特表 2024-529343 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）修飾脂質ナノ粒子組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）修飾脂質ナノ粒子組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/51 20060101AFI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

A61K9/51

A61P35/00

A61K31/7088

A61K47/18

A61K31/573

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501751

(86)(22)【出願日】2022-07-13

(85)【翻訳文提出日】2024-02-05

(86)【国際出願番号】 US2022036930

(87)【国際公開番号】W WO2023287861

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/221,290

(32)【優先日】2021-07-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520068043

【氏名又は名称】ジェネレーション バイオ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】サマヨア， フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】シルバー， ナサニエル

(72)【発明者】

【氏名】リー， プルーデンス ユイ トゥン

(72)【発明者】

【氏名】トイ， ランドール ニュートン

(72)【発明者】

【氏名】ノルティング， バート

(72)【発明者】

【氏名】オーントンパン， ラリータ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD51

4C076EE41

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA10

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZB26

(57)【要約】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む］、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原に結合することができ、有利には、受容体を発現する細胞又は組織のみを標的とするＬＮＰ組成物を提供する。本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、有利なことに、粒径及び安定性への影響が最小限である効率的な共有結合によるコンジュゲーションを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、治療用核酸（ＴＮＡ）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、前記ＬＮＰが、前記ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖが、細胞の表面に存在する抗原を対象とする、薬学的組成物。

【請求項2】

前記ｓｃＦＶが、前記ＬＮＰに共有結合により連結される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記ｓｃＦＶが、前記ＬＮＰに化学的にコンジュゲートされている、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記ｓｃＦＶが、切断不可能なリンカーを介して前記ＬＮＰに化学的にコンジュゲートされている、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記切断不可能なリンカーが、マレイミド含有リンカーである、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記ｓｃＦＶが、切断可能なリンカーを介して前記ＬＮＰに化学的にコンジュゲートされている、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記切断可能なリンカーが、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）含有リンカーである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記ｓｃＦｖが、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションを介して前記ＬＮＰに連結される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり、任意選択的に、前記抗原が、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記ｓｃＦｖが二価である、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記ＬＮＰが、前記細胞内に内在化されることが可能である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記ｓｃＦＶが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列類似性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記ｓｃＦＶが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３に示される前記アミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列類似性を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記ＬＮＰが、カチオン性脂質、ステロール又はその誘導体、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ化脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記ＴＮＡが、前記ＬＮＰ中に封入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記ＴＮＡが、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端（ｃｅＤＮＡ）、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記ＴＮＡが、ｃｅＤＮＡである、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

前記ｃｅＤＮＡが、直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

前記ＴＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項20】

前記ＴＮＡが、ｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項21】

前記ＴＮＡが、プラスミドである、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項22】

対象に投与される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項23】

前記対象が、ＴＮＡで封入されたＬＮＰによる治療を必要とするヒト患者である、請求項２２に記載の薬学的組成物。

【請求項24】

前記ｓｃＦｖが対象とする前記細胞表面抗原を発現する細胞を標的とする、請求項１～２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項25】

腫瘍細胞を標的とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項26】

肝臓細胞を標的とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項27】

肝臓内の肝細胞に標的とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項28】

前記カチオン性脂質が、式（Ｉ）によって表されるか、

【化61】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^２が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２及びＲ^３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^２’が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２’及びＲ^３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ独立して、－ＣＲ^ａ、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａであり、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立してＨ又はＣ_１～３アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^４が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３及びＲ^４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^４’が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３’及びＲ^４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～２０アルキレン又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
Ｒ^６及びＲ^６’が、各出現に対して、独立してＣ_１～２０アルキレン、Ｃ_３～２０シクロアルキレン、又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎが、それぞれ独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項29】

前記カチオン性脂質が、式（ＩＩ）によって表されるか、

【化62】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
ａが、１～２０の範囲の整数であり、
ｂが、２～１０の範囲の整数であり、
Ｒ^１が、存在しないか、又は（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキル、及び（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ^２が、（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルである、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項30】

前記脂質が、式（Ｖ）によって表されるか、

【化63】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、Ｒ^ａから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、（Ｃ_１～Ｃ_２）アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、Ｒ^ｂから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルであり、
又は代替的に、Ｒ^２及びＲ^３並びに／又はＲ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ_２～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルキル又は（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルケニルであり、これらのそれぞれが、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_６）シクロアルキルで中断され、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれハロ又はシアノである、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項31】

前記カチオン性脂質が、式（ＸＶ）によって表されるか、

【化64】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレン又はＣ_２～Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【化65】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１６アルキル又はＣ_７～Ｃ_１６アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂ中の合わせた場合の炭素原子の総数が、１５より大きく、
Ｘ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、
－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項32】

前記カチオン性脂質が、式（ＸＸ）によって表されるか、

【化66】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【化67】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項33】

前記カチオン性脂質が、表２、表５、表６、表７、又は表８のいずれかの脂質から選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項34】

前記カチオン性脂質が、以下の構造を有する脂質、

【化68】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項35】

前記カチオン性脂質が、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）であるか、

【化69】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項36】

前記ステロール又はその誘導体が、コレステロール又はベータ－シトステロールである、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項37】

前記非カチオン性脂質が、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）；レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３７に記載の薬学的組成物。

【請求項38】

前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の薬学的組成物。

【請求項39】

前記ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル；ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール；ＰＥＧ－ジステリルグリセロール；ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド；ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド；ＰＥＧ－ジステリルグリカミド；（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）；３，４－ジテトラデカオキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、及びｌ，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項40】

前記ＰＥＧ化脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の薬学的組成物。

【請求項41】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨ、ＤＭＧ－ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである、請求項３９又は４０に記載の薬学的組成物。

【請求項42】

前記ｓｃＦｖが、前記ＬＮＰのＰＥＧ化脂質に化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結され、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する、請求項１４又は３９～４１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項43】

前記ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結される前記ＰＥＧ化脂質がＤＳＰＥ－ＰＥＧである、請求項４２に記載の薬学的組成物。

【請求項44】

前記ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結される前記ＰＥＧ化脂質がＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である、請求項４３に記載の薬学的組成物。

【請求項45】

前記ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結される前記ＰＥＧ化脂質がＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００である、請求項４３に記載の薬学的組成物。

【請求項46】

前記カチオン性脂質が、約３０％～約８０％のモル百分率で存在する、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

前記ステロールが、約２０％～約５０％のモル百分率で存在する、請求項３６に記載の薬学的組成物。

【請求項48】

前記非カチオン性脂質が、約２％～約２０％のモル百分率で存在する、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項49】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、約２．１％～約１０％のモル百分率で存在する、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項50】

前記ｓｃＦｖが、約０．０２μｇ／μｇのＴＮＡ～約０．１μｇ／μｇのＴＮＡの総量で存在する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項51】

パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項52】

前記ＬＮＰが、約１０：１～約４０：１の全脂質のＴＮＡに対する比を有する、請求項１～５１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項53】

前記ＬＮＰが、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１～５２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項54】

前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項55】

前記ナノ粒子が、約６０ｎｍ～約８０ｎｍの直径を有する、請求項１～５４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項56】

前記ｃｅＤＮＡが発現カセットを含み、前記発現カセットがプロモーター配列及び導入遺伝子を含む、請求項１６～５５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項57】

前記発現カセットが、ポリアデニル化配列を含む、請求項５６に記載の薬学的組成物。

【請求項58】

前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１６～５７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項59】

前記発現カセットが、２つのＩＴＲに隣接し、前記２つのＩＴＲが、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む、請求項５８に記載の薬学的組成物。

【請求項60】

前記発現カセットが、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される、請求項５８に記載の薬学的組成物。

【請求項61】

前記発現カセットが、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される、請求項５８又は６０に記載の薬学的組成物。

【請求項62】

前記少なくとも１つのＩＴＲが、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来するＩＴＲ、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来するＩＴＲ、又はパルボウイルスに由来する野生型ＩＴＲである、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項63】

前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２からなる群から選択される、請求項６２に記載の薬学的組成物。

【請求項64】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項65】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型又は変異型ＩＴＲである、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項66】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲが、対称である、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項67】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲが、非対称である、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項68】

前記ｃｅＤＮＡが、５’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項５９～６７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項69】

前記ｃｅＤＮＡが、３’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項70】

前記スペーサー配列が、長さが少なくとも５塩基対の長さである、請求項６８又は請求項６９に記載の薬学的組成物。

【請求項71】

前記ｃｅＤＮＡが、ニック又はギャップを有する、請求項１６～７０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項72】

前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニストリングＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである、請求項１６～７１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項73】

対象のがんを治療する方法であって、有効量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項74】

前記対象が、ヒトである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

対象の腫瘍に治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するか又は前記ＴＮＡの濃度を増加させる方法であって、有効量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項76】

対象の肝臓に治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するか又は前記ＴＮＡの濃度を増加させる方法であって、有効量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本出願は、２０２１年７月１３日に出願された米国仮出願第６３／２２１，２９０号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

イオン化可能な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＲＮＡ治療薬の全身送達に広く使用されてきた。Ｃ１２－２００、ｃＫＫ－Ｅ１２、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡなどの様々な種類のイオン化可能な脂質材料が、ＬＮＰ製剤について以前に報告されており、０．００２ｍｇのｓｉＲＮＡ／ｋｇの投与レベルでの肝臓における効率的な遺伝子サイレンシングが実証されている（Ｄｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３９５５－３９６０（２０１４））。標的化リガンドの包含は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの送達及び治療効率を増強することが示されているが、標的化部分を結合することは、ＬＮＰ系を製造するプロセスに複雑さ、コスト、及び規制上の困難さを加え得ることが認識されている（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｎｏｖ １６；３３８（６１０９）：９０３－１０）。加えて、いくつかの標的化リガンドの標的化特異性は、脂質ナノ粒子が生体液に曝露され、媒体中のタンパク質との相互作用及びその結果としてのタンパク質コロナの形成が起こる場合に、消失し得ることが実証されている（Ｓａｌｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｆｅｂ；８（２）：１３７－４３）。したがって、可能性のある臨床的利益と、標的化ＲＮＡ－ＬＮＰ製造の複雑さ及びコストとの間にトレードオフが存在する。

【0003】

抗体は、罹患細胞の表面でのみ発現されるか、又は健常細胞と比較してこれらの細胞上で高度に過剰発現される特異的抗原を標的化することによって機能する。これらの抗原は、標的罹患細胞の表面に単独で又は豊富に存在するので、抗体は、ナノ粒子及びそれらのカーゴ（例えば、治療剤）を身体を通して運搬し、選択的送達／標的化を可能にするために概念的に利用することができる。このアプローチは１９８０年代に最初に調査されたが、抗体で装飾されたナノ粒子を生成及び評価するための不十分な方法などのかなりの制限があり、この領域での著しい進歩を妨げた。過去数十年にわたる抗体発現技法とナノ粒子設計の両方の進歩により、ナノ粒子－抗体コンジュゲートのより完全な探索が可能になり、この分野の急速な拡大をもたらした。初期の開発は、主にそれらの生成と修飾の両方に関する利用可能な情報の豊富さに起因して、標的化リガンドとして完全抗体を使用することにほぼ完全に焦点を当てた。しかしながら、完全抗体リガンドの使用に関連するいくつかの問題、例えば、免疫原性、迅速な排除、低い安定性、及び予想される有効性よりも低いことが明らかになった。

【0004】

抗体のモジュール性は、構造的にも機能的にも、分子クローニング、抗体操作、更には酵素的方法によって、断片抗原結合（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、及び結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメインなどのより小さな抗原結合断片の生成を可能にする。抗体の抗原結合断片は、従来のｍＡｂの欠点、例えば、固形腫瘍への不十分な浸透及び免疫系のＦｃ媒介性バイスタンダー活性化を克服するかなりの可能性を有する。抗体断片は、それ自体で使用されるか、又は他の分子に連結され、二特異性分子、多重特異性分子、多量体分子、又は多機能性分子についての多数の可能性を生じ、種々の生物学的効果を達成することができる。抗体断片は、従来の抗体の使用に対していくつかの利点を提供することができる。例えば、それらは、一般に、微生物発現系を使用して容易に産生することができ、それにより、より速い培養、より高い収率、及びより低い産生コストがもたらされる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＪＣ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２０１８ Ｄｅｃ；２３（１２）：１９９６－２００２）。それらの小さいサイズは、挑戦的な潜在性エピトープへのアクセス、及び腫瘍浸透を可能にし、それらは、低減された免疫原性を有し、Ｆｃの欠如は、免疫系のバイスタンダー活性化を制限する（Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１９；２６（３）：３９６－４２６）。一方、それらのより小さいサイズは、より速い腎排泄をもたらし、これは、より高い用量及び／又はより頻繁な投薬レジメンインビボを必要とし得る。

【0005】

ＬＮＰはインビボ送達に有利であることが示されているが、肝臓肝細胞以外のＲＮＡ治療薬の全身送達は依然として非常に困難である。これらの比較的大きなサイズのＬＮＰは、いくつかの機構によって肝臓適応症の治療指数を低下させる：（１）より大きなＬＮＰは、肝類類洞に並ぶ内皮細胞の窓を効率的に迂回することができず、標的細胞（肝細胞）へのアクセスを妨げる、（２）より大きなＬＮＰは、いくつかの異なる受容体（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体）によるクラスリン媒介性エンドサイトーシスを介して、肝細胞によって効率的に内在化されることができない、また、（３）特定の閾値サイズを超えるＬＮＰは、細網内皮系の細胞によって優先的に取り込まれる傾向があり、これにより用量を制限する免疫応答を引き起こし得る。これらの進歩にもかかわらず、より大きな剛性のポリヌクレオチドカーゴ（例えば、二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、閉末端二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ））のＬＮＰ媒介性送達は、より小さな及び／又は可撓性のカーゴ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に対して、更なる課題を提示する。そのような課題の１つは、大きな剛性のカーゴが封入される場合に得られるＬＮＰのサイズを伴う。
ＬＮＰ標的化核酸治療薬の可能性を完全に実現するために、効率的なインビボ送達系が必要とされる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｄｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３９５５－３９６０（２０１４）

【非特許文献2】Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｎｏｖ １６；３３８（６１０９）：９０３－１０

【非特許文献3】Ｓａｌｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｆｅｂ；８（２）：１３７－４３

【非特許文献4】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＪＣ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２０１８ Ｄｅｃ；２３（１２）：１９９６－２００２

【非特許文献5】Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１９；２６（３）：３９６－４２６

【発明の概要】

【0007】

本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、治療用核酸（ＴＮＡ）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖが、細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面に存在する抗原を対象とする、薬学的組成物を提供する。本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、有利なことに、粒径及び安定性への影響が最小限である効率的な共有結合によるコンジュゲーションを提供する。ＬＮＰへのｓｃＦｖのマレイミドコンジュゲーションが、他のチオールベースの架橋方法と共にＬＮＰへの強固なコンジュゲーションをもたらし、重要なことに、ＬＮＰのサイズ及び完全性を維持したことは、本開示の知見である。

【0008】

第１の態様によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、治療用核酸（ＴＮＡ）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖが、細胞の表面に存在する抗原を対象とする、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、ＬＮＰに共有結合により連結される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、ＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、切断不可能なリンカーを介してＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、切断不可能なリンカーは、マレイミド含有リンカーである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、切断可能なリンカーを介してＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）含有リンカーである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションを介してＬＮＰに連結される。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。更なる実施形態では、抗原はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは二価である。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＬＮＰは、細胞内に内在化されることが可能である。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列類似性を有する。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列類似性を有する。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、ステロール又はその誘導体、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ化脂質からなる群から選択される脂質を含む。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＴＮＡは、ＬＮＰに封入されている。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＴＮＡは、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端（ｃｅＤＮＡ）、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＡは、ｃｅＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、直鎖状二重鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＴＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＴＮＡは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＴＮＡは、プラスミドである。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＮＡで封入されたＬＮＰによる治療を必要とするヒト患者である。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、ｓｃＦｖが対象とする細胞表面抗原を発現する細胞を標的とする。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍細胞を標的とする。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、肝臓細胞を標的とする。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、肝臓内の肝細胞を標的とする。

【0009】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式（Ｉ）によって表される：

【0010】

【化1】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^２が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２及びＲ^３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^２’が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２’及びＲ^３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ独立して、－ＣＲ^ａ、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａであり、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立してＨ又はＣ_１～３アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^４が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３及びＲ^４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^４’が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３’及びＲ^４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～２０アルキレン又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
Ｒ^６及びＲ^６’が、各出現に対して、独立してＣ_１～２０アルキレン、Ｃ_３～２０シクロアルキレン、又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎが、それぞれ独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。

【0011】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式（ＩＩ）によって表される：

【0012】

【化2】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
ａが、１～２０の範囲の整数であり、
ｂが、２～１０の範囲の整数であり、
Ｒ^１が、存在しないか、又は（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキル、及び（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ^２が、（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルである。

【0013】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、脂質は、式（Ｖ）によって表される：

【0014】

【化3】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、Ｒ^ａから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、（Ｃ_１～Ｃ_２）アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、Ｒ^ｂから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルであり、
又は代替的に、Ｒ^２及びＲ^３並びに／又はＲ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ_２～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルキル又は（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルケニルであり、これらのそれぞれが、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_６）シクロアルキルで中断され、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれハロ又はシアノである。

【0015】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式（ＸＶ）によって表される：

【0016】

【化4】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレン又はＣ_２～Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0017】

【化5】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１６アルキル又はＣ_７～Ｃ_１６アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂ中の合わせた場合の炭素原子の総数が、１５より大きく、
Ｘ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、
－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0018】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式（ＸＸ）によって表される：

【0019】

【化6】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0020】

【化7】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0021】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、表２、表５、表６、表７、又は表８のいずれかの脂質から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有する脂質：

【0022】

【化8】

又はその薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）：

【0023】

【化9】

又はその薬学的に許容される塩である。

【0024】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ステロール又はその誘導体は、コレステロール又はベータ－シトステロールである。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ，１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（18-1-trans PE,1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine）（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）；レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル；ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール；ＰＥＧ－ジステリルグリセロール；ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド；ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド；ＰＥＧ－ジステリルグリカミド；（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）；３，４－ジテトラデカオキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨ、ＤＭＧ－ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＬＮＰのＰＥＧ化脂質に化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結され、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結されるＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結されるＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結されるＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００である。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、約３０％～約８０％のモル百分率で存在する。いくつかの実施形態では、ステロールは、約２０％～約５０％のモル百分率で存在する。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、約２％～約２０％のモル百分率で存在する。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、約２．１％～約１０％のモル百分率で存在する。

