特表 2024-529308 細胞、組織又は臓器を保存するための単離されたミトコンドリアを含む組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】細胞、組織又は臓器を保存するための単離されたミトコンドリアを含む組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240730BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500483

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2024-02-29

(86)【国際出願番号】 KR2022010765

(87)【国際公開番号】W WO2023003418

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】10-2021-0097204

(32)【優先日】2021-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】521466954

【氏名又は名称】パエアン バイオテクノロジー インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＡＥＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】カン， ヨン‐チョル

(72)【発明者】

【氏名】ハン， キュボム

(72)【発明者】

【氏名】キム， チュン‐ヒュン

(72)【発明者】

【氏名】イ， ホン ギュ

(72)【発明者】

【氏名】キム， スミン

(72)【発明者】

【氏名】タノト， ヘンドラ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， イン ホア

(72)【発明者】

【氏名】リン， ジ ジュン

(72)【発明者】

【氏名】チェ， ホイ シン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065BB07

4B065BB08

4B065BB12

4B065BB25

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、単離されたミトコンドリアを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存するための保存液組成物；及びこれを使用して、単離された細胞、組織又は臓器を保存する方法に関する。本発明の保存液組成物は、単離された細胞、組織又は臓器の活性を維持したまま、優れた長期保存性を有する。したがって、本発明は、最終的に移植成功率を向上させるために移植医療分野で、そして再生医療分野等において、効果的に利用することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたミトコンドリアを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存するための保存液組成物。

【請求項2】

前記ミトコンドリアが、血小板、筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、幹細胞又は粘膜細胞から得られる、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項3】

前記組成物が、ヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタレートからなる群から選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項4】

前記組成物が、単離されたミトコンドリアと、ヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタレートからなる群から選択される少なくとも１種との混合物を含む、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項5】

前記組成物中の単離されたミトコンドリアの濃度が０．０１μｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項6】

前記組成物中のヒスチジンの濃度が１ｍＭ～５００ｍＭである、請求項３又は４に記載の保存液組成物。

【請求項7】

前記組成物中のトリプトファンの濃度が１μＭ～１００ｍＭである、請求項３又は４に記載の保存液組成物。

【請求項8】

前記組成物中のケトグルタレートの濃度が１μＭ～１００ｍＭである、請求項３又は４に記載の保存液組成物。

【請求項9】

前記細胞、組織又は臓器が、哺乳類に由来する細胞、組織又は臓器である、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項10】

前記哺乳類がヒトである、請求項９に記載の保存液組成物。

【請求項11】

前記細胞、組織又は臓器が生体への移植のためのものである、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項12】

前記臓器が心臓、肝臓、腎臓、小腸、胃、膵臓、肺、胆嚢、神経、皮膚、血管、歯、目及び角膜から選択されるいずれか１種である、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項13】

前記組成物が灌流又は再灌流のためのものである、請求項１に記載の保存液組成物。

【請求項14】

単離された細胞、組織又は臓器を、単離されたミトコンドリアを含む保存液組成物の存在下で保管することを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存する方法。

【請求項15】

前記保管が冷蔵状態で行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記保管が最長で１０日間行われる、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、単離されたミトコンドリアを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存するための保存液組成物；及びこれを使用して、単離された細胞、組織又は臓器を保存する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

臓器移植とは、機能不全の組織又は臓器を別の正常な組織又は臓器に置き換えることをいう。１９８０年代に免疫抑制剤が開発されたことで、臓器移植手術の成功率は上昇し、今日に至るまで優れた臓器移植手術法が開発されている。加えて、２０２０年に韓国で「臓器移植法」が施行されてから、脳死の人からの臓器提供による臓器移植手術が急増した。

【0003】

ドナーから単離された組織又は臓器の機能を体外で長期間維持することは難しいため、できるだけ早く移植すれば生体への移植の成功率が高くなる。しかし、残念ながら、単離された組織又は臓器を移植を必要とする患者の元に届けるのには時間がかかり、最終的には組織又は臓器が使用できなくなったり、移植された組織又は臓器の機能が低下したりするという問題がある。単離された組織又は臓器の機能を損なうことなく組織又は臓器を保存できれば、組織又は臓器の輸送がより一層容易になり、患者は移植の準備をすることができ、貴重な組織又は臓器が廃棄されることがなくなり、生体への移植の成功率も高めることができる。近年、組織及び臓器を保存する研究が行われている（国際公開第２０２１－００７２７５号）。

