特表 2024-529186 変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-01

(54)【発明の名称】変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240725BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240725BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240725BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/7088

A61K47/54

A61P1/16

A61P35/00

A61P37/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024532653

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-27

(86)【国際出願番号】 KR2022011190

(87)【国際公開番号】W WO2023013990

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】10-2021-0103567

(32)【優先日】2021-08-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0140386

(32)【優先日】2021-10-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0093739

(32)【優先日】2022-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524049169

【氏名又は名称】ネオナ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(72)【発明者】

【氏名】ナム，ソク－ウ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ヒ－ドゥ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC41

4C076DD69

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZB09

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７または肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物に関し、本発明による変形されたＲＴ－ＬＥＴ７は、既存のＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制するアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＡＳ－ｍｉＲＮＡ）であるＲＴ－ＬＥＴ７に対比してＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制を増加させ、肝癌細胞の成長抑制を増加させ、ＴＳＰ１の発現を増加させ、およびマクロファージの食作用活性を増加させる効果がある。また、前記変形されたＲＴ－ＬＥＴ７に肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）を結合することで肝癌細胞への伝達力を高めて肝癌の治療効果を顕著に向上させたので、肝癌の予防および治療用薬学組成物またはＣＤ４７－陽性肝癌の予防または治療用免疫抗がん剤として有用に用いられてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子であって、
前記核酸分子は、配列番号１の塩基配列で表示され、
前記核酸分子は、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形された核酸であることを特徴とし、
前記核酸分子は、一部または全体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたことを特徴とする、核酸分子。

【請求項2】

前記核酸分子は、配列番号１のヌクレオチドのうち５′末端から１乃至４番目のヌクレオチドの骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたものである、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記核酸分子は、配列番号１のヌクレオチドのうち３′末端から１乃至４番目のヌクレオチドの骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたものである、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子であって、
前記核酸分子は、配列番号１の塩基配列で表示され、
前記核酸分子は、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形された核酸であることを特徴とし、
前記核酸分子は、一部または全体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたことを特徴とし、前記核酸分子は、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたことを特徴とする、核酸分子。

【請求項5】

前記肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）は、Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌ－ＬＮＰ（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄｏｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）であることを特徴とする、請求項4に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）は、化学式１または化学式２で表されることを特徴とする、請求項５に記載の核酸分子：

【化1】

【化2】

【請求項7】

請求項１乃至６のいずれか一項に記載の核酸分子を有効成分として含む、肝癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項8】

前記組成物は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現を抑制するものである、請求項７に記載の肝癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項9】

前記組成物は、ＴＳＰ１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１）の発現を増加させるものである、請求項７に記載の肝癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項10】

前記組成物は、マクロファージの食作用活性を増加させるものである、請求項７に記載の肝癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項11】

請求項１乃至６のいずれか一項に記載の核酸分子を有効成分として含む、ＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤。

【請求項12】

請求項７に記載の薬学組成物または請求項１１に記載の免疫抗がん剤を個体に投与するステップを含む肝癌を治療する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝癌の予防または治療用薬学組成物に関し、具体的に、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制剤である変形されたＲＴ－ＬＥＴ７またはデリバリーシステムを搭載した変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

肝癌は、全世界的に五番目で頻発する癌であるが、それによる死亡率は３位に該当する攻撃的な癌である（Ａｈｎ Ｊ、Ｆｌａｍｍ ＳＬ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｄｉｓ Ｍｏｎ ２００４；５０：５５６～５７３）。治療を目的とする手術は単に１５％ないし２５％程度の患者にのみ可能であり、多くの肝癌患者は局所的に進行するかまたは転移する疾病によって比較的に短期間内に死亡する（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＬＲ、Ｇｏｒｅｓ ＧＪ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２００５；２５：２１２～２２５）。肝癌の主な原因として、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、およびアフラトキシンＢ１（ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１）などがよく知られている。しかしながら、去る２０年間の肝癌患者の全体的な生存率は大きく増加しておらず、肝癌の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）および進展（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）機序は依然としてよく知られていない状態である（Ｂｒｕｉｘ Ｊ、ｅｔ ａｌ Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００４；５：２１５～２１９）。今まで、分子標的治療（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）が成熟した肝癌の治療に効果的であることが示されているが（Ｓｈｅｎ ＹＣ、Ｈｓｕ Ｃ、Ｃｈｅｎｇ ＡＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；４５：７９４～８０７）、いかにこのような遺伝的な変化が肝癌患者のひとりひとりに観察される臨床的特徴を引き起こすかは不明確である。