【0025】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、約０．０２μｇ／μｇのＴＮＡ～約０．１μｇ／μｇのＴＮＡの総量で存在する。

【0026】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む。

【0027】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約１０：１～約４０：１の全脂質のＴＮＡに対する比を有する。

【0028】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ＬＮＰは、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の直径を有する。

【0029】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の直径を有する。

【0030】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ナノ粒子は、約６０ｎｍ～約８０ｎｍの直径を有する。

【0031】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは発現カセットを含み、発現カセットはプロモーター配列及び導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ポリアデニル化配列を含む。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。

【0032】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来するＩＴＲ、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来するＩＴＲ、又はパルボウイルスに由来する野生型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、当該ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２からなる群から選択される。

【0033】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。

【0034】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、修飾型ＩＴＲ又は変異型ＩＴＲである。

【0035】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは対称である。

【0036】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは非対称である。

【0037】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。

【0038】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー配列は、長さが少なくとも５塩基対の長さである。

【0039】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、ニック又はギャップを有する。

【0040】

上記の態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニストリングＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。

【0041】

いくつかの態様では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法であって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれか１つの有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

【0042】

いくつかの態様では、本開示は、対象における腫瘍に治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するか、又は対象における腫瘍にＴＮＡの濃度を増加させる方法であって、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれか１つの有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0043】

いくつかの態様では、本開示は、対象の肝臓に治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するか、又は対象の肝臓にＴＮＡの濃度を増加させる方法であって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれか１つの有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0044】

いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、細胞内に内在化される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、カチオン性脂質、ステロール又はその誘導体、非カチオン性脂質、又はＰＥＧ化脂質を含む。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、脂質中に封入される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端（ｃｅＤＮＡ）、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、ｃｅＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、直鎖状二重鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡは、プラスミドである。

【0045】

いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質を含み、ＰＥＧ化脂質は、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖポリペプチド）をコードするアミノ酸配列に連結される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、対象に投与される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、対象は、ＴＮＡで封入されたＬＮＰによる治療を必要とするヒト患者である。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、ＬＮＰ中のｓｃＦｖの抗原標的への結合を介して、標的抗原を発現する細胞又は組織を標的とする。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は腫瘍細胞を標的とする。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は血液腫瘍である。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は肝臓細胞を標的とする。

【0046】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、式（Ｉ）によって表される：

【0047】

【化10】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^２が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２及びＲ^３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^２’が、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、Ｒ^２’及びＲ^３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ独立して、－ＣＲ^ａ、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａであり、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立してＨ又はＣ_１～３アルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^４が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３及びＲ^４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^４’が、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａである場合、かつＲ^ａがＣ_１～３アルキルである場合、Ｒ^３’及びＲ^４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～２０アルキレン又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
Ｒ^６及びＲ^６’が、各出現に対して、独立してＣ_１～２０アルキレン、Ｃ_３～２０シクロアルキレン、又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎが、それぞれ独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。

【0048】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、式（ＩＩ）によって表される：

【0049】

【化11】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
ａが、１～２０の範囲の整数であり、
ｂが、２～１０の範囲の整数であり、
Ｒ^１が、存在しないか、又は（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキル、及び（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ^２が、（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルである。

【0050】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、脂質は、式（Ｖ）によって表される：

【0051】

【化12】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、Ｒ^ａから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、（Ｃ_１～Ｃ_２）アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、Ｒ^ｂから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルであり、
又は代替的に、Ｒ^２及びＲ^３並びに／又はＲ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ_２～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルキル又は（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルケニルであり、これらのそれぞれが、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_６）シクロアルキルで中断され、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれハロ又はシアノである。

【0052】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、式（ＸＶ）によって表される：

【0053】

【化13】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレン又はＣ_２～Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0054】

【化14】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１６アルキル又はＣ_７～Ｃ_１６アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂ中の合わせた場合の炭素原子の総数が、１５より大きく、
Ｘ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、
－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0055】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、式（ＸＸ）によって表される：

【0056】

【化15】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0057】

【化16】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0058】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、表２、表５、表６、表７、又は表８のいずれかの脂質から選択される。

【0059】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、以下の構造を有する脂質、

【0060】

【化17】

又はその薬学的に許容される塩である。

【0061】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ若しくはＭＣ３）、

【0062】

【化18】

又はその薬学的に許容される塩である。

【0063】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ステロール又はその誘導体は、コレステロール又はベータ－シトステロールである。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン（distearoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine、ＤＳＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidylcholine、ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（dioleoylphosphatidylcholine、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoylphosphatidylcholine、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（dioleoylphosphatidylglycerol、ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（dipalmitoylphosphatidylglycerol、ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（dioleoyl-phosphatidylethanolamine、ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（palmitoyloleoylphosphatidylcholine、ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine、ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine、ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（dimyristoylphosphoethanolamine、ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine、ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine、ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（hydrogenated soy phosphatidylcholine、ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（egg phosphatidylcholine、ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（dioleoylphosphatidylserine、ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（sphingomyelin、ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（dimyristoyl phosphatidylcholine、ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（dimyristoyl phosphatidylglycerol、ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（distearoylphosphatidylglycerol、ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（dierucoylphosphatidylcholine、ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（palmitoyloleyolphosphatidylglycerol、ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（dielaidoyl-phosphatidylethanolamine、ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（1,2-dilauroyl-sn-glycero-3 -pho sphoethanolamine、ＤＬＰＥ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）；レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル；ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール；ＰＥＧ－ジステリルグリセロール；ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド；ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド；ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド；ＰＥＧ－ジステリルグリカミド；（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）；３，４－ジテトラデカオキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、及びｌ，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨ、又はそれらの組み合わせである。

【0064】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ＬＮＰのＰＥＧ化脂質に化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結され、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖが化学的にコンジュゲートされるか又は共有結合により連結されるＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧである。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、切断不可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される。いくつかの実施形態によれば、切断不可能なリンカーは、マレイミド含有リンカーである。

【0065】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、切断可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される。

【0066】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）含有リンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される。

【0067】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、約３０％～約８０％のモル百分率で存在する。いくつかの実施形態によれば、ステロールは、約２０％～約５０％のモル百分率で存在する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、約２％～約２０％のモル百分率で存在する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、約２．１％～約１０％のモル百分率で存在する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖポリペプチドは、約０．０２μｇ／μｇのＴＮＡ～約０．１μｇ／μｇのＴＮＡの総量で存在する。

【0068】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約１０：１～約４０：１の全脂質のＴＮＡに対する比を有する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の直径を有する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の直径を有する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ナノ粒子は、約６０ｎｍ～約８０ｎｍの直径を有する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットを含み、発現カセットは、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態によれば、発現カセットはポリアデニル化配列を含む。

【0069】

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するか、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来するか、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来するＩＴＲ、又はパルボウイルスに由来する野生型ＩＴＲである。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２から選択される。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、修飾型ＩＴＲ又は変異型ＩＴＲである。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは対称である。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは非対称である。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが少なくとも５塩基対の長さである。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ニック又はギャップを有する。上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニストリングＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。

【0070】

別の態様によれば、本開示は、治療する方法を特徴とし、例えば

【0071】

別の態様によれば、本開示は、対象の腫瘍に治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するか、又は対象の腫瘍にＴＮＡの濃度を増加させる方法であって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれか１つの有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0072】

上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。

【図1】図１Ａ～図１Ｆは、トラスツズマブ由来α－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖが、明確なＨＥＲ２二特異的な膜標的化及び内在化をインビトロで示したことを示す。Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８－（ＡＦ４８８）標識抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを使用して、ＳｋＢＲ３（図１Ａ）及びＳｋＯＶ３（図１Ｂ）Ｈｅｒ２発現（ＨＥＲ２＋）細胞株においてＨＥＲ２受容体結合を示したが、ＨＥＲ２受容体を発現しない（ＨＥＲ２－）、ＭＣＦ７細胞（図１Ｃ）ではＨｅｒ２受容体結合を示さなかった。第２の免疫蛍光標識（ｐＨｒｈｏｄｏ）を使用して、リガンドの内在化を実証した。図１Ｄ～１Ｆに示されるように、ＨＥＲ２受容体を発現するＳｋＢＲ３及びＳｋＯＶ３細胞は、リガンド内在化を示したが（図１Ｄ及び図１Ｅ）、ＭＣＦ７ ＨＥＲ２細胞株は示さなかった（図１Ｆ）。

【図2A】チオールベースの架橋を使用するコンジュゲーションの例示的な一次経路の概略図を示す。

【図2B】チオールベースの架橋を使用するコンジュゲーションの例示的な一次経路の概略図を示す。

【図3A】ｓｃＦｖ－ＬＮＰコンジュゲーションプロセスが優れたコンジュゲーション収率及びＬＮＰ粒子安定性を実証したことを示す。最初のＴＣＥＰ還元、新鮮なＭＡＬ－ＬＮＰ（マレイミドコンジュゲートＬＮＰ）調製、０．５％ＭＡＬ－ＰＥＧ２Ｋ、ｓｃＦｖを含めたコンジュゲーションプロセスの結果：０．５、０．２５、０．１、及び０．０５の等モル当量を図３Ａに示す。次に、ＰＥＧ鎖長をＰＥＧ５Ｋまで増加させ、透析ステップを行って、粒径及び安定性を破壊することなく未反応のｓｃＦｖを除去した。結果を図３Ｂに示す。

【図3B】ｓｃＦｖ－ＬＮＰコンジュゲーションプロセスが優れたコンジュゲーション収率及びＬＮＰ粒子安定性を実証したことを示す。最初のＴＣＥＰ還元、新鮮なＭＡＬ－ＬＮＰ（マレイミドコンジュゲートＬＮＰ）調製、０．５％ＭＡＬ－ＰＥＧ２Ｋ、ｓｃＦｖを含めたコンジュゲーションプロセスの結果：０．５、０．２５、０．１、及び０．０５の等モル当量を図３Ａに示す。次に、ＰＥＧ鎖長をＰＥＧ５Ｋまで増加させ、透析ステップを行って、粒径及び安定性を破壊することなく未反応のｓｃＦｖを除去した。結果を図３Ｂに示す。

【図4A】ＬＮＰサイズ及び封入効率が、コンジュゲーションプロセスによるｓｃＦｖコンジュゲーション後（±１０ｎｍ）に維持されたことを示すグラフである。

【図4B】ＬＮＰサイズ及び封入効率が、コンジュゲーションプロセスによるｓｃＦｖコンジュゲーション後（±１０ｎｍ）に維持されたことを示すグラフである。

【図5】マレイミドコンジュゲーションプロセスが強固なコンジュゲーションをもたらしたことを示す。

【図6A】０．５％ＤＳＰＥ対照ＬＮＰ（図６Ｂ）ではなく、Ｔｒａｓ－ｓｃＦｖコンジュゲートＬＮＰ（図６Ａ）のみがＨＥＲ２結合を示したことを示すグラフであり、それによってＬＮＰ上のリガンド機能が確認された。

【図6B】０．５％ＤＳＰＥ対照ＬＮＰ（図６Ｂ）ではなく、Ｔｒａｓ－ｓｃＦｖコンジュゲートＬＮＰ（図６Ａ）のみがＨＥＲ２結合を示したことを示すグラフであり、それによってＬＮＰ上のリガンド機能が確認された。

【図7】マレイミドコンジュゲートＬＮＰ（ＭＡＬ－ＬＮＰ）が、Ｈｅｒ２特異的な増強された細胞取り込みを実証したことを示し、具体的には、コンジュゲートＴｒａｓ－ｓｃＦｖ Ｌｉｐｉｄ Ａ ＬＮＰ（ｍＣｈｅｒｒｙ）の取り込みがＨＥＲ２によって媒介されたことを実証している。

【図8A】ＬＮＰ表面のリガンド提示が生物活性に有意に影響を及ぼしたことを示す。図８Ａのグラフは、細胞生存率に対して正規化した、ＰＥＧ鎖長が２０００ Ｄａ（ＰＥＧ２Ｋ）又は５０００ Ｄａ（ＰＥＧ５Ｋ）のいずれかであったマレイミドコンジュゲートＬＮＰにおけるＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）を比較する。図８Ａに示すように、ＰＥＧ５Ｋを有するマレイミドコンジュゲートＬＮＰは、ＬＮＰの細胞取り込みによって評価したところ、より大きな生物活性を示した。図８Ｂのグラフは、（ＰＥＧ５Ｋにコンジュゲートした）マレイミド濃度が０．５％～１．２５％に増加するにつれて、ＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）の用量依存的減少が観察されたことを示す。

【図8B】ＬＮＰ表面のリガンド提示が生物活性に有意に影響を及ぼしたことを示す。図８Ａのグラフは、細胞生存率に対して正規化した、ＰＥＧ鎖長が２０００ Ｄａ（ＰＥＧ２Ｋ）又は５０００ Ｄａ（ＰＥＧ５Ｋ）のいずれかであったマレイミドコンジュゲートＬＮＰにおけるＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）を比較する。図８Ａに示すように、ＰＥＧ５Ｋを有するマレイミドコンジュゲートＬＮＰは、ＬＮＰの細胞取り込みによって評価したところ、より大きな生物活性を示した。図８Ｂのグラフは、（ＰＥＧ５Ｋにコンジュゲートした）マレイミド濃度が０．５％～１．２５％に増加するにつれて、ＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）の用量依存的減少が観察されたことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0073】

本開示は、治療用核酸（ＴＮＡ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物（例えば、薬学的組成物）であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖが、細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面に存在する抗原を対象とする、脂質ナノ粒子組成物を提供する。任意のｓｃＦｖがＬＮＰに連結され得、ｓｃＦｖが対象とする抗原を発現する任意の細胞又は組織を標的とするのに有用であることは、本開示の有利な特徴である。本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、有利なことに、粒径及び安定性への影響が最小限である効率的な共有結合によるコンジュゲーションを提供する。

【0074】

一態様によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、治療用核酸（ＴＮＡ）、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖが、細胞の表面に存在する抗原を対象とする、薬学的組成物を提供する。ＬＮＰへのｓｃＦｖのマレイミドコンジュゲーションが、ＬＮＰへの強固なコンジュゲーションをもたらし、重要なことに、ＬＮＰのサイズ及び完全性を維持したことは、本開示の知見である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶは、ＬＮＰに共有結合により連結される。本明細書で使用される場合、「共有結合」という用語は、原子間の電子対の共有を伴う化学結合を指す。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶは、ＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、コンジュゲーション化学又はシステムを指す場合の「コンジュゲーション」という用語は、複数の原子からの非局在化電子を有するｐ軌道を重複させる系を指す。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶは、切断不可能なリンカーを介してＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態によれば、切断不可能なリンカーは、マレイミド含有リンカーである。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶは、切断可能なリンカーを介してＬＮＰに化学的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態によれば、切断可能なリンカーは、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）含有リンカーである。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶは、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションを介してＬＮＰに連結される。本明細書で使用される場合、「トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーション」は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）によって媒介される、本明細書で定義されるコンジュゲーションを指す。ＭＴＧａｓｅは、リンカー内の第一級アミンと、抗体又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の特異的グルタミン残基の側鎖、例えば、脱グリコシル化キメラ、ヒト化ＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ１内のグルタミン２９５との間の部位特異的修飾（すなわち、ペプチド転移）を触媒する（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎａｍｉ Ｙ．，Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ Ｋ．（２０２０）Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｔｕｍｅｙ Ｌ．（ｅｄｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ２０７８．Ｈｕｍａｎａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照されたい）。この方法は、アスパラギン２９７の突然変異、グルタミン含有ペプチドタグの挿入、及び分岐リンカーの使用によって実施することができる。そのような修飾は、コンジュゲーションプロセスを容易にし、コンジュゲーション部位及び薬物対抗体比（ＤＡＲ）を調整する際に柔軟性をもたらす（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｓｕａｋｉ Ａｎａｍｉ ａｎｄ Ｋｙｏｊｉ Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ」ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ （２０２０））。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、グルタミン含有ペプチドタグの挿入及び／又は分岐リンカーの使用によって増強することができる。一実施形態では、グルタミン含有ペプチドタグは、ＬＬＱＧＡ（Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ａｌａ又は配列番号４）である。いくつかの実施形態では、グルタミン含有ペプチドタグは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、グルタミン含有ペプチドタグは、配列番号４からなる。

【0075】

更なる利点として、本明細書に記載のＬＮＰは、治療用核酸のより効率的な送達、より良好な忍容性及び改善された安全性プロファイルを提供する。本明細書中に記載する治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ウイルスカプシド内の空間によって課されるパッケージングの制約がないため、理論的には、治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の唯一のサイズ制限は、宿主細胞のＤＮＡ複製効率に存在する。本明細書に記載及び例示されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）のような治療用核酸（ＴＮＡ）である。本明細書に記載及び例示されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｃｅＤＮＡである。これも本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｍＲＮＡである。

【0076】

Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。免疫学及び分子生物学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．により発行，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２ （ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより発行，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（編），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより発行，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ （２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容は全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0077】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。

【0078】

略語「例えば（e.g.）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、「例えば（for example）」と同義である。

【0079】

代替案（例えば、「又は」）の使用は、代替案のいずれか一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されたい。

【0080】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、開示された方法を実施するのに適切であるように指定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、更により好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0081】

本明細書で使用される場合、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、又は整数範囲は、別途明記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合にはその端数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。

【0082】

本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、及び「含む（comprises）」、及び「含む（comprised of）」は、「含む（include）」、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（contain）」、「含有する（containing）」、「含有する（contains）」という用語と同義であることを意味し、例えば、構成成分に続くものの存在を指定する包括的又はオープンエンドの用語であり、当該技術分野において既知であるか、又はそこに開示されている、追加の、引用されていない構成成分、特徴、エレメント、メンバー、ステップの存在を除外又は排除しない。

【0083】

「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されていないいずれのエレメントも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、プロセス、及びそれらのそれぞれの構成成分を指す。

【0084】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的及び新規又は機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。

【0085】

本明細書で使用される場合、「など」、「例えば」などの用語は、例示的な実施形態を指すことを意図しており、本開示の範囲を限定するものではない。

【0086】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の試験のための実施において使用することができるが、好適な材料及び方法は、本明細書に記載される。

【0087】

本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語及びその変形語は、組成物又は薬剤（例えば、核酸、特にｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物又は薬剤の同時かつ連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、及び実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロ及びエクスビボ治療も包含する。組成物又は薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、又は局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理及び他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。