【0004】

しかし、単離された組織又は臓器の活性を長期間維持できる保存液又は保存装置の開発はまだ不十分である。したがって、単離された組織又は臓器の生物学的機能を維持し、単離された組織又は臓器を長期間保存できる保存液又は保存装置の開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

そこで、本発明者らは、単離された細胞、組織又は臓器を長期間保存できる保存液の開発を試みた。その結果、単離されたミトコンドリアを含む保存液は、単離された細胞、組織又は臓器の活性を長期間維持できることを確認した。したがって、本発明者らは、細胞、組織又は臓器の保存に効果的に使用できる保存液を開発した。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明の一態様において、単離されたミトコンドリアを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存するための保存液組成物を提供する。

【0007】

本発明の別の態様において、単離された細胞、組織又は臓器を、単離されたミトコンドリアを含む保存液組成物の存在下で保管することを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存する方法を提供する。

【発明の効果】

【0008】

本発明の単離されたミトコンドリアを含む保存液は、単離された細胞、組織又は臓器の活性を維持したまま、上記細胞、組織又は臓器を長期間保存することができる。したがって、移植のための生体の組織の活性を維持することができ、最終的に、移植の成功率が上がる可能性が高くなる。したがって、本発明の単離されたミトコンドリアを含む保存液は、移植医療分野だけでなく、再生医療分野でも産業上の利用可能性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ミトコンドリア含有ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタレート（ＨＴＫ）液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した単離された心臓についての正規化灌流液量対時間（ｈ）を表すグラフである。

【図2】単離された心臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合の保管時間（ｈ）別の筋原線維細胞の画像を示す。

【図3】ミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した後の単離された臓器の画像を示す。

【図4】単離された腎臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合の上記腎臓におけるＡＣＥ２酵素活性レベルを解析した結果を表すグラフである。

【図5】単離された心筋細胞を、ミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）（商標）で染色したミトコンドリアあり又はなしのＨＴＫ液に保管した後、ミトコンドリアの動きを確認した結果を表す共焦点顕微鏡写真である。ここで、ｈＰｌ－ｍｉｔｏはヒト血小板由来ミトコンドリアを指す。

【図6】単離された心筋細胞をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した後、心筋細胞の生存率の上昇の程度を確認した結果と、ＷＳＴ－１アッセイ測定の結果を表した図である。

【図7】単離された心筋細胞をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した後、心筋細胞の生存率の上昇の程度を確認した結果と、細胞内ＡＴＰ測定の結果を表した図である。

【図8】単離された心臓組織をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した後、心臓組織内におけるミトコンドリアの動きを確認した結果を表す共焦点顕微鏡写真である。

【図9】単離された心臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合の心臓におけるＡＴＰ合成酵素活性レベルを解析した結果を表すグラフである。

【図10】単離された心臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合の心臓におけるクエン酸合成酵素活性のレベルを解析した結果を表すグラフである。

【図11】単離された腎臓をミトコンドリアを様々な濃度で含有するミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した場合の腎臓におけるＡＣＥ２酵素活性レベルを解析した結果を表すグラフである。

【図12】単離された腎臓を活性化又は不活化した各種由来ミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した場合の腎臓におけるＡＣＥ２酵素活性レベルを解析した結果を表すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

ミトコンドリアを含む保存液組成物
本発明の一態様において、単離されたミトコンドリアを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存するための保存液組成物を提供する。

【0011】

本明細書で用いる場合、「ミトコンドリア」という用語は、エネルギー源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成と制御に関与する、真核細胞の生存に不可欠な細胞小器官である。ミトコンドリアは、細胞シグナル伝達、細胞分化、細胞死並びに細胞周期及び細胞成長の制御など、生体内での様々な代謝経路に関与している。