【0003】

ＨＤＡＣｓ（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ）は、たびたび補助抑制子（ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）や多重－タンパク質転写複合体（ｍｕｌｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）によって遺伝子プロモーターに付くことができ、そこでＤＮＡに直接結合することなくクロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）変形によって転写を調節する（Ｔｈｉａｇａｌｉｎｇａｍ Ｓ、Ｃｈｅｎｇ ＫＨ、Ｌｅｅ ＨＪ、Ｍｉｎｅｖａ Ｎ、Ｔｈｉａｇａｌｉｎｇａｍ Ａ、Ｐｏｎｔｅ ＪＦ Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ：ｕｎｉｑｕｅ ｐｌａｙｅｒｓ ｉｎ ｓｈａｐｉｎｇ ｔｈｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｄｅ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００３；９８３：８４～１００）。暗号化されたヒトＨＤＡＣｓは１８個があり、これらはクラスＩ（ＨＤＡＣ１、２、３および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０）、クラスＩＩＩ（ＳＩＲＴ１～７）、およびクラスＩＶ（ＨＤＡＣ１１）酵素に分類される（Ｙａｎｇ ＸＪ、Ｓｅｔｏ Ｅ Ｔｈｅ Ｒｐｄ３／Ｈｄａ１ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｎ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００８；９：２０６～２１８）。ヒストンアセチル化酵素（ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）およびＨＤＡＣｓはすべて細胞増殖、分化および細胞周期調節に関与するという事実が知られている（Ｗｉｔｔ Ｏ、Ｄｅｕｂｚｅｒ ＨＥ、Ｍｉｌｄｅ Ｔ、Ｏｅｈｍｅ Ｉ ＨＤＡＣ ｆａｍｉｌｙ：Ｗｈａｔ ａｒｅ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００９；２７７：８～２１）。また、ＨＤＡＣｓの病理学的な活性および調節減少（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が癌、免疫疾患、および筋ジストロフィー症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）のような様々な疾病を引き起こすことがあるという事実が報告されている（Ｙａｎｇ ＸＪ、Ｓｅｔｏ Ｅ ＨＡＴｓ ａｎｄ ＨＤＡＣｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００７；２６：５３１０～５３１８）。ＨＤＡＣ６はＨＤＡＣｓのクラスＩＩｂファミリーメンバーであり、微細小管（ＭＴｓ）［０００４］と関連している細胞質内の脱アセチル化酵素（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）として作用し、アルファ－チューブリン（α－ｔｕｂｕｌｉｎ）を脱アセチル化させる（Ｈｕｂｂｅｒｔ Ｃ、Ｇｕａｒｄｉｏｌａ Ａ、Ｓｈａｏ Ｒ、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ、Ｉｔｏ Ａ、Ｎｉｘｏｎ Ａ、ｅｔ ａｌ ＨＤＡＣ６ ｉｓ ａ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｉｓ１８α．Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１７：４５５～４５８）。

【0004】

一方、ｍｉＲＮＡは細胞内に存在する２０～２５核酸（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）長さの小さなＲＮＡ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）の一種であって、タンパク質を合成しないＤＮＡから由来され、ヘアピン－構造転写体（ｈａｉｒｐｉｎ－ｓｈａｐｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）から生成される。ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３′－ＵＴＲの相補的な配列に結合し、そのｍＲＮＡの翻訳抑制または不安定化を誘導し、究極的にその標的ｍＲＮＡのタンパク質合成を抑制するリプレッサ（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）の役割を果たすようになる。一つのｍｉＲＮＡは数個のｍＲＮＡをターゲティングし、ｍＲＮＡもまた数個のｍｉＲＮＡによって調節できると知られている。

【0005】

一方、マクロファージは食菌作用によって疾病細胞（癌細胞）を貪食し、それは、抗体のＦｃ切片がマクロファージの膜表面のＦｃ受容体との結合を媒介することで起こる。しかしながら、腫瘍は正常免疫調節機構の転覆によってマクロファージを含む免疫細胞の攻撃から切り抜けることができる。そのような機序の一つが正常細胞で発現される一つのタンパク質であるＣＤ４７である。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰα（ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α）と呼ぶマクロファージの受容体と相互作用し、これがマクロファージに「私を食わないで（貪食遮断）」という信号伝達を導くことで正常細胞を去らせる。同様に癌細胞によるＣＤ４７の発現もそれらによって癌細胞が抗体と結合した場合でさえマクロファージに対する抵抗性を持たせるものである。従って、腫瘍に多数のマクロファージが接近するが、「貪食遮断」信号が消えなければ癌細胞に作用できないものである。これに対する一つの治療戦略がＣＤ４７に対する単一クローン抗体を利用した「貪食遮断」信号を遮断するものである。

【0006】

従って、本発明は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制剤であるＲＴ－ＬＥＴ７を変形させて既存のＲＴ－ＬＥＴ７より効果が上昇されることを通じて、これを肝癌の予防または治療用薬学組成物として用いられてもよいことを確認し、また変形されたＲＴ－ＬＥＴ７は肝癌細胞からＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制してＴＳＰ１を増加させ、増加したＴＳＰ１はＣＤ４７と結合してマクロファージのＳＩＲＰαと相互作用を防ぐようになり、従って、肝癌細胞のＣＤ４７とマクロファージのＳＩＲＰαの結合を防いで癌細胞に対するマクロファージの免疫活性を高めて抗癌効果を示す機序を通じてマクロファージの食作用活性を顕著に増加させてＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤として用いられてもよいことを確認し、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記核酸分子に肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたことを特徴とする、核酸分子を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記核酸分子を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。

【0008】

また、本発明の他の目的は、前記核酸分子を有効成分として含むＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記薬学組成物を個体に投与するステップを含む肝癌の予防または治療方法を提供することである。

【0009】

また、本発明の他の目的は、配列番号１で表される核酸分子において、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形され、一部骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質された、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたことを特徴とする、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記課題を解決するために、本発明は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子であって、前記核酸分子は、配列番号１の塩基配列で表示され、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形された核酸であることを特徴とし、一部または全体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたことを特徴とする核酸分子を提供する。