【0088】

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書の他の箇所に更に記載されるように、任意の天然に存在する、組換え、修飾又は操作された免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン様構造又はその抗原結合断片若しくは部分、又はその誘導体を包含する。したがって、この用語は、標的抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むが、いくつかの事例では、重鎖のみを含み得るラクダ科動物において天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の供給源のみに由来し得るか、又は「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分は、２つの異なる抗体に由来し得る。抗体、又はその抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって、ハイブリドーマにおいて産生され得る。抗体という用語は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）をそれぞれ含む。

【0089】

抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ＴＧＦβ１）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指すことを意味する。抗原結合部分としては、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合部分は、例えば、任意の好適な標準的技法、例えば、タンパク質分解消化又は抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組換え遺伝子操作技法を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。抗原結合部分の非限定的な例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）、（ｖｉ）ｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＮＡＴＵＲＥ ３４１：５４４－５４６）、並びに（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。ダイアボディ等の他の形態の一本鎖抗体もまた、包含される。抗体の抗原結合部分という用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーを含み、当該抗体ドメイン及び当該リンカーがＮ末端からＣ末端方向に以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し、当該リンカーが少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである、「ｓｃＦａｂ」としても知られる「単鎖Ｆａｂ断片」を含む。

【0090】

本明細書中で使用される場合、「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成するために共有結合により連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、直接結合するか、又はＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、若しくはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と接続するペプチドコードリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）によって結合する。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富である。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３，１９８８）によって記載されているように、ＶＨ及びＶＬコード配列を含む核酸から発現させることができる。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号及び同第４，９５６，７７８号；並びに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号及び同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。いくつかの実施形態によれば、Ｆａｂ’に由来するｓｃＦｖが使用されてもよい（抗体からの代わりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた）。一実施形態において、ｓｃＦｖは、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する。

【0091】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子を指すことを意味する。この免疫応答は、抗体産生、又は特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、又はその両方を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、その用語が本明細書で使用される場合、「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。更に、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、生成、合成され得るか、又は生物試料に由来し得る。そのような生物試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞又は生体液が挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。一実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、グリオーマ関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログルビリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン－３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、ＨＭＷ－ＭＡＡ及びＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、フィブロネクチン、テネイシン、又は腫瘍の壊死領域の癌胎児性変異体などの腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する抗原である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ又はＴＳＡは、腫瘍細胞において発現又は過剰発現される任意の膜タンパク質又はバイオマーカーであり、インテグリン（例えば、インテグリンαｖβ３、α５β１）、ＥＧＦ受容体ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ２、Ｅｒｂｂ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｂｂ４）、プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）、ジシアロガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３）、Ｂ７－Ｈ３（ａｋａ ＣＤ２７６）、がん抗原１２５（ＣＡ－１２５）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１及び２（ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２）、ＣＤ５２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍関連糖タンパク質（例えば、ＴＡＧ－７２）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１５２、ムチン１（ＭＵＣ１）、腫瘍壊死因子受容体（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、インスリン様増殖因子受容体、葉酸受容体ａ、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、Ｃ－Ｃケモカイン抗原受容体（例えば、ＣＣＲ４）、前立腺特異的膜受容体（ＰＳＭＡ）、受容体ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）受容体、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、並びに他の腫瘍特異的受容体又は抗原が挙げられるが、これらに限定されない、腫瘍細胞において発現又は過剰発現される任意の膜タンパク質又はバイオマーカーである。

【0092】

一実施形態では、抗原は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。

【0093】

本明細書で使用される場合、「抗治療用核酸免疫応答」、「抗転移ベクター免疫応答」、「治療用核酸に対する免疫応答」、「転移ベクターに対する免疫応答」などの句は、その起源がウイルス性又は非ウイルス性の治療用核酸に対する任意の望ましくない免疫応答を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答は、ウイルス転移ベクター自体に対する抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡであり得る転移ベクターに特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターの配列に特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターのＣｐＧ含有量に特異的である。

【0094】

本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、全体又は一部に水を含む組成物を指すことを意味する。

【0095】

本明細書で使用される場合、「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、それらには、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、並びにプリン及びピリミジンの合成誘導体が更に含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。

【0096】

本明細書で使用される場合、「担体」と及び「賦形剤」という用語は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含むことを意味する。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

【0097】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（double stranded、ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（closed-ended linear duplex、ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（minimalistic immunological-defined gene expression、ＭＩＤＧＥ）ベクターである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニスタリングＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８号に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のための特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＵＳ１８／４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願された同第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のための特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0098】

本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。

【0099】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。

【0100】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指すことを意味する。

【0101】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指すことを意味する。

【0102】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）が挙げられるが、これに限定されない）を指すことを意味する。

【0103】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）領域を更に組み込む発現カセットを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。

【0104】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指すことを意味し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。

【0105】

本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス又は非ウイルス末端配列又は合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」又はＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）とも称される）及び末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒にＡＡＶの「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳ及び少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルス粒子及びＤＮＡのパッケージング、ＤＮＡの組み込み、並びにゲノム及びプロウイルスのレスキューを媒介するのに重要な役割を果たす。全長にわたって逆相補体（パリンドローム）ではないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、宿主細胞内の複製を媒介することができるウイルス又は非ウイルスＡＡＶベクター中のＴＲを指すために使用される。複合ＡＡＶベクター構成中、３つ以上のＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。

【0106】

「ＩＴＲ」は、１つ以上の望ましい機能的配列（例えば、パリンドローム配列、ＲＢＳ）を含むオリゴヌクレオチドのセットを使用して人工的に合成することができる。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ、人工の非ＡＡＶ ＩＴＲ、又はウイルス性ＡＡＶ ＩＴＲに物理的に由来するＩＴＲ（例えば、ウイルスゲノムから除去されたＩＴＲ断片）であり得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス及びディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来し得るか、又はＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、及び／若しくは付加によって更に修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ及び無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅからなる。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。典型的には、ＩＴＲ配列は、野生型、「ｄｏｇｇｙ ｂｏｎｅ」及び「ダンベル型」、対称型又は非対称型ＩＴＲ配向の構成で、ＡＡＶだけでなく、パルボウイルス、レンチウイルス、ガチョウウイルス、Ｂ１９に由来することができる。ＩＴＲは典型的にはＡＡＶベクターの５’及び３’末端の両方に存在するが、ＩＴＲは直鎖状ベクターの一方の末端にのみ存在することができる。例えば、ＩＴＲは、５’末端にのみ存在することができる。他のいくつかのケースでは、ＩＴＲは合成ＡＡＶベクターの３’末端にのみ存在することができる。本明細書では便宜上、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ベクター又は合成ＡＡＶ中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0107】

本明細書で使用される場合、「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を維持する、ＡＡＶゲノム又は他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コード又はドリフトの縮重に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。

【0108】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ＩＴＲである合成ＡＡＶベクター内の一対のＷＴ－ＩＴＲを指す。例えば、変化が配列の物理的及び機能的特性並びに全体的な三次元構造（二次元及び三次元構造体）に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される場合）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。

【0109】

本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ」又は「変異型ＩＴＲ」の語句は、交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの三次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、三次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその三次元構造）の変化をもたらし得る。

【0110】

本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも称される「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補ではない一本鎖合成ＡＡＶゲノム内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの三次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の三次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、三次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アーム及び／又は短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であってもよく、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型又は合成ＩＴＲ配列）であってもよい。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、又は短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。

【0111】

本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型又は変異型（例えば、野生型に対して修飾型）ディペンドウイルスＩＴＲ配列であり、かつそれらの全長にわたって逆相補である、一本鎖ＡＡＶゲノム内の一対のＩＴＲを指す。非限定的な一例において、両ＩＴＲは、ＡＡＶ２からの野生型ＩＴＲ配列である。別の例では、いずれのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは、修飾型ＩＴＲであり、変異型ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、又は点変異に起因して、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。

【0112】

本明細書で使用される場合、「実質的に対称な修飾型ＩＴＲ」又は「実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する合成ＡＡＶ内の一対の修飾型ＩＴＲを指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、三次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な三次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な三次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来してもよく、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来していてもよいが、両方が同じ対応する変異を有していてもよく（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが三次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（modified ITR、ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又はデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。

【0113】

本明細書で使用される場合、活性剤又は治療用核酸などの治療剤の「有効量」又は「治療有効量」という語句は、治療用核酸の不存在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。標的遺伝子又は標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、及び当業者に既知の表現型アッセイなどの当業者に既知の技法を使用するタンパク質又はＲＮＡレベルの検査を含む。

【0114】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及び処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「発現産物」という語句は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。

【0115】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指すことを意味する。発現される配列は、多くの場合、宿主細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。発現ベクターは、組換えベクターであってもよい。

【0116】

本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指すことを意味する。一般に、配列ＡＢＣにおいて、ＢはＡ及びＣに隣接している。配列Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。

【0117】

本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」という用語は、ベクター又はゲノム内の機能的エレメントを分離する介在配列を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ベクター又はゲノムの遺伝的安定性を提供するか、又は増大させる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、クローニング部位及び塩基対の設計番号のギャップに便利な位置を提供することによって、ゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。

【0118】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、ＤＮＡベクター、例えば、合成ＡＡＶベクターの導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他のＤＮＡ調節配列に操作可能に連結される異種ＤＮＡ配列を指すことを意味する。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。

【0119】

本明細書で使用される場合、「遺伝性疾患」又は「遺伝性障害」という語句は、ゲノム中の１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患を指すことを意味する。異常は、遺伝子における変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。

【0120】

本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の反復配列を指すことを意味する。

【0121】

本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指すことを意味し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。それらは、通常、少なくとも３つのクラス：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、並びに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」に分類される。

【0122】

リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。追加的に、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含む他の脂質と混合することができる。

【0123】

一実施形態では、脂質組成物は、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合、及びジスルフィド結合を含む。

【0124】

本明細書で使用される場合、「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を指すことを意味する。そのような脂質コンジュゲートには、限定されないが、ＰＥＧ化脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングしたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングしたＰＥＧ、及びセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）、カチオン性ＰＥＧ化脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びそれらの混合物が挙げられる。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加の例は、国際特許出願公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質にカップリングするのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0125】

本明細書で使用される場合、「脂質で封入する」という用語は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）などの活性剤又は治療剤を、完全封入、部分封入、又はその両方で提供する脂質粒子を指すことを意味する。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。

【0126】

本明細書で使用される場合、「脂質粒子」又は「脂質ナノ粒子」という用語は、核酸治療薬などの治療剤を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用され得る脂質製剤を指すことを意味する。一実施形態では、本開示の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び任意選択的に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分に封入し、それにより酵素分解から保護することができる。一実施形態では、脂質粒子は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）と、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合及びジスルフィド結合を含む脂質とを含む。

【0127】

いくつかの実施形態によれば、本開示の脂質粒子は、典型的には、平均直径が約２０ｎｍ～約７５ｎｍ、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２５ｎｍ～約７５ｎｍ、約２５ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７５ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３５ｎｍ～約７５ｎｍ、約３５ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７５ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６５ｎｍ～約７５ｎｍ、約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５１ｎｍ、約５２ｎｍ、約５３ｎｍ、約５４ｎｍ、約５５ｎｍ、約５６ｎｍ、約５７ｎｍ、約５８ｎｍ、約５９ｎｍ 約６０ｎｍ、約６１ｎｍ、約６２ｎｍ、約６３ｎｍ、約６４ｎｍ、約６５ｎｍ、約６６ｎｍ、約６７ｎｍ、約６８ｎｍ、約６９ｎｍ、約７０ｎｍ、約７１ｎｍ、約７２ｎｍ、約７３ｎｍ、約７４ｎｍ、又は約７５ｎｍ（±３ｎｍ）のサイズである。

【0128】

一般に、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。

【0129】

いくつかの実施形態によれば、本開示の脂質粒子は、典型的には、平均直径が約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満のサイズである。

【0130】

本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで正に荷電する任意の脂質を指す。脂質粒子中のカチオン性脂質は、例えば、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、「ＳＳ切断可能な脂質」、又はそれらの混合物などの１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はまた、イオン化可能な脂質、すなわち、イオン化可能なカチオン性脂質である。本明細書に記載の全てのカチオン性脂質の対応する四級脂質（すなわち、カチオン性部分中の窒素原子がプロトン化されており、４つの置換基を有するもの）は、本開示の範囲内であると企図される。本明細書に記載の任意のカチオン性脂質は、例えば、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）中のクロロメタン（ＣＨ_３Ｃｌ）で処理することにより、対応する四級脂質に変換され得る。

【0131】

本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0132】

本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１つ以上の芳香族、脂環式、又は複素環式基で任意選択的に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。

【0133】

本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能基を有する脂質、例えばカチオン性脂質を指すことを意味する。ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、荷電又は中性脂質への言及は優勢種の性質を指し、全ての脂質が荷電又は中性の形態で存在する必要はないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、イオン化可能な脂質は、約４～約７の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、「切断可能な脂質」又は「ＳＳ切断可能な脂質」を含み得る。

【0134】

本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指すことを意味する。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、及び任意の他の中性脂質又はアニオン性脂質を指すことを意味する。

【0136】

本明細書で使用される場合、「切断可能な脂質」又は「ＳＳ切断可能な脂質」という用語は、ジスルフィド結合の切断可能な単位を含む脂質を指す。切断可能な脂質には、ｐＨ感受性の三級アミン及び自己分解性フェニルエステルを含む脂質様物質を含有する切断可能なジスルフィド結合（「ｓｓ」）が含まれ得る。例えば、ＳＳ切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＰ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ）、ｓｓ－Ｍ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－Ｍ）、ｓｓ－Ｅ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－Ｅ）、ｓｓ－ＥＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ）、ｓｓ－ＬＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ）、ｓｓ－ＯＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ）、及びｓｓ－ＰａｌｍＥ脂質（例えば、式Ｉ～ＩＶを参照されたい）、又はＴｏｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ「Ａ ｈｅｐａｔｉｃ ｐＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ －ｓｃａｆｆｏｌｄ ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｉｄ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ」２７９：２６２－２７０によって記載された脂質であり得る。切断可能な脂質の追加の例は、米国特許第９，７０８，６２８号及び米国特許第１０，３８５，０３０号に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、切断可能な脂質は、酸性区画、例えば、膜不安定化のためのエンドソーム又はリソソーム、及び細胞質などの還元環境で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。一実施形態では、切断可能な脂質は、カチオン性脂質である。一実施形態では、切断可能な脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。切断可能な脂質は、本明細書でより詳細に記載されている。

【0137】

本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体又は一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指すことを意味する。

【0138】

本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水性体積を封入する球形構成で組み立てられた脂質分子を指すことを意味する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再位置付けすることによって作用して、薬物又は活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的には、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0139】

本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤の、生物内の標的部位への直接的送達を指すことを意味する。例えば、薬剤は、腫瘍等の疾患部位、又は炎症部位等の他の標的部位、又は肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。

【0140】

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むポリマーを指すことを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体又は修飾型骨格残基若しくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列だけではなく、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列を暗黙的に包含する。

【0141】

本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」及び「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患又は障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療剤の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ＤＯＧＧＹＢＯＮＥ（商標）ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（minimalistic immunological-defined gene expression、ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル形ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）を含む。

【0142】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。

【0143】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油などのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用について、米国連邦政府の規制当局によって承認された、又は米国薬局方に列挙されている薬剤、並びに対象に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性及び特性を損なわない担体又は希釈剤のいずれかを包含する。

【0144】

本明細書で使用される場合、「ギャップ」という用語は、本開示の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指すことを意味し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計及び作成された典型的なギャップ、及び当該方法によって生成された合成ベクターは、長さが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、長さが１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。

【0145】

本明細書で使用される場合、「ニック」という用語は、典型的には損傷又は酵素作用による一本鎖の隣接ヌクレオチド間にホスホジエステル結合がない二本鎖ＤＮＡ分子の不連続性を指す。１つ以上のニックは、ＤＮＡ複製中に鎖のねじれの解放を可能にし、ニックはまた、転写機構の結合を促進する役割を果たすと考えられていることが理解される。

【0146】

「受容体」とは、１つ以上のリガンドに選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチド、又はその一部を意味する。「受容体」という用語は、本明細書中で使用される場合、受容体全体又はそのリガンド結合部分を包含することが意図される。受容体のこれらの部分は、特に、リガンドの特異的結合が生じるのに十分な領域を含む。

【0147】

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には調節されない細胞増殖及び悪性腫瘍を特徴とする多細胞真核生物における生理学的状態を指す。したがって、この用語は、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病）、並びに骨髄線維症及び多発性骨髄腫を広く包含する。

【0148】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示による治療用核酸による予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指すことを意味する。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、トラウト、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様の特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。

【0149】

本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という語句は、語句の文脈及び使用法が別段の指示されない限り、（ｉ）記載された開示内容に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（若しくはｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を投与される予定であり、（ｉｉ）記載された開示内要に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（若しくはａｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けているか、又は（ｉｉｉ）記載された開示内要に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（若しくはｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けた、対象を指す。

【0150】

本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」及び／又は「低減する」という用語（並びに同様の用語）は、一般に、天然、予想若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低減する行為を指す。

【0151】

本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指すことを意味する。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺など）によって、又は急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解又は排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、例えば静脈内、皮下、及び腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、静脈内送達による。

【0152】

本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「有効な量」、又は「薬学的有効量」という用語は交換可能に使用され、治療の意図された利益を提供するのに十分な量を指す。しかしながら、投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、記載された本開示の組成物の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）量を含む。記載された本開示の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）用途において、薬学的組成物又は薬剤は、疾患、障害又は状態の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症、並びに疾患、障害又は状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害又は状態に罹患しやすい患者、又はそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除若しくは低減するか、重症度を減少させるか、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0153】

本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。

【0154】

本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。

【0155】

薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。

【0156】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、又は状態の臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、以下：（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者において障害の再発を制限すること、及び（ｅ）以前に障害に対して無症候性であった患者において症状の再発を制限すること、のうちの１つ以上を達成することを更に指す。

【0157】

薬理学的及び／又は生理学的効果などの有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。

【0158】

薬理学的及び／又は生理学的効果などの有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。

【0159】

本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、２つ以上の治療剤を含む臨床適応のための処置レジメンを指す。したがって、この用語は、第１の組成物（例えば、有効成分）を含む第１の療法が、第２の組成物（有効成分）を含む第２の療法と併せて患者に投与され、同じ又は重複する疾患又は臨床状態を治療することが意図される治療レジメンを指す。第１及び第２の組成物は両方とも、同じ細胞標的、又は別個の細胞標的に作用し得る。併用療法の文脈における「と併せて」という語句は、併用療法を受けている対象において、第１の療法の治療効果が第２の療法の治療効果と一時的及び／又は空間的に重複することを意味する。したがって、併用療法は、同時投与のための単一製剤として、又は療法の連続投与のための別々の製剤として製剤化することができる。