【0012】

本明細書で用いる場合、「単離されたミトコンドリア」という用語は、自家、同種又は異種の供給源から得られたミトコンドリアを指すことができる。

【0013】

本明細書で用いる場合、「自家ミトコンドリア」という用語は、同じ対象者の組織又は細胞から得られたミトコンドリアのことをいう。加えて、「同種ミトコンドリア」という用語は、対象者と同じ種に属し、対立遺伝子に関して異なる遺伝子型を有する別の対象者の組織又は細胞から得られたミトコンドリアのことをいう。加えて、「異種ミトコンドリア」という用語は、異なる種に属する対象者の組織又は細胞から得られたミトコンドリアのことをいう。

【0014】

この場合、対象者は哺乳類であってもよく、好ましくはヒトであってもよい。

【0015】

ミトコンドリアは対象者の組織又は細胞から単離することができる。例えば、ミトコンドリアは、体細胞、生殖細胞又は幹細胞から得ることができる、若しくは血液細胞又は血小板から単離することができる。加えて、ミトコンドリアは、正常なミトコンドリア生物活性を有する細胞から得られる正常なミトコンドリアでもよい。加えて、ミトコンドリアは、生体外で培養された自己細胞又は同種細胞から得ることができる。

【0016】

本明細書で用いる場合、「細胞」という用語は、細胞膜に囲まれた細胞質からなり、タンパク質や核酸などの生体分子を含む、生体を構成する構造的又は機能的単位のことをいう。細胞とは、細胞膜の内側にミトコンドリアを有する細胞のことをいう。

【0017】

本明細書で用いる場合、「体細胞」という用語は、生物を構成する細胞のことをいい、生殖細胞は除く。体細胞は、筋細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、粘膜細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１種でもよい。好ましくは、体細胞は優れたミトコンドリア活性を有する筋細胞又は肝細胞から得ることができる。加えて、体細胞は自己又は同種の血液ＰＢＭＣ細胞から得ることができる。

【0018】

本明細書で用いる場合、「血小板」という用語は、血液の有形成分である血液細胞の一種のことをいう。血小板は骨髄で生成され、血管や組織が損傷した後の止血及び血液凝固に重要な役割を果たしている。ミトコンドリアは自己又は同種血小板から得ることができる。

【0019】

本明細書で用いる場合、「生殖細胞」という用語は、生殖に関与する細胞であり、有性生殖を行う生物の配偶子である精子及び卵子、並びにこれらの発生のすべての段階にある先祖細胞を含む。ミトコンドリアは、自己又は同種の生殖細胞から得ることができる。生殖細胞は精子又は卵子でもよい。

【0020】

本明細書で用いる場合、「幹細胞」という用語は、様々な種類の組織細胞に分化する能力を持つ未分化細胞のことをいう。幹細胞は、間葉系幹細胞、成体幹細胞、脱分化幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、角膜縁幹細胞、組織由来幹細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１種でもよい。

【0021】

この場合、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤、滑液、精巣、骨膜及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１種でもよい。好ましくは、間葉系幹細胞はヒト臍帯に由来することができる。

【0022】

加えて、ミトコンドリアは、対象者から単離された、又は生体外で培養された細胞又は組織サンプルを濃縮し破壊することによって得ることができる。加えて、ミトコンドリアは、冷凍保管後に解凍した細胞又は組織サンプルを破壊することによって得ることができる。

【0023】

加えて、ミトコンドリアは、冷凍乾燥した、冷凍保管した、又は冷凍保管後に解凍した細胞又は組織サンプルから得られたものであってもよいが、得られたミトコンドリアの生物活性に悪影響を及ぼさない限り特に限定されない。

【0024】

加えて、ミトコンドリアは損傷を受けておらず、正常な生物学的活性を持ち得る。具体的には、正常な生物学的活性を有するミトコンドリアは、（ｉ）膜電位を有すること、（ｉｉ）ミトコンドリア内でＡＴＰを生成すること及び（ｉｉｉ）ミトコンドリア内でＲＯＳを除去するかＲＯＳの活性を低下させること、からなる群から選択される１種又は複数の特性を有することができる。

【0025】

保存液組成物は、ヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタレートからなる群から選択される少なくとも１種をさらに含むことができる。