【0011】

また、本発明は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子であって、前記核酸分子は、配列番号１の塩基配列で表示され、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形された核酸であることを特徴とし、一部または全体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたことを特徴とし、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたことを特徴とする核酸分子を提供する。

【0012】

本発明は、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
また、本発明は、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
また、本発明は、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含むＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤薬学組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７を有効成分として含むＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤を提供する。
また、本発明は、前記薬学組成物を個体に投与するステップを含む肝癌の予防または治療方法を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明による変形されたＲＴ－ＬＥＴ７または肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７は既存のＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制するアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＡＳ－ｍｉＲＮＡ）であるＲＴ－ＬＥＴ７に対比してＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制を増加させ、肝癌細胞の成長抑制を増加させ、ＴＳＰ１の発現を増加させ、およびマクロファージの食作用活性を増加させる効果がある。また、前記変形されたＲＴ－ＬＥＴ７に肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）を結合することで肝癌細胞への伝達力を高めて肝癌の治療効果を顕著に向上させたので、肝癌の予防および治療用薬学組成物またはＣＤ４７－陽性肝癌の予防または治療用免疫抗がん剤として有用に用いられてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】本発明の一実施例において、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制剤であるＲＴ－ＬＥＴ７の多様な変形構造（図１Ａ）および抑制効率（図１Ｂ）を示した図である（基本形：ＲＴ－ＬＥＴ７、変形：ＲＴ－ＬＥＴ７－２、ＲＴ－ＬＥＴ７－４、ＲＴ－ＬＥＴ７－６およびＲＴ－ＬＥＴ７－８）。

【図1B】（上記の通り。）

【図2A】本発明の一実施例において、本発明の変形されたＲＴ－ＬＥＴ７であるＲＴ－ＬＥＴ７－８がＨＣＣ細胞株において有意に持続的にＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制する効果を確認した図である（図２Ａ；ＳＮＵ－３８７、図２Ｂ；ＳＮＵ－３６８、図２Ｃ；ＳＮＵ－４２３）。

【図2B】（上記の通り。）

【図2C】（上記の通り。）

【図3A】本発明の一実施例において、本発明の変形されたＲＴ－ＬＥＴ７であるＲＴ－ＬＥＴ７－８によってＨＣＣ細胞株の生長抑制およびマクロファージの活性増加を確認した図である（図３Ａ；ＭＴＴおよび細胞生存分析によるＬｅｔ－７ｉ－５ｐの腫瘍形成に関する特性、図３Ｂ；基本形ＲＴ－ＬＥＴ７および変形ＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した後のウェスタンブロット分析によるＴＳＰ１の発現変化、図３Ｃ；基本形ＲＴ－ＬＥＴ７および変形ＲＴ－ＬＥＴ７－８が処理されたＨＣＣ細胞のマクロファージの食作用活性）。

【図3B】（上記の通り。）

【図3C】（上記の通り。）

【図4A】ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８のＨＣＣ細胞においてＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効率および持続的にＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制する効果を確認した図である。

【図4B】（上記の通り。）

【図5A】本発明の一実施例において、Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８のＨＣＣ細胞においてＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効率および持続的にＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制する効果を確認した図である。

【図5B】（上記の通り。）

【図6A】本発明の一実施例において、ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８によってＨＣＣ細胞株の生長抑制およびマクロファージの活性増加を確認した図である（図６Ａ；ＭＴＴおよび細胞生存分析によるＬｅｔ－７ｉ－５ｐの腫瘍形成に関する特性、図６Ｂ；ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した後のウェスタンブロット分析によるＴＳＰ１の発現変化、図６Ｃ；ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８が処理されたＨＣＣ細胞のマクロファージの食作用活性）。

【図6B】（上記の通り。）

【図6C】（上記の通り。）

【図7A】本発明の一実施例において、Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８によってＨＣＣ細胞株の生長抑制およびマクロファージの活性増加を確認した図である（図7Ａ；ＭＴＴおよび細胞生存分析によるＬｅｔ－７ｉ－５ｐの腫瘍形成に関する特性、図7Ｂ；Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した後のウェスタンブロット分析によるＴＳＰ１の発現変化、図7Ｃ；Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８が処理されたＨＣＣ細胞のマクロファージの食作用活性）。

【図7B】（上記の通り。）

【図7C】（上記の通り。）

【図8A】本発明の一実施例において、肝細胞標的デリバリーシステム（ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌ－ＬＮＰ）結合に関する模式図を簡単に示した図である（図８Ａ；Ｇａｌ－ＬＮＰ結合、図８Ｂ；Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ結合、図８Ｃ；Ｄ－ＧａｌＮＡｃ結合）。

【図8B】（上記の通り。）

【図8C】（上記の通り。）

【図9A】本発明の一実施例において、構造が異なるＧａｌＮＡｃ（Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８のＨＣＣ細胞においてＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効率および持続的にＬｅｔ－７ｉ－５ｐを抑制する効果を確認した図である。

【図9B】（上記の通り。）

【図9C】（上記の通り。）

【図10A】本発明の一実施例において、構造が異なるＧａｌＮＡｃ（Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８によるＨＣＣ細胞株の生長抑制を確認した図である。