【0160】

本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和一価炭化水素基（すなわち、Ｃ_１～２０アルキル）を指す。「一価」とは、アルキルが分子の残りの部分に１つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキルは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～１２アルキル）、又は１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～１０アルキル）を有する。一実施形態では、アルキルは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～８アルキル）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～７アルキル）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～６アルキル）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～４アルキル）、又は１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～３アルキル）を有する。例としては、メチル、エチル、１－プロピル、２－プロピル、１－ブチル、２－メチル－１－プロピル、２－ブチル、２－メチル－２－プロピル、１－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、２－メチル－２－ブチル、３－メチル－２－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－１－ブチル、１－ヘキシル、２－ヘキシル、３－ヘキシル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、３－メチル－３－ペンチル、２－メチル－３－ペンチル、２，３－ジメチル－２－ブチル、３，３－ジメチル－２－ブチル、１－ヘプチル、１－オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキル」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～４アルキル」、若しくは「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキル」などの直鎖又は分岐鎖アルキルは、飽和一価炭化水素基が直鎖又は分岐鎖であることを意味する。本明細書で使用される場合、脂肪族炭化水素鎖を指す用語「直鎖」は、鎖が分岐していないことを意味する。

【0161】

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和二価炭化水素基（すなわち、Ｃ_１～２０アルキレン）を指し、その例には、上に例示したようなアルキル基の同じコア構造を有するものが挙げられるが、それらに限定されない。「二価」とは、アルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキレンは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～１２アルキレン）、又は１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～１０アルキレン）を有する。一実施形態では、アルキレンは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～８アルキレン）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～７アルキレン）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～６アルキレン）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～４アルキレン）、又は１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１～３アルキレン）を有し、エチレン、又はメチレンである。「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレン」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～４アルキレン」、若しくは「直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキレン」などの直鎖又は分岐鎖アルキレンは、飽和二価炭化水素基が直鎖又は分岐鎖であることを意味する。

【0162】

「アルケニル」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖脂肪族炭化水素基を指し、アルケニル基は、「シス」及び「トランス」配向、又は別の命名法によれば、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を含む。

【0163】

本明細書で使用される「アルケニレン」は、１つ又は２つの炭素－炭素二重結合を有する２～２０個の炭素原子の脂肪族二価炭化水素基（すなわち、Ｃ_２～２０アルケニレン）を指し、ここで、アルケニレン基は、「シス」及び「トランス」配向又は別の命名法によれば、「Ｅ」及び「Ｚ］配向を有する基を含む。「二価」とは、アルケニレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルケニレンは、２～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ_２～１６アルケニレン）、又は２～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ_２～１０アルケニレン）を有する。一実施形態では、アルケニレンは２～４個の炭素原子（Ｃ_２～４）を有する。例としては、エチレニレン又はビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、アリル（－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－）などが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖又は分岐鎖Ｃ_２～６アルケニレン」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ_２～４アルケニレン」、若しくは「直鎖又は分岐鎖Ｃ_２～３アルケニレン」などの直鎖又は分岐鎖アルケニレンは、不飽和二価炭化水素基が直鎖又は分岐鎖であることを意味する。

【0164】

本明細書で使用される「シクロアルキレン」は、単環式環として３～１２個の炭素原子、又は二環式環として７～１２個の炭素原子を有する二価飽和炭素環式環基を指す。「二価」は、シクロアルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、シクロアルキレンは、３員～７員の単環式又は３員～６員の単環式である。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、シクロノニレン、シクロデシレン、シクロウンデシレン、シクロドデシレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シクロアルキレンはシクロプロピレンである。

【0165】

「複素環」、「ヘテロシクリル」、複素環式及び「複素環式環」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも１個のＮ原子を含有し、ヘテロ原子、並びに任意選択的にＮ及びＳから選択される１～３個の追加のヘテロ原子を有し、非芳香族である（すなわち、部分的又は完全に飽和している）環状基を指す。単環式又は二環式（架橋若しくは融合）にすることができる。複素環式環の例としては、アジリジニル、ジアジリジニル、チアジリジニル、アゼチジニル、ジアゼチジニル、トリアゼチジニル、チアジアゼチジニル、チアゼチジニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イソチアゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、アゼパニル、アゾカニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。複素環は、１～４個のヘテロ原子を含み、これは、Ｎ及びＳから選択され、同じであっても異なっていてもよい。１つの実施形態では、複素環は、１～３個のＮ原子を含む。別の実施形態では、複素環は、１個又は２個のＮ原子を含有する。別の実施形態では、複素環は、１個のＮ原子を含有する。「４員～８員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された４～８個の原子（Ｎ及びＳから選択される１～４個のヘテロ原子、又は１～３個のＮ原子、又は１個若しくは２個のＮ原子、又は１個のＮ原子を含む）を有する基を意味する。「５員又は６員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された５又は６個の原子（Ｎ及びＳから選択される１～４個のヘテロ原子、又は１～３個のＮ原子、又は１個若しくは２個のＮ原子、又は１個のＮ原子を含む）を有する基を意味する。「複素環」という用語は、考えられる全ての異性体形態を含むことを意図している。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １、３、４、６、７及び９、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０から現在まで）、特に、Ｖｏｌｕｍｅｓ １３、１４、１６、１９、及び２８、並びにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。ヘテロシクリル基は、可能であれば、分子の残りの部分に結合した炭素（炭素結合）又は窒素（窒素結合）であり得る。

【0166】

基が「任意選択的に置換されている」と記載されている場合、その基は（１）置換されていないか、又は（２）置換されている場合がある。基の炭素が置換基のリストのうちの１つ以上で任意選択的に置換されていると記載されている場合、炭素上水素原子のうちの１つ以上（存在する範囲で）を、独立して選択された任意の置換基で別々に及び／又は一緒に置き換えることができる。

【0167】

アルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクリルに好適な置換基は、二官能性化合物の生物活性に著しく悪影響を及ぼさないものである。特に明記しない限り、これらの基の例示的な置換基としては、１～１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状又は環状のアルキル、アルケニル又はアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、グアニジニウム［－ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、－ＯＲ_１００、ＮＲ_１０１Ｒ_１０２、－ＮＯ_２、－ＮＲ_１０１ＣＯＲ_１０２、－ＳＲ_１００、－ＳＯＲ_１０１によって表されるスルホキシド、－ＳＯ_２Ｒ_１０１によって表されるスルホン、スルホネート－ＳＯ_３Ｍ、サルフェート－ＯＳＯ_３Ｍ、－ＳＯ_２ＮＲ_１０１Ｒ_１０２によって表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、－ＣＯＲ_１０１、－ＯＣＯＲ_１０１、－ＯＣＯＮＲ_１０１Ｒ_１０２、及びポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＲ_１０１、式中、Ｍが、Ｈ又はカチオン（例えば、Ｎａ^＋若しくはＫ^＋である）が挙げられ、Ｒ_１０１、Ｒ_１０２及びＲ_１０３は、それぞれ独立して、Ｈ、１～１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－Ｒ_１０４（ｎが１～２４の整数である）、６～１０個の炭素原子を有するアリール、３～１０個の炭素原子を有する複素環式環、及び５～１０個の炭素原子を有するヘテロアリールから選択され、Ｒ_１０４は、Ｈ、１～４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖環状アルキルであり、Ｒ_１００、Ｒ_１０１、Ｒ_１０２、Ｒ_１０３及びＲ_１０４によって表される基のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクルシル（heterocyclcyl）は、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、及び１～４個の炭素原子を有する非置換の直鎖若しくは分岐鎖アルキルから独立して選択される１個以上（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれより多くの）置換基で任意選択的に置換される。好ましくは、上記の任意選択的に置換されたアルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクリルについての置換基は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＲ_１０１Ｒ_１０２、－ＣＦ_３、－ＯＲ_１００、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－ＳＲ_１０１、－ＳＯＲ_１０１、－ＳＯ_２Ｒ_１０１、及び－ＳＯ_３Ｍからなる群から選択される。あるいは、適切な置換基は、ハロゲン、－ＯＨ、－ＮＯ_２、－ＣＮ、Ｃ_１～４アルキル、－ＯＲ_１００、ＮＲ_１０１Ｒ_１０２、－ＮＲ_１０１ＣＯＲ_１０２、－ＳＲ_１００、－ＳＯ_２Ｒ_１０１、－ＳＯ_２ＮＲ_１０１Ｒ_１０２、－ＣＯＲ_１０１、－ＯＣＯＲ_１０１、及び－ＯＣＯＮＲ_１０１Ｒ_１０２からなる群から選択され、ここで、Ｒ_１００、Ｒ_１０１、及びＲ_１０２は、それぞれ独立して、－Ｈ又はＣ_１～４アルキルである。

【0168】

本明細書で使用される「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを指す。「シアノ」は、－ＣＮである。

【0169】

本明細書で交換可能に使用される「アミン」又は「アミノ」は、孤立電子対を有する塩基性窒素原子を含有する官能基を指す。

【0170】

本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のイオン化可能な脂質の薬学的に許容される有機又は無機の塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモ酸（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、並びにアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。

【0171】

本明細書に開示される本開示の代替エレメント又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。

【0172】

態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。

【0173】

本明細書では、本開示の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。

【0174】

本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。

【0175】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0176】

前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示の特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0177】

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。

【0178】

ＩＩ．脂質ナノ粒子組成物
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む薬学的組成物が本明細書で提供される。ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする。「結合された」という用語は、化学的コンジュゲーション、吸着（物理吸着及び／又は化学吸着）を包含する。「連結された」という用語によって包含される結合の種類は、共有結合相互作用及び非共有結合相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合、及び疎水結合）である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、共有結合によるコンジュゲーションを介してＬＮＰに連結される。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、マレイミド連結を介してＬＮＰに連結される。ＬＮＰへのｓｃＦｖのマレイミドコンジュゲーションが、ＰＤＳコンジュゲーションなどの他のチオールベースの架橋方法と比較して、ＬＮＰへのより強固なコンジュゲーションをもたらし、重要なことにＬＮＰのサイズ及び完全性を維持したことは、本開示の知見である。

【0179】

したがって、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ここで、ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする］、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ｓｃＦｖが、切断不可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される、薬学的組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態によれば、切断不可能なリンカーは、マレイミド含有リンカーである。

【0180】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ここで、ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする］、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ｓｃＦｖが、切断可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される、薬学的組成物、薬学的組成物も本明細書で提供される。

【0181】

本明細書に記載されるＬＮＰは、大きな治療用核酸分子を封入することができる、より小さなサイズを含む、多数の治療上の利点を提供する。本明細書に記載されるｓｃＦｖ ＬＮＰが、ｓｃＦｖが対象とする細胞の表面に存在する抗原を能動的に発現する任意の細胞又は組織を標的とするのに有用であることは、本開示の有利な特徴である。いくつかの実施形態によれば、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態によれば、細胞は肝臓細胞（肝細胞）である。

【0182】

いくつかの実施形態によれば、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍選択的抗原（ＴＳＡ）である。「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡは、腫瘍上で発現される抗原である。「腫瘍選択的抗原」又はＴＳＡは、腫瘍上で選択的に発現される抗原である。一実施形態では、抗原は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。

【0183】

一実施形態では、ＴＡＡ発現は、腫瘍細胞集団のみに限定され、全ての腫瘍細胞によって発現され、腫瘍細胞表面で発現され得る。他の抗原は、腫瘍細胞上で過剰発現されるが、正常細胞上ではより低い発現レベルで見られる場合があり、したがって腫瘍選択的抗原（ＴＳＡ）である。更に、いくつかの腫瘍抗原は、「パッセンジャー変異」として生じ、すなわち、ＤＮＡ修復に対する制御に欠陥を有する腫瘍細胞によって発現される非必須抗原であり、したがって、多様なタンパク質における変異を蓄積する。いくつかの腫瘍抗原は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。

【0184】

いくつかの実施形態によれば、ＴＡＡ又はＴＳＡは、グリオーマ関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログルビリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体及びメソテリン、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン－３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス－Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、及びＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。使用することができる他の例示的な抗原は、フィブロネクチン、テネイシン、又は腫瘍の壊死領域の癌胎児性変異体などの腫瘍の細胞外マトリックス中に存在する抗原である。

【0185】

使用することができる更なる腫瘍選択的分子としては、腫瘍細胞において発現又は過剰発現される任意の膜タンパク質又はバイオマーカーが挙げられ、これらに限定されないが、インテグリン（例えば、インテグリンαｖβ３、α５β１）、ＥＧＦ受容体ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ２、Ｅｒｂｂ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｂｂ４）、プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）、ジシアロガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３）、Ｂ７－Ｈ３（ａｋａ ＣＤ２７６）、がん抗原１２５（ＣＡ－１２５）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１及び２（ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２）、ＣＤ５２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍関連糖タンパク質（例えば、ＴＡＧ－７２）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１５２、ムチン１（ＭＵＣ１）、腫瘍壊死因子受容体（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、インスリン様増殖因子受容体、葉酸受容体ａ、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）受容体、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、及び他の腫瘍特異的受容体又は抗原が挙げられる。

【0186】

がん抗原性ペプチドデータベース（Cancer Antigenic Peptide Database）は、ペプチド配列及びタンパク質配列中のその位置を含むヒト腫瘍抗原の情報を編集する公的に利用可能なデータベース（ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．）である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、がん抗原ペプチドデータベースに示される腫瘍関連抗原を対象とする。

【0187】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、血液学的悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、固形腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。

【0188】

現在臨床で開発されている抗体断片の大部分は、腫瘍学的適用に関するものである。従来のｍＡｂと比較して、それらに優れた組織及び腫瘍浸透性を与える、免疫療法としてそれらを魅力的にする抗体断片の一般的な特徴、例えば、それらのサイズが小さいこと、及び自然免疫細胞の非特異的活性化を低下させるＦｃドメインの欠如に加えて、特定のフォーマットに固有の多くの作用機序が存在する。

【0189】

腫瘍学は、抗体断片が治療分子の顕著な分類になっている主要な領域であるが、抗体断片が評価されているいくつかの他の疾患領域がある。

【0190】

自己免疫疾患は慢性であり、生命を脅かす可能性があり、抗体療法は、通常、集中的な生涯にわたる治療を必要とするため、極めて高価である。抗体断片のより低い生産コスト及びそれらの小さいサイズに起因する免疫原性低下の可能性は、半減期延長部分を有する抗体断片の使用を、完全長抗体に対する実行可能な代替物とする。更に、がん免疫療法と同様に、自己免疫疾患の治療のための抗体断片の開発は、速いペースで成長しており、二特異性標的化について多数の可能性が存在する。

【0191】

自己免疫疾患の適応症のために市販された最初の抗体断片の１つは、ＵＣＢ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって開発されたＴＮＦを標的とするペグ化Ｆａｂであるセルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））であり、２００８年にクローン病の治療のためにＦＤＡによって承認された。その後、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎について承認された。２つの他のＦａｂが臨床試験中である：ＲＡについての第ＩＩ相のＣＤ２８に対するＦＲ１０４（ＯＳＥ／Ｊａｎｓｓｅｎ）、及びＳＬＥについての第ＩＩ相のＵＣＢによって開発された抗ＣＤ４０Ｌ Ｆａｂ、すなわちダピロリズマブ。

【0192】

ＲＡの治療のための臨床試験において現在評価されている１つのｓｃＦｖ形式は、Ｄｅｋａｖｉｌ又はＦ８ＩＬ１０（Ｐｈｉｌｏｇｅｎ）である。これは、血管標的化ｓｃＦｖ抗体Ｆ８がサイトカインインターロイキン－１０に融合して構成される完全ヒト融合タンパク質である。ｓｃＦｖに融合したいくつかの他の免疫サイトカインも前臨床開発中である。

【0193】

Ｆａｂ及びｓｃＦｖなどの抗体断片は、局所投与後入りの妥当な期間にわたって、角膜に浸透し、眼の中に入り、前眼房において臨床的に有用な濃度を達成することができることが示されている（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２．）。抗体又は抗体断片で処置される最も一般的な眼障害は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）であり、これは、先進国において、５０歳以上の人々における不可逆的失明の主な原因である。ＡＭＤの場合、抗体断片は、硝子体内経路を介して眼に直接適用される。ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））は、ベバシズマブと同じ親マウス抗体に由来する、ＶＥＧＦ－Ａを標的とする抗血管新生モノクローナル抗体断片である。これは、２００６年に滲出型ＡＭＤに対して承認され、その後２０１２年及び２０１５年にそれぞれ糖尿病性黄斑浮腫及び糖尿病性網膜症に対して承認された。ブロルシズマブ（Ａｌｃｏｎ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、滲出型ＡＭＤの第ＩＩＩ相にあるＶＥＧＦを標的とするｓｃＦｖである。

【0194】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１を含む。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＤＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＤＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１）

【0195】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号１からなる。

【0196】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２を含む。配列番号２は、ｍｙｃ（太字下線）タグ及びＨｉｓ（イタリック体）タグを、マレイミドコンジュゲーションに必要なｃ末端システインと共に含有する。

【0197】

【化18-1】

【0198】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号２からなる。

【0199】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３を含む。配列番号３は、配列番号１と同じｓｃＦＶコア配列を含むが、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションを容易にするためのＮ末端Ｈｉｓ（イタリック体）タグ及びｃ末端ＬＬＱＧＡポリペプチド（太字及び下線）を有する。

【0200】

【化18-2】

【0201】

いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、配列番号３からなる。

【0202】

いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、カチオン性脂質、ステロール又はその誘導体、非カチオン性脂質、又はＰＥＧ化脂質を含む。

【0203】

Ａ．カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、２０～７４ｎｍの平均直径を有する脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、非融合性カチオン性脂質である。「非融合性カチオン性脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合性活性を有するか、又はほとんど有しないカチオン性脂質を意味する。

【0204】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の表１に列挙される国際公開及び米国特許出願公開に記載されており、例えば、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ（例えば、本明細書の実施例のセクションに記載されるアッセイ）によって測定されるように、非融合性であると決定される。以下の表１に列挙されるこれらの特許文献国際公開及び米国特許出願公開の全ての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0205】

