特表 2024-529194 カンカニクジュヨウ抽出物のドライアイ症候群を緩和する薬物の調製における応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-02

(54)【発明の名称】カンカニクジュヨウ抽出物のドライアイ症候群を緩和する薬物の調製における応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/64 20060101AFI20240726BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240726BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240726BHJP

   A61K 31/7034 20060101ALI20240726BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20240726BHJP

   C07H 15/18 20060101ALN20240726BHJP

【ＦＩ】

A61K36/64

A61P27/02

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/14

A61K9/16

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/19

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K31/7034

A23L33/105

C07H15/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506582

(86)(22)【出願日】2022-05-06

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 CN2022091159

(87)【国際公開番号】W WO2022233318

(87)【国際公開日】2022-11-10

(31)【優先権主張番号】63/185,320

(32)【優先日】2021-05-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/244,129

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517004551

【氏名又は名称】シンファー ティアン－リー ファーマシューティカル カンパニー リミテッド（ハンツォウ）

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＮＰＨＡＲ ＴＩＡＮ－ＬＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ． （ＨＡＮＧＺＨＯＵ）

【住所又は居所原語表記】５９９ Ｈｏｎｇｆｅｎｇ Ｒｄ．， Ｙｕｈａｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１１１００ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】クオ，ハン－ペン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ヤオ－イ

【テーマコード（参考）】

4B018

4C057

4C076

4C084

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018MD48

4B018ME14

4C057BB03

4C057BB04

4C057DD03

4C057JJ19

4C076AA11

4C076AA16

4C076AA22

4C076AA30

4C076AA31

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076CC10

4C076FF01

4C076FF11

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA44

4C084MA52

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA33

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA07

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA44

4C086MA52

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZC75

4C088AB12

4C088AC01

4C088BA08

4C088BA13

4C088CA03

4C088MA02

4C088MA17

4C088MA22

4C088MA23

4C088MA35

4C088MA37

4C088MA41

4C088MA43

4C088MA44

4C088MA52

4C088NA14

4C088ZA33

(57)【要約】

カンカニクジュヨウ抽出物を用いてドライアイ症候群を緩和する薬物を調製する。その症状には、目の焼灼感、かゆみ、刺すような痛み、涙液過剰、異物感、痛み、赤目、羞明及びかすみ目が含まれる。
【選択図】図３（ａ）

【特許請求の範囲】

【請求項1】

必要な被験者に有効量のカンカニクジュヨウ抽出物を投与することを含む、ドライアイ症候群を緩和する方法。

【請求項2】

ドライアイ症候群は煙、微粒子、乾燥空気、エアコン、長時間の電子機器の使用、コンタクトレンズの装用、老化、ホルモン変化、炎症、自己免疫性疾患、屈折矯正手術又は薬物に関連する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抽出物はエキナコシド（ｅｃｈｉｎａｃｏｃｉｄｅ）、アクテオシド（ａｃｅｔｅｏｓｉｄｅ）、イソアクテオシド（ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）及びツブロシドＡ（ｔｕｂｕｌｏｓｉｄｅＡ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

カンカニクジュヨウ抽出物は薬学的に許容される製剤形態で経口投与され、前記製剤形態は、丸薬、錠剤、カプセル、粉末、粒子、非水性液体、水性液体、懸濁液、溶液、乳剤及び凍結乾燥製剤形態からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

カンカニクジュヨウ抽出物は、５０から２５０ｍｇの使用量で１日１回投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

カンカニクジュヨウ抽出物は１つ又は複数の他のサプリメントと併用投与され、前記サプリメントは、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ラクトフェリン、リノレン酸、ルテイン、マキベリー抽出物、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、植物ステロール、スフィンゴミエリン、ウコン抽出物、ビタミンＢ６、ビタミンＣ及びビタミンＥからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ドライアイ症候群は、涙液の分泌を増加させることによって緩和される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ドライアイ症候群は、マイボーム腺機能障害を改善することによって緩和される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ドライアイ症候群は、涙膜破裂時間又は涙膜脂質層の厚さを増加させることによって緩和される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