【0026】

ケトグルタレートは、アルファ－ケトグルタレートでもよい。

【0027】

組成物は、単離されたミトコンドリアと、ヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタレートからなる群から選択される少なくとも１種との混合物を含むことができる。

【0028】

組成物中の単離されたミトコンドリアの濃度は、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約９０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ又は約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬでもよい。

【0029】

組成物中のヒスチジンの濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約７５ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１７５ｍＭ～約５００ｍＭ、約１９８ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ又は約１００ｍＭ～約１９８ｍＭでもよい。

【0030】

組成物中のトリプトファンの濃度は、約１μＭ～約１００ｍＭ、約１μＭ～約９０ｍＭ、約１μＭ～約８０ｍＭ、約１μＭ～約７０ｍＭ、約１μＭ～約６０ｍＭ、約１μＭ～約５０ｍＭ、約１μＭ～約４０ｍＭ、約１μＭ～約３０ｍＭ、約１μＭ～約２０ｍＭ、約１μＭ～約１０ｍＭ、約１μＭ～約５ｍＭ、約１０μＭ～約１０ｍＭ、約１００μＭ～約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約１０ｍＭ又は約２ｍＭ～約１０ｍＭでもよい。

【0031】

組成物中のケトグルタレートの濃度は、約１μＭ～約１００ｍＭ、約１μＭ～約９０ｍＭ、約１μＭ～約８０ｍＭ、約１μＭ～約７０ｍＭ、約１μＭ～約６０ｍＭ、約１μＭ～約５０ｍＭ、約１μＭ～約４０ｍＭ、約１μＭ～約３０ｍＭ、約１μＭ～約２０ｍＭ、約１μＭ～約１０ｍＭ、約１μＭ～約５ｍＭ、約１０μＭ～約１０ｍＭ、約１００μＭ～約１０ｍＭ、約２５０μＭ～約１０ｍＭ、約５００μＭ～約１０ｍＭ、約７５０μＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ又は約１ｍＭ～約２ｍＭでもよい。

【0032】

加えて、保存液組成物は、単離された細胞、組織又は臓器を長期保存するための冷蔵保管液や冷凍保存液をさらに含むことができる。

【0033】

冷蔵保管液は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）及びデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含むことができる。ＨＥＳは、テトラヒドロキシエチルスターチ（Ｔ－ＨＥＳ）、ペンタヒドロキシエチルスターチ（Ｐ－ＨＥＳ）又はヘキサヒドロキシエチルスターチ（Ｈ－ＨＥＳ）でもよいが、これらに限定されない。

【0034】

冷蔵保管液は、必須アミノ酸、インスリン及びグルコースをさらに含むことができるが、これらに限定されない。

【0035】

冷凍保存液は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。冷凍保存液はＤＭＥＭ又はＭＥＭなどの細胞培養培地及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ又はＰＢＳなどの生理的緩衝液を含むことができる。

【0036】

具体的には、冷凍保存液は、アセトアミド、アガロース、アルギネート、１－アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリスリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α－グリセロリン酸、グリセロールモノアセテート、グリシン、ヒドロキシエチルスターチ、イノシトール、乳糖、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ－オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、尿素、バリン、キシロース、デキストリン、デキストラン及びイソマルトオリゴ糖からなる群から選択される少なくとも１種の追加の凍結防止物質を含むことができる。

【0037】

一方、保存液組成物は、ＩＡＰ（アポトーシス阻害剤）、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル経路阻害剤及び／又はＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＢＤＮＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ及び／又はＶＥＧＦなどの成長因子に属するタンパク質をさらに含むことができる。

【0038】

加えて、保存液組成物は、抗酸化剤、浸透圧調節剤及びエネルギー源から選択される１種又は複数の添加剤を含むことができる。

【0039】

抗酸化剤としては、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）、アルファトコフェロール酢酸エステル、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシキノン、ブチル化ヒドロキシトルエン、ヒドロキシクマリン、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、没食子酸ラウリル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、トリヒドロキシブチロフェノン、ジメチルフェノール、レシチン、コエンザイムＱ１０、エタノールアミン又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

浸透圧調節剤としては、デキストラン、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、デキストロース、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、リンゲル液、乳酸リンゲル液、ヒドロキシエチルスターチ、ラフィノース、グリセロール又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

