特表 2024-529369 ＡＡＶトランスファープラスミド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ＡＡＶトランスファープラスミド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240730BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240730BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K35/76

A61P27/02

A61P9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502616

(86)(22)【出願日】2022-07-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-18

(86)【国際出願番号】 US2022038520

(87)【国際公開番号】W WO2023009622

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/226,410

(32)【優先日】2021-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】524020744

【氏名又は名称】アトセナ セラピューティクス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コズロースキー，クリストファー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA33

(57)【要約】

本明細書において、ＣｐＧアイランドがない、および同じ同一性の連続核酸塩基が４個以下という特徴の１つ以上を備える核酸スタッファー配列であって、長さが２０アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない、核酸スタッファー配列が開示される。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００核酸塩基～約５０００核酸塩基の長さを有する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣｐＧアイランドがない、および同じ同一性の連続核酸塩基が４個以下という特徴の１つ以上を含む核酸スタッファー配列であって、長さが２０アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない、核酸スタッファー配列。

【請求項2】

ＣｐＧアイランドを有していない、請求項１に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項3】

４個以下の同じ同一性の連続核酸塩基を有する、請求項１または請求項２に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項4】

約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項5】

前記核酸スタッファー配列が、制限酵素切断部位を含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項6】

前記核酸スタッファー配列が、約１００核酸塩基～約５０００核酸塩基の長さを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載核酸スタッファー配列。

【請求項7】

前記核酸スタッファー配列が、約２２００核酸塩基～約２３００核酸塩基の長さを有する、請求項６に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項8】

前記核酸スタッファー配列が、約３０００核酸塩基～約３１００核酸塩基の長さを有する、請求項６に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項9】

前記核酸スタッファー配列が、約３００核酸塩基～約４００核酸塩基の長さを有する、請求項６に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項10】

前記核酸スタッファー配列が、配列番号７、８もしくは１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項11】

配列番号７の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、核酸スタッファー配列。

【請求項12】

配列番号８の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、核酸スタッファー配列。

【請求項13】

配列番号１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、核酸スタッファー配列。

【請求項14】

前記核酸スタッファー配列が、ＣｐＧアイランドを含まない、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項15】

前記核酸スタッファー配列が、４個以下の同じ同一性の連続核酸塩基を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項16】

前記核酸スタッファー配列が、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項17】

前記核酸スタッファー配列が、制限酵素切断部位を含まない、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項18】

前記核酸スタッファー配列が、約１００～約５０００核酸塩基の長さを有する、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列。

【請求項19】

請求項１～１８に記載の核酸スタッファー配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド。

【請求項20】

前記ＡＡＶプラスミドが、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置する異種配列を含む発現カセットを含む、請求項１９に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項21】

前記ＡＡＶプラスミドが、約２０００～約８０００核酸塩基の長さを有するバックボーンを含む、請求項２０に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項22】

前記ＡＡＶプラスミドは、約５５００～約６０００核酸塩基の長さを有するバックボーンを含む、請求項２１に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項23】

前記発現カセットは、約３０００～約６０００核酸塩基の長さを有する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項24】

前記発現カセットが、約４０００核酸塩基～約５０００核酸塩基の長さを有する、請求項２３に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項25】

前記異種配列が治療用ペプチドをコードする、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項26】

前記治療用ペプチドが、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＭＹＯ７Ａ、ＲＳ１、ＣＮＢＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＢＣＡ４、およびフラタキシンからなる群から選択される、請求項２５に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項27】

抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項28】

前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子を含む、請求項２６に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項29】

前記ＡＡＶプラスミドが抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項30】

前記ＡＡＶプラスミドがアンピシリン抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項１９～２９のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項31】

ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ血清型１０、またはＡＡＶ４４９．５（Ｅ５３１Ｄ）に由来する、請求項１９～３０のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項32】

プロモーターをさらに含む、請求項１９～３１のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項33】

スプライスドナー／スプライスアクセプター配列をさらに含む、請求項１９～３２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項34】

ＷＰＲＥ配列をさらに含む、請求項１９～３３に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項35】

前記核酸スタッファー配列が、前記発現カセットの外側に位置する、請求項２０～３４のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項36】

複製起点を含む、請求項２０～３５のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項37】

前記核酸スタッファー配列が、前記複製起点の３’側に位置する、請求項３６に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項38】

前記核酸スタッファー配列が、前記複製起点とＩＴＲとの間に位置する、請求項３６または請求項３７に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項39】

前記核酸スタッファー配列が、前記ＩＴＲが前記複製起点から約１０００～約４０００核酸塩基離れるように位置する、請求項３８に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項40】

前記核酸スタッファー配列が、第１のスタッファー配列および第２のスタッファー配列を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項41】

前記第１のスタッファー配列が、約３０００～約３５００核酸塩基の長さを有する、請求項４０に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項42】

前記第１のスタッファー配列が、配列番号８の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項４０に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項43】

前記第２のスタッファー配列が、約１００～約５００核酸塩基の長さを有する、請求項４０に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項44】

前記第２のスタッファー配列が、配列番号１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項４０に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項45】

前記核酸スタッファー配列が前記発現カセット内に位置する、請求項２０～４４のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項46】

前記核酸スタッファー配列が、約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する、請求項４５に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項47】

前記核酸スタッファー配列が、配列番号７の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項４４または４５のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項48】

前記核酸スタッファー配列の存在が、前記核酸スタッファー配列を含まないＡＡＶプラスミドと比較して、ＩＴＲの一方または両方の変異を減少させる、請求項１９～４７のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項49】

前記ＡＡＶプラスミドが１つ以下の複製起点を有する、請求項１９～４８のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項50】

前記ＡＡＶプラスミドがＭ１３複製起点を有していない、請求項１９～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項51】

前記ＡＡＶプラスミドが、ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を含まない、請求項１９～５０のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項52】

前記ＡＡＶプラスミドが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続するグアニン塩基を有する配列を含まない、請求項１９～５１のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド。

【請求項53】

請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミドと、ウイルス複製（ｒｅｐ）遺伝子および／またはウイルスカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むパッケージングプラスミドとを含む、組成物。

【請求項54】

前記パッケージングプラスミドが前記ｒｅｐ遺伝子を含む、請求項５３に記載の組成物。

【請求項55】

前記Ｒｅｐ遺伝子が、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

前記パッケージングプラスミドが、前記ｃａｐ遺伝子を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

前記ｃａｐ遺伝子が、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項58】

前記ｃａｐ遺伝子が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

ヘルパープラスミドと請求項５３～５８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項60】

請求項１９～５９のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミドとヘルパープラスミドとを含む組成物。

【請求項61】

前記ヘルパープラスミドが、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ、ｅ３遺伝子、Ｅ５遺伝子、Ｆｉｂｅｒ遺伝子、またはＶＡ遺伝子、あるいはそれらの組合せを含む、請求項５９または請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記ヘルパープラスミドが変異Ｆｉｂｅｒ遺伝子を含む、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

前記ヘルパープラスミドがＦｉｂｅｒ遺伝子を含まない、請求項６１に記載の組成物。

【請求項64】

請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミドまたは請求項５３～６３のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。

【請求項65】

核酸およびカプシドを含むＡＡＶ粒子であって、前記ＡＡＶ粒子が、請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項６４に記載の細胞によって産生される、ＡＡＶ粒子。

【請求項66】

請求項６５に記載のＡＡＶ粒子と、薬学的に許容可能な担体、緩衝剤、希釈剤、または賦形剤、あるいはそれらの任意の組合せとを含む、医薬組成物。

【請求項67】

細胞を形質導入するための方法であって、請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の組成物、請求項６５に記載のＡＡＶ粒子、または請求項６６に記載の医薬組成物を細胞に投与することを含む、方法。

【請求項68】

前記細胞が光受容体細胞である、請求項６４または請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記細胞が網膜神経節細胞である、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

哺乳動物における眼の疾患または疾病を処置するための方法であって、請求項６５に記載のＡＡＶ粒子または請求項６６に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。

【請求項72】

前記疾患または疾病が、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ベスト病、シュタルガルト病、ウッシャー症候群、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜症、アクロマトーシス、コロイデレミア、バーデット・ビードル症候群、またはグリコーゲン蓄積症（眼症状）を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

投与が前記哺乳動物の片眼または両眼に行われる、請求項７１または７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ＡＡＶ粒子が硝子体内または網膜下に投与される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

眼の疾患または疾病の処置における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列、請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミド、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の組成物、請求項６４に記載の細胞、請求項６５に記載のＡＡＶ粒子、または請求項６６に記載の医薬組成物。

【請求項76】

眼の疾患または疾病の処置に使用するための医薬の製造における、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸スタッファー配列の、請求項１９～５２のいずれか一項に記載のＡＡＶプラスミドの、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の組成物の、請求項６４に記載の細胞の、請求項６５に記載のＡＡＶ粒子の、または請求項６６に記載の医薬組成物の、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年７月２８日提出の米国仮特許出願６３／２２６，４１０の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年７月２５日に作成され、58774-726_601_SL.XMLと題されたファイルとして提供され、サイズが１５２キロバイトである。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み込まれる。

【発明の概要】

【0003】

ある態様では、核酸スタッファー配列は、ＣｐＧアイランドがない、および同じ同一性の連続核酸塩基が４個以下という特徴の１つ以上を含み、長さが２０アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列はＣＰＧアイランドを有していない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、４個以下の同じ同一性の連続核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００核酸塩基～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２２００核酸塩基～約２３００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３０００核酸塩基～約３１００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３００核酸塩基～約４００核酸塩基の長さを有する。

【0004】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７、８、または１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。ある態様では、本明細書において、配列番号７の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む核酸スタッファー配列が開示される。ある態様では、本明細書において、配列番号８の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む核酸スタッファー配列が開示される。ある態様では、配列番号１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む核酸スタッファー配列が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列はＣＰＧアイランドを含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、４個以下の同じ同一性の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸スタッファー配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置する異種配列を含む発現カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、約２０００～約８０００核酸塩基の長さを有するバックボーンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、約５５００～約６０００核酸塩基の長さを有するバックボーンをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、約３０００～約６０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、約４０００核酸塩基～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、異種配列は治療用ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドは、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＭＹＯ７Ａ、ＲＳ１、ＣＮＢＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＢＣＡ４、およびフラタキシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ血清型１０、またはＡＡＶ４４９．５（ｅ５３１ｄ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、スプライスドナー／スプライスアクセプター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ＷＰＲＥ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、発現カセットの外側に位置する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、複製起点をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、複製起点の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、複製起点とＩＴＲとの間に位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約１０００～約４０００核酸塩基離れるように位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、第１のスタッファー配列および第２のスタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、約３０００～約３５００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、配列番号８の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、約１００～約５００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、配列番号１１の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、発現カセット内に位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７の少なくとも１００個の連続する塩基と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列の存在は、核酸スタッファー配列を含まないＡＡＶプラスミドと比較して、ＩＴＲの一方または両方の変異を低減する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、１つ以下の複製起点を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ｍ１３複製起点を有していない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続グアニン塩基を有する配列を含まない。

【0005】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミド、ならびにウイルス複製（ｒｅｐ）遺伝子および／またはウイルスカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むパッケージングプラスミドを含む組成物が本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、パッケージングプラスミドはｒｅｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０をコードする。いくつかの実施形態では、パッケージングプラスミドは、ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ｖｐｌ、ｖｐ２、およびｖｐ３をコードする。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を備える。いくつかの実施形態では、組成物はヘルパープラスミドを含む。

【0006】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶプラスミド、およびヘルパープラスミドを含む組成物が本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ、ｅ３遺伝子、Ｅ５遺伝子、Ｆｉｂｅｒ遺伝子、またはＶＡ遺伝子、あるいはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、変異Ｆｉｂｅｒ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、変異Ｆｉｂｅｒ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドはＦｉｂｅｒ遺伝子を含まない。

【0007】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミドまたは本明細書に開示される組成物を含む細胞が本明細書に開示される。

【0008】

いくつかの実施形態では、核酸およびカプシドを含むＡＡＶ粒子が本明細書に開示され、ＡＡＶ粒子は、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミド、本明細書に開示される組成物、または本明細書に開示される細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、もしくは賦形剤、またはそれらの任意の組合せとを含む医薬組成物が本明細書において記載される。

【0009】

いくつかの実施形態では、本明細書において、細胞に形質導入するための方法が開示され、該方法は、細胞に、本明細書に開示されるＡＡＶベクター、本明細書に開示される組成物、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子、または本明細書に開示される医薬組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞は光受容体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は網膜神経節細胞である。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書には、哺乳動物における眼の疾患または疾病を処置するための方法が開示され、該方法は、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子または本明細書に開示される医薬組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ベスト病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜症、アクロマトーシス、コロイデレミア、バーデットビール症候群、またはグリコーゲン蓄積症（眼症状）を含む。いくつかの実施形態では、投与は哺乳動物の片眼または両眼に行われる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は硝子体内または網膜下に投与される。

【0011】

いくつかの実施形態では、眼の疾患または疾病の処置における使用のための、本明細書に開示される核酸スタッファー配列、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミド、本明細書に開示される組成物、本明細書に開示される細胞、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子、または本明細書に開示される医薬組成物が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、眼の疾患または疾病の処置において使用するための医薬の製造における、本明細書に開示される核酸スタッファー配列、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミド、本明細書に開示される組成物、本明細書に開示される細胞、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子、または本明細書に開示される医薬組成物の使用が、本明細書に開示される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

本発明の新規な特徴を、具体的に添付の特許請求の範囲とともに説明する。本発明の特徴と利点をより良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と添付図面とを参照されたい。

【0013】

【図1】図１Ａは、Ｓｍａｌで消化したＡＡＶバックボーンプラスミドの代表的な例を示す。図１Ｂは、アンピシリン耐性細胞中で増殖させ、Ｓｍａｌで消化したＡＡＶバックボーンプラスミドを示す。図１Ｃは、カナマイシン耐性細胞中で増殖させ、Ｓｍａｌで消化したＡＡＶバックボーンプラスミドを示す。

【図2A】ＡＡＶプラスミドバックボーン中のｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を示す。

【図2B】Ｓｍａｌで消化した、ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列が除去されたＡＡＶバックボーンプラスミドを示す。

【図3】ＡＡＶパッケージングにおいてエラーをもたらし得る異なるプロセスを示す概略図である。

【図4A】起点の３’に位置するスタッファー配列を有するＡＡＶプラスミドバックボーンを示す。

【図4B】Ｓｍａｌで消化された図４ＡのＡＡＶバックボーンプラスミドを示す。

【図5A】起点の５’に位置するスタッファー配列を有するＡＡＶプラスミドバックボーンを示す。

【図5B】Ｓｍａｌで消化された図５ＡのＡＡＶバックボーンプラスミドを示す。

【図6】起源の５’に位置するスタッファー配列およびＳｍａｌで消化されたｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を有するＡＡＶプラスミドバックボーンを示す。

【図7】アンピシリン耐性細胞またはカナマイシン耐性細胞中で増殖させたＡＡＶバックボーンプラスミド間でＩＴＲ安定性を比較する。

【図8A】使用したｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲトランスファープラスミドの概略図を示す。

【図8B】ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲトランスファープラスミドを作製するプロセスを示す。

【図8C】Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドの概略図を示す。

【図8D】ヘルパープラスミドの概略図を示す。

【図9】図９Ａ～９Ｃは、本開示の例示的なベクターからの６つのカセットの概略図を示す。例示的なベクターとして、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端まで４５３４ｂｐの長さを有するｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ（図９Ａ）、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端まで４５２８ｂｐの長さを有するｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐ（図９Ｂ）、および第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端まで４５４９ｂｐの長さを有するｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ（図９Ｃ）とが挙げられる。ｐＴＲ－ＧＲＫｌ－ｈＲＳ１ｓｙｎはＡＡＶ５およびＡＡＶ．ＳＰＲにパッケージングされた。ｐＴＲ－ＣＢＡ－ｈＲＳ１ｓｙｎベクタープラスミド（ｐＴＲ－ＵＦｌ１バックボーン）は、対照としてＡＡＶ５にパッケージングされた。