必要な被験者にサプリメントを投与することを含み、前記サプリメントは有効量のカンカニクジュヨウ抽出物を含む、ドライアイを緩和する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、有効量のカンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａ）抽出物を投与することによってドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

ドライアイ症候群は乾性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅｓｉｃｃａ）とも呼ばれ、現在よく見られる眼科疾患の１つであり、その特徴は涙液の量が減少したり、品質が低下したりすることである。適切な制御がなければ、ドライアイ症候群は角膜潰瘍や永久的視力障害を引き起こす可能性がある。ドライアイ症候群は通常、アレルゲン、煙、微粒子、乾燥空気、エアコンなどの環境要因と関係がある。その他の要因としては、老化、ホルモン変化、眼瞼炎、乾燥症候群（Ｓｊoｇｒｅｎ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、狼瘡、薬物、長時間の電子機器の使用及びコンタクトレンズの装用が含まれる。レーシック（ＬＡＳＩＫ）などの角膜形状を永久的に変える屈折矯正手術もドライアイ症候群を引き起こすことがある。バランスのとれた涙液の分泌と排出は涙膜の完全性、安定性及び正常な浸透圧の維持にとって極めて重要である。バランスが崩れると、涙膜の構造と成分の変化が発生し、最終的に涙膜が不安定になり、且つ涙膜浸透圧の上昇も測定される。涙膜浸透圧の上昇はドライアイの核心機序と考えられ、ドライアイ症状の基礎であり、且つ眼表面の損傷を引き起こす（臨床と実験検眼（ＣｌｉｎＥｘｐＯｐｔｏｍ）２０１２；９５：１：３－１１）。また、炎症もドライアイ症候群の根本的な原因の１つであり、サイトカインの放出が関与している。

【0003】

涙液代替品はドライアイ症候群の緩和に使われてきた。しかし、涙液代替品の効果が一時的であるため、１日に何度も滴下する必要がある。コルチコステロイド又はシクロスポリン目薬製剤もドライアイの緩和に使用されている。しかし、目薬製剤中の活性成分、賦形剤又は防腐剤は、眼表面に悪影響を与える可能性があり、長時間の使用を避けるべきである。そのため、ドライアイをよりよく管理できる方法を開発する必要がある。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、必要な被験者に有効量のカンカニクジュヨウ抽出物を投与することを含む、ドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。

【0005】

いくつかの実施例では、本開示は、必要な被験者に有効量のカンカニクジュヨウ抽出物を投与することを含む、涙液の分泌を増加させ、マイボーム腺機能障害を改善し、涙膜破裂時間又は涙膜脂質層の厚さを増加させる方法を提供する。

【0006】

いくつかの実施例では、本開示は、煙、微粒子、低湿度、エアコン、長時間の電子機器の使用又はコンタクトレンズの装用に関連するドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。

【0007】

いくつかの実施例では、本開示は、年齢、炎症、自己免疫性疾患、屈折矯正手術又は薬物に関連するドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。

【0008】

いくつかの実施例では、本開示は、カンカニクジュヨウ抽出物と他のサプリメントとの併用投与を含む、ドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。

【0009】

別の態様では、本開示は、カンカニクジュヨウ抽出物を含む、目の不快感又はドライアイを緩和するサプリメントを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ＭＴＴ実験（ｎ＝２）において、（ａ）０．０３％ＤＭＳＯと（ｂ）ＳＴ０１の角膜細胞株２．０４０ｐＲＳＶ－Ｔに対する２４時間以内の細胞毒性である。有意性は、対照群と比較して、＊Ｐ＜０．０５で、＊＊Ｐ＜０．０１であると定義される。

【図2】ＭＴＴ実験（ｎ＝４）において、ＳＴ０１が角膜細胞株２．０４０ｐＲＳＶ－Ｔの２４時間以内の高浸透圧による細胞死に与える影響である。有意性は、対照群と比較して、＊Ｐ＜０．０５で、＊＊Ｐ＜０．０１であると定義される。

