ）細胞を再生して、細胞からトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションで細胞に導入される。特定の実施形態では、導入遺伝子は、微粒子銃で細胞に導入される。

【0231】

プログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ＣｐｆＩ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、正確なゲノム編集が行われることを可能にする。それ故、特定の実施形態では、本発明によるトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造を作成する方法は、以下を含む：
（ａ）種子からカルス形成を誘導するステップ、
（ｂ）マイクロキャリア上にポリヌクレオチド配列、ガイドＲＮＡ、及びヌクレアーゼを沈殿させるステップであって、ポリヌクレオチド配列が、本明細書に記載の少なくとも２つの導入遺伝子を含み、
（ｃ）微粒子銃を使用してマイクロキャリアでカルスを形質転換して、形質転換カルスを生成するステップであって、ポリヌクレオチド配列が、トランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造のゲノムに組み込まれ、
（ｄ）形質転換カルスを回収して、少なくとも２つの導入遺伝子を含む多細胞構造を生成するステップ。

【0232】

いくつかの実施形態では、多細胞構造は、本明細書に記載の１つ以上の植物細胞を含むトランスジェニック植物、植物組織、植物器官、植物部位、植物生殖材料、または培養植物組織に再生される。特定の実施形態では、多細胞構造は、トランスジェニック植物に再生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、植物のゲノムに安定して組み込まれる。

【0233】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはプラスミドである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＤＮＡが細胞外と、細胞質及び核内の両方で安定性が高く、製造中にエラーが発生しにくく、Ｃａｓ切断部位の修復中にエラーが発生しにくいので、ＲＮＡではなくＤＮＡが使用され得る。ＤＮＡがゲノムへの安定した組み込みを提供するので、プラスミドではなくＤＮＡが使用され得る。ＤＮＡは、多くの場合、より小さな挿入で組み込まれ得る、何世代にもわたって検出ないままで、それにより、新しい生物及びその後の世代の永続的な特徴となることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素と組み合わせると、ＤＮＡ挿入は、挿入を宿主ゲノムに安全に組み込み、任意のビヒクルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの組み込み、または切断がゲノムで行われたことを示す任意のサインが顕著に存在しない。はるかに大きなプラスミド構造とは対照的に、これらの小さなＤＮＡ挿入を使用する安全性は、細胞へのプラスミドＤＮＡの導入のいくつかの予測不可能な結果と比較して、挿入／影響を受けた遺伝子の正確な意図された出力を生成する正確及び精密な挿入をもたらす。

【0234】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。

【0235】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造は、相同組み換えを含むプロセスにより生成されず、または本質的に生物学的なプロセスで生成されない。

【0236】

改変植物及びトランスジェニック植物の使用
別の実施形態では、本発明は、種子から得られる小麦粉、全粒粉、デンプン、または他の生成物を生成する方法を提供し、方法は、ａ）本発明の種子を取得するステップ、及び、ｂ）小麦粉、全粒粉、デンプン、または他の生成物を抽出するステップ、を含む。

【0237】

別の実施形態では、本発明は、米を加工する方法を提供し、方法は、ａ）本発明の種子を得るステップ、ｂ）殻を除去するステップ、ｃ）脱穀米を精米して、ぬか層を除去するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、米を白くするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、米を精米するステップを含む。

【0238】

別の実施形態では、本発明は、動物飼料として、または動物消費用飼料もしくはヒト消費用食品を生成するための、本発明の改変植物またはその一部の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物飼料として、または動物消費用飼料もしくはヒト消費用食品を生成するための、本発明のトランスジェニック植物またはその一部の使用を提供する。

【0239】

発明を実施するための様式
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0240】

実施例１－改変イネの遺伝子インサートの生成
Ｃａｓ９及びＣｐｆ１ヌクレアーゼを使用して、イネのゲノムにエンハンサーエレメントを安定して導入するように、遺伝子インサートを設計した。これらのエンハンサーエレメントは、異なる機能を有する様々なタンパク質（細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質を含む）をコードする目的遺伝子に作動可能に連結されているように導入される。

【0241】

各目的遺伝子に使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が表３に示される。エンハンサーエレメント及び対応する目的遺伝子の概要が表４に示される。表５にまとめたように、Ｃａｓ９相同アームを、いくつかのインサートの５’及び３’末端に追加した。エンハンサーエレメントを２つの目的を持つように設計した：１つ目は、塩類ストレスを即座に軽減するために目的遺伝子の発現を増加させることである。２つ目は、他のストレス誘発遺伝子の遺伝子発現を弱めることである。弱められるストレス誘発遺伝子は、ストレス下にある時に、植物の成長を妨げ、植物の代謝が完全に機能するのを妨げる集合的なグループである。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ストレス誘発遺伝子の効果的な発現を弱めることにより、これは、その初期効果が弱めるが、植物への目的遺伝子の発現の増加により、公平で有益な塩類分布が確立されるはずである。

【0242】

抗酸化物質をコードする目的遺伝子は、確実に同時に発現されるように同じポリヌクレオチド配列を有するエンハンサーエレメントに作動可能に連結されていた。植物の寿命及び組織全体にわたって高められたベースラインレベルも提供しながら、活性酸素種を「浄化」するために、植物の発育における重要な瞬間に、確実に抗酸化物質を発現させるように、抗酸化物質のエンハンサーエレメントを設計した。抗酸化物質のベースライン発現は、エンハンサーエレメント内のＴＡＴＡボックスの存在により達成され、これは、構成的且つ遍在的に発現されるモチーフであり、植物全体の発現を促進する。抗酸化物質のエンハンサーエレメントは、ジベレリン酸応答性エレメントも含む。ジベレリン酸（ＧＡ）は、初期発育段階での発現を促進し、表皮根の抗酸化遺伝子の発現に集中させる。エンハンサーエレメントにエチレン応答性エレメントが存在すると、植物の後期発育段階を通じて抗酸化遺伝子が発現し、開花期及び果実発育期に特異的に発現する。抗酸化物質のエンハンサーエレメントは、エチレンと反応するストレス誘発プロモーターエレメントであるＤＲＥＢ２Ａエレメントも含有していた。

【0243】

オーキシンは、最初の発芽後、主に茎と根の両方の軸方向の位置（根冠及び中心根）で発現し始める。それは、植物のライフサイクルを通して発現し続け、開花及び果実の発育段階で、エチレンによりサポートされる（図７を参照）。オーキシンが、根の末端、特に、根が成長し始める場所、で多く発現するので、ジベレリンではなく、ＳＯＳ１／ＳＯＳ２／ＡＨＡグループのエンハンサーエレメントで、オーキシンエレメントを使用した。これは、これらの重要なタンパク質の一貫した生成を生じさせるために利用することができ、これは、その後、成長するにつれて根の細胞膜に導入することができる。経時的に、これらの根の成長は遅くなり、発現の強さは、根に沿って先端からさらに奥への勾配を生じるであろう。これは、塩類を根の先端に移動させ、根から外に押し出す勾配を確立させることができる。

【表3】

【表4】

【表5-1】

【表5-2】

【0244】

実施例２－改変植物の生成
ステップ１－カルスの誘導
手でまたはピンセットを使用して、種子の殻を取り除いた。次に、種子の表面を７５％のエタノールで１分間、続いて、２．５％の次亜塩素酸ナトリウムで１５分間滅菌し、その後、蒸留水で８回洗浄した。次に、種子の殻を、オートクレーブ処理した。次に、種子を、イネカルス誘導培地上に置いた。この培地の構成成分は、以下の表６に示される。種子を暗所、２５℃で１４時間インキュベートした。これにより、白または黄色がかった、コンパクトで結節状の構造を有する胚形成カルスが生成された。

【表6】

【0245】

１４日後、胚形成カルスを種子から切り取り、さらに、直径５ｍｍほどの等しい断片に分割した。これらのカルスを、新鮮なイネカルス誘導培地に移し、同じ条件（２５℃で２４時間暗所）で４日間インキュベートした。

【0246】

ステップ２－微粒子銃
微粒子銃を使用して、実施例１で設計されたＤＮＡインサートをイネに形質転換した。各微粒子銃は、衝突毎に最大４つのＤＮＡインサートで構成される。それ故、胚カルスに８つのＤＮＡインサートを衝突させるには、複数セットの衝突が必要とされた。胚形成カルスに、以下のＤＮＡインサートのセットを衝突させ、ＤＮＡインサートのセットは、以下の表にまとめられるような改変植物を生成するための表５に記載の配列を含む。胚形成カルスを作成するために使用されたイネの品種も表に示される。

【0247】

実験１

【表7】

【0248】

実験２
セット１：ＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＡＨＡ３、及びＨＫＴ１
セット２：ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤ２
表８－各イネで標的とされる目的遺伝子の組み合わせ。使用されたイネ品種も示される。

【表8】

【0249】

ＤＮＡインサートがゲノムに安定して組み込まれるためには、表３に示すように、プログラム可能なヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）及び少なくとも１つのＲＮＡガイドを組み合わせて衝突させる必要がある。Ｃａｓ９は、植物ゲノムにエンハンサーエレメントを含むＤＮＡインサートを安定して挿入するためのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡという２つのＲＮＡガイドを必要するが、Ｃｐｆ１は、単一のガイドＲＮＡのみを必要とする。ヌクレアーゼ酵素対ＲＮＡガイド対遺伝子ＤＮＡインサートの比は、遺伝子毎に１：１：２であった。ＤＮＡ／酵素混合物を、以下に概説されるように作成した。

【表9】

【0250】

金粒子をＤＮＡ／酵素混合物、スペルミジン、及び塩化カルシウムと混合することにより、ＤＮＡ／酵素混合物を金粒子上に沈殿させた。得られた混合物を、氷上で１０分間インキュベートした。ＤＮＡでコーティングされた粒子を遠心分離し、上清を除去して、７５％のエタノールに置き換え、金粒子を再懸濁した。

【0251】

胚形成カルスを、衝突を行う前に、イネ浸透圧培地の入ったペトリ皿上に４時間置いた。イネ浸透圧培地の構成成分が、以下の表９にまとめられる。あるいは、カルスを、Ｗｈａｔｍａｎ（商標）濾紙に移し、暗所、２５℃で２４時間乾燥させた。次に、カルスを遺伝子銃システムに移し、少なくとも－５Ｈｇの真空圧下で、調製されたＤＮＡ被覆金粒子１０μｌを、少なくとも１１００ｐｓｉで焼成した。

【0252】

衝突後に、カルスを、暗所で２６℃のイネ浸透圧培地上に１６時間～２０時間置いた。次に、カルスを、イネカルス誘導培地に移し、暗所、２５℃で７～１４日間インキュベートした。

【表10】

【0253】

ステップ３－胚形成カルスの再生
次に、カルスを、氷再生培地Ｉ（ＲＲＭＩ）に移し、明条件下で（２５℃で、明所で１６時間、暗所で８時間）１～３週間インキュベートした。約７日後、いくつかのカルスに緑色の斑点が現れ始め、発育して、苗条及び根が成長して、苗木を形成した。３週間後、または苗木が移植するには大きくなりすぎる前に、苗木及び残りのカルスを、イネ再生培地ＩＩ（以下の表１０に記載）に移植し、明条件下で（２５℃で１６時間明所：８時間暗所）インキュベートした。

【表11】

【0254】

より多くの根組織の成長を生じさせるために、苗木を、イネ根増殖培地（ＲＲＰＭ）（表１１に記載）に移し、根の質量が健康な植物の成長を保証するのに十分になるまで、明条件下で（２５℃で、明所で１６時間：暗所で８時間）インキュベートした。

【表12】

【0255】

実施例３－カルス誘導率の最適化
実施例３に記載の方法を使用して、異なるイネ品種のカルス誘導率を試験した。カルス誘導率に対するホルモン２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）及び６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の様々な濃度の影響を調査した。

【0256】

４つの異なるイネ品種：ＴＨ３－５、Ｔｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ、ＭＨＣ２、及びＨａ Ｐｈａｔ３を試験した。カルスを、実施例３のステップ１に記載されているように誘導した。イネカルス誘導培地中で試験された２，４－Ｄ及びＢＡＰの濃度が以下の表１２にまとめられる。図２に示されるように、カルスを、４つのイネ品種全てから効率よく生成した。２ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ及び０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰを含む培地は、最高の誘導率を生じた。

【表13】

【0257】

さらに、５つのイネ品種（Ｊａｖａ ｌｏｎｇ、Ｓｅ Ｚｉｃ、Ａｇｏｓｔａｎｏ、Ｈｕｎａｎ、及びＤｉｃｈｒｏａ）におけるカルス誘導率を試験した。図３ａは、各米品種の発芽率を示し、図３ｂは、カルス誘導の割合を示す。これらのデータは、試験された全ての品種からカルスを生成することができることを示す。図３ｃは、これらの誘導カルスからの苗条の発育も、試験された全品種で生じ得ることを示す。これらのデータは、様々な植物品種に対するカルス誘導法の有用性を示す。

【0258】

イネ品種「ハヤユキ」についてもカルス誘導率を測定した。実施例３のステップ１に記載されているように、カルスを誘導した。イネカルス誘導培地中で試験された２，４－Ｄ及びＢＡＰの濃度が以下の表１３にまとめられる。図４は、試験された処理の全てが、ハヤユキのカルス誘導をもたらしたことを示す。３ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ及び０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰの組み合わせが、最も高い誘導率を生じた。

【表14】

【0259】

実施例４－再生された改変植物の分析
野生型植物と比較して特定の遺伝子の発現レベルを決定するために、実施例２で生成された改変植物を、ｑＲＴ－ＰＣＴを使用して分析した。

【0260】

ＲＮＡ抽出
根（５～１０ｍｇ）及び苗条（約１５ｍｇ）組織を、実施例２の実験１から再生した植物から収集し、液体窒素中で急速冷凍し、必要になるまで－８０℃で保存した。さらに、実施例２の実験２から再生された改変植物全体からの組織を含有した試料を収集した。これらの試料は、主に、葉の組織を含有していた。

【0261】

続いて、これらの試料を、液体窒素を使用して乳鉢及び乳棒で粉砕した。製造者のプロトコールに従って、ＧｅｎｅＪｅｔ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ精製キットまたはＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＥａｓｙキットを使用して、全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ＯｎｅＣ微量紫外可視分光光度計を使用して、ＲＮＡの濃度を分析した。２６０／２３０比が２．０を超える（２．０１～２．１４）全ての抽出ＲＮＡを下流プロセスに使用した。ＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで３７℃で３０分間処理することにより、試料からＤＮＡを除去した。次に、混合物を６５℃で１０分間インキュベートすることにより、ＤＮａｓｅを不活化した。

【0262】

ｑＲＴ－ＰＣＲ解析
ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、改変植物内の様々な耐塩性遺伝子の遺伝子発現を分析した。２セットのプローブ／色素セットを試験した。両方のセットは、対照として機能するハウスキーピング遺伝子アクチンの５番目のプライマー／プローブを含んでいた。
セット１：ＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＡＨＡ３、及びＨＫＴ１
セット２：ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、及びＳＯＤ２／ＳＯＤＣＣ１