【表1-1】

【0206】

【表1-2】

【0207】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyll-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＭＡ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyll-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＤＬＥＰＣ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＤＭＥＰＣ）；１，２－ジミリストオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノールブチルカルボキサミドイエチル１－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンザミド（ＭＶＬ５）；ジオクタデシルアミド－グリシルスペルミン（Dioctadecylamido-glycylspermine、ＤＯＧＳ）；３ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（3b-[N-(N’,N’-dimethylaminoethyl)carb amoyl]cholesterol、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）；ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（Dioctadecyldimethylammonium Bromide、ＤＤＡＢ）；Ｓａｉｎｔ脂質（例えば、ＳＡＩＮＴ－２、Ｎ－メチル－４－（ジオレイル）メチルピリジニウム）；１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（1,2-dimyristyloxypropy1-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide、ＤＭＲＩＥ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（1,2-dioleoy1-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide、ＤＯＲＩＥ）；１，２－ジオレオイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（1,2-dioleoyloxypropy1-3-dimethylhydroxyethyl ammonium chloride、ＤＯＲＩ）；ジ－アルキル化アミノ酸（Di-alkylated Amino Acid、ＤＩＬＡ２）（例えば、Ｃ１８：１－ｎｏｒＡｒｇ－Ｃ１６）；ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（Dioleyldimethylammonium chloride、ＤＯＤＡＣ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（1-palmitoy1-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylpho sphocholine、ＰＯＥＰＣ）；及び１，２－ジミリストオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＭＯＥＰＣ）からなる群から選択される。いくつかの変形例では、縮合剤、例えば、カチオン性脂質は、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２ジメチルアミノエチル）－［１，３１－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、モルホリノコレステロール（Ｍｏ－ＣＨＯＬ）、（Ｒ）－５－（ジメチルアミノ）ペンタン－１，２－ジイルジオレエート塩酸塩（ＤＯＤＡＰｅｎ－Ｃ１）、（Ｒ）－５－グアニジノペンタン－１，２－ジイルジオレエート塩酸塩（ＤＯＰｅｎ－Ｇ）、（Ｒ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－４，５－ビス（オレオイルオキシ）ペンタン－１－アミニウムクロリド（ＤＯＴＡＰｅｎ）などの脂質である。

【0208】

いくつかの実施形態では、縮合脂質は、ＤＯＴＡＰである。

【0209】

イオン化可能な脂質
いくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質及び非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）などの治療用核酸を含むＬＮＰを含有する薬学的組成物も本明細書で提供される。そのようなＬＮＰを使用して、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、本明細書に記載されるように、ＬＮＰに連結されたｓｃＦｖを含む薬学的組成物を、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達することができる。

【0210】

例示的なイオン化脂質は、国際特許出願公開第２０１５／０９５３４０号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１８／０１１６３３号、同第２０１７／０４９２４５号、同第２０１５／０６１４６７号、同第２０１２／０４０１８４号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１５／０７４０８５号、同第２０１６／０８１０２９号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１７／０７５５３１号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１１／０２２４６０号、同第２０１３／１４８５４１号、同第２０１３／１１６１２６号、同第２０１１／１５３１２０号、同第２０１２／０４４６３８号、同第２０１２／０５４３６５号、同第２０１１／０９０９６５号、同第２０１３／０１６０５８号、同第２０１２／１６２２１０号、同第２００８／０４２９７３号、同第２０１０／１２９７０９号、同第２０１０／１４４７４０号、同第２０１２／０９９７５５号、同第２０１３／０４９３２８号、同第２０１３／０８６３２２号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１１／０７１８６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０６号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１２／０１６１８４号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１１／０００１０６号、同第２０１１／０００１０７号、同第２００５／１２０１５２号、同第２０１１／１４１７０５号、同第２０１３／１２６８０３号、同第２００６／００７７１２号、同第２０１１／０３８１６０号、同第２００５／１２１３４８号、同第２０１１／０６６６５１号、同第２００９／１２７０６０号、同第２０１１／１４１７０４号、同第２００６／０６９７８２号、同第２０１２／０３１０４３号、同第２０１３／００６８２５号、同第２０１３／０３３５６３号、同第２０１３／０８９１５１号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／０９５３４６、及び同第２０１３／０８６３５４号、並びに米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０１５１２８４号、同第２０１７／０２１０６９７号、同第２０１５／０１４００７０号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１５／０１４１６７８号、同第２０１５／０２３９９２６号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１７／０１１９９０４号、同第２０１２／０１４９８９４号、同第２０１５／００５７３７３号、同第２０１３／００９０３７２号、同第２０１３／０２７４５２３号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２００９／００２３６７３号、同第２０１２／０１２８７６０号、同第２０１０／０３２４１２０号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１８／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１２／０１０１１４８号、同第２０１２／００２７７９６号、同第２０１２／００５８１４４号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２００６／００８３７８０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１５／００６４２４２号、同第２００６／００５１４０５号、同第２０１３／００６５９３９号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００３／００２２６４９号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１０／００６２９６７号、同第２０１３／０２０２６８４号、同第２０１４／０１４１０７０号、同第２０１４／０２５５４７２号、同第２０１４／００３９０３２号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１６／０３１７４５８、及び同２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0211】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である：

【0212】

【化19】

【0213】

脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。

【0214】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、国際公開第２０１５／０７４０８５号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、脂質ＡＴＸ－００２である。

【0215】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、国際公開第２０１２／０４０１８４号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。

【0216】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、国際公開第２０１５／１９９９５２号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、化合物６又は化合物２２である。

【0217】

式（Ｉ）
いくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、式（Ｉ）によって表される：

【0218】

【化20】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’は、それぞれ独立して、Ｃ_１～３アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレン、又はＣ_３～６シクロアルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’は、それぞれ独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～６アルキル、又は任意選択的に置換されたＣ_３～６シクロアルキルであるか、
又は代替的に、Ｒ^２が、分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、かつＲ^３が、Ｃ_１～６アルキルである場合、Ｒ^２及びＲ^３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
又は代替的に、Ｒ^２’が、分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである場合、かつＲ^３’が、Ｃ_１～６アルキルである場合、Ｒ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’は、それぞれ独立して、－ＣＨ、－ＣＨ_２ＣＨ、又は－（ＣＨ_２）_２ＣＨであり、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～２０アルキレン又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
Ｒ^６及びＲ^６’が、各出現に対して、独立してＣ_１～２０アルキレン、Ｃ_３～２０シクロアルキレン、又はＣ_２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎが、それぞれ独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。

【0219】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^２及びＲ^２’は、それぞれ独立してＣ_１～３アルキレンである。

【0220】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^１又はＲ^１’によって表される直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～３アルキレン、Ｒ^２又はＲ^２’によって表される直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキレン、及び任意選択的に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ_１～６アルキルは、それぞれ任意選択的に、１つ以上のハロ及びシアノ基で置換されている。

【0221】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^１及びＲ^２は一緒になって、Ｃ_１～３アルキレンであり、Ｒ^１’及びＲ^２’は一緒になって、Ｃ_１～３アルキレン、例えば、エチレンである。

【0222】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^３及びＲ^３’は、それぞれ独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～３アルキル、例えば、メチルである。

【0223】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^４及びＲ^４’は、それぞれ－ＣＨである。

【0224】

本明細書の態様又は実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^２は、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^２’は、任意選択的に置換された分岐鎖Ｃ_１～６アルキレンである。Ｒ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニルなどの５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。

【0225】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^４は、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａであり、Ｒ^ａは、Ｃ_１～３アルキルであり、Ｒ^３及びＲ^４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^４’は、－Ｃ（Ｒ^ａ）_２ＣＲ^ａ、又は－［Ｃ（Ｒ^ａ）_２］_２ＣＲ^ａであり、Ｒ^ａは、Ｃ_１～３アルキルであり、Ｒ^３’及びＲ^４’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニルなどの５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。

【0226】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^５及びＲ^５’は、それぞれ独立して、Ｃ_１～１０アルキレン又はＣ_２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｒ^５及びＲ^５’は、それぞれ独立して、Ｃ_１～８アルキレン又はＣ_１～６アルキレンである。

【0227】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ^６及びＲ^６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ_１～１０アルキレン、Ｃ_３～１０シクロアルキレン、又はＣ_２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ_１～６アルキレン、Ｃ_３～６シクロアルキレン、又はＣ_２～６アルケニレン。一実施形態では、Ｃ_３～１０シクロアルキレン又はＣ_３～６シクロアルキレンは、シクロプロピレンである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｍ及びｎは、それぞれ３である。

【0228】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、表２の脂質のいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩から選択される。

【0229】

【表2-1】

【0230】

【表2-2】

【0231】

【表2-3】

【0232】

【表2-4】

【0233】

【表2-5】

【0234】

【表2-6】

【0235】

【表2-7】

【0236】

【表2-8】

【0237】

【表2-9】

【0238】

【表2-10】

【0239】

【表2-11】

【0240】

式（ＩＩ）
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、式（ＩＩ）のもの、

【0241】

【化21】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
ａは、１～２０の範囲の整数であり（例えば、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり）、
ｂは、２～１０の範囲の整数であり（例えば、ｂは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり）、
Ｒ^１が、存在しないか、又は（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキル、及び（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ^２が、（Ｃ_２～Ｃ_２０）アルキルである。

【0242】

第２の化学的実施形態では、式（ＩＩ）のカチオン性脂質は、式（ＸＩＩＩ）のもの：

【0243】

【化22】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、１～８の範囲の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）について記載されているとおりである。

【0244】

第３の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のカチオン性脂質中のｃ及びｄは、それぞれ独立して、２～８、３～８、３～７、３～６、３～５、４～８、４～７、４～６、５～８、５～７、又は６～８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）について記載されているとおりである。

【0245】

第４の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のカチオン性脂質中のｃは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第４の化学的実施形態の一部として、式（ＸＩＩ）若しくは（ＸＩＩＩ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のｃ及びｄは、それぞれ独立して、１、３、５、又は７であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0246】

第５の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のカチオン性脂質中のｄは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（ＩＩ）又は第２若しくは第３若しくは第４の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第４の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のｃ及びｄの少なくとも１つは７であり、残りの変数は、式（ＩＩ）又は第２若しくは第３若しくは第４の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0247】

第６の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、式（ＩＶ）のもの：

【0248】

【化23】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｉ）について記載されているとおりである。

【0249】

第７の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のｂは、３～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第７の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のｂは、３～８、３～７、３～６、３～５、４～９、４～８、４～７、４～６、５～９、５～８、５～７、６～９、６～８、又は７～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されているとおりである。別の代替例では、第７の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のｂは、３、４、５、６、７、８、又は９であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）、又は第２、第３、第４若しくは第５の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0250】

第８の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のａは、２～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第８の実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のａは、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１３、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、２５～８、５～７、６～１８、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、７～１８、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、８～１８、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、９～１８、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１５～１８、１５～１７、又は１６～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されているとおりである。別の代替例では、第８の実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のカチオン性脂質中のａは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0251】

第９の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１は、存在しないか、又は（Ｃ_５～Ｃ_１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１８）アルキル、及び（Ｃ_４～Ｃ_１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１は、存在しないか、又は（Ｃ_５～Ｃ_１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１６）アルキル、及び（Ｃ_４～Ｃ_１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。あるいは、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１は、存在しないか、又は（Ｃ_５～Ｃ_１２）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１２）アルキル、及び（Ｃ_４～Ｃ_１２）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。別の代替例では、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１は、存在しないか、又は（Ｃ_５～Ｃ_１０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１０）アルキル、及び（Ｃ_４～Ｃ_１０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0252】

第１０の化学的実施形態では、Ｒ^１は、Ｃ_１０アルケニルであり、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されているとおりである。

【0253】

第１１の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１のＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４－Ｃ_１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１０）アルキル中のアルキルは、非分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されているとおりである。１つの化学的実施形態では、Ｒ^１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_９アルキル）である。あるいは、第１１の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１の－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_４～Ｃ_１０）アルキル中のアルキルは、分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つに記載されているとおりである。１つの化学的実施形態では、Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_１７アルキル）であり、残りの変数は、前述の化学的実施形態のいずれか１つに記載されているとおりである。

【0254】

第１２の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^１は、以下の表３に列挙される任意の基から選択され、ここで、基の各々における波状結合は、脂質分子の残りへの基の結合点を示し、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。本開示は、表４中のＲ^１基のいずれか１つと表５中のＲ^２基のいずれか１つとの組み合わせを更に企図し、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）若しくは（ＩＶ）又は第２、第３、第４、第５、第７若しくは第８の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0255】

【表3】

【0256】

第１３の化学的実施形態では、式（ＩＩ）のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩中のＲ^２は、以下の表４に列挙される任意の基から選択され、基の各々における波状結合は、脂質分子の残りへの基の結合点を示し、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第７、第８、第９、第１０、若しくは第１１の化学的実施形態について記載されているとおりである。

【0257】

【表4】

【0258】

特定の例は、表５、以下の例示セクションに提供され、式（ＩＩ）のカチオン性脂質の本明細書における第１４の化学的実施形態の一部として含まれる。薬学的に許容される塩及びイオン化形態及び中性形態もまた含まれる。

【0259】

【表5-1】

【0260】

【表5-2】

【0261】

【表5-3】

【0262】

【表5-4】

【0263】

【表5-5】

【0264】

式（Ｖ）
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、式（Ｖ）のもの：

【0265】

【化24】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ^１及びＲ^１’が、それぞれ独立して、Ｒ^ａから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^２及びＲ^２’が、それぞれ独立して、（Ｃ_１～Ｃ_２）アルキレンであり、
Ｒ^３及びＲ^３’が、それぞれ独立して、Ｒ^ｂから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換された（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルであり、
又は代替的に、Ｒ^２及びＲ^３並びに／又はＲ^２’及びＲ^３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ^４及びＲ^４’が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ_２～Ｃ_６）アルキレンであり、
Ｒ^５及びＲ^５’が、それぞれ独立して、（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルキル又は（Ｃ_２～Ｃ_３０）アルケニルであり、これらのそれぞれが、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_６）シクロアルキルで中断され、
Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれハロ又はシアノである。

【0266】

第２の化学的態様では、式（Ｖ）のカチオン性脂質中のＲ^１及びＲ^１’は、それぞれ独立して（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキレンであり、残りの変数は式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。あるいは、第２の化学的態様の一部として、式（Ｖ）のカチオン性脂質中のＲ^１及びＲ^１’は、それぞれ独立して（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキレンであり、残りの変数は式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。

【0267】

第３の化学的態様では、式（Ｖ）のカチオン性脂質は、
式（ＶＩ）：

【0268】

【化25】

のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。

【0269】

第４の化学的態様では、式（Ｖ）のカチオン性脂質は、式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）

【0270】

【化26】

のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。

【0271】

第５の化学的態様では、式（Ｖ）のカチオン性脂質は、式（ＩＸ）又は（ＶＩ）

【0272】

【化27】

のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。

【0273】

第６の化学的態様では、式（Ｖ）のカチオン性脂質は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）

【0274】

【化28】

のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は式（ＸＶ）について上に記載されているとおりである。

【0275】

第７の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５及びＲ^５’の少なくとも１つは、分岐アルキル又は分岐アルケニルである（炭素原子のｓ数は、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）について上に記載されているとおりである）。別の代替形態では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５及びＲ^５’のうちの１つは、分岐アルキル又は分岐アルケニルである。別の代替形態では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、分岐アルキル又は分岐アルケニルである。別の代替形態では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、分岐アルキル又は分岐アルケニルである。

【0276】

第８の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_６～Ｃ_２６）アルキル又は（Ｃ_６～Ｃ_２６）アルケニルであり、これらのそれぞれは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_６）シクロアルキルで中断され、残りの変数は、式（Ｉ）について上に記載されているとおりである。あるいは、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_６～Ｃ_２６）アルキル又は（Ｃ_６～Ｃ_２６）アルケニルであり、これらのそれぞれは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_５）シクロアルキルで中断され、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_７～Ｃ_２６）アルキル又は（Ｃ_７～Ｃ_２６）アルケニルであり、これらのそれぞれは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_５）シクロアルキルで中断され、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_８～Ｃ_２６）アルキル又は（Ｃ_８～Ｃ_２６）アルケニルであり、これらのそれぞれは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ_３～Ｃ_５）シクロアルキルで中断され、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_６～Ｃ_２４）アルキル又は（Ｃ_６～Ｃ_２４）アルケニルであり、これらのそれぞれは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又はシクロプロピルで中断され、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_８～Ｃ_２４）アルキル又は（Ｃ_８～Ｃ_２４）アルケニルであり、当該（Ｃ_８～Ｃ_２４）アルキルは、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又はシクロプロピルで中断され、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_８～Ｃ_１０）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、シクロプロピルで中断された（Ｃ_１４～Ｃ_１６）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１０～Ｃ_２４）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、（Ｃ_１６～Ｃ_１８）アルケニルであり、残りの変数は、式（Ｖ）について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５は、－（ＣＨ_２）_３Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_８ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_５Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_８ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_７Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_８ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］_２、－（ＣＨ_２）_７－Ｃ_３Ｈ_６－（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１６ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３、又は－（ＣＨ_２）_７ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３であり、残りの変数は、式（ＸＶ）について上に記載されているとおりである。

【0277】

第９の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１５～Ｃ_２８）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。あるいは、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１７～Ｃ_２８）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の実施形態の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１９～Ｃ_２８）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１７～Ｃ_２６）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の実施形態の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_１９～Ｃ_２６）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質中のＲ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_２０～Ｃ_２６）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の実施形態の一部として、Ｒ^５’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ_２２～Ｃ_２４）アルキルであり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。別の代替例では、第９の実施形態の一部として、Ｒ^５’は、－（ＣＨ_２）_５Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］_２、－（ＣＨ_２）_７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］_２、－（ＣＨ_２）_５Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ_２）_２［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］_２、又は－（ＣＨ_２）_７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ_２）_２［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］_２であり、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上に記載されているとおりである。

【0278】

別の態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のカチオン性脂質は、表６の以下の脂質又はその薬学的に許容される塩のいずれかから選択されてもよい。

【0279】

【表6】

【0280】

式（ＸＶ）
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、式（ＸＶ）のもの、

【0281】

【化29】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレン又はＣ_２～Ｃ_１２アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0282】

【化30】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１６アルキル又はＣ_７～Ｃ_１６アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂ中の合わせた場合の炭素原子の総数が、１５より大きく、
Ｘ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、
－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0283】

第２の実施形態では、第１の実施形態によるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｘ^１及びＸ^２が、同じであり、他の全ての残りの変数が、式（Ｖ）又は第１の実施形態について記載したとおりである。

【0284】

第３の実施形態では、第１若しくは第２の実施形態によるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｘ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、若しくは－Ｓ－Ｓ－であるか、又はＸ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、若しくは－Ｓ－Ｓ－であるか、又はＸ^１及びＸ^２が、それぞれ独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくは－Ｓ－Ｓ－であり、全ての他の残りの変数が、式Ｖ又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0285】