【図3】ＳＴ０１が角膜細胞株２．０４０ｐＲＳＶ－Ｔの高浸透性ストレス刺激下での２４時間以内の（ａ）ＴＮＦ－αと（ｂ）ＩＦＮ－γの分泌に与える影響である（ｎ＝４）。有意性は、対照群と比較して、＊Ｐ＜０．０５で、＊＊Ｐ＜０．０１であると定義される。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書で使用される用語「被験者」は、哺乳動物、例えばヒト又は動物を指す。実施例では、被験者はドライアイ症候群を患っている。具体的な実施例では、ドライアイ症候群の症状は、目の乾き、刺激感、砂利感、異物感、痛みやだるい痛み、刺すような痛みや灼熱感、かゆみ、まばたき回数の増加、目の疲れ、羞明、かすみ目及び赤目を含むが、これらに限定されない。ドライアイ症候群を患っている全ての被験者は全ての症状を同時に示すわけではない。

【0012】

本明細書で使用される用語「緩和」は、疾患の徴候や症状の重症度が低下する過程を指す。徴候や症状は軽減される可能性があるが、解消されていない。好ましい実施例において、カンカニクジュヨウ抽出物の投与により、徴候や症状が解消されたが、必ずしも解消しない。有効量で徴候や症状の重症度を低下させることが期待されている。

【0013】

「有効量」という用語は、有益又は予期される効果を達成するのに十分な量を指す。特に、それは１つの疾患又は病症の１つ又は複数の症状の進行、深刻化又は悪化を緩め又は阻止するのに十分な量を指すか、又は１つの疾患又は病症の１つ又は複数の症状を緩和する量を指す。通常、インビトロ及び／又はインビボ試験によって得られた供与量効果関係は、人体の適切な使用量に初期の有用な指導を提供することができる。

【0014】

「サプリメント」という用語は、ビタミン、ミネラル、薬草又は他の植物薬、アミノ酸、脂肪酸、抽出物、又はこれらの成分の組合せを含む製品を指す。

【0015】

本開示は、カンカニクジュヨウ抽出物を用いてドライアイを緩和する方法を提供する。ドライアイ症候群は多因子且つ複雑な疾患であり、涙液の高浸透圧、涙膜の不安定性、涙膜脂質層の異常、マイボーム腺機能障害などの様々な要因に関連する。高浸透性涙液は、炎症カスケード反応を活性化させ、炎症媒体を涙液中に放出させ、多種の病態生理学的影響を引き起こし、最終的に涙膜の蒸発を加速させ、涙膜の不安定性を激化する可能性がある。

【0016】

高浸透性涙液は涙膜の過剰蒸発が原因である可能性がある。したがって、いくつかの実施例では、本発明で提供される方法は、有効量のカンカニクジュヨウ抽出物によって涙液の分泌、涙膜破裂時間又は涙膜脂質層の厚さを増加させる。

【0017】

いくつかの実施例では、本発明で提供される方法は、有効量のカンカニクジュヨウ抽出物によってマイボーム腺機能障害を改善する。

【0018】

いくつかの実施例では、ドライアイ症候群は、アレルゲン、煙、微粒子、乾燥空気及びエアコンを含むがこれらに限定されない環境要因に関連する。

【0019】

いくつかの実施例では、ドライアイ症候群は、長時間の電子機器の使用及びコンタクトレンズの装用を含むがこれらに限定されないライフスタイルに関連する。

【0020】

加齢、妊娠、避妊薬や更年期によるホルモン変化、及び白内障手術、角膜屈折矯正手術（ＰＲＫ）とＬＡＳＩＫにより、涙液の機能は損なわれる可能性がある。本開示のいくつかの実施例では、ドライアイ症候群は年齢、ホルモン及び眼表面の変化に関連する。

【0021】

いくつかの実施例では、ドライアイ症候群は、眼瞼炎症（眼瞼炎）と、眼球表面の炎症と、眼瞼内反や外反と、乾燥症、リウマチ性関節炎、エリテマトーデスなどの自己免疫性疾患とを含むがこれらに限定されないいくつかの医療病症に関連する。