【0263】

各遺伝子に結合したプローブは、以下であった：ＦＡＭ：ＮＨＸ１及びＶＨＡ－Ａ；ＳＵＮ：ＳＯＳ１及びＳＯＳ２；ＲＯＸ：ＡＨＡ３及びＳＯＤＡ１；ならびにＣｙ５’：ＨＫＴ１、ＳＯＤＣＣ１、及びＳＯＤ２。１２．５μｌのｉＴａｑ反応混合物、０．５μｌのｉＳｃｒｉｐｔリバース、５×１μｌの各目的遺伝子のフォワード及びリバースプライマーのそれぞれ（表Ｘで提示）、５×０．８μｌの蛍光プローブ、及び１μｌのＲＮＡを、以下のサイクルのＰＣＴ装置内に置いた：１サイクルの５０℃で３０分間、１サイクルの９４℃で２分間、４０サイクルの９４℃で１５秒間、５９℃で１５秒間、６８℃で１５秒間、１サイクルの６８℃で５分間。各目的遺伝子に使用されたプライマーは、以下である：
ＮＨＸ１ ＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＧ（配列番号５０）
ＶＨＡ－Ａ ＡＡＴＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣ（配列番号５１）
ＳＯＳ１ ＴＧＴＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧ（配列番号５２）
ＳＯＳ２ ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＣＡＴＣＡ（配列番号５３）
ＡＨＡ３ ＴＧＧＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＧ（配列番号５４）
ＨＫＴ１ ＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴ（配列番号５５）
ＳＯＤＡ１ ＣＣＡＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣ（配列番号５６）
ＳＯＤＣＣ１ ＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＴＧＣ（配列番号５７）
ＳＯＤ２ ＡＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号５８）

【0264】

Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを使用して、プローブの蛍光を分析した。野生型植物におけるＣｑ値と比較して、再生された独立事象イネ植物における遺伝子の相対的転写物存在量を分析した。試料毎に２つの技術的繰り返しを使用して、全ての反応を実施した。まず、ΔＣｔ値を取得するためのイネゲノム配列に基づく設計により、アクチン及び／または２５ＳリボソームＲＮＡ（２５Ｓ ｒＲＮＡ）ハウスキーピング遺伝子と比較して転写レベルを分析した。次に、再生された独立事象イネにおける相対的な倍率変化遺伝子発現を、ΔΔＣｔ値を計算することにより野生型と比較して分析した。

【0265】

図５ａ及び５ｂは、改変イネの苗条または根のいずれかにおけるＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＨＫＴ１、及びＳＯＤＡ１のＲＮＡ発現レベルが、野生型イネと比較して有意に高かったことを示す。これらのデータは、ＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＨＫＴ１、及びＳＯＤＡ１のＲＮＡ発現レベルが野生型植物と比較して増加していることを示す。目的遺伝子の発現レベルは、根と苗条の間で異なっていた。例えば、ＮＨＸ１は、根と比較して、葉でより高いレベルの発現を有していた。

【0266】

図９ａ、９ｂ、及び９ｃは、改変植物全体から得られた組織におけるＮＨＸ１、ＳＯＳ１、ＡＨＡ３、ＨＫＴ１、ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２及びＳＯＤＣＣ１のＲＮＡ発現レベルを示す。これらのデータは、これらの遺伝子が、野生型植物と比較して改変植物において差次的に発現されたことを示す。この違いは、さらに、図１０ａ～１０ｊの散布図で評価される。図９及び１０に見られる、異なる改変植物間のこれらの遺伝子の発現の変化は、各改変植物から収集された組織の種類の違いによるものであり得る。上述されたように、目的遺伝子の発現は、植物全体で空間的に異なり得る。例えば、ＨＫＴ１は、植物の維管束構造内でのみ発現され、それ故、収集された試料が、維管束構造を含有していない場合、ＨＫＴ１発現は、ほとんど～全く観察されないであろう。試験された多くの改変植物では、ＳＯＤ２の発現が低減している。この発現減少の考えられる理由は、対照として使用された野生型植物が、改変植物と比較して異なる年齢であったことであり得る。

【0267】

実施例５－改変植物の耐塩性
実施例２の改変植物の耐塩性は、最初に０ｇの塩類を含む水耕培地に苗木または植物の根を部分的に浸すことにより試験した。

【表15】

【0268】

次に、水耕培地の塩類濃度を、完全な海洋塩類濃度である４５ｇ／Ｌまで段階的に増加させた。塩類濃度の段階的な変化と、各変化の間の間隔は、品種の性能に応じて変更されやすい可能性がある。苗条と根の両方の成長速度を監視し、植物の全体的な健康状態及び葉の色を分析した。

【表16】

【0269】

実施例６－改変植物の耐塩性
実施例２の改変植物の耐塩性を、塩化ナトリウムが補充されている培地中で植物を成長させることにより試験した。実施例２の改変植物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ１、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩを、最初に、８ｇ／ＬのＮａＣｌ、後に、１６ｇ／Ｌに増加させたＮａＣｌが補充されたＲＲＭＩＩ培地に直接置いた。改変植物は、このような高塩類濃度条件下でも成長を続けた。野生型植物を、最初に２ｇ／ＬのＮａＣｌが補充されたＭＳ培地に置いた。塩類濃度を、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌになるまで、２日毎に２ｇ／Ｌずつ増加した。

【表17】

【0270】

図１１は、実験最終日の改変及び野生型植物の画像を提示する。図１１の画像は、全ての野生型植物が葉の少なくとも半分に顕著な黄変を示すことを示す。葉の先端から始まり、多くの場合、葉の全長全体に広がる。この黄変は、改変植物では観察されない。目的遺伝子に作動可能に連結されるようにエンハンサーエレメントを挿入すると、物理的なストレスの兆候を示さずに、改変植物により高濃度の塩類に対し耐性があることを可能にしている。データは、本発明による改変植物が野生型植物と比較して耐塩性が増加していることを示す。

【0271】

改変植物のいくつかは、白く見える（Ａ＆Ｈ）。これらの植物は、再生後のライフサイクル全体を通じてこの色を示している。任意の特定の理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、クロロフィル生成の低減を引き起こす遺伝子発現の実質的な増加によるものであると仮定している。これらの植物は、依然として、緑色の対応物と同様に行動している。

【0272】

野生型対照は、根及び葉の量の大幅な低減を示す。それらの構造は、また、薄く、独力で植物の重量を支えることができない。これらの特徴は、塩類濃度の増加が、野生型植物の健康に影響を与えていることを示す。対照的に、改変植物は、これらの特徴を示さず、さらに、ゲノムに行われている編集により、植物が生存することを可能にするだけでなく、野生型イネが成長できない高塩類環境でも生き延びることが示唆される。この改善は、複数のイネ品種で見られ、発明者らの設計が、様々なイネ品種に適用することができることを示す。

【0273】

全体として、これらのデータは、特定の目的遺伝子に作動可能に連結されているエンハンサーエレメントを有するように改変されている植物が、高塩類でも成長し得、それにより、野生型植物と比較して耐塩性が向上していることを示す。

【0274】

実施例７－遺伝子インサートの設計の改良
編集効率を向上させ、良好な編集を行う必要があるＤＮＡの量を最小限に抑えるために、遺伝子インサートの設計を変更した。この改良された設計の主な焦点は、Ｃａｓ９が以前に使用されたゲノム配列内に切り込みを入れるために、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を使用することである。Ｃａｓ９は、任意の量のＤＮＡを効率的に編集してゲノム配列に挿入するために、大きな相同性アーム（遺伝子インサートを含む約１２５塩基）を必要とする平滑末端切断を行い、ＤＮＡのこのセクション全体が、植物に組み込まれ、遺伝子毎に約１２０塩基対の編集が得られる。比較すると、Ｃｐｆ１は、互い違いの切断を使用して、図１に示されるように、センス鎖のＰＡＭ部位の１９塩基対後ろ、アンチセンス鎖のＰＡＭ部位の２３塩基対後ろに切り込みを入れる。Ｃｐｆ１編集は、相同性アームを必要とせず、代わりに、図１で太字で見ることができる４～５塩基対のオーバーハングに依存する。

【0275】

これらのオーバーハングは、図６の配列を使用して、より小さなＤＮＡ片をゲノムに組み込むことを可能にするために、遺伝子インサートの末端に含まれていた。遺伝子の正常な機能が変更されないように、編集部位を設計して、発現強度及び発現位置パターンのみを変更する。この更新された設計では、目的遺伝子ＶＨＡ－Ａ、ＳＯＳ２、ＡＨＡ３、及びＳＯＤＡ１は全て、Ｃａｓ９ではなくＣｐｆ１に適応するように変換されている。更新されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び関連するオーバーハング配列を含む更新されたフォワード及びリバースインサート配列が表１４及び図６に示される。

【0276】

これらのデータは、実施例１と組み合わせると、様々なヌクレアーゼを使用して、エンハンサーエレメントを植物のゲノムに組み込むことができることを示す。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、改変植物を生成するより効率的な方法となるので、エンハンサーエレメントをゲノムに組み込むために使用され得る。

【表18】

【0277】

実施例８－改変カルスの生成
実施例３に記載されるように、カルスを生成した。これらのカルスに、ゲノム配列内に切り込みを入れるためだけに、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを使用する実施例７に記載のＤＮＡインサートを衝突させた。４つの目的遺伝子（ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１及びＯｓＳＯＳ２）ならびにそれらの配列を標的としたＤＮＡインサートが、図６で提供される。ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている。

【0278】

再生改変植物と比較した生理機能、ホルモン、及び転写因子の存在量の違いを考慮して、カルス内で発現される可能性が最も高いので、これら４つの目的遺伝子を選択した。それらが相乗的に機能して任意の植物細胞内で塩類の排除及び分離を促進して、耐塩性を促進するように、この目的遺伝子のセットも選択した。

【0279】

実施例９－カルスの耐塩性
２ｇ／Ｌの塩化ナトリウムが補充されたイネカルス誘導培地にカルスを移すことにより、実施例８の改変カルスの耐塩性を試験した。２日毎に、カルスをより高濃度の塩類に移した。試験された濃度を、以下に示す。

【表19】

【0280】

カルスが、植物全体と比較して最適な働きが予想されないので、最大１５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムは、海洋塩類濃度の５０％をわずかに下回る。しかし、１５ｇ／Ｌで成長し得るカルスは、現在商業的に使用されているイネ品種の耐性をはるかに超え、メコン川の水田の塩類濃度をはるかに超える、非常に高い耐塩性を有するであろう。成長速度；色；質感；及び構造的完全性を含む全体的なカルスの健康状態も記録されるであろう。

【0281】

図１２ａ～ｃは、改変カルスが、最大１５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含有していた培地中で成長することが可能であったが、野生型カルスが、同じ条件下では成長することができなかったことを示す。カルスの健康状態の識別子は、色（黒ではなく白／黄色がかった）及び質感（もろい及び柔らかくない）を含んでいた。図１２ａ～ｃの画像は、一般に、改変カルスが、ＷＴよりも白く見え、より明確なエッジを有することを示し、これは、これらのカルスがより高い耐性を有することを示す。

【0282】

実施例４に記載されているように、改変カルスに対して、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲを実施した。図１３は、改変カルスにおけるＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＨＫＴ１、ＮＨＸ１、ＡＨＡ－３、ＶＨＡ－Ａ、及びＳＯＤＡ１の遺伝子発現を示す。図１３は、改変カルスの大部分が、１５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムで成長させる場合に、野生型カルスと比較して、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＨＫＴ１、ＮＨＸ１、ＡＨＡ－３、ＶＨＡ－Ａ、及びＳＯＤＡ１の発現が増加していることを示す。この違いは、さらに、図１５ａ～１５ｏの散布図で評価される。これらのデータは、衝突プロセスが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように、エンハンサーエレメントを植物のゲノムに効率的に取り込ませ、これにより、改変カルスが、野生型と比較して増加した塩類ストレス下でも成長できるようになったことを示す。

【0283】

以前の研究では、イネカルスは、８．７ｇ／ＬのＮａＣｌで新鮮重の急激な減少を示すことが観察され［２７］、本発明者らの形質転換カルスは、１５ｇ／ＬのＮａＣｌまで継続的な成長を示すので、カルスの耐塩性の大幅な増加が観察されている。０、２、４、６、８、１０、１２．５、及び１５ｇ／ＬのＮａＣｌで採取された野生型カルスに対して、ｑＲＴ ＰＣＲ分析を実施した。図１４に見られるように、８ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間の間隔では、ＮＨＸ１、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＳＯＤＡ１、ＳＯＳ１、及びＳＯＳ２の発現に劇的な変化があり、これは、カルスがそのような高濃度のＮａＣｌに耐えられなくなる同様のシフトを示す。全体として、データは、塩類中で成長させたカルスの文献で観察された物理的特徴と類似している。

【0284】

実施例１０－改変ケール（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）の遺伝子インサートの生成
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを使用して、ケールのゲノムにエンハンサーエレメントを安定して導入するように、遺伝子インサートを設計した。これらの目的遺伝子は、異なる機能を有する様々なタンパク質（細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、液胞膜イオントランスポーター、カリウムトランスポーター、プロテインキナーゼ、及び抗酸化物質を含む）をコードする。

【表20-1】

【表20-2】

【0285】

実施例１１－改変植物のゲノムシーケンシング
衝突後に、目的遺伝子が植物に効率的に導入されているかどうかを決定するために、実施例２で生成された改変植物のゲノムＤＮＡをシーケンシングした。

【0286】

Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットを使用して、ゲノムＤＮＡを単離及び精製した。要約すると、４０ｍｇの主要物質を、対象植物からが採取した。葉組織を液体窒素中で凍結し、乳棒及び乳鉢を使用して微粉末に粉砕した。６００μｌのＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを試料に添加し、１～３秒間ボルテックスした。次に、試料を６５℃で１５分間インキュベートした。３μｌのＲＮａｓｅ溶液を、細胞溶解物に添加し、チューブを２～５回反転させて混合した。混合物を、３７℃で１５分間インキュベートした。試料を、室温で５分間冷却し、その後、２００μｌのタンパク質沈殿溶液を添加した。試料を、高速で２０秒間激しくボルテックスし、１３，０００～１６，０００ｘｇで３分間遠心分離した。沈殿したタンパク質は、堅いペレットを形成した。上清を、室温のイソプロパノール６００μｌを含有するチューブに移した。チューブを反転させることにより試料を混合し、次に、室温で１３，０００～１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。室温の７０％のエタノール６００μｌを添加し、チューブを数回穏やかに反転させてＤＮＡを洗浄した。次に、試料を室温で１３，０００～１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。エタノールを除去し、ＤＮＡを含有するペレットを１５分間風乾した。１００μｌのＤＮＡ再水和溶液を添加し、試料を６５℃で１時間インキュベートした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、各ＤＮＡ試料の濃度を測定した。得られたＤＮＡを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｌａｂでシーケンシングした。

【0287】

実施例１２－エンジニアリングプラントにおける耐塩性の安定した継承
ハヤユキ及びＴｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ品種の改変イネを、実施例２に記載されるように生成した。これらの改変イネは、以下の目的遺伝子、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１またはＯｓＳＯＤ２のいずれか（各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）を含んでいた。これらの改変イネを、種子を生成するように成長させて成熟させた。図１６ａ～ｅは、穂及び種子を示すこれらの改変イネの画像である。