【図10】スタッファーあり（ｓｔｕｆｆｅｄ）カセットを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲで処置したＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜構造の回復を示す。ビヒクルあるいは以下のカセット、Ｘ００１、Ｘ００１－３ｐ、Ｘ００１－５ｐ、またはＸ００２－３ｐを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲベクターのいずれかで処置されたＲＳ１ＫＯマウスにおける分離腔スコアの定量化である。全てのベクターは、注射後１ヶ月でのＸ００１－５ｐを除いて、両方の時点で網膜分離症スコアを改善した。名目上の記述的な統計有意性を、処置した眼に対するＴｕｋｅｙの事後検定による２元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で判定した。

【図11A】図１１Ａ～図１１Ｂは、スタッファーありカセットを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲで処置したＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜機能の回復を示す。ＲＳ１ＫＯマウスにおける平均最大暗順応（左）および明所視（右）ｂ波振幅は、ビヒクルまたは以下のカセット：Ｘ００１、Ｘ００１－３ｐ、Ｘ００１－５ｐ、またはＸ００２－３ｐを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲのいずれかを片眼に網膜下注射してから１ヶ月および２ヶ月後に測定した。ベクターを１×１０^８ｖｇ（図１１Ａ）または５×１０^８ｖｇ（図１１Ｂ）のいずれかで投与した。全てのベクターで処置された眼における網膜機能は、未処置の対照の眼よりも改善された。名目上の記述的な統計有意性を、各個別データセットに対するＴｕｋｅｙの事後検定による２元配置分散分析で判定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図11B】図１１Ａ～図１１Ｂは、スタッファーありカセットを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲで処置したＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜機能の回復を示す。ＲＳ１ＫＯマウスにおける平均最大暗順応（左）および明所視（右）ｂ波振幅は、ビヒクルまたは以下のカセット：Ｘ００１、Ｘ００１－３ｐ、Ｘ００１－５ｐ、またはＸ００２－３ｐを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲのいずれかを片眼に網膜下注射してから１ヶ月および２ヶ月後に測定した。ベクターを１×１０^８ｖｇ（図１１Ａ）または５×１０^８ｖｇ（図１１Ｂ）のいずれかで投与した。全てのベクターで処置された眼における網膜機能は、未処置の対照の眼よりも改善された。名目上の記述的な統計有意性を、各個別データセットに対するＴｕｋｅｙの事後検定による２元配置分散分析で決定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図12A】図１２Ａ～図１２Ｂは、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００２－３ｐで処置したＲＳ１ＫＯマウスの網膜におけるＲＳ１発現を示す。片眼にビヒクルまたはＸ００２－３ｐカセットを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲのいずれかのみを処置したＲＳ１ＫＯマウス（上）からの代表的な網膜断面である。ベクターを１×１０^８ｖｇ（図１２Ａ）または５×１０^８ｖｇ（図１２Ｂ）のいずれかで投与した。反対側の未処置の眼を下の列に示す。全ての網膜をＲＳ１に対して産生された抗体（赤色）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。

【図12B】図１２Ａ～図１２Ｂは、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００２－３ｐで処置したＲＳ１ＫＯマウスの網膜におけるＲＳ１発現を示す。片眼でビヒクルまたはＸ００２－３ｐカセットを含有するｒＡＡＶ．ＳＰＲのいずれかのみを処置したＲＳ１ＫＯマウス（上）からの代表的な網膜断面である。ベクターを１×１０^８ｖｇ（図１２ＡＡ）または５×１０^８ｖｇ（図１２Ｂ）のいずれかで投与した。反対側の未処置の眼を下の列に示す。全ての網膜をＲＳ１に対して産生された抗体（赤色）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。

【発明を実施するための形態】

【0014】

Ｉ．物質の組成物
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ヒト疾患の多数の前臨床動物モデルにおけるインビボ遺伝子導入に成功裏に使用されており、ならびに多種多様な治療薬の長期発現に成功裏に使用されている。ＡＡＶベクターはまた、例えば、レーバー先天性黒内障のための眼送達など、免疫特権部位に標的化される場合、ヒトにおいて長期の臨床的利益をもたらした。このベクターの利点は、その比較的低い免疫プロファイルであり、限られた炎症応答しか誘発せず、場合によっては、導入遺伝子産物に対する免疫寛容さえも誘導する。

【0015】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その効率、持続性および低い免疫原性のため、眼の遺伝子治療に使用される。本開示の態様は、目的のタンパク質またはポリペプチドを含む１つまたは複数の核酸ベクターを様々な組織、器官、および／または細胞に送達するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子またはそのような粒子の調製物に関する。

【0016】

本明細書に記載されるのは、ＡＡＶ粒子の製造およびパッケージングのための改善された系である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系および方法は、ＡＡＶ粒子のパッケージングの効率、複製ＡＡＶ粒子の精度、またはそれらの組合せを改善する。

【0017】

Ａ．スタッファー配列
いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列が本明細書に記載される。本明細書に記載されるように、「核酸スタッファー配列」と互換的に呼ばれる「スタッファー配列」は、ＡＡＶウイルスゲノム配列の長さを、正常な長さまたは近似した長さにサイズ変更または調整する核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＣｐＧアイランドを含まず、核酸スタッファー配列は、４つを超える同じ同一性の連続核酸塩基を含まず、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含み、核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まず、または核酸スタッファー配列は、２０アミノ酸より大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードせず、あるいはこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＣｐＧアイランドを含まず、核酸スタッファー配列は、４つを超える同じ同一性の連続核酸塩基を含まず、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含み、核酸スタッファー配列は、２０アミノ酸より大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードせず、および核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まない。

【0018】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファーは、ＣｐＧアイランドを含まない。いくつかの実施形態では、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）は、多数のＣｐＧジヌクレオチド反復を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧアイランドは、ＧＣ含量が５０％ＧＣを超える少なくとも１００塩基対長の領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧアイランドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００またはそれ以上の塩基対長の領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧアイランドは、ＧＣ含量が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％を超える領域を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える同じ同一性の連続核酸塩基を含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続するアデノシンを含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続するシトシンを含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続するグアニンを含まない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続するチミンを含まない。

【0020】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３０％～約６０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約４５％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約０％～１０％のＧＣ含量、約５％～１５％のＧＣ含量、約１０％～２０％のＧＣ含量、約１５％～２０％のＧＣ含量、約２５％～３５％のＧＣ含量、約３０％～４０％のＧＣ含量、約３５％～４５％のＧＣ含量、約４０％～５０％のＧＣ含量、約４５％～５５％のＧＣ含量、約５０％～６０％のＧＣ含量、約５５％～６５％のＧＣ含量、約６０％～７０％のＧＣ含量、約６５％～７５％のＧＣ含量、約７０％～８０％のＧＣ含量、約７５％～８５％のＧＣ含量、約８０％～９０％のＧＣ含量、約８５％～９５％のＧＣ含量、または約０５％～１００％のＧＣ含量を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、制限酵素切断部位を含まない。いくつかの実施形態では、制限酵素切断部位は、ＡａｔＩＩ、ＡｂａＳＩ、ＡｃｃＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ §、ＡｇｅＩ－ＨＦ（登録商標）、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ－ｖ２、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ §、ＡｐｏＩ－ＨＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ §、ＢａｍＨＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ §、ＢｂｓＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ §、ＢｃｌＩ－ＨＦ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ §、ＢｍｔＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ－ＨＦ（登録商標）ｖ２、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ §、ＢｓｉＷＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ－ｖ２、ＢｓｒＧＩ §、ＢｓｒＧＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＳＩ－ｖ２、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ §、ＢｓｔＥＩＩ－ＨＦ（登録商標）、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ－ＨＦ（登録商標）、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ－１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ－ＨＦ（登録商標）、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ－ＨＦ（登録商標）、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ §、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ（登録商標）、ＥｃｏＲＶ §、ＥｃｏＲＶ－ＨＦ（登録商標）、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＥＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ §、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（登録商標）、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ §、ＫｐｎＩ－ＨＦ（登録商標）、ＬｐｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ §、ＭｆｅＩ－ＨＦ（登録商標）、ＭｌｕＣＩ、ＭｌｕＩ §、ＭｌｕＩ－ＨＦ（登録商標）、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＪＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ §、ＮｃｏＩ－ＨＦ（登録商標）、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ－ＨＦ（登録商標）、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ §、ＮｏｔＩ－ＨＦ（登録商標）、ＮｒｕＩ §、ＮｒｕＩ－ＨＦ（登録商標）、ＮｓｉＩ §、ＮｓｉＩ－ＨＦ（登録商標）、ＮｓｐＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰａｑＣＩ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰｌｅＩ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ－ｖ２、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ §、ＰｓｔＩ－ＨＦ（登録商標）、ＰｖｕＩ §、ＰｖｕＩ－ＨＦ（登録商標）、ＰｖｕＩＩ §、ＰｖｕＩＩ－ＨＦ（登録商標）、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ §、ＳａｃＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ §、ＳａｌＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ §、ＳｂｆＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃａＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ §、ＳｐｅＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｐｈＩ §、ＳｐｈＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｒｆＩ、ＳｓｐＩ §、ＳｓｐＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ－ＨＦ（登録商標）、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ－ｖ２、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩ、またはＺｒａＩ制限切断部位である。

【0022】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファーは、１０、２０、３０、４０、または５０アミノ酸より大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしない。いくつかの実施形態では、核酸スタッファーは、２０アミノ酸より大きなＯＲＦをコードしない。

【0023】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００、１００～約４０００、１００～約３０００、１００～約２０００、１００～約１０００、１００～約９００、１００～約８００、１００～約７００、１００～約６００、１００～約５００、または１００～約４００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００、５００～約５０００、１０００～約５０００、２０００～約５０００、または３０００～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１０００～約５０００、１０５０～約４５００、または２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３０２８核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２２３５核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３８１核酸塩基の長さを有する。