【0022】

いくつかの実施例では、ドライアイ症候群は、抗ヒスタミン薬、充血除去剤、降圧薬及び抗うつ薬を含むがこれらに限定されない薬物に関連する。

【0023】

いくつかの実施例では、本開示は、カンカニクジュヨウ抽出物を含む、目の不快感又はドライアイを緩和するサプリメントを提供する。

【0024】

ドライアイ症候群の症状はそれぞれ違う。シルメル氏試験（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ’ｓｔｅｓｔ）、角膜染色、ドライアイアンケート、涙膜破裂時間（ＴＦＢＵＴ）及び眼表面分析器（Ｏ．Ｓ．Ａ）は、ドライアイの重症度又は改善状況を検出するための既知の試験である。ドライアイアンケートは、眼の標準患者評価（ＳＰＥＥＤ）及び眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）のような既知のアンケートであってもよいし、実際の必要に応じて独自に開発したアンケートであってもよい。

【0025】

眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）は、ドライアイ症候群の症状及びその視覚関連機能への影響を迅速に評価するための１２個の項目を含むアンケートである。被験者はリッカート（Ｌｉｋｅｒｔ）尺度を用いて様々な症状の頻度、関連する視覚機能及びドライアイの環境誘因を評価する必要があり、尺度は０点から４点まで異なる（（０点＝全くない、１点＝時々、２点＝半々、３点＝ほとんど、４点＝いつも）。これは目ごとではなく全体に対する評価である（眼科アーカイブ（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）．２０００；１１８（５）：６１５－６２１．；眼部免疫学と炎症（ＯｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ），１５：３８９-３９３，２００７）。

【0026】

ＯＳＤＩには次の３種類の質問がある。
「この１週間で下記の症状を感じましたか？」
１．まぶしさ
２．目の砂利感
３．目の痛みやだるい痛み
４．目のかすみ
５．見づらさ
「この１週間で目の症状が原因で、下記の行動は制限されましたか？」
６．読書
７．夜間の運転
８．パソコンや銀行の現金自動預け払い機（ＡＴＭ）の使用
９．テレビ鑑賞
「この１週間で次の環境において目の不快感を感じましたか？」
１０．風が強いとき
１１．湿度が低い場所
１２．エアコンの効いている場所

【0027】

眼表面分析器（Ｏ．Ｓ．Ａ）は非侵襲的なドライアイ分析器である。具体的には、前記機器は干渉測定法によって脂質の量と涙膜脂質層の厚さを評価し、赤外線マイボーム腺観察器によって上下眼瞼の画像を分析し、最後の完全なまばたきから涙膜に初めて不連続が現れるまでの時間（非侵入破裂時間）（秒を単位とする）を測定し、涙液メニスカスの高さを測定することによって涙液の量を推定する。

【0028】

ニクジュウヨウは最初に、約西暦２００年から２５０年の間に編纂された有名な薬用植物書籍『神農本草経』（ＳｈｅｎｎｏｎｇＢｅｎｃａｏＪｉｎｇ）に記載された。伝統的な漢方薬の中で、ニクジュウヨウは、慢性腎症、インポテンツ、女性不妊、病態おりもの、月経過剰及び老年性便秘の治療によく用いられる。カンカニクジュヨウは全寄生砂漠属（ｈｏｌｏｐａｒａｓｉｔｉｃｄｅｓｅｒｔｇｅｎｕｓ）の２２種類のニクジュウヨウのうちの１つである。研究により、カンカニクジュヨウ抽出物は角膜上皮細胞を高浸透圧による損傷から保護できることが意外に発見され、高浸透圧はまさにドライアイの核心機序である。したがって、カンカニクジュヨウ抽出物は、目の灼熱、かゆみ、刺すような痛み、涙液過剰、異物感、痛み、赤目、羞明及びかすみ目を含むがこれらに限定されないドライアイ症候群の症状を緩和することができる。