【0288】

種子を、これら３つの植物（ハヤユキ１、ハヤユキ２、及びＴｒｕｏｎｇ Ｇｉａｎｇ）から採取し、発芽させて実生にした。実施例４で実施されたように、耐塩性が効率よく継承されたかどうかを観察するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、子孫植物の葉における遺伝子発現を分析した。

【0289】

実生１３及び１４は、ハヤユキ植物１から採取された種子から成長させた２本の実生である。図１７は、これらの実生におけるＯｓＮＨＸ１、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＳＯＤＡ１、ＳＯＤＣＣ１、及びＯｓＳＯＤ２のＲＮＡ発現レベルが野生型イネと比較して有意に高かったことを示す。これらのデータは、これらの遺伝子が、野生型植物と比較して後代で差次的に発現されたことを示す。この差異を、さらに、図１８に提示される散布図で評価する。２つの実生で観察された遺伝子発現は、親植物（ハヤユキ１）及び本発明による他の改変イネで観察された遺伝子発現と類似している。これらのデータは、本発明の改変植物に形質転換された耐塩性形質が効率よく遺伝されることを示す。

【0290】

本発明は、以下の番号付けされた実施形態を提供する。

【0291】

１．トランスジェニック植物であって、少なくとも２つの導入遺伝子を含み、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする導入遺伝子及び抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。

【0292】

２．細胞内イオン濃度を制御するタンパク質が、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、またはプロテインキナーゼである、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。

【0293】

３．イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼが、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態２に記載のトランスジェニック植物。

【0294】

４．細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３である、実施形態３に記載のトランスジェニック植物。

【0295】

５．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のトランスジェニック植物。

【0296】

６．イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼが、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態２に記載のトランスジェニック植物。
７．（ａ）液胞膜イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または
（ｂ）液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａである、実施形態６に記載のトランスジェニック植物。

【0297】

８．（ａ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態７に記載のトランスジェニック植物。

【0298】

９．プロテインキナーゼが、セリン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態２～８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0299】

１０．ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態９に記載のトランスジェニック植物。

【0300】

１１．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0301】

１２．トランスジェニック植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0302】

１３．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質を含む、実施形態１２に記載のトランスジェニック植物。

【0303】

１４．トランスジェニック植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも３つの導入遺伝子を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0304】

１５．抗酸化物質（複数可）が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0305】

１６．（ａ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載のトランスジェニック植物。

【0306】

１７．トランスジェニック植物であって、少なくとも２つの導入遺伝子を含み、少なくとも２つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。

【0307】

１８．細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質が、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり、任意に、細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３である、実施形態１７に記載のトランスジェニック植物。

【0308】

１９．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１８に記載のトランスジェニック植物。

【0309】

２０．細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質が、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0310】

２１．液胞膜イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａである、実施形態２０に記載のトランスジェニック植物。

【0311】

２２．（ａ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載のトランスジェニック植物。

【0312】

２３．トランスジェニック植物が、さらに、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子、及び／または抗酸化物質をコードする導入遺伝子を含む、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0313】

２４．プロテインキナーゼが、リン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態２３に記載のトランスジェニック植物。

【0314】

２５．ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２４に記載のトランスジェニック植物。

【0315】

２６．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質である、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0316】

２７．抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＣＣ１のいずれか１つを含む、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0317】

２８．（ａ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２７に記載のトランスジェニック植物。

【0318】

２９．トランスジェニック植物であって、少なくとも３つの導入遺伝子を含み、トランスジェニック植物が、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して耐塩性が増加している、トランスジェニック植物。

【0319】

３０．トランスジェニック植物であって、少なくとも３つの導入遺伝子を含み、少なくとも３つの導入遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする導入遺伝子、及び抗酸化物質をコード化する導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。

【0320】

３１．細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質及び／または液胞膜タンパク質が、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、または水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態３０に記載のトランスジェニック植物。

【0321】

３２．トランスジェニック植物が、さらに、プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子を含む、実施形態３０または実施形態３１に記載のトランスジェニック植物。

【0322】

３３．プロテインキナーゼが、リン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態３２に記載のトランスジェニック植物。

【0323】

３４．トランスジェニックイネであって、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする導入遺伝子を含む、トランスジェニックイネ。

【0324】

３５．トランスジェニックイネであって、少なくとも４つの導入遺伝子を含み、少なくとも４つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードする導入遺伝子を含み、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニックイネ。

【0325】

３６．トランスジェニック植物が、少なくとも７つの導入遺伝子を含み、少なくとも７つの導入遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする導入遺伝子
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする導入遺伝子、及び
（ｇ）抗酸化物質をコードする導入遺伝子
を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0326】

３７．トランスジェニック植物が、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする導入遺伝子、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする導入遺伝子
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする導入遺伝子
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする導入遺伝子
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする導入遺伝子、及び
（ｇ）第１の抗酸化物質及び第２の抗酸化物質をコードする導入遺伝子
を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0327】

３８．（ａ）細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり；及び／または
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３であり；及び／または
（ｃ）プロテインキナーゼが、ＳＯＳ２であり；及び／または
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａであり；及び／または
（ｅ）液胞イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり；及び／または
（ｆ）カリウムトランスポーターが、ＨＫＴ１であり、及び／または
（ｇ）第１及び第２の抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１である、実施形態３６～３７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0328】

３９．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｄ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｅ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｆ）ＨＫＴ１が、ＯｓＨＫＴ１であり、任意に、ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
（ｇ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｈ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｉ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３８に記載のトランスジェニック植物。

【0329】

４０．トランスジェニックイネであって、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードする導入遺伝子を含む、トランスジェニックイネ。

【0330】

４１．トランスジェニックイネであって、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードする導入遺伝子を含み、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２導入遺伝子が、配列番号９３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニックイネ。

【0331】

４２．トランスジェニックイネであって、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含む、トランスジェニックイネ。

【0332】

４３．トランスジェニックイネであって、少なくとも８つの導入遺伝子を含み、少なくとも８つの導入遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする導入遺伝子を含み、
ＯｓＳＯＳ１導入遺伝子が、配列番号９５及び／または９６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２導入遺伝子が、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３導入遺伝子が、配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ導入遺伝子が、配列番号１０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１導入遺伝子が、配列番号９７及び／または９８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１導入遺伝子が、配列番号９９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１導入遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１導入遺伝子が、配列番号９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、トランスジェニックイネ。

【0333】

４４．トランスジェニック植物が、さらに、少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含み、少なくとも１つの追加の導入遺伝子が、
（ａ）シトクロムｐ４５０（Ｐ４５０）、及び／または
（ｂ）酸素発生複合体、及び／または
（ｃ）スクロースリン酸シンターゼ、及び／または
（ｄ）ピロリンカルボン酸シンターゼ
であるタンパク質をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック動物。

【0334】

４５．酸素発生複合体が、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱから形成される、実施形態４４に記載のトランスジェニック植物。

【0335】

４６．酸素発生複合体が、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ、及びＰｓｂＶから形成される、実施形態４４または実施形態４５に記載のトランスジェニック植物。

【0336】

４７．スクロースリン酸シンターゼが、スクロースリン酸シンターゼ１、スクロースリン酸シンターゼ２、またはスクロースリン酸シンターゼ３である、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0337】

４８．ピロリンカルボン酸シンターゼが、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１、またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２である、実施形態４４～４７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0338】

４９．トランスジェニック植物が、さらに、ＯＳＫ１をコードする導入遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0339】

５０．トランスジェニック植物が、ＰＥＲＫ１３をコードする導入遺伝子を含有しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0340】

５１．導入遺伝子の少なくとも１つが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されており、任意に、導入遺伝子の全てが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0341】

５２．少なくとも１つのプロモーターが、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０のヌクレオチドを含む、実施形態５１に記載のトランスジェニック植物。

【0342】

５３．少なくとも１つのプロモーターが、導入遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の１５０～５００ヌクレオチド以内にある、実施形態５１または実施形態５２に記載のトランスジェニック植物。

【0343】

５４．少なくとも１つのプロモーターが、根特異的プロモーターであり、任意に、導入遺伝子の全てが、根特異的プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0344】

５５．少なくとも１つのプロモーターが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含むプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態５１～５４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0345】

５６．少なくとも１つのプロモーターが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせ由来のプロモーターエレメントの少なくとも６ヌクレオチドを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、またはオーキシンのプロモーター配列由来のプロモーターエレメントを含むプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態５１～５５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0346】

５７．少なくとも１つのプロモーターが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、もしくはＣＡＡＴのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、導入遺伝子の全てが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＣＡＡＴのプロモーター配列を含むプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態５１～５６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0347】

５８．少なくとも１つのプロモーターが、配列番号１０～１８のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0348】

５９．各導入遺伝子が、別個のタンパク質をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0349】

６０．トランスジェニック植物が、被子植物である、先行実施形態のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0350】

６１．トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、実施形態６０に記載のトランスジェニック植物。

【0351】

６２．トランスジェニック植物が、穀物である、実施形態６０または実施形態６１に記載のトランスジェニック植物。

【0352】

６３．トランスジェニック植物が、トウモロコシ、イネ、ダイズ、サトウキビ、ヤエナリ、キヌア、オオムギ、オートムギ、ライムギ、モロコシ、またはコムギである、実施形態６２に記載のトランスジェニック植物。

【0353】

６４．トランスジェニック植物が、トランスジェニックイネである、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。

【0354】

６５．トランスジェニック植物が、野菜作物である、実施形態６０または実施形態６１に記載のトランスジェニック植物。

【0355】

６６．トランスジェニック植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｇｌｙｃｉｎｅ属、またはＳｏｊａ属に由来する、実施形態６５に記載のトランスジェニック植物。

【0356】

６７．実施形態１～６６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の植物部位。

【0357】

６８．植物部位が、細胞、種子、葉、苗条、茎、または根である、実施形態６７に記載の植物部位。

【0358】

６９．植物部位が、種子である、実施形態６８に記載の植物部位。

【0359】

７０．植物部位が、細胞である、実施形態６８に記載の植物部位。

【0360】

７１．実施形態７０に記載の１つ以上の植物細胞を含む多細胞構造。

【0361】

７２．多細胞構造体が、カルスである、実施形態７１に記載の多細胞構造体。

【0362】

７３．実施形態１～７２に記載のトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造の作成方法であって、方法が、
ｉ）実施形態１～６６によるトランスジェニック植物において定義される少なくとも２つの導入遺伝子を植物の細胞に導入するステップ（導入遺伝子が、植物の細胞のゲノムに組み込まれる）、及び
ｉｉ）細胞を再生して、細胞からトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ
を含む、方法。

【0363】

７４．導入遺伝子が、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションで細胞に導入される、実施形態７３に記載の方法。

【0364】

７５．実施形態７３～７４のいずれか１つに記載の方法であって、方法が、
（ａ）種子からカルス形成を誘導こと、
（ｂ）ポリヌクレオチド配列、ガイドＲＮＡ、及びヌクレアーゼをマイクロキャリア上に沈殿させることであって、ポリヌクレオチド配列が、実施形態１～７２のいずれか１つに従って定義される少なくとも２つの導入遺伝子を含み、
（ｃ）微粒子銃を使用してマイクロキャリアでカルスを形質転換して、形質転換カルスを生成することであって、ポリヌクレオチド配列が、トランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造のゲノムに組み込まれ、
（ｄ）形質転換カルスを回収して、実施形態７１または実施形態７２による多細胞構造を生成すること
を含む、方法。

【0365】

７６．多細胞構造が、トランスジェニック植物に再生される、実施形態７５に記載の方法。

【0366】

７７．ポリヌクレオチド配列が、植物のゲノムに安定して組み込まれる、実施形態７５または実施形態７６に記載の方法。

【0367】

７８．ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、任意に、ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態７５～７７のいずれか１つに記載の方法。

【0368】

７９．ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはプラスミドであり、任意に、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の方法。

【0369】

８０．トランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造が、相同組み換えを含むプロセスで生成されず、及び／または本質的に生物学的プロセスで生成されない、実施形態１～７２に記載のトランスジェニック植物、植物部位、または多細胞構造。

【0370】

８１．実施形態６９に記載の、小麦粉、全粒粉、デンプン、または種子から得られる他の生成物を生成する方法。

【0371】

８２．動物飼料として、または動物消費用飼料もしくはヒト摂取用食品を生成するための、実施形態１～６６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の植物部位、または実施形態７１もしくは実施形態７２に記載の多細胞構造の使用。

【0372】

８３．導入遺伝子の１つ以上が、本明細書の開示されるように、任意に、以下の実施形態のどこかに開示されるように、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている対応する目的遺伝子で置換されている、任意の先行実施形態で定義されるトランスジェニック植物。

【0373】

本発明は、以下の番号付けされた実施形態も提供する。

【0374】

１．改変植物であって、少なくとも２つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変植物。

【0375】

２．細胞内イオン濃度を制御するタンパク質が、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、水素輸送ピロホスファターゼ、またはプロテインキナーゼである、実施形態１に記載の改変植物。

【0376】

３．イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼが、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態２に記載の改変植物。

【0377】

４．細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３である、実施形態３に記載の改変植物。

【0378】

５．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載の改変植物。

【0379】

６．イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または水素輸送ピロホスファターゼが、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、及び／または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態２に記載の改変植物。

【0380】

７．（ａ）液胞膜イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または
（ｂ）液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａである、実施形態６に記載の改変植物。

【0381】

８．（ａ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態７に記載の改変植物。

【0382】

９．プロテインキナーゼが、セリン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態２～８のいずれか１つに記載の改変植物。

【0383】

１０．ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態９に記載の改変植物。

【0384】

１１．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の改変植物。

【0385】

１２．改変植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも２つの目的遺伝子を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の改変植物。

【0386】

１３．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質及び細胞質抗酸化物質を含む、実施形態１２に記載の改変植物。

【0387】

１４．改変植物が、抗酸化物質をコードする少なくとも３つの遺伝子を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の改変植物。

【0388】

１５．抗酸化物質（複数可）が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の改変植物。

【0389】

１６．（ａ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載の改変植物。

【0390】

１７．改変植物であって、少なくとも２つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子及び細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子を含み、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変植物。

【0391】

１８．細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質が、細胞膜イオントランスポーター、細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または細胞膜水素輸送ピロホスファターゼであり、任意に、細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり、及び／または細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３である、実施形態１７に記載の改変植物。

【0392】

１９．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１８に記載の改変植物。

【0393】

２０．細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質が、液胞膜イオントランスポーター、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼ、または液胞膜水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の改変植物。

【0394】

２１．液胞膜イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり、及び／または、液胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａである、実施形態２０に記載の改変植物。

【0395】

２２．（ａ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の改変植物。

【0396】

２３．改変植物が、さらに、プロテインキナーゼをコードする遺伝子及び／または抗酸化物質をコードする遺伝子を含む、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の改変植物。

【0397】

２４．プロテインキナーゼが、リン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態２３に記載の改変植物。

【0398】

２５．ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２４に記載の改変植物。

【0399】

２６．抗酸化物質が、ミトコンドリア抗酸化物質または細胞質抗酸化物質である、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の改変植物。

【0400】

２７．抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤＣＣ１のいずれか１つを含む、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の改変植物。
２８．（ａ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態２７に記載の改変植物。

