特表 2024-529297 ＩＬ－２を有するチェックポイント阻害剤のコンジュゲート及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ＩＬ－２を有するチェックポイント阻害剤のコンジュゲート及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240730BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240730BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240730BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K14/55

C12N15/13

C12N15/26

C12N15/62 Z

C12P21/02 B

C12P21/08

C12P21/02 C

A61K38/20

A61K47/64

A61K39/395 Y

A61K47/61

A61K47/60

A61K47/54

A61K39/395 V

A61P35/00

A61K9/19

C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500136

(86)(22)【出願日】2022-07-09

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 IB2022056362

(87)【国際公開番号】W WO2023281480

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/219,985

(32)【優先日】2021-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522240265

【氏名又は名称】ブライト ピーク セラピューティクス エージー

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パタタビラマン，ウィジャヤ，ラーガヴァン

(72)【発明者】

【氏名】クレフト，ベルトルト

(72)【発明者】

【氏名】キャラロット，ジャン－フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】アルバレス サンチェス，ルーベン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4C076AA30

4C076AA95

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB29

4C076CC27

4C076DD01

4C076DD60

4C076EE06

4C076EE13

4C076EE16

4C076EE23

4C076EE30

4C076FF51

4C076FF61

4C076FF70

4C084AA02

4C084CA53

4C084CA59

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA14

4C084MA44

4C084MA55

4C084MA60

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA33

4H045FA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、修飾抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、修飾抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドを含む組成物、それらを製造する方法、及び疾患の治療のために修飾抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドを使用する方法に関する。一態様では、本開示は、修飾抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドを使用する癌の治療に関する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物であって、
プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチドと、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーが、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドの非末端残基に共有結合した第１の結合点、および
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドに共有結合した第２の結合点
を含む、リンカーと
を含む、組成物。

【請求項2】

組成物であって、
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドと、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーが、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第１の結合点、および
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドの非末端残基に共有結合した第２の結合点
を含む、リンカーと
を含む、組成物。

【請求項3】

組成物であって、
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドと、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーが、化学的リンカーであり、前記リンカーが、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第１の結合点、および
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドに共有結合した第２の結合点
を含む、リンカーと
を含む、組成物。

【請求項4】

前記第１の結合点が、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基３０～１１０の領域内の残基にあり、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記第１の結合点が、アミノ酸残基３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸残基にあり、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記第１の結合点がアミノ酸残基４２又は４５にあり、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが参照配列としての配列番号１に基づく、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記第１の結合点が、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙ若しくはＹ４５にあるか、又はＮ末端修飾にある、請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＩＬ－２ポリペプチドが、それに共有結合した非リンカーポリマーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、Ｆｃ領域を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片がＦｃ領域を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記第２の結合点が前記Ｆｃ領域中のアミノ酸残基にある、請求項９又は１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記Ｆｃ領域が、配列番号１０５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９、１１、又は１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記第２の結合点が、配列番号１０５のアミノ酸残基１０～１１０からなる群から選択されるアミノ酸残基にある、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記第２の結合点が、（ａ）配列番号１０５の２５～３５位のアミノ酸残基、（ｂ）配列番号１０５の７０～８０位のアミノ酸残基、又は（ｃ）配列番号１０５の９５～１０５のアミノ酸残基である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

第２の位置結合点が、Ｋ２４６アミノ酸残基、Ｋ２４８アミノ酸残基、Ｋ２８８アミノ酸残基、Ｋ３１７アミノ酸残基、又はそれらの組合せ（Ｅｕナンバリング）の位置の前記Ｆｃ領域にある、請求項９又は１１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記第２の結合点が前記Ｋ２４８アミノ酸残基にある、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、移植抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、脱免疫化抗体、又は二重特異性抗体である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが抗原結合断片であり、前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、三重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、ＡＶＩＭＥＲ（登録商標）、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、マキシボディ、ラクダ状体、ＶＨＨ、ミニボディ、イントラボディ、抗体部分（ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、一本鎖結合ポリペプチド、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－Ｆｃ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、四価タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、二重特異性抗体（ｂｓｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、融合タンパク質、又は二重特異性ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むか、又はそれらに由来する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが前記ＩｇＧを含み、前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ４であるか、又はそれに由来する、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、４５１２３８、ＫＸＧ２ＰＪ５５１Ｉ、ＭＳＢ－００１０６８２、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＰＦ－０６８３４６３５、ＣＡＳ１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（イミフィンジ、２８Ｘ２８Ｘ９ＯＫＶ（ＵＮＩＩコード）、ＭＥＤＩ－４７３６、ＣＡＳ１４２８９３５－６０－７）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、５２ＣＭＩ０ＷＣ３Ｙ、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＲＧ－７４４６、ＲＯ－５５４１２６７、ＣＡＳ１３８０７２３－４４－３）、スゲマリマブ（ＣＳ－１００１、ＷＢＰ－３１５５）、ＫＮ－０４６（ＣＡＳ２２５６０８４－０３－２）、ＡＰＬ－５０２（ＣＢＴ－５０２、ＴＱＢ－２４５０）、エンバホリマブ（３Ｄ－０２５、ＡＳＣ－２２、ＫＮ－０３５、ｈｕ５６Ｖ１－Ｆｃ－ｍ１、ＣＡＳ２１０２１９２－６８－５）、Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａ（Ｍ－７８２４、ＭＳＢ－００１１３５９Ｃ、ＮＷ９Ｋ８Ｃ１ＪＮ３、ＣＡＳ１９１８１４９－０１－５）、ＳＴＩ－１０１４（ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＺＫＡＢ－００１）、ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ、Ａ－１６７（ＨＢＭ－９１６７、ＫＬ－Ａ１６７）、ＩＭＣ－００１（ＳＴＩ－３０３１、ＳＴＩ－Ａ－１０１５、ＳＴＩ－Ａ１０１５、ｓ）、ＨＴＩ－１０８８（ＳＨＲ－１３１６）、ＩＯ－１０３、ＣＸ－０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＵＰＭ－１７０（ＣＡ－１７０）、ＧＳ－４２２４、ＮＤ－０２１（ＮＭ２１－１４８０、ＰＲＯ－１４８０）、ＢＮＴ－３１１（ＤｕｏＢｏｄｙ－ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ、ＧＥＮ－１０４６）、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＩＢＩ－３２２、ＮＭ－０１、ＬＹ－３４３４１７２、ＬＤＰ、ＣＤＸ－５２７、ＩＢＩ－３１８、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＲＥＧＮ３５０４、ＡＬＰＮ－２０２（ＣＤ８０ ｖＩｇＤ－Ｆｃ）、ＩＮＣＢ－０８６５５０、ＬＹ－３４１５２４４、ＳＨＲ－１７０１、ＪＳ－００３（ＪＳ００３－３０、ＪＳ００３－ＳＤ）、ＨＬＸ－２０（ＰＬ２＃３）、ＥＳ－１０１（ＩＮＢＲＸ－１０５、ＩＮＢＲＸ－１０５－１）、ＭＳＢ－２３１１、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ－２７９２５２、ＴＡＫ－２５２）、ＦＳ－１１８、ＦＳ１１８ ｍＡｂ２、ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ２）、ＦＡＺ－０５３（ＬＡＥ－００５）、ロダポリマブ（ＬＹ－３３０００５４、ＮＲ４ＭＡＤ６ＰＰＢ、ＣＡＳ２１１８３４９－３１－６）、ＭＣＬＡ－１４５、ＢＭＳ－１８９、コシベリマブ（ＣＫ－３０１、ＴＧ－１５０１、ＣＡＳ２２１６７５１－２６－５）、ＩＬ－１５Ｒａｌｐｈａ－ＳＤ／ＩＬ－１５（ＫＤ－０３３）、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ８５７０６４－３８－１）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＢＭＳ－９８６１９２、ＲＣ－９８、ＣＤ－２００ＡＲ－Ｌ（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）、ＡＴＡ－３２７１、ＩＢＣ－Ａｂ００２、ＢＭＸ－１０１、ＡＶＡ－０４－ＶｂＰ、ＡＣＥ－１７０８、ＫＹ－１０４３、ＡＣＥ－０５（ＹＢＬ－０１３）、ＯＮＣ－００５５（ＯＮＣ００５５、ＰＲＳ－３４４ Ｓ－０９５０１２）、ＴＬＪ－１－ＣＫ、ＧＲ－１４０５、ＰＤ１ＡＣＲ－Ｔ、Ｎ－８０９（Ｎ－ＩＬ１５／ＰＤＬ１）、ＣＢ－２０１、ＭＥＤＩ－１１０９、ＡＶＡ－００４（ＡＶＡ－０４）、ＣＡ－３２７、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＫＹ－１００３、ＣＤ２２（ａＰＤ－Ｌ１）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＳＬ－２２Ｐ）、ＡＴＡ－２２７１（Ｍ２８ｚ１ＸＸＰＤ１ＤＮＲ ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、又はアベルマブを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、表１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

前記第２の結合点が、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチド上のリジン残基に対するものである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

前記第２の結合点が、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドの非末端アミノ酸残基にある、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

前記リンカーがポリマーを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

前記ポリマーが水溶性ポリマーを含む、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

前記ポリマーが、少なくとも約０．１ｋＤａ、少なくとも約０．５ｋＤａ、又は少なくとも約１ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記リンカーが、前記第１の結合点と前記第２の結合点との間に少なくとも５０個の原子の鎖を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

前記リンカーが、構造：

【化1】

であって、

【化2】

が、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドのリジン残基への前記第１の結合点であり、
Ｌが連結基であり、

【化3】

が、前記第１の結合点に接続する連結基への結合点である、構造を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、それに共有結合した非リンカーポリマーを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

前記非リンカーポリマーが、アミノ酸残基３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸残基に結合している、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが異種抗体又は抗原結合断片を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記異種抗体又は抗原結合断片がリンカーを更に含み、前記リンカーが、（ＧＳ）_ｎ（配列番号２４）、（ＧＧＳ）_ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２６）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（配列番号２７）、又は（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（配列番号２８）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２９）を含み、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

組成物であって、
アミノ酸残基４２に結合した第１のポリマーであって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、第１のポリマーを含む、ＩＬ－２ポリペプチドと、
プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチドと
を含む、組成物。

【請求項38】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、モノクローナル、ヒト化、移植、キメラ、ヒト、脱免疫化、又は二重特異性である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、三重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、ＡＶＩＭＥＲ（登録商標）、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、マキシボディ、ラクダ状体、ＶＨＨ、ミニボディ、イントラボディ、抗体部分（ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、一本鎖結合ポリペプチド、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－Ｆｃ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、四価タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、二重特異性抗体（ｂｓｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、融合タンパク質、二重特異性ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）を含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むか、又はそれらに由来する、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが前記ＩｇＧを含み、前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ４を含むか、又はそれに由来する、請求項４０に記載の組成物。

【請求項43】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、４５１２３８、ＫＸＧ２ＰＪ５５１Ｉ、ＭＳＢ－００１０６８２、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＰＦ－０６８３４６３５、ＣＡＳ１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（イミフィンジ、２８Ｘ２８Ｘ９ＯＫＶ（ＵＮＩＩコード）、ＭＥＤＩ－４７３６、ＣＡＳ１４２８９３５－６０－７）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、５２ＣＭＩ０ＷＣ３Ｙ、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＲＧ－７４４６、ＲＯ－５５４１２６７、ＣＡＳ１３８０７２３－４４－３）、スゲマリマブ（ＣＳ－１００１、ＷＢＰ－３１５５）、ＫＮ－０４６（ＣＡＳ２２５６０８４－０３－２）、ＡＰＬ－５０２（ＣＢＴ－５０２、ＴＱＢ－２４５０）、エンバホリマブ（３Ｄ－０２５、ＡＳＣ－２２、ＫＮ－０３５、ｈｕ５６Ｖ１－Ｆｃ－ｍ１、ＣＡＳ２１０２１９２－６８－５）、Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａ（Ｍ－７８２４、ＭＳＢ－００１１３５９Ｃ、ＮＷ９Ｋ８Ｃ１ＪＮ３、ＣＡＳ１９１８１４９－０１－５）、ＳＴＩ－１０１４（ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＺＫＡＢ－００１）、ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ、Ａ－１６７（ＨＢＭ－９１６７、ＫＬ－Ａ１６７）、ＩＭＣ－００１（ＳＴＩ－３０３１、ＳＴＩ－Ａ－１０１５、ＳＴＩ－Ａ１０１５、ｓ）、ＨＴＩ－１０８８（ＳＨＲ－１３１６）、ＩＯ－１０３、ＣＸ－０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＵＰＭ－１７０（ＣＡ－１７０）、ＧＳ－４２２４、ＮＤ－０２１（ＮＭ２１－１４８０、ＰＲＯ－１４８０）、ＢＮＴ－３１１（ＤｕｏＢｏｄｙ－ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ、ＧＥＮ－１０４６）、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＩＢＩ－３２２、ＮＭ－０１、ＬＹ－３４３４１７２、ＬＤＰ、ＣＤＸ－５２７、ＩＢＩ－３１８、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＲＥＧＮ３５０４、ＡＬＰＮ－２０２（ＣＤ８０ ｖＩｇＤ－Ｆｃ）、ＩＮＣＢ－０８６５５０、ＬＹ－３４１５２４４、ＳＨＲ－１７０１、ＪＳ－００３（ＪＳ００３－３０、ＪＳ００３－ＳＤ）、ＨＬＸ－２０（ＰＬ２＃３）、ＥＳ－１０１（ＩＮＢＲＸ－１０５、ＩＮＢＲＸ－１０５－１）、ＭＳＢ－２３１１、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ－２７９２５２、ＴＡＫ－２５２）、ＦＳ－１１８、ＦＳ１１８ ｍＡｂ２、ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ２）、ＦＡＺ－０５３（ＬＡＥ－００５）、ロダポリマブ（ＬＹ－３３０００５４、ＮＲ４ＭＡＤ６ＰＰＢ、ＣＡＳ２１１８３４９－３１－６）、ＭＣＬＡ－１４５、ＢＭＳ－１８９、コシベリマブ（ＣＫ－３０１、ＴＧ－１５０１、ＣＡＳ２２１６７５１－２６－５）、ＩＬ－１５Ｒａｌｐｈａ－ＳＤ／ＩＬ－１５（ＫＤ－０３３）、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ８５７０６４－３８－１）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＢＭＳ－９８６１９２、ＲＣ－９８、ＣＤ－２００ＡＲ－Ｌ（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）、ＡＴＡ－３２７１、ＩＢＣ－Ａｂ００２、ＢＭＸ－１０１、ＡＶＡ－０４－ＶｂＰ、ＡＣＥ－１７０８、ＫＹ－１０４３、ＡＣＥ－０５（ＹＢＬ－０１３）、ＯＮＣ－００５５（ＯＮＣ００５５、ＰＲＳ－３４４ Ｓ－０９５０１２）、ＴＬＪ－１－ＣＫ、ＧＲ－１４０５、ＰＤ１ＡＣＲ－Ｔ、Ｎ－８０９（Ｎ－ＩＬ１５／ＰＤＬ１）、ＣＢ－２０１、ＭＥＤＩ－１１０９、ＡＶＡ－００４（ＡＶＡ－０４）、ＣＡ－３２７、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＫＹ－１００３、ＣＤ２２（ａＰＤ－Ｌ１）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＳＬ－２２Ｐ）、ＡＴＡ－２２７１（Ｍ２８ｚ１ＸＸＰＤ１ＤＮＲ ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、又はアベルマブを含む、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドが、表１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

前記第１のポリマーが、第２の結合点でＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドに共有結合される、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドがＦｃ領域を含む、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記第２の結合点が前記Ｆｃ領域中のアミノ酸残基にある、請求項４７に記載の組成物。

【請求項49】

前記Ｆｃ領域が、配列番号１０５の前記アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８に記載の組成物。

【請求項50】

前記第２の結合点が、配列番号１０５の前記アミノ酸配列セットのアミノ酸残基１０～１１０からなる群から選択されるアミノ酸残基にある、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

前記第２の結合点が、（ａ）配列番号１０５の２５～３５位のアミノ酸残基、（ｂ）配列番号１０５の７０～８０位のアミノ酸残基、又は（ｃ）配列番号１０５の９５～１０５のアミノ酸残基である、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記第１のポリマーが約２００～約２０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

前記第１のポリマーが水溶性ポリマーを含む、請求項３７～５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

前記第１のポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む、請求項３７～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

前記第１のポリマーがポリ（アルキレンオキシド）を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、前記ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第２のポリマーを更に含む、請求項３７～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

前記第２のポリマーが、前記Ｆｃ領域のアミノ酸残基３５、３７、３８、４１、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸残基に共有結合される、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

前記第２のポリマーが前記ＩＬ－２ポリペプチドの残基４５に共有結合される、請求項５６又は５７に記載の組成物。

【請求項59】

前記第２のポリマーが、前記ＩＬ－２ポリペプチドの残基Ｙ４５に共有結合される、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項60】

前記第２のポリマーが、第２の結合点でＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドに共有結合される、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

前記第２のポリマーが、少なくとも約５００ダルトン、少なくとも約１０００ダルトン、少なくとも約２０００ダルトン、少なくとも約３０００ダルトン、少なくとも約４０００ダルトン、少なくとも約５０００ダルトン、又は少なくとも約６０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

前記第２のポリマーが、少なくとも約１２０ダルトン、少なくとも約２５０ダルトン、少なくとも約３００ダルトン、少なくとも約４００ダルトン、少なくとも約５００ダルトン、少なくとも約１０００ダルトン、少なくとも約２０００ダルトン、少なくとも約３０００ダルトン、少なくとも約４０００ダルトン、少なくとも約５０００ダルトン、又は少なくとも約６０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドが異種抗体又は抗原結合断片を含む、請求項３７～６２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項64】

前記異種抗体又は抗原結合断片がリンカーを更に含み、前記リンカーが、（ＧＳ）_ｎ（配列番号２４）、（ＧＧＳ）_ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２６）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（配列番号２７）、又は（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（配列番号２８）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２９）を含み、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

組成物であって、
（ａ）配列番号１０５と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片と、
（ｂ）１つ以上のリンカーであって、
（ｉ）配列番号１０５の３０～４０位
（ｉｉ）配列番号１０５の７０～８０位、及び
（ｉｉｉ）配列番号１０５の９５～１０５位
からなる群から選択されるアミノ酸残基において前記Ｆｃ領域に共有結合した１つ以上のリンカーと、
（ｃ）前記リンカーに共有結合した１つ以上のサイトカインと
を含む、組成物。

【請求項66】

前記アミノ酸残基が、リジン、チロシン、トリプトファン、又はシステインである、請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

前記アミノ酸残基がリジン残基である、請求項６５又は６６に記載の組成物。

【請求項68】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、移植抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、脱免疫化抗体、又は二重特異性抗体である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むか、又はそれらに由来する、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項70】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が前記ＩｇＧを含み、前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ４を含むか、又はそれに由来する、請求項６９に記載の組成物。

【請求項71】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、４５１２３８、ＫＸＧ２ＰＪ５５１Ｉ、ＭＳＢ－００１０６８２、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＰＦ－０６８３４６３５、ＣＡＳ１５３７０３２－８２－８）、デュルバルマブ（イミフィンジ、２８Ｘ２８Ｘ９ＯＫＶ（ＵＮＩＩコード）、ＭＥＤＩ－４７３６、ＣＡＳ１４２８９３５－６０－７）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、５２ＣＭＩ０ＷＣ３Ｙ、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＲＧ－７４４６、ＲＯ－５５４１２６７、ＣＡＳ１３８０７２３－４４－３）、スゲマリマブ（ＣＳ－１００１、ＷＢＰ－３１５５）、ＫＮ－０４６（ＣＡＳ２２５６０８４－０３－２）、ＡＰＬ－５０２（ＣＢＴ－５０２、ＴＱＢ－２４５０）、エンバホリマブ（３Ｄ－０２５、ＡＳＣ－２２、ＫＮ－０３５、ｈｕ５６Ｖ１－Ｆｃ－ｍ１、ＣＡＳ２１０２１９２－６８－５）、Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａ（Ｍ－７８２４、ＭＳＢ－００１１３５９Ｃ、ＮＷ９Ｋ８Ｃ１ＪＮ３、ＣＡＳ１９１８１４９－０１－５）、ＳＴＩ－１０１４（ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＺＫＡＢ－００１）、ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ、Ａ－１６７（ＨＢＭ－９１６７、ＫＬ－Ａ１６７）、ＩＭＣ－００１（ＳＴＩ－３０３１、ＳＴＩ－Ａ－１０１５、ＳＴＩ－Ａ１０１５、ｓ）、ＨＴＩ－１０８８（ＳＨＲ－１３１６）、ＩＯ－１０３、ＣＸ－０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＵＰＭ－１７０（ＣＡ－１７０）、ＧＳ－４２２４、ＮＤ－０２１（ＮＭ２１－１４８０、ＰＲＯ－１４８０）、ＢＮＴ－３１１（ＤｕｏＢｏｄｙ－ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ、ＧＥＮ－１０４６）、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＩＢＩ－３２２、ＮＭ－０１、ＬＹ－３４３４１７２、ＬＤＰ、ＣＤＸ－５２７、ＩＢＩ－３１８、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＲＥＧＮ３５０４、ＡＬＰＮ－２０２（ＣＤ８０ ｖＩｇＤ－Ｆｃ）、ＩＮＣＢ－０８６５５０、ＬＹ－３４１５２４４、ＳＨＲ－１７０１、ＪＳ－００３（ＪＳ００３－３０、ＪＳ００３－ＳＤ）、ＨＬＸ－２０（ＰＬ２＃３）、ＥＳ－１０１（ＩＮＢＲＸ－１０５、ＩＮＢＲＸ－１０５－１）、ＭＳＢ－２３１１、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ－２７９２５２、ＴＡＫ－２５２）、ＦＳ－１１８、ＦＳ１１８ ｍＡｂ２、ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ２）、ＦＡＺ－０５３（ＬＡＥ－００５）、ロダポリマブ（ＬＹ－３３０００５４、ＮＲ４ＭＡＤ６ＰＰＢ、ＣＡＳ２１１８３４９－３１－６）、ＭＣＬＡ－１４５、ＢＭＳ－１８９、コシベリマブ（ＣＫ－３０１、ＴＧ－１５０１、ＣＡＳ２２１６７５１－２６－５）、ＩＬ－１５Ｒａｌｐｈａ－ＳＤ／ＩＬ－１５（ＫＤ－０３３）、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ８５７０６４－３８－１）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＢＭＳ－９８６１９２、ＲＣ－９８、ＣＤ－２００ＡＲ－Ｌ（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）、ＡＴＡ－３２７１、ＩＢＣ－Ａｂ００２、ＢＭＸ－１０１、ＡＶＡ－０４－ＶｂＰ、ＡＣＥ－１７０８、ＫＹ－１０４３、ＡＣＥ－０５（ＹＢＬ－０１３）、ＯＮＣ－００５５（ＯＮＣ００５５、ＰＲＳ－３４４ Ｓ－０９５０１２）、ＴＬＪ－１－ＣＫ、ＧＲ－１４０５、ＰＤ１ＡＣＲ－Ｔ、Ｎ－８０９（Ｎ－ＩＬ１５／ＰＤＬ１）、ＣＢ－２０１、ＭＥＤＩ－１１０９、ＡＶＡ－００４（ＡＶＡ－０４）、ＣＡ－３２７、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＫＹ－１００３、ＣＤ２２（ａＰＤ－Ｌ１）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＳＬ－２２Ｐ）、ＡＴＡ－２２７１（Ｍ２８ｚ１ＸＸＰＤ１ＤＮＲ ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項72】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、又はアベルマブを含む、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項73】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が、表１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項74】

前記１つ以上のサイトカインが、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－７ポリペプチド、ＩＬ－１８ポリペプチド又はそれらの組合せを含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項75】

前記１つ以上のサイトカインが、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、修飾ＩＬ－７ポリペプチド、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド又はそれらの組合せを含む、請求項７４に記載の組成物。

【請求項76】

前記リンカーが、前記ＩＬ－２ポリペプチド、前記ＩＬ－７ポリペプチド、前記ＩＬ－１８ポリペプチド、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチド、前記修飾ＩＬ－７ポリペプチド、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチド又はそれらの組合せの非末端残基に共有結合される、請求項７５に記載の組成物。

【請求項77】

前記リンカーが、３５、３７、３８、４１、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７からなる群から選択されるアミノ酸残基に共有結合され、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、請求項７５又は７６に記載の組成物。

【請求項78】

前記リンカーが、アミノ酸残基４５に共有結合され、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項79】

前記リンカーが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片の前記アミノ酸配列中のチロシン残基に共有結合される、請求項７８に記載の組成物。

【請求項80】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチド、前記修飾ＩＬ－７ポリペプチド、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチド又はそれらの組合せが、それに共有結合した非リンカーポリマーを含む、請求項７５～７９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項81】

前記非リンカーポリマーが、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸残基に結合しており、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、請求項８０に記載の組成物。

【請求項82】

前記リンカーがポリマーを含む、請求項６５～８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項83】

前記ポリマーが水溶性ポリマーである、請求項８２に記載の組成物。

【請求項84】

前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む、請求項８３に記載の組成物。

【請求項85】

前記ポリマーが、前記第１の結合点と前記第２の結合点との間に少なくとも５０個の原子の鎖を含む、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項86】

前記ポリマーが、少なくとも約０．５ｋＤａ、少なくとも約１ｋＤａ、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、又は少なくとも約３０ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項87】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号３～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７５～８６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項88】

前記１つ以上のサイトカインが、２つの同じ修飾ＩＬ－２ポリペプチド、２つの異なる修飾ＩＬ－２ポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び修飾ＩＬ－７ポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、又は修飾ＩＬ－７ポリペプチド及び修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項89】

ＰＤ－Ｌ１又は前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくは抗原結合断片に選択的に結合するポリペプチドが、組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドを含む、請求項１～８８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項90】

ａ）請求項１～８９のいずれか一項に記載の組成物、及び
ｂ）１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤
を含む、医薬組成物。

【請求項91】

非経口投与又は経腸投与のために製剤化される、請求項９０に記載の医薬組成物。

【請求項92】

静脈内又は皮下投与用に製剤化される、請求項９０又は９１に記載の医薬組成物。

【請求項93】

凍結乾燥形態にある、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項94】

前記１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤が、糖質、無機塩、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、又はそれらの任意の組合せのそれぞれの１つ以上を含む、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項95】

１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の賦形剤を含む、請求項９０～９４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項96】

癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、有効量の請求項１～８９のいずれか一項に記載の組成物又は請求項９０～９５のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項97】