【0029】

いくつかの実施例では、カンカニクジュヨウ抽出物はＵＳ７，０８７，２５２に記載されているように調製することができ、ここではその全ての内容を参考として組み込む。好ましくは、カンカニクジュヨウ抽出物はエキナコシド（ｅｃｈｉｎａｃｏｃｉｄｅ）、アクテオシド（ａｃｅｔｅｏｓｉｄｅ）、イソアクテオシド（ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）及びツブロシドＡ（ｔｕｂｕｌｏｓｉｄｅＡ）を含む。

【0030】

カンカニクジュヨウ抽出物は、様々な投与経路に適した薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤及び媒体を含む適切な用量の単位製剤として、単独で又は組み合わせて調製することができる。いくつかの実施例では、カンカニクジュヨウ抽出物は薬学的に許容される製剤形態で経口投与され、前記製剤形態は、丸薬、錠剤、カプセル、粉末、粒子、非水性液体、水性液体、懸濁液、溶液、乳剤及び凍結乾燥製剤形態からなる群から選択される。

【0031】

本明細書に記載の方法において、カンカニクジュヨウ抽出物の投与量は５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５又は２５０ｍｇであり、１日１回である。

【0032】

いくつかの実施例では、本開示は、カンカニクジュヨウ抽出物を他のサプリメントと併用投与することを含む、ドライアイ症候群を緩和する方法を提供する。サプリメントは、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ラクトフェリン、リノレン酸、ルテイン、マキベリー抽出物、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、植物ステロール、スフィンゴミエリン、ウコン抽出物、ビタミンＢ６、ビタミンＣ及びビタミンＥを含むが、これらに限定されない。カンカニクジュヨウ抽出物とその他のサプリメントの相乗作用は、ドライアイの緩和に役立つ。

【0033】

いくつかの実施例では、カンカニクジュヨウ抽出物はルテインと併用投与することができる。カンカニクジュヨウ抽出物とルテインは同時、順次、又は交互に投与することができる。いくつかの実施例では、ルテインの投与量は６ｍｇから３０ｍｇの間であり得る。

【実施例】

【0034】

実例１：カンカニクジュヨウ抽出物の調製

【0035】

１０ｋｇのカンカニクジュヨウの肉質茎をスライスし、そして茎スライスの体積の８倍の水中に浸した。スライスを１時間浸し、２時間煮出し、濾過して最初の濾液を得た。その後、残留物をその体積の６倍の水中に入れて１時間煮出し、さらに濾過し、第２濾液を得た。第２濾液を得るのと同じ手順により、第３濾液と第４濾液を得ることができる。４種類の濾液を合わせ、５０℃で比重の１０分の１まで減圧濃縮した。濃縮濾液をエタノールと混合し、６０％エタノール混合物を形成し、その後１２時間冷蔵した。次に、冷却された混合物から上澄み液を収集し、同時に残留物を濾過して濾液を得て、濾液と上澄み液を混合して粗抽出物を形成した。粗抽出物を５０℃で比重の１０分の１まで真空濃縮し、その中のエタノールをリサイクルした。生成した粗抽出物の重さは６ｋｇであった。

【0036】

粗抽出物を１倍体積の水中に添加し、次いで混合物を加熱して粗抽出物を溶解させた。得られた溶液は、マクロ多孔質吸着樹脂カラムによって抽出された。次に、まずカラム体積の４倍の水でカラムを洗浄し、さらにカラム体積の５倍の濃度４０％エタノールでカラムを洗浄した。水溶離液は再びマクロ多孔質吸着樹脂カラムによって抽出された。次に、カラム体積の３倍の水とカラム体積の４倍の濃度４０％エタノールでカラムを洗浄した。得られた水溶離液を捨て、２部の４０％エタノール溶離液を合わせ、乾燥まで濃縮し、約１．１ｋｇのカンカニクジュヨウ抽出物を得た。

【0037】

実例２：高浸透圧によるヒト角膜上皮細胞損傷

【0038】

方法
ヒト角膜上皮細胞増殖

【0039】

材料
培地については、角質細胞－無血清培地（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）１７００５－０４２）を、５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＥＧＦ、０．０５ｍｇ／ｍＬのウシ下垂体抽出物、０．００５ｍｇ／ｍＬのインスリン、及び５００ｎｇ／ｍＬのコルチゾールと十分に混合した。
培養プレートコーティング溶液については、０．０１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン、０．０３ｍｇ／ｍＬのウシＩ型コラーゲン、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を十分に混合した。
ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）については、２ｍＬのＤＰＢＳに１０ｍｇのＭＴＴを溶解させた。