エネルギー源としては、アデノシン－５－三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン－５－三リン酸二ナトリウム塩、グルコース、マルトース、マンノース、ガラクトース又はフルクトースが挙げられるが、これらに限定されず、アデノシン－５－三リン酸（ＡＴＰ）及び／又はアデノシン－５－三リン酸二ナトリウム塩でもよい。

【0042】

一実施形態では、保存液組成物は、ヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタレートからなる群から選択される少なくとも１種の物質に加えて、活性成分として、アデノシン、グルタチオン、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］－２－アミノエタンスルホン酸）、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）又はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含むことができる。加えて、冷蔵保管用ＥＣ（ユーロコリンズ）液、ＵＷ（ウィスコンシン大学）液ビアスパン（Ｖｉａ－ｓｐａｎ）（登録商標）、セルシオール（Ｃｅｌｓｉｏｒ）（登録商標）、カストジオール（Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ）（登録商標）、ＩＧＬ－１（登録商標）、ＢＧＰ－ＨＭＰ（Ｎ，Ｎ－ビス－ヒドロキシエチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）－グルコネート－ポリエチレングリコール［ＢＧＰ］系液（低体温機械灌流［ＨＭＰ］）液、ＢＧＰ－ＣＳ（冷蔵保管）液などを添加してもよいが、これらに限定されない。

【0043】

細胞、組織又は臓器は哺乳類に由来することができる。哺乳類は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ又はネコでもよい。

【0044】

細胞、組織又は臓器は生体への移植のためのものでもよい。

【0045】

細胞としては、組織又は臓器を構成する細胞が挙げられ、例えば、筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、幹細胞又は粘膜細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

組織は、皮膚、筋肉、角膜、軟骨、神経及び骨から選択され得る。

【0047】

臓器は、心臓、肝臓、腎臓、小腸、胃、膵臓、肺、胆嚢、神経、皮膚、血管、歯、目、角膜、脳、脊髄、甲状腺、骨髄、筋肉、胸腺、脾臓、大腸、精巣及び卵巣から選択されるいずれか１種でもよい。

【0048】

保存液組成物は、単離された細胞、組織又は臓器の長期保存効率を高め得る添加剤をさらに含むことができる。添加剤は、水、糖類（例えば、スクロース、ラフィノース、デンプン）、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム）、ＡＴＰ、緩衝剤、アルブミン又は抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ）でもよい。

【0049】

灌流又は再灌流のためのミトコンドリアを含む組成物
本発明の別の態様において、灌流又は再灌流のための単離されたミトコンドリアを含む組成物を提供する。

【0050】

灌流は、単離された細胞、組織又は臓器に灌流液を注入又は連続的に流すことによって原形質を人工液で置換することでもよい。再灌流は、単離された細胞、組織又は臓器への血液供給を一時的に停止し、その後血流を回復することでもよい。

【0051】

組成物は、非経口投与用組成物でもよい。組成物は液体でもよい。加えて、組成物は１種又は複数の添加剤を含むことができる。添加剤としては、賦形剤、希釈剤、付着防止剤、保存剤、溶媒、界面活性剤又はこれらの組み合わせが挙げられる。加えて、組成物は、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はこれらの組み合わせなどの塩をさらに含むことができる。

【0052】

組成物は医薬組成物でもよい。

【0053】

保存液組成物を使用して細胞、組織又は臓器を保存する方法
本発明の別の態様において、単離された細胞、組織又は臓器を、単離されたミトコンドリアを含む保存液組成物の存在下で保管することを含む、単離された細胞、組織又は臓器を保存する方法を提供する。

【0054】

細胞、組織、臓器、ミトコンドリア及び保存液組成物は上記の通りである。

【0055】

本明細書で用いる場合、「保存液組成物の存在下」という用語は、本発明の保存液組成物を保存対象物、すなわち、細胞、組織又は臓器に接触させることを指すことができる。

【0056】

一実施形態では、上記方法は本発明の保存液組成物に細胞、組織又は臓器等を浸漬することにより、保存液を保存対象物に接触させる、細胞、組織又は臓器等を保存する方法である。保存対象物に対する保存液の量は特に限定されないが、保存対象物が完全に浸漬する量より多い量が好ましい可能性がある。