第４の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＶＩ）で表されるか、

【0286】

【化31】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0287】

第５の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＶＩＩ）で表されるか：

【0288】

【化32】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0289】

第６の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＶＩＩＩ）で表されるか、

【0290】

【化33】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0291】

第７の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_６アルケニル、又はＣ_１～Ｃ_５アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_５アルケニル、又はＣ_１～Ｃ_４アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_４アルケニル、又はＣ_６アルキル、又はＣ_５アルキル、又はＣ_４アルキル、又はＣ_３アルキル、又はＣ_２アルキル、又はＣ_１アルキル、又はＣ_６アルケニル、又はＣ_５アルケニル、又はＣ_４アルケニル、又はＣ_３アルケニル、又はＣ_２アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0292】

第８の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＩＸ）で表されるか、

【0293】

【化34】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0294】

第９の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^３は、Ｃ_１～Ｃ_９アルキレン若しくはＣ_２～Ｃ_９アルケニレン、Ｃ_１～Ｃ_７アルキレン若しくはＣ_２～Ｃ_７アルケニレン、Ｃ_１～Ｃ_５アルキレン若しくはＣ_２～Ｃ_５アルケニレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルキレン若しくはＣ_２～Ｃ_８アルケニレン、又はＣ_３～Ｃ_７アルキレン若しくはＣ_３～Ｃ_７アルケニレン、又はＣ_５～Ｃ_７アルキレン若しくはＣ_５～Ｃ_７アルケニレンであるか、あるいはＲ^３が、Ｃ_１２アルキレン、Ｃ_１１アルキレン、Ｃ_１０アルキレン、Ｃ_９アルキレン、又はＣ_８アルキレン、又はＣ_７アルキレン、又はＣ_６アルキレン、又はＣ_５アルキレン、又はＣ_４アルキレン、又はＣ_３アルキレン、又はＣ_２アルキレン、又はＣ_１アルキレン、又はＣ_１２アルケニレン、Ｃ_１１アルケニレン、Ｃ_１０アルケニレン、Ｃ_９アルケニレン、又はＣ_８アルケニレン、又はＣ_７アルケニレン、又はＣ_６アルケニレン、又はＣ_５アルケニレン、又はＣ_４アルケニレン、又はＣ_３アルケニレン、又はＣ_２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0295】

第１０の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_４アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_４アルケニレンであるか、又はＲ^５が存在しないか、又はＲ^５が、Ｃ_８アルキレン、Ｃ_７アルキレン、Ｃ_６アルキレン、Ｃ_５アルキレン、Ｃ_４アルキレン、Ｃ_３アルキレン、Ｃ_２アルキレン、Ｃ_１アルキレン、Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_７アルケニレン、Ｃ_６アルケニレン、Ｃ_５アルケニレン、Ｃ_４アルケニレン、Ｃ_３アルケニレン、又はＣ_２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0296】

第１１の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニル、又は

【0297】

【化35】

であり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_５～Ｃ_７非分岐アルキル若しくはＣ_５～Ｃ_７非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２非分岐アルキル、Ｃ_１非分岐アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0298】

【化36】

であり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_２～Ｃ_１０非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１０非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0299】

【化37】

であり、式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２アルキル、Ｃ_１アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0300】

第１２の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_６～Ｃ_１４アルキル若しくはＣ_６～Ｃ_１４アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂは、それぞれ独立して、Ｃ_８～Ｃ_１２アルキル若しくはＣ_８～Ｃ_１２アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１６アルキル、Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１４アルキル、Ｃ_１３アルキル、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１６アルケニル、Ｃ_１５アルケニル、Ｃ_１４アルケニル、Ｃ_１３アルケニル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂにおいて合わせた炭素原子の総数が１５より大きく、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0301】

第１３の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いに等しい数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが同じであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが両方とも、Ｃ_１６アルキル、Ｃ_１５アルキル、Ｃ_１４アルキル、Ｃ_１３アルキル、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１６アルケニル、Ｃ_１５アルケニル、Ｃ_１４アルケニル、Ｃ_１３アルケニル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、但し、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂにおいて合わせた炭素原子の総数が１５より大きく、他の全ての残りの変数が、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0302】

第１４の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、先行する実施形態のうちのいずれか１つに定義されるＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いにそれぞれ異なる数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂの炭素原子の数が、１個若しくは２個の炭素原子だけ異なるか、又は、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂの炭素原子の数が、１個の炭素原子だけ異なるか、又はＲ^６ａがＣ_７アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_７ アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１２アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_７アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１２アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１３アルキルであるか、又はＲ^６ａがＣ_１３アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、などであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0303】

一実施形態では、本開示のカチオン性脂質、又は式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）若しくは式（ＸＩＸ）のカチオン性脂質は、表７の脂質から選択される任意の１つの脂質又はその薬学的に許容される塩である。

【0304】

【表7-1】

【0305】

【表7-2】

【0306】

式（ＸＸ）
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、式（ＸＸ）のもの、

【0307】

【化38】

（ＸＸ）
又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されており、
Ｒ^１及びＲ^２が、それぞれ独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0308】

【化39】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。

【0309】

第２の実施形態では、第１の実施形態によるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、又は－Ｓ－Ｓ－であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ又は第１の実施形態について説明したとおりである。

【0310】

第３の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＸＩ）で表されるか、

【0311】

【化40】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。代替の第３の実施形態では、ｎが、１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0312】

第４の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＸＩＩ）で表されるか、

【0313】

【化41】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0314】

第５の実施形態では、第１の実施形態によるカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_２アルキル、若しくはＣ_２～Ｃ_３アルケニルであるか、又はＲ’、Ｒ^１、及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_２アルキルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0315】

第６の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＸＩＩ）で表されるか、

【0316】

【化42】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0317】

第７の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^５が、存在しないか、若しくはＣ_１～Ｃ_８アルキレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_４アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_４アルケニレンであるか、又はＲ^５が存在しないか、又はＲ^５が、Ｃ_８アルキレン、Ｃ_７アルキレン、Ｃ_６アルキレン、Ｃ_５アルキレン、Ｃ_４アルキレン、Ｃ_３アルキレン、Ｃ_２アルキレン、Ｃ_１アルキレン、Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_７アルケニレン、Ｃ_６アルケニレン、Ｃ_５アルケニレン、Ｃ_４アルケニレン、Ｃ_３アルケニレン、又はＣ_２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0318】

第８の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式（ＸＸＩＶ）で表されるか、

【0319】

【化43】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0320】

第９の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニル、又は

【0321】

【化44】

であり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_５～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_５～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２非分岐アルキル、Ｃ_１非分岐アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0322】

【化45】

であり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_２～Ｃ_１０非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１０非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0323】

【化46】

であり、式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２アルキル、Ｃ_１アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0324】

第１０の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは先行する実施形態のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_８アルキレン若しくはＣ_３～Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレン若しくはＣ_３～Ｃ_７アルケニレン、又はＣ_３～Ｃ_５アルキレン若しくはＣ_３～Ｃ_５アルケニレンであるか、又はＲ^３が、Ｃ_８アルキレン、若しくはＣ_７アルキレン、若しくはＣ_６アルキレン、若しくはＣ_５アルキレン、若しくはＣ_４アルキレン、若しくはＣ_３アルキレン、若しくはＣ_１アルキレン、若しくはＣ_８アルケニレン、若しくはＣ_７アルケニレン、若しくはＣ_６アルケニレン、若しくはＣ_５アルケニレン、若しくはＣ_４アルケニレン、若しくはＣ_３アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0325】

第１１の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキル若しくはＣ_７～Ｃ_１２アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂは、それぞれ独立して、Ｃ_８～Ｃ_１０アルキル若しくはＣ_８～Ｃ_１０アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂは、それぞれ独立して、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0326】

第１２の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いに等しい数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが同じであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが両方ともＣ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0327】

第１３の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、先行する実施形態のうちのいずれか１つに定義されるＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いにそれぞれ異なる数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂの炭素原子の数が、１個若しくは２個の炭素原子だけ異なるか、又は、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂの炭素原子の数が、１個の炭素原子だけ異なるか、又はＲ^６ａがＣ_７アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_７アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１２アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_７アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_８アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１１アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_９アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１２アルキルであるか、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、かつＲ^６ａがＣ_１０アルキルであるか、などであり、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0328】

第１４の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩に記載のカチオン性脂質において、Ｒ’が存在せず、他の全ての残りの変数が、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は先行する実施形態のうちのいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0329】

一実施形態では、本開示のカチオン性脂質、又は式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）のカチオン性脂質は、表８の脂質から選択される任意の１つの脂質又はその薬学的に許容される塩である。

【0330】

【表8-1】

【0331】

【表8-2】

【0332】

特定の例は、以下の例示のセクションにおいて提供されており、本明細書に記載のカチオン性又はイオン化可能な脂質の一部として含まれる。薬学的に許容される塩及び中性形態もまた含まれる。

【0333】

切断可能な脂質
いくつかの実施形態によれば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、カプシドを含まない非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用することができる切断可能な脂質を介して、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、薬学的組成物が本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「切断可能な脂質」という用語は、ジスルフィド結合（「ＳＳ」）切断可能な単位を含むカチオン性脂質を指す。一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、膜不安定化のための酸性区画（例えば、エンドソーム又はリソソーム）、及び還元環境で切断され得るジスルフィド結合（例えば、細胞質）に応答する三級アミンを含む。ＳＳ切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＰ脂質、ｓｓＰａｌｍ脂質、ｓｓ－Ｍ脂質、ｓｓ－Ｅ脂質、ｓｓ－ＥＣ脂質、ｓｓ－ＬＣ脂質及びｓｓ－ＯＣ脂質などのＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質を含み得る。

【0334】

いくつかの実施形態によれば、ＳＳ切断可能な脂質は、国際特許出願公開第２０１９１８８８６７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0335】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、平均直径が約２０～約７０ｎｍのサイズの範囲であり、例えば、平均直径が約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２５ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３５ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍである。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰの平均直径は、約５０ｎｍ～約７０ｎｍであり、これは著しく小さく、したがって免疫応答を標的とし、回避するのに有利である。更に、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約６０％より多く約９０％までを封入することができる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約６０％より多く、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約６５％より多く、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約７０％より多く、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約７５％より多く、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約８０％より多く、ｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約８５％より多く、又はｃｅＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの約９０％より多くを封入することができる。

【0336】

本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含むＬＮＰ）は、他のプロセスによって生成されたＬＮＰと比較して、及び他の脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質と比較して、標的細胞／組織への核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の送達を増加させるために有利に使用することができる。したがって、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含むＬＮＰ）は、当該技術分野で公知のプロセス及び方法によって調製された脂質粒子と比較して、最大の核酸送達を提供した。機構はまだ決定されておらず、また、理論に束縛されるものではないが、肝細胞への脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含むＬＮＰ）は、核からの食作用を回避し、核へのより効率的な輸送を行うと考えられる。本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）の別の利点は、他の脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、ＭＣ３と比較して、より良好な忍容性である。

【0337】

一実施形態では、切断可能な脂質は、３つの構成成分、すなわち、アミン頭部基、リンカー基、及び疎水性テールを含み得る。一実施形態では、切断可能な脂質は、１つ以上のフェニルエステル結合、多くの三級アミノ基のうちの１つ、及びジスルフィド結合を含む。三級アミン基はｐＨ応答性を提供し、エンドソームの脱出を誘導し、フェニルエステル結合は、構造の分解性（自己分解性）を高め、ジスルフィド結合は、還元環境で切断する。

【0338】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＰ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＯＰ脂質は、以下の式Ａに示される構造を含む：

【0339】

【化47】

【0340】

一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質（ｓｓＰａｌｍ）である。ｓｓＰａｌｍ脂質は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｔｏｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２７９ （２０１８）２６２－２７０を参照し、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ｓｓＰａｌｍは、脂質Ｂの構造を含むｓｓＰａｌｍＭ脂質である。

【0341】

【化48】

【0342】

一実施形態では、ｓｓＰａｌｍＥ脂質は、脂質Ｃの構造を含むｓｓＰａｌｍＥ－Ｐ４－Ｃ２脂質である。

【0343】

【化49】

【0344】

一実施形態では、ｓｓＰａｌｍＥ脂質は、脂質Ｄの構造を含むｓｓＰａｌｍＥ－Ｐａｚ４－Ｃ２脂質である。

【0345】

【化50】

【0346】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－Ｍ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－Ｍ脂質は、以下の脂質Ｅに示される構造を含む。

【0347】

【化51】

【0348】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－Ｅ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－Ｅ脂質は、以下の脂質Ｆに示される構造を含む。

【0349】

【化52】

【0350】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＥＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＥＣ脂質は、以下の脂質Ｇに示される構造を含む。

【0351】

【化53】

【0352】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＬＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＬＣ脂質は、以下の脂質Ｈに示される構造を含む。

【0353】

【化54】

【0354】

一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＯＣ脂質は、以下の脂質Ｊに示される構造を含む。

【0355】

【化55】

【0356】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）製剤を作製し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年９月７日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されているプロセスによって得られるｃｅＤＮＡを充填される。これは、脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。一実施形態では、本開示は、米国仮出願第６３／１９４，６２０号の実施例２に記載のプロセスによって調製された式Ｉの脂質を含むｃｅＤＮＡ脂質粒子を提供する。

【0357】

一般に、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）は、約１０：１～６０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１、約３０：１～約６０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）は、約６０：１のｃｅＤＮＡ（質量又は重量）対全脂質比で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）は、約３０：１のｃｅＤＮＡ（質量又は重量）対全脂質比で調製される。脂質及びｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0358】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入するための薬剤を含む。このような薬剤は、本明細書では、凝縮剤又は封入剤とも称される。制限なしに、核酸を凝縮及び／又は封入するための当該技術分野で既知の任意の化合物は、それが非融合性である限り使用することができる。言い換えれば、薬剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合活性をほとんど又は全く有しない。理論に拘束されることを望まないが、凝縮剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸を凝縮／封入しない場合、いくらかの融合活性を有する可能性があるが、当該凝縮剤で形成された脂質ナノ粒子を封入する核酸は、非融合性であり得る。

【0359】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）を含むＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％より多く、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６５％より多く、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７０％より多く、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７５％より多く、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８０％より多く、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８５％より多く、又はｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約９０％より多くを封入することができる。

【0360】

カチオン性脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、カチオン性脂質は、正に電荷される、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。カチオン性脂質はまた、イオン化可能な脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。「非融合性カチオン性脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合性活性を有するか、又はほとんど有しないカチオン性脂質を意味する。

【0361】

一実施形態では、カチオン性脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、カチオン性脂質モル含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、４０～６０％（ｍｏｌ）、４０～５５％（ｍｏｌ）又は４５～５５％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を構成する。

【0362】

一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ ｌ－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）ではない。ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）の構造を脂質Ｋとして以下に示す。

【0363】

【化56】

【0364】

一実施形態では、切断可能な脂質は、脂質ＡＴＸ－００２ではない。脂質ＡＴＸ－００２は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一実施形態では、切断可能な脂質は、（１３Ｚ．１６Ｚ）－／Ｖ，／Ｖ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）ではない。化合物３２は、ＷＯ２０１２／０４０１８４に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、切断可能な脂質は、化合物６又は化合物２２ではない。化合物６及び２２は、ＷＯ２０１５／１９９９５２に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0365】

カチオン性脂質の非限定的な例としては、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－ＯＰ（ｓｓ－ＯＰ；式Ｉ）、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－Ｍ（ＳＳ－Ｍ；式Ｖ）、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－Ｅ（ＳＳ－Ｅ；式ＶＩ）、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－ＥＣ（ＳＳ－ＥＣ；式ＶＩＩ）、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－ＬＣ（ＳＳ－ＬＣ；式ＶＩＩＩ）、ＳＳ切断可能かつｐＨ活性化脂質様物質－ＯＣ（ＳＳ－ＯＣ；式ＩＸ）、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、ＤＯＰＥ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＥｕｆｅｃｔｉｎ（ＪＢＬ，Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオールオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオールオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から作製することができる。核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ又はＣＥＬｉＤ）はまた、例えばポリ（Ｌ－リジン）又はアビジンと複合体化されてもよく、脂質は、この混合物、例えばステリル－ポリ（Ｌ－リジン）に含まれてもよく、又は含まれなくてもよい。

【0366】

一実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉのｓｓ－ＯＰである。別の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩのＳＳ－ＰＡＺである。

【0367】

一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第８，１５８，６０１号に記載されるカチオン性脂質、又は米国特許第８，０３４，３７６号に記載されるポリアミン化合物若しくは脂質を使用して送達される。

【0368】

Ｂ．非カチオン性脂質
一実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ＬＮＰ）は、非カチオン性脂質を更に含み得る。非カチオン性脂質は、融合性を高め、形成中のＬＮＰの安定性を高めるのに役立つことができる。非カチオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。

【0369】

例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）；レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることを理解されたい。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ_１０～Ｃ_２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。

【0370】

脂質粒子（例えば、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、ｌ ＬＮＰ）中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン－硫酸ラウリル、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどの非リン脂質が挙げられる。

【0371】

一実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。一実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。

【0372】

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０．５～１５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１２％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約６％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．５％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約８．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約９．０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１１％（ｍｏｌ）である。

【0373】

例示的な非カチオン性脂質は、国際特許出願公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0374】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、脂質粒子の膜の統合性及び安定性を提供するために、ステロールなどの構成成分を更に含み得る。一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、コレステロール又はその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体；５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン、及びコレステリルデカノエートなどの非極性類似体、；並びにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、ヘミコハク酸コレストリル（ＣＨＥＭＳ）である。

【0375】

例示的なコレステロール誘導体は、国際特許出願公開第２００９／１２７０６０号及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0376】

一実施形態では、ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３０～４０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３５～４５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３８～４２％（ｍｏｌ）である。

【0377】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートされた脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的なコンジュゲートされた脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ化脂質、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲートされた脂質である。いくつかの他の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ_２０００－ＤＭＧ（ジミリストイルグリセロール）である。

【0378】

例示的なＰＥＧ化脂質には、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１、同第２００３／００７７８２９号、同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１６／０３７６２２４号、及び同第２０１７／０１１９９０４号に記載されており、それら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0379】

一実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡ ＰＥＧ化脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデカオキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］、