【0024】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号８と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号１１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７、８、または１１の１００個のヌクレオチドと約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７に相補的な配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号８に相補的な配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号１１に相補的な配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７、８、または１１の少なくとも１００個のヌクレオチドに相補的な配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号７もしくは配列番号７に相補的な配列の塩基１～１００、２～１０１、３～１０２、４～１０３、５～１０４、６～１０５、７～１０６、８～１０７、９～１０８、１０～１０９、１１～１１０、１２～１１１、１３～１１２、１４～１１３、１５～１１４、１６～１１５、１７～１１６、１８～１１７、１９～１１８、２０～１１９、２１～１２０、２２～１２１、２３～１２２、２４～１２３、２５～１２４、２６～１２５、２７～１２６、２８～１２７、２９～１２８、３０～１２９、３１～１３０、３２～１３１、３３～１３２、３４～１３３、３５～１３４、３６～１３５、３７～１３６、３８～１３７、３９～１３８、４０～１３９、４１～１４０、４２～１４１、４３～１４２、４４～１４３、４５～１４４、４６～１４５、４７～１４６、４８～１４７、４９～１４８、５０～１４９、５１～１５０、５２～１５１、５３～１５２、５４～１５３、５５～１５４、５６～１５５、５７～１５６、５８～１５７、５９～１５８、６０～１５９、６１～１６０、６２～１６１、６３～１６２、６４～１６３、６５～１６４、６６～１６５、６７～１６６、６８～１６７、６９～１６８、７０～１６９、７１～１７０、７２～１７１、７３～１７２、７４～１７３、７５～１７４、７６～１７５、７７～１７６、７８～１７７、７９～１７８、８０～１７９、８１～１８０、８２～１８１、８３～１８２、８４～１８３、８５～１８４、８６～１８５、８７～１８６、８８～１８７、８９～１８８、９０～１８９、９１～１９０、９２～１９１、９３～１９２、９４～１９３、９５～１９４、９６～１９５、９７～１９６、９８～１９７、９９～１９８、１００～１９９、１０１～２００、１０２～２０１、１０３～２０２、１０４～２０３、１０５～２０４、１０６～２０５、１０７～２０６、１０８～２０７、１０９～２０８、１１０～２０９、１１１～２１０、１１２～２１１、１１３～２１２、１１４～２１３、１１５～２１４、１１６～２１５、１１７～２１６、１１８～２１７、１１９～２１８、１２０～２１９、１２１～２２０、１２２～２２１、１２３～２２２、１２４～２２３、１２５～２２４、１２６～２２５、１２７～２２６、１２８～２２７、１２９～２２８、１３０～２２９、１３１～２３０、１３２～２３１、１３３～２３２、１３４～２３３、１３５～２３４、１３６～２３５、１３７～２３６、１３８～２３７、１３９～２３８、１４０～２３９、１４１～２４０、１４２～２４１、１４３～２４２、１４４～２４３、１４５～２４４、１４６～２４５、１４７～２４６、１４８～２４７、１４９～２４８、１５０～２４９、１５１～２５０、１５２～２５１、１５３～２５２、１５４～２５３、１５５～２５４、１５６～２５５、１５７～２５６、１５８～２５７、１５９～２５８、１６０～２５９、１６１～２６０、１６２～２６１、１６３～２６２、１６４～２６３、１６５～２６４、１６６～２６５、１６７～２６６、１６８～２６７、１６９～２６８、１７０～２６９、１７１～２７０、１７２～２７１、１７３～２７２、１７４～２７３、１７５～２７４、１７６～２７５、１７７～２７６、１７８～２７７、１７９～２７８、１８０～２７９、１８１～２８０、１８２～２８１、１８３～２８２、１８４～２８３、１８５～２８４、１８６～２８５、１８７～２８６、１８８～２８７、１８９～２８８、１９０～２８９、１９１～２９０、１９２～２９１、１９３～２９２、１９４～２９３、１９５～２９４、１９６～２９５、１９７～２９６、１９８～２９７、１９９～２９８、２００～２９９、２０１～３００、２０２～３０１、２０３～３０２、２０４～３０３、２０５～３０４、２０６～３０５、２０７～３０６、２０８～３０７、２０９～３０８、２１０～３０９、２１１～３１０、２１２～３１１、２１３～３１２、２１４～３１３、２１５～３１４、２１６～３１５、２１７～３１６、２１８～３１７、２１９～３１８、２２０～３１９、２２１～３２０、２２２～３２１、２２３～３２２、２２４～３２３、２２５～３２４、２２６～３２５、２２７～３２６、２２８～３２７、２２９～３２８、２３０～３２９、２３１～３３０、２３２～３３１、２３３～３３２、２３４～３３３、２３５～３３４、２３６～３３５、２３７～３３６、２３８～３３７、２３９～３３８、２４０～３３９、２４１～３４０、２４２～３４１、２４３～３４２、２４４～３４３、２４５～３４４、２４６～３４５、２４７～３４６、２４８～３４７、２４９～３４８、２５０～３４９、２５１～３５０、２５２～３５１、２５３～３５２、２５４～３５３、２５５～３５４、２５６～３５５、２５７～３５６、２５８～３５７、２５９～３５８、２６０～３５９、２６１～３６０、２６２～３６１、２６３～３６２、２６４～３６３、２６５～３６４、２６６～３６５、２６７～３６６、２６８～３６７、２６９～３６８、２７０～３６９、２７１～３７０、２７２～３７１、２７３～３７２、２７４～３７３、２７５～３７４、２７６～３７５、２７７～３７６、２７８～３７７、２７９～３７８、２８０～３７９、２８１～３８０、２８２～３８１、２８３～３８２、２８４～３８３、２８５～３８４、２８６～３８５、２８７～３８６、２８８～３８７、２８９～３８８、２９０～３８９、２９１～３９０、２９２～３９１、２９３～３９２、２９４～３９３、２９５～３９４、２９６～３９５、２９７～３９６、２９８～３９７、２９９～３９８、３００～３９９、３０１～４００、３０２～４０１、３０３～４０２、３０４～４０３、３０５～４０４、３０６～４０５、３０７～４０６、３０８～４０７、３０９～４０８、３１０～４０９、３１１～４１０、３１２～４１１、３１３～４１２、３１４～４１３、３１５～４１４、３１６～４１５、３１７～４１６、３１８～４１７、３１９～４１８、３２０～４１９、３２１～４２０、３２２～４２１、３２３～４２２、３２４～４２３、３２５～４２４、３２６～４２５、３２７～４２６、３２８～４２７、３２９～４２８、３３０～４２９、３３１～４３０、３３２～４３１、３３３～４３２、３３４～４３３、３３５～４３４、３３６～４３５、３３７～４３６、３３８～４３７、３３９～４３８、３４０～４３９、３４１～４４０、３４２～４４１、３４３～４４２、３４４～４４３、３４５～４４４、３４６～４４５、３４７～４４６、３４８～４４７、３４９～４４８、３５０～４４９、３５１～４５０、３５２～４５１、３５３～４５２、３５４～４５３、３５５～４５４、３５６～４５５、３５７～４５６、３５８～４５７、３５９～４５８、３６０～４５９、３６１～４６０、３６２～４６１、３６３～４６２、３６４～４６３、３６５～４６４、３６６～４６５、３６７～４６６、３６８～４６７、３６９～４６８、３７０～４６９、３７１～４７０、３７２～４７１、３７３～４７２、３７４～４７３、３７５～４７４、３７６～４７５、３７７～４７６、３７８～４７７、３７９～４７８、３８０～４７９、３８１～４８０、３８２～４８１、３８３～４８２、３８４～４８３、３８５～４８４、３８６～４８５、３８７～４８６、３８８～４８７、３８９～４８８、３９０～４８９、３９１～４９０、３９２～４９１、３９３～４９２、３９４～４９３、３９５～４９４、３９６～４９５、３９７～４９６、３９８～４９７、３９９～４９８、４００～４９９、４０１～５００、４０２～５０１、４０３～５０２、４０４～５０３、４０５～５０４、４０６～５０５、４０７～５０６、４０８～５０７、４０９～５０８、４１０～５０９、４１１～５１０、４１２～５１１、４１３～５１２、４１４～５１３、４１５～５１４、４１６～５１５、４１７～５１６、４１８～５１７、４１９～５１８、４２０～５１９、４２１～５２０、４２２～５２１、４２３～５２２、４２４～５２３、４２５～５２４、４２６～５２５、４２７～５２６、４２８～５２７、４２９～５２８、４３０～５２９、４３１～５３０、４３２～５３１、４３３～５３２、４３４～５３３、４３５～５３４、４３６～５３５、４３７～５３６、４３８～５３７、４３９～５３８、４４０～５３９、４４１～５４０、４４２～５４１、４４３～５４２、４４４～５４３、４４５～５４４、４４６～５４５、４４７～５４６、４４８～５４７、４４９～５４８、４５０～５４９、４５１～５５０、４５２～５５１、４５３～５５２、４５４～５５３、４５５～５５４、４５６～５５５、４５７～５５６、４５８～５５７、４５９～５５８、４６０～５５９、４６１～５６０、４６２～５６１、４６３～５６２、４６４～５６３、４６５～５６４、４６６～５６５、４６７～５６６、４６８～５６７、４６９～５６８、４７０～５６９、４７１～５７０、４７２～５７１、４７３～５７２、４７４～５７３、４７５～５７４、４７６～５７５、４７７～５７６、４７８～５７７、４７９～５７８、４８０～５７９、４８１～５８０、４８２～５８１、４８３～５８２、４８４～５８３、４８５～５８４、４８６～５８５、４８７～５８６、４８８～５８７、４８９～５８８、４９０～５８９、４９１～５９０、４９２～５９１、４９３～５９２、４９４～５９３、４９５～５９４、４９６～５９５、４９７～５９６、４９８～５９７、４９９～５９８、５００～５９９、５０１～６００、５０２～６０１、５０３～６０２、５０４～６０３、５０５～６０４、５０６～６０５、５０７～６０６、５０８～６０７、５０９～６０８、５１０～６０９、５１１～６１０、５１２～６１１、５１３～６１２、５１４～６１３、５１５～６１４、５１６～６１５、５１７～６１６、５１８～６１７、５１９～６１８、５２０～６１９、５２１～６２０、５２２～６２１、５２３～６２２、５２４～６２３、５２５～６２４、５２６～６２５、５２７～６２６、５２８～６２７、５２９～６２８、５３０～６２９、５３１～６３０、５３２～６３１、５３３～６３２、５３４～６３３、５３５～６３４、５３６～６３５、５３７～６３６、５３８～６３７、５３９～６３８、５４０～６３９、５４１～６４０、５４２～６４１、５４３～６４２、５４４～６４３、５４５～６４４、５４６～６４５、５４７～６４６、５４８～６４７、５４９～６４８、５５０～６４９、５５１～６５０、５５２～６５１、５５３～６５２、５５４～６５３、５５５～６５４、５５６～６５５、５５７～６５６、５５８～６５７、５５９～６５８、５６０～６５９、５６１～６６０、５６２～６６１、５６３～６６２、５６４～６６３、５６５～６６４、５６６～６６５、５６７～６６６、５６８～６６７、５６９～６６８、５７０～６６９、５７１～６７０、５７２～６７１、５７３～６７２、５７４～６７３、５７５～６７４、５７６～６７５、５７７～６７６、５７８～６７７、５７９～６７８、５８０～６７９、５８１～６８０、５８２～６８１、５８３～６８２、５８４～６８３、５８５～６８４、５８６～６８５、５８７～６８６、５８８～６８７、５８９～６８８、５９０～６８９、５９１～６９０、５９２～６９１、５９３～６９２、５９４～６９３、５９５～６９４、５９６～６９５、５９７～６９６、５９８～６９７、５９９～６９８、６００～６９９、６０１～７００、６０２～７０１、６０３～７０２、６０４～７０３、６０５～７０４、６０６～７０５、６０７～７０６、６０８～７０７、６０９～７０８、６１０～７０９、６１１～７１０、６１２～７１１、６１３～７１２、６１４～７１３、６１５～７１４、６１６～７１５、６１７～７１６、６１８～７１７、６１９～７１８、６２０～７１９、６２１～７２０、６２２～７２１、６２３～７２２、６２４～７２３、６２５～７２４、６２６～７２５、６２７～７２６、６２８～７２７、６２９～７２８、６３０～７２９、６３１～７３０、６３２～７３１、６３３～７３２、６３４～７３３、６３５～７３４、６３６～７３５、６３７～７３６、６３８～７３７、６３９～７３８、６４０～７３９、６４１～７４０、６４２～７４１、６４３～７４２、６４４～７４３、６４５～７４４、６４６～７４５、６４７～７４６、６４８～
７４７、６４９～７４８、６５０～７４９、６５１～７５０、６５２～７５１、６５３～７５２、６５４～７５３、６５５～７５４、６５６～７５５、６５７～７５６、６５８～７５７、６５９～７５８、６６０～７５９、６６１～７６０、６６２～７６１、６６３～７６２、６６４～７６３、６６５～７６４、６６６～７６５、６６７～７６６、６６８～７６７、６６９～７６８、６７０～７６９、６７１～７７０、６７２～７７１、６７３～７７２、６７４～７７３、６７５～７７４、６７６～７７５、６７７～７７６、６７８～７７７、６７９～７７８、６８０～７７９、６８１～７８０、６８２～７８１、６８３～７８２、６８４～７８３、６８５～７８４、６８６～７８５、６８７～７８６、６８８～７８７、６８９～７８８、６９０～７８９、６９１～７９０、６９２～７９１、６９３～７９２、６９４～７９３、６９５～７９４、６９６～７９５、６９７～７９６、６９８～７９７、６９９～７９８、７００～７９９、７０１～８００、７０２～８０１、７０３～８０２、７０４～８０３、７０５～８０４、７０６～８０５、７０７～８０６、７０８～８０７、７０９～８０８、７１０～８０９、７１１～８１０、７１２～８１１、７１３～８１２、７１４～８１３、７１５～８１４、７１６～８１５、７１７～８１６、７１８～８１７、７１９～８１８、７２０～８１９、７２１～８２０、７２２～８２１、７２３～８２２、７２４～８２３、７２５～８２４、７２６～８２５、７２７～８２６、７２８～８２７、７２９～８２８、７３０～８２９、７３１～８３０、７３２～８３１、７３３～８３２、７３４～８３３、７３５～８３４、７３６～８３５、７３７～８３６、７３８～８３７、７３９～８３８、７４０～８３９、７４１～８４０、７４２～８４１、７４３～８４２、７４４～８４３、７４５～８４４、７４６～８４５、７４７～８４６、７４８～８４７、７４９～８４８、７５０～８４９、７５１～８５０、７５２～８５１、７５３～８５２、７５４～８５３、７５５～８５４、７５６～８５５、７５７～８５６、７５８～８５７、７５９～８５８、７６０～８５９、７６１～８６０、７６２～８６１、７６３～８６２、７６４～８６３、７６５～８６４、７６６～８６５、７６７～８６６、７６８～８６７、７６９～８６８、７７０～８６９、７７１～８７０、７７２～８７１、７７３～８７２、７７４～８７３、７７５～８７４、７７６～８７５、７７７～８７６、７７８～８７７、７７９～８７８、７８０～８７９、７８１～８８０、７８２～８８１、７８３～８８２、７８４～８８３、７８５～８８４、７８６～８８５、７８７～８８６、７８８～８８７、７８９～８８８、７９０～８８９、７９１～８９０、７９２～８９１、７９３～８９２、７９４～８９３、７９５～８９４、７９６～８９５、７９７～８９６、７９８～８９７、７９９～８９８、８００～８９９、８０１～９００、８０２～９０１、８０３～９０２、８０４～９０３、８０５～９０４、８０６～９０５、８０７～９０６、８０８～９０７、８０９～９０８、８１０～９０９、８１１～９１０、８１２～９１１、８１３～９１２、８１４～９１３、８１５～９１４、８１６～９１５、８１７～９１６、８１８～９１７、８１９～９１８、８２０～９１９、８２１～９２０、８２２～９２１、８２３～９２２、８２４～９２３