【図10B】（上記の通り。）

【図11A】本発明の一実施例において、構造が異なるＧａｌＮＡｃ（Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８によるＨＣＣ細胞株のＴＳＰ１の発現変化およびマクロファージの活性増加を確認した図である。

【図11B】（上記の通り。）

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、添付の図面を参照して本発明の具現例で本発明を詳しく説明することとする。ただし、下記具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであって、当業者にとって周知著名な技術または構成に関する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曇らせる可能性があると判断される場合は、その詳細な説明を省略することができ、これによって本発明が制限されるものではない。本発明は後述する特許請求の範囲の記載およびそれから解析される均等範疇内で多様な変形および応用が可能である。

【0017】

また、本明細書において用いられる用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために用いられた用語であって、これは、使用者、運用者の意図または本発明が属する分野の慣例などによって変わってもよい。従って、本用語に対する定義は、本明細書の全般にわたった内容に基づいて下されなければならない。明細書の全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除くのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。

【0018】

一側面において、本発明は、配列番号１で表される核酸分子であって、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐを標的化する核酸分子に関する。

【0019】

一具現例において、本発明の「核酸分子」は、ヌクレオチド配列が２′－Ｏ－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）化されて変形されたものであってもよい。

【0020】

一具現例において、本発明の「核酸分子」は、一部または全体骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたものであってもよく、好ましくは、配列番号１のヌクレオチドのうち５′末端から１乃至４番目のヌクレオチドおよび３′末端から１乃至４番目のヌクレオチドの骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で改質されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0021】

一具現例において、本発明の「核酸分子」は、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたものであってもよい。

【0022】

また、前記肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）は、肝組織ターゲット薬物伝達システムであると知られたものであれば制限なく用いられてもよく、例えば、Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）、Ｇａｌ－ＬＮＰ（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄｏｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、Ｌｉｐｉｄ－ｓｉＲＮＡ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｓｉＲＮＡ、Ｐｅｐｔｉｄｅ－ＡＳＯ、Ｓｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｅｘｏｓｏｍｅ、Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＤＮＡ ｃａｇｅなどがある（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０ Ｏｃｔ；１９（１０）：６７３～６９４）。

【0023】

また、前記Ｇａｌ－ＬＮＰ（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄｏｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、コレステロール、ＤＳＰＣ、Ｃ１６－ＰＥＴ２０００－ｃｅｒａｍｉｄｅおよびα－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｃｅｒａｍｉｄｅで構成されたものであってもよい。

【0024】

また、前記Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）は、化学式１または２で表されるものであってもよく、好ましくは、化学式２で表されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0025】

【化1】

【0026】

【化2】

【0027】

一側面において、本発明は、前記核酸分子を有効成分として含む肝癌の予防または治療用薬学組成物に関する。

【0028】

一具現例において、本発明の「組成物」は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現を抑制するものであってもよい。

【0029】

一具現例において、本発明の「組成物」は、肝癌細胞の成長を抑制するものであってもよい。

【0030】

一具現例において、本発明の「組成物」は、ＴＳＰ１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１）の発現を増加させるものであってもよい。

【0031】

一具現例において、本発明の「組成物」は、マクロファージの食作用活性を増加させるものであってもよい。

【0032】

一側面において、本発明は、前記核酸分子を有効成分として含むＣＤ４７－陽性肝癌の治療用免疫抗がん剤に関する。

【0033】

一具現例において、本発明の「ＴＳＰ１」は、ＣＤ４７受容体を占有してＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用を妨害してもよい。

【0034】

一具現例において、本発明の「核酸分子」はｌｅｔ－７ｉ－ｐ－ＴＳＰ１の信号伝達軸を調節してもよく、マクロファージとＨＣＣとの間のＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用をＣＤ４７－ＴＳＰ１の相互作用に転換することでマクロファージのＨＣＣ細胞に対する食作用を再－活性化するものであってもよい。

【0035】

一具現例において、本発明の「肝癌」は、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ高発現肝癌であってもよく、肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）であってもよく、ｓｔａｇｅI、II、III、IVＡまたはIVＢ病期（ｐｈａ
ｓｅ）の肝細胞癌腫であってもよく、初期病期よりも治療が難しいｓｔａｇｅIII乃至IV病期の肝細胞癌腫であることがさらに好ましい。

【0036】

一具現例において、本発明の「肝癌」は、ＴＳＰ１低発現肝癌であってもよく、肝細胞癌腫であってもよく、ｓｔａｇｅI、II、III、IVＡまたはIVＢ病期
（ｐｈａｓｅ）の肝細胞癌腫であってもよく、初期病期よりも治療が難しいｓｔａｇｅIII乃至IV病期の肝細胞癌腫であることがさらに好ましい。

【0037】

本発明において用いられる「発現抑制」なる用語は、標的遺伝子の（ｍＲＮＡへの）発現または（タンパク質への）翻訳の低下を引き起こすことを意味し、好ましくは、これによって標的遺伝子の発現が探知不可能になるか、または無意味な水準で存在するようになることを意味する。

【0038】

本発明において用いられた「予防」なる用語は、本発明による組成物の投与によって肝癌の発生、発達および再発を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。