前記癌が癌腫、肉腫、又はそれらの組合せである、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記癌が前記癌腫であり、前記癌腫が、皮膚扁平上皮癌（ＣＳＣＣ）、尿路上皮癌（ＵＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、胃食道接合部（ＧＥＪ）癌、子宮内膜癌（ＥＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、又はそれらの組合せを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記癌が、黒色腫、肺癌、膀胱癌（ＢＣ）、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）／ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）固形腫瘍、腫瘍変異負荷高（ＴＭＢ－Ｈ）固形腫瘍、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌（ＧＣ）、子宮頸癌（ＣＣ）、胸膜中皮腫（ＰＭ）、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、又はそれらの組合せである、請求項９６に記載の方法。

【請求項100】

ａ）ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドの特定の残基に反応性基を共有結合させることと、
ｂ）前記反応性基をサイトカインに結合した相補的反応性基と接触させることと、
ｃ）組成物を形成することと
を含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。

【請求項101】

組成物を作製する方法であって、前記組成物が、
プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチド、
修飾ＩＬ－２ポリペプチド、ならびに
リンカーであって、前記リンカーが、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドの非末端残基に共有結合した第１の結合点、及び
ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する前記ポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含む、リンカー、
を含み、前記方法が、
ａ）カップリング酵素の存在下でリンカーと反応性である少なくとも１つの受容体アミノ酸残基を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片を提供することと、
ｂ）前記少なくとも１つの受容体アミノ酸残基と前記リンカーとの間の共有結合の形成を引き起こすことができる酵素の存在下で、前記抗体又は抗原結合断片を、反応性基（Ｒ）を含み第１級アミンを含むリンカーと反応させることと
を含み、
前記共有結合がＲ部分には存在せず、前記方法が、前記少なくとも１つの受容体アミノ酸残基が前記リンカーを介して前記反応性基に共有結合を形成するのに十分な条件下で実施され、前記共有結合が前記リンカーの前記第２の結合点を含む、
方法。

【請求項102】

前記酵素がトランスアミナーゼを含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記酵素がトランスグルタミナーゼを含む、請求項１０１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年７月９日に出願された米国仮出願第６３／２１９，９８５号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

２０２１年には、米国で推定１８０万人の新規癌症例が診断され、６０万人を超える人々がこの疾患で死亡する。免疫療法は、疾患の治療を支援するために対象の免疫系を利用する。免疫療法は、治療される疾患の性質に応じて免疫系を活性化又は抑制するように設計することができる。癌の治療のための様々な免疫療法の目標は、免疫系を刺激して、腫瘍又は他の癌性組織を認識し、破壊することである。

【0003】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫系を下方制御し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することによって自己寛容を促進することによって、人体の細胞に対する免疫系の応答を制御する細胞表面のタンパク質である。プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、免疫系の適応アームを抑制する１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１経路は、内因性免疫抗腫瘍活性に応答して腫瘍細胞によって発揮される適応免疫系耐性機構を表す。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤、例えば抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイントタンパク質の活性を遮断するチェックポイント阻害剤抗癌剤である。しかしながら、単一機構療法単独では、多くの場合、癌を治療するには不十分である。したがって、癌治療のための改善されたツールが必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

抗プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）－インターロイキン２（ＩＬ２）イムノコンジュゲート（ＰＤＬ１－ＩＬ２）及びその使用が本明細書に記載される。

【0005】

一態様では、プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及びリンカーを含む、組成物であって、リンカーが、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの非末端残基に共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含む、組成物が本明細書に記載される。

【0006】

一態様では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及びリンカーを含む、組成物であって、リンカーが、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドの非末端残基に共有結合した第２の結合点を含む、組成物が本明細に記載される。

【0007】

別の態様では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び化学的リンカーを含む組成物であって、化学的リンカーが、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含む、組成物が本明細書に記載される。

【0008】

別の態様では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び化学的リンカーを含む組成物であって、化学的リンカーが、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドはＩＬ－２受容体βサブユニットに向かって偏向されている、組成物が本明細書に記載される。

【0009】

別の態様では、アミノ酸残基４２に結合した第１のポリマーであって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングが、参照配列としての配列番号１に基づく、第１のポリマーを含む、ＩＬ－２ポリペプチドと、プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチドとを含む、組成物が本明細書に記載される。

【0010】

別の態様では、（ａ）プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合し、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域が配列番号１０５と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体又は抗原結合断片、（ｂ）（ｉ）配列番号１０５の２５～３５位、（ｉｉ）配列番号１０５の７２～７４位、（ｉｉｉ）配列番号１０５の１０１位からなる群から選択されるアミノ酸残基においてＦｃ領域に共有結合される１つ以上のリンカー、及び（ｃ）リンカーに共有結合した１つ以上のサイトカインを含む組成物が本明細書に記載される。

【0011】

別の態様では、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合し、Ｆｃ領域を含む、抗体又はその抗原結合断片、（ｂ）Ｋ２４６、Ｋ２４８、Ｋ２８８、Ｋ２９０及びＫ３１７（Ｅｕナンバリング）からなる群から選択されるアミノ酸残基においてＦｃ領域に共有結合した１つ以上のリンカー、及び（ｃ）１つ以上のリンカーに共有結合した１つ以上のサイトカインを含む組成物が本明細書に記載される。

【0012】

ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、例えば、抗体等の組換えタンパク質、又は合成タンパク質であり得る。

【0013】

別の態様では、ａ）本明細書に記載される組成物、及びｂ）１つ以上の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に記載される。

【0014】

別の態様では、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の任意の組成物又は本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書に記載される。

【0015】

別の態様では、本明細書に記載の組成物を製造する方法であって、ａ）ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドの特定の残基に反応性基を共有結合させることと、ｂ）反応性基をサイトカインに結合した相補的反応性基と接触させることと、ｃ）組成物を形成することと、を含む方法が本明細書に記載される。

【0016】

別の態様では、組成物を作製する方法であって、組成物が、プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及びリンカーを含み、リンカーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの非末端残基に共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含み、方法は、ａ）カップリング酵素の存在下でリンカーと反応性である少なくとも１つの受容体アミノ酸残基を有するＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを提供することと、ｂ）ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する当該ポリペプチドを、第１級アミンを含むリンカーであって、反応性基（Ｒ）を含むリンカーと、少なくとも１つの受容体アミノ酸残基とリンカーとの間に共有結合を形成させることができる酵素の存在下で反応させることと、を含み、共有結合がＲ部分には存在せず、少なくとも１つの受容体アミノ酸残基がリンカーを介して反応性基に共有結合を形成するのに十分な条件下で実施され、共有結合がリンカーの第２の結合点を含む、組成物を作製する方法が本明細書に記載される。

【0017】

別の態様では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及びリンカーを含む組成物を作製する、方法であって、リンカーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基に共有結合した第１の結合点、及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドに共有結合した第２の結合点を含み、方法は、ａ）官能化Ｆｃ結合親和性ペプチドの存在下でリンカー前駆体と反応性である少なくとも１つの受容体アミノ酸残基を有するＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを提供することと、ｂ）ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する当該ポリペプチドを、受容体アミノ酸残基と結合を形成することができる反応性基（Ｒ）を含むリンカー前駆体と反応させることと、を含み、方法が、少なくとも１つの受容体アミノ酸残基に、リンカーを介して反応性基と共有結合を形成させるのに十分な条件下で行われ、共有結合が、リンカーの第２の結合点を含む、方法が本明細書に記載される。

【0018】

本開示の更なる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され説明される以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の様々な実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、種々の明白な点で修正が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示と見なされるべきであり、限定と見なされるべきではない。

【0019】

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許若しくは特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような矛盾する材料に取って代わる及び／又は優先することを意図している。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】本開示の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカイン、並びにＩＬ２Ｒβ／γの上方制御及びＰＤ－１／ＰＤＬ１経路の遮断を介した抗ＰＤＬ１－ＩＬ－２免疫サイトカインと活性化Ｔ細胞との相互作用を示す図である。

【図1B】本明細書中に提供されるコンジュゲーション可能なＩＬ－２ポリペプチドである組成物ＡＢの３Ｄ表現を示す図である。

【図2A】１つ又は２つのコンジュゲーションハンドルを導入するためのＡＪＩＣＡＰ技術による抗ＰＤＬ１抗体の部位選択的修飾を示す図である。

【図2B】非修飾デュルバルマブ（上）及びＤＢＣＯコンジュゲーションハンドルを有するデュルバルマブ（下）のＱ－ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である。

【図2C】ＤＡＲ１、ＤＡＲ２又は１～２の混合ＤＡＲを有するＰＤＬ１－ＩＬ２を生成するためのＩＬ２サイトカインの部位選択的コンジュゲーション反応を示す図である。

【図2D】ＤＡＲ１、ＤＡＲ２又は１～２の混合ＤＡＲのいずれかを有するＰＤＬ１－ＩＬ２免疫サイトカインを示す図である。

【図2E】１～２の混合ＤＡＲを有するＰＤＬ１－ＩＬ２免疫サイトカインのインタクトＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す図である。

【図2F】ＰＤＬ１－ＩＬ２免疫サイトカインのＳＥＣ－ＨＰＬＣトレースを示す図であり、１～２の混合ＤＡＲ、凝集したＨＭＷ＜０．５％である。

【図3】非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体がＰＤ－Ｌ１リガンドと結合する能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸に正規化されたＥＬＩＳＡシグナルを示し、ｘ軸にビオチン化ＰＤ－Ｌ１タンパク質の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ、アベルマブ並びに組成物Ａ及びＢである。抗ＰＤ１抗体ペンブロリズマブも対照として使用した。

【図4】非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体が、ＰＤ１／ＰＤＬ１経路を妨害する能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上にエフェクター細胞ＮＦＡＴ－ＲＥレポーターの平均発光強度を示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。この図で試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、プロロイキン及び組成物ＡＡである。

【図5】ｐＨ６でヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃＲｎ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【図6A】ヒトＦｃγ受容体Ｉ（ＣＤ６４）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【図6B】ヒトＦｃγ受容体ＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩＩａ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【図6C】ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩＩＩａ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【図7】ヒトＴ細胞のインビトロ試料におけるＴ_ｅｆｆ及びＴ_ｒｅｇ細胞の誘導に対する、抗ＰＤＬ１抗体にコンジュゲートされていない修飾ＩＬ－２ポリペプチド及びコンジュゲートされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドの効果を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上にリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５（ｐＳＴＡＴ５）についての平均蛍光強度を示し、ｘ軸上に修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び免疫サイトカインの投与量を示す。試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、組成物ＡＡである。この図で試験した免疫サイトカインは、組成物Ａ及び対照としてのＨｅｒ２標的化免疫サイトカイン組成物Ｆ（ＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体）である。

【図8】過剰量の非コンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の存在下又は非存在下でのヒトＴ細胞のインビトロ試料における静止期ＣＤ８＋Ｔ_ｅｆｆ細胞の誘導に対する、抗ＰＤＬ１抗体にコンジュゲートされていない修飾ＩＬ－２ポリペプチド及びコンジュゲートされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドの効果を測定するプロットを示す図であり、図は、ｙ軸上にリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５（ｐＳＴＡＴ５）についての平均蛍光強度を示し、ｘ軸上に修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び免疫サイトカインの投与量を示す。この図で試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、組成物ＡＡである。この図で試験した免疫サイトカインは、組成物Ａ及び対照としてのＨｅｒ２標的化免疫サイトカイン組成物Ｆ（ＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体）である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又はその抗原結合断片が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又はその抗原結合断片は、サイトカイン等の細胞シグナル伝達分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、サイトカインはＩＬ－２である。図１は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカイン、並びにＩＬ２Ｒβ／γの上方制御及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の遮断を介した抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインと活性化Ｔ細胞との相互作用を示す。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、対象による相乗的有効性及び改善された耐容性を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を直接標的化することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、癌等の疾患を有する対象に対する抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又はＩＬ－２の治療用量を有意に減少させることができる。

【0022】

抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、１つ以上の作用様式によって作用し得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、腫瘍内のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とすることによってＰＤ－Ｌ１を阻害することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２免疫サイトカインは、ＩＬ－２Ｒβγを介してＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化することができる。

【0023】

以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、本開示の範囲内に包含される本開示の多数の変形及び修正が存在することを認識するであろう。

【0024】

本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で記載され得るが、これらの特徴は、別々に又は任意の適切な組合せでも提供され得る。反対に、本開示は、明確にするために別個の実施形態の文脈で本明細書において記載され得るが、本開示は、単一の実施形態でも実施され得る。

【0025】

本明細書で使用される章の見出しは、系統立てのみを目的にしたものであり、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0026】

定義
全ての用語は、それらの用語が当業者によって理解される通りに理解されることが意図されている。別段の定義が為されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0027】

以下の定義は、当技術分野における定義を補足し、本出願を対象とするものであり、関連する又は関連しない事例、例えば、共有される特許又は出願に適用されるべきではない。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本開示の試験のための実施において使用することができるが、本明細書には好ましい材料及び方法が記載されている。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。

【0028】

本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。本願では、単数形の使用は、特段明記しない限り複数形の使用を含む。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。

【0029】

本願では、「又は（ｏｒ）」の使用は、特段明記しない限り「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。本明細書で使用される「及び／又は」及び「それらの任意の組合せ」という用語及びそれらの文法上の等価物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組合せが具体的に想定されることを伝えることができる。単に例示を目的として、以下の語句「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの任意の組合せ」は、「Ａ個別、Ｂ個別、Ｃ個別、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＣ、並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味することができる。「又は」という用語は、文脈が特に選言的使用を指す場合を除き、連言的又は選言的に使用することができる。

【0030】

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し得、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内又は１標準偏差超を意味することができる。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、ある値の、５倍以内、又は２倍以内の大きさの程度を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味すると仮定されるべきである。

【0031】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等の任意のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」等の、任意のｈａｖｉｎｇの形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等の、任意のｉｎｃｌｕｄｉｎｇの形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等の任意のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの形態）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であると考えられる。更に、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用することができる。

【0032】

本明細書における「いくつかの実施形態」、「一実施形態」、「１つの実施形態」又は「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。本開示の理解を容易にするために、多数の用語及び語句を以下に定義する。

【0033】

ＩＬ－２ポリペプチドの残基に「結合した」又は「共有結合した」基が本明細書で言及される。本明細書で使用される場合、「結合される」又は「共有結合される」は、基が示された存在にテザリングされていることを意味し、そのようなテザリングは連結基（すなわち、リンカー）を含むことができる。したがって、残基に「結合した」又は「共有結合した」基の場合、そのような連結基も包含されることが明確に企図される。

【0034】

結合親和性は、単一分子とそのリガンド／結合パートナとの間の結合相互作用の強度を指す。より高い結合親和性は、より低い結合親和性よりも高い強度の結合を指す。場合によっては、結合親和性は、２つの関連分子間の解離定数（ＫＤ）によって測定される。ＫＤ値を比較する場合、より低い値を有する結合相互作用は、より高い値を有する結合相互作用よりも高い結合親和性を有する。タンパク質－リガンド相互作用の場合、ＫＤは、以下の式

【0035】

【数1】

であって、式中、［Ｌ］はリガンドの濃度であり、［Ｐ］はタンパク質の濃度であり、［ＬＰ］はリガンド／タンパク質複合体の濃度である、式に従って計算される。

【0036】

本明細書では、参照配列に対して特定のパーセント配列同一性を有するか、又は参照配列の位置に対応する位置の残基を指す特定のアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド配列）を指す。配列同一性は、Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、及びＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔのパラメータを使用して、タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定される。このアライメントアルゴリズムはまた、比較される２つの配列のアライメントの分析を通じて残基が「対応する」位置にあるかどうかを評価するために使用される。

【0037】

「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか又は承認可能であるか、又はヒトを含む動物における使用のために米国薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを指す。

【0038】

「薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤」は、薬剤と共に対象に投与することができ、その薬理活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である賦形剤、担体又は希釈剤を指す。

【0039】

本開示に適した「薬学的に許容される塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト又は動物の組織と接触して使用するのに適していると当技術分野で一般的に考えられている酸又は塩基の塩であり得る。そのような塩には、アミン等の塩基性残基の無機及び有機酸塩、並びにカルボン酸等の酸性残基のアルカリ又は有機塩が含まれる。特定の医薬塩には、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸等のアルカン酸、ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは０～４である）等の酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンには、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本開示及び当技術分野の知識から、更なる薬学的に許容される塩には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）によって列挙されたものが含まれることを認識するであろう。一般に、薬学的に許容される酸又は塩基塩は、任意の従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。簡潔には、このような塩は、これらの化合物の遊離酸又は遊離塩基形態を適切な溶媒中で化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製することができる。

【0040】

本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値の全てに対する省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、並びに例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９等の前述の整数間の全ての介在する十進値からなる群からの任意の数、数の組合せ又は部分範囲を含むものと理解される。部分範囲に関して、その範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子状部分範囲」が特に企図される。例えば、１～５０の例示的な範囲の入れ子状部分範囲は、一方の方向に１～１０、１～２０、１～３０及び１～４０、又は他方の方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、及び５０～１０を含み得る。

【0041】

本明細書で提供される特定の式及び他の例示は、アジド－アルキン環化付加反応から生じるトリアゾール反応生成物を示す。そのような式は、一般に、反応で形成された得られたトリアゾールの単一の位置異性体のみを示すが、式は両方の得られた位置異性体を包含することが意図されている。したがって、式は単一の位置異性体（例えば、

【0042】

【化1】

）のみを示す一方で、他の位置異性体（例えば、

【0043】

【化2】

）も包含されることが意図される。

【0044】

「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、対象には、それだけに限らないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコが含まれる哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、続いて記載される事象又は状況が起こり得るが、起こる必要はないこと、及びその説明が、その事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。

【0046】

「部分」という用語は、分子の特定のセグメント又は官能基を指す。化学部分は、多くの場合、分子に埋め込まれた又は付加された化学的実体として認識される。

【0047】

本明細書で使用される場合、「数平均分子量」（Ｍｎ）という用語は、試料中の全ての個々の単位の統計的平均分子量を意味し、式（１）

【0048】

【数2】

であって、式中、Ｍ_ｉは単位の分子量であり、Ｎ_ｉはその分子量の単位数である、式（１）によって定義される。

【0049】

本明細書で使用される場合、「重量平均分子量」（Ｍｗ）という用語は、式（２）

【0050】

【数3】

であって、式中、Ｍ_ｉは単位の分子量であり、Ｎ_ｉはその分子量の単位数である、式（２）によって定義される数を意味する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「ピーク分子量」（Ｍｐ）は、所与の分析方法（例えば、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ、動的光散乱、分析遠心分離等）における最高ピークの分子量を意味する。

【0052】

本明細書で使用される場合、「非標準」アミノ酸は、天然に存在するタンパク質に一般に組み込まれる２０個の標準的なアミノ酸の中にはないＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を指し得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲーションハンドル」は、相補的な反応性基と接触すると結合を形成することができる反応性基を指す。いくつかの例では、コンジュゲーションハンドルは、好ましくは、意図される相補的反応性基を含まない他の分子との実質的な反応性を有さない。コンジュゲーションハンドル、それらのそれぞれの相補的なコンジュゲーションハンドル、及び対応する反応生成物の非限定的な例は、以下の表に見出すことができる。表の見出しは、「コンジュゲーションハンドル」又は「相補的コンジュゲーションハンドル」というタイトルの下に特定の反応性基を記載しているが、コンジュゲーションハンドルへの任意の言及は、代わりに、表に列挙された相補的コンジュゲーションハンドルを包含し得ることを意図している（例えば、トランス－シクロオクテンはコンジュゲーションハンドルであり得、この場合、テトラジンは相補的なコンジュゲーションハンドルである）。いくつかの例では、アミンコンジュゲーションハンドル及びアミンに相補的なコンジュゲーションハンドルは、生物学的系におけるアミンの遍在的存在及び標的外コンジュゲーションの可能性の増加のために、生物学的系における使用にあまり好ましくない。

【0054】

【表1】

【0055】

本出願を通して、「コンジュゲーションハンドル」という用語の前に接頭辞を使用して、コンジュゲーションハンドルが連結される機能を示す。例えば、「タンパク質コンジュゲーションハンドル」は、タンパク質に（直接又はリンカーを介して）結合したコンジュゲーションハンドルであり、「抗体コンジュゲーションハンドル」は、抗体に（直接又はリンカーを介して）結合したコンジュゲーションハンドルであり、「リンカーコンジュゲーションハンドル」は、リンカー基に結合したコンジュゲーションハンドルである（例えば、合成タンパク質と抗体とを連結するために使用される二官能性リンカー）。

【0056】

用語「アルキル」は、１～２０個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りに結合される直鎖又は分岐の炭化水素鎖ラジカルを指す。１０個までの炭素原子を含むアルキルは、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルと呼ばれ、同様に、例えば、６個までの炭素原子を含むアルキルは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル（及び本明細書で定義される他の部分）も同様に表される。アルキル基としては、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_９アルキル、Ｃｉ～Ｃ_８アルキル、Ｃ_１～Ｃ_７アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_５アルキル、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、Ｃ_１～Ｃ_３アルキル、Ｃ_１～Ｃ_２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキル、Ｃ_３～Ｃ_８アルキル及びＣ_４～Ｃ_８アルキルが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、－プロピル、１－メチルエチル、－ブチル、－ペンチル、１，１－ジメチルエチル、３－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、１－エチル－プロピル等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルキルは、メチル又はエチルである。いくつかの実施形態では、アルキルは、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２又は－Ｃ（ＣＨ_３）_３である。本明細書中で具体的に他の意味を示さない限り、アルキル基は場合により置換されていてもよい。「アルキレン」又は「アルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖又は分岐二価炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ_２ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－である。本明細書中で具体的に他の意味を示さない限り、アルキレン基は場合により置換されていてもよい。

【0057】

「アルケニレン」又は「アルケニレン鎖」という用語は、分子の残りをラジカル基に連結する少なくとも１つの炭素－炭素二重結合が存在する直鎖又は分岐二価炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態では、アルケニレンは、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－又は－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２－である。いくつかの実施形態では、アルケニレンは、－ＣＨ＝ＣＨ－である。いくつかの実施形態では、アルケニレンは、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－である。いくつかの実施形態では、アルケニレンは、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２－である。

【0058】

「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合が存在する種類のアルキル基を指す。一実施形態では、アルケニル基は、式－Ｃ≡Ｃ－Ｒ^Ｘを有し、式中、Ｒ^ｘは、アルキニル基の残りの部分を指す。いくつかの実施形態では、Ｒ^ｘは、Ｈ又はアルキルである。いくつかの実施形態では、アルキニルは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等から選択される。アルキニル基の非限定的な例としては、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｃ≡ＣＣＨ_３、－Ｃ≡ＣＣＨ_２ＣＨ、及び－ＣＨ_２Ｃ^ｏＣＨが挙げられる。

【0059】

「アリール」という用語は、環を形成する原子のそれぞれが炭素原子である少なくとも１つの芳香環を含むラジカルを指す。アリール基は必要に応じて置換されていてもよい。アリール基の例としては、フェニル及びナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アリールはフェニルである。構造に応じて、アリール基はモノラジカル又はジラジカル（すなわち、アリーレン基）であり得る。本明細書で具体的に他の意味を示さない限り、「アリール」又は接頭辞「ａｒ－」（「アラルキル」等）は、必要に応じて置換されているアリールラジカルを含むことを意味する。いくつかの実施形態では、アリール基は、本明細書で定義される部分的に還元されたシクロアルキル基（例えば、１，２－ジヒドロナフタレン）を含む。いくつかの実施形態では、アリール基は、本明細書で定義される完全に還元されたシクロアルキル基（例えば、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン）を含む。アリールがシクロアルキル基を含む場合、アリールは芳香環炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。アリールラジカルは、縮合、スピロ又は架橋環系を含み得る単環式又は多環式（例えば、二環式、三環式又は四環式）環系であり得る。

【0060】

用語「シクロアルキル」は、環を形成する原子（すなわち、骨格原子）の各々が炭素原子である、単環式若しくは多環式非芳香族ラジカルを指す。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、飽和又は部分的に不飽和である。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、スピロ環式又は架橋化合物である。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、芳香族環と縮合している（この場合、シクロアルキルは、非芳香族環炭素原子を介して結合される）。シクロアルキル基には、３～１０個の環原子を有する基が含まれる。代表的なシクロアルキルには、３～１０個の炭素原子、３～８個の炭素原子、３～６個の炭素原子又は３～５個の炭素原子を有するシクロアルキルが含まれるが、これらに限定されない。単環式シクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンチルである。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルである。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンテニルである。多環式ラジカルには、例えば、アダマンチル、１，２－ジヒドロナフタレニル、１，４－ジヒドロナフタレニル、テトラニル、デカリニル、３，４－ジヒドロナフタレニル－１（２Ｈ）－オン、スピロ［２．２］ペンチル、ノルボルニル及びビシクロ［１．１．１］ペンチルが含まれる。本明細書で具体的に他の意味を示さない限り、シクロアルキル基は必要に応じて置換されていてもよい。

【0061】

「ヘテロアルキレン」又は「ヘテロアルキレン鎖」という用語は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖又は分岐二価ヘテロアルキル鎖を指す。本明細書で具体的に他の意味を示さない限り、ヘテロアルキル又はヘテロアルキレン基は、以下に記載されるように必要に応じて置換されていてもよい。代表的なヘテロアルキレン基には、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（アルキル）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（アリール）－ＣＨ_２－、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－、又は－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－が含まれるが、これらに限定されない。

【0062】

「ヘテシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むシクロアルキル基を指す。本明細書において具体的に他の意味を示さない限り、ヘテロシクロアルキルラジカルは、縮合（アリール環又はヘテロアリール環と縮合している場合、ヘテロシクロアルキルは、非芳香族環原子を介して結合される）又は架橋環系を含み得る単環式又は二環式環系であり得る。ヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素又は硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてもよい。窒素原子は、必要に応じて四級化されていてもよい。ヘテロシクリルラジカルは、部分的又は完全に飽和している。ヘテロシクリルラジカルの例としては、ジオキソラニル、チエニル［ｌ，３］ジチアニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソ－チオモルホリニル、及び１，１－ジオキソ－チオモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルという用語はまた、単糖、二糖及びオリゴ糖を含むがこれらに限定されない糖質の全ての環形態を含む。特に明記しない限り、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素と、１又は２個のＮ原子とを有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素と、３又は４個のＮ原子とを有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素、０～２個のＮ原子、０～２個のＯ原子、０～２個のＰ原子及び０～１個のＳ原子を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素、１～３個のＮ原子、０～１個のＯ原子及び０～１個のＳ原子を有する。ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数に言及する場合、ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数は、ヘテロシクロアルキルを構成する（ヘテロ原子を含む）原子（すなわち、ヘテロシクロアルキル環の骨格原子）の総数と同じではないことが理解される。本明細書で具体的に他の意味を示さない限り、ヘテロシクロアルキル基は必要に応じて置換されていてもよい。