、８２５～９２４、８２６～９２５、８２７～９２６、８２８～９２７、８２９～９２８、８３０～９２９、８３１～９３０、８３２～９３１、８３３～９３２、８３４～９３３、８３５～９３４、８３６～９３５、８３７～９３６、８３８～９３７、８３９～９３８、８４０～９３９、８４１～９４０、８４２～９４１、８４３～９４２、８４４～９４３、８４５～９４４、８４６～９４５、８４７～９４６、８４８～９４７、８４９～９４８、８５０～９４９、８５１～９５０、８５２～９５１、８５３～９５２、８５４～９５３、８５５～９５４、８５６～９５５、８５７～９５６、８５８～９５７、８５９～９５８、８６０～９５９、８６１～９６０、８６２～９６１、８６３～９６２、８６４～９６３、８６５～９６４、８６６～９６５、８６７～９６６、８６８～９６７、８６９～９６８、８７０～９６９、８７１～９７０、８７２～９７１、８７３～９７２、８７４～９７３、８７５～９７４、８７６～９７５、８７７～９７６、８７８～９７７、８７９～９７８、８８０～９７９、８８１～９８０、８８２～９８１、８８３～９８２、８８４～９８３、８８５～９８４、８８６～９８５、８８７～９８６、８８８～９８７、８８９～９８８、８９０～９８９、８９１～９９０、８９２～９９１、８９３～９９２、８９４～９９３、８９５～９９４、８９６～９９５、８９７～９９６、８９８～９９７、８９９～９９８、９００～９９９、９０１～１０００、９０２～１００１、９０３～１００２、９０４～１００３、９０５～１００４、９０６～１００５、９０７～１００６、９０８～１００７、９０９～１００８、９１０～１００９、９１１～１０１０、９１２～１０１１、９１３～１０１２、９１４～１０１３、９１５～１０１４、９１６～１０１５、９１７～１０１６、９１８～１０１７、９１９～１０１８、９２０～１０１９、９２１～１０２０、９２２～１０２１、９２３～１０２２、９２４～１０２３、９２５～１０２４、９２６～１０２５、９２７～１０２６、９２８～１０２７、９２９～１０２８、９３０～１０２９、９３１～１０３０、９３２～１０３１、９３３～１０３２、９３４～１０３３、９３５～１０３４、９３６～１０３５、９３７～１０３６、９３８～１０３７、９３９～１０３８、９４０～１０３９、９４１～１０４０、９４２～１０４１、９４３～１０４２、９４４～１０４３、９４５～１０４４、９４６～１０４５、９４７～１０４６、９４８～１０４７、９４９～１０４８、９５０～１０４９、９５１～１０５０、９５２～１０５１、９５３～１０５２、９５４～１０５３、９５５～１０５４、９５６～１０５５、９５７～１０５６、９５８～１０５７、９５９～１０５８、９６０～１０５９、９６１～１０６０、９６２～１０６１、９６３～１０６２、９６４～１０６３、９６５～１０６４、９６６～１０６５、９６７～１０６６、９６８～１０６７、９６９～１０６８、９７０～１０６９、９７１～１０７０、９７２～１０７１、９７３～１０７２、９７４～１０７３、９７５～１０７４、９７６～１０７５、９７７～１０７６、９７８～１０７７、９７９～１０７８、９８０～１０７９、９８１～１０８０、９８２～１０８１、９８３～１０８２、９８４～１０８３、９８５～１０８４、９８６～１０８５、９８７～１０８６、９８８～１０８７、９８９～１０８８、９９０～１０８９、９９１～１０９０、９９２～１０９１、９９３～１０９２、９９４～１０９３、９９５～１０９４、９９６～１０９５、９９７～１０９６、９９８～１０９７、９９９～１０９８、１０００～１０９９、１０００～１１００、１００１～１１０１、１００２～１１０２、１００３～１１０３、１００４～１１０４、１００５～１１０５、１００６～１１０６、１００７～１１０７、１００８～１１０８、１００９～１１０９、１０１０～１１１０、１０１１～１１１１、１０１２～１１１２、１０１３～１１１３、１０１４～１１１４、１０１５～１１１５、１０１６～１１１６、１０１７～１１１７、１０１８～１１１８、１０１９～１１１９、１０２０～１１２０、１０２１～１１２１、１０２２～１１２２、１０２３～１１２３、１０２４～１１２４、１０２５～１１２５、１０２６～１１２６、１０２７～１１２７、１０２８～１１２８、１０２９～１１２９、１０３０～１１３０、１０３１～１１３１、１０３２～１１３２、１０３３～１１３３、１０３４～１１３４、１０３５～１１３５、１０３６～１１３６、１０３７～１１３７、１０３８～１１３８、１０３９～１１３９、１０４０～１１４０、１０４１～１１４１、１０４２～１１４２、１０４３～１１４３、１０４４～１１４４、１０４５～１１４５、１０４６～１１４６、１０４７～１１４７、１０４８～１１４８、１０４９～１１４９、１０５０～１１５０、１０５１～１１５１、１０５２～１１５２、１０５３～１１５３、１０５４～１１５４、１０５５～１１５５、１０５６～１１５６、１０５７～１１５７、１０５８～１１５８、１０５９～１１５９、１０６０～１１６０、１０６１～１１６１、１０６２～１１６２、１０６３～１１６３、１０６４～１１６４、１０６５～１１６５、１０６６～１１６６、１０６７～１１６７、１０６８～１１６８、１０６９～１１６９、１０７０～１１７０、１０７１～１１７１、１０７２～１１７２、１０７３～１１７３、１０７４～１１７４、１０７５～１１７５、１０７６～１１７６、１０７７～１１７７、１０７８～１１７８、１０７９～１１７９、１０８０～１１８０、１０８１～１１８１、１０８２～１１８２、１０８３～１１８３、１０８４～１１８４、１０８５～１１８５、１０８６～１１８６、１０８７～１１８７、１０８８～１１８８、１０８９～１１８９、１０９０～１１９０、１０９１～１１９１、１０９２～１１９２、１０９３～１１９３、１０９４～１１９４、１０９５～１１９５、１０９６～１１９６、１０９７～１１９７、１０９８～１１９８、１０９９～１１９９、１１００～１２００、１１０１～１２０１、１１０２～１２０２、１１０３～１２０３、１１０４～１２０４、１１０５～１２０５、１１０６～１２０６、１１０７～１２０７、１１０８～１２０８、１１０９～１２０９、１１１０～１２１０、１１１１～１２１１、１１１２～１２１２、１１１３～１２１３、１１１４～１２１４、１１１５～１２１５、１１１６～１２１６、１１１７～１２１７、１１１８～１２１８、１１１９～１２１９、１１２０～１２２０、１１２１～１２２１、１１２２～１２２２、１１２３～１２２３、１１２４～１２２４、１１２５～１２２５、１１２６～１２２６、１１２７～１２２７、１１２８～１２２８、１１２９～１２２９、１１３０～１２３０、１１３１～１２３１、１１３２～１２３２、１１３３～１２３３、１１３４～１２３４、１１３５～１２３５、１１３６～１２３６、１１３７～１２３７、１１３８～１２３８、１１３９～１２３９、１１４０～１２４０、１１４１～１２４１、１１４２～１２４２、１１４３～１２４３、１１４４～１２４４、１１４５～１２４５、１１４６～１２４６、１１４７～１２４７、１１４８～１２４８、１１４９～１２４９、１１５０～１２５０、１１５１～１２５１、１１５２～１２５２、１１５３～１２５３、１１５４～１２５４、１１５５～１２５５、１１５６～１２５６、１１５７～１２５７、１１５８～１２５８、１１５９～１２５９、１１６０～１２６０、１１６１～１２６１、１１６２～１２６２、１１６３～１２６３、１１６４～１２６４、１１６５～１２６５、１１６６～１２６６、１１６７～１２６７、１１６８～１２６８、１１６９～１２６９、１１７０～１２７０、１１７１～１２７１、１１７２～１２７２、１１７３～１２７３、１１７４～１２７４、１１７５～１２７５、１１７６～１２７６、１１７７～１２７７、１１７８～１２７８、１１７９～１２７９、１１８０～１２８０、１１８１～１２８１、１１８２～１２８２、１１８３～１２８３、１１８４～１２８４、１１８５～１２８５、１１８６～１２８６、１１８７～１２８７、１１８８～１２８８、１１８９～１２８９、１１９０～１２９０、１１９１～１２９１、１１９２～１２９２、１１９３～１２９３、１１９４～１２９４、１１９５～１２９５、１１９６～１２９６、１１９７～１２９７、１１９８～１２９８、１１９９～１２９９、１２００～１３００、１２０１～１３０１、１２０２～１３０２、１２０３～１３０３、１２０４～１３０４、１２０５～１３０５、１２０６～１３０６、１２０７～１３０７、１２０８～１３０８、１２０９～１３０９、１２１０～１３１０、１２１１～１３１１、１２１２～１３１２、１２１３～１３１３、１２１４～１３１４、１２１５～１３１５、１２１６～１３１６、１２１７～１３１７、１２１８～１３１８、１２１９～１３１９、
１２２０～１３２０、１２２１～１３２１、１２２２～１３２２、１２２３～１３２３、１２２４～１３２４、１２２５～１３２５、１２２６～１３２６、１２２７～１３２７、１２２８～１３２８、１２２９～１３２９、１２３０～１３３０、１２３１～１３３１、１２３２～１３３２、１２３３～１３３３、１２３４～１３３４、１２３５～１３３５、１２３６～１３３６、１２３７～１３３７、１２３８～１３３８、１２３９～１３３９、１２４０～１３４０、１２４１～１３４１、１２４２～１３４２、１２４３～１３４３、１２４４～１３４４、１２４５～１３４５、１２４６～１３４６、１２４７～１３４７、１２４８～１３４８、１２４９～１３４９、１２５０～１３５０、１２５１～１３５１、１２５２～１３５２、１２５３～１３５３、１２５４～１３５４、１２５５～１３５５、１２５６～１３５６、１２５７～１３５７、１２５８～１３５８、１２５９～１３５９、１２６０～１３６０、１２６１～１３６１、１２６２～１３６２、１２６３～１３６３、１２６４～１３６４、１２６５～１３６５、１２６６～１３６６、１２６７～１３６７、１２６８～１３６８、１２６９～１３６９、１２７０～１３７０、１２７１～１３７１、１２７２～１３７２、１２７３～１３７３、１２７４～１３７４、１２７５～１３７５、１２７６～１３７６、１２７７～１３７７、１２７８～１３７８、１２７９～１３７９、１２８０～１３８０、１２８１～１３８１、１２８２～１３８２、１２８３～１３８３、１２８４～１３８４、１２８５～１３８５、１２８６～１３８６、１２８７～１３８７、１２８８～１３８８、１２８９～１３８９、１２９０～１３９０、１２９１～１３９１、１２９２～１３９２、１２９３～１３９３、１２９４～１３９４、１２９５～１３９５、１２９６～１３９６、１２９７～１３９７、１２９８～１３９８、１２９９～１３９９、１３００～１４００、１３０１～１４０１、１３０２～１４０２、１３０３～１４０３、１３０４～１４０４、１３０５～１４０５、１３０６～１４０６、１３０７～１４０７、１３０８～１４０８、１３０９～１４０９、１３１０～１４１０、１３１１～１４１１、１３１２～１４１２、１３１３～１４１３、１３１４～１４１４、１３１５～１４１５、１３１６～１４１６、１３１７～１４１７、１３１８～１４１８、１３１９～１４１９、１３２０～１４２０、１３２１～１４２１、１３２２～１４２２、１３２３～１４２３、１３２４～１４２４、１３２５～１４２５、１３２６～１４２６、１３２７～１４２７、１３２８～１４２８、１３２９～１４２９、１３３０～１４３０、１３３１～１４３１、１３３２～１４３２、１３３３～１４３３、１３３４～１４３４、１３３５～１４３５、１３３６～１４３６、１３３７～１４３７、１３３８～１４３８、１３３９～１４３９、１３４０～１４４０、１３４１～１４４１、１３４２～１４４２、１３４３～１４４３、１３４４～１４４４、１３４５～１４４５、１３４６～１４４６、１３４７～１４４７、１３４８～１４４８、１３４９～１４４９、１３５０～１４５０、１３５１～１４５１、１３５２～１４５２、１３５３～１４５３、１３５４～１４５４、１３５５～１４５５、１３５６～１４５６、１３５７～１４５７、１３５８～１４５８、１３５９～１４５９、１３６０～１４６０、１３６１～１４６１、１３６２～１４６２、１３６３～１４６３、１３６４～１４６４、１３６５～１４６５、１３６６～１４６６、１３６７～１４６７、１３６８～１４６８、１３６９～１４６９、１３７０～１４７０、１３７１～１４７１、１３７２～１４７２、１３７３～１４７３、１３７４～１４７４、１３７５～１４７５、１３７６～１４７６、１３７７～１４７７、１３７８～１４７８、１３７９～１４７９、１３８０～１４８０、１３８１～１４８１、１３８２～１４８２、１３８３～１４８３、１３８４～１４８４、１３８５～１４８５、１３８６～１４８６、１３８７～１４８７、１３８８～１４８８、１３８９～１４８９、１３９０～１４９０、１３９１～１４９１、１３９２～１４９２、１３９３～１４９３、１３９４～１４９４、１３９５～１４９５、１３９６～１４９６、１３９７～１４９７、１３９８～１４９８、１３９９～１４９９、１４００～１５００、１４０１～１５０１、１４０２～１５０２、１４０３～１５０３、１４０４～１５０４、１４０５～１５０５、１４０６～１５０６、１４０７～１５０７、１４０８～１５０８、１４０９～１５０９、１４１０～１５１０、１４１１～１５１１、１４１２～１５１２、１４１３～１５１３、１４１４～１５１４、１４１５～１５１５、１４１６～１５１６、１４１７～１５１７、１４１８～１５１８、１４１９～１５１９、１４２０～１５２０、１４２１～１５２１、１４２２～１５２２、１４２３～１５２３、１４２４～１５２４、１４２５～１５２５、１４２６～１５２６、１４２７～１５２７、１４２８～１５２８、１４２９～１５２９、１４３０～１５３０、１４３１～１５３１、１４３２～１５３２、１４３３～１５３３、１４３４～１５３４、１４３５～１５３５、１４３６～１５３６、１４３７～１５３７、１４３８～１５３８、１４３９～１５３９、１４４０～１５４０、１４４１～１５４１、１４４２～１５４２、１４４３～１５４３、１４４４～１５４４、１４４５～１５４５、１４４６～１５４６、１４４７～１５４７、１４４８～１５４８、１４４９～１５４９、１４５０～１５５０、１４５１～１５５１、１４５２～１５５２、１４５３～１５５３、１４５４～１５５４、１４５５～１５５５、１４５６～１５５６、１４５７～１５５７、１４５８～１５５８、１４５９～１５５９、１４６０～１５６０、１４６１～１５６１、１４６２～１５６２、１４６３～１５６３、１４６４～１５６４、１４６５～１５６５、１４６６～１５６６、１４６７～１５６７、１４６８～１５６８、１４６９～１５６９、１４７０～１５７０、１４７１～１５７１、１４７２～１５７２、１４７３～１５７３、１４７４～１５７４、１４７５～１５７５、１４７６～１５７６、１４７７～１５７７、１４７８～１５７８、１４７９～１５７９、１４８０～１５８０、１４８１～１５８１、１４８２～１５８２、１４８３～１５８３、１４８４～１５８４、１４８５～１５８５、１４８６～１５８６、１４８７～１５８７、１４８８～１５８８、１４８９～１５８９、１４９０～１５９０、１４９１～１５９１、１４９２～１５９２、１４９３～１５９３、１４９４～１５９４、１４９５～１５９５、１４９６～１５９６、１４９７～１５９７、１４９８～１５９８、１４９９～１５９９、１５００～１６００、１５０１～１６０１、１５０２～１６０２、１５０３～１６０３、１５０４～１６０４、１５０５～１６０５、１５０６～１６０６、１５０７～１６０７、１５０８～１６０８、１５０９～１６０９、１５１０～１６１０、１５１１～１６１１、１５１２～１６１２、１５１３～１６１３、１５１４～１６１４、１５１５～１６１５、１５１６～１６１６、１５１７～１６１７、１５１８～１６１８、１５１９～１６１９、１５２０～１６２０、１５２１～１６２１、１５２２～１６２２、１５２３～１６２３、１５２４～１６２４、１５２５～１６２５、１５２６～１６２６、１５２７～１６２７、１５２８～１６２８、１５２９～１６２９、１５３０～１６３０、１５３１～１６３１、１５３２～１６３２、１５３３～１６３３、１５３４～１６３４、１５３５～１６３５、１５３６～１６３６、１５３７～１６３７、１５３８～１６３８、１５３９～１６３９、１５４０～１６４０、１５４１～１６４１、１５４２～１６４２、１５４３～１６４３、１５４４～１６４４、１５４５～１６４５、１５４６～１６４６、１５４７～１６４７、１５４８～１６４８、１５４９～１６４９、１５５０～１６５