【0039】

本発明において用いられた「治療」なる用語は、本発明による組成物の投与により肝癌およびそれによる合併症の症状を好転させるか、または有利に変更するすべての行為を意味する。本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などにおいて提示されている資料を参照して本願の組成物が効果がある疾患の正確な基準を知り、改善、向上および治療された程度を判断できるはずである。

【0040】

一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される一つ以上の剤形であってもよい。

【0041】

本発明の組成物はまた生物学的製剤に通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含んでもよい。薬学的に許容できる担体は、組成物を生体内の伝達に適合したものであれば特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載されている化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれら成分のうち一つの成分以上を混合して利用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような主な利用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化してもよい。よりさらに、当分野の適正な方法にてまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を利用して、各疾患に従ってまたは成分に従って好ましく製剤化してもよい。

【0042】

本発明の組成物にさらに同一または類似した機能を示す有効成分を１種以上含んでもよい。本発明の組成物は、組成物の総重量に対して前記タンパク質を０．０００１乃至１０重量％で、好ましくは０．００１乃至１重量％を含む。

【0043】

本発明の薬学組成物は薬学的に許容できる添加剤をさらに含んでもよく、このとき、薬学的に許容できる添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶性セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが用いられてもよい。本発明による薬学的に許容できる添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部乃至９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0044】

本発明の組成物は、目的とする方法に従って、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、または経口投与してもよく、経口投与することが最も好ましい。投与量は、個体の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
本発明の組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、通常用いられる単なる希釈剤である水、液体パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などがともに含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。

【0045】

一側面において、本発明は、前記薬学組成物または免疫抗がん剤を個体に投与するステップを含む肝癌を治療する方法に関する。

【0046】

本発明における「個体」なる用語は、疾病の予防、調節または治療方法を要する対象を意味し、ヒト、犬、サル、猫、齧歯類、例えば、マウス、遺伝子操作されたマウスなどが制限なく用いられてもよい。より具体的には、人間または非－人間である霊長類、ハツカネズミ（ｍｏｕｓｅ）、ネズミ（ｒａｔ）、犬、猫、馬、牛などの哺乳類を意味する。

【0047】

本発明の薬学組成物は、治療学的に有効な量または薬学的に有効な量で投与されてもよい。

【0048】

本発明における「治療学的に有効な量」なる用語は、対象疾患を予防または治療するのに有効な組成物の薬学的に許容される塩の量を意味し、本発明の組成物の治療的に有効な量は、様々な要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わってもよい。従って、人体に使用する際の投与量は、安全性および効率性をともに考慮して適正量で決定されなければならない。動物実験を通じて決めた有効量から人間に用いられる量を推定することも可能である。有効な量を決定する際に考慮するこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ
．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。

【0049】

本発明の薬学組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において用いられる「薬学的に有効な量」なる用語は、医学的な治療に適用可能な合理的な利益／危険の割合で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効容量の水準は、個体の健康状態、感染症の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、配合または同時に用いられる薬物を含む要素、および、その他の医学分野によく知られた要素によって決定されてもよい。本発明の組成物は、個別治療剤で投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。上記した要素をすべて考慮して、副作用なく最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されてもよい。

【実施例】

【0050】

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳しく説明することとする。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0051】

＜実施例１＞既存のＲＴ－ＬＥＴ７の変形されたＲＴ－ＬＥＴ７の製作
Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの抑制剤であるＲＴ－ＬＥＴ７（配列番号１：ＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＵＡＣＵＡＣＣＵＣＡに４ステップの過程で１ｃｙｃｌｅずつ進め、ＲＮＡ ｏｌｉｇｏ １ｍｅｒずつ３′末端から５′末端までＤｅｂｌｏｃｋｉｎｇ－＞Ｃｏｕｐｌｉｎｇ－＞Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－＞Ｃａｐｐｉｎｇの過程で順次に進める。このとき、変形された塩基を用い、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０ Ｏｃｔ；１９（１０）：６７３～６９４．によれば、２′－Ｒｉｂｏｓｅの変形（２′－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ、２′－ＭＯＥ）は変形させていないＲＮＡより核酸分解酵素から抵抗性を増加させ、細胞質内で安定性を増加させるのに寄与する。また、生体組織内で半減期を増加させる役割も果たし、結果として、薬物の効果を増大させる役割を果たす。さらに、相補的なＲＮＡに強く付着し、ＲＮａｓｅによって標的遺伝子がさらに効果的に分解されるのに役立つ。さらに、ＲＮＡ塩基の間にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに置換した場合、ＲＮａｓｅの活性には影響を与えず、標的ＲＮＡに効率的に結合する。そして、細胞と体内でアルブミンのようなタンパク質と結合し、核酸分解酵素から保護され、これによって、薬物が小便に排出されることを防ぐ役割を果たし、体内で薬物の持続時間を増やし、薬物の効果を増大させる役割を果たす理由のため、Ｒｉｂｏｓｅとｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅの変形を進めた。変形されたＲＮＡ塩基２′－ＯＭｅ ｒＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ｃａｔ．１０－３１００）、２′－ＯＭｅ ｒＣ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３１１５）、２′－ＯＭｅ ｒＧ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３１２０）、２′－ＯＭｅ ｒＵ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３１３０）、２′－ＭＯＥ ｒＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３２００）、２′－ＭＯＥ ｒＣ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３２１１）、２′－ＭＯＥ ｒＧ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３２２０）、２′－ＭＯＥ ｒＵ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．１０－３２３１）を合成する。合成過程において、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに置換が必要な部分はＳｕｌｆｕｒｉｚｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．４０－４０３７－１０）を活用して合成する（バイオニア合成）。このとき、何の変形をしていないＲＮＡ ｏｌｉｇｏをＲＴ－ＬＥＴ７、すべての塩基を２′－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌに変形し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに変形したＲＮＡ ｏｌｉｇｏをＲＴ－ＬＥＴ７－２、５′末端と３′末端の４ヶ所を変形させた塩基をＲＴ－ＬＥＴ７－６と名付けた。そして、すべての塩基を２′－ＭＯＥに変形し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに変形したＲＮＡ ｏｌｉｇｏをＲＴ－ＬＥＴ７－４、５′末端と３′末端の４ヶ所を変形させた塩基をＲＴ－ＬＥＴ７－８と名付けた（図１Ａ）。