【0057】

保存容器は特に限定されず、密閉容器か開放容器のどちらでも使用できる。保存容器は目的に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、保存容器は好気的条件（酸素、二酸化炭素及び窒素等の気体が自由に通れる条件）を維持できる容器でもよい。

【0058】

保管は冷蔵状態で行ってもよい。冷蔵状態は、約－４℃～約２５℃、約－４℃～約２０℃、約－４℃～約１５℃、約－４℃～約１０℃、約－２℃～約１０℃、約－２℃～約８℃、約０℃～約１５℃、約０℃～約１０℃、約０℃～約８℃、約０℃～約６℃、約０℃～約５℃、約０℃～約４℃、約０℃～約３℃又は約２℃～約５℃でもよい。

【0059】

一方、保存対象物を本発明の保存液組成物に浸漬して冷凍保存する場合には、必要に応じて公知の凍結防止剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセリン等）を保存液組成物に添加することができる。

【0060】

保管期間は、目的に応じて適切な期間を設定すればよい。具体的には、保管は、最長で約１０日間、最長で約９日間、最長で約８日間、最長で約７日間、約０時間～約７日間、約０時間～約６日間、約０時間～約５日間、約０時間～約４日間、約０時間～約３日間、約０時間～約２日間、約０時間～約４２時間、約０時間～約３６時間、約０時間～約３０時間、約０時間～約２４時間、約０時間～約１８時間、約０時間～約１２時間、約０時間～約９時間、約０時間～約６時間又は約０時間～約３時間行うことができるが、これらに限定されない。

【0061】

上記の方法は細胞からミトコンドリアを単離することをさらに含むことができる。細胞からミトコンドリアを単離する際は、当分野で知られている方法を用いることができる。細胞からミトコンドリアを単離することは、細胞を溶解し、溶解物からミトコンドリアを単離することを含むことができる。単離は遠心分離によって行うことができる。

【実施例】

【0062】

以下、次の実施例により本発明をより詳細に説明する。しかし、次の実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

【0063】

実施例１．単離されたミトコンドリア含有液の利用による心臓機能の確認

【0064】

実施例１．１．血小板の調製
約４０ｍＬ～約５０ｍＬの濃縮ヒト血小板を２，０００×ｇで約３０分間遠心分離した。血漿を含む上清を除去し、生じた血小板沈殿物（ペレット）を得た。得られた血小板沈殿物を血漿と同量のＴＴＧ混合保存液（０．１９５Ｍトレハロース、２０ｍＭトリス及び６５ｍＭグリシン：ＴＴＧ）に再懸濁した。再懸濁した血小板沈殿物を１ｍＬずつ分注し、使用するまで－８０℃で保管した。

【0065】

実施例１．２．血小板からのミトコンドリアの取得
冷凍保管した血小板を解凍し、約５分間ボルテックスすることによって破壊し、２，０００×ｇで約５分間遠心分離した。生じた上清を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、沈殿したミトコンドリアを得た。

【0066】

実施例１．３．単離された心臓の安定化
心臓の機能を確認するため、まず単離された心臓を安定化させた。

【0067】

具体的には、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（１２週齢、雄）をケタミンで麻酔し、次いで屠殺した。ラットの心臓を摘出し、単離された心臓を大動脈カテーテルを介してランゲンドルフに置いた。単離された心臓をクレブス－ヘンゼライト液で約２０分間灌流して心臓を洗浄した。冷蔵保管されたヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタレート（ＨＴＫ）液を心臓の大動脈から注入し、約１０分間灌流して心臓を安定化させた。

【0068】

ＨＴＫ液には１９８ｍＭヒスチジン、２ｍＭトリプトファン、１ｍＭケトグルタレート、３０ｍＭマンニトール、４ｍＭＭｇＣｌ_２、１５μＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭＮａＣｌ及び９ｍＭＫＣｌが含まれていた。

【0069】

実施例２．ミトコンドリア含有液の利用による摘出した心臓の灌流液維持の確認
実施例１．２．で調製したミトコンドリアをＨＴＫ液に添加し、５μｇ／ｍＬミトコンドリアを含むミトコンドリア－ＨＴＫ液を調製した。