０、１５５１～１６５１、１５５２～１６５２、１５５３～１６５３、１５５４～１６５４、１５５５～１６５５、１５５６～１６５６、１５５７～１６５７、１５５８～１６５８、１５５９～１６５９、１５６０～１６６０、１５６１～１６６１、１５６２～１６６２、１５６３～１６６３、１５６４～１６６４、１５６５～１６６５、１５６６～１６６６、１５６７～１６６７、１５６８～１６６８、１５６９～１６６９、１５７０～１６７０、１５７１～１６７１、１５７２～１６７２、１５７３～１６７３、１５７４～１６７４、１５７５～１６７５、１５７６～１６７６、１５７７～１６７７、１５７８～１６７８、１５７９～１６７９、１５８０～１６８０、１５８１～１６８１、１５８２～１６８２、１５８３～１６８３、１５８４～１６８４、１５８５～１６８５、１５８６～１６８６、１５８７～１６８７、１５８８～１６８８、１５８９～１６８９、１５９０～１６９０、１５９１～１６９１、１５９２～１６９２、１５９３～１６９３、１５９４～１６９４、１５９５～１６９５、１５９６～１６９６、１５９７～１６９７、１５９８～１６９８、１５９９～１６９９、１６００～１７００、１６０１～１７０１、１６０２～１７０２、１６０３～１７０３、１６０４～１７０４、１６０５～１７０５、１６０６～１７０６、１６０７～１７０７、１６０８～１７０８、１６０９～１７０９、１６１０～１７１０、１６１１～１７１１、１６１２～１７１２、１６１３～１７１３、１６１４～１７１４、１６１５～１７１５、１６１６～１７１６、１６１７～１７１７、１６１８～１７１８、１６１９～１７１９、１６２０～１７２０、１６２１～１７２１、１６２２～１７２２、１６２３～１７２３、１６２４～１７２４、１６２５～１７２５、１６２６～１７２６、１６２７～１７２７、１６２８～１７２８、１６２９～１７２９、１６３０～１７３０、１６３１～１７３１、１６３２～１７３２、１６３３～１７３３、１６３４～１７３４、１６３５～１７３５、１６３６～１７３６、１６３７～１７３７、１６３８～１７３８、１６３９～１７３９、１６４０～１７４０、１６４１～１７４１、１６４２～１７４２、１６４３～１７４３、１６４４～１７４４、１６４５～１７４５、１６４６～１７４６、１６４７～１７４７、１６４８～１７４８、１６４９～１７４９、１６５０～１７５０、１６５１～１７５１、１６５２～１７５２、１６５３～１７５３、１６５４～１７５４、１６５５～１７５５、１６５６～１７５６、１６５７～１７５７、１６５８～１７５８、１６５９～１７５９、１６６０～１７６０、１６６１～１７６１、１６６２～１７６２、１６６３～１７６３、１６６４～１７６４、１６６５～１７６５、１６６６～１７６６、１６６７～１７６７、１６６８～１７６８、１６６９～１７６９、１６７０～１７７０、１６７１～１７７１、１６７２～１７７２、１６７３～１７７３、１６７４～１７７４、１６７５～１７７５、１６７６～１７７６、１６７７～１７７７、１６７８～１７７８、１６７９～１７７９、１６８０～１７８０、１６８１～１７８１、１６８２～１７８２、１６８３～１７８３、１６８４～１７８４、１６８５～１７８５、１６８６～１７８６、１６８７～１７８７、１６８８～１７８８、１６８９～１７８９、１６９０～１７９０、１６９１～１７９１、１６９２～１７９２、１６９３～１７９３、１６９４～１７９４、１６９５～１７９５、１６９６～１７９６、１６９７～１７９７、１６９８～１７９８、１６９９～１７９９、１７００～１８００、１７０１～１８０１、１７０２～１８０２、１７０３～１８０３、１７０４～１８０４、１７０５～１８０５、１７０６～１８０６、１７０７～１８０７、１７０８～１８０８、１７０９～１８０９、１７１０～１８１０、１７１１～１８１１、１７１２～１８１２、１７１３～１８１３、１７１４～１８１４、１７１５～１８１５、１７１６～１８１６、１７１７～１８１７、１７１８～１８１８、１７１９～１８１９、１７２０～１８２０、１７２１～１８２１、１７２２～１８２２、１７２３～１８２３、１７２４～１８２４、１７２５～１８２５、１７２６～１８２６、１７２７～１８２７、１７２８～１８２８、１７２９～１８２９、１７３０～１８３０、１７３１～１８３１、１
７３２～１８３２、１７３３～１８３３、１７３４～１８３４、１７３５～１８３５、１７３６～１８３６、１７３７～１８３７、１７３８～１８３８、１７３９～１８３９、１７４０～１８４０、１７４１～１８４１、１７４２～１８４２、１７４３～１８４３、１７４４～１８４４、１７４５～１８４５、１７４６～１８４６、１７４７～１８４７、１７４８～１８４８、１７４９～１８４９、１７５０～１８５０、１７５１～１８５１、１７５２～１８５２、１７５３～１８５３、１７５４～１８５４、１７５５～１８５５、１７５６～１８５６、１７５７～１８５７、１７５８～１８５８、１７５９～１８５９、１７６０～１８６０、１７６１～１８６１、１７６２～１８６２、１７６３～１８６３、１７６４～１８６４、１７６５～１８６５、１７６６～１８６６、１７６７～１８６７、１７６８～１８６８、１７６９～１８６９、１７７０～１８７０、１７７１～１８７１、１７７２～１８７２、１７７３～１８７３、１７７４～１８７４、１７７５～１８７５、１７７６～１８７６、１７７７～１８７７、１７７８～１８７８、１７７９～１８７９、１７８０～１８８０、１７８１～１８８１、１７８２～１８８２、１７８３～１８８３、１７８４～１８８４、１７８５～１８８５、１７８６～１８８６、１７８７～１８８７、１７８８～１８８８、１７８９～１８８９、１７９０～１８９０、１７９１～１８９１、１７９２～１８９２、１７９３～１８９３、１７９４～１８９４、１７９５～１８９５、１７９６～１８９６、１７９７～１８９７、１７９８～１８９８、１７９９～１８９９、１８００～１９００、１８０１～１９０１、１８０２～１９０２、１８０３～１９０３、１８０４～１９０４、１８０５～１９０５、１８０６～１９０６、１８０７～１９０７、１８０８～１９０８、１８０９～１９０９、１８１０～１９１０、１８１１～１９１１、１８１２～１９１２、１８１３～１９１３、１８１４～１９１４、１８１５～１９１５、１８１６～１９１６、１８１７～１９１７、１８１８～１９１８、１８１９～１９１９、１８２０～１９２０、１８２１～１９２１、１８２２～１９２２、１８２３～１９２３、１８２４～１９２４、１８２５～１９２５、１８２６～１９２６、１８２７～１９２７、１８２８～１９２８、１８２９～１９２９、１８３０～１９３０、１８３１～１９３１、１８３２～１９３２、１８３３～１９３３、１８３４～１９３４、１８３５～１９３５、１８３６～１９３６、１８３７～１９３７、１８３８～１９３８、１８３９～１９３９、１８４０～１９４０、１８４１～１９４１、１８４２～１９４２、１８４３～１９４３、１８４４～１９４４、１８４５～１９４５、１８４６～１９４６、１８４７～１９４７、１８４８～１９４８、１８４９～１９４９、１８５０～１９５０、１８５１～１９５１、１８５２～１９５２、１８５３～１９５３、１８５４～１９５４、１８５５～１９５５、１８５６～１９５６、１８５７～１９５７、１８５８～１９５８、１８５９～１９５９、１８６０～１９６０、１８６１～１９６１、１８６２～１９６２、１８６３～１９６３、１８６４～１９６４、１８６５～１９６５、１８６６～１９６６、１８６７～１９６７、１８６８～１９６８、１８６９～１９６９、１８７０～１９７０、１８７１～１９７１、１８７２～１９７２、１８７３～１９７３、１８７４～１９７４、１８７５～１９７５、１８７６～１９７６、１８７７～１９７７、１８７８～１９７８、１８７９～１９７９、１８８０～１９８０、１８８１～１９８１、１８８２～１９８２、１８８３～１９８３、１８８４～１９８４、１８８５～１９８５、１８８６～１９８６、１８８７～１９８７、１８８８～１９８８、１８８９～１９８９、１８９０～１９９０、１８９１～１９９１、１８９２～１９９２、１８９３～１９９３、１８９４～１９９４、１８９５～１９９５、１８９６～１９９６、１８９７～１９９７、１８９８～１９９８、１８９９～１９９９、１９００～２０００、１９０１～２００１、１９０２～２００２、１９０３～２００３、１９０４～２００４、１９０５～２００５、１９０６～２００６、１９０７～２００７、１９０８～２００８、１９０９～２００９、１９１０～２０１０、１９１１～２０１１、１９１２～２０１２、１９１３～２０１３、１９１４～２０１４、１９１５～２０１５、１９１６～２０１６、１９１７～２０１７、１９１８～２０１８、１９１９～２０１９、１９２０～２０２０、１９２１～２０２１、１９２２～２０２２、１９２３～２０２３、１９２４～２０２４、１９２５～２０２５、１９２６～２０２６、１９２７～２０２７、１９２８～２０２８、１９２９～２０２９、１９３０～２０３０、１９３１～２０３１、１９３２～２０３２、１９３３～２０３３、１９３４～２０３４、１９３５～２０３５、１９３６～２０３６、１９３７～２０３７、１９３８～２０３８、１９３９～２０３９、１９４０～２０４０、１９４１～２０４１、１９４２～２０４２、１９４３～２０４３、１９４４～２０４４、１９４５～２０４５、１９４６～２０４６、１９４７～２０４７、１９４８～２０４８、１９４９～２０４９、１９５０～２０５０、１９５１～２０５１、１９５２～２０５２、１９５３～２０５３、１９５４～２０５４、１９５５～２０５５、１９５６～２０５６、１９５７～２０５７、１９５８～２０５８、１９５９～２０５９、１９６０～２０６０、１９６１～２０６１、１９６２～２０６２、１９６３～２０６３、１９６４～２０６４、１９６５～２０６５、１９６６～２０６６、１９６７～２０６７、１９６８～２０６８、１９６９～２０６９、１９７０～２０７０、１９７１～２０７１、１９７２～２０７２、１９７３～２０７３、１９７４～２０７４、１９７５～２０７５、１９７６～２０７６、１９７７～２０７７、１９７８～２０７８、１９７９～２０７９、１９８０～２０８０、１９８１～２０８１、１９８２～２０８２、１９８３～２０８３、１９８４～２０８４、１９８５～２０８５、１９８６～２０８６、１９８７～２０８７、１９８８～２０８８、１９８９～２０８９、１９９０～２０９０、１９９１～２０９１、１９９２～２０９２、１９９３～２０９３、１９９４～２０９４、１９９５～２０９５、１９９６～２０９６、１９９７～２０９７、１９９８～２０９８、１９９９～２０９９、２０００～２１００、２００１～２１０１、２００２～２１０２、２００３～２１０３、２００４～２１０４、２００５～２１０５、２００６～２１０６、２００７～２１０７、２００８～２１０８、２００９～２１０９、２０１０～２１１０、２０１１～２１１１、２０１２～２１１２、２０１３～２１１３、２０１４～２１１４、２０１５～２１１５、２０１６～２１１６、２０１７～２１１７、２０１８～２１１８、２０１９～２１１９、２０２０～２１２０、２０２１～２１２１、２０２２～２１２２、２０２３～２１２３、２０２４～２１２４、２０２５～２１２５、２０２６～２１２６、２０２７～２１２７、２０２８～２１２８、２０２９～２１２９、２０３０～２１３０、２０３１～２１３１、２０３２～２１３２、２０３３～２１３３、２０３４～２１３４、２０３５～２１３５、２０３６～２１３６、２０３７～２１３７、２０３８～２１３８、２０３９～２１３９、２０４０～２１４０、２０４１～２１４１、２０４２～２１４２、２０４３～２１４３、２０４４～２１４４、２０４５～２１４５、２０４６～２１４６、２０４７～２１４７、２０４８～２１４８、２０４９～２１４９、２０５０～２１５０、２０５１～２１５１、２０５２～２１５２、２０５３～２１５３、２０５４～２１５４、２０５５～２１５５、２０５６～２１５６、２０５７～２１５７、２０５８～２１５８、２０５９～２１５９、２０６０～２１６０、２０６１～２１６１、２０６２～２１６２、２０６３～２１６３、２０６４～２１６４、２０６５～２１６５、２０６６～２１６６、２０６７～２１６７、２０６８～２１６８、２０６９～２１６９、２０７０～２１７０、２０７１～２１７１、２０７２～２１７２、２０７３～２１７３、２０７４～２１７４、２０７５～２１７５、２０７６～２１７６、２０７７～２１７７、２０７８～２１７８、２０７９～２１７９、２０８０～２１８０、２０８１～２１８１、２０８２～２１８２、２０８３～２１８３、２０８４～２１８４、２０８５～２１８５、２０８６～２１８６、２０８７～２１８７、２０８８～２１８８、２０８９～２１８９、２０９０～２１９０、２０９１～２１９１、２０９２～２１９２、２０９３～２１９３、２０９４～２１９４、２０９５～２１９５、２０９６～２１９６、２０９７～２１９７、２０９８～２１９８、２０９９～２１９９、２１００～２２００、２１０１～２２０１、２１０２～２２０２、２１０３～２２０３、２１０４～２２０４、２１０５～２２０５、２１０６～２２０６、２１０７～２２０７、２１０８～２２０８、２１０９～２２０９、２１１０～２２１０、２１１１～２２１１、２１１２～２２１２、２１１３～２２１３、２１１４～２２１４、２１１５～２２１５、２１１６～２２１６、２１１７～２２１７、２１１８～２２１８、２１１９～２２１９、２１２０～２２２０、２１２１～２２２１、２１２２～２２２２、２１２３～２２２３、２１２４～２２２４、２１２５～２２２５、２１２６～２２２６、２１２７～２２２７、２１２８～２２２８、２１２９～２２２９、２１３０～２２３０、２１３１～２２３１、２１３２～２２３２、２１３３～２２３３、２１３４～２２３４、または２１３５～２２３５と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号８もしくは配列番号８に相補的な配列の塩基１～１００、２～１０１、３～１０２、４～１０３、５～１０４、６～１０５、７～１０６、８～１０７、９～１０８、１０～１０９、１１～１１０、１２～１１１、１３～１１２、１４～１１３、１５～１１４、１６～１１５、１７～１１６、１８～１１７、１９～１１８、２０～１１９、２１～１２０、２２～１２１、２３～１２２、２４～１２３、２５～１２４、２６～１２５、２７～１２６、２８～１２７、２９～１２８、３０～１２９、３１～１３０、３２～１３１、３３～１３２、３４～１３３、３５～１３４、３６～１３５、３７～１３６、３８～１３７、３９～１３８、４０～１３９、４１～１４０、４２～１４１、４３～１４２、４４～１４３、４５～１４４、４６～１４５、４７～１４６、４８～１４７、４９～１４８、５０～１４９、５１～１５０、５２～１５１、５３～１５２、５４～１５３、５５～１５４、５６～１５５、５７～１５６、５８～１５７、５９～１５８、６０～１５９、６１～１６０、６２～１６１、６３～１６２、６４～１６３、６５～１６４、６６～１６５、６７～１６６、６８～１６７、６９～１６８、７０～１６９、７１～１７０、７２～１７１、７３～１７２、７４～１７３、７５～１７４、７６～１７５、７７～１７６、７８～１７７、７９～１７８、８０～１７９、８１～１８０、８２～１８１、８３～１８２、８４～１８３、８５～１８４、８６～１８５、８７～１８６、８８～１８７、８９～１８８、９０～１８９、９１～１９０、９２～１９１、９３～１９２、９４～１９３、９５～１９４、９６～１９５、９７～１９６、９８～１９７、９９～１９８、１００～１９９、１０１～２００、１０２～２０１、１０３～２０２、１０４～２０３、１０５～２０４、１０６～２０５、１０７～２０６、１０８～２０７、１０９～２０８、１１０～２０９、１１１～２１０、１１２～２１１、１１３～２１２、１１４～２１３、１１５～２１４、１１６～２１５、１１７～２１６、１１８～２１７、１１９～２１８、１２０～２１９、１２１～２２０、１２２～２２１、１２３～２２２、１２４～２２３、１２５～２２４、１２６～２２５、１２７～２２６、１２８～２２７、１２９～２２８、１３０～２２９、１３１～２３０、１３２～２３１、１３３～２３２、１３４～２３３、１３５～２３４、１３６～２３５、１３７～２３６、１３８～２３７、１３９～２３８、１４０～２３９、１４１～２４０、１４２～２４１、１４３～２４２、１４４～２４３、１４５～２４４、１４６～２４５、１４７～２４６、１４８～２４７、１４９～２４８、１５０～２４