【0063】

用語「ヘテロアリール」は、窒素、酸素及び硫黄から選択される１つ以上の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、単環式又は二環式である。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンズイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン及びプテリジンが挙げられる。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、及びフラザニルが挙げられる。二環式ヘテロアリールの具体例としては、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンズイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン、及びプテリジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、チエニル、チアジアゾリル又はフリルである。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～６個のＮ原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に１～４個のＮ原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に４～６個のＮ原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～４個のＮ原子、０～１個の０原子、０～１個のＰ原子及び０～１個のＳ原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に１～４個のＮ原子、０～１個のＯ原子及び０～１個のＳ原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、Ｃ_１～Ｃ_９ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、単環式ヘテロアリールは、Ｃ_１～Ｃ_５ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、単環式ヘテロアリールは、５員又は６員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、二環式ヘテロアリールは、Ｃ６～Ｃ９ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、本明細書で定義される部分的に還元されたシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基（例えば、７，８－ジヒドロキノリン）を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、本明細書で定義される完全に還元されたシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基（例えば、５，６，７，８－テトラヒドロキノリン）を含む。ヘテロアリールがシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基を含む場合、ヘテロアリールは、ヘテロ芳香環炭素又はヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合される。ヘテロアリールラジカルは、縮合、スピロ又は架橋環系を含み得る単環式又は多環式（例えば、二環式、三環式又は四環式）環系であり得る。

【0064】

「場合により置換されていてもよい」又は「置換された」という用語は、言及された基が、Ｄ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ（アルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｎ（アルキル）_２、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、フルオロアルコキシ、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホン及びアリールスルホンから個別に独立して選択される１つ以上の追加の基で任意に置換されることを意味する。いくつかの他の実施形態では、任意の置換基は、独立して、Ｄ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ_２、－ＮＨ（ＣＨ_３）、－Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）_２、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_４フルオロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_４フルオロアルコキシ、－ＳＣ_１～Ｃ_４アルキル、－Ｓ（＝Ｏ）Ｃ_１～Ｃ_４アルキル及び－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｃ_１～Ｃ_４アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、任意の置換基は、独立して、Ｄ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＮＨ（ＣＨ_３）、－Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＮＨ（シクロプロピル）、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＦ_３、－ＯＣＨ_３及び－ＯＣＦ_３から選択される。いくつかの実施形態では、置換された基は、先行する基の１つ又は２つで置換される。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素原子（非環式又は環式）上の任意の置換基は、オキソ（＝Ｏ）を含む。

【0065】

本明細書で使用される場合、「ＡＪＩＣＡＰ（商標）技術」、「ＡＪＩＣＡＰ（商標）方法」及び同様の用語は、所望の官能化を所望の部位に送達するための親和性ペプチドを使用した抗体及び関連分子の部位特異的官能化のためのシステム及び方法（現在、味の素バイオファーマサービス（「味の素」）によって製造されている）を指す。ＡＪＩＣＡＰ（商標）方法論のための一般的なプロトコルは、少なくともＰＣＴ公開番号国際公開第２０１８１９９３３７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８８号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０２００９０９７９号、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１，１８，４０５８－４０６６，ａｎｄ Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＩＣＡＰ：Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１９，５８，５５９２－５５９７、及び特に米国特許出願公開第２０２００１９０１６５号の実施例２～４に見出される。いくつかの実施形態では、そのような方法論は、抗体Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域）の位置２４６、位置２４８、位置２８８、位置２９０、及び位置３１７（ＥＵナンバリング）から選択される位置のリジン残基に所望の官能化を特異的に組み込む。いくつかの実施形態では、所望の官能基化は、抗体Ｆｃ領域の残基位置２４８に組み込まれる（ＥＵナンバリング）。いくつかの実施形態では、位置２４８は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域の１８番目の残基に対応する（ＥＵナンバリング）。

【0066】

組成物ＡＡは、残基Ｙ４５に結合した約０．５ｋＤａのＰＥＧ基及び残基Ｆ４２Ｙに結合した第２の約０．５ｋＤａのＰＥＧ基を含む、配列番号３に示される配列を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0067】

組成物ＡＢは、残基Ｙ４５に結合した約０．５ｋＤａのＰＥＧ基と、残基Ｆ４２Ｙでのコンジュゲーションを容易にするアジド官能基でキャップした０．５ｋＤａのＰＥＧ基とを含む、配列番号３に示される配列を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。組成物ＡＢのイラスト画像を図１Ｂに示す。組成物ＡＢ及び関連する修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号国際公開第２０２１１４０４１６号に記載されている。組成物ＡＢに結合したポリマーは、組成物ＡＢとＩＬ－２受容体αサブユニットとの相互作用を破壊し、分子をＩＬ－２受容体βサブユニットのシグナル伝達に有利に偏向させるように作用し、したがって、ＩＬ－２ポリペプチドがＷＴ ＩＬ－２と比較してインビボでＴ_ｅｆｆ細胞を増殖及び／又は刺激する能力を増強する。

【0068】

組成物ＡＣは、残基Ｆ４２Ｙ及びＹ４５に結合した約０．５ｋＤａのＰＥＧ基を含む、配列番号３に示される配列を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。組成物ＡＣは、グルタル酸リンカー官能基を介してカップリングされた約０．５ｋＤａのＰＥＧを介してＮ末端Ａ残基に結合されたアジドコンジュゲーションハンドルを含む。

【0069】

組成物Ａは、組成物ＡＢと抗ＰＤ－Ｌ１抗体デュルバルマブとの反応から調製された抗ＰＤ－Ｌ１抗体／ＩＬ－２コンジュゲートを指す。組成物Ａは、組成物ＡＢのアジド官能基と、デュルバルマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してデュルバルマブに付加される。組成物Ａは、１．６の薬物－抗体比を有する。

【0070】

組成物Ｂは、組成物ＡＢと抗ＰＤ－Ｌ１抗体デュルバルマブとの反応から調製された抗ＰＤ－Ｌ１抗体／ＩＬ－２コンジュゲートを指す。組成物Ｂは、組成物ＡＢのアジド官能基と、デュルバルマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してデュルバルマブに付加される。組成物Ｂは、薬物－抗体比が１である。

【0071】

組成物Ｃは、組成物ＡＢと抗ＰＤ－Ｌ１抗体デュルバルマブとの反応から調製された抗ＰＤ－Ｌ１抗体／ＩＬ－２コンジュゲートを指す。組成物Ｃは、組成物ＡＢのアジド官能基と、デュルバルマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してデュルバルマブに付加される。組成物Ｃは、２の薬物－抗体比を有する。

【0072】

組成物Ｄは、組成物ＡＢのアジド官能基と、アテゾリズマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してアテゾリズマブに付加される。組成物Ｄは、１の薬物－抗体比を有する。

【0073】

組成物Ｅは、組成物ＡＣのアジド官能基と、アテゾリズマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してアテゾリズマブに付加される。組成物Ｅは、２の薬物－抗体比を有する。

【0074】

組成物Ｆは、組成物ＡＢのアジド官能基とトラスツズマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してトラスツズマブに付加される。組成物Ｆは、１．５の薬物－抗体比を有する。

【0075】

組成物Ｇは、組成物ＡＢのアジド官能基と、トラスツズマブのＦｃ領域の残基Ｋ２４８に結合したＤＢＣＯ官能基との反応から形成される（ＥＵナンバリング）。ＤＢＣＯ官能基は、味の素のＡＪＩＣＡＰ技術による親和性ペプチド系を使用してトラスツズマブに付加される。組成物Ｇは、１の薬物－抗体比を有する。全ての免疫サイトカイン組成物の概要を以下の表に示す。

【0076】

サイトカインにコンジュゲートした抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、活性化Ｔ細胞及び活性化Ｂ細胞において主に発現され、抗原受容体シグナル伝達を負に制御することができる免疫抑制受容体「プログラム死受容体１（ＰＤ－１）」のリガンドである。ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、構成的に発現されてもよく、又は非造血細胞組織及び様々な腫瘍型を含む多数の細胞型に由来してもよい。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞（ＤＣ）において発現されるが、末梢細胞、擬似血管内皮細胞及び心臓、肺等の非リンパ器官においても発現される。非限定的な、例示的な、ヒトＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列は、以下である。
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号１２０）

【0077】

１つ以上のサイトカイン分子又はその誘導体にコンジュゲートされたプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合するポリペプチド、例えば抗体及びその抗原結合断片が本明細書で提供される。本明細書で提供されるコンジュゲートは、癌細胞等の標的細胞に、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するサイトカイン及びポリペプチドを同時に送達するのに有効である。同じ細胞への両方の薬剤のこの同時送達は、ＩＬ－２ポリペプチド選択性の改善、ＩＬ－２の治療可能性の向上、及びＩＬ－２療法の投与による副作用のリスクの潜在的低減を含む、多くの利点を有する。

【0078】

本明細書で提供されるコンジュゲート組成物は、リンカーを利用して、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドをサイトカイン、例えばＩＬ－２ポリペプチド及びその誘導体に結合させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、特定の残基又は残基の特定のサブセットにおいてＰＤ－Ｌ１及びサイトカインに選択的に結合するポリペプチドの各部分に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、コンジュゲートの集団が実質的に均一になるように、部位選択的に各部分に結合される。これは、コンジュゲーション反応のための試薬をコンジュゲーションされる部分に部位選択的に添加することによって、コンジュゲーション反応のための所望の試薬によりコンジュゲートされる部分を合成することによって、又はそうでなければ調製することによって、又はこれら２つのアプローチの組合せを含む、本明細書で提供されるような様々な方法で達成することができる。これらのアプローチを使用して、各部分に対するリンカーの結合部位（特定のアミノ酸残基等）を正確に選択することができる。更に、これらのアプローチは、融合タンパク質に必要とされるようなアミノ酸残基に限定されない様々なリンカーを組成物に使用することを可能にする。リンカーの選択と部分への正確な結合とのこの組合せは、いくつかの実施形態では、例えば、リンカーがサイトカインの受容体と相互作用する位置でサイトカインに結合される場合、リンカーが部分の１つの活性を調節する機能も果たすことを可能にする。

【0079】

抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。抗体は、他の物質に結合するよりも高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、標的に選択的に結合するか又は優先的に結合する。したがって、「特異的結合」又は「優先的結合」は、排他的結合を（含むことができるが）必ずしも必要としない。一般に、必ずしもそうとは限らないが、特異的結合への言及は、抗体又はその抗原結合断片の親和性が、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、又は少なくとも１０００倍大きい優先的結合を意味する。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１とリガンド（例えば、ＰＤ－１）との相互作用を遮断することができる。

【0080】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原結合ドメインであるか、又は抗原結合ドメインと相同である、結合ドメインを有する、免疫グロブリン（Ｉｇ）、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。この用語は、「抗原結合断片」及び以下に記載される類似の結合断片についての他の交換可能な用語を更に含む。ネイティブ抗体及びネイティブ免疫グロブリン（Ｉｇ）は、一般に、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（「Ｖ_Ｈ」）を有し、その後に多数の定常ドメイン（「Ｃ_Ｈ」）が続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（「Ｖ_Ｌ」）を有し、他方の末端に定常ドメイン（「Ｃ_Ｌ」）を有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。

【0081】

いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、単離された抗体又は抗原結合断片、精製された抗体又は抗原結合断片、組換え抗体又は抗原結合断片、修飾された抗体又は抗原結合断片、又は合成抗体又は抗原結合断片を含む。

【0082】

本明細書における抗体及び抗原結合断片は、部分的又は全体的に合成的に産生され得る。抗体又は抗原結合断片は、抗原結合ドメインであり得るか、又は抗原結合ドメインと相同であり得る結合ドメインを有するポリペプチド又はタンパク質であり得る。一例では、抗体又は抗原結合断片は、適切なインビボ動物モデルにおいて産生され得、次いで単離及び／又は精製され得る。

【0083】

その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリン（Ｉｇ）を異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分割され得る。Ｉｇ又はその一部は、いくつかの場合、ヒトＩｇであり得る。いくつかの例では、Ｃ_Ｈ３ドメインは免疫グロブリン由来であり得る。いくつかの場合、抗体若しくは抗原結合断片、修飾された抗体若しくは抗原結合断片、又は結合剤の鎖又は一部は、Ｉｇ由来であり得る。そのような場合、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭであり得るか、又はそれらに由来する。ＩｇがＩｇＧである場合、ＩｇはＩｇＧのサブタイプであり得、ＩｇＧのサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４を含み得る。いくつかの場合、Ｃ_Ｈ３ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来し得るか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧを含むか、又はＩｇＧに由来する。いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ１を含むか、又はＩｇＧ１に由来する。いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ４を含むか、又はＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＭを含むか、ＩｇＭに由来するか、又はＩｇＭの単量体形態である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＥを含むか、又はＩｇＥに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片はＩｇＤを含むか、又はＩｇＤに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＡを含むか、又はＩｇＡに由来する。

【0084】

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」又は「Ｋ」）又はラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。

【0085】

抗体の「可変領域」とは、単独で又は組み合わせてのいずれかで、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術がある。（１）種間配列可変性に基づくアプローチ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｐａｇｅｓ ６４７－６６９、以下「Ｋａｂａｔ」という）、及び（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－Ｉａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかのアプローチ又は両方のアプローチの組合せによって定義されるＣＤＲを指し得る。

【0086】

抗体に関して、「可変ドメイン」という用語は、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用される抗体の可変ドメインを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。むしろ、それは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方の超可変領域（ＣＤＲとしても知られる）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と呼ばれる。修飾されていない重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、主に３つのＣＤＲが散在するβシート構成を採用し、これらは接続するループ、及び場合によりβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔを参照されたい）。

【0087】

「超可変領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、抗原に相補的に結合し、Ｖ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として知られる３つの配列領域からのアミノ酸残基を含む。軽鎖可変ドメインでは、Ｋａｂａｔによれば、ＣＤＲは、典型的には、およそ残基２４～３４（ＣＤＲＬ１）、５０～５６（ＣＤＲＬ２）、及び８９～９７（ＣＤＲＬ３）に対応し、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲは、典型的には、およそ残基３１～３５（ＣＤＲＨ１）、５０～６５（ＣＤＲＨ２）、及び９５～１０２（ＣＤＲＨ３）に対応する。異なる抗体のＣＤＲは挿入を含み得るので、アミノ酸ナンバリングは異なり得ることが理解される。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、特異的残基（例えば、軽鎖におけるＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ及び２７Ｆ）に結合した文字を利用して異なる抗体間のナンバリングにおける任意の挿入を反映するナンバリングスキームを用いて、そのような挿入を説明する。あるいは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７））によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＣＤＲは、典型的には、およそ残基２６～３２（ＣＤＲＬ１）、５０～５２（ＣＤＲＬ２）、及び９１～９６（ＣＤＲＬ３）に対応し、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲは、典型的には、およそ残基２６～３２（ＣＤＲＨ１）、５３～５５（ＣＤＲＨ２）、及び９６～１０１（ＣＤＲＨ３）に対応する。

【0088】

本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」、「ＦＷ」又は「ＦＲ」は、抗原結合ポケット又は溝の一部を形成するフレームワークアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、フレームワーク残基は、抗原結合ポケット又は溝の一部であるループを形成し、ループ内のアミノ酸残基は抗原と接触してもしなくてもよい。フレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲ間の領域を含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前掲書）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲは典型的にはおよそ残基０～２３（ＦＲＬ１）、３５～４９（ＦＲＬ２）、５７～８８（ＦＲＬ３）及び９８～１０９に対応し、重鎖可変ドメインでは、ＦＲは典型的にはおよそ残基０～３０（ＦＲＨ１）、３６～４９（ＦＲＨ２）、６６～９４（ＦＲＨ３）及び１０３～１３３に対応する。軽鎖のＫａｂａｔナンバリングで上述したように、重鎖も同様の様式での挿入を説明する（例えば、重鎖におけるＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。あるいは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（前掲書）によれば、軽鎖可変ドメインでは、ＦＲは、典型的には、およそ残基０～２５（ＦＲＬ１）、３３～４９（ＦＲＬ２）５３～９０（ＦＲＬ３）、及び９７～１０９（ＦＲＬ４）に対応し、重鎖可変ドメインでは、ＦＲは、典型的には、およそ残基０～２５（ＦＲＨ１）、３３～５２（ＦＲＨ２）、５６～９５（ＦＲＨ３）、及び１０２～１１３（ＦＲＨ４）に対応する。ＦＲのループアミノ酸は、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖の三次元構造の検査によって評価及び決定することができる。三次元構造は、そのような位置がループを形成し、及び／又は抗体可変ドメイン内で抗原接触を提供する可能性が高いため、溶媒にアクセス可能なアミノ酸位置について分析することができる。溶媒に接近可能な位置のいくつかは、アミノ酸配列の多様性に耐えることができ、他の位置（例えば、構造位置）は、一般に、あまり多様ではない。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造又はタンパク質モデリングに由来し得る。

【0089】

本開示においては、必要に応じて、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）、重鎖第１の相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２の相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３の相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、軽鎖第１の相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２の相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、及び軽鎖第３の相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）の略語（括弧内）を、慣用に従って使用する。

【0090】

「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域又はバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスのナンバリングである。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む。

【0091】

本開示で有用な「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、移植抗体、脱免疫化抗体、それらの変異体、それらの融合物、それらのイムノコンジュゲート、それらの抗原結合断片、及び／又は抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合修飾抗体を含む、必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含するが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法及びコンジュゲートの特定の実施形態では、抗体は、抗体とタンパク質（例えば、本明細書中に提供されるサイトカイン）との間のリンカーの結合を可能にするためにＦｃ領域を必要とする。

【0092】

いくつかの例では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る、可能な天然に存在する変異を除いて同一である。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原（エピトープ）上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。

【0093】

いくつかの例では、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び生物学的活性を有するマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られないが、抗体の性能を更に改良及び最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むであろう。抗体は、例えば、国際公開第９９／５８５７２号に記載されているように修飾Ｆｃ領域を有し得る。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に対して変化した１つ以上（１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有し、これは元の抗体由来の１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。

【0094】

必要に応じて、本明細書中に記載される抗体又は抗原結合断片を免疫原性について評価することができ、必要に応じて脱免疫化することができる（すなわち、抗体は、１つ以上のＴ細胞エピトープを変化させることによって免疫反応性が低くされる）。本明細書で使用される場合、「脱免疫化抗体」は、抗体配列中の１つ以上のＴ細胞エピトープが、対象への抗体の投与後のＴ細胞応答が、脱免疫化されていない抗体と比較して低下するように修飾されていることを意味する。本明細書に記載の抗体及び抗原結合断片に存在する免疫原性及びＴ細胞エピトープの分析は、ソフトウェア及び特異的データベースの使用を介して行うことができる。例示的なソフトウェア及びデータベースには、英国ケンブリッジのＡｎｔｉｔｏｐｅによって開発されたｉＴｏｐｅ（商標）が含まれる。ｉＴｏｐｅ（商標）は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチド結合の分析のためのインシリコ技術である。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチド結合を予測し、それにより、そのような「潜在的Ｔ細胞エピトープ」の位置についての初期スクリーニングを提供する。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と３４個のヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の結合溝内の特異的結合ポケットとの間の好ましい相互作用を予測する。重要な結合残基の位置は、試験抗体可変領域配列にまたがる１つのアミノ酸が重複する９ｍｅｒペプチドのインシリコ生成によって達成される。各９ｍｅｒペプチドを、３４個のＭＨＣクラスＩＩアロタイプのそれぞれに対して試験し、それらの潜在的な「適合」及びＭＨＣクラスＩＩ結合溝との相互作用に基づいてスコア化することができる。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の＞５０％に対して高い平均結合スコア（ｉＴｏｐｅ（商標）スコアリング関数で＞０．５５）を生じるペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープと考えられる。そのような領域では、ＭＨＣクラスＩＩ溝内のペプチド結合のためのコア９アミノ酸配列を分析して、ＭＨＣクラスＩＩポケット残基（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ９）及び可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）接触残基（Ｐ－ｌ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ８）を決定する。任意のＴ細胞エピトープの同定後、アミノ酸残基の変化、置換、付加、及び／又は欠失を導入して、同定されたＴ細胞エピトープを除去することができる。そのような変更は、同定されたエピトープを依然として除去しながら抗体の構造及び機能を保存するように行うことができる。例示的な変化には、保存的アミノ酸変化が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0095】

抗体はヒト抗体であり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／又はヒト抗体を作製するための任意の適切な技術を使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド又は少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような一例は、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。一実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリから選択され、そのファージライブラリはヒト抗体を発現する。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製することができる。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製され得る（そのようなＢリンパ球は、個体から回収され得るか、又はインビトロで免疫化され得る）。

【0096】

本明細書の抗体のいずれも二重特異性であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有し、本明細書に開示される抗体を使用して調製することができる抗体である。従来、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいており、２つの重鎖は異なる特異性を有する。二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とから構成され得る。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。

【0097】

二重特異性抗体を作製するための１つのアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であり得る。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合物の少なくとも１つに存在し得る。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の比率が等しくないと最適な収率が得られる実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率を調整する際の大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、又は比が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。

【0098】

いくつかの例では、本明細書における抗体はキメラ抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「キメラ」形態には、非ヒトＩｇに由来する最小配列を含有するキメラ抗体が含まれる。ほとんどの場合、キメラ抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部がマウスＦｃの代わりに挿入されているマウス抗体である。キメラ抗体又はハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含む合成タンパク質化学の好適な方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル－４－メルカプトブチリミダートが挙げられる。

【0099】

本明細書では、抗体及びその抗原結合断片、修飾抗体及びその抗原結合断片、並びに１つ以上の標的抗原上の１つ以上のエピトープに特異的に結合する結合剤が提供される。一例では、結合剤は、単一の抗原上のエピトープに選択的に結合する。別の例では、結合剤は二価であり、単一の抗原上の２つの異なるエピトープに選択的に結合するか、又は２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。別の例では、結合剤は多価（すなわち、三価、四価等）であり、結合剤は、単一の抗原上の３つ以上の異なるエピトープに結合するか、又は２つ以上の（複数の）抗原上の３つ以上の異なるエピトープに結合する。

【0100】

本明細書の抗体のいずれかの抗原結合断片も企図される。「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」又は「抗体の機能的断片」という用語は、本明細書では、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指すために互換的に使用される。代表的な抗原結合断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、三重特異性Ｆ（ａｂ’）_２、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、ＡＶＩＭＥＲ（登録商標）、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、マキシボディ、ラクダ状体、ＶＨＨ、ミニボディ、イントラボディ、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、一本鎖結合ポリペプチド、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－Ｆｃ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ、単一のポリペプチド鎖として産生された２つのｓｃＦｖであって、各ｓｃＦｖが、本明細書に記載のＣＤＲの組合せ又はＶＬ／ＶＬの組合せのアミノ酸配列を含む、２つのｓｃＦｖ）、四価タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ、頭－尾配置の非共有ホモダイマーフォルダ、例えばｓｃＦｖを含むＴａｎｄＡｂとして産生される抗体断片であり、ｓｃＦｖが、本明細書に記載のＣＤＲの組合せ又はＶＬ／ＶＬの組合せのアミノ酸配列を含む）、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ、安定化鎖間ジスルフィド結合によって結合された異なるｓｃＦｖ）、二重特異性抗体（ｂｓｃＡｂ、グリシン－セリンリンカーを介して連結された２つの一本鎖Ｆｖ断片）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、融合タンパク質、二重特異性ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、可撓性リンカーペプチドによって連結された２つの異なるジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片）を含む。

【0101】

２つの共有結合した抗体又は抗体の抗原結合断片を含むヘテロコンジュゲートポリペプチドも本開示の範囲内である。適切なリンカーは、結合剤を多量体化するために使用され得る。連結ペプチドの非限定的な例としては、限定されないが、（ＧＳ）_ｎ（配列番号２４）、（ＧＧＳ）_ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２６）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（配列番号２７）、又は（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（配列番号２８）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２９）が挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。例えば、連結ペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号３０）又は（ＧＧＧＧＳ）_４（配列番号３１）であり得る。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間に約３．５ｎｍ架橋する。他の配列のリンカーが設計され、使用されている。次いで、リンカーを、薬物の付着又は固体支持体への付着等の更なる機能のために修飾することができる。

【0102】

本明細書で使用される場合、「結合活性」という用語は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は任意の他の適切な技術等の方法によって決定することができる。結合活性は、スキャッチャード解析又は任意の他の適切な技術等の方法によって決定することができる。

【0103】

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、Ｋ_Ｄとして表される。本明細書における抗体又は抗原結合断片の結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、５００ｎＭ、４７５ｎＭ、４５０ｎＭ、４２５ｎＭ、４００ｎＭ、３７５ｎＭ、３５０ｎＭ、３２５ｎＭ、３００ｎＭ、２７５ｎＭ、２５０ｎＭ、２２５ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、５０ｎＭ、５０ｎＭ、４９ｎＭ、４８ｎＭ、４７ｎＭ、４６ｎＭ、４５ｎＭ、４４ｎＭ、４３ｎＭ、４２ｎＭ、４１ｎＭ、４０ｎＭ、３９ｎＭ、３８ｎＭ、３７ｎＭ、３６ｎＭ、３５ｎＭ、３４ｎＭ、３３ｎＭ、３２ｎＭ、３１ｎＭ、３０ｎＭ、２９ｎＭ、２８ｎＭ、２７ｎＭ、２６ｎＭ、２５ｎＭ、２４ｎＭ、２３ｎＭ、２２ｎＭ、２１ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９９０ｐＭ、９８０ｐＭ、９７０ｐＭ、９６０ｐＭ、９５０ｐＭ、９４０ｐＭ、９３０ｐＭ、９２０ｐＭ、９１０ｐＭ、９００ｐＭ、８９０ｐＭ、８８０ｐＭ、８７０ｐＭ、８６０ｐＭ、８５０ｐＭ、８４０ｐＭ、８３０ｐＭ、８２０ｐＭ、８１０ｐＭ、８００ｐＭ、７９０ｐＭ、７８０ｐＭ、７７０ｐＭ、７６０ｐＭ、７５０ｐＭ、７４０ｐＭ、７３０ｐＭ、７２０ｐＭ、７１０ｐＭ、７００ｐＭ、６９０ｐＭ、６８０ｐＭ、６７０ｐＭ、６６０ｐＭ、６５０ｐＭ、６４０ｐＭ、６３０ｐＭ、６２０ｐＭ、６１０ｐＭ、６００ｐＭ、５９０ｐＭ、５８０ｐＭ、５７０ｐＭ、５６０ｐＭ、５５０ｐＭ、５４０ｐＭ、５３０ｐＭ、５２０ｐＭ、５１０ｐＭ、５００ｐＭ、４９０ｐＭ、４８０ｐＭ、４７０ｐＭ、４６０ｐＭ、４５０ｐＭ、４４０ｐＭ、４３０ｐＭ、４２０ｐＭ、４１０ｐＭ、４００ｐＭ、３９０ｐＭ、３８０ｐＭ、３７０ｐＭ、３６０ｐＭ、３５０ｐＭ、３４０ｐＭ、３３０ｐＭ、３２０ｐＭ、３１０ｐＭ、３００ｐＭ、２９０ｐＭ、２８０ｐＭ、２７０ｐＭ、２６０ｐＭ、２５０ｐＭ、２４０ｐＭ、２３０ｐＭ、２２０ｐＭ、２１０ｐＭ、２００ｐＭ、１９０ｐＭ、１８０ｐＭ、１７０ｐＭ未満、又はそれらの間の任意の整数であり得る。結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）バイオセンサ、シンチレーション近接アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光移動、酵母ディスプレイ、又はそれらの任意の組合せを使用して決定することができる。結合親和性はまた、適切なバイオアッセイを使用してスクリーニングされ得る。