【0052】

＜実施例２＞変形されたＲＴ－ＬＥＴ７の処理によるＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制の確認
図１Ａのように作製された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７をトランスフェクションしたＨＣＣ細胞株（ＳＮＵ－３８７、ＳＮＵ－３６８、およびＳＮＵ－４２３）で総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を利用して分離した後、前記二つのｍｉＲＮＡに特異的なｃＤＮＡをｍｉｃｓｃｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を利用して合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲはＳｅｎｓｉＦＡＳＴＴＭ ＳＹＢＲ ＮｏＲＯＸ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）にて行われた。ＨＣＣ細胞株（ＳＮＵ－３８７、ＳＮＵ－３６８、およびＳＮＵ－４２３）でＬｅｔ－７ｉ－５ｐのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った結果、２′－ＭＯＥにすべての塩基を置換した場合（ＲＴ－ＬＥＴ７－４およびＲＴ－ＬＥＴ７－８）、２′－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌに置換した場合（ＲＴ－ＬＥＴ７－２およびＲＴ－ＬＥＴ７－６）よりＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現を抑制するのに効果が良いことを確認した（図１Ｂ）。

【0053】

また、２′－ＭＯＥでＲＴ－ＬＥＴ７を変形させたとき、ＨＣＣ細胞株（ＳＮＵ－３８７、ＳＮＵ－３６８、およびＳＮＵ－４２３）にトランスフェクションした後、最大７日まで培養した後、ＲＮＡを抽出した後Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制の程度を比べたとき、２′－ＭＯＥで変形させた後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに置換した場合、何の変形もしていないＲＴ－ＬＥＴ７に比べてＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制が有意に効率が増大されることを確認した（図２）。

【0054】

＜実施例３＞ＭＴＴおよび細胞生存分析によるＬｅｔ－７ｉ－５ｐの腫瘍形成に関する特性の確認
肝癌でのＲＴ－ＬＥＴ７を処理する時のインビトロ腫瘍形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）抑制能を確認するために、ＲＴ－ＬＥＴ７を利用してＭＴＴ分析を行った。具体的に、ＭＴＴ分析のために、ＳＮＵ－３８７細胞を１２－ウェルプレートに分注してＲＴ－ＬＥＴ７、ＲＴ－ＬＥＴ７－４、ＲＴ－ＬＥＴ７－８をトランスフェクションした後、ＭＴＴ［３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］溶液（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｇ／ｍｌと１時間にかけてインキュベーションした後、ＳＹＮＥＲＧＹ Ｈ１ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を利用して吸光度を測定した。その結果、ＲＴ－ＬＥＴ７の変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した実験群で腫瘍細胞の成長を最も優れるように抑制することを確認することができた（図３Ａ）。

【0055】

＜実施例４＞変形されたＲＴ－ＬＥＴ７によるマクロファージの食作用調節の確認
Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐがマクロファージの食作用（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の調節に関与するＴＳＰ１の発現を調節するかを確認するために、ＲＴ－ＬＥＴ７と変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した後、ウェスタンブロット分析を通じて発現変化を確認した。その結果、ＲＴ－ＬＥＴ７とＲＴ－ＬＥＴ７－８をそれぞれ処理した場合、ＴＳＰ１の発現が増加されることを確認することができた（図３Ｂ）。

【0056】

このような結果に基づいて、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ－ＴＳＰ１ネットワークのＣＤ４７とＳＩＲＰα（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α）の相互作用においてＴＳＰ１がＣＤ４７受容体を占有し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用を妨害してマクロファージがＨＣＣを食作用可能にするかを確認するために、インビトロ食作用分析を行った。具体的に、ＨＣＣ細胞株であるＳＮＵ－３８７をそれぞれ単一細胞懸濁液にした後、ＣＦＳＥ（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）で標識した。その後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから腹膜マクロファージを得て、ＳＮＵ－３８７と２時間にかけて共培養した後、ＲＴ－ＬＥＴ７および変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８でそれぞれ処理し、陽性対照群でＴＳＰ１組換えタンパク質を直接処理したＨＣＣ細胞と比べた。食作用指数は腫瘍細胞を捕獲するマクロファージの数をマクロファージの総数で分けて計算した。その結果、ＲＴ－ＬＥＴ７および変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８が処理されたＨＣＣ細胞はすべてマクロファージの食作用活性が顕著に増加することを確認し、ＲＴ－ＬＥＴ７に対比して変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８でマクロファージの食作用活性がさらに増加することを確認した（図３Ｃ）。