【0401】

２９．改変植物であって、少なくとも３つの目的遺伝子を含み、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、改変植物が、該ゲノム改変のない同種の植物と比較して耐塩性が増加している、改変植物。

【0402】

３０．改変植物であって、少なくとも３つの目的遺伝子を含み、目的遺伝子が、細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子、及び抗酸化物質をコードする遺伝子を含み、
細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、細胞内イオン濃度を制御する液胞膜タンパク質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変植物。

【0403】

３１．細胞内イオン濃度を制御する細胞膜タンパク質及び／または液胞膜タンパク質が、イオントランスポーター、水素輸送ＡＴＰアーゼ、または水素輸送ピロホスファターゼである、実施形態３０に記載の改変植物。

【0404】

３２．改変植物が、さらに、プロテインキナーゼをコードする遺伝子を含む、実施形態３０または実施形態３１に記載の改変植物。

【0405】

３３．プロテインキナーゼが、リン／スレオニンキナーゼであり、任意に、セリン／スレオニンキナーゼが、ＳＯＳ２である、実施形態３２に記載の改変植物。

【0406】

３４．改変イネであって、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、各目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0407】

３５．改変イネであって、少なくとも４つの目的遺伝子を含み、少なくとも４つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、及びＯｓＳＯＤＡ１をコードし、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0408】

３６．改変植物が、少なくとも７つの目的遺伝子を含み、少なくとも７つの目的遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子（細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする遺伝子（プロテインキナーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子（液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする遺伝子（カリウムトランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、及び
（ｇ）抗酸化物質をコードする遺伝子（抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）
を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の改変植物。

【0409】

３７．改変植物が、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、
（ａ）細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子（細胞膜イオントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｃ）プロテインキナーゼをコードする遺伝子（プロテインキナーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子（液胞水素輸送ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｅ）液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子（液胞ナトリウム／プロトントランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｆ）カリウムトランスポーターをコードする遺伝子（カリウムトランスポーターをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
（ｇ）第１の抗酸化物質をコードする遺伝子（第１の抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、及び
（ｈ）第２の抗酸化物質をコードする遺伝子（第２の抗酸化物質をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）、
を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の改変植物。

【0410】

３８．（ａ）細胞膜イオントランスポーターが、ＳＯＳ１であり；及び／または
（ｂ）細胞膜水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＡＨＡ３であり；及び／または
（ｃ）プロテインキナーゼが、ＳＯＳ２であり；及び／または
（ｄ）液胞水素輸送ＡＴＰアーゼが、ＶＨＡ－Ａであり；及び／または
（ｅ）液胞イオントランスポーターが、ＮＨＸ１であり；及び／または
（ｆ）カリウムトランスポーターが、ＨＫＴ１であり、及び／または
（ｇ）第１及び第２の抗酸化物質が、ＳＯＤＡ１、ＳＯＤ２、及び／またはＳＯＤＣＣ１である、実施形態３６～３７のいずれか１つに記載の改変植物。

【0411】

３９．（ａ）ＳＯＳ１が、ＯｓＳＯＳ１であり、任意に、ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｂ）ＡＨＡ３が、ＯｓＡＨＡ３であり、任意に、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｃ）ＳＯＳ２が、ＯｓＳＯＳ２であり、任意に、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｄ）ＶＨＡ－Ａが、ＯｓＶＨＡ－Ａであり、任意に、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｅ）ＮＨＸ１が、ＯｓＮＨＸ１であり、任意に、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｆ）ＨＫＴ１が、ＯｓＨＫＴ１であり、任意に、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
（ｇ）ＳＯＤＡ１が、ＯｓＳＯＤＡ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｈ）ＳＯＤ２が、ＯｓＳＯＤ２であり、任意に、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び／または
（ｉ）ＳＯＤＣＣ１が、ＯｓＳＯＤＣＣ１であり、任意に、ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３８に記載の改変植物。

【0412】

４０．改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0413】

４１．改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0414】

４２．改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0415】

４３．改変イネであって、少なくとも８つの目的遺伝子を含み、少なくとも８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤＣＣ１をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＳ２をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＡＨＡ３をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＶＨＡ－Ａをコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＮＨＸ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＨＫＴ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＡ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されており；ＯｓＳＯＤＣＣ１をコードする遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0416】

４４．改変植物が、さらに、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている少なくとも１つの追加の目的遺伝子を含み、（エンハンサーエレメントに作動可能に連結されている）少なくとも１つの追加の目的遺伝子が、
（ａ）シトクロムｐ４５０（Ｐ４５０）、及び／または
（ｂ）酸素発生複合体、及び／または
（ｃ）スクロースリン酸シンターゼ、及び／または
（ｄ）ピロリンカルボン酸シンターゼ
であるタンパク質をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0417】

４５．酸素発生複合体が、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、及びＰｓｂＱから形成される、実施形態４４に記載の改変植物。

【0418】

４６．酸素発生複合体が、タンパク質ＰｓｂＯ、ＰｓｂＰ、ＰｓｂＱ、ＰｓｂＵ、及びＰｓｂＶから形成される、実施形態４４または実施形態４５に記載の改変植物。

【0419】

４７．スクロースリン酸シンターゼが、スクロースリン酸シンターゼ１、スクロースリン酸シンターゼ２、またはスクロースリン酸シンターゼ３である、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の改変植物。

【0420】

４８．ピロリンカルボン酸シンターゼが、デルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１、またはデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ２である、実施形態４４～４７のいずれか１つに記載の改変植物。

【0421】

４９．改変植物が、さらに、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されているＯＳＫ１をコードする目的遺伝子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0422】

５０．改変植物が、ＰＥＲＫ１３をコードする目的遺伝子を含有しないか、または該目的遺伝子が、エンハンサーエレメントに作動可能に連結されていない、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0423】

５１．エンハンサーエレメントが、同じポリヌクレオチド配列を有するか、またはエンハンサーエレメントが、異なるポリヌクレオチド配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0424】

５２．エンハンサーエレメントが、野生型植物における目的遺伝子の発現レベルと比較して、目的遺伝子の発現レベルを変化させる、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0425】

５３．植物の少なくとも１つの発育段階中の植物の少なくとも一部において、エンハンサーエレメントが、野生型植物における目的遺伝子の発現レベルと比較して、目的遺伝子の発現レベルを増加または減少させ、任意に、エンハンサーエレメントが、野生型植物における目的遺伝子の発現レベルと比較した、目的遺伝子の発現レベルを増加させる、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0426】

５４．エンハンサーエレメントが、根、苗条、葉、種子、または茎における目的遺伝子の発現レベルを変化させる、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0427】

５５．エンハンサーエレメントが、根における目的遺伝子の発現レベルを変化させる、実施形態５４に記載の改変植物。

【0428】

５６．発芽中に、植物の成長時、植物の開花時、及び／または、植物の結実時に、エンハンサーエレメントが、目的遺伝子の発現レベルを変更させる、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0429】

５７．エンハンサーエレメントが、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0430】

５８．エンハンサーエレメントが、目的遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の１５０～５００ヌクレオチド以内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0431】

５９．エンハンサーエレメントが、根特異的プロモーターを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0432】

６０．目的遺伝子の全てが、根特異的プロモーターを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、実施形態５９に記載の改変植物。

【0433】

６１．エンハンサーエレメントが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0434】

６２．目的遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、実施形態６１に記載の改変植物。

【0435】

６３．エンハンサーエレメントが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、もしくはオーキシンのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせ由来のプロモーターエレメントの少なくとも６ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0436】

６４．目的遺伝子の全てが、ＤＲＥＢ２Ａ、ジベレリン、エチレン、またはオーキシンのプロモーター配列由来のプロモーターエレメントを含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、実施形態６３に記載の改変植物。

【0437】

６５．エンハンサーエレメントが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、もしくはＣＡＡＴのプロモーター配列、またはそれらの組み合わせを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0438】

６６．目的遺伝子の全てが、ＴＡＦ－１、ＴＡＴＡ、Ｅ２Ｆ、Ｇ－ＢＯＸ、またはＣＡＡＴのプロモーター配列を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、実施形態６５に記載の改変植物。

【0439】

６７．エンハンサーエレメントが、配列番号１０～１８のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0440】

６８．（ａ）ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｂ）ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｃ）ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｄ）ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｅ）ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｆ）ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｇ）ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｈ）ＯｓＳＯＤＣＣ１遺伝子が、配列番号１７を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、及び／または
（ｉ）ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0441】

６９．少なくとも８つの目的遺伝子を含む改変イネであって、８つの目的遺伝子が、ＯｓＳＯＳ１、ＯｓＳＯＳ２、ＯｓＡＨＡ３、ＯｓＶＨＡ－Ａ、ＯｓＮＨＸ１、ＯｓＨＫＴ１、ＯｓＳＯＤＡ１、及びＯｓＳＯＤ２をコードし、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号９５及び／または９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１００のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号９７及び／または９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号９９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号９２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み；ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
ＯｓＳＯＳ１遺伝子が、配列番号１２を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＳ２遺伝子が、配列番号１３を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＡＨＡ３遺伝子が、配列番号１４を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＶＨＡ－Ａ遺伝子が、配列番号１１を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＮＨＸ１遺伝子が、配列番号１０を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＨＫＴ１遺伝子が、配列番号１５を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤＡ１遺伝子が、配列番号１６を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されており、ＯｓＳＯＤ２遺伝子が、配列番号１８を含むエンハンサーエレメントに作動可能に連結されている、改変イネ。

【0442】

７０．各目的遺伝子が、別個のタンパク質をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0443】

７１．改変植物が、被子植物である、先行実施形態のいずれか１つに記載の改変植物。

【0444】

７２．改変植物が、単子葉植物または双子葉植物である、実施形態７１に記載の改変植物。

【0445】

７３．改変植物が、穀物である、実施形態７１または実施形態７２に記載の改変植物。

【0446】

７４．改変植物が、トウモロコシ、イネ、ダイズ、サトウキビ、ヤエナリ、キヌア、オオムギ、オートムギ、ライムギ、モロコシ、またはコムギである、実施形態７３に記載の改変植物。

【0447】

７５．改変植物が、改変イネである、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の改変植物。

【0448】

７６．改変植物が、野菜作物である、実施形態７１または実施形態７２に記載の改変植物。

【0449】

７７．改変植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｇｌｙｃｉｎｅ属、またはＳｏｊａ属に由来する、実施形態７６に記載の改変植物。

【0450】

７８．実施形態１～７７のいずれか１つに記載の改変植物の植物部位。

【0451】

７９．植物部位が、細胞、種子、葉、苗条、茎、または根である、実施形態７８に記載の植物部位。

【0452】

８０．植物部位が、種子である、実施形態７８に記載の植物部位。

【0453】

８１．植物部位が、細胞である、実施形態７８に記載の植物部位。

【0454】

８２．実施形態８１に記載の１つ以上の植物細胞を含む多細胞構造。

【0455】

８３．多細胞構造体が、カルスである、実施形態８２に記載の多細胞構造体。

【0456】

８４．実施形態１～８３に記載の改変植物、植物部位、または多細胞構造の作成方法であって、方法が、
ｉ）実施形態１～７７に記載の改変植物において定義される少なくとも２つのエンハンサーエレメントを、植物の細胞に導入するステップ（エンハンサーエレメントが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように植物の細胞のゲノムに組み込まれる）、及び
ｉｉ）細胞を再生して、細胞から改変植物、植物部位、または多細胞構造を形成するステップ
を含む、方法。

【0457】

８５．エンハンサーエレメントが、微粒子銃、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションで細胞に導入される、実施形態８４に記載の方法。

【0458】

８６．実施形態８４～８５のいずれか１つに記載の方法であって、方法が、
（ａ）種子からカルス形成を誘導すること、
（ｂ）実施形態１～７７に記載の改変植物において定義されるエンハンサーエレメント、２つ以上のガイドＲＮＡ、及び１つ以上のヌクレアーゼをマイクロキャリア上に沈殿させること、
（ｃ）微粒子銃を使用してマイクロキャリアでカルスを形質転換して、形質転換カルスを生成することであって、エンハンサーエレメントが、目的遺伝子に作動可能に連結されているように、改変植物、植物部位、または多細胞構造のゲノムに組み込まれ、
（ｄ）形質転換カルスを回収して、実施形態８２または実施形態８３による多細胞構造を生成すること
を含む、方法。

【0459】

８７．多細胞構造が、改変植物に再生される、実施形態８６に記載の方法。

【0460】

８８．ポリヌクレオチド配列が、植物のゲノムに安定して組み込まれる、実施形態８６または実施形態８７に記載の方法。

【0461】

８９．ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、任意に、ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態８６～８８のいずれか１つに記載の方法。

【0462】

９０．改変植物、植物部位、または多細胞構造が、相同組み換えを含むプロセスで生成されない、及び／または本質的に生物学的なプロセスで生成されない、実施形態１～８３に記載の改変植物、植物部位、または多細胞構造。

【0463】

９１．実施形態８０に記載の、小麦粉、全粒粉、デンプン、または種子から得られる他の生成物を生成する方法。

【0464】

９２．動物飼料として、または動物消費用飼料もしくはヒト摂取用食品を生成するための、実施形態１～７７のいずれか１つに記載の改変植物、実施形態７８～８１のいずれか１つに記載の植物部位、または実施形態８２もしくは実施形態８３に記載の多細胞構造の使用。