９、１５１～２５０、１５２～２５１、１５３～２５２、１５４～２５３、１５５～２５４、１５６～２５５、１５７～２５６、１５８～２５７、１５９～２５８、１６０～２５９、１６１～２６０、１６２～２６１、１６３～２６２、１６４～２６３、１６５～２６４、１６６～２６５、１６７～２６６、１６８～２６７、１６９～２６８、１７０～２６９、１７１～２７０、１７２～２７１、１７３～２７２、１７４～２７３、１７５～２７４、１７６～２７５、１７７～２７６、１７８～２７７、１７９～２７８、１８０～２７９、１８１～２８０、１８２～２８１、１８３～２８２、１８４～２８３、１８５～２８４、１８６～２８５、１８７～２８６、１８８～２８７、１８９～２８８、１９０～２８９、１９１～２９０、１９２～２９１、１９３～２９２、１９４～２９３、１９５～２９４、１９６～２９５、１９７～２９６、１９８～２９７、１９９～２９８、２００～２９９、２０１～３００、２０２～３０１、２０３～３０２、２０４～３０３、２０５～３０４、２０６～３０５、２０７～３０６、２０８～３０７、２０９～３０８、２１０～３０９、２１１～３１０、２１２～３１１、２１３～３１２、２１４～３１３、２１５～３１４、２１６～３１５、２１７～３１６、２１８～３１７、２１９～３１８、２２０～３１９、２２１～３２０、２２２～３２１、２２３～３２２、２２４～３２３、２２５～３２４、２２６～３２５、２２７～３２６、２２８～３２７、２２９～３２８、２３０～３２９、２３１～３３０、２３２～３３１、２３３～３３２、２３４～３３３、２３５～３３４、２３６～３３５、２３７～３３６、２３８～３３７、２３９～３３８、２４０～３３９、２４１～３４０、２４２～３４１、２４３～３４２、２４４～３４３、２４５～３４４、２４６～３４５、２４７～３４６、２４８～３４７、２４９～３４８、２５０～３４９、２５１～３５０、２５２～３５１、２５３～３５２、２５４～３５３、２５５～３５４、２５６～３５５、２５７～３５６、２５８～３５７、２５９～３５８、２６０～３５９、２６１～３６０、２６２～３６１、２６３～３６２、２６４～３６３、２６５～３６４、２６６～３６５、２６７～３６６、２６８～３６７、２６９～３６８、２７０～３６９、２７１～３７０、２７２～３７１、２７３～３７２、２７４～３７３、２７５～３７４、２７６～３７５、２７７～３７６、２７８～３７７、２７９～３７８、２８０～３７９、２８１～３８０、２８２～３８１、２８３～３８２、２８４～３８３、２８５～３８４、２８６～３８５、２８７～３８６、２８８～３８７、２８９～３８８、２９０～３８９、２９１～３９０、２９２～３９１、２９３～３９２、２９４～３９３、２９５～３９４、２９６～３９５、２９７～３９６、２９８～３９７、２９９～３９８、３００～３９９、３０１～４００、３０２～４０１、３０３～４０２、３０４～４０３、３０５～４０４、３０６～４０５、３０７～４０６、３０８～４０７、３０９～４０８、３１０～４０９、３１１～４１０、３１２～４１１、３１３～４１２、３１４～４１３、３１５～４１４、３１６～４１５、３１７～４１６、３１８～４１７、３１９～４１８、３２０～４１９、３２１～４２０、３２２～４２１、３２３～４２２、３２４～４２３、３２５～４２４、３２６～４２５、３２７～４２６、３２８～４２７、３２９～４２８、３３０～４２９、３３１～４３０、３３２～４３１、３３３～４３２、３３４～４３３、３３５～４３４、３３６～４３５、３３７～４３６、３３８～４３７、３３９～４３８、３４０～４３９、３４１～４４０、３４２～４４１、３４３～４４２、３４４～４４３、３４５～４４４、３４６～４４５、３４７～４４６、３４８～４４７、３４９～４４８、３５０～４４９、３５１～４５０、３５２～４５１、３５３～４５２、３５４～４５３、３５５～４５４、３５６～４５５、３５７～４５６、３５８～４５７、３５９～４５８、３６０～４５９、３６１～４６０、３６２～４６１、３６３～４６２、３６４～４６３、３６５～４６４、３６６～４６５、３６７～４６６、３６８～４６７、３６９～４６８、３７０～４６９、３７１～４７０、３７２～４７１、３７３～４７２、３７４～４７３、３７５～４７４、３７６～４７５、３７７～４７６、３７８～４７７、３７９～４７８、３８０～４７９、３８１～４８０、３８２～４８１、３８３～４８２、３８４～４８３、３８５～４８４、３８６～４８５、３８７～４８６、３８８～４８７、３８９～４８８、３９０～４８９、３９１～４９０、３９２～４９１、３９３～４９２、３９４～４９３、３９５～４９４、３９６～４９５、３９７～４９６、３９８～４９７、３９９～４９８、４００～４９９、４０１～５００、４０２～５０１、４０３～５０２、４０４～５０３、４０５～５０４、４０６～５０５、４０７～５０６、４０８～５０７、４０９～５０８、４１０～５０９、４１１～５１０、４１２～５１１、４１３～５１２、４１４～５１３、４１５～５１４、４１６～５１５、４１７～５１６、４１８～５１７、４１９～５１８、４２０～５１９、４２１～５２０、４２２～５２１、４２３～５２２、４２４～５２３、４２５～５２４、４２６～５２５、４２７～５２６、４２８～５２７、４２９～５２８、４３０～５２９、４３１～５３０、４３２～５３１、４３３～５３２、４３４～５３３、４３５～５３４、４３６～５３５、４３７～５３６、４３８～５３７、４３９～５３８、４４０～５３９、４４１～５４０、４４２～５４１、４４３～５４２、４４４～５４３、４４５～５４４、４４６～５４５、４４７～５４６、４４８～５４７、４４９～５４８、４５０～５４９、４５１～５５０、４５２～５５１、４５３～５５２、４５４～５５３、４５５～５５４、４５６～５５５、４５７～５５６、４５８～５５７、４５９～５５８、４６０～５５９、４６１～５６０、４６２～５６１、４６３～５６２、４６４～５６３、４６５～５６４、４６６～５６５、４６７～５６６、４６８～５６７、４６９～５６８、４７０～５６９、４７１～５７０、４７２～５７１、４７３～５７２、４７４～５７３、４７５～５７４、４７６～５７５、４７７～５７６、４７８～５７７、４７９～５７８、４８０～５７９、４８１～５８０、４８２～５８１、４８３～５８２、４８４～５８３、４８５～５８４、４８６～５８５、４８７～５８６、４８８～５８７、４８９～５８８、４９０～５８９、４９１～５９０、４９２～５９１、４９３～５９２、４９４～５９３、４９５～５９４、４９６～５９５、４９７～５９６、４９８～５９７、４９９～５９８、５００～５９９、５０１～６００、５０２～６０１、５０３～６０２、５０４～６０３、５０５～６０４、５０６～６０５、５０７～６０６、５０８～６０７、５０９～６０８、５１０～６０９、５１１～６１０、５１２～６１１、５１３～６１２、５１４～６１３、５１５～６１４、５１６～６１５、５１７～６１６、５１８～６１７、５１９～６１８、５２０～６１９、５２１～６２０、５２２～６２１、５２３～６２２、５２４～６２３、５２５～６２４、５２６～６２５、５２７～６２６、５２８～６２７、５２９～６２８、５３０～６２９、５３１～６３０、５３２～６３１、５３３～６３２、５３４～６３３、５３５～６３４、５３６～６３５、５３７～６３６、５３８～６３７、５３９～６３８、５４０～６３９、５４１～６４０、５４２～６４１、５４３～６４２、５４４～６４３、５４５～６４４、５４６～６４５、５４７～６４６、５４８～６４７、５４９～６４８、５５０～６４９、５５１～６５０、５５２～６５１、５５３～６５２、５５４～６５３、５５５～６５４、５５６～６５５、５５７～６５６、５５８～６５７、５５９～６５８、５６０～６５９、５６１～６６０、５６２～６６１、５６３～６６２、５６４～６６３、５６５～６６４、５６６～６６５、５６７～６６６、５６８～６６７、５６９～６６８、５７０～６６９、５７１～６７０、５７２～６７１、５７３～６７２、５７４～６７３、５７５～６７４、５７６～６７５、５７７～６７６、５７８～６７７、５７９～６７８、５８０～６７９、５８１～６８０、５８２～６８１、５８３～６８２、５８４～６８３、５８５～６８４、５８６～６８５、５８７～６８６、５８８～６８７、５８９～６８８、５９０～６８９、５９１～６９０、５９２～６９１、５９３～６９２、５９４～６９３、５９５～６９４、５９６～６９５、５９７～６９６、５９８～６９７、５９９～６９８、６００～６９９、６０１～７００、６０２～７０１、６０３～７０２、６０４～７０３、６０５～７０４、６０６～７０５、６０７～７０６、６０８～７０７、６０９～７０８、６１０～７０９、６１１～７１０、６１２～７１１、６１３～７１２、６１４～７１３、６１５～７１４、６１６～７１５、６１７～７１６、６１８～７１７、６１９～７１８、６２０～７１９、６２１～７２０、６２２～７２１、６２３～７２２、６２４～７２３、６２５～７２４、６２６～７２５、６２７～７２６、６２８～７２７、６２９～７２８、６３０～７２９、６３１～７３０、６３２～７３１、６３３～７３２、６３４～７３３、６３５～７３４、６３６～７３５、６３７～７３６、６３８～７３７、６３９～７３８、６４０～７３９、６４１～７４０、６４２～７４１、６４３～７４２、６４４～７４３、６４５～７４４、６４６～７４５、６４７～７４６、６４８～
７４７、６４９～７４８、６５０～７４９、６５１～７５０、６５２～７５１、６５３～７５２、６５４～７５３、６５５～７５４、６５６～７５５、６５７～７５６、６５８～７５７、６５９～７５８、６６０～７５９、６６１～７６０、６６２～７６１、６６３～７６２、６６４～７６３、６６５～７６４、６６６～７６５、６６７～７６６、６６８～７６７、６６９～７６８、６７０～７６９、６７１～７７０、６７２～７７１、６７３～７７２、６７４～７７３、６７５～７７４、６７６～７７５、６７７～７７６、６７８～７７７、６７９～７７８、６８０～７７９、６８１～７８０、６８２～７８１、６８３～７８２、６８４～７８３、６８５～７８４、６８６～７８５、６８７～７８６、６８８～７８７、６８９～７８８、６９０～７８９、６９１～７９０、６９２～７９１、６９３～７９２、６９４～７９３、６９５～７９４、６９６～７９５、６９７～７９６、６９８～７９７、６９９～７９８、７００～７９９、７０１～８００、７０２～８０１、７０３～８０２、７０４～８０３、７０５～８０４、７０６～８０５、７０７～８０６、７０８～８０７、７０９～８０８、７１０～８０９、７１１～８１０、７１２～８１１、７１３～８１２、７１４～８１３、７１５～８１４、７１６～８１５、７１７～８１６、７１８～８１７、７１９～８１８、７２０～８１９、７２１～８２０、７２２～８２１、７２３～８２２、７２４～８２３、７２５～８２４、７２６～８２５、７２７～８２６、７２８～８２７、７２９～８２８、７３０～８２９、７３１～８３０、７３２～８３１、７３３～８３２、７３４～８３３、７３５～８３４、７３６～８３５、７３７～８３６、７３８～８３７、７３９～８３８、７４０～８３９、７４１～８４０、７４２～８４１、７４３～８４２、７４４～８４３、７４５～８４４、７４６～８４５、７４７～８４６、７４８～８４７、７４９～８４８、７５０～８４９、７５１～８５０、７５２～８５１、７５３～８５２、７５４～８５３、７５５～８５４、７５６～８５５、７５７～８５６、７５８～８５７、７５９～８５８、７６０～８５９、７６１～８６０、７６２～８６１、７６３～８６２、７６４～８６３、７６５～８６４、７６６～８６５、７６７～８６６、７６８～８６７、７６９～８６８、７７０～８６９、７７１～８７０、７７２～８７１、７７３～８７２、７７４～８７３、７７５～８７４、７７６～８７５、７７７～８７６、７７８～８７７、７７９～８７８、７８０～８７９、７８１～８８０、７８２～８８１、７８３～８８２、７８４～８８３、７８５～８８４、７８６～８８５、７８７～８８６、７８８～８８７、７８９～８８８、７９０～８８９、７９１～８９０、７９２～８９１、７９３～８９２、７９４～８９３、７９５～８９４、７９６～８９５、７９７～８９６、７９８～８９７、７９９～８９８、８００～８９９、８０１～９００、８０２～９０１、８０３～９０２、８０４～９０３、８０５～９０４、８０６～９０５、８０７～９０６、８０８～９０７、８０９～９０８、８１０～９０９、８１１～９１０、８１２～９１１、８１３～９１２、８１４～９１３、８１５～９１４、８１６～９１５、８１７～９１６、８１８～９１７、８１９～９１８、８２０～９１９、８２１～９２０、８２２～９２１、８２３～９２２、８２４～９２３、８２５～９２４、８２６～９２５、８２７～９２６、８２８～９２７、８２９～９２８、８３０～９２９、８３１～９３０、８３２～９３１、８３３～９３２、８３４～９３３、８３５～９３４、８３６～９３５、８３７～９３６、８３８～９３７、８３９～９３８、８４０～９３９、８４１～９４０、８４２～９４１、８４３～９４２、８４４～９４３、８４５～９４４、８４６～９４５、８４７～９４６、８４８～９４７、８４９～９４８、８５０～９４９、８５１～９５０、８５２～９５１、８５３～９５２、８５４～９５３、８５５～９５４、８５６～９５５、８５７～９５６、８５８～９５７、８５９～９５８、８６０～９５９、８６１～９６０、８６２～９６１、８６３～９６２、８６４～９６３、８６５～９６４、８６６～９６５、８６７～９６６、８６８～９６７、８６９～９６８、８７０～９６９、８７１～９７０、８７２～９７１、８７３～９７２、８７４～９７３、８７５～９７４、８７６～９７５、８７７～９７６、８７８～９７７、８７９～９７８、８８０～９７９、８８１～９８０、８８２～９８１、８８３～９８２、８８４～９８３、８８５～９８４、８８６～９８５、８８７～９８６、８８８～９８７、８８９～９８８、８９０～９８９、８９１～９９０、８９２～９９１、８９３～９９２、８９４～９９３、８９５～９９４、８９６～９９５、８９７～９９６、８９８～９９７、８９９～９９８、９００～９９９、９０１～１０００、９０２～１００１、９０３～１００２、９０４～１００３、９０５～１００４、９０６～１００５、９０７～１００６、９０８～１００７、９０９～１００８、９１０～１００９、９１１～１０１０、９１２～１０１１、９１３～１０１２、９１４～１０１３、９１５～１０１４、９１６～１０１５、９１７～１０１６、９１８～１０１７、９１９～１０１８、９２０～１０１９、９２１～１０２０、９２２～１０２１、９２３～１０２２、９２４～１０２３、９２５～１０２４、９２６～１０２５、９２７～１０２６、９２８～１０２７、９２９～１０２８、９３０～１０２９、９３１～１０３０、９３２～１０３１、９３３～１０３２、９３４～１０３３、９３５～１０３４、９３６～１０３５、９３７～１０３６、９３８～１０３７、９３９～１０３８、９４０～１０３９、９４１～１０４０、９４２～１０４１、９４３～１０４２、９４４～１０４３、９４５～１０４４、９４６～１０４５、９４７～１０４６、９４８～１０４７、９４９～１０４８、９５０～１０４９、９５１～１０５０、９５２～１０５１、９５３～１０５２、９５４～１０５３、９５５～１０５４、９５６～１０５５、９５７～１０５６、９５８～１０５７、９５９～１０５８、９６０～１０５９、９６１～１０６０、９６２～１０６１、９６３～１０６２、９６４～１０６３、９６５～１０６４、９６６～１０６５、９６７～１０６６、９６８～１０６７、９６９～１０６８、９７０～１０６９、９７１～１０７０、９７２～１０７１、９７３～１０７２、９７４～１０７３、９７５～１０７４、９７６～１０７５、９７７～１０７６、９７８～１０７７、９７９～１０７８、９８０～１０７９、９８１～１０８０、９８２～１０８１、９８３～１０８２、９８４～１０８３、９８５～１０８４、９８６～１０８５、９８７～１０８６、９８８～１０８７、９８９～１０８８、９９０～１０８９、９９１～１０９０、９９２～１０９１、９９３～１０９２、９９４～１０９３、９９５～１０９４、９９６～１０９５、９９７～１０９６、９９８～１０９７、９９９～１０９８、１０００～１０９９、１０００～１１００、１００１～１１０１、１００２～１１０２、１００３～１１０３、１００４～１１０４、１００５～１１０５、１００６～１１０６、１００７～１１０７、１００８～１１０８、１００９～１１０９、１０１０～１１１０、１０１１～１