【0380】

【化57】

からなる群から選択され得る。

【0381】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコールｎ）－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ_ｎ、ここで、ｎは、３５０、５００、７５０、１０００又は２０００である）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール_ｎ）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ_ｎ、ここで、ｎは、３５０、５００、７５０、１０００又は２０００である）、ＤＳＰＥ－ポリグリセリン－シクロヘキシル－カルボン酸、ＤＳＰＥ－ポリグリセリン－２－メチルグルタル－カルボン酸、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）コンジュゲートポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）、ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ポリエチレングリコール－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、又はＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００１１（Ｃ８ ＰＥＧ２０００セラミド）からなる群から選択される。ｎが３５０、５００、７５０、１０００又は２０００であるＤＭＰＥ－ＰＥＧ_ｎのいくつかの例では、ＰＥＧ－脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ ２，０００）である。ｎが３５０、５００、７５０、１０００又は２０００であるＤＳＰＥ－ＰＥＧ_ｎのいくつかの例では、ＰＥＧ－脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２，０００）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨである。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。

【0382】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質、例えば、ＰＥＧ化脂質は、組織特異的標的化リガンド、例えば、第１又は第２の標的化リガンドを含む。例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートしたＰＥＧ－ＤＭＧ。

【0383】

一実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的なコンジュゲートされた脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0384】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、０．５～１０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、１～５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、２～４％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、２～３％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約２％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約２．５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約３％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約３．５％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約４％（ｍｏｌ）である。

【0385】

カチオン性脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質と、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ化脂質とのモル比は、必要に応じて変えることができることが理解される。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモル又は全重量で３０～７０％のカオチン性脂質、組成物のモル又は全重量で０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で０～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含み得る。一実施形態では、組成物は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で３０～５０％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ又はコンジュゲートされた脂質を含む。一実施形態では、組成物は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で３０～４０％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質である。組成物は、組成物のモル又は全重量で６０～７０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で２５～３５％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は全重量で最大４５～５５％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で３５～４５％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で２～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含有し得る。製剤はまた、脂質ナノ粒子製剤であってもよく、例えば、組成物のモル又は全重量で８～３０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で０～４０％のコレステロール；組成物のモル又は全重量で４～２５％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で２～２５％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で１０～３５％のコンジュゲートされた脂質、及び組成物のモル又は全重量で５％のコレステロール；又は組成物のモル又は全重量で２～３０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で１～１５％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で２～３５％のＰＥＧ化脂質、及び組成物のモル又は全重量で１～２０％のコレステロール；又は更には、組成物のモル又は全重量で最大９０％のカチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～１０％の非カチオン性脂質、又は更には、組成物のモル又は全重量で１００％のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：９：３８．５：２．５のモル比で含む。

【0386】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：７：４０：３のモル比で含む。

【0387】

他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。

【0388】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を含み、脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合、２０～７０モルパーセントの範囲であり（目標３０～６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり（目標０～１５）、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり（目標３０～５０）、ＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）のモルパーセントは、１～６の範囲である（目標２～５）。

【0389】

ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際特許出願第ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、これはその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法及び組成物における使用が想定される。

【0390】

脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）のサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して準弾性光散乱によって決定することができる。いくつかの実施形態によれば、光散乱によって決定されるＬＮＰの平均直径は、約７５ｎｍ未満又は約７０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態によれば、光散乱によって決定されるＬＮＰの平均直径は、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ又は約５０ｎｍ～約７０ｎｍである。

【0391】

製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６ （２０ １ ０）を参照されたい（これらは両方とも、参照によりその全体が組み込まれる））。一実施形態では、各カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、脂質ナノ粒子中で決定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書及び他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００ｍＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４ｍＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５～１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１ｍＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。

【0392】

一実施形態では、相対活性は、尾静脈注射を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって決定され得る。活性は、０．３及び１．０ｍｇ ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で比較され、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇ当たりのルシフェラーゼｎｇとして表される。

【0393】

限定されないが、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター及びカチオン性脂質又はその塩を含む。

【0394】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カチオン性脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一実施形態では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。

【0395】

ＩＩＩ．閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター
本開示の実施形態は、導入遺伝子（例えば治療用核酸（ＴＮＡ））を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を可能にする。

【0396】

ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである可能性が高い。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）並びにこれらの異なる対象物を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。

【0397】

共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）が本明細書に提供される。これらの非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（例えば、導入遺伝子、特に治療用導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス又は統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生させることができ、ＩＴＲは、互いに関して異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えばＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾され、かつＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）及びＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えばエキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。

【0398】

一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称である。すなわち、それらは、互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、又は異なる修飾を有するか、又は同一の修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲにおける任意の変化が他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、又はあるいは、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。

【0399】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。一実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称な三次元形状を有し得る。いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。一実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。

【0400】

本明細書に提供される野生型又は変異型又は他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミド又は他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。

【0401】

一実施形態では、治療用核酸配列である導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするか又は制御する１つ以上の調節配列に操作可能に連結され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列及び第２のＩＴＲ配列を含み、目的のヌクレオチド配列は、第１及び第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１及び第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、又は互いに対して対称である。

【0402】

一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、並びにポリアデニル化及び終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導可能又は抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター又はその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、治療用核酸配列である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。

【0403】

一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含む。一実施形態では、ポリアデニル化及び終結シグナルは、ＢＧＨポリＡを含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、又はその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）又は他の転写後処理エレメント（単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’～３’方向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、又は５ｋｂ超、又は６ｋｂ超、又は７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。

【0404】

一実施形態では発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限がないため、大きなサイズの発現カセットを宿主に送達することが可能である。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。

【0405】

一実施形態では、剛性治療用核酸は、プラスミドであり得る。

【0406】

一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。

【0407】

発現カセットは、治療用核酸配列である任意の導入遺伝子を含むことができる。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を含む。

【0408】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、若しくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）、又は所望の生物学的若しくは治療効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。一実施形態では、ドナー配列などの外因性配列は、欠陥遺伝子又は転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。一実施形態では、発現カセットはまた、訂正ＤＮＡ鎖をコードし、ポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。一実施形態では、発現カセットは、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばｂ－ラクタマーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。

【0409】

したがって、発現カセットは、変異のために低減若しくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、若しくはＲＮＡをコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（又はニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレート又はドナーヌクレオチド配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、誘導型ＲＮＡヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（又はニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレートヌクレオチド配列を含み得る。

【0410】

ＩＶ．治療用核酸
本開示の態様は、一般に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む組成物（例えば．、薬学的組成物）であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖを含む、組成物を提供する。実施形態によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結されたｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ｓｃＦｖが、マレイミドコンジュゲーションによってＬＮＰに連結される、薬学的組成物を提供する。

【0411】

本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、並びにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0412】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡもまた、本開示によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。

【0413】

タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソンは、クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／又はｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。

【0414】

本明細書に提供される態様及び実施形態のいずれにおいても、治療用核酸は、治療用ＲＮＡであり得る。当該治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、又はｍＲＮＡ転写産物（ＡＳＯ）、タンパク質若しくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又は三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。

【0415】

変性治療用核酸
本開示の態様は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結された、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、組成物）及び変性治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＴＮＡが、上に定義したとおりである、薬学的組成物を更に提供する。

【0416】

一実施形態では、変性ＴＮＡは、閉端ＤＮＡ（closed-ended DNA、ｃｅＤＮＡ）である。「変性した治療用核酸」という用語は、その立体構造が標準的なＢ型構造から変化した部分的又は完全なＴＮＡを指す。立体構造変化は、二次構造の変化（すなわち、単一核酸分子内の塩基対相互作用）及び／又は三次構造の変化（すなわち、二重らせん構造）を含み得る。理論に束縛されるものではないが、アルコール／水溶液又は純粋なアルコール溶媒で処理されたＴＮＡは、ＬＮＰによる封入効率を増強し、より小さい直径サイズ（すなわち、７５ｎｍ未満、例えば、直径約６８～７４ｎｍの平均サイズ）を有するＬＮＰ製剤を生成する立体構造への核酸の変性をもたらすと考えられた。本明細書に記載される全てのＬＮＰ平均直径サイズ及びサイズ範囲は、変性ＴＮＡを含有するＬＮＰに適用される。

【0417】

ＤＮＡが水性環境中にある場合、それは、各々の完全なヘリックス１回転中に１０．４塩基対を有するＢ型構造を有する。メタノールのような適度に極性の低いアルコールを添加することによってこの水性環境を徐々に変化させると、ヘリックスのねじれが緩和し、それによってＤＮＡは、円偏光二色性（circular dichroism、ＣＤ）分光法によって可視化されるように、ヘリックス１回転当たり１０．２塩基対しか有しない形態に滑らかに変化する。一実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、１０．２型構造を有する。

【0418】

この挙動とは対照的に、水がエタノールなどのわずかに極性の低いアルコールで置換される場合、同じ種類の立体構造変化は、水の約６５％がエタノールで置換されるまでしか起こらない。この時点で、ＤＮＡは突然Ａ型構造に変化し、これは、ＣＤによって可視化されるように、ヘリックス１回転当たり１１塩基対を含有する、より緊密にねじれたヘリックスを有する。一実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、Ａ型構造を有する。

【0419】

いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、透過型電子顕微鏡（transmission electron microscopy、ＴＥＭ）下で可視化された場合に、棒状構造を有する。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）下で可視化された場合、環状様構造を有する。比較すると、変性されていないＴＮＡは、鎖様構造を有する。

【0420】

Ｖ．ｃｅＤＮＡベクターの産生
本開示の実施形態は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を可能にする。

【0421】

本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、プロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。

【0422】

以下は、非限定的な例として提供される。

【0423】

いくつかの実施形態によれば、合成ｃｅＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子からの切除を介して産生される。ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。簡潔には、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図７Ａ～８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。

【0424】

いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、導入遺伝子の発現を調節するための追加成分、例えば、導入遺伝子の発現を調節するための調節スイッチ、又はベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチを含む。

【0425】

分子調節スイッチは、シグナルに応答して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、導入遺伝子の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける目的の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始又は停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、合成ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターでの使用に包含される例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、参照により全体が本明細書に組み込まれかつ本明細書に記載される国際出願第ＵＳ１８／４９９９６号においてより完全に考察されている。

【0426】

様々なオリゴヌクレオチドの構築を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。

【0427】

合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する例示的な方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成及び／又は産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５’及び３’末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。

【0428】

更に別の態様では、本開示は、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生に使用するため、本明細書に記載されるＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株を提供する。そのような細胞株を産生する方法は、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、３のＭＯＩで宿主細胞に添加される。一実施形態では、宿主細胞株は無脊椎動物の細胞株、好ましくは昆虫Ｓｆ９細胞である。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、好ましくは２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。

【0429】

任意のプロモーターは、ベクターポリヌクレオチドの異種核酸（例えば、レポーター核酸又は治療用導入遺伝子）に操作可能に連結することができる。発現カセットは、ＣＡＧプロモーターなどの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（ｉｉ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、発現カセットは、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター、又はヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１－α）プロモーターを含むことができる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）を含む。代替的に、誘導性若しくは抑制性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。遺伝子療法のための好適な導入遺伝子は、当業者に周知である。

【0430】

カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターはまた、シス調節エレメント、又はシス調節エレメントの組み合わせを更に含むベクターポリヌクレオチド発現構築物から産生することができ、非限定的な例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）及びＢＧＨポリＡ、又は例えば、ベータ－グロビンポリＡを含む。他の転写後処理エレメントは、例えば、単純ヘルペスウイルス、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡ若しくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然、又は合成などの、当該技術分野において既知の任意のポリアデニル化配列又はその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（upstream enhancer、ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。

【0431】

本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。

【0432】

ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。

【0433】

一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、外因性ＤＮＡの発現カセット）及び修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順で含むポリヌクレオチドテンプレートを含むプラスミドを含むか、又はそれから得られ、当該テンプレート核酸分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質コードを欠いている。更なる実施形態では、本開示の核酸テンプレートは、ウイルス性カプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。加えて、特定の実施形態では、テンプレート核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本開示の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。

【0434】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに関して変異したＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ＴＲＳ、及びＲＢＥ’部分を保持する。

【0435】

ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の操作可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）修飾型５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、及び（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ及びｃａｐコード領域を置き換える。

【0436】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、及び変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と参照されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補又は対称である）。

【0437】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。一実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ １０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム、例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７；ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能な、Ｋｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓに由来する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’及び３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。

【0438】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能又は選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。

【0439】

ＶＩ．脂質粒子の調製
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ｃｅＤＮＡ及び脂質の混合時に自発的に形成することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、膜（例えば、１００ｎｒｎカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押し出しステップは省略することができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、米国仮出願第６３／１９４，６２０号に記載される実施例３に記載されるように形成される。

【0440】

一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、当該技術分野において既知の任意の方法によって形成することができる。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、ＵＳ２０１３／００３７９７７、ＵＳ２０１０／００１５２１８、ＵＳ２０１３／０１５６８４５、ＵＳ２０１３／０１６４４００、ＵＳ２０１２／０２２５１２９、及びＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されている方法によって調製することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、連続混合法、直接希釈プロセス、又はインライン希釈プロセスを使用して調製することができる。直接希釈及びインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のプロセス及び装置は、ＵＳ２００７／００４２０３１に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセス及び装置は、ＵＳ２００４／０１４２０２５に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0441】

いくつかの態様によれば、本開示は、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターと、イオン化可能な脂質とを含む、ＬＮＰを提供する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡなどの治療用核酸で作製され、充填される、脂質ナノ粒子製剤。

【0442】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、衝突ジェットプロセスによって調製することができる。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸及び塩化ナトリウム緩衝液、又はクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム緩衝液に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。ｃｅＤＮＡに対する脂質の混合比は、約４５～５５％の脂質及び約６５～４５％のｃｅＤＮＡであり得る。

【0443】

脂質溶液は、アルコール、例えばエタノール中に、５～３０ｍｇ／ｍＬ、よりおそらく５～１５ｍｇ／ｍＬ、最もおそらく９～１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で、カチオン性脂質（例えば、イオン化可能なカチオン性脂質）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＰＣなどのリン脂質）、ＰＥＧ又はＰＥＧコンジュゲートされた分子（例えば、ＰＥＧ－脂質）、及びステロール（例えば、コレステロール）を含有することができる。脂質溶液において、脂質のモル比は、カチオン性脂質について約２５～９８％、好ましくは約３５～６５％；非イオン性脂質について約０～１５％、好ましくは約０～１２％の範囲；ＰＥＧ又はＰＥＧコンジュゲートされた脂質分子について約０～１５％、好ましくは約１～６％；ステロールについて約０～７５％、好ましくは約３０～５０％の範囲であり得る。

【0444】

ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５～５の範囲のｐＨを有する、緩衝溶液中に０．３～１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３～０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＡを含むことができる。

【0445】

ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体は、約１５～４０℃、好ましくは約３０～４０℃の範囲の温度に加熱され、次いで、例えば、衝突ジェットミキサーにおいて混合され、即座にＬＮＰを形成する。混合流量は、１０～６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤは、０．２５～１．０ｍｍの範囲を有し、１０～６００ｍＬ／分の総流量であり得る。流量とチューブＩＤとの組み合わせは、ＬＮＰの粒子サイズを３０～２００ｎｍに制御する効果を有し得る。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１～１：３の体積：体積、好ましくは約１：２の体積：体積の範囲の混合比で緩衝溶液と混合することができる。必要に応じて、この緩衝溶液は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度であり得る。次いで、混合されたＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受けることができる。アニオン交換の前に、混合されたＬＮＰを一定期間、例えば３０分～２時間インキュベートすることができる。インキュベーション中の温度は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。インキュベーション後、アニオン交換分離ステップを含む０．８μｍフィルターなどのフィルターで溶液を濾過する。このプロセスでは、１ｍｍのＩＤ～５ｍｍのＩＤの範囲のチューブＩＤ及び１０～２０００ｍＬ／分の流量を使用できる。

【0446】

形成後、ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスを介して限界濾過することができ、このプロセスでは、アルコールが除去され、緩衝液が最終的な緩衝溶液、例えば、約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）と交換される。

【0447】

限外濾過プロセスでは、膜の公称分子量カットオフ範囲が３０～５００ｋＤのタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションフォーマット（ＴＦＦ）を使用できる。膜フォーマットは中空糸又はフラットシートカセットである。適切な分子量カットオフのＴＦＦプロセスでは、保持液にＬＮＰを保持することができ、濾液又は透過液はアルコール、クエン酸緩衝液及び最終緩衝液の廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、初期濃度が１～３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度になる複数ステップのプロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終緩衝液に対して１０～２０容量で限界濾過し、アルコールを除去して緩衝液交換を実施する。次いで、材料を更に１～３倍に濃縮することができる。濃縮されたＬＮＰ溶液は滅菌濾過できる。

【0448】

ＶＩＩ．薬学的組成物及び製剤
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結されたｓｃＦｖ、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。一態様によれば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ここで、ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする］、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ｓｃＦｖが、切断不可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される、薬学的組成物が本明細書で提供される。一態様によれば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ここで、ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする］、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ｓｃＦｖが、切断可能なリンカーを介してＬＮＰに共有結合により連結される、薬学的組成物が本明細書で提供される。一態様によれば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）［ここで、ＬＮＰは、ＬＮＰに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする］、並びに少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、ｓｃＦｖが、ＬＮＰに非共有結合により連結される、薬学的組成物が本明細書で提供される。

【0449】

いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、脂質中に封入される。一実施形態では、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療用核酸の完全な封入、部分的な封入と共に提供される。一実施形態では、核酸治療薬は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に完全に封入されて、脂質粒子を含有する核酸を形成する。一実施形態では、核酸は、粒子の脂質部分内に封入され、それによって、それを酵素分解から保護し得る。

【0450】

脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化する可能性があり、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。

【0451】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、凝集を防止するために他の部分とコンジュゲートされ得る。そのような脂質コンジュゲートには、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングしたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングしたＰＥＧ、及びセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びそれらの混合物が挙げられる。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、ＰＣＴ公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質にカップリングするのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0452】

一実施形態では、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質粒子（（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に封入され得る。一実施形態では、ＴＮＡは、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に完全に封入されてもよく、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。

【0453】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。

【0454】

一実施形態では、本開示の治療用核酸を含む薬学的組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、カチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本開示の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される治療用核酸を含むカチオン性脂質から形成される。

【0455】

別の好ましい実施形態では、本開示の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは非カチオン性脂質、及び任意選択的に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。

【0456】

一実施形態では、脂質粒子製剤は、水溶液である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0457】

いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質粒子製剤を提供する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。

【0458】

一実施形態では、本明細書に開示される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及び薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、本開示のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に適した薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと共に組み込み、その後の濾過滅菌によって調製され得る。