【0465】

追加の配列
配列番号９２－ＯｓＳＯＤＡ１－Ｑ４３１２１
ＭＡＬＲＴＬＡＳＲＫＴＬＡＡＡＡＬＰＬＡＡＡＡＡＡＲＧＶＴＴＶＡＬＰＤＬＰＹＤＹＧＡＬＥＰＡＩＳＧＥＩＭＲＬＨＨＱＫＨＨＡＴＹＶＡＮＹＮＫＡＬＥＱＬＤＡＡＶＡＫＧＤＡＰＡＩＶＨＬＱＳＡＩＫＦＮＧＧＧＨＶＮＨＳＩＦＷＮＮＬＫＰＩＳＥＧＧＧＤＰＰＨＡＫＬＧＷＡＩＤＥＤＦＧＳＦＥＡＬＶＫＫＭＳＡＥＧＡＡＬＱＧＳＧＷＶＷＬＡＬＤＫＥＡＫＫＬＳＶＥＴＴＡＮＱＤＰＬＶＴＫＧＡＮＬＶＰＬＬＧＩＤＶＷＥＨＡＹＹＬＱＹＫＮＶＲＰＤＹＬＳＮＩＷＫＶＭＮＷＫＹＡＧＥＶＹＥＮＡＴＡ
配列番号９３－ＯｓＳＯＤ２－Ｑ１０ＰＷ４
ＭＡＧＫＡＧＧＬＫＧＶＡＬＩＧＧＡＧＧＮＳＡＶＡＧＡＬＨＦＦＱＤＰＳＴＧＹＴＥＶＲＧＲＶＴＧＬＡＰＧＬＨＧＦＨＩＨＳＦＧＤＴＴＮＧＣＮＳＴＧＰＨＦＮＰＨＮＫＳＨＧＡＰＳＤＤＥＲＨＶＧＤＬＧＮＩＶＡＮＫＤＧＶＡＤＩＦＩＫＤＬＱＩＳＬＳＧＰＨＳＩＬＧＲＡＶＶＶＨＡＤＳＤＤＬＧＲＧＧＨＥＬＳＫＴＴＧＮＡＧＡＲＩＧＣＧＩＩＧＬＲＳＡＶ
配列番号９４－ＯｓＳＯＤＣＣ１－Ｑ０ＤＲＶ６
ＭＶＫＡＶＶＶＬＧＳＳＥＩＶＫＧＴＩＨＦＶＱＥＧＤＧＰＴＴＶＴＧＳＶＳＧＬＫＰＧＬＨＧＦＨＩＨＡＬＧＤＴＴＮＧＣＭＳＴＧＰＨＹＮＰＡＧＫＥＨＧＡＰＥＤＥＴＲＨＡＧＤＬＧＮＶＴＡＧＥＤＧＶＡＮＩＨＶＶＤＳＱＩＰＬＴＧＰＮＳＩＩＧＲＡＶＶＶＨＡＤＰＤＤＬＧＫＧＧＨＥＬＳＫＴＴＧＮＡＧＧＲＶＡＣＧＩＩＧＬＱＧ
配列番号９５－ＯｓＳＯＳ１－Ｑ５ＩＣＮ３
ＭＤＮＰＥＡＥＰＤＤＡＶＬＦＶＧＶＳＬＶＬＧＩＡＳＲＨＬＬＲＧＴＲＶＰＹＴＶＡＬＬＶＬＧＶＡＬＧＳＬＥＦＧＴＫＨＧＭＧＫＬＧＡＧＩＲＩＷＡＮＩＮＰＤＬＬＬＡＶＦＬＰＡＬＬＦＥＳＳＦＳＭＥＩＨＱＩＫＫＣＭＡＱＭＶＬＬＡＧＰＧＶＬＩＳＴＦＦＬＧＳＡＬＫＬＴＦＰＹＮＷＮＷＫＴＳＬＬＬＧＧＬＬＳＡＴＤＰＶＡＶＶＡＬＬＫＥＬＧＡＳＫＫＬＳＴＩＩＥＧＥＳＬＭＮＤＧＴＡＩＶＶＹＱＬＦＹＲＭＶＬＧＲＴＦＤＡＧＳＩＩＫＦＬＳＥＶＳＬＧＡＶＡＬＧＬＡＦＧＩＡＳＶＬＷＬＧＦＩＦＮＤＴＩＩＥＩＡＬＴＬＡＶＳＹＩＡＦＦＴＡＱＤＡＬＥＶＳＧＶＬＴＶＭＴＬＧＭＦＹＡＡＦＡＫＴＡＦＫＧＤＳＱＱＳＬＨＨＦＷＥＭＶＡＹＩＡＮＴＬＩＦＩＬＳＧＶＶＩＡＤＧＶＬＥＮＮＶＨＦＥＲＨＧＡＳＷＧＦＬＬＬＬＹＶＦＶＱＩＳＲＩＬＶＶＶＩＬＹＰＬＬＲＨＦＧＹＧＬＤＬＫＥＡＴＩＬＶＷＡＧＬＲＧＡＶＡＬＳＬＳＬＳＶＫＲＡＳＤＡＶＱＴＨＬＫＰＶＤＧＴＭＦＶＦＦＴＧＧＩＶＦＬＴＬＩＦＮＧＳＴＴＱＦＬＬＨＬＬＧＭＤＲＬＡＡＴＫＬＲＩＬＮＹＴＫＹＥＭＬＮＫＡＬＥＡＦＧＤＬＲＤＤＥＥＬＧＰＰＡＤＷＶＴＶＫＫＹＩＴＣＬＮＤＬＤＤＥＰＶＨＰＨＡＶＳＤＲＮＤＲＭＨＴＭＮＬＲＤＩＲＶＲＬＬＮＧＶＱＡＡＹＷＧＭＬＥＥＧＲＩＴＱＴＴＡＮＩＬＭＲＳＶＤＥＡＭＤＬＶＰＴＱＥＬＣＤＷＫＧＬＲＳＮＶＨＦＰＮＹＹＲＦＬＱＭＳＲＬＰＲＲＬＩＴＹＦＴＶＥＲＬＥＳＧＣＹＩＣＡＡＦＬＲＡＨＲＩＡＲＲＱＬＨＤＦＬＧＤＳＥＶＡＲＩＶＩＤＥＳＮＡＥＧＥＥＡＲＫＦＬＥＤＶＲＶＴＦＰＱＶＬＲＶＬＫＴＲＱＶＴＹＳＶＬＴＨＬＳＥＹＩＱＮＬＱＫＴＧＬＬＥＥＫＥＭＡＨＬＤＤＡＬＱＴＤＬＫＫＦＫＲＮＰＰＬＶＫＭＰＲＶＳＤＬＬＮＴＨＰＬＶＧＡＬＰＡＡＭＲＤＰＬＬＳＳＴＫＥＴＶＫＧＨＧＴＩＬＹＲＥＧＳＲＰＴＧＩＷＬＶＳＩＧＶＶＫＷＴＳＱＲＬＳＳＲＨＳＬＤＰＩＬＳＨＧＳＴＬＧＬＹＥＶＬＩＧＫＰＹＩＣＤＭＩＴＤＳＶＶＨＣＦＦＩＥＡＥＫＩＥＱＬＲＱＳＤＰＳＩＥＩＦＬＷＱＥＳＡＬＶＶＡＲＬＬＬＰＭＭＦＥＫＭＡＴＨＥＬＲＶＬＩＴＥＲＳＴＭＮＩＹＩＫＧＥＥＩＥＬＥＱＮＦＩＧＩＬＬＥＧＦＬＫＴＫＮＱＴＬＩＴＰＰＧＬＬＬＰＰＮＡＤＬＮＬＦＧＬＥＳＳＡＩＮＲＩＤＹＣＹＴＡＰＳＹＱＶＥＡＲＡＲＩＬＦＶＥＩＧＲＰＥＩＥＡＤＬＱＲＳＡＳＬＩＳＱＴＬＥＬＰＲＴＱＳＫＥＨＳＧＬＬＳＷＰＥＳＦＲＫＳＲＧＡＱＮＧＡＳＬＴＥＩＲＤＨＰＡＳＦＳＡＲＡＬＱＬＳＭＹＧＳＭＩＮＤＭＫＳＧＱＧＱＧＱＲＲＱＲＨＲＨＴＫＡＳＳＮＫＡＨＳＳＳＹＰＲＶＰＳＲＳＳＮＴＱＲＰＬＬＳＶＱＳＥＧＡＮＭＴＴＡＲＱＡＡＡＡＧＡＳＬＰＰＥＰＥＥＡＧＲＲＲＲＲＱＲＫＡＩＥＥＤＥＤＮＳＳＤＥＳＡＧＥＥＶＩＶＲＶＤＳＰＳＭＬＴＦＲＱＰＳＳＡＡＤＲ
配列番号９６－ＯｓＳＯＳ１－Ｑ７ＸＢＦ９
ＭＤＮＰＥＡＥＰＤＤＡＶＬＦＶＧＶＳＬＶＬＧＩＡＳＲＨＬＬＲＧＴＲＶＰＹＴＶＡＬＬＶＬＧＶＡＬＧＳＬＥＦＧＴＫＨＧＭＧＫＬＧＡＧＩＲＩＷＡＮＩＮＰＤＬＬＬＡＶＦＬＰＡＬＬＦＥＳＳＦＳＭＥＩＨＱＩＫＫＣＭＡＱＭＶＬＬＡＧＰＧＶＬＩＳＴＦＦＬＧＳＡＬＫＬＴＦＰＹＮＷＮＷＫＴＳＬＬＬＧＧＬＬＳＡＴＤＰＶＡＶＶＡＬＬＫＥＬＧＡＳＫＫＬＳＴＩＩＥＧＥＳＬＭＮＤＧＴＡＩＶＶＹＱＬＦＹＲＭＶＬＧＲＴＦＤＡＧＳＩＩＫＦＬＳＥＶＳＬＧＡＶＡＬＧＬＡＦＧＩＡＳＶＬＷＬＧＦＩＦＮＤＴＩＩＥＩＡＬＴＬＡＶＳＹＩＡＦＦＴＡＱＤＡＬＥＶＳＧＶＬＴＶＭＴＬＧＭＦＹＡＡＦＡＫＴＡＦＫＧＤＳＱＱＳＬＨＨＦＷＥＭＶＡＹＩＡＮＴＬＩＦＩＬＳＧＶＶＩＡＤＧＶＬＥＮＮＶＨＦＥＲＨＧＡＳＷＧＦＬＬＬＬＹＶＦＶＱＩＳＲＩＬＶＶＶＩＬＹＰＬＬＲＨＦＧＹＧＬＤＬＫＥＡＴＩＬＶＷＡＧＬＲＧＡＶＡＬＳＬＳＬＳＶＫＲＡＳＤＡＶＱＴＨＬＫＰＶＤＧＴＭＦＶＦＦＴＧＧＩＶＦＬＴＬＩＦＮＧＳＴＴＱＦＬＬＨＬＬＧＭＤＲＬＡＡＴＫＬＲＩＬＮＹＴＫＹＥＭＬＮＫＡＬＥＡＦＧＤＬＲＤＤＥＥＬＧＰＰＡＤＷＶＴＶＫＫＹＩＴＣＬＮＧＬＤＤＥＰＶＨＰＨＡＶＳＤＲＮＤＲＭＨＴＭＮＬＲＤＩＲＶＲＬＬＮＧＶＱＡＡＹＷＧＭＬＥＥＧＲＩＴＱＴＴＡＮＩＬＭＲＳＶＤＥＡＭＤＬＶＰＴＱＥＬＣＤＷＫＧＬＲＳＮＶＨＦＰＮＹＹＲＦＬＱＭＳＲＬＰＲＲＬＩＴＹＦＴＶＥＲＬＥＳＧＣＹＩＣＡＡＦＬＲＡＨＲＩＡＲＲＱＬＨＤＦＬＧＤＳＥＶＡＲＩＶＩＤＥＳＮＡＥＧＥＥＡＲＫＦＬＥＤＶＲＶＴＦＰＱＶＬＲＶＬＫＴＲＱＶＴＹＳＶＬＴＨＬＳＥＹＩＱＮＬＱＫＴＧＬＬＥＥＫＥＭＡＨＬＤＤＡＬＱＴＤＬＫＫＦＫＲＮＰＰＬＶＫＭＰＲＶＳＤＬＬＮＴＨＰＬＶＧＡＬＰＡＡＭＲＤＰＬＬＳＳＴＫＥＴＶＫＧＨＧＴＩＬＹＲＥＧＳＲＰＴＧＩＷＬＶＳＩＧＶＶＫＷＴＳＱＲＬＳＳＲＨＳＬＤＰＩＬＳＨＧＳＴＬＧＬＹＥＶＬＩＧＫＰＹＩＣＤＭＩＴＤＳＶＶＨＣＦＦＩＥＡＥＫＩＥＱＬＲＱＳＤＰＳＩＥＩＦＬＷＱＥＳＡＬＶＶＡＲＬＬＬＰＭＭＦＥＫＭＡＴＨＥＬＲＶＬＩＴＥＲＳＴＭＮＩＹＩＫＧＥＥＩＥＬＥＱＮＦＩＧＩＬＬＥＧＦＬＫＴＫＮＱＴＬＩＴＰＰＧＬＬＬＰＰＮＡＤＬＮＬＦＧＬＥＳＳＡＩＮＲＩＤＹＣＹＴＡＰＳＹＱＶＥＡＲＡＲＩＬＦＶＥＩＧＲＰＥＩＥＡＤＬＱＲＳＡＳＬＩＳＱＴＬＥＬＰＲＴＱＳＫＥＨＳＥＴＩＱＱＬＳＧＡＱＮＧＡＳＬＴＥＩＲＤＨＰＡＳＦＳＡＲＡＬＱＬＳＭＹＧＳＭＩＮＤＭＫＳＧＱＧＱＧＱＲＲＱＲＨＲＨＴＫＡＳＳＮＫＡＨＳＳＳＹＰＲＶＰＳＳＳＳＮＴＱＲＰＬＬＳＶＱＳＥＧＡＮＭＴＴＡＲＱＡＡＡＡＧＡＳＬＰＰＥＰＥＥＡＧＲＲＲＲＲＱＲＫＡＩＥＥＤＥＤＮＳＳＤＥＳＡＧＥＥＶＩＶＲＶＤＳＰＳＭＬＴＦＲＱＰＳＳＡＡＤＲ
配列番号９７－ＯｓＮＨＸ１－Ｑ９ＳＸＪ８
ＭＧＭＥＶＡＡＡＲＬＧＡＬＹＴＴＳＤＹＡＳＶＶＳＩＮＬＦＶＡＬＬＣＡＣＩＶＬＧＨＬＬＥＥＮＲＷＶＮＥＳＩＴＡＬＩＩＧＬＣＴＧＶＶＩＬＬＭＴＫＧＫＳＳＨＬＦＶＦＳＥＤＬＦＦＩＹＬＬＰＰＩＩＦＮＡＧＦＱＶＫＫＫＱＦＦＲＮＦＭＴＩＴＬＦＧＡＶＧＴＭＩＳＦＦＴＩＳＩＡＡＩＡＩＦＳＲＭＮＩＧＴＬＤＶＧＤＦＬＡＩＧＡＩＦＳＡＴＤＳＶＣＴＬＱＶＬＮＱＤＥＴＰＦＬＹＳＬＶＦＧＥＧＶＶＮＤＡＴＳＩＶＬＦＮＡＬＱＮＦＤＬＶＨＩＤＡＡＶＶＬＫＦＬＧＮＦＦＹＬＦＬＳＳＴＦＬＧＶＦＡＧＬＬＳＡＹＩＩＫＫＬＹＩＧＲＨＳＴＤＲＥＶＡＬＭＭＬＭＡＹＬＳＹＭＬＡＥＬＬＤＬＳＧＩＬＴＶＦＦＣＧＩＶＭＳＨＹＴＷＨＮＶＴＥＳＳＲＶＴＴＫＨＡＦＡＴＬＳＦＩＡＥＴＦＬＦＬＹＶＧＭＤＡＬＤＩＥＫＷＥＦＡＳＤＲＰＧＫＳＩＧＩＳＳＩＬＬＧＬＶＬＩＧＲＡＡＦＶＦＰＬＳＦＬＳＮＬＴＫＫＡＰＮＥＫＩＴＷＲＱＱＶＶＩＷＷＡＧＬＭＲＧＡＶＳＩＡＬＡＹＮＫＦＴＲＳＧＨＴＱＬＨＧＮＡＩＭＩＴＳＴＩＴＶＶＬＦＳＴＭＶＦＧＭＭＴＫＰＬＩＲＬＬＬＰＡＳＧＨＰＶＴＳＥＰＳＳＰＫＳＬＨＳＰＬＬＴＳＭＱＧＳＤＬＥＳＴＴＮＩＶＲＰＳＳＬＲＭＬＬＴＫＰＴＨＴＶＨＹＹＷＲＫＦＤＤＡＬＭＲＰＭＦＧＧＲＧＦＶＰＦＳＰＧＳＰＴＥＱＳＨＧＧＲ
配列番号９８－ＯｓＮＨＸ１－Ｑ６ＶＶＡ７
ＭＧＭＥＶＡＡＡＲＬＧＰＬＹＴＴＳＤＹＡＳＶＶＳＩＮＬＦＶＡＬＬＣＡＣＩＶＬＧＨＬＬＥＥＮＲＷＶＮＥＳＩＴＡＬＩＩＧＬＣＴＧＶＶＩＬＬＭＴＫＧＫＳＳＨＬＦＶＦＳＥＤＬＦＦＩＹＬＬＰＰＩＩＦＮＡＧＦＱＶＫＫＫＱＦＦＲＮＦＭＴＩＴＬＦＧＡＶＧＴＭＩＳＦＦＴＩＳＩＡＡＩＡＩＦＳＲＭＮＩＧＴＬＤＶＧＤＦＬＡＩＲＡＩＦＰＡＴＤＳＶＣＴＬＱＶＬＮＱＤＥＴＰＦＬＹＳＬＶＦＧＥＧＶＶＮＤＡＴＳＩＶＬＦＮＡＬＱＮＦＤＬＶＨＩＤＡＡＶＶＬＫＦＬＧＮＦＦＹＬＦＬＳＳＴＦＬＧＶＦＡＧＬＬＳＡＹＩＩＫＫＬＹＩＧＲＨＳＴＤＲＥＶＡＬＭＭＬＭＡＹＬＳＹＭＬＡＥＬＬＤＬＳＧＩＬＴＶＦＦＣＧＩＶＭＳＨＹＴＷＨＮＶＴＥＳＳＲＶＴＴＫＨＡＦＡＴＬＳＦＩＡＥＴＦＬＦＬＹＶＧＭＤＡＬＤＩＥＫＷＥＦＡＳＤＲＰＧＫＳＩＧＩＳＳＩＬＬＧＬＶＬＩＧＲＡＡＦＶＦＰＬＳＦＬＳＮＬＴＫＫＡＰＮＥＫＲＴＷＲＱＱＶＶＩＷＷＡＧＬＭＲＧＡＶＳＩＡＬＡＹＮＫＦＴＲＳＧＨＴＱＬＨＧＮＡＩＭＩＴＳＴＩＴＶＶＬＷＳＴＭＶＦＧＭＭＴＫＰＬＩＲＬＬＬＰＡＳＧＨＰＶＴＳＥＰＳＳＰＫＳＬＨＳＰＬＬＴＲＭＱＧＳＤＬＥＳＴＴＮＩＶＲＰＳＳＬＲＭＬＬＴＫＰＴＨＴＶＨＹＹＷＲＫＦＤＤＡＬＭＲＰＭＦＧＧＲＧＦＶＰＦＳＰＧＳＰＴＥＱＳＨＧＧＲ
配列番号９９－ＯｓＨＫＴ１－Ｑ０Ｄ９Ｓ３