１１１、１０１２～１１１２、１０１３～１１１３、１０１４～１１１４、１０１５～１１１５、１０１６～１１１６、１０１７～１１１７、１０１８～１１１８、１０１９～１１１９、１０２０～１１２０、１０２１～１１２１、１０２２～１１２２、１０２３～１１２３、１０２４～１１２４、１０２５～１１２５、１０２６～１１２６、１０２７～１１２７、１０２８～１１２８、１０２９～１１２９、１０３０～１１３０、１０３１～１１３１、１０３２～１１３２、１０３３～１１３３、１０３４～１１３４、１０３５～１１３５、１０３６～１１３６、１０３７～１１３７、１０３８～１１３８、１０３９～１１３９、１０４０～１１４０、１０４１～１１４１、１０４２～１１４２、１０４３～１１４、１０４４～１１４４、１０４５～１１４５、１０４６～１１４６、１０４７～１１４７、１０４８～１１４８、１０４９～１１４９、１０５０～１１５０、１０５１～１１５１、１０５２～１１５２、１０５３～１１５３、１０５４～１１５４、１０５５～１１５５、１０５６～１１５６、１０５７～１１５７、１０５８～１１５８、１０５９～１１５９、１０６０～１１６０、１０６１～１１６１、１０６２～１１６２、１０６３～１１６３、１０６４～１１６４、１０６５～１１６５、１０６６～１１６６、１０６７～１１６７、１０６８～１１６８、１０６９～１１６９、１０７０～１１７０、１０７１～１１７１、１０７２～１１７２、１０７３～１１７３、１０７４～１１７４、１０７５～１１７５、１０７６～１１７６、１０７７～１１７７、１０７８～１１７８、１０７９～１１７９、１０８０～１１８０、１０８１～１１８１、１０８２～１１８２、１０８３～１１８３、１０８４～１１８４、１０８５～１１８５、１０８６～１１８６、１０８７～１１８７、１０８８～１１８８、１０８９～１１８９、１０９０～１１９０、１０９１～１１９１、１０９２～１１９２、１０９３～１１９３、１０９４～１１９４、１０９５～１１９５、１０９６～１１９６、１０９７～１１９７、１０９８～１１９８、１０９９～１１９９、１１００～１２００、１１０１～１２０１、１１０２～１２０２、１１０３～１２０３、１１０４～１２０４、１１０５～１２０５、１１０６～１２０６、１１０７～１２０７、１１０８～１２０８、１１０９～１２０９、１１１０～１２１０、１１１１～１２１１、１１１２～１２１２、１１１３～１２１３、１１１４～１２１４、１１１５～１２１５、１１１６～１２１６、１１１７～１２１７、１１１８～１２１８、１１１９～１２１９、１１２０～１２２０、１１２１～１２２１、１１２２～１２２２、１１２３～１２２３、１１２４～１２２４、１１２５～１２２５、１１２６～１２２６、１１２７～１２２７、１１２８～１２２８、１１２９～１２２９、１１３０～１２３０、１１３１～１２３１、１１３２～１２３２、１１３３～１２３３、１１３４～１２３４、１１３５～１２３５、１１３６～１２３６、１１３７～１２３７、１１３８～１２３８、１１３９～１２３９、１１４０～１２４０、１１４１～１２４１、１１４２～１２４２、１１４３～１２４３、１１４４～１２４４、１１４５～１２４５、１１４６～１２４６、１１４７～１２４７、１１４８～１２４８、１１４９～１２４９、１１５０～１２５０、１１５１～１２５１、１１５２～１２５２、１１５３～１２５３、１１５４～１２５４、１１５５～１２５５、１１５６～１２５６、１１５７～１２５７、１１５８～１２５８、１１５９～１２５９、１１６０～１２６０、１１６１～１２６１、１１６２～１２６２、１１６３～１２６３、１１６４～１２６４、１１６５～１２６５、１１６６～１２６６、１１６７～１２６７、１１６８～１２６８、１１６９～１２６９、１１７０～１２７０、１１７１～１２７１、１１７２～１２７２、１１７３～１２７３、１１７４～１２７４、１１７５～１２７５、１１７６～１２７６、１１７７～１２７７、１１７８～１２７８、１１７９～１２７９、１１８０～１２８０、１１８１～１２８１、１１８２～１２８２、１１８３～１２８３、１１８４～１２８４、１１８５～１２８５、１１８６～１２８６、１１８７～１２８７、１１８８～１２８８、１１８９～１２８９、１１９０～１２９０、１１９１～１２９１、１１９２～１２９２、１１９３～１２９３、１１９４～１２９４、１１９５～１２９５、１１９６～１２９６、１１９７～１２９７、１１９８～１２９８、１１９９～１２９９、１２００～１３００、１２０１～１３０１、１２０２～１３０２、１２０３～１３０３、１２０４～１３０４、１２０５～１３０５、１２０６～１３０６、１２０７～１３０７、１２０８～１３０８、１２０９～１３０９、１２１０～１３１０、１２１１～１３１１、１２１２～１３１２、１２１３～１３１３、１２１４～１３１４、１２１５～１３１５、１２１６～１３１６、１２１７～１３１７、１２１８～１３１８、１２１９～１３１９、１
２２０～１３２０、１２２１～１３２１、１２２２～１３２２、１２２３～１３２３、１２２４～１３２４、１２２５～１３２５、１２２６～１３２６、１２２７～１３２７、１２２８～１３２８、１２２９～１３２９、１２３０～１３３０、１２３１～１３３１、１２３２～１３３２、１２３３～１３３３、１２３４～１３３４、１２３５～１３３５、１２３６～１３３６、１２３７～１３３７、１２３８～１３３８、１２３９～１３３９、１２４０～１３４０、１２４１～１３４１、１２４２～１３４２、１２４３～１３４３、１２４４～１３４４、１２４５～１３４５、１２４６～１３４６、１２４７～１３４７、１２４８～１３４８、１２４９～１３４９、１２５０～１３５０、１２５１～１３５１、１２５２～１３５２、１２５３～１３５３、１２５４～１３５４、１２５５～１３５５、１２５６～１３５６、１２５７～１３５７、１２５８～１３５８、１２５９～１３５９、１２６０～１３６０、１２６１～１３６１、１２６２～１３６２、１２６３～１３６３、１２６４～１３６４、１２６５～１３６５、１２６６～１３６６、１２６７～１３６７、１２６８～１３６８、１２６９～１３６９、１２７０～１３７０、１２７１～１３７１、１２７２～１３７２、１２７３～１３７３、１２７４～１３７４、１２７５～１３７５、１２７６～１３７６、１２７７～１３７７、１２７８～１３７８、１２７９～１３７９、１２８０～１３８０、１２８１～１３８１、１２８２～１３８２、１２８３～１３８３、１２８４～１３８４、１２８５～１３８５、１２８６～１３８６、１２８７～１３８７、１２８８～１３８８、１２８９～１３８９、１２９０～１３９０、１２９１～１３９１、１２９２～１３９２、１２９３～１３９３、１２９４～１３９４、１２９５～１３９５、１２９６～１３９６、１２９７～１３９７、１２９８～１３９８、１２９９～１３９９、１３００～１４００、１３０１～１４０１、１３０２～１４０２、１３０３～１４０３、１３０４～１４０４、１３０５～１４０５、１３０６～１４０６、１３０７～１４０７、１３０８～１４０８、１３０９～１４０９、１３１０～１４１０、１３１１～１４１１、１３１２～１４１２、１３１３～１４１３、１３１４～１４１４、１３１５～１４１５、１３１６～１４１６、１３１７～１４１７、１３１８～１４１８、１３１９～１４１９、１３２０～１４２０、１３２１～１４２１、１３２２～１４２２、１３２３～１４２３、１３２４～１４２４、１３２５～１４２５、１３２６～１４２６、１３２７～１４２７、１３２８～１４２８、１３２９～１４２９、１３３０～１４３０、１３３１～１４３１、１３３２～１４３２、１３３３～１４３３、１３３４～１４３４、１３３５～１４３５、１３３６～１４３６、１３３７～１４３７、１３３８～１４３８、１３３９～１４３９、１３４０～１４４０、１３４１～１４４１、１３４２～１４４２、１３４３～１４４３、１３４４～１４４４、１３４５～１４４５、１３４６～１４４６、１３４７～１４４７、１３４８～１４４８、１３４９～１４４９、１３５０～１４５０、１３５１～１４５１、１３５２～１４５２、１３５３～１４５３、１３５４～１４５４、１３５５～１４５５、１３５６～１４５６、１３５７～１４５７、１３５８～１４５８、１３５９～１４５９、１３６０～１４６０、１３６１～１４６１、１３６２～１４６２、１３６３～１４６３、１３６４～１４６４、１３６５～１４６５、１３６６～１４６６、１３６７～１４６７、１３６８～１４６８、１３６９～１４６９、１３７０～１４７０、１３７１～１４７１、１３７２～１４７２、１３７３～１４７３、１３７４～１４７４、１３７５～１４７５、１３７６～１４７６、１３７７～１４７７、１３７８～１４７８、１３７９～１４７９、１３８０～１４８０、１３８１～１４８１、１３８２～１４８２、１３８３～１４８３、１３８４～１４８４、１３８５～１４８５、１３８６～１４８６、１３８７～１４８７、１３８８～１４８８、１３８９～１４８９、１３９０～１４９０、１３９１～１４９１、１３９２～１４９２、１３９３～１４９３、１３９４～１４９４、１３９５～１４９５、１３９６～１４９６、１３９７～１４９７、１３９８～１４９８、１３９９～１４９９、１４００～１５００、１４０１～１５０１、１４０２～１５０２、１４０３～１５０３、１４０４～１５０４、１４０５～１５０５、１４０６～１５０６、１４０７～１５０７、１４０８～１５０８、１４０９～１５０９、１４１０～１５１０、１４１１～１５１１、１４１２～１５１２、１４１３～１５１３、１４１４～１５１４、１４１５～１５１５、１４１６～１５１６、１４１７～１５１７、１４１８～１５１８、１４１９～１５１９、１４２０～１５２０、１４２１～１５２１、１４２２～１５２２、１４２３～１５２３、１４２４～１５２４、１４２５～１５２５、１４２６～１５２６、１４２７～１５２７、１４２８～１５２８、１４２９～１５２９、１４３０～１５３０、１４３１～１５３１、１４３２～１５３２、１４３３～１５３３、１４３４～１５３４、１４３５～１５３５、１４３６～１５３６、１４３７～１５３７、１４３８～１５３８、１４３９～１５３９、１４４０～１５４０、１４４１～１５４１、１４４２～１５４２、１４４３～１５４３、１４４４～１５４４、１４４５～１５４５、１４４６～１５４６、１４４７～１５４７、１４４８～１５４８、１４４９～１５４９、１４５０～１５５０、１４５１～１５５１、１４５２～１５５２、１４５３～１５５３、１４５４～１５５４、１４５５～１５５５、１４５６～１５５６、１４５７～１５５７、１４５８～１５５８、１４５９～１５５９、１４６０～１５６０、１４６１～１５６１、１４６２～１５６２、１４６３～１５６３、１４６４～１５６４、１４６５～１５６５、１４６６～１５６６、１４６７～１５６７、１４６８～１５６８、１４６９～１５６９、１４７０～１５７０、１４７１～１５７１、１４７２～１５７２、１４７３～１５７３、１４７４～１５７４、１４７５～１５７５、１４７６～１５７６、１４７７～１５７７、１４７８～１５７８、１４７９～１５７９、１４８０～１５８０、１４８１～１５８１、１４８２～１５８２、１４８３～１５８３、１４８４～１５８４、１４８５～１５８５、１４８６～１５８６、１４８７～１５８７、１４８８～１５８８、１４８９～１５８９、１４９０～１５９０、１４９１～１５９１、１４９２～１５９２、１４９３～１５９３、１４９４～１５９４、１４９５～１５９５、１４９６～１５９６、１４９７～１５９７、１４９８～１５９８、１４９９～１５９９、１５００～１６００、１５０１～１６０１、１５０２～１６０２、１５０３～１６０３、１５０４～１６０４、１５０５～１６０５、１５０６～１６０６、１５０７～１６０７、１５０８～１６０８、１５０９～１６０９、１５１０～１６１０、１５１１～１６１１、１５１２～１６１２、１５１３～１６１３、１５１４～１６１４、１５１５～１６１５、１５１６～１６１６、１５１７～１６１７、１５１８～１６１８、１５１９～１６１９、１５２０～１６２０、１５２１～１６２１、１５２２～１６２２、１５２３～１６２３、１５２４～１６２４、１５２５～１６２５、１５２６～１６２６、１５２７～１６２７、１５２８～１６２８、１５２９～１６２９、１５３０～１６３０、１５３１～１６３１、１５３２～１６３２、１５３３～１６３３、１５３４～１６３４、１５３５～１６３５、１５３６～１６３６、１５３７～１６３７、１５３８～１６３８、１５３９～１６３９、１５４０～１６４０、１５４１～１６４１、１５４２～１６４２、１５４３～１６４３、１５４４～１６４４、１５４５～１６４５、１５４６～１６４６、１５４７～１６４７、１５４８～１６４８、１５４９～１６４９、１５５０～１６５０、１５５１～１６５１、１５５２～１６５２、１５５３～１６５３、１５５４～１６５４、１５５５～１６５５、１５５６～１６５６、１５５７～１６５７、１５５８～１６５８、１５５９～１６５９、１５６０～１６６０、１５６１～１６６１、１５６２～１６６２、１５６３～１６６３、１５６４～１６６４、１５６５～１６６５、１５６６～１６６６、１５６７～１６６７、１５６８～１６６８、１５６９～１６６９、１５７０～１６７０、１５７１～１６７１、１５７２～１６７２、１５７３～１６７３、１５７４～１６７４、１５７５～１６７５、１５７６～１６７６、１５７７～１６７７、１５７８～１６７８、１５７９～１６７９、１５８０～１６８０、１５８１～１６８１、１５８２～１６８２、１５８３～１６８３、１５８４～１６８４、１５８５～１６８５、１５８６～１６８６、１５８７～１６８７、１５８８～１６８８、１５８９～１６８９、１５９０～１６９０、１５９１～１６９１、１５９２～１６９２、１５９３～１６９３、１５９４～１６９４、１５９５～１６９５、１５９６～１６９６、１５９７～１６９７、１５９８～１６９８、１５９９～１６９９、１６００～１７００、１６０１～１７０１、１６０２～１７０２、１６０３～１７０３、１６０４～１７０４、１６０５～１７０５、１６０６～１７０６、１６０７～１７０７、１６０８～１７０８、１６０９～１７０９、１６１０～１７１０、１６１１～１７１１、１６１２～１７１２、１６１３～１７１３、１６１４～１７１４、１６１５～１７１５、１６１６～１７１６、１６１７～１７１７、１６１８～１７１８、１６１９～１７１９、１６２０～１７２０、１６２１～１７２１、１６２２～１７２２、１６２３～１７２３、１６２４～１７２４、１６２５～１７２５、１６２６～１７２６、１６２７～１７２７、１６２８～１７２８、１６２９～１７２９、１６３０～１７３０、１６３１～１７３１、１６３２～１７３２、１６３３～１７３３、１６３４～１７３４、１６３５～１７３５、１６３６～１７３６、１６３７～１７３７、１６３８～１７３８、１６３９～１７３９、１６４０～１７４０、１６４１～１７４１、１６４２～１７４２、１６４３～１７４３、１６４４～１７４４、１６４５～１７４５、１６４６～１７４６、１６４７～１７４７、１６４８～１７４８、１６４９～１７４９、１６５０～１７５０、１６５１～１７５１、１６５２～１７５２、１６５３～１７５３、１６５４～１７５４、１６５５～１７５５、１６５６～１７５６、１６５７～１７５７、１６５８～１７５８、１６５９～１７５９、１６６０～１７６０、１６６１～１７６１、１６６２～１７６２、１６６３～１７６３、１６６４～１７６４、１６６５～１７６５、１６６６～１７６６、１６６７～１７６７、１６６８～１７６８、１６６９～１７６９、１６７０～１７７０、１６７１～１７７１、１６７２～１７７２、１６７３～１７７３、１６７４～１７７４、１６７５～１７７５、１６７６～１７７６、１６７７～１７７７、１６７８～１７７８、１６７９～１７７９、１６８０～１７８０、１６８１～１７８１、１６８２～１７８２、１６８３～１７８３、１６８４～１７８４、１６８５～１７８５、１６８６～１７８６、１６８７～１７８７、１６８８～１７８８、１６８９～１７８９、１６９０～１７９０、１６９１～１７９１、１６９２～１７９２、１６９３～１７９３、１６９４～１７９４、１６９５～１７９５、１６９６～１７９６、１６９７～１７９７、１６９８～１７９８、１６９９～１７９９、１７００～１８００、１７０１～１８０１、１７０２～１８０２、１７０３～１８０３、１７０４～１８０４、１７０５～１８０５、１７０６～１８０６、１７０７～１８０７、１７０８～１８０８、１７０９～１８０９、１７１０～１８１０、１７１１～１８１１、１７１２～１８１２、１７１３～１８１３、１７１４～１８１４、１７１５～１８１５、１７１６～１８１６、１７１７～１８１７、１７１８～１８１８、１７１９～１８１９、１７２０～１８２０、１７２１～１８２１、１７２２～１８２２、１７２３～１８２３、１７２４～１８２４、１７２５～１８２５、１７２６～１８２６、１７２７～１８２７、１７２８～１８２８、１７２９～１８２９、１７３０～１８３０、１７３１～１８３１、１７