【0057】

このことを通じて、ＲＴ－ＬＥＴ７を変形させたＲＴ－ＬＥＴ７－８がｌｅｔ－７ｉ－ｐ－ＴＳＰ１信号伝達軸を調節することができ、マクロファージとＨＣＣとの間のＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用をＣＤ４７－ＴＳＰ１の相互作用に転換することで、マクロファージのＨＣＣ細胞に対する食作用を再－活性化することが分かる。

【0058】

＜実施例５＞肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の効率の検証
５－１．デリバリーシステムを利用したＲＴ－ＬＥＴ７－８のＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制の確認
デリバリーシステムを利用した変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８のＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果を確認するために、薬物伝達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）と知られたＮ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌ－ＬＮＰ（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄｏｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）にＲＴ－ＬＥＴ７－８を結合させた核酸分子をＡＳＧＰＲ（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現がｐｏｓｉｔｉｖｅなｃｅｌｌ（Ｈｅｐ３Ｂ）とｎｅｇａｔｉｖｅなｃｅｌｌ（ＳＮＵ－４４９）に伝達した。

【0059】

具体的に、Ｇａｌ－ＬＮＰ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８は、アルキルエポキシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とポリアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を結合して合成したＣ１２－ＳＰＭ、ＤＳＰＣ（Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｃ１６－ＰＥＧ２０００－ｃｅｒａｍｉｄｅ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）とα－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｃｅｒａｍｉｄｅ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）をそれぞれ５０：１０：３８．５：０．７５：０．７５の割合で混合してＧａｌ－ＬＮＰを製造した。その後、ＲＴ－ＬＥＴ７－８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭのｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３）に混ぜ、Ｇａｌ－ＬＮＰとＲＴ－ＬＥＴ７－８を７：１で混合した後、３７℃で３０分間培養してＧａｌ－ＬＮＰにＲＴ－ＬＥＴ７－８が搭載されるようにした。その後、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．Ｐ５３６８）に７５分間透析し、エタノールとＧａｌ－ＬＮＰが搭載されていないＲＴ－ＬＥＴ７－８を除去した（図８Ａ参照）。引き続き、ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８は、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＴ－ＬＥＴ７－８の５′末端にＴｒｅｂｌｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＧＬＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を接合してＲＴ－ＬＥＴ７－８を変形した後、Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧＬＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を接合してＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８を合成した（図８Ｂ参照）。その後、実施例２と同一の方法にて各細胞でＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現量を確認した。

【0060】

その結果、ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、ＡＳＧＰＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌであるＨｅｐ３Ｂ細胞では既存のＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が有意に増加したが、ＡＳＧＰＲ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｅｌｌであるＳＮＵ－４４９細胞ではＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が増加しないことが示された（図４Ａ）。これに対し、Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、ＡＳＧＰＲの有無と関係なく、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が有意に増加することが示された（図５Ａ）。このような結果は、ＧａｌＮＡｃは肝細胞の表面のＡＳＧＰＲ受容体と結合する性質を有するデリバリーシステムであるので、ＡＳＧＰＲ ｐｏｓｔｉｖｅ ｃｅｌｌにのみ効果があるが、Ｇａｌ－ＬＮＰは細胞膜と類似した構造を有するため、ＡＳＧＰＲと関係なく効果を示したものと予想される。

【0061】

また、Ｇａｌ－ＬＮＰが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８（Ｇａｌ－ＬＮＰ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８）はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８（Ｌｉｐｏ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８）に対比してＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現が顕著に減少されることが示された。これは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの場合、単純なリン脂質で構成されており、コレステロール、ＤＳＰＣ、Ｃ１６－ＰＥＴ２０００－ｃｅｒａｍｉｄｅ、α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｃｅｒａｍｉｄｅで構成されたＧａｌ－ＬＮＰと比べたとき、肝臓への伝達効率や、生体内における安定性が顕著に低下するということを意味する。

【0062】

引き続き、Ｈｅｐ３Ｂ細胞で肝細胞標的化部分（ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌ－ＬＮＰ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の７日間の効率維持の検証を行った。その結果、７日までＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が維持されており、Ｌｉｐｏ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８と比べても、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現を安定的に抑制することが示された（図４Ｂおよび図５Ｂ）。

【0063】

５－２．デリバリーシステムを利用したＲＴ－ＬＥＴ７－８の肝癌での腫瘍形成抑制の確認
肝癌での肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理するとき、インビトロ腫瘍形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）抑制能を確認するために、実施例３の方法にてＭＴＴ分析を行った。

【0064】

その結果、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８およびＧａｌ－ＬＮＰ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、対照群に対比して肝癌細胞の腫瘍形成を効果的に抑制し、Ｌｉｐｏ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８と比べても７２時間が経過した場合、高い腫瘍形成抑制能を示すことが示された（図６Ａおよび図７Ａ）。

【0065】

５－３．デリバリーシステムを利用したＲＴ－ＬＥＴ７－８のマクロファージの食作用調節の確認
ＲＴ－ＬＥＴ７の標的ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現低下によってｌｅｔ－７ｉ－５ｐの標的タンパク質であるＴＳＰ１の発現変化を確認するために、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８と肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した後、ウェスタンブロット分析によって発現変化を確認した。