ＭＴＳＩＹＨＤＦＩＨＮＫＬＱＳＦＧＲＩＧＲＹＦＶＮＦＶＶＬＡＨＲＦＩＡＬＨＩＨＰＦＷＩＱＬＳＹＦＬＬＩＳＩＬＧＳＶＬＬＭＦＬＫＰＳＮＰＥＦＲＰＧＹＩＤＭＬＦＬＳＴＳＡＬＴＬＳＳＬＩＴＩＥＭＥＶＬＳＳＳＱＩＶＶＩＴＬＬＭＬＬＧＧＥＶＦＶＳＦＬＧＬＭＬＲＬＮＨＫＨＮＰＥＦＳＧＤＫＶＳＳＶＰＩＥＬＤＴＩＮＳＡＳＴＶＩＳＣＥＥＬＱＬＥＡＡＩＰＥＶＰＳＳＴＩＫＤＬＫＲＳＫＲＬＲＷＦＬＧＦＶＶＦＳＹＦＶＶＩＨＶＡＧＦＬＬＶＬＷＹＩＳＲＶＳＳＡＫＡＰＬＫＫＫＧＩＮＩＡＬＦＳＦＳＶＴＶＳＳＦＡＮＶＧＬＶＰＴＮＥＮＭＡＩＦＳＫＮＰＧＬＬＬＬＦＩＧＱＩＬＡＧＮＴＬＹＰＬＦＬＲＬＬＩＷＦＬＧＫＶＴＫＬＲＥＬＫＬＭＩＫＮＰＥＥＬＱＹＤＹＬＬＰＫＬＰＴＡＦＬＡＳＴＶＩＧＬＭＡＳＬＶＴＬＦＧＡＶＤＷＮＳＳＶＦＤＧＬＳＳＹＱＫＩＩＮＡＬＦＭＡＶＮＡＲＨＳＧＥＮＳＩＤＣＳＬＩＡＰＡＶＬＶＬＦＩＩＬＭＹＬＰＰＳＴＴＦＡＬＳＮＧＤＥＫＴＡＮＫＫＡＫＲＫＬＧＬＶＶＱＮＬＡＦＳＱＬＡＣＩＳＶＦＶＩＶＡＦＩＴＥＲＳＲＬＲＮＤＰＬＮＦＳＡＬＮＭＩＦＥＩＩＳＡＹＧＮＶＧＬＳＴＧＹＳＣＳＲＬＱＫＬＨＰＧＳＩＣＱＤＫＰＹＳＬＳＧＷＷＳＤＥＧＫＬＬＬＶＦＶＭＬＹＧＲＬＫＡＦＴＫＧＴＧＥＹＷＲＬＷ
配列番号１００－ＯｓＳＯＳ２－Ｑ６９Ｑ４７
ＭＧＧＥＥＧＭＡＡＧＲＫＫＲＶＧＲＹＥＶＧＲＴＩＧＱＧＴＦＡＫＶＫＦＡＶＤＡＤＴＧＡＡＶＡＭＫＶＬＤＫＤＴＩＬＮＨＲＭＬＨＱＩＫＲＥＩＳＩＭＫＩＶＲＨＰＮＩＶＲＬＮＥＶＬＡＧＫＴＫＩＹＩＩＬＥＬＩＴＧＧＥＬＦＤＫＩＡＲＱＧＫＬＲＥＮＥＡＲＫＹＦＱＱＬＩＤＡＩＮＹＣＨＳＫＧＶＹＨＲＤＬＫＰＥＮＬＬＬＤＳＲＧＮＬＫＶＳＤＦＧＬＳＴＬＡＱＫＧＶＧＬＬＨＴＴＣＧＴＰＮＹＶＡＰＥＶＬＳＮＮＧＹＤＧＳＡＡＤＶＷＳＣＧＶＩＬＹＶＬＭＡＧＹＬＰＦＥＥＤＤＬＰＴＬＹＤＫＩＴＡＧＱＦＳＣＰＹＷＦＳＰＧＡＴＳＬＩＨＲＩＬＤＰＮＰＫＴＲＩＴＩＥＱＩＲＥＤＴＷＦＫＫＴＹＶＡＩＫＲＧＥＤＥＮＶＤＬＤＤＶＱＡＶＦＤＮＩＥＤＫＹＶＳＥＱＶＴＨＮＤＧＧＰＬＶＭＮＡＦＥＭＩＴＬＳＱＧＬＤＬＳＡＬＦＤＲＱＱＥＦＶＫＲＱＴＲＦＶＳＲＫＰＡＫＴＩＶＡＴＩＥＶＶＡＥＴＭＧＬＫＶＨＳＱＮＹＫＬＲＬＥＧＶＳＳＮＲＭＳＰＦＡＶＶＬＱＶＦＥＶＡＰＳＬＦＭＶＤＶＲＫＶＡＧＤＴＬＥＹＨＲＦＹＫＮＬＣＮＫＭＥＳＩＩＷＲＰＩＥＶＳＡＫＳＡＬＬＲＴＡＴＣ
配列番号１０１－ＯｓＡＨＡ３－Ｑ８Ｌ６Ｉ３
ＭＡＥＤＫＧＧＬＤＡＶＬＫＥＳＶＤＬＥＮＩＰＩＥＥＶＦＱＮＬＫＣＣＲＱＧＬＴＳＥＥＡＱＬＲＬＱＬＦＧＰＮＫＬＥＥＫＥＥＳＫＦＬＫＦＬＧＦＭＷＮＰＬＳＷＶＭＥＡＡＡＩＭＡＩＡＬＡＮＧＧＧＫＰＰＤＷＱＤＦＶＧＩＩＴＬＬＬＩＮＳＴＩＳＦＩＥＥＮＮＡＧＮＡＡＡＡＬＭＡＲＬＡＰＫＡＫＶＬＲＮＧＳＷＴＥＥＥＡＡＩＬＶＰＧＤＩＩＳＩＫＬＧＤＩＩＰＡＤＡＲＬＬＥＧＤＰＬＫＩＤＱＳＡＬＴＧＥＳＬＰＡＴＫＧＰＧＤＧＶＹＳＧＳＴＶＫＱＧＥＩＥＡＶＶＩＡＴＧＶＨＴＦＦＧＫＡＡＨＬＶＤＳＴＮＱＶＧＨＦＱＫＶＬＴＡＩＧＮＦＣＩＣＳＩＡＶＧＭＦＶＥＩＩＶＭＹＰＩＱＨＲＰＹＲＰＧＩＤＮＬＬＶＬＬＩＧＧＩＰＩＡＭＰＴＶＬＳＶＴＭＡＩＧＳＨＲＬＳＱＱＧＡＩＴＫＲＭＴＡＩＥＥＭＡＧＭＤＶＬＣＳＤＫＴＧＴＬＴＬＮＫＬＴＶＤＫＮＬＩＥＩＦＥＲＧＶＴＱＤＱＶＩＬＭＡＡＲＡＳＲＴＥＮＱＤＡＩＤＴＡＩＶＧＭＬＡＤＰＫＥＡＲＡＧＩＱＥＶＨＦＬＰＦＮＰＴＤＫＲＴＡＬＴＹＩＤＳＤＧＫＭＹＲＶＳＫＧＡＰＥＱＩＬＮＬＡＨＮＫＴＱＩＥＲＲＶＨＡＶＩＤＫＦＡＥＲＧＬＲＳＬＡＶＡＹＱＥＶＰＤＧＲＫＥＳＰＧＧＰＷＲＦＶＡＬＬＰＬＦＤＰＰＲＨＤＳＡＥＴＩＲＲＡＬＮＬＧＶＮＶＫＭＩＴＧＤＱＬＡＩＧＫＥＴＧＲＲＬＧＭＧＴＮＭＹＰＳＳＡＬＬＧＱＮＫＤＥＳＶＡＡＬＰＶＤＤＬＩＥＫＡＤＧＦＡＧＶＦＰＥＨＫＹＥＩＶＫＲＬＱＡＲＫＨＩＣＧＭＴＧＤＧＶＮＤＡＰＡＬＫＫＡＤＩＧＩＡＶＡＤＡＴＤＡＡＲＳＡＳＤＩＶＬＴＥＰＧＬＳＶＩＩＳＡＶＬＴＳＲＡＩＦＱＲＭＫＮＹＴＩＹＡＶＳＩＴＩＲＩＶＦＧＦＭＬＬＡＬＩＷＥＦＤＦＰＰＦＭＶＬＩＩＡＩＬＮＤＧＴＩＭＴＩＳＫＤＬＶＫＰＳＰＬＰＤＳＷＫＬＡＥＩＦＴＴＧＶＶＬＧＧＹＬＡＭＭＴＶＩＦＦＷＡＡＹＫＴＮＦＦＰＲＩＦＨＶＥＳＬＥＫＴＡＱＤＤＹＱＫＬＡＳＡＶＹＬＱＶＳＴＩＳＱＡＬＩＦＶＴＲＳＲＳＷＳＦＩＥＲＰＧＦＬＬＶＦＡＦＦＶＡＱＬＩＡＴＬＩＡＶＹＡＮＷＡＦＴＳＩＫＧＩＧＷＧＷＡＧＩＶＷＬＹＮＬＶＦＹＦＰＬＤＩＩＫＦＬＩＲＹＡＬＳＧＫＡＷＤＬＶＩＥＱＲＩＡＦＴＲＫＫＤＦＧＫＥＥＲＥＬＫＷＡＨＡＨＲＴＬＨＧＬＱＰＰＤＡＫＰＦＰＥＫＴＧＹＳＥＬＮＱＭＡＥＥＡＫＲＲＡＥＩＡＲＬＲＥＬＨＴＬＫＧＨＶＥＳＶＶＫＬＫＧＬＤＩＤＴＩＨＱＳＹＴＶ
配列番号１０２－ＯｓＶＨＡ－Ａ－Ｑ６５１Ｔ８
ＭＳＹＤＲＶＴＴＦＥＤＳＥＫＥＳＥＹＧＹＶＲＫＶＳＧＰＶＶＶＡＤＧＭＧＧＡＡＭＹＥＬＶＲＶＧＮＤＮＬＩＧＥＩＩＲＬＥＧＤＳＡＴＩＱＶＹＥＥＴＡＧＬＭＶＮＤＰＶＬＲＴＲＫＰＬＳＶＥＬＧＰＧＩＬＧＮＩＦＤＧＩＱＲＰＬＫＴＩＡＩＫＳＧＤＶＹＩＰＲＧＶＳＶＰＡＬＤＫＤＱＬＷＤＦＥＰＫＫＬＧＶＧＤＡＩＴＧＧＤＬＹＡＴＶＦＥＮＴＬＭＫＨＨＶＡＬＰＰＧＳＭＧＫＩＳＹＩＡＰＡＧＱＹＳＬＱＤＴＶＬＥＬＥＦＱＧＩＫＫＱＦＴＭＬＱＴＷＰＶＲＳＰＲＰＶＳＳＫＬＡＡＤＴＰＬＬＴＧＱＲＶＬＤＡＬＦＰＳＶＬＧＧＴＣＡＩＰＧＡＦＧＣＧＫＴＶＩＳＱＡＬＳＫＹＳＮＳＥＡＶＶＹＶＧＣＧＥＲＧＮＥＭＡＥＶＬＭＤＦＰＱＬＴＭＴＬＰＤＧＲＥＥＳＶＭＫＲＴＴＬＶＡＮＴＳＮＭＰＶＡＡＲＥＡＳＩＹＴＧＩＴＩＡＥＹＦＲＤＭＧＹＮＶＳＭＭＡＤＳＴＳＲＷＡＥＡＬＲＥＩＳＧＲＬＡＥＭＰＡＤＳＧＹＰＡＹＬＡＡＲＬＡＳＦＹＥＲＡＧＫＶＫＣＬＧＳＰＤＲＴＧＳＶＴＩＶＧＡＶＳＰＰＧＧＤＦＳＤＰＶＴＳＡＴＬＳＩＶＱＶＦＷＧＬＤＫＫＬＡＱＲＫＨＦＰＳＶＮＷＬＩＳＹＳＫＹＳＫＡＬＥＳＦＹＥＫＦＤＱＤＦＩＤＩＲＴＫＡＲＥＶＬＱＲＥＤＤＬＮＥＩＶＱＬＶＧＫＤＡＬＡＥＳＤＫＩＴＬＥＴＡＫＬＬＲＥＤＹＬＡＱＮＡＦＴＰＹＤＫＦＣＰＦＹＫＳＶＷＭＭＲＮＩＩＨＦＮＴＬＡＮＱＡＶＥＲＡＡＮＡＤＧＱＫＩＴＹＳＶＩＫＨＲＭＧＤＬＦＹＲＬＶＳＱＫＦＥＤＰＡＥＧＥＤＶＬＶＡＫＦＱＫＬＹＤＤＬＴＴＧＦＲＮＬＥＤＥＡＲ
配列番号１０３－ＯｓＶＨＡ－Ｂ－Ｑ７ＦＶ２５
ＭＧＬＶＫＤＧＡＡＤＬＥＥＧＴＬＥＩＧＭＥＹＲＴＶＳＧＶＡＧＰＬＶＩＬＤＫＶＫＧＰＫＹＱＥＩＶＮＩＲＬＧＤＧＴＴＲＲＧＱＶＬＥＶＤＧＥＫＡＶＶＱＶＦＥＧＴＳＧＩＤＮＫＹＴＴＶＱＦＴＧＥＶＬＫＴＰＶＳＬＤＭＬＧＲＩＦＮＧＳＧＫＰＩＤＮＧＰＰＩＬＰＥＡＹＬＤＩＳＧＳＳＩＮＰＳＥＲＴＹＰＥＥＭＩＱＴＧＩＳＴＩＤＶＭＮＳＩＡＲＧＱＫＩＰＬＦＳＡＡＧＬＰＨＮＥＩＡＡＱＩＣＲＱＡＧＬＶＫＳＬＥＫＧＫＨＡＥＧＧＥＤＤＮＦＡＩＶＦＡＡＭＧＶＮＭＥＴＡＱＦＦＫＲＤＦＥＥＮＧＳＭＥＲＶＴＬＦＬＮＬＡＮＤＰＴＩＥＲＩＩＴＰＲＩＡＬＴＴＡＥＹＬＡＹＥＣＧＫＨＶＬＶＩＬＴＤＭＳＳＹＡＤＡＬＲＥＶＳＡＡＲＥＥＶＰＧＲＲＧＹＰＧＹＭＹＴＤＬＡＴＩＹＥＲＡＧＲＩＥＧＲＳＧＳＩＴＱＩＰＩＬＴＭＰＮＤＤＩＴＨＰＴＰＤＬＴＧＹＩＴＥＧＱＩＹＩＤＲＱＬＨＮＲＱＩＹＰＰＩＮＶＬＰＳＬＳＲＬＭＫＳＡＩＧＥＧＭＴＲＲＤＨＳＤＶＳＮＱＬＹＡＮＹＡＩＧＫＤＶＱＡＭＫＡＶＶＧＥＥＡＬＳＳＥＤＬＬＹＬＥＦＬＤＫＦＥＲＫＦＶＴＱＧＡＹＤＴＲＮＩＦＱＳＬＤＬＡＷＴＬＬＲＩＦＰＲＥＬＬＨＲＩＰＡＫＴＬＤＱＹＹＳＲＤＡＴＨ
配列番号１０４－ＯｓＰｓｂＯ－Ａ５ＪＶ９３
ＭＡＡＳＬＱＡＡＡＴＬＭＰＡＫＩＧＧＲＡＳＳＡＲＰＳＳＨＶＡＲＡＦＧＶＤＡＧＡＲＩＴＣＳＬＱＳＤＩＲＥＶＡＳＫＣＡＥＡＡＫＭＡＧＦＡＬＡＴＳＡＬＬＶＳＧＡＳＡＥＧＡＰＫＲＬＴＦＤＥＩＱＳＫＴＹＭＥＶＫＧＴＧＴＡＮＱＣＰＴＩＤＧＧＶＤＳＦＰＦＫＡＧＫＹＥＭＫＫＦＣＬＥＰＴＳＦＴＶＫＡＥＧＩＱＫＮＥＰＰＡＦＱＫＴＫＬＭＴＲＬＴＹＴＬＤＥＭＥＧＰＬＥＶＧＡＤＧＴＬＫＦＥＥＫＤＧＩＤＹＡＡＶＴＶＱＬＰＧＧＥＲＶＰＦＬＦＴＶＫＱＬＶＡＴＧＫＰＥＳＦＳＧＰＦＬＶＰＳＹＲＧＳＳＦＬＤＰＫＧＲＧＧＳＴＧＹＤＮＡＶＡＬＰＡＧＧＲＧＤＥＥＥＬＡＫＥＮＶＫＮＡＳＳＳＴＧＮＩＴＬＳＶＴＫＳＫＰＥＴＧＥＶＩＧＶＦＥＲＶＱＰＳＤＴＤＬＧＡＫＡＰＫＤＶＫＩＱＧＶＷＹＡＱＬＥＳＮ
配列番号１０５－ＯｓＰｓｂＰ－ＸＰ＿００２８７６３７７．１／Ｑ０ＫＩＷ５フラグメント
ＶＶＮＡＳＳＳＥＡＳＳＤＥＫＮＶＴＲＲＲＬＡＬＬＧＡＧＡＬＡＴＧＬＬＫＳＳＳＡＹＡＥＥＶＰＫＮＹＫＳＹＶＤＳＫＤＧＹＳＹＬＹＰＡＤＷＲＤＦＤＦＬＧＨＤＳＡＦＫＤＲＮＶＡＬＱＣＶＲＶＧＦＩＰＴＴＫＴＤＩＲＤＬＧＰＭＤＥＡＩＦＮＬＶＮＮＶＹＡＡＰＮＱＩＰＴＶＹＤＭＱＥＲＴＶＨＧＫＮＹＷＴ
配列番号１０６－ＯｓＰｓｂＱ－Ｐ８３６４６
ＭＡＱＡＭＡＳＭＴＧＬＳＱＧＶＱＬＰＡＧＰＲＲＡＧＧＲＳＲＬＡＶＶＲＡＤＡＡＡＡＤＶＱＴＧＲＲＡＶＬＧＬＶＡＴＧＩＡＧＧＡＬＡＱＡＡＬＡＥＡＡＫＰＩＫＬＧＰＰＰＰＰＳＧＧＬＰＧＴＬＮＳＤＱＡＲＤＴＤＬＰＬＲＥＲＦＹＬＱＰＬＰＰＡＥＡＡＡＲＡＫＥＳＡＱＤＩＩＮＬＫＰＬＩＥＫＫＱＷＰＦＶＲＤＤＬＲＬＲＡＳＹＬＲＹＤＬＫＴＶＩＮＳＫＰＫＤＥＫＫＧＬＫＤＬＴＧＫＬＦＡＴＩＤＧＬＤＨＡＡＫＩＫＳＰＥＥＡＥＫＹＹＴＬＴＫＳＡＬＧＤＶＬＡＫＬＧ
配列番号１０７－ＯｓＯＳＫ１－Ｑ８５２Ｑ２
ＭＥＧＡＧＲＤＧＮＰＬＧＧＹＲＩＧＫＴＬＧＩＧＳＦＧＫＶＫＩＡＥＨＩＬＴＧＨＫＶＡＩＫＩＬＮＲＲＫＩＫＳＭＥＭＥＥＫＶＫＲＥＩＫＩＬＲＬＦＭＨＰＨＩＩＲＬＹＥＶＩＤＴＰＡＤＩＹＶＶＭＥＹＶＫＳＧＥＬＦＤＹＩＶＥＫＧＲＬＱＥＥＥＡＲＲＦＦＱＱＩＩＳＧＶＥＹＣＨＲＮＭＶＶＨＲＤＬＫＰＥＮＬＬＬＤＳＫＣＮＶＫＩＡＤＦＧＬＳＮＶＭＲＤＧＨＦＬＫＴＳＣＧＳＰＮＹＡＡＰＥＶＩＳＧＫＬＹＡＧＰＥＶＤＶＷＳＣＧＶＩＬＹＡＬＬＣＧＴＬＰＦＤＤＥＮＩＰＮＬＦＫＫＩＫＧＧＩＹＴＬＰＳＨＬＳＰＬＡＲＤＬＩＰＲＭＬＶＶＤＰＭＫＲＩＴＩＲＥＩＲＥＨＱＷＦＴＶＧＬＰＲＹＬＡＶＰＰＰＤＴＡＱＱＶＫＫＬＤＤＥＴＬＮＤＶＩＮＭＧＦＤＫＮＱＬＩＥＳＬＨＫＲＬＱＮＥＡＴＶＡＹＹＬＬＬＤＮＲＬＲＴＴＳＧＹＬＧＡＥＦＨＥＳＭＥＳＳＬＡＱＶＴＰＡＥＴＰＮＳＡＴＤＨＲＱＨＧＨＭＥＳＰＧＦＧＬＲＨＨＦＡＡＤＲＫＷＡＬＧＬＱＳＲＡＨＰＲＥＩＩＴＥＶＬＫＡＬＱＥＬＮＶＣＷＫＫＩＧＨＹＮＭＫＣＲＷＳＰＳＦＰＳＨＥＳＭＭＨＮＮＨＧＦＧＡＥＳＡＩＩＥＴＤＤＳＥＫＳＴＨＴＶＫＦＥＩＱＬＹＫＴＲＤＥＫＹＬＬＤＬＱＲＶＳＧＰＱＬＬＦＬＤＬＣＳＡＦＬＴＱＬＲＶＬ