【0104】

本明細書で使用される場合、「結合活性」という用語は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている任意の他の技術等の方法によって決定することができる。結合活性は、スキャッチャード分析又は当業者によく知られている任意の他の技術等の方法によって決定することができる。

【0105】

親和性成熟抗体も本明細書で提供される。抗体の親和性を調整するため、及びＣＤＲを特徴付けるために、以下の方法を使用することができる。抗体のＣＤＲを特徴付ける、及び／又は抗体等のポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば改善する）１つの方法は、「ライブラリ走査変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリ走査変異誘発は以下のように働く。ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸位置は、２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）アミノ酸で置換される。これにより、それぞれが２つ以上のメンバの複雑さを有する（いくつかの実施形態では、分析されるアミノ酸位置ごとに１つ）クローンの小さなライブラリが生成される（２つ以上のアミノ酸が全ての位置で置換される場合）。一般に、ライブラリは、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリからの少数のクローン、例えば（ライブラリの複雑さに応じて）約２０～８０個のクローンを、標的ポリペプチド（又は他の結合標的）に対する結合特異性又は結合親和性についてスクリーニングすることができ、結合が増加した、同じ、減少した、又は結合がない候補が同定される。結合親和性は、約２倍以上の結合親和性の差を検出するＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用して決定され得る。

【0106】

いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、二重特異性又は多重特異性であり、２つ以上の抗原に特異的に結合することができる。場合によっては、そのような二重特異性又は多重特異性抗体又は抗原結合断片は、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合することができる。いくつかの場合、二重特異性抗体又は抗原結合断片は、二価の抗体又は抗原結合断片であり得る。いくつかの場合、多重特異性抗体又は抗原結合断片は、二価抗体又は抗原結合断片、三価抗体又は抗原結合断片、又は四価抗体又は抗原結合断片であり得る。

【0107】

本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、単離、精製、組換え、又は合成することができる。

【0108】

本明細書中に記載される抗体は、任意の好適な方法によって作製され得る。抗体は、特に高レベル発現ベクターを利用する場合、大量に産生され得ることが多い。

【0109】

一実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、本明細書に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との組合せを含む。別の実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、本明細書に記載の相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３）の組合せを含む。一実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、修飾Ｍｏｄｉｆｉｅｄ アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、４５１２３８、ＫＸＧ２ＰＪ５５１Ｉ、ＭＳＢ－００１０６８２、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＰＦ－０６８３４６３５、ＣＡＳ １５３７０３２－８２－８：ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）、Ｐｆｉｚｅｒ）、デュルバルマブ（イミフィンジ、２８Ｘ２８Ｘ９ＯＫＶ（ＵＮＩＩ ｃｏｄｅ）、ＭＥＤＩ－４７３６、ＣＡＳ １４２８９３５－６０－７：ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｃｅｌｇｅｎｅ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ＣＨＬＡ）、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍｉｒａｔｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）、Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＭＣ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、５２ＣＭＩ０ＷＣ３Ｙ、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＲＧ－７４４６、ＲＯ－５５４１２６７、ＣＡＳ １３８０７２３－４４－３：Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｍｅｄｉｓｃｈ Ｃｅｎｔｒｕｍ（ＡＭＣ）、Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、ＥＯＲＴＣ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）、Ｒｏｃｈｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、Ｓｕｇｅｍａｌｉｍａｂ（ＣＳ－１００１、ＷＢＰ－３１５５：ＣＳｔｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＥＱＲｘ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＫＮ－０４６（ＣＡＳ ２２５６０８４－０３－２：Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｌｐｈａｍａｂ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｉｎｏｖｅｎｔ）、ＡＰＬ－５０２（ＣＢＴ－５０２、ＴＱＢ－２４５０：Ａｐｏｌｌｏｍｉｃｓ、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、エンバホリマブ（３Ｄ－０２５、ＡＳＣ－２２、ＫＮ－０３５、ｈｕ５６Ｖ１－Ｆｃ－ｍ１、ＣＡＳ ２１０２１９２－６８－５：３Ｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、Ａｓｃｌｅｔｉｓ、Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｌｐｈａｍａｂ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｕｚｈｏｕ Ａｌｐｈａｍａｂ、Ｔｒａｃｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、ビントラフスα（Ｍ－７８２４、ＭＳＢ－００１１３５９Ｃ、ＮＷ９Ｋ８Ｃ１ＪＮ３、ＣＡＳ １９１８１４９－０１－５：ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））、ＳＴＩ－１０１４（ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＺＫＡＢ－００１：Ｌｅｅ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ（ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ）、Ａ－１６７（ＨＢＭ－９１６７、ＫＬ－Ａ１６７：Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ、Ｓｉｃｈｕａｎ Ｋｅｌｕｎ－Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＩＭＣ－００１（ＳＴＩ－３０３１、ＳＴＩ－Ａ－１０１５、ＳＴＩ－Ａ１０１５、ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＨＴＩ－１０８８（ＳＨＲ－１３１６：Ａｔｒｉｄｉａ、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＩＯ－１０３（ＩＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＸ－０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＵＰＭ－１７０（ＣＡ－１７０：Ａｕｒｉｇｅｎｅ、Ｃｕｒｉｓ）、ＧＳ－４２２４（Ｇｉｌｅａｄ）、ＮＤ－０２１（ＮＭ２１－１４８０、ＰＲＯ－１４８０：ＣＳｔｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｎｕｍａｂ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＢＮＴ－３１１（ＤｕｏＢｏｄｙ－ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ、ＧＥＮ－１０４６：ＢｉｏＮＴｅｃｈ、Ｇｅｎｍａｂ）、ＢＧＢ－Ａ３３３（ＢｅｉＧｅｎｅ）、ＩＢＩ－３２２（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＮＭ－０１（Ｎａｎｏｍａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ＬＹ－３４３４１７２（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＤＰ（Ｄｒａｇｏｎｂｏａｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＤＸ－５２７（Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＩＢＩ－３１８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｌｉｌｌｙ）、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＲＥＧＮ３５０４（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＡＬＰＮ－２０２（ＣＤ８０ ｖＩｇＤ－Ｆｃ：Ａｌｐｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＮＣＢ－０８６５５０（Ｉｎｃｙｔｅ）、ＬＹ－３４１５２４４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＨＲ－１７０１（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＪＳ－００３（ＪＳ００３－３０、ＪＳ００３－ＳＤ：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＬＸ－２０（ＰＬ２＃３：Ｈｅｎｌｉｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｌｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＳ－１０１（ＩＮＢＲＸ－１０５、ＩＮＢＲＸ－１０５－１：Ｅｌｐｉｓｃｉｅｎｃｅ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ｉｎｈｉｂｒｘ）、ＭＳＢ－２３１１（ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ－２７９２５２、ＴＡＫ－２５２：Ｈｅａｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｈａｔｔｕｃｋ Ｌａｂｓ、Ｔａｋｅｄａ）、ＦＳ－１１８、ＦＳ１１８ ｍＡｂ２、ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ２：Ｆ－ｓｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ＦＡＺ－０５３（ＬＡＥ－００５：Ｌａｅｋｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｌｏｄａｐｏｌｉｍａｂ（ＬＹ－３３０００５４、ＮＲ４ＭＡＤ６ＰＰＢ、ＣＡＳ ２１１８３４９－３１－６：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＭＣＬＡ－１４５（Ｉｎｃｙｔｅ、Ｍｅｒｕｓ）、ＢＭＳ－１８９（ＢＭＳ－９８６１８９、ＰＤ－Ｌ１－Ｍｉｌｌａ ｆｒｏｍ Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｃｏｓｉｂｅｌｉｍａｂ（ＣＫ－３０１、ＴＧ－１５０１、ＣＡＳ ２２１６７５１－２６－５：Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓａｍｓｕｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＩＬ－１５Ｒａｌｐｈａ－ＳＤ／ＩＬ－１５（ＫＤ－０３３：Ｋａｄｍｏｎ）、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ ８５７０６４－３８－１：Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５：Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．）、ＢＭＳ－９８６１９２（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＣ－９８（ＲｅｍｅＧｅｎ）、ＣＤ－２００ＡＲ－Ｌ（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ：ＯＸ２ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、ＡＴＡ－３２７１（Ａｔａｒａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＩＢＣ－Ａｂ００２（ＩｍｍｕｎｏＢｒａｉｎ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）、ＢＭＸ－１０１（Ｂｉｏｍｕｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＶＡ－０４－ＶｂＰ（Ａｖａｃｔａ）、ＡＣＥ－１７０８（Ａｃｅｐｏｄｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＫＹ－１０４３（Ｋｙｍａｂ、Ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＣＥ－０５（ＹＢＬ－０１３：Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＯＮＣ－００５５（ＯＮＣ００５５、ＰＲＳ－３４４ Ｓ－０９５０１２：Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｅｒｖｉｅｒ）、ＴＬＪ－１－ＣＫ（Ｉ－Ｍａｂ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＧＲ－１４０５（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ１ＡＣＲ－Ｔ（Ｔａｉｐｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｎ－８０９（Ｎ－ＩＬ１５／ＰＤＬ１：ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ）、ＣＢ－２０１（Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＭＥＤＩ－１１０９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＡＶＡ－００４（ＡＶＡ－０４：Ａｖａｃｔａ）、ＣＡ－３２７（Ａｕｒｉｇｅｎｅ、Ｃｕｒｉｓ）、ＡＬＮ－ＰＤＬ（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＫＹ－１００３（Ｋｙｍａｂ）、ＣＤ２２（ａＰＤ－Ｌ１）ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＳＬ－２２Ｐ：Ｈｅｂｅｉ Ｓｅｎｌａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＴＡ－２２７１（Ｍ２８ｚ１ＸＸＰＤ１ＤＮＲ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ａｔａｒａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、及びＺｅｕｓｈｉｅｌｄ細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｓｅｃｏｎｄ Ｘｉａｎｇｙａ Ｈｏｓｐ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖ．）を含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、スゲマリマブ、サザンリマブ、エンバホリマブ、ロダポリマブ、若しくはコシベリマブ、又はそれらの修飾バージョンである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、スゲマリマブ、サザンリマブ、エンバホリマブ、ロダポリマブ又はコシベリマブである。

【0111】

示された抗体と同じアミノ酸配列を共有する本明細書中で命名された抗体の一般的又はバイオシミラーバージョンもまた、抗体の名称が使用されるときに包含されることが企図される。いくつかの実施形態では、抗体は、アベルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、スゲマリマブ、サザンリマブ、エンバホリマブ、ロダポリマブ、又はコシベリマブのバイオシミラーである。

【0112】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドをｍＡＢ３で修飾する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドをｍＡＢ４で修飾する。

【0113】

表１は、抗ＰＤ－Ｌ１イムノコンジュゲートを調製するために修飾され得る例示的な抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片の配列を提供する。表１はまた、修飾抗ＰＤ－Ｌ１イムノコンジュゲートにおいて利用され得るＣＤＲの例示的な組合せを提供する。本明細書における抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドへの言及は、代替的に、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片を指し得る。

【0114】

【表2-1】

【0115】

【表2-2】

【0116】

【表2-3】

【0117】

【表2-4】

【0118】

【表2-5】

【0119】

【表2-6】

【0120】

【表2-7】

【0121】

【表2-8】

【0122】

抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６又は４８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨを含む。抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７又は４９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４３のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。別の例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。

【0123】

一例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド又は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合断片は、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＨＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＨＲ２、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＨＲ３、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＨＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＨＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＨＲ３を含む。

【0124】

一例では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列を有する単一ドメインコンジュゲート抗体、配列番号５７のアミノ酸配列を有する三重特異的融合一本鎖抗体構築物、又は配列番号５８のアミノ酸配列を有する二重特異性四量体抗体様エンゲージャを含む。

【0125】

抗ＨＥＲ２抗体も本明細書で提供される。抗ＨＥＲ２抗体は、本明細書において提供するＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ、Ｈｅｒｃｌｏｎ、ＲＧ５９７、ＲＯ４５２３１７）である。トラスツズマブは以下のＶＨ配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５９）トラスツズマブのＶＬ配列は、以下の配列である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６０）

【0126】

Ｆｃ領域への修飾
抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドであって、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域が少なくとも１つの共有結合した化学的リンカーを含む、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、アスパラギン、グルタミン、システイン又はリジン残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、リジン又はシステイン残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、リジン残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの定常領域に共有結合される。

【0127】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、又はＩｇＥ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域又はＩｇＤ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はヒト化されている。Ｆｃ領域。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域である。いくつかの例では、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。いくつかの例では、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。

【0128】

抗体又は抗原結合断片のＦｃ媒介エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体機能を低下させるために、１つ以上の変異をＦｃ領域に導入することができる。いくつかの例では、修飾Ｆｃは、Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ変異を含有するヒト化ＩｇＧ４カッパアイソタイプを含む。いくつかの例では、修飾Ｆｃは、重鎖ＣＨ２ドメインが、例えば、（ａ）Ｌ２３８Ｐ、Ｌ２３９Ｅ及びＰ３３５Ｓ、又は（２）Ｋ２４８、Ｋ２８８、及びＫ３１７等の三重変異で操作されているヒトＩｇＧ１κを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１０５（Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ１ Ｇｌｕ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇｌｕ Ｘａａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｘａａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ（式中、Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る））に示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。

【0130】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１０５中のシステインを含有しない位置にシステイン残基を組み込むこと等によって、Ｆｃ領域を特定の残基での修飾又はコンジュゲーションに感受性にする１つ以上の変異を含む。あるいは、Ｆｃ領域は、コンジュゲーションハンドルを含む修飾天然アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えばリンカーを介して修飾天然アミノ酸又は非天然アミノ酸に連結されたものを組み込むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、更なるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７又はＩＬ－１８ポリペプチド）へのリンカーの結合を促進する変異を含まない。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５に示される天然残基に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の天然リジン残基に結合される。

【0131】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域の１つのアミノ酸残基に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、Ｆｃ領域の非末端残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、非末端残基は、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３領域にある。いくつかの実施形態では、非末端残基は、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＣＨ２領域にある。

【0132】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の１０位～９０位のいずれか１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、１０～１２０、１０～１３０、１０～１４０、１０～１５０、１０～１６０、１０～１７０、１０～１８０、１０～１９０、又は１０～２００位のいずれか１つのアミノ酸残基においてＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の２０～４０位、６５～８５位、又は９０～１１０位のいずれか１つのアミノ酸残基においてＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の１０～３０位、５０～７０位、又は８０～１００位のいずれか１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の２５～３５位、７０～８０位、又は９５～１０５位のいずれか１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の１５～２６位、５５～６５位、又は８５～９０位のうちの１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の３０、３２、７２、７４、７９又は１０１位のいずれか１つの位置のアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の位置Ｋ３０、Ｋ３２、Ｋ７２、Ｋ７４、Ｑ７９、又はＫ１０１のいずれか１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５の位置Ｋ３０、Ｋ３２、Ｋ７２、Ｋ７４、又はＫ１０１のいずれか１つのアミノ酸残基でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基３０でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基３２でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基７２でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基７４でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基７９でＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１０５のアミノ酸残基１０１でＦｃ領域に結合される。

【0133】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ポリペプチドの機能が維持されるように（例えば、ポリペプチドを変性させずに）、癌又は炎症関連抗原（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）に選択的に結合するポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合される。例えば、ポリペプチドがヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）等の抗体である場合、グルタミン残基が露出した露出リジン残基と、チロシン残基が露出した露出リジン残基は、以下の位置に存在する（ウェブサイトｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌをＥＵナンバリングで参照）。例示的な露出リジン残基：ＣＨ２ドメイン（位置２４６、位置２４８、位置２７４、位置２８８、位置２９０、位置３１７、位置３２０、位置３２２、及び位置３３８）ＣＨ３ドメイン（位置３６０、位置４１４、及び位置４３９）。例示的な露出グルタミン残基：ＣＨ２ドメイン（位置２９５）。例示的な露出チロシン残基：ＣＨ２ドメイン（位置２７８、位置２９６、及び位置３００）ＣＨ３ドメイン（位置４３６）。

【0134】

ヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１はまた、後の修飾のために理想的に表面露出される残基を提供するために、上に列挙した位置のいずれか１つでリジン、グルタミン又はチロシン残基で修飾されてもよい。

【0135】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の定常領域中のアミノ酸残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３領域のアミノ酸残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＣＨ２領域中のアミノ酸残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ヒトＩｇＧ ＦｃにおけるＥＵナンバリングに従う残基：アミノ酸残基１～４７８、アミノ酸残基２～４７８、アミノ酸残基１～４７７、アミノ酸残基２～４７７、アミノ酸残基１０～４６７、アミノ酸残基３０～４４７、アミノ酸残基５０～４２７、アミノ酸残基１００～３７７、アミノ酸残基１５０～３２７、アミノ酸残基２００～３２７、アミノ酸残基２４０～３２７及びアミノ酸残基２４０～３２０の群から選択される１つの残基に共有結合され得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の１つのリジン又はグルタミン残基に共有結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域のＬｙｓ２４６に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域のＬｙｓ２４８に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域のＬｙｓ２８８に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域のＬｙｓ２９０に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗体ポリペプチドのＦｃ領域のＧｌｎ２９５に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＬｙｓ３１７に共有結合しており、アミノ酸残基の位置番号は、Ｅｕナンバリングに基づく。

【0137】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、アミノ酸残基のサブセットから選択されるアミノ酸残基に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、サブセットは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域の２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域の２つのリジン残基のうちの１つに共有結合し得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのＦｃ領域に共有結合した２つのリンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つのリンカーの各々は、抗ＰＤ１ポリペプチドの異なる重鎖に共有結合される。いくつかの実施形態では、２つのリンカーの各々は、同じ残基位置で抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの異なる重鎖に共有結合される。いくつかの実施形態では、２つのリンカーの各々は、異なる残基位置で抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの異なる重鎖に共有結合される。２つのリンカーが異なる残基位置に共有結合される場合、本明細書で提供される残基位置の任意の組合せを組み合わせて使用することができる。

【0139】

いくつかの実施形態では、第１の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第１のＦｃ領域のＬｙｓ２４８に共有結合しており、第２の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第２のＦｃ領域のＬｙｓ２８８に共有結合しており、残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、第１の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第１のＦｃ領域のＬｙｓ２４６に共有結合しており、第２の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第２のＦｃ領域のＬｙｓ２８８に共有結合しており、残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、第１の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第１のＦｃ領域のＬｙｓ２４８に共有結合しており、第２の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第２のＦｃ領域のＬｙｓ３１７に共有結合しており、残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、第１の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第１のＦｃ領域のＬｙｓ２４６に共有結合しており、第２の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第２のＦｃ領域のＬｙｓ３１７に共有結合しており、残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。いくつかの実施形態では、第１の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第１のＦｃ領域のＬｙｓ２８８に共有結合しており、第２の化学的リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの第２のＦｃ領域のＬｙｓ３１７に共有結合しており、残基の位置番号はＥｕナンバリングに基づく。

【0140】

Ｆｃ領域の修飾方法
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に選択的に結合するポリペプチドの修飾Ｆｃ領域を調製する方法、例えば、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドへの、リンカー、コンジュゲーションハンドル又はサイトカインの付着のための方法も本明細書で提供される。ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又は他のポリペプチドのＦｃ領域の部位特異的修飾のための様々な方法が当技術分野で公知である。

【0141】

リンカーを抗体に部位特異的に付着させるように構成された親和性ペプチドによる修飾
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、リンカー、コンジュゲーションハンドル、又はそれらの組合せを組み込むように修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、Ｆｃ領域を、リンカー又は他の基をＦｃ領域に、例えばＦｃ領域の特定の残基において結合させるように構成されたペイロードを有する親和性ペプチドと接触させることによって行われる。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆｃ領域の残基と結合を形成する反応性基（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用して結合される。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、リンカー又は他の基がＦｃ領域に結合した後、親和性ペプチドを除去して、Ｆｃ領域に結合した所望のリンカー又は他の基のみを残すことができるように、親和性ペプチド上に構成される。次いで、リンカー又は他の基を更に使用して、サイトカイン又はサイトカインに結合したリンカー等の更なる基をＦｃ領域に付加することができる。

【0142】

そのような親和性ペプチドの非限定的な例は、少なくともＰＣＴ公開番号国際公開第２０１８１９９３３７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８８号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８７号及びＰＣＴ公開番号国際公開第２０２００９０９７９号に見出すことができ、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に記載されているかのように参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドは、リンカー／コンジュゲーションハンドルペイロードに抗体のＦｃ領域の１つ以上の特異的残基を送達するように修飾されたペプチドである。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドは、（１）ＱＥＴＮＰＴＥＮＬＹＦＱＱＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＤＣ（配列番号１０６）、（２）ＱＴＡＤＮＱＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＱＱＬＮＤＡＱＡＰＱＡ（配列番号１０７）、（３）ＱＥＴＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＤＣ（配列番号１０８）、（４）ＱＥＴＦＮＫＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＤＣ（配列番号１０９）、（５）ＱＥＴＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＫＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＤＣ（配列番号１１０）、（６）ＱＥＴＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１１１）、（７）ＱＥＴＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１１２）、（８）ＱＥＴＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１１３）、（９）ＱＥＴＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１１４）、（１０）ＱＥＴＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号１１５）、及び（１１５）ＱＥＴＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１１６）、又はＮ末端が１、２、３、４、若しくは５残基切断されている対応するペプチドの中から選択されるペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。本明細書で提供される抗体の残基Ｋ２４８にペイロードを結合させることができる切断可能なリンカー及びコンジュゲーションハンドルペイロードを有する例示的な親和性ペプチドを以下に示す（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１，１８，１１，４０５８－４０６６に報告されるように）。

【0143】

【化3】

【0144】

Ｆｃ領域の別の残基を標的とする別の親和性ペプチドは、ＡＪＩＣＡＰ（商標）技術について上に引用した参考文献に記載されており、そのような親和性ペプチドを使用して、所望の官能性をＦｃ領域の別の残基に結合させることができる（例えば、Ｋ２４６、Ｋ２８８等）。例えば、上記の親和性ペプチドのジスルフィド基を代わりにチオエステルで置換して、連結基の切断可能な部分としてスルフヒドリル保護基を提供することができる（例えば、親和性ペプチドの関連部分は、以下の構造

【0145】

【化4】

又は以下に記載される切断可能なリンカーの別のものを有するであろう）。

【0146】

本開示の親和性ペプチドは、切断可能なリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドの切断可能なリンカーは、親和性ペプチドを、Ｆｃ領域に結合することになる基に接続し、リンカー又はコンジュゲーションハンドルを含む基が結合した後にペプチドが切断され得るように構成される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは二価の基である。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、チオエステル基、エステル基、スルファン基、メタンイミン基、オキシビニル基、チオプロパノアート基、エタン－１，２－ジオール基、（イミダゾール－１－イル）メタン－１－オン基、セレノエーテル基、シリルエーテル基、ジオキシシラン基、エーテル基、ジオキシメタン基、テトラオキソスピロ［５．５］ウンデカン基、アセトアミドエチルホスホラミダイト基、ビス（メチルチオ）－ピラゾロピラゾール－ジオン基、２－オキソ－２－フェニルエチルホルメート基、４－オキシベンジルカルバマート基、２－（４－ヒドロキシ－オキシフェニル）ジアジニル）安息香酸基、４－アミノ－２－（２－アミノ－２－オキソエチル）－４－オキソブタ－２－エン酸基、２－（２－メチレンヒドラジニル）ピリジン基、Ｎ’－メチレンホルモヒドラジド基、又はイソプロピルカルバマート基であり、そのいずれもが非置換であるか、又は置換されている。親和性ペプチドに対する切断可能なリンカーの組成及び結合点、並びに関連する使用方法は、少なくとも、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１８１９９３３７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８８号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８７号及びＰＣＴ公開番号国際公開第２０２００９０９７９号に記載されている。

【0147】

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、以下：

【0148】

【化5】

の式であって、
式中、
－ Ａ又はＢの一方はリンカーとの結合点であり、Ａ又はＢの他方は親和性ペプチドとの結合点であり、
－ 各Ｒ^２ａは、独立して、Ｈ又は場合により置換されていてもよいアルキルであり、
－ 各Ｒ^２ｂは、独立して、Ｈ又は場合により置換されていてもよいアルキルであり、
－ Ｒ^２ｃは、Ｈ又は場合により置換されていてもよいアルキルであり、
－Ｊは、メチレン、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＯ原子であり、
－ ｒは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である、式である。

【0149】

親和性ペプチドは、Ｆｃ領域へのリンカー／コンジュゲーションハンドルの共有結合を可能にするように構成された反応性基を含む。いくつかの実施形態では、反応性基は、リンカーの結合を促進するために組み込まれたＦｃ領域のリジン残基、チロシン残基、セリン残基、システイン残基、又は非天然アミノ酸残基等の特定のアミノ酸残基の官能基に対して選択的である。反応性基は、リジンとの反応のための活性化エステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル又はその誘導体、ペンタフルオロフェニルエステル等が挙げられる）又はシステインとの反応のためのスルフヒドリル反応性基（例えば、α－β不飽和カルボニル又はマレイミド等のＭｉｃｈａｅｌ受容体）等の任意の適切な官能基であり得る。いくつかの実施形態では、反応性基は以下：

【0150】

【化6】

の式であって、
式中、
－ 各Ｒ_５ａ、Ｒ_５ｂ、及びＲ_５ｃは、独立して、Ｈ、ハロゲン、又は場合により置換されていてもよいアルキルであり、
－ 各ｊは、１、２、３、４、又は５であり、
－ 各ｋは、１、２、３、４、又は５である、式である。

【0151】

いくつかの実施形態では、親和性ペプチドは、切断可能なリンカーの切断時に反応性部分が露出するように、反応性部分を所望のアミノ酸残基に送達するために使用される。非限定的な例として、反応性基は、親和性ペプチドとＦｃ領域との間の相互作用により抗ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドのＦｃ領域の所望の残基と共有結合を形成する。この共有結合形成に続いて、切断可能なリンカーは、反応性部分を明らかにするために適切な条件下で切断される（例えば、切断可能なリンカーがチオエステルを含む場合、切断可能なリンカーの切断後に遊離スルフヒドリル基がＦｃ領域に結合する）。次いで、この新しい反応性部分を使用して、その後、スルフヒドリル反応性基（例えば、α－ハロゲン化カルボニル基、α－β不飽和カルボニル基、マレイミド基等）につながれたコンジュゲーションハンドルを含む試薬によって、コンジュゲーションハンドル等の追加の部分を加えることができる。