【0040】

手順
増殖面積が７５ｃｍ^２のフラスコに４．５ｍＬのフィブロネクチン／ＢＳＡ／コラーゲン溶液を加え、そして二酸化炭素濃度が５％、温度が３７℃の条件下で２４時間培養した。ワーキングストック細胞バンクから細胞を抽出し、氷結晶が細胞に損傷を与えないように急速に３７℃に昇温した。次に、フラスコからコーティング溶液を注ぎ出した。細胞播種後、ＤＭＳＯが０．５％未満になるまで細胞培地を徐々に添加した。細胞を二酸化炭素濃度が５％、温度が３７℃の条件下で２４時間培養した後、培地を交換した。細胞密度が８０％から９０％に達すると、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡにおいて連続培養した。その後、培地を２日又は３日ごとに交換した。

【0041】

ＭＴＴ実験

【0042】

培地の調製については、細胞培地を用いてＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。

【0043】

９６ウェルプレートに４．５ｍＬ／７５ｃｍ^２のフィブロネクチン／ＢＳＡ／コラーゲン溶液を加え、二酸化炭素濃度が５％で且つ温度が３７℃の条件下で２４時間培養した。１ウェル当たり６，０００個の細胞の密度で細胞を播種し、一晩培養した。次いで、細胞培地を活性剤含有培地に置換した。細胞と活性剤含有培地を３７℃で２４時間インキュベートした後、培地を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（１００マイクログラム／ウェル（μｇ／ｗｅｌｌ））を含有する培地に交換した。細胞とＭＴＴ含有培地を３７℃で２４時間インキュベートした後、培地を除去し、ＤＭＳＯ（１００マイクログラム／ウェル）を添加して紫色結晶を溶解させた。溶液を４５０ｒｐｍの回転数で２０から３０分間遠心分離した。ＯＤ_５７０を用いて細胞活性を計算した。

【0044】

カンカニクジュヨウ抽出物（コードネーム：ＳＴ０１）を溶解させ、ＣＴＥ－０（ＳＴ０１：０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＣＴＥ－１０（ＳＴ０１：１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＣＴＥ－２２．５（ＳＴ０１：２２．５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＣＴＥ－４５（ＳＴ０１：４５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）及びＣＴＥ－９０（ＳＴ０１：９０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）の各群を形成して細胞活性をテストした。対照群（０．０３％ＤＭＳＯ）は、ブランク対照群（ＤＰＢＳ）と比較して明らかな細胞毒性を生じなかった（図１（ａ）を参照）。対照群（０．０３％ＤＭＳＯ）と比較して、濃度が１０、２２．５、４５と９０μｇ／ｍＬのＳＴ０１は細胞毒性を生じなかった（図１（ｂ）を参照）。

【0045】

また、さらに細胞を高浸透培地（５００ｍＯｓＭ）で処理し、細胞生存率を検出した。図２の結果によると、高浸透圧状態（５００ｍＯｓＭ）下で、対照群（０．０３％ＤＭＳＯ）（ＣＴＥ－０群）の角膜上皮細胞生存率は５９％に低下し、ＣＴＥ－５群は６７％に低下し、ＣＴＥ－１０群は７４％に低下し、ＣＴＥ－２２．５群は７１％に低下し、ＣＴＥ－４５群は７１％に低下し、ＣＴＥ－９０群は８１％に低下した。これらの結果から、カンカニクジュヨウ抽出物は角膜上皮細胞を高浸透圧による損傷から保護することができ、高浸透圧はドライアイ症候群の重要な機序である。