配列番号１０８－ＯｓＯＳＫ１－Ｑ０ＤＧＩ１
ＭＥＧＡＧＲＤＧＮＰＬＧＧＹＲＩＧＫＴＬＧＩＧＳＦＧＫＶＫＩＡＥＨＩＬＴＧＨＫＶＡＩＫＩＬＮＲＲＫＩＫＳＭＥＭＥＥＫＶＫＲＥＩＫＩＬＲＬＦＭＨＰＨＩＩＲＬＹＥＶＩＤＴＰＡＤＩＹＶＶＭＥＹＶＫＳＧＥＬＦＤＹＩＶＥＫＧＲＬＱＥＥＥＡＲＲＦＦＱＱＩＩＳＧＶＥＹＣＨＲＮＭＶＶＨＲＤＬＫＰＥＮＬＬＬＤＳＫＣＮＶＫＩＡＤＦＧＬＳＮＶＭＲＤＧＨＦＬＫＴＳＣＧＳＰＮＹＡＡＰＥＶＩＳＧＫＬＹＡＧＰＥＶＤＶＷＳＣＧＶＩＬＹＡＬＬＣＧＴＬＰＦＤＤＥＮＩＰＮＬＦＫＫＩＫＧＧＩＹＴＬＰＳＨＬＳＰＬＡＲＤＬＩＰＲＭＬＶＶＤＰＭＫＲＩＴＩＲＥＩＲＥＨＱＷＦＴＶＧＬＰＲＹＬＡＶＰＰＰＤＴＡＱＱＶＫＫＬＤＤＥＴＬＮＤＶＩＮＭＧＦＤＫＮＱＬＩＥＳＬＨＫＲＬＱＮＥＡＴＶＡＹＹＬＬＬＤＮＲＬＲＴＴＳＧＹＬＧＡＥＦＨＥＳＭＥＳＳＬＡＱＶＴＰＡＥＴＰＮＳＡＴＤＨＲＱＨＧＨＭＥＳＰＧＦＧＬＲＨＨＦＡＡＤＲＫＷＡＬＧＬＱＳＲＡＨＰＲＥＩＩＴＥＶＬＫＡＬＱＥＬＮＶＣＷＫＫＩＧＨＹＮＭＫＣＲＷＳＰＳＦＰＳＨＥＳＭＭＨＮＮＨＧＦＧＡＥＳＡＩＩＥＴＤＤＳＥＫＳＴＨＴＶＫＦＥＩＱＬＹＫＴＲＤＥＫＹＬＬＤＬＱＲＶＳＧＰＱＬＬＦＬＤＬＣＳＡＦＬＴＱＬＲＶＬ
配列番号１０９－ＯｓＯＳＫ１－Ｑ９ＺＴＦ６
ＭＥＧＡＧＳＤＧＮＰＬＧＧＹＲＩＧＫＴＬＧＩＧＳＦＧＫＶＫＩＡＥＨＩＬＴＧＨＫＶＡＩＫＩＬＮＲＲＫＳＭＥＭＥＥＫＶＫＲＥＩＫＩＬＲＬＦＭＨＰＨＩＩＲＬＹＥＶＩＤＴＰＡＤＩＹＶＶＭＥＹＶＫＳＧＥＬＦＤＹＤＶＥＫＧＲＬＱＥＥＥＡＲＲＦＦＱＱＩＩＳＧＶＥＹＣＨＲＮＭＶＶＲＲＤＬＫＰＥＮＬＬＬＤＳＫＣＮＶＫＩＡＤＦＧＬＳＮＶＭＲＤＧＨＦＬＫＴＳＣＧＳＰＮＹＡＡＰＥＶＩＳＧＫＬＹＡＧＰＥＶＤＶＷＳＣＧＶＩＬＹＡＬＬＣＧＴＬＰＦＤＤＥＮＩＰＮＬＦＫＮＩＫＧＧＩＹＴＬＰＳＨＬＳＰＬＧＲＤＬＩＰＲＭＬＶＶＤＰＭＫＲＩＴＩＲＥＩＲＥＨＱＷＦＴＶＧＬＰＲＹＬＡＶＰＰＰＤＴＡＱＱＶＫＫＬＤＤＥＴＱＮＤＶＩＮＭＧＦＤＫＮＱＬＩＥＳＬＨＫＲＬＱＮＥＡＴＶＡＹＹＬＬＬＤＮＲＬＲＴＴＳＧＹＬＧＡＥＦＨＥＳＭＶＳＳＬＡＱＶＴＰＡＥＴＰＮＳＡＴＤＨＲＱＨＧＨＭＥＳＰＧＦＧＬＲＨＨＦＡＡＤＲＫＷＡＬＧＬＱＳＲＡＨＰＲＥＩＩＴＥＶＬＫＡＬＱＥＬＮＶＣＷＫＫＩＧＨＨＮＭＫＣＲＷＳＰＳＦＰＳＨＥＳＭＭＨＮＮＨＧＦＧＡＡＳＡＭＩＥＴＤＤＳＥＫＳＴＨＴＶＫＦＥＩＱＬＹＫＴＲＤＥＫＹＦＬＤＬＱＲＬＳＧＰＱＬＬＦＬＤＬＣＳＡＦＬＴＱＬＲＶＬ
配列番号１１０－ＯｓＯＳＫ１－Ｑ９ＺＲＪ１
ＭＥＧＡＧＲＤＧＮＰＬＧＧＹＲＩＧＫＴＬＧＩＧＳＦＧＫＶＫＩＡＥＨＩＬＴＧＨＫＶＡＩＫＩＬＮＲＲＫＩＫＳＭＥＭＥＥＫＶＫＲＥＩＫＩＬＲＬＦＭＨＰＨＩＩＲＬＹＥＶＩＤＴＰＡＤＩＹＶＶＭＥＹＶＫＳＧＥＬＦＤＹＩＶＥＫＧＲＬＱＥＥＥＡＲＲＦＦＱＱＩＩＳＧＶＥＹＣＨＲＮＭＶＶＨＲＤＬＫＰＥＮＬＬＬＤＳＫＣＮＶＫＩＡＤＦＧＬＳＮＶＭＲＤＧＨＦＬＫＴＳＣＧＳＰＮＹＡＡＰＥＶＩＳＧＫＬＹＡＧＰＥＶＤＶＷＳＣＧＶＩＬＹＡＬＬＣＧＴＬＰＦＤＤＥＮＩＰＮＬＦＫＫＩＫＧＧＩＹＴＬＰＳＨＬＳＰＬＡＲＤＬＩＰＲＭＬＶＶＤＰＭＫＲＩＴＩＲＥＩＲＥＨＱＷＦＴＶＧＬＰＲＹＬＡＶＰＰＰＤＴＡＱＱＶＫＫＬＤＤＥＴＬＮＤＶＩＮＭＧＦＤＫＮＱＬＩＥＳＬＨＫＲＬＱＮＥＡＴＶＡＹＹＬＬＬＤＮＲＬＲＴＴＳＧＹＬＧＡＥＦＨＥＳＭＥＳＳＬＡＱＶＴＰＡＥＴＰＮＳＡＴＤＨＲＱＨＧＨＭＥＳＰＧＦＧＬＲＨＨＦＡＡＤＲＫＷＡＬＧＬＱＳＲＡＨＰＲＥＩＩＴＥＶＬＫＡＬＱＥＬＮＶＣＷＫＫＩＧＨＹＮＭＫＣＲＷＳＰＳＦＰＳＨＥＳＭＭＨＮＮＨＧＦＧＡＥＳＡＩＩＥＴＤＤＳＥＫＳＴＨＴＶＫＦＥＩＱＬＹＫＴＲＤＥＫＹＬＬＤＬＱＲＶＳＧＰＱＬＬＦＬＤＬＣＳＡＦＬＴＱＬＲＶＬ
配列番号１１２－Ｐ４５０－Ｑ９ＦＶＳ９
ＭＡＭＬＧＦＹＶＴＦＩＦＦＬＶＣＬＦＴＹＦＦＬＱＫＫＰＱＧＱＰＩＬＫＮＷＰＦＬＲＭＬＰＧＭＬＨＱＩＰＲＩＹＤＷＴＶＥＶＬＥＡＴＮＬＴＦＹＦＫＧＰＷＬＳＧＴＤＭＬＦＴＡＤＰＲＮＩＨＨＩＬＳＳＮＦＧＮＹＰＫＧＰＥＦＫＫＩＦＤＶＬＧＥＧＩＬＴＶＤＦＥＬＷＥＥＭＲＫＳＮＨＡＬＦＨＮＱＤＦＩＥＬＳＶＳＳＮＫＳＫＬＫＥＧＬＶＰＦＬＤＮＡＡＱＫＮＩＩＩＥＬＱＤＶＦＱＲＦＭＦＤＴＳＳＩＬＭＴＧＹＤＰＭＳＬＳＩＥＭＬＥＶＥＦＧＥＡＡＤＩＧＥＥＡＩＹＹＲＨＦＫＰＶＩＬＷＲＬＱＮＷＩＧＩＧＬＥＲＫＭＲＴＡＬＡＴＶＮＲＭＦＡＫＩＩＳＳＲＲＫＥＥＩＳＲＡＫＴＥＰＹＳＫＤＡＬＴＹＹＭＮＶＤＴＳＫＹＫＬＬＫＰＮＫＤＫＦＩＲＤＶＩＦＳＬＶＬＡＧＲＤＴＴＳＳＶＬＴＷＦＦＷＬＬＳＫＨＰＱＶＭＡＫＬＲＨＥＩＮＴＫＦＤＮＥＤＬＥＫＬＶＹＬＨＡＡＬＳＥＳＭＲＬＹＰＰＬＰＦＮＨＫＳＰＡＫＰＤＶＬＰＳＧＨＫＶＤＡＮＳＫＩＶＩＣＩＹＡＬＧＲＭＲＳＶＷＧＥＤＡＬＤＦＫＰＥＲＷＩＳＤＮＧＧＬＲＨＥＰＳＹＫＦＭＡＦＮＳＧＰＲＴＣＬＧＫＮＬＡＬＬＱＭＫＭＶＡＬＥＩＩＲＮＹＤＦＫＶＩＥＧＨＫＶＥＰＩＰＳＩＬＬＲＭＫＨＧＬＫＶＴＶＴＫＫＩ
配列番号１１３－Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａスクロース－リン酸シンターゼ１－Ｑ０ＪＧＫ４
ＭＡＧＮＥＷＩＮＧＹＬＥＡＩＬＤＳＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＶＤＰＲＳＰＡＡＧＡＡＳＰＲＧＰＨＭＮＦＮＰＴＨＹＦＶＥＥＶＶＫＧＶＤＥＳＤＬＨＲＴＷＩＫＶＶＡＴＲＮＡＲＥＲＳＴＲＬＥＮＭＣＷＲＩＷＨＬＡＲＫＫＫＱＬＥＬＥＧＩＬＲＩＳＡＲＲＫＥＱＥＱＶＲＲＥＴＳＥＤＬＡＥＤＬＦＥＧＥＫＡＤＴＶＧＥＬＡＱＱＤＴＰＭＫＫＫＦＱＲＮＦＳＥＬＴＶＳＷＳＤＥＮＫＥＫＫＬＹＩＶＬＩＳＬＨＧＬＶＲＧＤＮＭＥＬＧＲＤＳＤＴＧＧＱＶＫＹＶＶＥＬＡＲＡＬＡＭＭＰＧＶＹＲＶＤＬＦＴＲＱＶＳＳＰＥＶＤＷＳＹＧＥＰＴＥＭＬＴＳＧＳＴＤＧＥＧＳＧＥＳＡＧＡＹＩＶＲＩＰＣＧＰＲＤＫＹＬＲＫＥＡＬＷＰＹＬＱＥＦＶＤＧＡＬＡＨＩＬＮＭＳＫＡＬＧＥＱＶＳＮＧＫＬＶＬＰＹＶＩＨＧＨＹＡＤＡＧＤＶＡＡＬＬＳＧＡＬＮＶＰＭＶＬＴＧＨＳＬＧＲＮＫＬＥＱＩＭＫＱＧＲＭＳＫＥＥＩＤＳＴＹＫＩＭＲＲＩＥＧＥＥＬＡＬＤＡＡＥＬＶＩＴＳＴＲＱＥＩＤＥＱＷＧＬＹＤＧＦＤＶＫＬＥＫＶＬＲＡＲＡＲＲＧＶＳＣＨＧＲＦＭＰＲＭＶＶＩＰＰＧＭＤＦＳＳＶＶＶＰＥＤＴＳＤＧＤＤＧＫＤＦＥＩＡＳＰＲＳＬＰＰＩＷＡＥＶＭＲＦＬＴＮＰＨＫＰＭＩＬＡＬＳＲＰＤＰＫＫＮＩＴＴＬＶＫＡＦＧＥＣＲＰＬＲＥＬＡＮＬＩＬＩＭＧＮＲＤＤＩＤＥＭＳＡＧＮＡＳＶＬＴＴＶＬＫＬＩＤＫＹＤＬＹＧＳＶＡＦＰＫＨＨＫＱＳＤＶＰＥＩＹＲＬＴＧＫＭＫＧＶＦＩＮＰＡＬＶＥＰＦＧＬＴＬＩＥＡＡＡＨＧＬＰＩＶＡＴＫＮＧＧＰＶＤＩＫＮＡＬＮＮＧＬＬＶＤＰＨＤＱＨＡＩＡＤＡＬＬＫＬＶＡＤＫＮＬＷＱＥＣＲＫＮＧＬＲＮＩＱＬＹＳＷＰＥＨＣＲＴＹＬＴＲＩＡＧＣＲＩＲＮＰＲＷＬＭＤＴＰＡＤＡＡＡＥＥＥＥＡＬＥＤＳＬＭＤＶＱＤＬＳＬＲＬＳＩＤＧＥＲＧＳＳＭＮＤＡＰＳＳＤＰＱＤＳＶＱＲＩＭＮＫＩＫＲＳＳＰＡＤＴＤＧＡＫＩＰＡＥＡＡＡＴＡＴＳＧＡＭＮＫＹＰＬＬＲＲＲＲＲＬＦＶＩＡＶＤＣＹＧＤＤＧＳＡＳＫＲＭＬＱＶＩＱＥＶＦＲＡＶＲＳＤＳＱＭＳＲＩＳＧＦＡＬＳＴＡＭＰＬＰＥＴＬＫＬＬＱＬＧＫＩＰＰＴＤＦＤＡＬＩＣＧＳＧＳＥＶＹＹＰＳＴＡＱＣＶＤＡＧＧＲＬＲＰＤＱＤＹＬＬＨＩＮＨＲＷＳＨＤＧＡＫＱＴＩＡＫＬＡＨＤＧＳＧＴＮＶＥＰＤＶＥＳＣＮＰＨＣＶＳＦＦＩＫＤＰＮＫＶＲＴＩＤＥＭＲＥＲＶＲＭＲＧＬＲＣＨＬＭＹＣＲＮＡＴＲＬＱＶＶＰＬＬＡＳＲＳＱＡＬＲＹＬＦＶＲＷＧＬＳＶＧＮＭＹＬＩＶＧＥＨＧＤＴＤＨＥＥＭＬＳＧＬＨＫＴＶＩＩＲＧＶＴＥＫＧＳＥＱＬＶＲＳＳＧＳＹＱＲＥＤＶＶＰＳＥＳＰＬＩＡＦＴＫＧＤＬＫＡＤＥＩＭＲＡＬＫＥＶＴＫＡＡＳＧＭ
配列番号１１４－Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａデルタ－１－ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ１ Ｏ０４２２６
ＭＡＳＶＤＰＳＲＳＦＶＲＤＶＫＲＶＩＩＫＶＧＴＡＶＶＳＲＱＤＧＲＬＡＬＧＲＶＧＡＬＣＥＱＶＫＥＬＮＳＬＧＹＥＶＩＬＶＴＳＧＡＶＧＶＧＲＱＲＬＲＹＲＫＬＶＮＳＳＦＡＤＬＱＫＰＱＭＥＬＤＧＫＡＣＡＡＶＧＱＳＧＬＭＡＬＹＤＭＬＦＮＱＬＤＶＳＳＳＱＬＬＶＴＤＳＤＦＥＮＰＫＦＲＥＱＬＴＥＴＶＥＳＬＬＤＬＫＶＩＰＩＦＮＥＮＤＡＩＳＴＲＫＡＰＹＥＤＳＳＧＩＦＷＤＮＤＳＬＡＧＬＬＡＬＥＬＫＡＤＬＬＩＬＬＳＤＶＤＧＬＹＳＧＰＰＳＥＰＳＳＫＩＩＨＴＹＩＫＥＫＨＱＱＥＩＴＦＧＤＫＳＲＶＧＲＧＧＭＴＡＫＶＫＡＡＶＬＡＳＮＳＧＴＰＶＶＩＴＳＧＦＥＮＲＳＩＬＫＶＬＨＧＥＫＩＧＴＬＦＨＫＮＡＮＬＷＥＳＳＫＤＶＳＴＲＥＭＡＶＡＡＲＤＣＳＲＨＬＱＮＬＳＳＥＥＲＫＫＩＬＬＤＶＡＤＡＬＥＡＮＥＤＬＩＲＳＥＮＥＡＤＶＡＡＡＱＶＡＧＹＥＫＰＬＶＡＲＬＴＩＫＰＧＫＩＡＳＬＡＫＳＩＲＴＬＡＮＭＥＤＰＩＮＱＩＬＫＫＴＥＶＡＤＤＬＶＬＥＫＴＳＣＰＬＧＶＬＬＩＶＦＥＳＲＰＤＡＬＶＱＩＡＳＬＡＩＲＳＧＮＧＬＬＬＫＧＧＫＥＡＩＲＳＮＴＩＬＨＫＶＩＴＤＡＩＰＲＮＶＧＥＫＬＩＧＬＶＴＴＲＤＥＩＡＤＬＬＫＬＤＤＶＩＤＬＶＩＰＲＧＳＮＫＬＶＳＱＩＫＡＳＴＫＩＰＶＬＧＨＡＤＧＩＣＨＶＹＩＤＫＳＡＤＭＤＭＡＫＨＩＶＭＤＡＫＩＤＹＰＡＡＣＮＡＭＥＴＬＬＶＨＫＤＬＭＫＳＰＧＬＤＤＩＬＶＡＬＫＴＥＧＶＮＩＹＧＧＰＩＡＨＫＡＬＧＦＰＫＡＶＳＦＨＨＥＹＳＳＭＡＣＴＶＥＦＶＤＤＶＱＳＡＩＤＨＩＨＲＹＧＳＡＨＴＤＣＩＶＴＴＤＤＫＶＡＥＴＦＬＲＲＶＤＳＡＡＶＦＨＮＡＳＴＲＦＳＤＧＡＲＦＧＬＧＡＥＶＧＩＳＴＧＲＩＨＡＲＧＰＶＧＶＥＧＬＬＴＴＲＷＩＬＲＧＲＧＱＶＶＮＧＤＫＤＶＶＹＴＨＫＳＬＰＬＱ