【0152】

いくつかの実施形態では、親和性ペプチドを使用して、遊離スルフヒドリル基をＦｃ領域のリジンに送達する。いくつかの実施形態では、次いで、遊離スルフヒドリル基を二官能性連結試薬と反応させて、新しいコンジュゲーションハンドルをＦｃ領域に結合させる。いくつかの実施形態では、次いで、新しいコンジュゲーションハンドルを使用して、結合したサイトカインに対するリンカーを形成する。いくつかの実施形態では、新しいコンジュゲーションハンドルは、アルキン官能基である。いくつかの実施形態では、新しいコンジュゲーションハンドルは、ＤＢＣＯ官能基である。

【0153】

この目的に有用な例示的な二官能性連結試薬は、式Ａ－Ｂ－Ｃのものであり、式中、Ａはスルフヒドリル反応性コンジュゲーションハンドル（例えば、マレイミド、α、β－不飽和カルボニル、ａ－ハロゲン化カルボニル）であり、Ｂは連結基（ｌｉｎｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）であり、Ｃは新しいコンジュゲーションハンドル（例えば、ＤＢＣＯ等のアルキン）である。二官能性連結試薬の具体的な非限定的な例としては、以下：

【0154】

【化7】

の式であって、式中、各ｎは独立して１～６の整数であり、各ｍは独立して１～３０の整数である、式及び関連分子（例えば、異性体）を含む。

【0155】

あるいは、親和性ペプチドは、反応性基とＦｃ領域の残基との間の共有結合形成直後に（リンカー基等によって）コンジュゲーションハンドルがＦｃ領域に付加されるように構成することができる。そのような場合、親和性ペプチドが切断され、コンジュゲーションハンドルは、ＩＬ－２ポリペプチド（又は他のサイトカイン）へのその後のコンジュゲーションの準備が直ちに整う。
別の結合方法（例えば、酵素媒介）
抗体のＦｃ領域の親和性ペプチド媒介修飾は、Ｆｃ領域を部位特異的に修飾するために使用することができる他の方法を超える多くの利点（例えば、使いやすさ、多くの異なる抗体コンジュゲートを迅速に生成する能力、時間のかかるタンパク質操作を行う必要なしに多くの「既製の」市販の抗体を使用する能力等である）を有するが、修飾を行う他の方法も本開示の範囲内であると考えられる。

【0156】

いくつかの実施形態では、本開示は、一般に、以下を含むトランスグルタミナーゼ媒介部位特異的抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する：１）グルタミン含有タグ、内因性グルタミン（例えば、操作を伴わない天然グルタミン、例えば、可変ドメイン中のグルタミン、ＣＤＲ等）、及び／又は抗体操作又は操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミン、及び２）アミンドナー単位、リンカー及び薬剤部分を含むアミンドナー剤。そのようなトランスグルタミナーゼ媒介部位特異的修飾の非限定的な例は、少なくとも国際公開第２０２０１８８０６１号、米国特許第２０２２１３３９０４号、米国特許第２０１９１９４６４１号、米国特許第２０２１１２８７４３号、米国特許第９７６４０３８号、米国特許第１０６７５３５９号、米国特許第９７１７８０３号、米国特許第１０４３４１８０号、米国特許第９４２７４７８号の刊行物に見出すことができ、それらは、それらの全体が本明細書に記載されているかのように参照により組み込まれる。

【0157】

別の態様では、本開示は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド－Ｔ－Ａ）を含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、ここで、Ｔは特定の部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー剤であり、アミンドナー剤は、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、又は別の部位でアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートされており、アシルドナーグルタミン含有タグはアミノ酸配列ＸＸＱＸを含み、Ｘは任意のアミノ酸（例えば、Ｘは同じ又は異なるアミノ酸であり得る）であり、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは位置２９５でのグルタミンからアスパラギンへのアミノ酸置換（Ｑ２９５Ｎ、ＥＵナンバリングスキーム）を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、アシルドナーグルタミン含有タグは、ポリペプチド又はＦｃ含有ポリペプチド中の反応性Ｌｙｓ（例えば、アシルドナー及びトランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナーとして共有結合を形成する能力）に空間的に隣接していない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はＦｃ含有ポリペプチドは、同じ位置の野生型ポリペプチドと比較して、カルボキシル末端の最後のアミノ酸位置にアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、変異、又はそれらの任意の組合せであり得る。

【0159】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドコンジュゲートは、完全長抗体重鎖及び抗体軽鎖を含み、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖、軽鎖、又は重鎖と軽鎖の両方のカルボキシル末端に位置する。

【0160】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドコンジュゲートは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディ、又は抗体断片である抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧである。

【0161】

別の態様では、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド－Ｔ－Ａ）を含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法であって、ここで、Ｔは特定の部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー剤であり、アミンドナー剤は、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、又は別の部位でアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートされており、アシルドナーグルタミン含有タグはアミノ酸配列ＸＸＱＸを含み、Ｘは任意のアミノ酸（例えば、Ｘは同じ又は異なるアミノ酸であり得る）であり、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは位置２９５（Ｑ２９５Ｎ、ＥＵナンバリングスキーム）でのグルタミンからアスパラギンへのアミノ酸置換を含み、ａ）Ｆｃ含有ポリペプチドとアシルドナーグルタミン含有タグとを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）－Ｔ分子を提供する工程と、ｂ）トランスグルタミナーゼの存在下で、アミンドナー剤を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）－Ｔ分子と接触させる工程と、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）－Ｔをアミンドナー剤に共有結合させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成する工程と、を含む方法が本明細書に記載される。

【0162】

別の態様では、式：ポリペプチド－Ｔ－Ａを含む操作されたポリペプチドコンジュゲートを調製する方法であって、式中、Ｔは特定の部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー剤であり、アミンドナー剤はポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、又は別の部位でアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートされ、アシルドナーグルタミン含有タグはアミノ酸配列ＬＬＱＧＰＸ（配列番号１０３）を含み、ＸはＡ又はＰ、又はＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号１０４）であり、ａ）ポリペプチドとアシルドナーグルタミン含有タグとを含む操作されたポリペプチド－Ｔ分子を提供する工程と、ｂ）トランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナー剤を操作されたポリペプチド－Ｔ分子と接触させる工程と、ｃ）操作されたポリペプチド－Ｔをアミンドナー剤に共有結合させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成する工程と、を含む方法が本明細書に記載される。

【0163】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、又は操作された抗体コンジュゲート）は、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、又は操作された抗体コンジュゲート）及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0164】

いくつかの実施形態では、目的の部分（Ｚ）を抗体にコンジュゲートさせる方法であって、（ａ）カップリング酵素、例えばトランスアミダーゼの存在下で連結試薬（リンカー）と反応性である（例えば、定常領域の一次配列内）少なくとも１つの受容体アミノ酸残基（例えば、天然に存在するアミノ酸）を有する抗体を提供する工程と、（ｂ）当該抗体を、受容体アミノ酸残基と連結試薬（Ｒ部分以外）との間に共有結合を形成させることができる酵素の存在下、連結試薬を介して反応性基（Ｒ）に（共有結合的に）連結された受容体アミノ酸残基を含む抗体を得るのに十分な条件下で、反応性基（Ｒ）、場合により保護された反応性基又は場合により保護されていない反応性基を含む連結試薬（例えば、第１級アミンを含むリンカー）と反応させる工程と、を含む方法が本明細書に記載される。場合により、抗体又は抗体断片の当該受容体残基は、＋２位で非アスパラギン酸残基に隣接している。場合により、＋２位の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非負電荷アミノ酸（アスパラギン酸又はグルタミン酸以外のアミノ酸）である。場合により、受容体グルタミンは、抗体重鎖のＦｃドメイン中にあり、場合によりＣＨ２ドメインの更に内部にある。場合により、抗体は、重鎖Ｎ２９７結合グリコシル化を含まない。場合により、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位の残基は抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックスナンバリング）の残基である。

【0165】

一態様では、目的の部分（Ｚ）を抗体にコンジュゲートする方法であって、（ａ）少なくとも１つの受容体グルタミン残基を有する抗体を提供する工程と、（ｂ）当該リンカーを介して反応性基（Ｒ）に（共有結合的に）連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るのに十分な条件下で、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）の存在下で、反応性基（Ｒ）、好ましくは保護された反応性基を含む第１級アミン（リジン系リンカー）を含むリンカーと当該抗体を反応させる工程と、を含む方法が本明細書に記載される。場合により、抗体又は抗体断片の当該受容体グルタミン残基は、＋２位で非アスパラギン酸残基に隣接している。場合により、＋２位の残基は非アスパラギン酸残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非アスパラギン酸、非グルタミン残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非アスパラギン酸、非アスパラギン残基である。一実施形態では、＋２位の残基は、非負電荷アミノ酸（アスパラギン酸又はグルタミン酸以外のアミノ酸）である。場合により、受容体グルタミンは、抗体重鎖のＦｃドメイン中にあり、場合によりＣＨ２ドメインの更に内部にある。場合により、抗体は、重鎖Ｎ２９７結合グリコシル化を含まない。場合により、受容体グルタミンは位置２９５にあり、＋２位の残基は抗体重鎖の位置２９７（ＥＵインデックスナンバリング）の残基である。

【0166】

第１級アミン（リジン系リンカー）を含むリンカーを介して反応性基（Ｒ）に連結された受容体残基又は受容体グルタミン残基を含む抗体を、その後、目的の部分（Ｚ）を含む反応パートナと反応させて、リンカーを介して目的の部分（Ｚ）に連結された受容体残基又は受容体グルタミン残基を含む抗体を生成することができる。したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｃ）：（ｉ）場合により固体支持体上に固定化された、第１級アミン（リジン系リンカー）を含むリンカーを介して反応性基（Ｒ）に連結された受容体グルタミンを含む工程ｂ）の抗体を、（ｉｉ）目的の部分（Ｚ）及び反応性基Ｒと反応することができる反応性基（Ｒ’）を含む化合物と、第１級アミン（リジン系リンカー）を含むリンカーを介して目的の部分（Ｚ）に連結された受容体グルタミンを含む抗体を得るのに十分な条件下で反応させる工程を更に含む。好ましくは、目的の部分（Ｚ）及び反応性基Ｒと反応することができる反応性基（Ｒ’）を含む当該化合物は、抗体に対して８０倍、４０倍、２０倍、１０倍、５倍又は４モル当量未満で提供される。一実施形態では、抗体は、２つの受容体グルタミンを含み、目的の部分（Ｚ）及び反応性基（Ｒ’）を含む化合物は、抗体に対して１０モル当量以下で提供される。一実施形態では、抗体は、２つの受容体グルタミンを含み、目的の部分（Ｚ）及び反応性基（Ｒ’）を含む化合物は、抗体に対して５モル当量以下で提供される。一実施形態では、抗体は、４つの受容体グルタミンを含み、目的の部分（Ｚ）及び反応性基（Ｒ’）を含む化合物は、抗体に対して２０モル当量以下で提供される。一実施形態では、抗体は、４つの受容体グルタミンを含み、目的の部分（Ｚ）及び反応性基（Ｒ’）を含む化合物は、抗体に対して１０モル当量以下で提供される。一実施形態では、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）は水性条件下で行われる。場合により、工程（ｃ）は、官能化受容体グルタミン残基を含む抗体の試料を固体支持体に固定化して、固定化抗体を含む試料を提供する工程と、固定化抗体を含む試料を化合物と反応させる工程と、場合により任意の未反応化合物を回収し、そのような回収化合物を固定化抗体との反応のために固体支持体に再導入する工程と、抗体コンジュゲートを溶出させて、Ｚ部分を含む組成物を提供する工程と、を含む。

【0167】

コンジュゲーションハンドル化学
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドの適切に修飾されたＦｃ領域は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドをＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートするために使用されるコンジュゲーションハンドルを含む。

【0168】

ＩＬ－２ポリペプチドに結合した相補的反応性基と反応することができる任意の適切な反応性基をコンジュゲーションハンドルとして使用することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、Ｃｕ（Ｉ）触媒又は「銅を含まない」アルキン－アジドトリアゾール形成反応（例えば、歪み促進付加環化）、シュタウディンガーライゲーション、逆電気オンデマンド型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応、「写真クリック」化学、トランスシクロクテンとのテトラジン環化付加、又はオレフィンメタセシス及び鈴木－宮浦若しくは薗頭クロスカップリング等の金属媒介プロセスのための試薬を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、「銅を含まない」アルキンアジドトリアゾール形成反応のための試薬を含む。当該アルキンアジドトリアゾール形成反応のためのアルキンの非限定的な例としては、シクロオクチン試薬（例えば、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール含有試薬、ジベンゾシクロオクチン－アミン試薬、ジフルオロシクロオクチン、又はそれらの誘導体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキン官能基はＦｃ領域に結合される。いくつかの実施形態では、アジド官能基はＦｃ領域に結合される。

【0170】

いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、アジド、アルキン、テトラジン、ハライド、スルフヒドリル、ジスルフィド、マレイミド、活性化エステル、アルケン、アルデヒド、ケトン、イミン、ヒドラジン、及びヒドラジドから選択される反応性基を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃ領域のコンジュゲーションハンドルに相補的な反応性基を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドル及び相補的コンジュゲーションハンドルは、「ＣＬＩＣＫ」化学試薬を含む。クリック化学残基の例示的な群は、Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌｕｍｅ ２５，ｐａｇｅｓ２２１６－２２３０（２００８）；Ｔｈｉｒｕｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ－Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１３，１１３，７，４９０５－４９７９、米国特許出願公開第２０１６０１０７９９９号、米国特許第１０２６６５０２号、及び米国特許出願公開第２０１９０２０４３３０号に記載されており、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる。

【0171】

リンカー構造
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及びサイトカイン（ＩＬ－２ポリペプチド等）に選択的に結合するポリペプチドを結合させるために使用されるリンカーは、両方の部分に結合点を含む。結合点は、本明細書で提供される結合を促進するための残基のいずれかであり得る。リンカー構造は、２つの部分間の空間的結合を作り出すための任意の適切な構造であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、両方の部分の共有結合を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは化学的リンカーである（例えば、融合タンパク質のような発現ポリペプチドではない）。

【0172】

いくつかの実施形態では、リンカーはポリマーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはポリ（アルキレンオキシド）を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレングリコール若しくはポリプロピレングリコール、又はそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレングリコールである。

【0173】

いくつかの実施形態では、リンカーは二官能性リンカーである。いくつかの実施形態では、二官能性リンカーは、アミド基、エステル基、エーテル基、チオエーテル基、又はカルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは非ポリマーリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、非ポリマーの二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、非ポリマー二官能性リンカーは、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、マレイミドカプロイル、バリン－シトルリン、アリル（４－メトキシフェニル）ジメチルシラン、６－（アリルオキシカルボニルアミノ）－１－ヘキサノール、４－アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール、又は（Ｅ）－Ｎ－（２－アミノエチル）－４－｛２－［４－（３－アジドプロポキシ）フェニル］ジアゼニル｝ベンズアミドヒドロクロリドを含む。

【0174】

リンカーは、分岐又は直鎖であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは直鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは分岐である。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、又は５０００個の原子の鎖の直鎖部分（例えば、第１の結合点と第２の結合点との間で）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０個の原子の鎖の直鎖部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０個の原子の直鎖部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは分岐しており、少なくとも１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００又は５０００個の原子の鎖の直鎖部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で約３００、２５０、２００、１５０、１００又は５０個の原子の鎖の直鎖部分を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、リンカーは、約２００ダルトン～約２０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２００ダルトン～約５０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、２００ダルトン～１００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、２００ダルトン～５００ダルトン、２００ダルトン～７５０ダルトン、２００ダルトン～１，０００ダルトン、２００ダルトン～５，０００ダルトン、２００ダルトン～１０，０００ダルトン、２００ダルトン～２０，０００ダルトン、２００ダルトン～５０，０００ダルトン、２００ダルトン～１００，０００ダルトン、５００ダルトン～７５０ダルトン、５００ダルトン～１，０００ダルトン、５００ダルトン～５，０００ダルトン、５００ダルトン～１０，０００ダルトン、５００ダルトン～２０，０００ダルトン、５００ダルトン～５０，０００ダルトン、５００ダルトン～１００，０００ダルトン、７５０ダルトン～１，０００ダルトン、７５０ダルトン～５，０００ダルトン、７５０ダルトン～１０，０００ダルトン、７５０ダルトン～２０，０００ダルトン、７５０ダルトン～５０，０００ダルトン、７５０ダルトン～１００，０００ダルトン、１，０００ダルトン～５，０００ダルトン、１，０００ダルトン～１０，０００ダルトン、１，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、１，０００ダルトン～５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン～１００，０００ダルトン、５，０００ダルトン～１０，０００ダルトン、５，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、５，０００ダルトン～５０，０００ダルトン、５，０００ダルトン～１００，０００ダルトン、１０，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン～５０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン～１００，０００ダルトン、２０，０００ダルトン～５０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン～１００，０００ダルトン、又は５０，０００ダルトン～１００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、２００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、又は１００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、又は５０，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、又は１００，０００ダルトンの分子量を有する。

【0176】

いくつかの実施形態では、リンカーは式（Ｘ）

【0177】

【化8】

の構造であって、
式中、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｌ^５、Ｌ^６、Ｌ^８及びＬ^９は、それぞれ独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物、又は存在せず、
各Ｒ^Ｌは、独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数であり、
式中、各

【0178】

【化9】

は、ＰＤ－Ｌ１又はサイトカイン（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド）に選択的に結合するポリペプチドへの結合点である、構造を含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、リンカーは、１対又は複数対のコンジュゲーションハンドル及びその相補的コンジュゲーションハンドルの反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、反応生成物は、トリアゾール、ヒドラゾン、ピリダジン、スルフィド、ジスルフィド、アミド、エステル、エーテル、オキシム、アルケン、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、反応生成物はトリアゾールを含む。反応生成物は、リンカーの任意の部分によって第１の結合点及び第２の結合点から分離することができる。いくつかの実施形態では、反応生成物は、リンカーの実質的に中心にある。いくつかの実施形態では、反応生成物は、他の結合点よりも１つの結合点に実質的に近い。

【0180】

いくつかの実施形態では、リンカーは式（Ｘ^ａ）：

【0181】

【化10】

の構造であって、
式中、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｌ^５、Ｌ^６、Ｌ^７、Ｌ^８及びＬ^９のそれぞれは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓ－、－Ｓ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物、又は存在しない、（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）であり、
各Ｒ^Ｌは、独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数であり、
式中、各

【0182】

【化11】

は、ＰＤ－Ｌ１又はサイトカイン（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド）に選択的に結合するポリペプチドへの結合点である、構造を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、リンカーは式（Ｘ’）：

【0184】

【化12】

の構造であって、
式中、Ｌ’のそれぞれは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓ－、－Ｓ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物、又は存在しない、（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）であり、
各Ｒ^Ｌは、独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数であり、
ｇは、１～１００の整数であり、
式中、各

【0185】

【化13】

が、修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は抗体若しくは抗原結合断片への結合点である、構造を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、式（Ｘ）又は式（Ｘ^ａ）又は式（Ｘ’）のリンカーは、以下：

【0187】

【化14】

の構造であって、
式中、

【0188】

【化15】

は、ＰＤ－１に選択的に結合するポリペプチドのリジン残基への第１の結合点であり、
Ｌは連結基であり、

【0189】

【化16】

は、第１の結合点に接続する連結基に対する結合点である、構造又はその位置異性体を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、Ｌは、以下：

【0191】

【化17】

の構造であって、式中、各ｎは独立して１～６の整数であり、各ｍは１～３０の整数である、構造を有する。いくつかの実施形態では、各ｍは独立して２又は３である。いくつかの実施形態では、各ｍは、１～２４、１～１８、１～１２、又は１～６の整数である。

【0192】

いくつかの実施形態では、式（Ｘ）又は式（Ｘ^ａ）又は式（Ｘ’）のリンカーは、以下：

【0193】

【化18】

の構造であって、
式中、

【0194】

【化19】

は、ＰＤ－１に選択的に結合するポリペプチドのリジン残基への第１の結合点であり、
Ｌは連結基であり、

【0195】

【化20】

は、第１の結合点に接続する連結基に対する結合点である、
構造又はその位置異性体を含む。

【0196】

いくつかの実施形態では、Ｌ’’は、以下：

【0197】

【化21】

の構造であって、式中、各ｎは独立して１～６の整数であり、各ｍは独立して１～３０の整数である、構造を有する。いくつかの実施形態では、各ｍは独立して２又は３である。いくつかの実施形態では、各ｍは、１～２４、１～１８、１～１２、又は１～６の整数である。

【0198】

いくつかの実施形態では、Ｌ又はＬ’’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上の、以下：

【0199】

【化22】

からそれぞれ独立して以下から選択されるサブユニットであって、式中、各ｎは独立して１～３０の整数である、サブユニットを含む。いくつかの実施形態では、各ｎは独立して１～６の整数である。いくつかの実施形態では、Ｌ又はＬ’’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のサブユニットを含む。

【0200】

いくつかの実施形態では、Ｌ又はＬ’’は、式（Ｘ’’）：

【0201】

【化23】

の構造であって、
式中、Ｌ^１ａ、Ｌ^２ａ、Ｌ^３ａ、Ｌ^４ａ、Ｌ^５ａのそれぞれは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌａ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^Ｌａ－、－ＮＲ^Ｌａ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｎ（Ｒ^Ｌａ）_２ ^＋（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌａ）Ｏ－、－Ｓ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓ－、－Ｓ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌａ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌａ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌａ－、－ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌａ－、－ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌａ－、－ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌａ－、－ＣＲ^Ｌａ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌａ、－ＮＲ^ＬａＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌａ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬａＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬａＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑｅ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｆ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｇ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｈ－、又は存在せず、
各Ｒ^Ｌａは独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑｅ、ｑｆ、ｑｇ及びｑｈの各々は、独立して、１～１００の整数である、構造である。

【0202】

いくつかの実施形態では、Ｌ又はＬ’’は、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、又は２～３０個の原子の直鎖を含む。いくつかの実施形態では、直鎖は、１つ以上のアルキル基（例えば、低級アルキル（Ｃ_１～Ｃ_４））、１つ以上の芳香族基（例えば、フェニル）、１つ以上のアミド基、１つ以上のエーテル基、１つ以上のエステル基、又はそれらの任意の組合せを含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、第１の結合点（例えば、サイトカインへの結合点）に接続する連結基は、ポリ（エチレングリコール）を含む。いくつかの実施形態では、連結基は、約２～約３０個のポリ（エチレングリコール）単位を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合点（例えば、サイトカインへの結合点）に接続する連結基は、アジド（例えば、トリアゾールはアジドの反応生成物である）を含む本明細書で提供されるサイトカインに結合する官能基である。

【0204】

いくつかの実施形態では、Ｌは、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２＋－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－であり、式中、Ｒ^Ｌは、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数である。

【0205】

いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドル及び相補的コンジュゲーションハンドル（例えば、式（Ｘ）、式（Ｘ^ａ）、式（Ｘ’）、又は式（Ｘ’’）で指定されるように）の各反応生成物は、トリアゾール、ヒドラゾン、ピリダジン、スルフィド、ジスルフィド、アミド、エステル、エーテル、オキシム、又はアルケンを独立して含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドル及び相補的コンジュゲーションハンドルの各反応生成物は、トリアゾールを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドル及び相補的コンジュゲーションハンドルの各反応生成物は、

【0206】

【化24】

の構造、又はその位置異性体若しくは誘導体を含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境において、その近傍において、又はその中で切断される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、腫瘍微小環境で、その近くで、又はその中で機械的又は物理的に切断される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、腫瘍微小環境で、その近くで、又はその中で化学的に切断される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは還元感受性リンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは酸化感受性リンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境で、その付近、又はその中のｐＨの結果として切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、腫瘍微小環境で、その付近、又はその中の腫瘍代謝産物によるものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境、その付近、又はその中でプロテアーゼによって切断される。

【0208】

ＩＬ－２サイトカイン
サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要な体内で産生されるタンパク質である。サイトカインは免疫系を調節することができ、サイトカイン療法は分子の免疫調節特性を利用して対象の免疫系を増強し、癌細胞を死滅させる。増強された生物学的活性を示すことができる、サイトカインにコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドを本明細書中に開示する。

【0209】

インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、免疫系の調節に重要なサイトカインシグナル伝達分子である。ＩＬ－２は、免疫系が外来細胞型と内因性細胞型との間で分化するのを助け、それによって免疫系が対象自身の細胞を攻撃するのを防ぐことに関与する。ＩＬ－２は、リンパ球によって発現されるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）との相互作用を通じてその活性を達成する。これらの結合相互作用を通して、ＩＬ－２は、Ｔエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の対象の集団を調節することができる。

【0210】

ＩＬ－２は、単独で、及び他の療法と組み合わせて、癌を治療するために使用されてきた。しかしながら、治療としてのＩＬ－２の使用は、ＩＬ－２の毒性、血管漏出症候群等の望ましくない副作用、及びＩＬ－２の短い半減期によって制限されてきた。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドへのＩＬ－２のコンジュゲーションは、ＩＬ－２ポリペプチド選択性を改善し、ＩＬ－２の治療可能性を高め、ＩＬ－２療法の投与による副作用のリスクを潜在的に低減することができる。

【0211】

本開示は、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドにコンジュゲートした抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド及び治療剤としてのそれらの使用を記載する。本明細書で提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、免疫療法として、又は他の免疫療法レジメンの一部として使用することができる。そのような修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２とは異なるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に対する結合特性を示し得る。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒαβγ複合体（ＩＬ－２Ｒα）に対する親和性が低下している。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβγ複合体（ＩＬ－２Ｒβ）に対して増加した親和性を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒβとの間の結合親和性は、野生型ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβとの間の結合親和性と同じ又はそれより高い。本明細書中に記載される実施形態では利用されるＩＬ－２アミノ酸配列の非限定的な例を下記の表８に示す。

【0212】

本開示のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体βサブユニットを介したシグナル伝達に有利に偏ることが好ましい。いくつかの実施形態では、これは、ａ）ＩＬ－２受容体αサブユニットへのＩＬ－２ポリペプチドの結合を阻害又は減少させること（例えば、αサブユニットと接触する残基における変異、αサブユニットと接触する残基へのポリマーの付加、又は、αサブユニットと接触する残基へのＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドへのリンカーの結合による）、及び／又はｂ）ＩＬ－２受容体のβサブユニットへのＩＬ－２ポリペプチドの結合を増強する（例えば、結合を増強するβサブユニットと接触する残基における変異を有する）ことの一方又は両方によって達成される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する免疫サイトカイン組成物のＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２受容体βサブユニットに偏っている。ＩＬ－２受容体βシグナル伝達に偏っている修飾を有するＩＬ－２ポリペプチドの非限定的な例は、例えばＰＣＴ公開番号国際公開第２０２１１４０４１６号、国際公開第２０１２０６５０８６号、国際公開第２０１９０２８４１９号、国際公開第２０１２１０７４１７号、国際公開第２０１８１１９１１４号、国際公開第２０１２０６２２２８号、国際公開第２０１９１０４０９２号、国際公開第２０１２０８８４４６号及び国際公開第２０１５１６４８１５号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。