【0070】

実施例１．３．で調製した安定化した心臓に、５μｇ／ｍＬミトコンドリアを含むミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液を約２分間注入した。その後、心臓を１５０μｇ／３０ｍＬのミトコンドリア－ＨＴＫ液及び３０ｍＬのミトコンドリアを含まないＨＴＫ液それぞれに浸漬し、約４℃で保管した。１０、１２及び２９時間後、保管した心臓を大動脈カテーテルを介してランゲンドルフに置き、クレブス－ヘンゼライト液を通過させた。心臓を通過した灌流液の量を測定した。このとき、灌流液の量の変化は心拍数に依存しており、心拍数と関連している。したがって、経時的な正規化された灌流液量（ｍＬ）を測定し、図１に示した。

【0071】

図１に示すように、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液のみに保管した場合と比較して、ミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した場合、９、１０、１２及び２９時間において心臓の灌流液が約２０％増加した。

【0072】

加えて、心臓を単離した後、単離された心臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管し、心拍の持続時間を確認した。

【0073】

心臓を単離してから９時間後、ミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管された心臓の拍動は明確に区別可能であった。ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管された心臓は、９時間後において非常に弱い心拍を示したが、ミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管された心臓は、９時間後でもミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管された心臓よりも速く、より安定した心拍を示した。

【0074】

したがって、単離された心臓は、ミトコンドリア含有液の存在下で長期間にわたり心収縮性を維持していたことを確認した。

【0075】

実施例３．ミトコンドリア含有液の利用による摘出した心臓における筋原線維細胞の維持の確認
実施例２で灌流液を測定した心臓から筋原線維細胞を単離した。単離された細胞の状態を顕微鏡で観察した。単離された心臓をミトコンドリア－ＨＴＫ液又はミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合の保管時間別（９、１０、１２及び２９時間）の筋原線維細胞の画像を図２に示す。

【0076】

図２に示すように、ミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した場合、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合に比べて約２～３倍多くの心臓の心筋細胞が単離された。

【0077】

したがって、ミトコンドリア含有液の存在下で心臓を保管した場合、ミトコンドリアが存在しない場合に比べて心臓の心筋細胞の数が増加することを確認した。

【0078】

実施例４．単離されたミトコンドリアを含む液に保管した心臓、肝臓及び腎臓の機能の確認

【0079】

実施例４．１．単離された心臓、肝臓及び腎臓の機能の確認の準備
Ｃ５７ＢＬ６マウス（７週齢、雄）をケタミンで麻酔し、次いで心臓、肝臓及び腎臓を摘出した。摘出した心臓、肝臓及び腎臓をＰＢＳで数回洗浄し、血液や異物を除去した。洗浄した臓器を冷蔵保管したミトコンドリアを含まないＨＴＫ液及びミトコンドリア－ＨＴＫ液それぞれに浸漬し、次いで冷蔵保管した。

【0080】

実施例４．２．ミトコンドリア含有液の利用による摘出した心臓、肝臓及び腎臓の色度変化の確認
実施例４．１．で保管された心臓、肝臓及び腎臓をＰＢＳで数回洗浄し、次いで写真を撮り色度を比較した。図３に示すように、ミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した場合、心臓はその明るい赤色を維持したが、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液に保管した場合、赤色は消失した。同様の結果が肝臓及び腎臓でも見られた。

【0081】

実施例４．３．ミトコンドリア含有液の利用による摘出した腎臓における酵素活性の維持の確認
実施例４．１．で保管した腎臓全体を、６０及び１６０時間後それぞれで均質化し、次いで腎臓で高発現しているＡＣＥ２（アンジオテンシンＩＩ変換酵素）の活性を、ＡＣＥ２活性アッセイキット（カタログ番号Ｋ８９７－１００、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して、製造業者のマニュアルに従って測定した。図４に示すように、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液及びミトコンドリア－ＨＴＫ液においてＡＣＥ２の活性が時間の経過とともに増加した。特に、ミトコンドリア－ＨＴＫ液に腎臓を保管した場合、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液のみに保管した場合と比べて、ＡＣＥ２活性の上昇がより遅くなる、すなわち、ＡＣＥ２活性の上昇が遅れることを確認した。