【0066】

その結果、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、肝細胞標的化部分（Ｍｏｉｅｔｙ）が結合されていない変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＴＳＰ１の発現が増加されることを確認した（図６Ｂおよび図７Ｂ）。

【0067】

引き続き、マクロファージがＨＣＣを食作用可能にするかを確認するために、実施例４の方法にてインビトロ食作用分析を行った。

【0068】

その結果、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８およびＧａｌ－ＬＮＰ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８でマクロファージの食作用活性がさらに増加することを確認した（図６Ｃおよび図７Ｃ）。

【0069】

＜実施例６＞Ｄ－ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の効率の検証
実施例５を通じてＧａｌＮＡｃの場合、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８と結合するとき、Ｇａｌ－ＬＮＰに比べて肝臓への伝達効率および生体内における安定性が高いことを確認した。

【0070】

従って、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８と結合してＲＴ－ＬＥＴ７－８の効能を顕著に向上させ得る最適のＧａｌＮＡｃを探索するために、構造が互いに異なるＧａｌＮＡｃ（Ｄ－ＧａｌＮＡｃ）を５′末端に結合させたＲＴ－ＬＥＴ７－８を製作し、下記実験を通じてＧａｌＮＡｃが結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の効率を比べた。

【0071】

６－１．Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８のＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制の確認
実施例５において用いられたＧａｌＮＡｃ（Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ）と新たなＧａｌＮＡｃであるＤ－ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を製造しており、前記２種のＯｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８（図８Ｂ参照）およびＤ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８（図８Ｃ参照）をＨｅｐ３Ｂ細胞にそれぞれ伝達し、実施例２と同一の方法にて各細胞でＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現量を確認した。

【0072】

その結果、Ｄ－ＧａｌＮａｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、ＡＳＧＰＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌであるＨｅｐ３Ｂ細胞では既存のＯｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が有意に増加することを確認した（図９Ａ）。

【0073】

引き続き、Ｈｅｐ３Ｂ細胞でＯｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８およびＤ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の１４日間の効率維持の検証を行い、効率維持の検証テストは温度条件（４℃／室温）を異にして行った。

【0074】

その結果、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、７日までＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効果が維持されているが、７日が経過する場合、Ｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現が対照群と似た水準に回復した。しかし、ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、１４日までＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現を安定的に抑制することが示された（図９Ｂ、Ｃ）。

【0075】

６－２．ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の肝癌での腫瘍形成抑制の確認
肝癌でのＧａｌＮＡｃ（Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ）と新たなＧａｌＮＡｃであるＤ－ＧａｌＮＡｃが結合されたＲＴ－ＬＥＴ７－８を処理した時のインビトロ腫瘍形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）抑制能を確認するために、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８およびＤ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８をＨｅｐ３Ｂ細胞にそれぞれ伝達した後、ＭＴＴ ａｓｓａｙおよびＢｒｄＵ ａｓｓａｙを行った。

【0076】

ＭＴＴ ａｓｓａｙは実施例３に記載されている方法にて行っており、ＢｒｄＵ ａｓｓａｙは製造企業のプロトコルに従ってＢｒｄＵ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。

【0077】

ＭＴＴ ａｓｓａｙの結果、Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比して肝癌細胞の腫瘍形成を効果的に抑制することが示された（図１０Ａ）。引き続き、ＢｒｄＵ ａｓｓａｙの結果もＭＴＴ ａｓｓａｙの結果と同様に、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＤ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８が処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ阻害能が顕著に高くなることを確認した（図１０Ｂ）。

【0078】

６－３．ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８のマクロファージの食作用調節の確認
ＲＴ－ＬＥＴ７の標的ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｌｅｔ－７ｉ－５ｐの発現低下によってｌｅｔ－７ｉ－５ｐの標的タンパク質であるＴＳＰ１の発現変化を確認するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にＯｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８およびＤ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８をそれぞれ処理した後、ウェスタンブロット分析によって発現変化を確認した。

【0079】

その結果、Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してＴＳＰ１の発現が増加することを確認した（図１１Ａ）。

【0080】

引き続き、マクロファージがＨＣＣを食作用可能にするかを確認するために、実施例４の方法にてインビトロ食作用分析を行った。

【0081】

その結果、Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、Ｏｌｄ－ＧａｌＮＡｃ－ＲＴ－ＬＥＴ７－８に対比してマクロファージの食作用活性がさらに増加することを確認した（図１１Ｂ）。

【0082】

このような結果を通じて、変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８に肝細胞標的デリバリーシステムを搭載する場合、ターゲット器官である肝臓への伝達性を高め、肝細胞でＬｅｔ－７ｉ－５ｐの発現抑制効能、肝癌で腫瘍形成抑制効能およびマクロファージの食作用作用活性効能が顕著に増加させることを確認した。特に、肝細胞標的デリバリーシステムのうち化学式２で表されるＤ－ＧａｌＮＡｃが結合された変形されたＲＴ－ＬＥＴ７－８の場合、ＲＴ－ＬＥＴ７－８の前記言及された肝癌の予防または治療効果を顕著に向上させることが分かる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

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【国際調査報告】