【0213】

ＩＬ－２ポリペプチドへの化学的リンカーの結合点
化学的リンカーによってＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチド、例えば抗体を含む組成物が本明細書で提供される。上で考察されるように、化学的リンカーは、本明細書中に提供される位置のいずれかで抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに結合され得る。リンカーの第２の結合点は、本明細書で提供されるＩＬ－２ポリペプチドに結合される。

【0214】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、アミノ酸残基でＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、配列番号１のアミノ酸残基１～１３３のいずれか１つに対応するアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、非末端アミノ酸残基（例えば、配列番号１のアミノ酸残基２～１３２のいずれか１つ、又は配列番号１のアミノ酸残基１～１３３のいずれか１つであって、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかが１つ以上のアミノ酸残基によって伸長されている）に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２ポリペプチドの非末端アミノ酸残基に結合しており、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１と比較してＮ末端短縮又はＣ末端短縮のいずれかを含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）タンパク質又はサブユニットと相互作用するアミノ酸残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）、ＩＬ－２Ｒβサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）又はＩＬ－２Ｒγサブユニット（ＩＬ－２Ｒγ）と相互作用するアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）と相互作用するアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２Ｒβサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）と相互作用するアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、ＩＬ－２Ｒγサブユニット（ＩＬ－２Ｒγ）と相互作用するアミノ酸残基に結合される。

【0216】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドと少なくとも１つのＩＬ－２受容体サブユニットとの相互作用が減少又は遮断されるように、ＩＬ－２ポリペプチドへの結合点が選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒαとの相互作用が低減又は遮断されるように、結合点が選択される。いくつかの実施形態では、結合点は、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒβとの相互作用が低減されるように選択される。

【0217】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）との結合を破壊する残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合される。これらの残基の例としては、例えば、全体が記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９０２８４１９号、国際公開第２０２００５６０６６号、国際公開第２０２１１４０４１６号及び国際公開第２０２１２１６４７８号に記載されているように、残基３、５、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７１、７２、１０３、１０４、１０５及び１０７が挙げられる。

【0218】

いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３０～１１０のいずれか１つのアミノ酸残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０～５０位、３０～７０位、３０～１００位、４０～５０位、４０～７０位、４０～１００位又は４０～１１０位のいずれか１つのアミノ酸残基でＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７のいずれか１つのアミノ酸残基でＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３５、３７、３８、４１、４３、４４、４５、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７のいずれか１つのアミノ酸残基でＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７のいずれか１つのアミノ酸残基でＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３５、３７、３８、４１、４３、４４、６０、６１、６２、６４、６５、６８、６９、７１、７２、１０４、１０５及び１０７のいずれか１つのアミノ酸残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５又は４６のいずれか１つのアミノ酸残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、位置４１、４２、４３、４４、及び４５のいずれか１つのアミノ酸残基においてＩＬ－２ポリペプチドに結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基４２又は４５に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基４２に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基４５に結合される。

【0219】

いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１に示されるＩＬ－２ポリペプチドの天然アミノ酸残基であるアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１に示されるＩＬ－２ポリペプチドの天然アミノ酸残基の修飾版であるアミノ酸残基に結合される。そのような修飾の非限定的な例としては、天然アミノ酸残基へのコンジュゲーションハンドルの組み込み若しくは結合（リンカーを介したものを含む）、又は任意の適合性のある方法を使用した天然アミノ酸への化学的リンカーの結合が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１のＩＬ－２ポリペプチドと比較して置換アミノ酸残基であるアミノ酸残基に結合される。置換は、追加の官能基（例えば、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リジン、セリン、トレオニン又はチロシン）、任意の天然アミノ酸の修飾バージョンの誘導体、又は任意の非天然アミノ酸（例えば、所望の反応性基を含有するアミノ酸、例えば、アジド、アルキン等のＣＬＩＣＫ化学試薬）の結合により適した天然アミノ酸に対するものであり得る。置換され得るアミノ酸の非限定的な例としては、－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－ビフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｂｉｐ－ＯＨ）及びＮ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｏ－ベンジル－Ｌ－チロシン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な非標準アミノ酸としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－プロパルギルチロシン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、セレノシステイン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、アジド－リジン（ＡｚＫ）、チロシンアミノ酸の類似体、グルタミンアミノ酸の類似体、フェニルアラニンアミノ酸の類似体、セリンアミノ酸の類似体、トレオニンアミノ酸の類似体、アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト又はアミノ置換アミノ酸、β－アミノ酸、プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン以外の芳香族アミノ酸、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、非標準アミノ酸は、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化側鎖を有するアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、非標準アミノ酸は、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ^α－エチルグリシン、Ｎ^α－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロイソロイシン、ω－メチルアルギニン、Ｎ^α－メチルグリシン、Ｎ^α－メチルイソロイシン、Ｎ^α－メチルバリン、γ－カルボキシグルタマート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ^α－アセチルセリン、Ｎ^α－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、及び／又は他の類似のアミノ酸を含む。

【0220】

いくつかの実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸残基は、コンジュゲーションハンドルを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドへのリンカーの付加を容易にする。コンジュゲーションハンドルは、本明細書で提供されるコンジュゲーションハンドルのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸に部位特異的に共有結合される。コンジュゲーションハンドルを含むアミノ酸残基の非限定的な例は、例えば、それぞれ、その全体が示されているかのように参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１５０５４６５８号、国際公開第２０１４０３６４９２号、及び国際公開第２０２１１３３８３９号、国際公開第２００６０６９２４６号、及び国際公開第２００７０７９１３０号に見出され得る。

【0221】

いくつかの実施形態では、リンカーは、天然アミノ酸で置換されたアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、システイン、リジン又はチロシン残基で置換されたアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、システイン残基で置換されたアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、リジン残基で置換されたアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、チロシン残基で置換されたアミノ酸残基に結合される。

【0222】

いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基Ｋ３５、Ｆ４２Ｙ、Ｋ４３、Ｆ４４Ｙ又はＹ４５に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙ又はＹ４５に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基Ｙ４５に結合される。

【0223】

ＩＬ－２ポリペプチドに対する修飾
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸残基を含有する。そのような修飾は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の配列からのアミノ酸の付加及び／若しくは欠失、又はアミノ酸残基への部分の付加等の野生型ＩＬ－２ポリペプチドの変異の形態をとることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１の配列からの第１のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１の配列を参照配列として使用して、Ｃ１２５Ｓ変異を含む。アミノ酸残基に付加され得る部分としては、ポリマー、リンカー、スペーサー、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。特定のアミノ酸残基に添加すると、これらの部分は、野生型ＩＬ－２と比較して修飾ＩＬ－２ポリペプチドの活性又は他の特性を調節することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基３５～４６の範囲内の２つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基４０～４３の範囲内である。いくつかの実施形態では、１つの修飾はアミノ酸残基４２にある。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基４４～４６の範囲内である。いくつかの実施形態では、１つ修飾はアミノ酸残基４５にある。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上のポリマーを含有する。例えば、特定のアミノ酸残基へのポリマーの付加は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒ、特にαβγ複合体との結合相互作用を破壊する効果を有し得る。いくつかの実施形態では、この相互作用を破壊するためにポリマーが付加される残基には、Ｆ４２及びＹ４５が含まれる。いくつかの実施形態では、残基４２又は４５に添加されたポリマーは、ＩＬ－２ポリペプチドとＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドとの間のリンカーとしても作用する。

【0224】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー等の水溶性ポリマーである。Ｆ４２残基を別の残基に変異させて、例えばチロシン残基へのＰＥＧポリマーの付加を容易にすることができる。ポリマーは、アミノ酸残基Ｆ４２及びＹ４５の一方又は両方、又はそれらの変異体に付加され得る。これらのポリマーは、ＩＬ－２ポリペプチドとＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドとの間のリンカーの形態であってもよく、又はリンカーに加えて追加のポリマーであってもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表２から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む。

【0225】

【表3】

【0226】

＊参照配列としての配列番号１に基づく残基位置ナンバリング。

【0227】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表３から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む。

【0228】

【表4】

【0229】

＊参照配列としての配列番号１に基づく残基位置ナンバリング。

【0230】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表４から選択される１つ以上のポリマーを含む。

【0231】

【表5】

【0232】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表５に提供される変異及びポリマーを含む。いくつかの実施形態では、表のポリマーの１つ以上は、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドに結合したリンカーの一部で置き換えられるか、又はそれを含む。

【0233】

【表6】

【0234】

＊参照配列としての配列番号１に基づく残基位置ナンバリング。

【0235】

本明細書中に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、組換えであり得る。本明細書中に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドはまた、組換えポリペプチドとして発現されるのではなく、化学的に合成される場合がある。合成ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくともＰＣＴ公開番号国際公開第２０２１１４０４１６号、米国特許出願公開第２０１９００２３７６０号、及びＡｓａｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，８２２６－８２３０に記載されており、これらの各々は、あたかもその全体が本明細書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、全長修飾ＩＬ－２ポリペプチドの１つ以上の断片を合成し、断片を一緒にライゲーションし、ライゲーションされた全長ポリペプチドをフォールディングすることによって作製することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸配列におけるＦ４２Ｙ変異、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙに共有結合した約５００Ｄａの第１のＰＥＧポリマー、アミノ酸残基Ｙ４５に共有結合した約５００Ｄａの第２のＰＥＧポリマー、及び修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合した約６ｋＤａの任意の第３のＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの一部を含む。

【0236】

いくつかの実施形態では、化学合成されたＩＬ－２ポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドへのリンカーの結合を促進するために、１つ以上のアミノ酸残基に結合したコンジュゲーションハンドルを含む。コンジュゲーションハンドルは、本明細書で提供される任意のそのようなコンジュゲーションハンドルであってもよく、リンカーが結合され得る任意のアミノ酸残基に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基４２又は４５に結合される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、アジド又はアルキンを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、組換えＩＬ－２ポリペプチドの非天然又は修飾天然アミノ酸に組み込まれる。非天然アミノ酸を有する組換えＩＬ－２ポリペプチドは、例えば、特許協力条約公開番号国際公開第２０１６１１５１６８号、国際公開第２００２０８５９２３号、国際公開第２００５０１９４１５号及び国際公開第２００５００３２９４号に記載されている方法を用いて作製することができる。

【0237】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与された場合にＴエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞増殖を増強する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与された場合、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の優先的活性化を防止しながら、Ｔ_ｅｆｆ又はＮＫ細胞増殖を増強する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を増加させる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与した場合、１に近いＴ_ｅｆｆ／Ｔ_ｒｅｇ比を生じる。

【0238】

一態様では、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、共有結合した第１のポリマーを含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に記載される。修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドが本明細書に記載され、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｆ４２Ｙに共有結合した第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、ＩＬ－２ポリペプチド及びＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを結合するリンカーと同じである。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、リンカーとは異なる追加のポリマーである。別の態様では、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、一次Ｔｒｅｇ（ＩＬ－２Ｒα／β／γ受容体を発現）及び静止期ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ（ＩＬ－２Ｒβ／γ受容体を発現）に対するアゴニストアッセイにおいて最大半量有効濃度（ＥＣ５０）によって測定した場合に、高親和性ヘテロ三量体ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒα／β／γ）を発現する細胞に対して低下した機能活性及び中間親和性ヘテロ二量体ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒβ／γ）を発現する細胞に対してより大きい機能活性を示し、ＩＬ－２Ｒβに対する修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＥＣ５０値とＩＬ－２Ｒαに対する修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＥＣ５０値との比が３：１未満である、修飾ポリペプチドが本明細書に記載される。いくつかの例では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表８又は表５に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表２又は表３に提供される変異を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び／又は表４に提供されるポリマーを有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドである。

【0239】

生物学的活性
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドにコンジュゲートさせた修飾ＩＬ－２ポリペプチドから構成される抗ＰＤＬ１－ＩＬ－２イムノコンジュゲートは、腫瘍浸潤リンパ節癌及び腫瘍排出リンパ節癌、並びに高レベルのＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）を発現する免疫細胞に対する増強された親和性、並びに低レベル又は中レベルの表面ＰＤ－Ｌ１を発現する末梢における健康及び免疫細胞に対する低下した親和性を示す。

【0240】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド（ＰＤＬ１－ＩＬ２）にコンジュゲーションした修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートは、非標的ＩＬ－２ポリペプチド又は非標的ＩＬ－２イムノコンジュゲートと比較して、血漿中での曝露と比較して、腫瘍又は腫瘍排出リンパ節内での曝露が増強されている。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートの血漿又は血清中での曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節内での曝露の比は、非標的ＩＬ－２イムノコンジュゲート又は非コンジュゲーションＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、腫瘍又は腫瘍排出リンパ節内のＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートの半減期は、血漿又は血清中のその半減期と比較して１０倍～１００倍高い。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートの血漿又は血清中での曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節内での曝露の比は、非標的ＩＬ－２イムノコンジュゲート又は非コンジュゲーションＩＬ－２ポリペプチドと比較して、１０倍～１００倍、２０倍～１００倍、３０倍～１００倍、４０倍～１００倍、２０倍～７５倍、３０倍～７５倍、４０倍～１００倍、又は４０倍～７５倍高い。

【0241】

いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートは、ＰＤ－Ｌ１を標的としないＩＬ－２イムノコンジュゲート又はＩＬ－２ポリペプチドと比較して、血漿又は血清曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節曝露の増大した比を示す。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１－ＩＬ－２イムノコンジュゲートの血漿又は血清曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節曝露の比は、ＰＤ－Ｌ１を標的としないＩＬ－２イムノコンジュゲート又はＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍高い。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２の血漿又は血清曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節曝露の比は、ＰＤ－Ｌ１を標的としないＩＬ－２イムノコンジュゲート又はＩＬ－２ポリペプチドと比較して１０倍～１００倍高い。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートの血漿又は血清曝露に対する腫瘍又は腫瘍排出リンパ節曝露の比は、非標的ＩＬ－２イムノコンジュゲート又はＩＬ－２ポリペプチドと比較して、１０倍～１００倍、２０倍～１００倍、３０倍～１００倍、４０倍～１００倍、２０倍～７５倍、３０倍～７５倍、４０倍～１００倍、又は４０倍～７５倍高い。

【0242】

いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートによって誘導される他の組織（例えば、他の組織における同じタイプの免疫細胞）における免疫細胞集団の増殖に対する腫瘍内（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））及び腫瘍排出リンパ節内の免疫細胞集団の増殖の比は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートによって誘導される他の組織中の免疫細胞集団の増殖に対する腫瘍及び腫瘍排出リンパ節内の免疫細胞集団の増殖の比は、約１．５～１０、約２～１０、約２．５～１０、約３～１０、約１．５～８、約２～８、約２．５～８、約３～８、約１．５～６、約２～６、約２．５～６、又は約３～６である。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、ナイーブＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又はそれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、比は、投与後の指定された時間（例えば、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間又は７日間）に測定される。

【0243】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドにコンジュゲーションした修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含むＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートは、高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（ＣＤ２７４）に対する修飾ＩＬ－２ポリペプチドのシスシグナル伝達により、ＰＤ－Ｌ１を発現しないか又は中レベルのみを発現する細胞と比較して増強された効力を示す。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートについて、高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現する細胞におけるＩＬ－２経路関与のＥＣ５０値（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）に対する、ＰＤ－Ｌ１を発現しないか又は中レベルのみ発現する細胞におけるＩＬ－２経路関与のＥＣ５０値（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）の比は、最後に１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、又は少なくとも３０００である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１－ＩＬ２イムノコンジュゲートについて、高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現する細胞におけるＩＬ－２経路関与のＥＣ５０値（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）に対する、ＰＤ－Ｌ１を発現しないか又は中レベルのみ発現する細胞におけるＩＬ－２経路関与のＥＣ５０値（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）の比は、ＰＤ－Ｌ１を標的としないＩＬ－２イムノコンジュゲート又はＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍又は少なくとも１０００倍である。

【0244】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２とは異なる活性を示す。本明細書で以下に提供されるこれらの修飾された生物学的活性は、いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチド単独（例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドにコンジュゲートされていないか、そうでなければ結合されていない）、並びにＩＬ－２ポリペプチドがＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドにコンジュゲートされているか、そうでなければ結合する（例えば、修飾された生物学的活性は、コンジュゲーション又は付着時に保持される）場合に適用される。したがって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、示された活性を有するとして本明細書中に記載される場合、本明細書中に提供される免疫サイトカイン組成物（例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチドに結合したＩＬ－２ポリペプチド）は、同じ活性を有することも想定される。

【0245】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞、ナイーブＣＤ８＋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞集団、又はそれらの組合せを増殖させることができる。いくつかの例では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表８又は表５に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表２又は表３に提供される変異を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び／又は表４に提供されるポリマーを有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドである。

【0246】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、エフェクターＴ細胞（Ｔ_ｅｆｆ細胞）の細胞集団を増殖させる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％増殖させる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも２０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも３０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも４０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも５０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも１００％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を少なくとも２００％増殖する。

【0247】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、エフェクターＴ細胞（Ｔ_ｅｆｆ細胞）の細胞集団を増殖させる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で５％、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で７５％、最大で１００％、又は最大で５００％増殖させる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で５％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で２０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で５０％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で１００％増殖する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが集団と接触している場合、Ｔ_ｅｆｆ細胞の細胞集団を最大で５００％増殖する。

【0248】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、約０．１～約１５、約０．５～約１０、約０．７５～約５、又は約１～約２である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、０．１～１５である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、０．１～０．５、０．１～０．７５、０．１～１、０．１～２、０．１～５、０．１～１０、０．１～１５、０．５～０．７５、０．５～１、０．５～２、０．５～５、０．５～１０、０．５～１５、０．７５～１、０．７５～２、０．７５～５、０．７５～１０、０．７５～１５、１～２、１～５、１～１０、１～１５、２～５、２～１０、２～１５、５～１０、５～１５、１０～１５、又はそれらの間の任意の数若しくは範囲である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、約０．１、０．５、０．７５、１、２、５、１０又は１５である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、少なくとも０．１、０．５、０．７５、１、２、５、又は１０である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させたＴ_ｒｅｇ細胞の細胞集団増殖に対するＴ_ｅｆｆ細胞の細胞集団増殖の比は、最大で０．５、０．７５、１、２、５、１０又は１５である。

【0249】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドによって増殖させた細胞集団は、インビトロ細胞集団、インビボ細胞集団又はエクスビボ細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団はインビトロ細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団はインビボ細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団はエクスビボ細胞集団である。細胞集団は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞、ナイーブＣＤ８＋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、又はそれらの組合せの集団であり得る。

【0250】

いくつかの実施形態では、細胞のレベルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの注射の１時間後に測定される。いくつかの実施形態では、細胞のレベルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの注射の２時間後に測定される。いくつかの実施形態では、細胞のレベルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの注射の４時間後に測定される。いくつかの実施形態では、細胞のレベルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、インビトロ実験の場合）の注射の３０分後に測定される。 いくつかの実施形態では、細胞のレベルは、特にインビボ実験のために、延長された時点（例えば、６時間、１２時間、２４時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間等）で測定される。

【0251】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるイムノコンジュゲート組成物（例えば、リンカーを介してＩＬ－２ポリペプチドに結合したＰＤ－Ｌ１（例えば、デュルバルマブ等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体）に結合するポリペプチド）は、２つの基間の結合の形成後に、成分の少なくとも１つに関連する結合親和性を維持する。例えば、ＩＬ－２ポリペプチドに連結された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片を含むイムノコンジュゲート組成物において、いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のＦｃ受容体への結合を保持する。いくつかの実施形態では、組成物は、非コンジュゲート抗体と比較して、約５倍以下、約１０倍以下、約１５倍以下、又は約２０倍以下減少する、１つ以上のＦｃ受容体への結合を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のＦｃ受容体は、ＦｃＲｎ受容体、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２α）、ＦｃγＲＩＩβ受容体（ＣＤ３２β）、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６ａ）、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ受容体、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２α）、及びＦｃγＲＩＩβ受容体（ＣＤ３２β）、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６ａ）のそれぞれへの組成物の結合は、非コンジュゲート抗体と比較して約１０倍以下減少する。

【0252】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチド（例えば、抗体）の結合は、ＩＬ－２ポリペプチドとのコンジュゲーションによる実質的な影響を受けない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１へのポリペプチドの結合は、非コンジュゲート抗体と比較して約５％以下低下する。

【0253】

部位特異的修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドに基づく。いくつかの例では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表８又は表５に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表２又は表３に提供される変異を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び／又は表４に提供されるポリマーを有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドである。

【0254】

本明細書中に記載されるポリペプチドに対する修飾は、タンパク質又はタンパク質断片の野生型バージョンの変異、様々な機能の付加、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は任意の他の修飾を包含する。ポリペプチドに付加され得る官能基としては、ポリマー、リンカー、アルキル基、検出可能な分子、例えば発色団又はフルオロフォア、反応性官能基、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの個々のアミノ酸に官能基が付加される。いくつかの実施形態では、官能基は、ポリペプチドに部位特異的に付加される。いくつかの実施形態では、官能基は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させるために使用されるリンカーの少なくとも一部を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基３５～４６の領域からのアミノ酸残基に修飾を含み、残基のナンバリングは配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾は、Ｋ３５、Ｌ３６、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｍ３９、Ｌ４０、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５又はＭ４６におけるものである。いくつかの実施形態では、修飾はＦ４２にある。いくつかの実施形態では、修飾はＹ４５にある。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｎ末端残基に修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｃ１２５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ａ１欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの結合を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基３５～４６のいずれかのアミノ酸残基に共有結合した第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基３９～４３のいずれかのアミノ酸残基に共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｆ４２に共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙに共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基４４～４６のいずれかのアミノ酸残基に共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｙ４５に共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合するリンカーの一部である。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーとは別個の修飾である。

【0257】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基３５からアミノ酸残基４５までの領域のアミノ酸残基に位置する１つ以上のＰＥＧ化チロシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ化チロシンは、アミノ酸残基４２、アミノ酸残基４５、又はその両方に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ化チロシンは、アミノ酸残基４２に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ化チロシンは、アミノ酸残基４５に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ化チロシンはアミノ酸残基４２及びアミノ酸残基４５の両方に位置する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それぞれ独立して式（Ｉ）の構造を有する２つのＰＥＧ化チロシンを含む。本明細書で提供される様々なリンカー結合点及びポリマーを有する本明細書で提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドの非限定的なセットを以下の表７に示す。

【0258】

【表7】

【0259】

一態様では、１つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆ４２Ｙ及びＹ４５を含む。

【0260】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは合成である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基３５～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基６１～８１のいずれか１つに位置するＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基９４～１１４のいずれか１つに位置するＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１、２、３又はそれを超えるＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、その少なくとも２つのアミノ酸置換は、（ａ）アミノ酸残基３５～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基、（ｂ）アミノ酸残基６１～８１のいずれか１つに位置するホモセリン残基、及び（ｃ）アミノ酸残基９４～１１４のいずれか１つに位置するホモセリン残基から選択される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１及びＨｓｅ７１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ７１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ７１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１、２、３又はそれを超えるノルロイシン（Ｎｌｅ）残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基１８～２８のいずれか１つに位置するＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基３４～５０のいずれか１つに位置する１つ以上のＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基２０～６０のいずれか１つに位置するＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３つのＮｌｅ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｎｌｅ２３、Ｎｌｅ３９及びＮｌｅ４６を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ａ１欠失を有する配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ａ１欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ａ１欠失を有する配列番号４を含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表８に提供される配列番号３～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３～２３のいずれか１つの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0262】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３個又は４個のアミノ酸置換、３個～５個のアミノ酸置換、３個～６個のアミノ酸置換、３個～７個のアミノ酸置換、３個～９個のアミノ酸置換、４個又は５個のアミノ酸置換、４個～６個のアミノ酸置換、４個～７個のアミノ酸置換、４個～９個のアミノ酸置換、５個又は６個のアミノ酸置換、５個～７個のアミノ酸置換、５個～９個のアミノ酸置換、６個又は７個のアミノ酸置換、６個～９個のアミノ酸置換、又は７個～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３個のアミノ酸置換、４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換又は９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換又は９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が表２から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が表３から選択される。いくつかの例では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表８又は表５に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表２又は表３に提供される変異を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び／又は表４に提供されるポリマーを有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドである。

【0263】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、第２の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、第３の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、第２及び第３の修飾を含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、及びＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔのパラメータを使用して、タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定される。

【0265】

本明細書中に記載されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上の非標準アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、場合によっては、Ｔｙｒ４５及び／又はＰｈｅ４２は、非標準アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、表２及び／又は表３に提供される位置に位置する１つ以上のアミノ酸は、１つ以上の非標準アミノ酸で置換される。非標準アミノ酸には、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－ビフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｂｉｐ－ＯＨ）及びＮ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｏ－ベンジル－Ｌ－チロシン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨが含まれるが、これらに限定されない。例示的な非標準アミノ酸としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－プロパルギルチロシン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、セレノシステイン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、アジド－リジン（ＡｚＫ）、チロシンアミノ酸の類似体、グルタミンアミノ酸の類似体、フェニルアラニンアミノ酸の類似体、セリンアミノ酸の類似体、トレオニンアミノ酸の類似体、アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト又はアミノ置換アミノ酸、β－アミノ酸、プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン以外の芳香族アミノ酸、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、非標準アミノ酸は、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化側鎖を有するアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、非標準アミノ酸は、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ^α－エチルグリシン、Ｎ^α－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロイソロイシン、ω－メチルアルギニン、Ｎ^α－メチルグリシン、Ｎ^α－メチルイソロイシン、Ｎ^α－メチルバリン、γ－カルボキシグルタマート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ^α－アセチルセリン、Ｎ^α－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、及び／又は他の類似のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｙｒ４５及び／又はＰｈｅ４２は、修飾チロシン残基で置換されている。いくつかの実施形態では、修飾チロシン残基は、アミノ、アジド、アリル、エステル及び／又はアミド官能基を含む。いくつかの実施形態では、４２又は４５位の修飾チロシン残基は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合するリンカーの結合点として使用される。いくつかの実施形態では、４２及び／又は４５位の修飾チロシン残基は、前駆体の構造１、構造２、構造３、構造４又は構造５から構築された構造を有し、ここで、構造１は、