【0082】

言い換えれば、臓器単離後の継続的なエネルギーの減少とストレスの増加により、ＡＣＥ２の発現と活性が増加する。その結果、ミトコンドリアで処理することによってＡＣＥ２の活性上昇は臓器のストレスを軽減し、エネルギーを供給し、それによりＡＣＥ２の活性を低下させることが分かった。

【0083】

実施例５．摘出した心臓に対するミトコンドリア含有液の利用効果の確認

【0084】

実施例５．１．摘出した心臓からの心筋細胞の単離
摘出した心臓の左心室断片をコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、カタログ番号ＬＳ００４１９４）及びプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号 ｐ４６３０）で５分間処理した後、２，０００×ｇで遠心分離して心筋細胞を得た。

【0085】

実施例５．２．単離されたミトコンドリアの染色
血小板から単離したミトコンドリアを、ミトコンドリア特異的染色試薬であるミトトラッカー（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号 Ｍ７５１２）で１０分間染色した。その後、１２，０００×ｇで遠心分離して上清を除去し、ミトコンドリア単離液に再懸濁した。

【0086】

実施例５．３．ミトコンドリア含有液の利用による心筋細胞生存率の上昇の確認
実施例５．１．で単離した心筋細胞を、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液及び実施例５．２で調製した染色したミトコンドリア－ＨＴＫ液に９時間保管し、その後共焦点顕微鏡を用いてミトコンドリアの動きを確認した。その結果、図５に示すように、液中のミトコンドリアが心筋細胞内に移動したことを確認した。

【0087】

加えて、ＷＳＴ－１（水溶性テトラゾリウム塩）及び細胞内ＡＴＰの測定結果から、ミトコンドリアが心筋細胞内に移動することによる生存率の上昇を確認した（図６及び図７）。

【0088】

実施例５．４．ミトコンドリア含有液の利用による心臓組織内のミトコンドリアの動きの確認
摘出した心臓を、ミトコンドリアを含まないＨＴＫ液及び実施例５．２．で調製した染色したミトコンドリア－ＨＴＫ液に保管した。９時間後、心臓を固定して切片化した。その後、共焦点顕微鏡を用いて組織内に移動したミトコンドリアを確認した（図８）。

【0089】

実施例５．５．ミトコンドリア含有液の利用による心臓組織におけるミトコンドリア酵素活性の増加の確認
摘出して保管していた心臓組織からミトコンドリアを単離し、次いでＡＴＰ合成酵素及びクエン酸合成酵素の活性をそれぞれ測定した。その結果、図９及び図１０に示すように、ミトコンドリア－ＨＴＫ液を適用した場合、ＡＴＰ合成酵素及びクエン酸合成酵素はともに顕著に高い活性を示した。

【0090】

実施例６．ミトコンドリア濃度に応じた腎臓の酵素活性維持の確認
保管時間を１９２時間とし、ミトコンドリア－ＨＴＫ液の処理を濃度依存的（０、５、１０、１５及び２０μｇ／ｍＬ）にした以外は実施例４．１．と同様の方法で腎臓を調製し、ＡＣＥ２の活性を測定した。図１１に示すように、ミトコンドリアによりＡＣＥ２の活性が濃度依存的に低下することを確認した。

【0091】

実施例７．ミトコンドリア含有液の利用によるミトコンドリアの由来と活性化に応じた酵素活性維持の確認
保管時間を１９２時間とし、ミトコンドリアの由来と活性化が異なるミトコンドリア－ＨＴＫ液で処理した以外は実施例４．１と同様の方法で腎臓を調製し、ＡＣＥ２の活性を測定した。このとき、不活化ミトコンドリアは超音波処理後、５６℃で３０分間加熱処理した。

【0092】

その結果、図１２に示すように、各熱不活化ミトコンドリアを適用してもＡＣＥ２の活性は低下しないが、臍帯血間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）、血小板及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された様々な由来のミトコンドリアはＡＣＥ２の活性を低下させることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】