【0459】

本明細書に開示される脂質粒子は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。

【0460】

ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。

【0461】

治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと共に組み込み、その後の濾過滅菌によって調製され得る。

【0462】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち．、非二層）形態を有する。限定されないが、非二層形態としては、例えば、三次元チューブ、棒、立方対称性などを挙げることができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して決定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、例えば、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。

【0463】

一実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、高電子密度である。

【0464】

一実施形態では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡系粒子を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。脂質構成成分の組成及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子（脂質ナノ粒子）外で交換する速度、次いで脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。

【0465】

一実施形態では、製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照されたい（これらはいずれも、参照によりその全体が組み込まれる））。一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。一実施形態では、カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）において決定され得る。

【0466】

一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）の封入は、核酸と会合したときに蛍光を増強した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって決定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉｏ－Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤の添加前及び添加後の蛍光強度を指す。

【0467】

いくつかの実施形態によれば、眼科的送達のために、干渉ＲＮＡ－リガンドコンジュゲート及びナノ粒子－リガンドコンジュゲートを、眼科的に許容される保存剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、又は水と組み合わせて、水性の無菌眼科用懸濁液又は溶液を形成することができる。

【0468】

単位投与量
一実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。

【0469】

ＶＩＩＩ．治療方法
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰが、本明細書に記載されるように、ＬＮＰに連結されたｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖは、細胞の表面に存在する抗原を対象とする）を含む、薬学的組成物は、疾患又は障害を治療又は予防するために、核酸配列（例えば、ＴＮＡ）を細胞に導入するために使用され得る。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、診断方法において使用され得る。

【0470】

対象の疾患又は障害を治療する方法であって、対象のそれを必要とする標的細胞（例えば、筋細胞若しくは筋組織、又は他の罹患細胞型）に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む治療有効量の薬学的組成物を導入することを含む方法であって、ＬＮＰが、ＬＮＰに連結されたｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、細胞が腫瘍細胞である方法が本明細書で提供される。

【0471】

したがって、いくつかの態様によれば、本明細書に記載の薬学的組成物は、がんを治療する方法において使用され得る。他の態様によれば、本明細書に記載の薬学的組成物は、がんを予防する方法又はがんの再発を予防する方法において使用され得る。

【0472】

本明細書中で使用される場合、「がん」という用語は、周辺組織に侵入し、新しい身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖によって特徴付けられる任意の様々な悪性新生物を指し、また、そのような悪性新生物の増殖によって特徴付けられる病的状態を指す。がんは、限局性であってもよく（例えば、固形腫瘍）、全身性であってもよい。本開示の文脈において、「限局性」という用語（「限局性腫瘍」におけるような）は、全身性疾患とは対照的に、固形悪性腫瘍などの解剖学的に単離された又は単離可能な異常を指す。例えば、特定の白血病（例えば、骨髄線維症）及び多発性骨髄腫などの特定のがんは、疾患に対する限局性成分（例えば、骨髄）と全身性成分（例えば、循環血液細胞）の両方を有し得る。いくつかの実施形態では、がんは、血液学的悪性腫瘍などの全身性であり得る。本開示に従って治療され得るがんとしては、全ての種類のリンパ腫／白血病、癌腫及び肉腫、例えば、肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、子宮頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、眼、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、精巣、甲状腺及び子宮において見られるがん又は腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法によって治療され得る癌の種類としては、乳頭腫／癌、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、メラノーマ、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ種／白血病、扁平上皮細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、基底細胞癌及び副鼻腔未分化癌が挙げられるが、これらに限定されない。肉腫の種類としては、軟部肉腫、例えば、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、デスモイド腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨外軟骨肉腫、骨外骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫及びアスキン腫瘍、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性シュワン細胞腫、骨肉腫及び軟骨肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0473】

ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知の任意の適切な経路を介して投与することができる。一実施形態では、標的細胞は、ヒト対象にある。

【0474】

診断有効量又は治療有効量の、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物をそれを必要とする対象に提供するための方法であって、それを必要とする対象の細胞、組織又は器官に、ある量の、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を、導入遺伝子のｃｅＤＮＡベクターからの発現を可能にするのに有効な時間提供し、それにより、診断有効量又は治療有効量の、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を対象に提供することを含む、方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象は、ヒトである。

【0475】

疾患又は疾患状態の１つ以上の症状を治療又は軽減するために、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用することを含む方法が本明細書で提供される。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態疾患については、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、補充療法のために正常遺伝子を罹患組織にもたらす導入遺伝子を送達することができ、いくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作成ことができる。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。

【0476】

一般に、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、遺伝子発現に関連する任意の障害に関連する症状を治療、予防、又は改善するために、上記の記載に従って任意の導入遺伝子を送達することができる。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（及び他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症及び他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（及び他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、及び亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）及び心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オミチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個体の治療において有利に使用され得る。

【0477】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞）の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、遺伝子又は遺伝子産物の変異によって引き起こされる疾患又は障害を治療、改善、及び／又は予防することができる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞）の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）で治療することができる例示的な疾患又は障害としては、がん及び腫瘍、代謝性疾患又は障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、糖原病）；尿素サイクル疾患又は障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積症又は障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳＩＩ；ハンター症候群））；肝臓の疾患又は障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患又は障害（例えば、血友病（Ａ及びＢ）、サラセミア、及び貧血）；及び遺伝的疾患又は障害（例えば、嚢胞性線維症）を含む。

【0478】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載されるホルモン又は増殖因子をコードする導入遺伝子）発現のレベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達し得る。

【0479】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、疾患又は障害を引き起こす遺伝子産物の異常なレベル及び／又は機能（例えば、タンパク質の非存在、又はタンパク質中の欠陥）を修正することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を生成し、かつ／又はタンパク質のレベルを修正して、タンパク質の非存在、又はタンパク質中の欠陥によって引き起こされる特定の疾患若しくは障害から生じる症状を緩和若しくは低減するか、又は利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成することができ；血友病Ａ及びＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子のレベルを改変することによって達成することができ；ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを改変することによって達成することができ；ファブリー病又はゴーシェ病の治療は、機能的なアルファガラクトシダーゼ又はベータグルコセレブロシダーゼをそれぞれ産生することによって達成することができ；ＭＦＤ又はＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ、機能的アリールスルファターゼＡ又はイズロン酸－２－スルファターゼを産生することによって達成することができ；嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症膜貫通調節因子を産生することによって達成することができ；糖原病の治療は、機能的なＧ６Ｐａｓｅ機能を回復させることによって達成することができ；ＰＦＩＣの治療は、機能的なＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成することができる。

【0480】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、ＲＮＡベースの治療薬を細胞にインビトロ又はインビボで提供することができる。ＲＮＡベースの治療薬の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にアンチセンス核酸を提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸又はＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子又はアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。

【0481】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＤＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＤＮＡベースの治療薬の例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0482】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターなどのＴＮＡによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、リソソーム酵素（例えば、テイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、又はハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロン酸スルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、並びにサイトカイン（例えば、インターフェロン、ｂ－インターフェロン、インターフェロン－ｇ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３及び４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－ａ及び－ｂなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体又は抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、及び腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。

【0483】

投与
一実施形態では、本明細書に記載されるような、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。一実施形態では、ＴＮＡを、エクスビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。

【0484】

一般に、投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時的であり、より効果的な反応を提供し得る。ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物の例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、及び動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚と粘膜表面の両方への、及び経皮投与）、リンパ内など、並びに直接組織又は器官注射（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、若しくは脳への）が挙げられる。

【0485】

ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物の投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、及び眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。

【0486】

一実施形態では、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物の投与は、腫瘍（例えば、腫瘍若しくはリンパ節の内部若しくは付近）に対して行われ得る。

【0487】

任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される状態の性質及び重症度、並びに使用されている本明細書に記載の特定のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子）の性質に依存するであろう。追加的に、ｃｅＤＮＡは、単一のベクター、又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。

【0488】

一実施形態では、骨格筋へのｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）の投与としては、四肢（例えば、上腕、前腕、上肢、及び／又は下肢）、背中、頸部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意選択的に、脚及び／又は腕の隔離された四肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）並びに／又は直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の四肢（腕及び／又は脚）に、四肢灌流、任意選択的に隔離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって投与される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、「流体力学」の技法を用いることなく、投与することができる。

【0489】

ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）の心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室及び／又は中隔への投与が挙げられる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって、心筋に送達することができる。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。

【0490】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋に投与する（例えば、筋ジストロフィー又は心疾患（例えば、ＰＡＤ又はうっ血性心不全）を治療、改善、及び／又は予防するために）。

【0491】

ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、ＣＮＳに（例えば、脳又は眼に）投与することができる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、脊髄液、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉及び前頭葉を含む大脳、皮質、大脳基底核、海馬及び扁桃体（portaamygdala））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、及び下丘に導入し得る。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）はまた、網膜、角膜及び／又は視神経などの眼の異なる領域にも投与され得る。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、脳脊髄液に送達し得る（例えば、腰椎穿刺によって）。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。

【0492】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与してもよい。

【0493】

いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、ＣＮＳにおける所望の領域又は区画への直接注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤で投与する。他の実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）は、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy、ＳＭＡ）など）を治療、改善、及び／又は予防するための逆行性輸送に使用することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ＬＮＰ及びＴＮＡを含み、ＬＮＰがｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖが、本明細書に記載されるように、細胞の表面に存在する抗原を対象とし、ＬＮＰに連結される、薬学的組成物）を、筋組織に送達することができ、そこからニューロンに移動することができる。

【0494】

一実施形態では、適切なレベルの発現が達成されるまで、治療用製品の反復投与を行うことができる。したがって、一実施形態では、治療用核酸を複数回投与及び再投与することができる。例えば、治療用核酸は、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、治療用核酸を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、又は約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年又は約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。

【0495】

一実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、又は追加の化合物は、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に含まれ得る。言い換えれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ｃｅＤＮＡに加えて他の化合物、又は少なくとも第１のものとは異なる第２のｃｅＤＮＡを含有し得る。限定されないが、他の追加の化合物は、小さい又は大きい有機又は無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体物質から作製される抽出物、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。

【0496】

一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。したがって、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。

【0497】

例えば、一実施形態では、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、又は抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態によれば、追加の化合物は、免疫刺激剤である。

【0498】

一実施形態では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。一実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質粒子の異なるカクテルを、本開示の組成物及び方法で使用することができる。一実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。

【0499】

参考文献
本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。

【0500】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0501】

前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示の特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0502】

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。

【実施例】

【0503】

以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。

【0504】

実施例１：標的化リガンドの検証
概念実証として、インビトロでの細胞ベースのアッセイにおけるＨＥＲ２ ｓｃＦｖ結合及び内在化を行った。図１Ａ～１Ｆは、トラスツズマブ由来α－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖが、インビトロでの明確なＨＥＲ２特異的膜標的化及び内在化を示すことを示す。Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを使用して、Ｓｋ－ＢＲ３及びＳｋ－ＯＶ３ ＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋）細胞株（図１Ａ及び１Ｂ）におけるＨＥＲ２受容体結合を示したが、ＨＥＲ２受容体を発現しない（ＨＥＲ２－）、ＭＣＦ７細胞（図１Ｃ）では示さなかった。第２の免疫蛍光標識（ｐＨｒｈｏｄｏ）を使用して、リガンド内在化を実証した。図１Ｄ及び１Ｅに示すように、ＨＥＲ２受容体を発現するＳｋ－ＢＲ３及びＳｋ－ＯＶ３細胞はリガンド内在化を示したが、ＭＣＦ７ ＨＥＲ２－細胞株は示さなかった（図１Ｆ）。

【0505】

実施例２：α－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを有するＬＮＰの製剤化
本実施例は、α－ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（配列番号１）をそれらの表面に提示するＬＮＰの調製を記載する。本明細書に記載されるように、取り込みの増強を、マレイミド化学によって調製されたＨＥＲ２ ｓｃＦｖｓ ＬＮＰで実証した。ＨＥＲ２標的化のためのｓｃＦＶ配列を以下に示す：
配列番号１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＤＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＤＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１）

【0506】

配列番号２は、ｍｙｃ（太字下線）タグ及びＨｉｓ（イタリック体）タグを、マレイミドコンジュゲーションに必要なｃ末端システインと共に含有する。この配列を、ＰＤＳコンジュゲーションのためにｓｃＦＶにおいて使用した。

【0507】

【化58】

【0508】

配列番号３は、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションのために使用され、配列番号１と同じｓｃＦＶコア配列を有するが、トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションを容易にするためのＮ末端Ｈｉｓ（イタリック体）タグ及びｃ末端ＬＬＱＧＡポリペプチド（太字及び下線）を有する。

【0509】

【化59】

【0510】

ｓｃＦｖ－ＬＮＰのマレイミド化学の評価
チオール系架橋を使用するコンジュゲーションの例示的な一次経路を図２Ａ及び図２Ｂに示す。マレイミド（切断不可能）連結を図２Ａに示す。ピリジルジスルフィド又はＰＤＳ（切断可能）連結を図２Ｂに示す。

【0511】

ＰＤＳ化学のためのコンジュゲーションプロトコルを以下のように行った。ｓｃＦｖを５０モル過剰のＴＣＥＰで３７℃で２時間還元した。還元後、Ｇ－２５スピンカラム（２３７μｇ ｓｃＦｖ／カラム）を使用してｓｃＦｖからＴＣＥＰを除去した。次いで、ｓｃＦｖを、異なるモル百分率（０．１％、０．５％）及びＰＥＧ長（２ｋ、５ｋ）の脂質Ａ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＰＳＳ（Ｎａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて製剤化したＬＮＰと共に２５℃で２時間インキュベートした。ｓｃＦＶ／ＰＤＳの比は０．０５である。反応後、未反応のｓｃＦｖを３００ ｋＤ ＭＷＣＯ膜で一晩透析することによって除去した。ｓｃＦｖがＬＮＰにコンジュゲートされたかどうかを決定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖに対するウェスタンブロットを行った。

【0512】

マレイミド化学のためのコンジュゲーションプロトコルを以下のように行った。ｓｃＦｖを５０モル過剰のＴＣＥＰで３７℃で２時間還元した。還元後、Ｇ－２５スピンカラム（２３７μｇｓｃＦｖ／カラム）を使用してｓｃＦｖからＴＣＥＰを除去した。次いで、ｓｃＦｖを、脂質Ａ並びに異なるモル百分率（０．１％、０．５％、０．７５％、１％、１．２５％）及びＰＥＧ長（２ｋ、５ｋ）のＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミドを用いて製剤化されたＬＮＰと共に２５℃で２時間インキュベートした。ｓｃＦＶ／マレイミドの比は０．０５である。反応後、未反応のｓｃＦｖを３００ ｋＤ ＭＷＣＯ膜で一晩透析することによって除去した。ｓｃＦｖがＬＮＰにコンジュゲートされたかどうかを決定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖに対するウエスタンブロットを実施した。ｓｃＦｖ－ＬＮＰコンジュゲーションプロセスは、優れたコンジュゲーション収率及びＬＮＰ粒子安定性を示すことが見い出された。例えば、最初のＴＣＥＰ還元、新鮮なマレイミドコンジュゲートＬＮＰ調製、０．５％ＭＡＬ－ＰＥＧ２Ｋ、及びｓｃＦｖの減少を含めたコンジュゲーションプロセスの結果：０．５：１、０．２５：１、０．１：１、及び０．０５：１の等モル当量を図３Ａに示す。次に、ＰＥＧ鎖長を増加させ、透析ステップを使用して、粒径及び安定性を破壊することなく未反応ｓｃＦｖを除去した。結果を図３Ｂに示す。

【0513】

図４Ａ及び図４Ｂは、封入効率（ＥＥ）によって測定されるＬＮＰサイズ及び完全性がｓｃＦｖコンジュゲーション後に維持された（±１０ｎｍ）ことを示す。図５は、マレイミドコンジュゲーションプロセスが強固なコンジュゲーションをもたらしたが、ＰＤＳコンジュゲーションプロセスは同等又はわずかに弱かったことを示す。マレイミドは、一般に、水性環境において、特に、より高いｐＨ値において加水分解を受けやすく、これは、ポリペプチドのＬＮＰへのコンジュゲーション効率に影響を及ぼし得るが、ＰＤＳ化学は、典型的には、この課題を示さないので、これは驚くべき予想外の結果であった。

【0514】

次に、ＬＮＰ上のリガンド機能の確認を行った。図６Ａは、図６ＢにおけるＤＳＰＥ対照ＬＮＰと比較して、Ｔｒａｓ－ｓｃＦｖコンジュゲートＬＮＰのみがＨＥＲ２結合を示したことを示し、ＬＮＰ上のリガンド機能が確認された。図７は、マレイミドコンジュゲートＬＮＰが、ＨＥＲ２特異的な増強された細胞取り込みを実証したことを示す。具体的には図７は、コンジュゲートされたＴｒａｓ－ｓｃＦｖ脂質Ａ ＬＮＰ（ｍＣｈｅｒｒｙ）の取り込みがＨＥＲ２によって媒介されたことを実証する。最後に、図８Ａ及び図８Ｂは、ＬＮＰ表面のリガンド提示が生物活性に有意に影響を及ぼしたことを示す。図８Ａのグラフは、細胞生存率に対して正規化した、ＰＥＧ鎖長が２０００ Ｄａ（ＰＥＧ２Ｋ）又は５０００ Ｄａ（ＰＥＧ５Ｋ）のいずれかであったマレイミドコンジュゲートＬＮＰにおけるＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）を比較する。図８Ａに示すように、ＰＥＧ５Ｋを有するマレイミドコンジュゲートＬＮＰは、ＬＮＰの細胞取り込みによって評価したところ、より大きな生物活性を示した。図８Ｂのグラフは、（ＰＥＧ５Ｋにコンジュゲートされた）マレイミド濃度が０．５％～１．２５％に増加するにつれて、ＬＮＰ取り込み（ｍＣｈｅｒｒｙ）の用量依存的減少が観察されたことを示す。

【0515】

本明細書に提示される結果は、ｓｃＦｖ－ＬＮＰのインビトロ結合及び内在化を実証し、ＬＮＰ粒径及び安定性に対する影響が最小限である最適かつ効率的なマレイミド共有結合コンジュゲーションを記載し、ＬＮＰに対するリガンド機能を確認し、受容体特異的細胞の内在化及びＴＮＡカーゴの送達を実証した。これらの結果は、全身投与後の最小限のオフターゲット組織（例えば、肝臓、脾臓）取り込みを伴うインビボでの標的化腫瘍取り込みにおける記載されたｓｃＦｖ－ＬＮＰの有効性を強く示唆する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【国際調査報告】