【0266】

【化25】

であり、
構造２は、

【0267】

【化26】

であり、
構造３は、

【0268】

【化27】

であり、
構造４は、

【0269】

【化28】

であり、
また、構造５は、

【0270】

【化29】

である。

【0271】

ポリマー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、その上に共有結合した１つ以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるポリマーを含む。いくつかの実施形態では、記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの少なくとも一部を含む。いくつかの例では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表８又は表５に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチド、表２又は表３に提供される変異を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び／又は表４に提供されるポリマーを有する修飾ＩＬ－２ポリペプチドである。

【0272】

いくつかの実施形態では、第１のポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは多糖類である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（エチレンオキシド）である。

【0273】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合した第１のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それに共有結合した第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それに共有結合した第２及び第３のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、アミノ酸残基４２又は４５に共有結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙ又はＹ４５に共有結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第２及び第３のポリマーは、アミノ酸残基４２及び４５に共有結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第２及び第３のポリマーは、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙ及びＹ４５に共有結合しており、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第１、第２又は第３のポリマーの少なくとも１つは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させるために使用されるリンカーの少なくとも一部を含む。

【0274】

いくつかの実施形態では、第１のポリマー等の付着したポリマーは、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、少なくとも約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、又は約５００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、最大で約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0275】

いくつかの実施形態では、第１のポリマー等の結合ポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレンオキシド）等のポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、修飾ポリ（アルキレンオキシド）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つ以上のリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー基は、アミド基、エステル基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基等の二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー基は、アミドリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つ以上のスペーサー基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー基は、置換又は非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー基は、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－を含む。いくつかの実施形態では、リンカー基は、双直交反応（例えば、生体適合性及び選択的反応）の生成物である。いくつかの実施形態では、生体直交反応は、Ｃｕ（Ｉ）触媒又は「銅フリー」アルキン－アジドトリアゾール形成反応、シュタウディンガーライゲーション、逆電気オンデマンド型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応、「写真クリック」化学、又はオレフィンメタセシス及び鈴木－宮浦若しくは薗頭クロスカップリング等の金属媒介プロセスである。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、クリック化学を介してＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの少なくとも一部を含む。

【0276】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドと、抗体及びポリマー等の誘導体化分子又は部分とのコンジュゲーションを容易にする反応基を含む。いくつかの実施形態では、反応基は、カルボン酸由来の活性エステル、混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルアジド、ハロゲン化アルキル、Ｎ－マレイミド、イミノエステル、イソシアナート、及びイソチオシアナートの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、反応基はアジドを含む。いくつかの実施形態では、反応基は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合するリンカーの一部を形成する。

【0277】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸残基に共有結合した化学試薬を含む。いくつかの実施形態では、化学試薬は生体直交試薬を含む。いくつかの実施形態では、化学試薬はアジドを含む。いくつかの実施形態では、化学試薬はアルキンを含む。いくつかの実施形態では、化学試薬は、３５～４６のアミノ酸残基に結合し、残基の位置のナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、３９～４３のアミノ酸残基に結合され、ここで、アミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、アミノ酸残基４２に結合され、ここで、アミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、アミノ酸残基Ｆ４２Ｙに結合され、ここで、アミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、４４～４６のアミノ酸残基に結合され、アミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、アミノ酸残基４５に結合され、ここで、アミノ酸残基の位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、表２又は表３に示されるアミノ酸残基のいずれかに結合される。いくつかの実施形態では、化学試薬は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合するリンカーの一部を形成する。

【0278】

いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。

【0279】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第２のポリマーを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、残基４０から残基５０までのアミノ酸残基領域に共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、アミノ酸残基Ｙ４５に共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの少なくとも一部を含む。

【0280】

いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、少なくとも約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、又は約５００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、最大で約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0281】

いくつかの実施形態では、第２のポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（エチレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、クリック化学を介してＩＬ－２ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドにＩＬ－２ポリペプチドを結合させたリンカーの少なくとも一部を含む。

【0282】

いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。

【0283】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した第３のポリマーを更に含む。いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、アミノ酸残基４０からアミノ酸残基５０までのアミノ酸残基領域に共有結合される。いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、アミノ酸残基Ｙ４５に共有結合される。いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合される。

【0284】

いくつかの実施形態では、各ポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。

【0285】

いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、直鎖又は分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、直鎖ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、分岐ポリエチレングリコールである。例えば、いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリマーの各々は、直鎖ポリエチレングリコール鎖を含む。

【0286】

いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アミド又はアミノ基で独立して末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アミノ基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アミド基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アルコキシ基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アルキル基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、ヒドロキシ基で末端がキャップされている。

【0287】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、式（Ｉ）：

【0288】

【化30】

の構造であって、
式中、ｎは４から３０から選択される整数である、構造を有する１つ以上のＰＥＧ化チロシンを含む。いくつかの実施形態では、ｎは、４～６、４～８、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、６～８、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０又は２５～３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、４、６、８、１０、１５、２０、２５又は３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４、６、８、１０、１５、２０又は２５である。いくつかの実施形態では、ｎは、最大で６、８、１０、１５、２０、２５又は３０である。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ又は２つのアミノ酸残基で共有結合した１つ又は２つの水溶性ポリマーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表６に示される特徴及び結合部位を有する１つ又は２つの水溶性ポリマーを含む。

【0289】

【表8】

【0290】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、適切な前駆体材料から合成される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、構造６、構造７、構造８、又は構造９の前駆体材料から合成され、構造６は、

【0291】

【化31】

であり、
構造７は、

【0292】

【化32】

であり、
構造８は、

【0293】

【化33】

であり、
また、構造９は、

【0294】

【化34】

である。

【0295】

直交ペイロード
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２イムノコンジュゲート（ＰＤＬ１－ＩＬ２）は、二重直交ペイロードを含むことができる。１つの非限定的な例では、ＰＤＬ１－ＩＬ２は、抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、１つの修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び化学的直交連結基によって抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに連結された１つのペイロードを含み得る。直交ペイロードは、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、タンパク質、サイトカイン、アルキル基、アリール又はヘテロアリール基、治療用小分子薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、脂質、糖、ビオチン、ビオチン誘導体、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得、そのいずれも置換、非置換、修飾、又は非修飾である。いくつかの実施形態では、直交ペイロードは治療用小分子である。いくつかの実施形態では、直交ペイロードはＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、直交ペイロードは、更なるサイトカイン（例えば、ＩＬ－７又はＩＬ－１８等）である。１つの例示的な例では、ヒトＩＬ－７は、ＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を有するか、又は修飾ヒトＩＬ－７である。１つの例示的な例では、ヒトＩＬ－１８は、ＹＦＧＫＬＥＳＫＬＳＶＩＲＮＬＮＤＱＶＬＦＩＤＱＧＮＲＰＬＦＥＤＭＴＤＳＤＣＲＤＮＡＰＲＴＩＦＩＩＳＭＹＫＤＳＱＰＲＧＭＡＶＴＩＳＶＫＣＥＫＩＳＴＬＳＣＥＮＫＩＩＳＦＫＥＭＮＰＰＤＮＩＫＤＴＫＳＤＩＩＦＦＱＲＳＶＰＧＨＤＮＫＭＱＦＥＳＳＳＹＥＧＹＦＬＡＣＥＫＥＲＤＬＦＫＬＩＬＫＫＥＤＥＬＧＤＲＳＩＭＦＴＶＱＮＥＤ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を有するか、又は修飾ヒトＩＬ－１８である。

【0296】

医薬組成物
本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結された抗ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の賦形剤を含み、ここで、１つ以上の賦形剤には、糖質、無機塩、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれを超える賦形剤を更に含み、ここで、１つ以上の賦形剤には、糖質、無機塩、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤又はそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。

【0297】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は糖質を更に含む。特定の実施形態では、糖質は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオスラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0298】

あるいは、又は加えて、医薬組成物は、無機塩を更に含む。特定の実施形態では、無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

【0299】

特定の実施形態では、医薬組成物は、抗酸化剤を更に含む。特定の実施形態では、抗酸化剤は、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸カリウム、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0300】

あるいは、又は加えて、医薬組成物は、界面活性剤を更に含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、ソルビタンエステル、脂質、リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、ＥＤＴＡ、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0301】

あるいは、又は加えて、医薬組成物は緩衝剤を更に含む。特定の実施形態では、緩衝剤は、クエン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、エタノールアミン、ヒスチジン、アミノ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、乳酸、トリス、ＨＥＰＥＳ、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

【0302】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与又は経腸投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内（ＩＶ又はｉ．ｖ．）又は皮下（ＳＱ）投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、筋肉内投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥形態にある。

【0303】

一態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する記載のポリペプチドを含む液体又は凍結乾燥組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、凍結乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末を緩衝溶液に再懸濁する。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩はナトリウムＮａ_２ＨＰＯ_４である。いくつかの実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はマンニトールを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末は、約１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝剤、約０．０２２％のＳＤＳ及び約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含み、約７．５のｐＨを有する溶液に懸濁される。

【0304】

剤形
本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、様々な剤形であり得る。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを、再構成凍結乾燥粉末として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを懸濁液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを溶液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを注射可能な溶液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドをＩＶ溶液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを、皮下投与又は筋肉内投与によって投与する。

【0305】

治療の方法
１つの態様では、本明細書中に記載されるのは、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、有効量の、本明細書中に記載されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は医薬組成物に連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを対象に投与する工程を含む方法である。いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。癌又は腫瘍は、例えば、原発性癌又は腫瘍又は転移性癌又は腫瘍であり得る。治療される癌及び腫瘍には、黒色腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）等である）、癌腫（例えば、皮膚扁平上皮癌（ＣＳＣＣ）、尿路上皮癌（ＵＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、胃食道接合部（ＧＥＪ）癌、子宮内膜癌（ＥＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）等）、膀胱癌（ＢＣ）、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）／ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）固形腫瘍（例えば、結腸直腸癌（ＣＲＣ））、腫瘍変異負荷高（ＴＭＢ－Ｈ）固形腫瘍、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌（ＧＣ）、子宮頸癌（ＣＣ）、胸膜中皮腫（ＰＭ）、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、又は縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0306】

いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。いくつかの実施形態では、固形癌が、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、カルチノイド癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、生殖細胞癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、口腔癌、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、小児癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織癌、脊髄癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿管癌、子宮癌、膣癌、又は外陰癌である。

【0307】

本明細書では、１つ以上の追加の活性薬剤との併用療法が企図される。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、腫瘍型、起源の腫瘍組織、腫瘍病期、又は腫瘍によって発現される遺伝子の変異に基づいて選択される。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、生物学的癌剤、癌特異的剤、サイトカイン療法、抗血管新生薬、癌代謝を標的とする薬物、癌細胞表面を破壊のためにマークする抗体、抗体－薬物コンジュゲート、細胞療法、一般的に使用される抗新生物剤、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス、非薬物療法、神経伝達遮断薬、又は神経成長因子遮断薬のうちの１つ以上と組み合わせて投与することができる。

【0308】

有効な応答は、対象が病気の徴候又は症状の部分的又は全体的な緩和又は軽減を経験する場合に達成され、具体的には、限定されないが、生存の延長を含む。予測無増悪生存期間は、再発数、疾患の病期及び他の因子を含む予後因子に応じて、数ヶ月から数年で測定され得る。生存期間の延長には、少なくとも１ヶ月（月）、約少なくとも２ヶ月、約少なくとも３ヶ月、約少なくとも４ヶ月、約少なくとも６ヶ月、約少なくとも１年、約少なくとも２年、約少なくとも３年、約少なくとも４年、約少なくとも５年等の期間が含まれるが、これらに限定されない。全生存又は無増悪生存も、数ヶ月から数年で測定することができる。あるいは、有効な応答は、対象の症状又は癌負荷が静止したままであり、悪化しないことであり得る。適応症の治療の更なる適応症を以下により詳細に記載する。いくつかの例では、癌又は腫瘍は、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％減少する。

【0309】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、単回用量の有効量の修飾ＩＬ－２ポリペプチドで投与され、（ｉ）修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、１日１回投与されるか、又は（ｉｉ）修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは対象に１日の期間にわたって複数回投与される、更なる実施形態を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに連結されたＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドを、毎日、１日おきに、１週間に３回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、３日間に１回、４日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、２週間に１回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回又は６ヶ月に１回投与する。投与には、任意の適切な経路（例えば、非経口、経腸、静脈内、皮下等）による注射が含まれるが、これに限定されない。

【0310】

製造方法
一態様では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドであって、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドが反応性基（例えば、コンジュゲーションハンドル）を含むポリペプチドを提供することと、反応性基をサイトカインに結合した相補的反応性基と接触させることと、組成物を形成することとを含む、組成物の製造方法が本明細書に記載される。得られる組成物は、本明細書で提供される組成物のいずれかである。

【0311】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合するポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、反応性基を含む抗体を提供することは、反応性基を抗体に結合させることを含む。いくつかの実施形態では、反応性基は、部位特異的に付加される。いくつかの実施形態では、反応性基を抗体に結合させることは、抗体を、抗体の特定の残基と結合を形成する反応性官能基を含む親和性基と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、反応性基を抗体に結合させることは、抗体を酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、反応性基を抗体の特定の残基に部位特異的に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、酵素はグリコシル化酵素又はトランスグルタミナーゼ酵素である。

【0312】

いくつかの実施形態では、方法は、サイトカインに相補的反応性基を結合させる工程を更に含む。いくつかの実施形態では、相補的反応性基をサイトカインに結合させることは、サイトカインを化学的に合成することを含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、本方法は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製することを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製する方法は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を合成し、断片をライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製する方法は、ａ．修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を合成することと、ｂ．断片をライゲーションすることと、ｃ．ライゲーションされた断片をフォールディングする工程と、を含む。

【0314】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は化学的に合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は、固相ペプチド合成によって合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は、自動ペプチド合成機で合成される。

【0315】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドは、２つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、４つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、２から１０個のペプチド断片にライゲーションされる。

【0316】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を一緒にライゲーションする。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの３つ以上の断片が、連続的な様式でライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの３つ以上の断片をワンポット反応でライゲーションする。

【0317】

いくつかの実施形態では、ライゲーションされた断片はフォールディングされる。いくつかの実施形態では、フォールディングは、修飾ＩＬ－２ポリペプチド内に１つ以上のジスルフィド結合を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションした断片をフォールディング工程に供する。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた断片は、当技術分野で周知の方法を使用してフォールディングされる。いくつかの実施形態では、ライゲーションされたポリペプチド又はフォールディングされたポリペプチドは、１つ以上のポリマーをそれに付着させることによって更に修飾される。いくつかの実施形態では、ライゲーションされたポリペプチド又はフォールディングされたポリペプチドは、ＰＥＧ化によって更に修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは合成である。

【0318】

【表9-1】

【0319】

【表9-2】

【0320】

【表9-3】

【0321】

【表9-4】

【0322】

【表9-5】

【0323】

上記の表８において、Ｎｌｅはノルロイシン残基であり、Ｈｓｅはホモセリン残基である。

【0324】

本開示及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変更、置換及び修飾を行うことができることを理解されたい。

【0325】

本開示は、例示のみを目的として与えられ、決して本開示を限定することを意図しない以下の実施例において更に例示される。

【実施例】

【0326】

実施例１：デュルバルマブ－ＩＬ２免疫サイトカインの調製
抗ＰＤ－Ｌ１抗体デュルバルマブ（イミフィンジ（登録商標））及び特注の組成物ＡＢを利用して、以下の方法で免疫サイトカインを調製した。

【0327】

デュルバルマブのコンジュゲーション可能なバリアントを、ＡＪＩＣＡＰ（商標）法（味の素バイオファーマサービス）を使用して調製した。この方法は、数週間以内に＞５０ｍｇのコンジュゲーション可能なデュルバルマブの産生を可能にする。コンジュゲーション可能な生成物は、更なる修飾（図２Ａ）のための１つ又は２つの化学的ハンドルを有する。

【0328】

ＡＪＩＣＡＰ（商標）方法論のための一般的なプロトコルは、少なくともＰＣＴ公開番号国際公開第２０１８１９９３３７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８８号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１９２４０２８７号、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０２００９０９７９号、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１，１８，４０５８－４０６６，ａｎｄ Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＩＣＡＰ：Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１９，５８，５５９２－５５９７、及び特に米国特許出願公開第２０２００１９０１６５号の実施例２～４に見出される。この方法論の一般的なプロトコルを以下に提供する。

【0329】

ＤＢＣＯコンジュゲーションハンドルを含む修飾抗体（例えば、デュルバルマブ等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体）は、米国特許出願公開第２０２００１９０１６５号の実施例２～４から修飾されたプロトコルを使用して調製される。簡潔には、Ｆｃ領域中のリジン残基側鎖に結合した遊離スルフヒドリル基を有するＰＤ－Ｌ１抗体を、抗体を、保護されたバージョンのスルフヒドリル基（例えば、チオエステル）をリジン残基に送達するように構成された親和性ペプチドと接触させることによって調製する。この反応を行うことができる例示的なペプチドは、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１，１８，４０５８－４０６６に報告されるように、以下に示され、抗体のＦｃ領域の残基Ｋ２４８においてＮＨＳエステルを介してスルフヒドリル基を選択的に結合する。

【0330】

【化35】

Ｆｃ領域の別の残基を標的とする別の親和性ペプチドは、ＡＪＩＣＡＰ（商標）技術について上に引用した参考文献に記載されており、そのような親和性ペプチドを使用して、所望の官能性をＦｃ領域の別の残基に結合させることができる（例えば、Ｋ２４６、Ｋ２８８等）。例えば、上記の親和性ペプチドのジスルフィド基を代わりにチオエステルで置き換えて、スルフヒドリル保護基を提供することができる（例えば、親和性ペプチドの関連部分は、

【0331】

【化36】

の構造を有するであろう）。

【0332】

次いで、保護基を除去して、遊離スルフヒドリルを露出させる（例えば、ＴＣＥＰによるジスルフィドの還元又はチオエステルの加水分解によって）。次いで、遊離スルフヒドリルを、連結基（例えば、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_４－アミド－ＤＢＣＯ）を介してＤＢＣＯコンジュゲーションハンドルに連結されたブロモアセトアミド又はブロモケトン基を含む二官能性試薬と反応させる。この方法は、存在する１つのＤＢＣＯ基（ＤＡＲ１）及び／又は抗体に結合した２つのＤＢＣＯ基（ＤＡＲ２、抗体の各Ｆｃに連結された１つのＤＢＣＯ基）を有する抗体を産生するために使用することができる。

【0333】

別の実施形態では、単一のＤＢＣＯコンジュゲーションハンドルを含む抗体は、保護基の適切な除去（例えば、ジスルフィド還元又はチオエステル切断）後に、過剰の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を適切に負荷された親和性ペプチドと最初に反応させて単一のスルフヒドリルを導入することによって調製される。次いで、スルフヒドリル反応性コンジュゲーションハンドル及びＤＢＣＯコンジュゲーションハンドル（例えば、ブロモアセトアミド－ｄＰＥＧ（登録商標）_４－アミド－ＤＢＣＯ）を有する二官能性連結基を、単一のスルフヒドリルと反応させて、単一のＤＢＣＯ含有抗体を生成する。次いで、単一ＤＢＣＯ含有抗体を、ＩＬ－２を含有する適切なアジド（例えば、ＣＭＰ－００３）とコンジュゲートさせて、ＤＡＲが１の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ－２イムノコンジュゲートを得る。

【0334】

分析逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）及び質量分析（Ｑ－ＴＯＦ）によって、デュルバルマブのコンジュゲーション可能なバリアントの純度及び同一性を確認した。非修飾のデュルバルマブ（上）及びデュルバルマブ＋ＤＢＣＯコンジュゲーションハンドル（下）の質量スペクトルプロファイル（Ｑ－ＴＯＦ）のプロファイルを図２Ｂに示す。

【0335】

デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲートの調製
１（ＤＡＲ１）又は２（ＤＡＲ２）の反応性ハンドルを有するデュルバルマブのコンジュゲーション可能なバリアントを、２～１０当量の組成物ＡＢ（ｐＨ５．２緩衝剤、５％トレハロース、ｒｔ、２４時間、図２Ｃ）と反応させた。得られたコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィ及び／又はサイズ排除クロマトグラフィによって精製して、組成物Ａを５０～６０％の収率で得た。

【0336】

２つのコンジュゲーションハンドル及び２つのペイロードを有する免疫サイトカインの三次元表示を図２Ｄに示す。
デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲートの精製及び特性評価

【0337】

デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲーションを、未反応の組成物ＡＢ及び凝集物から、脱塩カラム、ＣＩＥＸ及びＳＥＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＫＴＡ純粋、移動相：ヒスチジン５．２／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５％トレハロース、カラム：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００増加３．２／３００、流量：０．５ｍＬ／分）を用いて精製した。

【0338】

デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲートの純度及び同一性をＲＰ－ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００、カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ－４ ３００Ａ、３．０μｍ、４．６ｍｍ、２５０ｍｍ、移動相Ａ：水中０．０５％ＴＦＡ、移動相Ｂ：ＡＣＮ：ＩＰＡ：ＥＴＯＨ：Ｈ２Ｏの混合物中０．０５％ＴＦＡ（５：１．５：２：１．５）、流量：０．５ｍＬ／分、注入量：１０μｇ（１ｍｇ／ｍＬの１０μＬ注入）、勾配：５０分で０％～２０％の移動相Ｂ）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。 図２Ｅは、デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲート（組成物Ａ）の逆相クロマトグラフィ特性評価データを示す。図２Ｆは、デュルバルマブ－ＩＬ２コンジュゲート（組成物Ａ）の分析的サイズ排除クロマトグラフィ特性評価データを示す。

【0339】

認証試験

【0340】

【表10】

【0341】

実施例２：ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡアッセイ（図３）
非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体とＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）との相互作用をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。これらの研究のために、Ｃｏｒｎｉｎｇ高結合性ハーフエリアプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌの２５μｌの非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを１００μｌのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。プレート表面を２５μｌのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－１％ＢＳＡにより３７℃で１時間ブロッキングした。次いで、プレートを１００μｌのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの２５マイクロリットルの組換えビオチン化ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質（ＰＤ１－Ｈ８２Ｅ５－２５ＵＧ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）を、１８ｎＭから開始して０．００００１ｎＭまで７．５倍段階希釈でＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－０．１％ＢＳＡに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートを１００μｌのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－０．１％ＢＳＡに１：５００で希釈した２５マイクロリットルのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（＃ＲＡＢＨＲＰ３、Ｍｅｒｃｋ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを１００μｌのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。５０マイクロリットルのＴＭＢ基質試薬（番号ＣＬ０７、Ｍｅｒｃｋ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を各ウェルに添加し、３７℃で５分間インキュベートした。３７℃で５分後、５０μｌ／ウェルの０．５ＭのＨ_２ＳＯ_４停止溶液を添加することによって、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を停止した。次いで、ＥＬＩＳＡシグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍで測定した。

【0342】

図３は、非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体がＰＤ－Ｌ１リガンドと結合する能力を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸に正規化されたＥＬＩＳＡシグナルを示し、ｘ軸にビオチン化ＰＤ－Ｌ１タンパク質の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ、アベルマブ並びに組成物Ａ及びＢである。抗ＰＤ１抗体ペンブロリズマブも対照として使用した。

【0343】

実施例３：ＰＤ１－ＰＤＬ１阻止アッセイ（図４）
非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体がＰＤ１／ＰＤＬ１経路を妨害する能力を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻止バイオアッセイ（カタログ番号Ｊ１２５０，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して測定した。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻止バイオアッセイは、エフェクター細胞と免疫シナプスを模倣する標的細胞との共培養に基づく生物発光細胞ベースのアッセイである。ヒトＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターは、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞同族ＴＣＲを活性化するように設計された操作された細胞表面タンパク質によって活性化される。同時相互作用ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１はＴＣＲシグナル伝達を阻害し、ＮＦＡＴ－ＲＥ媒介性発光を抑制する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかを添加すると、阻害性シグナルが放出され、ＴＣＲ活性化が回復し、ＮＦＡＴ－ＲＥ発光レポーターのシグナルが増加する。

【0344】

簡潔には、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１標的細胞を白色組織培養９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩培養した。試験分子を、１μＭから開始して０．００２ｎＭまでの４倍連続希釈で測定し、新たに解凍したＰＤ－１Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を添加する前に標的細胞上で１０分間プレインキュベートした。３７℃／５％ＣＯ_２で６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬の添加によって活性ＮＦＡＴ－ＲＥ発光レポーターを評価し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製ＥＮＳＰＩＲＥ（登録商標）プレートリーダー（１秒／ウェル）で測定した。

【0345】

図４は、非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体がＰＤ１／ＰＤＬ１経路を妨害する能力を測定するプロットを示し、図は、エフェクター細胞ＮＦＡＴ－ＲＥレポーターの平均発光強度をｙ軸上に示し、非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量をｘ軸上に示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。この図で試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、プロロイキン及び組成物ＡＡである。この図は、コンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体がＰＤ１／ＰＤＬ１経路を妨害することができることを実証している。

【0346】

実施例４：ヒトＦｃＲｎ結合アッセイ（図５）
非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体と、ｐＨ６でのヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡＬ３０９５Ｃ）を使用して測定した。ＦｃＲｎ及びＩｇＧ結合のＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）検出は、ストレプトアビジン被覆ドナービーズ上に捕捉されたビオチン化ヒトＦｃＲｎと相互作用するためにＩｇＧ被覆ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）受容体ビーズを使用する。参照ＩｇＧがＦｃＲｎに結合すると、ドナー及び受容体ビーズが近接し、受容体ビーズ内のエネルギー移動反応のカスケードを引き起こす一重項酸素の移動を可能にし、６１５ｎｍでの発光の鋭いピークをもたらす。ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）混合物への遊離ＩｇＧ抗体の添加は、ＦｃＲｎの参照抗体への結合についての競合を生じさせ、シグナルの喪失をもたらす。

【0347】

簡潔には、試験分子を、５μＭから出発して６４ｐＭまで連続希釈で測定し、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝剤中の８００ｎＭの組換えビオチン化ヒトＦｃＲｎ、４０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧコンジュゲート化受容体ビーズ、及び４０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン被覆ドナービーズからなるＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）反応混合物とインキュベートした。２３℃、暗所で９０分後、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）シグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製プレートリーダー（６８０ｎｍで励起、６１５ｎｍで発光）で測定した。

【0348】

図５は、ｐＨ６でヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃＲｎ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【0349】

実施例５：ヒトＦｃＲｇ結合アッセイ（図６Ａ～図６Ｃ）
非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体と、ヒトＦｃγ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４）、ヒトＦｃγ受容体ＩＩ（ＦｃγＲＩＩａ／ＣＤ３２）及び低親和性ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＦｃγＲ３ａ／ＣＤ１６ Ｖ１５８との相互作用を、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）ヒトＦｃγＲ１／ＣＤ６４（ＡＬ３０８１Ｃ）、ＦｃγＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ １６７Ｈ（ＡＬ３０８６Ｃ）及びＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６ １７６Ｐ／Ｆ１５８（ＡＬ３４７ＨＶ）結合キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をそれぞれ使用して測定した。