【0046】

実例３：ＴＮＦ－αとＩＦＮ－γレベルの測定
６ウェルプレートに４．５ｍＬ／７５ｃｍ^２のフィブロネクチン／ＢＳＡ／コラーゲン溶液を加え、５％の二酸化炭素濃度及び３７℃の温度の下で２４時間培養した。７×１０^５個の細胞/ウェルの密度で細胞を播種し、一晩培養した。次いで、細胞培地を、カンカニクジュヨウ抽出物を含有する高浸透培地（５００ｍＯｓＭ）であるＳＴ０１－５（ＳＴ０１：５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＳＴ０１－１０（ＳＴ０１：１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＳＴ０１－２２．５（ＳＴ０１：２２．５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）、ＳＴ０１－４５（ＳＴ０１：４５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）及びＳＴ０１－９０（ＳＴ０１：９０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．０３％）に置換した。培地を３７℃で２４時間培養した。トリプシンで処理した細胞と培地を３，０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心分離して、ＲＮＡを抽出するための細胞を得た。リアルタイムＰＣＲによってヒト腫瘍壊死因子－α（ｈＴＮＦ－α）及びヒトインターフェロン－γ（ｈＩＦＮ－γ）を測定した。図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＳＴ０１（５から９０μｇ／ｍＬ）は高浸透圧によりＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの発現を示した。

【0047】

実例４：涙膜分析
ドライアイを患っている被験者がカンカニクジュヨウ抽出物及び／又は１つ又は複数のサプリメントを服用する前後の涙膜を分析し、関与するサプリメントは、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ラクトフェリン、リノレン酸、ルテイン、マキベリー抽出物、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、植物ステロール、スフィンゴミエリン、ウコン抽出物、ビタミンＢ６、ビタミンＣ及びビタミンＥを含む。被験者がカンカニクジュヨウ抽出物及び／又は１つ又は複数のサプリメントを服用する前（０週目）に、被験者は１週間以上ドライアイ薬物治療又はサプリメントの投与を停止し（投与中であれば）、その後、ベースラインとしてＳＢＭＳｉｓｔｅｍｉ眼表面分析器（Ｏ．Ｓ．Ａ）で涙膜を評価した。１週目から４週目まで、被験者は２２５ｍｇのカンカニクジュヨウ抽出物を１日１回服用し、最大３０日間持続した。１週目の２日目、３日目、４日目と５日目に、Ｏ．Ｓ．Ａによる涙膜評価を行った。２週目から５週目まで、Ｏ．Ｓ．Ａ測定を週１回行った。

【0048】

実例５：ドライアイアンケート
被験者がカンカニクジュヨウ抽出物及び／又は１つ又は複数のサプリメントを服用する前（ベースライン）及び服用した後に、ドライアイを患っている被験者のドライアイアンケートスコアを記録し、ドライアイ症候群と一致する眼刺激症状及び視覚関連機能への影響を評価し、関与するサプリメントは、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ラクトフェリン、リノレン酸、ルテイン、マキベリー抽出物、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、植物ステロール、スフィンゴミエリン、ウコン抽出物、ビタミンＢ６、ビタミンＣ及びビタミンＥを含む。対応のあるｔ検定によって、投与前後のアンケートスコアを比較した。Ｐ＜０．０５であると、有意差がある。被験者は全てカンカニクジュヨウ抽出物及び／又は１つ又は複数のサプリメントを服用した後に症状が改善したことを示した。有効なドライアイアンケートから見ると、ドライアイ症状は改善されている。

【0049】

実例６：カンカニクジュヨウ抽出物及びサプリメント
例示的な組成物は以下のとおりである。

【0050】

成分１については、乳糖、カンカニクジュヨウ抽出物、ゼラチン、チタニア、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン、マキベリー抽出物、ステアリン酸マグネシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、及びビタミンＢ６である。

【0051】

成分２については、ルテイン、サフラワー油、ビタミンＥ、ゼラチン、ドコサヘキサエン酸、グリセリン、レシチン、及びチタニアである。

【0052】

本明細書に引用された全ての出版物、特許及び特許出願の全ての内容は、いずれも参照によって本明細書に組み込まれる。上記の内容は異なる実施例に基づいて説明されているが、当業者であれば、その精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略及び変更を行うことができることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】