【0466】

参考文献
［１］Ｓｉｌｖａ ａｎｄ Ｇｅｒｏｓ（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ（８）：７１８－７２６．
［２］Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９：７４．
［３］Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，２９，５，８１５－８２５．
［４］Ｈｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７５－２８１．
［５］Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０
［６］Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９．
［７］Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ，６，２，２７５－２８６
［８］Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ，９７（１２）：６８９６－６９０１．
［９］Ｈｕｅｒｔａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，５，Ｉｓｓｕｅ ８／ｐ．１４６７－１４８２
［１０］Ａｂｄｅｌ－ｌａｔｉｆ（２００７）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３（６）：９３０－９３３
［１１］Ｈｍｉｄａ－Ｓａｙａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９，７４６－７５
［１２］Ｈｉｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，１，２９７－３００．
［１３］Ｄｕｂｏｕｚｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３，７５１－７６３
［１４］Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０；２６３－２７２
［１５］Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３，ｐ８１０
［１６］Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１８１９ ９７－１０３
［１７］Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１，１４１－１５０
［１８］Ｏｅｄａ ｅｔ ａｌ（１００１）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．１０ ｎｏ．７ ｐｐ．１７９３－１８０２
［１９］Ｃｓｅｒｈａｔｉ（２０１５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ ３ １２８－１３６
［２０］Ｂｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ，１２７：２６９－２８７
［２１］Ｘｕ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３１：１１１７－１１２７，．
［２２］Ｓａｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．４，１４８５－１４９３
［２３］Ｋａｐｌａｎ－Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｖｏｌ．１７，Ｎｏ．３
［２４］Ｓｈｉｎｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：９２３－９３２，
［２５］Ｓｃｈｌａｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ，１０７，６，２５３８－２５４３
［２６］Ｒａｔｈｕｓ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３：６１３－６１８．
［２７］Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｔｈｅ Ａｓｉａｎ ａｎｄ Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（１），ｐｐ．５７－６１．

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-1】

【図9A-2】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図15J】

【図15K】

【図15L】

【図15M】

【図15N】

【図15O】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024529182000001.xml

【国際調査報告】