【0350】

Ｆｃγ受容体及びＩｇＧ結合のＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）検出は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域被覆ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）受容体ビーズを使用して、ストレプトアビジン被覆ドナービーズ上に捕捉されたビオチン化ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩａと相互作用する。参照ＩｇＧがＦｃγ受容体に結合すると、ドナー及び受容体ビーズが近接し、受容体ビーズにおけるエネルギー移動反応のカスケードを引き起こす一重項酸素の移動を可能にし、６１５ｎｍでの発光の鋭いピークをもたらす。ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）混合物への遊離ＩｇＧ抗体の添加は、Ｆｃγ受容体の参照ＩｇＧ Ｆｃ領域への結合についての競合を生じさせ、シグナルの損失をもたらす。

【0351】

簡潔には、試験分子を、５μＭから４ｐＭまで連続希釈で測定し、４０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ Ｆｃコンジュゲート受容体ビーズ、及び４０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン被覆ドナービーズ並びに組換えビオチン化ヒトＦｃγＲＩ（２００ｎＭ）、ＦｃγＲＩＩａ（１２０ｎＭ）又はＦｃγＲＩＩＩａ（８ｎＭ）からなるＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）反応混合物とインキュベートした。暗所において２３℃で９０分後、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）シグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＥＮＳＰＩＲＥ（登録商標）プレートリーダー（６８０ｎｍで励起、６１５ｎｍで発光）で測定した。

【0352】

図６Ａは、ヒトＦｃγ受容体Ｉ（ＣＤ６４）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【0353】

図６Ｂは、ヒトＦｃγ受容体ＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩＩａ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【0354】

図６Ｃは、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合する非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の能力を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸上に平均ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＦｃγＲＩＩＩａ－ＩｇＧシグナルを示し、ｘ軸上に非修飾抗ＰＤＬ１抗体及びコンジュゲート抗ＰＤＬ１抗体の投与量を示す。この図で試験した非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体は、それぞれデュルバルマブ及び組成物Ａである。

【0355】

実施例６：ＩＬ２ ｐＳｔａｔ５活性化（図７～図８）
ヒトＴ細胞集団に対する様々なＩＬ－２ポリペプチドの効果を決定するために実験を行った。初代ｐａｎＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴｒｅｇＴ細胞）を、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）勾配遠心分離を使用する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）精製、引き続いて磁気ビーズでの陰性単離によって健康なドナーのバフィーコートから得て、その後使用するまで凍結保存した。ｐａｎＴ細胞を解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、１％ＮＥＡＡ、２５μＭβＭｅｏＨ、及び１％ＮａＰｙｒｏｖａｔｅ）で一晩回復させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞を２００，０００細胞／ウェルで分配し、開始濃度３１６ｎＭから３ｐＭまで下げて３７℃／５％ＣＯ_２で４０分間、抗ＰＤ１抗体にコンジュゲートされていない修飾ＩＬ－２ポリペプチド及びコンジュゲートされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドの３．１６倍連続希釈液で刺激した。インキュベーション後、細胞を、転写因子ホスホ緩衝剤キットを使用して固定し、透過処理し、その後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４５ＲＡ及びｐＳｔａｔ５についての表面免疫染色及び細胞内免疫染色を行って、細胞サブセットの同定及びＳｔａｔ５（シグナル伝達兼転写活性化因子５）リン酸化のレベルの測定を可能にした。ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）測定は、ＮＯＶＯＣＹＴＥ（登録商標）又はＡＣＥＡ（商標）のＱＵＡＮＴＥＯＮ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒのいずれかを用いて行った。

【0356】

以下のＴ細胞サブセットについてのｐＳｔａｔ５ ＭＦＩ（中程度の蛍光強度）シグナルを、修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は免疫サイトカインの濃度に対してプロットした。最大半量有効濃度（ＥＣ_５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、可変勾配、４パラメータ分析に基づいて計算した。

【0357】

【表11】

【0358】

図７は、ヒトＴ細胞のインビトロ試料におけるＴ_ｅｆｆ及びＴ_ｒｅｇ細胞の誘導に対する抗ＰＤＬ１抗体にコンジュゲートされていない修飾ＩＬ－２ポリペプチド及びコンジュゲートされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドの効果を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸上にリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５（ｐＳＴＡＴ５）についての平均蛍光強度を示し、ｘ軸上に修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び免疫サイトカインの投与量を示す。試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、組成物ＡＡである。この図で試験した免疫サイトカインは、組成物Ａ及び対照としてのＨｅｒ２標的化免疫サイトカイン組成物Ｆ（ＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体）である。

【0359】

図８は、過剰量の非コンジュゲート抗ＰＤ１抗体の存在下又は非存在下でのヒトＴ細胞のインビトロ試料における静止期ＣＤ８＋Ｔ_ｅｆｆ細胞の誘導に対する、抗ＰＤＬ１抗体にコンジュゲートされていない修飾ＩＬ－２ポリペプチド及びコンジュゲートされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドの効果を測定するプロットを示し、図は、ｙ軸上にリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５（ｐＳＴＡＴ５）についての平均蛍光強度を示し、ｘ軸上に修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び免疫サイトカインの投与量を示す。試験した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、組成物ＡＡである。この図で試験した免疫サイトカインは、組成物Ａ及び対照としてのＨｅｒ２標的化免疫サイトカイン組成物Ｆ（ＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体）である。

【0360】

実施例７：組成物ＡＢの合成
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて合成した個々のペプチドをライゲーションすることにより、残基Ｆ４２Ｙに結合したアジド－ＰＥＧ、Ｙ４５にＰＥＧ基を含み、配列番号３のアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド組成物ＡＢを合成した。個々のペプチドを、以下に記載される方法を使用して自動ペプチド合成装置で合成した。本明細書中に提供される関連する修飾ＩＬ－２を、類似のプロトコルを使用して合成した。

【0361】

市販の試薬をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｍｅｒｃｋ又はＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅから購入し、更に精製することなく使用した。固相ペプチド合成に適した側鎖保護基を有するＦｍｏｃアミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｈｒｉｓｔｏｆ Ｓｅｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＧ又はＰｅｐｔＡＲＴから購入し、供給されたまま使用した。ペプチド合成に使用したポリエチレングリコール誘導体は、Ｐｏｌｙｐｕｒｅにより購入した。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮを分析及び分取ＨＰＬＣ精製に使用した。

【0362】

ペプチド及びタンパク質の高分解能質量スペクトル（ＦＴＭＳ）を、マトリックスとして４－ヒドロキシ－α－シアノケイ皮酸（ＨＣＣＡ）を使用して、二重ＥＳＩ／ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ源を備えたＢｒｕｋｅｒ ｓｏｌａｒｉＸ（９．４Ｔ磁石）で測定した。ＣＤスペクトルは、１．０ｍｍ経路長セルを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－７１５分光計で記録した。スペクトルは、標準感度（１００ｍｄｅｇ）、０．５ｎｍのデータピッチ、５０ｎｍ／分の走査速度、１ｎｍの帯域幅及び５回の蓄積で連続走査モードで２５℃で収集した。

【0363】

ペプチド及びタンパク質断片を逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分析及び精製した。ペプチド分析及び反応モニタリングは、デュアルポンプ、ミキサー及びインライン脱気装置、オートサンプラー、可変波長ＵＶ検出器（２２０ｎｍ及び２５４ｎｍでの溶離液の同時モニタリング）及び１００μｌ注入ループを備えた注入器を備えた分析Ｊａｓｃｏ機器で行った。ペプチド断片の精製は、２０ｍＬ注入ループを備えたＧｉｌｓｏｎ分取装置で行った。両方の場合において、移動相は、０．１％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏ（緩衝剤Ａ）及び０．１％ＴＦＡを含むＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ（緩衝剤Ｂ）であった。分析ＨＰＬＣは、ｂｉｏＺｅｎ（商標）ＩｎｔａｃｔＣ４カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）又はＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＭＧ ＩＩＩ（５μｍ、１５０×４．６ｍｍ）カラムで、流速１ｍＬ／分で行った。分取ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、内径５０ｍｍ×２５０ｍｍ）で４０ｍＬ／分の流速で行った。

【0364】

ペプチドセグメントは、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ化学を使用して、Ｓｙｒｏ Ｉ又はＣＳ Ｂｉｏ １３６Ｘペプチド合成装置で合成した。側鎖保護基を有する以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ。Ｆｍｏｃ－シュードプロリンジペプチドを必要に応じて合成に組み込んだ。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ脱保護を行い（２×８分）、フィードバックループを用いて３０４ｎｍのＵＶで監視して完全なＦｍｏｃ除去を確実にした。カップリングは、室温又は５０℃で、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（樹脂置換に対して３．０～５．０当量）、カップリング試薬としてＨＣＴＵ又はＨＡＴＵ（２．９～４．９当量）及びＤＩＰＥＡ又はＮＭＭ（６～１０当量）を含むＤＭＦを用いて行った。３分間予備活性化した後、溶液を移し、アミノ酸に応じて３０分間又は２時間、樹脂上のペプチドと反応させた。場合によっては、二重結合が必要であった。カップリング後、未反応の遊離アミンをキャッピングするために、樹脂をＤＭＦ中２０％無水酢酸で処理した。必要に応じてＬｉＣｌ洗浄を行った。アリルエステルの脱保護は、フェニルシラン（２４当量）及びパラジウム（０）テトラキス（トリフェニルホスフィン）（０．５当量）を含む無水ジクロロメタンを用いて行った。

【0365】

ＳＰＰＳによるペプチドセグメントの合成を、微小切断及び対応する樹脂の分析によって監視した。９５：２．５：２．５のＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏ（α－ケト酸樹脂上で合成されたα－ケト酸セグメント）又は９５：２．５：２．５のＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（２－クロロトリチルポリスチレン樹脂上で合成されたペプチド）の混合物を２時間使用して、ペプチドを樹脂から切断した。樹脂を濾別し、濾液を蒸発させ、冷ジエチルエーテルで処理し、研和し、遠心分離した。エーテル層を慎重にデカントし、残渣をジエチルエーテルに再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返した。

【0366】

１．１ ＩＬ－２の組成物ＡＢバリアントの合成
ＩＬ－２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成

【0367】

【化37】

【0368】

ＩＬ２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸（配列番号３を参照のこと）を、０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有する保護されたＦｍｏｃ－α－Ｌｅｕ－ケト酸を予め充填したＲｉｎｋ－アミド樹脂上で合成した。そうするために、Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（４ｇ）をＤＭＦ中で１５分間予備膨潤させ、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。Ｆｍｏｃ－ロイシン保護α－ケト酸（７９５ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＭＦ４０ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（３６１ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、０．９５当量）及びＤＩＰＥＡ（３４８μＬ、２ｍｍｏｌ、２．００当量）で予備活性化した。カップリングを室温で６時間進行させた。次いで、樹脂をキャップした後、Ｆｍｏｃ脱保護した。セグメントの合成は、一般的方法のセクションに記載の手順を使用して、自動化Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによってＡｌａ１まで０．２５０ｍｍｏｌスケールアップで行った。ペプチド合成の進行を、（９５：２．５：２．５）ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏの混合物を１．５時間使用して微小切断及び分析を行うことによって監視した。ＨＰＬＣ分析を６０℃でＣ１８カラムで行った。一般的な方法に記載の手順に従って、９５：２．５：２．５ ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏ（１５ｍＬ／ｇ樹脂）の混合物を用いて２時間、樹脂からペプチドを切断した。粗ＩＬ２（１－３９）の精製を、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）を使用し、０．１％ＴＦＡを含む３０から８０％ＣＨ_３ＣＮの勾配で３０分間の分取ＨＰＬＣによって行った。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させて、６５０ｍｇの純粋なＩＬ２（１－３９）１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸（ペプチド合成、樹脂切断及び精製工程の収率６９％）を得た。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_２０４Ｈ_３４６Ｎ_５６Ｏ_６１［Ｍ］について計算されたｍ／ｚ：４５５６．５６９４、測定値：４５５６．５７８３。

【0369】

組成物ＡＢのＯｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）光保護Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成

【0370】

【化38】

【0371】

Ｏｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）（配列番号３を参照のこと）光保護Ｌｅｕ－α－ケト酸セグメントを、０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－ロイシン－光保護α－ケト酸をプレロードしたＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上で調製した。そうするために、４ｇのＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂をＤＭＦで１５分間膨潤させ、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。Ｆｍｏｃ－ロイシン－光保護α－ケト酸（７９５ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＭＦ４０ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（３６１ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、０．９５当量）及びＤＩＰＥＡ（３４８μＬ、２ｍｍｏｌ、２．００当量）で予備活性化した。反応物を室温で６時間撹拌した。次いで、樹脂をキャップした後、Ｆｍｏｃ脱保護した。セグメントの合成は、一般的方法のセクションに記載の手順を用いて、自動化Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによって０．１５１ｍｍｏｌスケールでＮｌｅ４６まで行った。Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（樹脂に対して１０当量）を、ＤＩＣ（樹脂に対して５当量）を用いて室温で２時間、対称無水物法によるＣｙｓ５８のカップリングに使用した。予め形成されたアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（Ａｃ０．５ｋＤａＰＥＧ）－ＯＨ（３当量）を、ＨＡＴＵ（２．９当量）及びＤＩＰＥＡ（６当量）を使用した単一カップリングによって４５位にカップリングした。Ｐｈｅ４４及びＬｙｓ４３を自動化ＳＰＰＳによってカップリングさせ、続いてＦｍｏｃ Ｔｙｒ－アリルアセタート及びＢｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンをそれぞれ４２及び４１の位置で手動カップリングさせた。アリルエステルの脱保護は、フェニルシラン（４４９μＬ、３、６ｍｍｏｌ、２４当量）及びＰｄ（Ｐｈ_３）_４（８７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、０．５当量）を用いて、室温で３０分間、確立された標準条件に従って行った。脱保護後、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール（２３７ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ、３当量）を５０℃で１．５時間カップリングした。ペプチド合成の進行を、（９５：２．５：２．５）ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏの混合物を１．５時間使用して微小切断及び分析を行うことによって監視した。ＨＰＬＣ分析を６０℃でＣ１８カラムで行った。一般的な方法に記載の手順に従って、９５：２．５：２．５ ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏ（１５ｍＬ／ｇ樹脂）の混合物を用いて２時間、樹脂からペプチドを切断した。冷エーテル：ペンタン混合物（１：１）を使用して、粗ペプチドを処理及び洗浄した。粗ＩＬ２（４２～６９）の精製を、２段階勾配を用いたＳｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）を用いる分取ＨＰＬＣによって行った：最初に、５分で０．１％ＴＦＡを含むＭＱ－Ｈ_２Ｏ中の１０～３０％ＣＨ_３ＣＮ、次いで３０分で０．１％ＴＦＡを含むＭＱ－Ｈ_２Ｏ中の３０～６０％ＣＨ_３ＣＮ。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させて、１１７．４ｍｇの純粋なＩＬ２（４２－６９）を得た（ペプチド合成、樹脂切断及び精製工程の収率１６％）。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_２３０Ｈ_３７６Ｎ_４６Ｏ_７４Ｓ［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：４９９８．６７９４、測定値４９９８．６７４９。

【0372】

組成物ＡＢのＦｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸の合成

【0373】

【化39】

【0374】

Ｆｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－フェニルアラニン－α－ケト酸は、約０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－プロトン化α－ケト酸を予め充填したＲｉｎｋＡｍｉｄｅＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上で合成した。カップリング試薬としてＨＣＴＵを使用して、Ａｌａ７３までの自動化ＦｍｏｃＳＰＰＳによって０．５８８ｍｍｏｌ規模で合成を行った。残基７２、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕのカップリングは、カップリング試薬としてＨＡＴＵを用いて行った。カップリングを４５℃で更に２回繰り返して、完全なカップリングを確実にした。ＨＡＴＵ（樹脂に対して２．９５当量）及びＮＭＭ（樹脂に対して６．００当量）を用いて室温で２時間、Ｆｍｏｃ－５－オキサプロリン（樹脂に対して３．００当量）を遊離アミンに手動でカップリングさせた。ペプチド合成の進行を、（９５：２．５：２．５）ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏの混合物を２時間使用して微小切断及び分析を行うことによって監視した。ＨＰＬＣ分析を６０℃でＣ１８カラムで行った。９５：２．５：２．５ＴＦＡ：ＤＯＤＴ：Ｈ_２Ｏ（１５ｍＬ／ｇ樹脂）の混合物を２．０時間使用して、ペプチドを樹脂から切断した。粗セグメントの精製は、６０℃で予熱したＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）を使用し、０．１％ＴＦＡを含む２０から７５％ＣＨ_３ＣＮの勾配で３０分で分取ＨＰＬＣによって行った。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させて、Ｆｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸を９８％超の純度（合成、切断及び精製工程について１４７．９ｍｇ、収率６％）で得た。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_１８４Ｈ_２８５Ｎ_４７Ｏ_５３［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：４００１．１０５１、測定値４００１．１２２７。

【0375】

Ｏｐｒ－ＩＬ２（１０５－１３３）の合成

【0376】

【化40】

【0377】

Ｏｐｒ－ＩＬ２（１０５～１３３）を、０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨを予め充填した２－クロロトリチル樹脂上で合成した。キャッピング（ジイソプロピルエチルアミン、メタノール）後、Ｇｌｕ１０６までの自動化Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによって０．３４ｍｍｏｌスケール（樹脂１．５ｇ）で合成を行った。Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（樹脂に対して１０当量）を、ＤＩＣ（樹脂に対して５当量）を用いて室温で２時間、対称無水物法によるＣｙｓ１０５のカップリングに使用した。次いで、Ｂｏｃ－５－オキサプロリン（樹脂に対して２．００当量）を、ＨＡＴＵ（１．９５当量）及びＮＭＭ（４当量）を使用して遊離アミンオン樹脂にカップリングした。ペプチド合成の進行を、（９５：２．５：２．５）ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏの混合物を１．５時間使用して微小切断及び分析を行うことによって監視した。ＨＰＬＣ分析を６０℃でＣ１８カラムで行った。９５：２．５：２．５ ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（１５ｍＬ／ｇ樹脂）の混合物を２．０時間使用して、ペプチドを樹脂から切断した。粗Ｏｐｒ－ＩＬ２（１０５～１３３）の精製を、６０℃で予熱したＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ４カラム（５０×２５０ｍｍ）を使用し、１０分で０．１％ＴＦＡを含む１０から６５％ＣＨ_３ＣＮ、次いで２０分で０．１％ＴＦＡを含む６５から９５％ＣＨ_３ＣＮの勾配で分取ＨＰＬＣによって行った。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させて、９８％超の純度（１０８．５ｍｇ、合成、切断及び精製工程について収率９％）のＯｐｒ－ＩＬ２（１０５～１３３）を得た。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_１５８Ｈ_２４２Ｎ_３７Ｏ_５２Ｓ［Ｍ＋Ｈ］のｍ／ｚ計算値：３５２１．７１４５、実測値３５２１．７１４０。

【0378】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＡＢのＩＬ２－Ｓｅｇ１２の合成

【0379】

【化41】

【0380】

ＫＡＨＡライゲーション：Ｓｅｇ１（４４ｍｇ、９．６μｍｏｌ、１．２当量）及びＳｅｇ２（４０ｍｇ、８．０μｍｏｌ、１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（４００μＬ、２０ｍＭ）を含有するＤＭＳＯ：Ｈ_２Ｏ（９：１）に溶解し、６０℃で２０時間反応させた。 ライゲーションバイアルをアルミニウム箔に包むことによって光から保護した。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ）を用いて、移動相として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを用いて、７分で５から９５％のＣＨ_３ＣＮの勾配で、６０℃でｕＨＰＬＣによって監視した。

【0381】

光脱保護及び精製：ライゲーションの完了後、混合物を、０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で約２０倍（８ｍＬ）に希釈し、３６５ｎｍの波長で１時間照射した。光分解反応の完了は、前述の方法を使用してｕＨＰＬＣに試料を注入することによって確認した。光脱保護された試料を、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）を６０℃に保ち、２段階勾配：水中のＣＨ_３ＣＮの二重勾配：０．１％ＴＦＡ：５分で１０から３５％、次いで３５分で３５から６５％、溶離液として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ及びＭＱ－Ｈ_２Ｏを用いて４０ｍＬ／分の流量で、分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて、純粋なＳｅｇ１２（ライゲーション及び精製工程について２５．４ｍｇ、収率４０％）を得た。Ｃ_４２２Ｈ_７０９Ｎ_１０１Ｏ_１３０Ｓ［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：９３０４．１６９４、測定値９３０４．１６３９。

【0382】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＡＢのＩＬ２－Ｓｅｇ３４の調製のためのＫＡＨＡライゲーション

【0383】

【化42】

【0384】

ライゲーション：Ｓｅｇ３（１３６ｍｇ、３４μｍｏｌ、１．２当量）及びＳｅｇ４（１００ｍｇ、２８．４０μｍｏｌ、１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（１．８ｍＬ、１５ｍＭ）を含有するＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ（９：１）に溶解し、６０℃で１６時間反応させた。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、移動相として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを使用し、７分で３０から７０％ＣＨ_３ＣＮの勾配で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラム（１５０×４．５６ｍｍ）を使用する６０℃でのｕＨＰＬＣによって監視した。

【0385】

Ｆｍｏｃ脱保護及び精製：ライゲーションの完了後、反応混合物をＤＭＳＯ（６ｍＬ）で希釈し、５％のジエチルアミン（３００μＬ）を添加し、反応混合物を室温で７分間振盪した。精製用の試料を調製するために、ＴＦＡ（３００μＬ）を含有するＤＭＳＯ（４ｍＬ）で希釈した。

【0386】

試料を、６０℃に保ったＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）で、０．１％ＴＦＡを含む水中３０から７０％ＣＨ_３ＣＮの勾配を用い、４０ｍＬ／分の流量で３５分間、分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて、純粋なＳｅｇ３４（ライゲーション及び精製後に４３．４ｍｇ、収率２１％）を得た。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_３２６Ｈ_５１６Ｎ_８４Ｏ_１０１Ｓ［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：７２５５．７５４５、測定値：７２５５．７６５３。
ＫＡＨＡライゲーションによるＩＬ２直鎖タンパク質組成物ＡＢの調製のための最終的なＫＡＨＡライゲーション。

【0387】

ライゲーション：Ｓｅｇ１２（５９．２ｍｇ、６．３５μｍｏｌ、１．２当量）及びＳｅｇ３４（３８．５ｍｇ、５．３μｍｏｌ、１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（４２３μＬ、１５ｍＭ）を含有するＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ（９：１）に溶解し、ライゲーションを６０℃で２４時間進行させた。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、６０℃でＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）及び移動相として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを使用して、１４分で３０から９５％ＣＨ_３ＣＮの勾配で分析ＨＰＬＣによって監視した。

【0388】

精製：ライゲーションの完了後、反応混合物を１５０μＬのＤＭＳＯで希釈し、続いて０．１％ＴＦＡ（７ｍＬ）を含有する（１：１）ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏの混合物で更に希釈した。試料を、６０℃で予熱したＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣに注入することによって精製し、２段階勾配：５分で１０から４０％及び３５分で４０から８０％、流速：溶離液として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ及びＭＱ－Ｈ_２Ｏを用いて４０ｍＬ／分であった。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍを含む純粋な組成物ＡＢ直鎖タンパク質を得た（４２．３ｍｇ、ライゲーション及び精製工程について収率４８％）。分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用して、生成物の純度及び正確な質量を確認した。Ｃ_７４７Ｈ_１２２５Ｎ_１８５Ｏ_２２９Ｓ_２［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：１６５１５．９３４０、測定値１６５１５．９００８。

【0389】

Ａｃｍ脱保護：Ａｃｍを有するペプチドＩＬ２直鎖タンパク質（３５．４ｍｇ、２．１４μｍｏｌ）をＡｃＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）（８．６ｍＬ、０．２５ｍＭ）に溶解し、８６ｍｇのＡｇＯＡｃ（１％ｍ／ｖ）を溶液に添加した。混合物を光から保護して５０℃で２．５時間振盪した。ＨＰＬＣによって確認される反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（１：１）で希釈し、６０℃に保たれたＳｈｉｓｅｉｄｏ ＣａｐＣｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用する分取ＨＰＬＣによって精製した。２段階勾配を精製のために使用した：５分で１０から４０％及び３０分で４０から９５％、流速：１０ｍＬ／分、溶離液として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ及びＭＱ－Ｈ_２Ｏ。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なＩＬ２直鎖タンパク質（脱保護及び精製工程については２６．１ｍｇ、収率７４％）を得た。Ｃ_７４１Ｈ_１２１５Ｎ_１８３Ｏ_２２７Ｓ_２［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：１６３７３．８５９７、測定値：１６３７３．８２５３

【0390】

フォールディングされたＩＬ－２組成物ＡＢの合成

【0391】

【化43】

【0392】

直鎖タンパク質の再編成：直鎖タンパク質（２０ｍｇ、１．２２１μｍｏｌ）を、０．１ＭのＴｒｉｓ及び３０ｍＭの還元型グルタチオン（８１ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭのＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、これを６ＭのＨＣｌ水溶液によってｐＨ８．０に調整した。混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪し、２５℃でｂｉｏＺｅｎ（商標）３．６μｍ Ｉｎｔａｃｔ Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ）を使用する分析逆相ＨＰＬＣによって、０．１％ＴＦＡを含むＭＱ－Ｈ_２Ｏ中３０から９５％ＣＨ_３ＣＮの勾配で１８分、流速：１．０ｍＬ／分で監視した。

【0393】

直鎖再構成タンパク質のフォールディング：前の溶液を室温に冷却し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオンを含有する第２緩衝溶液（２４０ｍＬ）でｐＨ８．０に３倍希釈した。混合物を室温で保存し、ｂｉｏＺｅｎ（商標）３．６μｍ Ｉｎｔａｃｔ Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ）を使用した分析ＨＰＬＣにより２５℃で、１８分で０．１％ＴＦＡを含む３０から９５％アセトニトリルの勾配で、流速：１．０ｍＬ／分で監視した。２０時間後、フォールディング溶液を１０％ＴＦＡ水溶液で約ｐＨ３に酸性化し、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＰｒｏｔｅｏｎａｖｉＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を用い、０．１％ＴＦＡを含む５から４０から９５％アセトニトリルの二段階勾配で６０分、流速：１０．０ｍＬ／分で分取ＨＰＬＣで精製した。フォールディングされたＩＬ２タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、凍結乾燥した。純粋なフォールディングされたタンパク質（３．５ｍｇ、収率１８％）の純度及び同一性を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及び高分解能ＥＳＩ質量分析によって更に確認した。Ｃ_７４１Ｈ_１２１３Ｎ_１８３Ｏ_２２７Ｓ_２［Ｍ］のｍ／ｚ計算値：１６３７１．８４４１、測定値：１６３７１．８１０７、組成物ＡＢの合成の成功を確認した。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】