３２～１８３２、１７３３～１８３３、１７３４～１８３４、１７３５～１８３５、１７３６～１８３６、１７３７～１８３７、１７３８～１８３８、１７３９～１８３９、１７４０～１８４０、１７４１～１８４１、１７４２～１８４２、１７４３～１８４３、１７４４～１８４４、１７４５～１８４５、１７４６～１８４６、１７４７～１８４７、１７４８～１８４８、１７４９～１８４９、１７５０～１８５０、１７５１～１８５１、１７５２～１８５２、１７５３～１８５３、１７５４～１８５４、１７５５～１８５５、１７５６～１８５６、１７５７～１８５７、１７５８～１８５８、１７５９～１８５９、１７６０～１８６０、１７６１～１８６１、１７６２～１８６２、１７６３～１８６３、１７６４～１８６４、１７６５～１８６５、１７６６～１８６６、１７６７～１８６７、１７６８～１８６８、１７６９～１８６９、１７７０～１８７０、１７７１～１８７１、１７７２～１８７２、１７７３～１８７３、１７７４～１８７４、１７７５～１８７５、１７７６～１８７６、１７７７～１８７７、１７７８～１８７８、１７７９～１８７９、１７８０～１８８０、１７８１～１８８１、１７８２～１８８２、１７８３～１８８３、１７８４～１８８４、１７８５～１８８５、１７８６～１８８６、１７８７～１８８７、１７８８～１８８８、１７８９～１８８９、１７９０～１８９０、１７９１～１８９１、１７９２～１８９２、１７９３～１８９３、１７９４～１８９４、１７９５～１８９５、１７９６～１８９６、１７９７～１８９７、１７９８～１８９８、１７９９～１８９９、１８００～１９００、１８０１～１９０１、１８０２～１９０２、１８０３～１９０３、１８０４～１９０４、１８０５～１９０５、１８０６～１９０６、１８０７～１９０７、１８０８～１９０８、１８０９～１９０９、１８１０～１９１０、１８１１～１９１１、１８１２～１９１２、１８１３～１９１３、１８１４～１９１４、１８１５～１９１５、１８１６～１９１６、１８１７～１９１７、１８１８～１９１８、１８１９～１９１９、１８２０～１９２０、１８２１～１９２１、１８２２～１９２２、１８２３～１９２３、１８２４～１９２４、１８２５～１９２５、１８２６～１９２６、１８２７～１９２７、１８２８～１９２８、１８２９～１９２９、１８３０～１９３０、１８３１～１９３１、１８３２～１９３２、１８３３～１９３３、１８３４～１９３４、１８３５～１９３５、１８３６～１９３６、１８３７～１９３７、１８３８～１９３８、１８３９～１９３９、１８４０～１９４０、１８４１～１９４１、１８４２～１９４２、１８４３～１９４３、１８４４～１９４４、１８４５～１９４５、１８４６～１９４６、１８４７～１９４７、１８４８～１９４８、１８４９～１９４９、１８５０～１９５０、１８５１～１９５１、１８５２～１９５２、１８５３～１９５３、１８５４～１９５４、１８５５～１９５５、１８５６～１９５６、１８５７～１９５７、１８５８～１９５８、１８５９～１９５９、１８６０～１９６０、１８６１～１９６１、１８６２～１９６２、１８６３～１９６３、１８６４～１９６４、１８６５～１９６５、１８６６～１９６６、１８６７～１９６７、１８６８～１９６８、１８６９～１９６９、１８７０～１９７０、１８７１～１９７１、１８７２～１９７２、１８７３～１９７３、１８７４～１９７４、１８７５～１９７５、１８７６～１９７６、１８７７～１９７７、１８７８～１９７８、１８７９～１９７９、１８８０～１９８０、１８８１～１９８１、１８８２～１９８２、１８８３～１９８３、１８８４～１９８４、１８８５～１９８５、１８８６～１９８６、１８８７～１９８７、１８８８～１９８８、１８８９～１９８９、１８９０～１９９０、１８９１～１９９１、１８９２～１９９２、１８９３～１９９３、１８９４～１９９４、１８９５～１９９５、１８９６～１９９６、１８９７～１９９７、１８９８～１９９８、１８９９～１９９９、１９００～２０００、１９０１～２００１、１９０２～２００２、１９０３～２００３、１９０４～２００４、１９０５～２００５、１９０６～２００６、１９０７～２００７、１９０８～２００８、１９０９～２００９、１９１０～２０１０、１９１１～２０１１、１９１２～２０１２、１９１３～２０１３、１９１４～２０１４、１９１５～２０１５、１９１６～２０１６、１９１７～２０１７、１９１８～２０１８、１９１９～２０１９、１９２０～２０２０、１９２１～２０２１、１９２２～２０２２、１９２３～２０２３、１９２４～２０２４、１９２５～２０２５、１９２６～２０２６、１９２７～２０２７、１９２８～２０２８、１９２９～２０２９、１９３０～２０３０、１９３１～２０３１、１９３２～２０３２、１９３３～２０３３、１９３４～２０３４、１９３５～２０３５、１９３６～２０３６、１９３７～２０３７、１９３８～２０３８、１９３９～２０３９、１９４０～２０４０、１９４１～２０４１、１９４２～２０４２、１９４３～２０４３、１９４４～２０４４、１９４５～２０４５、１９４６～２０４６、１９４７～２０４７、１９４８～２０４８、１９４９～２０４９、１９５０～２０５０、１９５１～２０５１、１９５２～２０５２、１９５３～２０５３、１９５４～２０５４、１９５５～２０５５、１９５６～２０５６、１９５７～２０５７、１９５８～２０５８、１９５９～２０５９、１９６０～２０６０、１９６１～２０６１、１９６２～２０６２、１９６３～２０６３、１９６４～２０６４、１９６５～２０６５、１９６６～２０６６、１９６７～２０６７、１９６８～２０６８、１９６９～２０６９、１９７０～２０７０、１９７１～２０７１、１９７２～２０７２、１９７３～２０７３、１９７４～２０７４、１９７５～２０７５、１９７６～２０７６、１９７７～２０７７、１９７８～２０７８、１９７９～２０７９、１９８０～２０８０、１９８１～２０８１、１９８２～２０８２、１９８３～２０８３、１９８４～２０８４、１９８５～２０８５、１９８６～２０８６、１９８７～２０８７、１９８８～２０８８、１９８９～２０８９、１９９０～２０９０、１９９１～２０９１、１９９２～２０９２、１９９３～２０９３、１９９４～２０９４、１９９５～２０９５、１９９６～２０９６、１９９７～２０９７、１９９８～２０９８、１９９９～２０９９、２０００～２１００、２００１～２１０１、２００２～２１０２、２００３～２１０３、２００４～２１０４、２００５～２１０５、２００６～２１０６、２００７～２１０７、２００８～２１０８、２００９～２１０９、２０１０～２１１０、２０１１～２１１１、２０１２～２１１２、２０１３～２１１３、２０１４～２１１４、２０１５～２１１５、２０１６～２１１６、２０１７～２１１７、２０１８～２１１８、２０１９～２１１９、２０２０～２１２０、２０２１～２１２１、２０２２～２１２２、２０２３～２１２３、２０２４～２１２４、２０２５～２１２５、２０２６～２１２６、２０２７～２１２７、２０２８～２１２８、２０２９～２１２９、２０３０～２１３０、２０３１～２１３１、２０３２～２１３２、２０３３～２１３３、２０３４～２１３４、２０３５～２１３５、２０３６～２１３６、２０３７～２１３７、２０３８～２１３８、２０３９～２１３９、２０４０～２１４０、２０４１～２１４１、２０４２～２１４２、２０４３～２１４３、２０４４～２１４４、２０４５～２１４５、２０４６～２１４６、２０４７～２１４７、２０４８～２１４８、２０４９～２１４９、２０５０～２１５０、２０５１～２１５１、２０５２～２１５２、２０５３～２１５３、２０５４～２１５４、２０５５～２１５５、２０５６～２１５６、２０５７～２１５７、２０５８～２１５８、２０５９～２１５９、２０６０～２１６０、２０６１～２１６１、２０６２～２１６２、２０６３～２１６３、２０６４～２１６４、２０６５～２１６５、２０６６～２１６６、２０６７～２１６７、２０６８～２１６８、２０６９～２１６９、２０７０～２１７０、２０７１～２１７１、２０７２～２１７２、２０７３～２１７３、２０７４～２１７４、２０７５～２１７５、２０７６～２１７６、２０７７～２１７７、２０７８～２１７８、２０７９～２１７９、２０８０～２１８０、２０８１～２１８１、２０８２～２１８２、２０８３～２１８３、２０８４～２１８４、２０８５～２１８５、２０８６～２１８６、２０８７～２１８７、２０８８～２１８８、２０８９～２１８９、２０９０～２１９０、２０９１～２１９１、２０９２～２１９２、２０９３～２１９３、２０９４～２１９４、２０９５～２１９５、２０９６～２１９６、２０９７～２１９７、２０９８～２１９８、２０９９～２１９９、２１００～２２００、２１０１～２２０１、２１０２～２２０２、２１０３～２２０３、２１０４～２２０４、２１０５～２２０５、２１０６～２２０６、２１０７～２２０７、２１０８～２２０８、２１０９～２２０９、２１１０～２２１０、２１１１～２２１１、２１１２～２２１２、２１１３～２２１３、２１１４～２２１４、２１１５～２２１５、２１１６～２２１６、２１１７～２２１７、２１１８～２２１８、２１１９～２２１９、２１２０～２２２０、２１２１～２２２１、２１２２～２２２２、２１２３～２２２３、２１２４～２２２４、２１２５～２２２５、２１２６～２２２６、２１２７～２２２７、２１２８～２２２８、２１２９～２２２９、２１３０～２２３０、２１３１～２２３１、２１３２～２２３２、２１３３～２２３３、２１３４～２２３４、２１３５～２２３５、２１３６～２２３６、２１３７～２２３７、２１３８～２２３８、２１３９～２２３９、２１４０～２２４０、２１４１～２２４１、２１４２～２２４２、２１４３～２２４３、２１４４～２２４４、２１４５～２２４５、２１４６～２２４６、２１４７～２２４７、２１４８～２２４８、２１４９～２２４９、２１５０～２２５０、２１５１～２２５１、２１５２～２２５２、２１５３～２２５３、２１５４～２２５４、２１５５～２２５５、２１５６～２２５６、２１５７～２２５７、２１５８～２２５８、２１５９～２２５９、２１６０～２２６０、２１６１～２２６１、２１６２～２２６２、２１６３～２２６３、２１６４～２２６４、２１６５～２２６５、２１６６～２２６６、２１６７～２２６７、２１６８～２２６８、２１６９～２２６９、２１７０～２２７０、２１７１～２２７１、２１７２～２２７２、２１７３～２２７３、２１７４～２２７４、２１７５～２２７５、２１７６～２２７６、２１７７～２２７７、２１７８～２２７８、２１７９～２２７９、２１８０～２２８０、２１８１～２２８１、２１８２～２２８２、２１８３～２２８３、２１８４～２２８４、２１８５～２２８５、２１８６～２２８６、２１８７～２２８７、２１８８～２２８８、２１８９～２２８９、２１９０～２２９０、２１９１～２２９１、２１９２～２２９２、２１９３～２２９３、２１９４～２２９４、２１９５～２２９５、２１９６～２２９６、２１９７～２２９７、２１９８～２２９８、２１９９～２２９９、２２００～２３００、２２０１～２３０１、２２０２～２３０２、２２０３～２３０３、２２０４～２３０４、２２０５～２３０５、２２０６～２３０６、２２０７～２３０７、２２０８～２３０８、２２０９～２３０９、２２１０～２３１０、２２１１～２３１１、２２１２～２３１２、２２１３～２３１３、２２１４～２３１４、２２１５～２３１５、２２１６～２３１６、２２１７～２３１７、２２１８～２３１８、２２１９～２３１９、２２２０～２３２０、２２２１～２３２１、２２２２～２３２２、２２２３～２３２３、２２２４～２３２４、２２２５～２３２５、２２２６～２３２６、２２２７～２３２７、２２２８～２３２８、２２２９～２３２９、２２３０～２３３０、２２３１～２３３１、２２３２～２３３２、２２３３～２３３３、２２３４～２３３４、２２３５～２３３５、２２３６～２３３６、２２３７～２３３７、２２３８～２３３８、２２３９～２３３９、２２４０～２３４０、２２４１～２３４１、２２４２～２３４２、２２４３～２３４３、２２４
４～２３４４、２２４５～２３４５、２２４６～２３４６、２２４７～２３４７、２２４８～２３４８、２２４９～２３４９、２２５０～２３５０、２２５１～２３５１、２２５２～２３５２、２２５３～２３５３、２２５４～２３５４、２２５５～２３５５、２２５６～２３５６、２２５７～２３５７、２２５８～２３５８、２２５９～２３５９、２２６０～２３６０、２２６１～２３６１、２２６２～２３６２、２２６３～２３６３、２２６４～２３６４、２２６５～２３６５、２２６６～２３６６、２２６７～２３６７、２２６８～２３６８、２２６９～２３６９、２２７０～２３７０、２２７１～２３７１、２２７２～２３７２、２２７３～２３７３、２２７４～２３７４、２２７５～２３７５、２２７６～２３７６、２２７７～２３７７、２２７８～２３７８、２２７９～２３７９、２２８０～２３８０、２２８１～２３８１、２２８２～２３８２、２２８３～２３８３、２２８４～２３８４、２２８５～２３８５、２２８６～２３８６、２２８７～２３８７、２２８８～２３８８、２２８９～２３８９、２２９０～２３９０、２２９１～２３９１、２２９２～２３９２、２２９３～２３９３、２２９４～２３９４、２２９５～２３９５、２２９６～２３９６、２２９７～２３９７、２２９８～２３９８、２２９９～２３９９、２３００～２４００、２３０１～２４０１、２３０２～２４０２、２３０３～２４０３、２３０４～２４０４、２３０５～２４０５、２３０６～２４０６、２３０７～２４０７、２３０８～２４０８、２３０９～２４０９、２３１０～２４１０、２３１１～２４１１、２３１２～２４１２、２３１３～２４１３、２３１４～２４１４、２３１５～２４１５、２３１６～２４１６、２３１７～２４１７、２３１８～２４１８、２３１９～２４１９、２３２０～２４２０、２３２１～２４２１、２３２２～２４２２、２３２３～２４２３、２３２４～２４２４、２３２５～２４２５、２３２６～２４２６、２３２７～２４２７、２３２８～２４２８、２３２９～２４２９、２３３０～２４３０、２３３１～２４３１、２３３２～２４３２、２３３３～２４３３、２３３４～２４３４、２３３５～２４３５、２３３６～２４３６、２３３７～２４３７、２３３８～２４３８、２３３９～２４３９、２３４０～２４４０、２３４１～２４４１、２３４２～２４４２、２３４３～２４４３、２３４４～２４４４、２３４５～２４４５、２３４６～２４４６、２３４７～２４４７、２３４８～２４４８、２３４９～２４４９、２３５０～２４５０、２３５１～２４５１、２３５２～２４５２、２３５３～２４５３、２３５４～２４５４、２３５５～２４５５、２３５６～２４５６、２３５７～２４５７、２３５８～２４５８、２３５９～２４５９、２３６０～２４６０、２３６１～２４６１、２３６２～２４６２、２３６３～２４６３、２３６４～２４６４、２３６５～２４６５、２３６６～２４６６、２３６７～２４６７、２３６８～２４６８、２３６９～２４６９、２３７０～２４７０、２３７１～２４７１、２３７２～２４７２、２３７３～２４７３、２３７４～２４７４、２３７５～２４７５、２３７６～２４７６、２３７７～２４７７、２３７８～２４７８、２３７９～２４７９、２３８０～２４８０、２３８１～２４８１、２３８２～２４８２、２３８３～２４８３、２３８４～２４８４、２３８５～２４８５、２３８６～２４８６、２３８７～２４８７、２３８８～２４８８、２３８９～２４８９、２３９０～２４９０、２３９１～２４９１、２３９２～２４９２、２３９３～２４９３、２３９４～２４９４、２３９５～２４９５、２３９６～２４９６、２３９７～２４９７、２３９８～２４９８、２３９９～２４９９、２４００～２５００、２４０１～２５０１、２４０２～２５０２、２４０３～２５０３、２４０４～２５０４、２４０５～２５０５、２４０６～２５０６、２４０７～２５０７、２４０８～２５０８、２４０９～２５０９、２４１０～２５１０、２４１１～２５１１、２４１２～２５１２、２４１３～２５１３、２４１４～２５１４、２４１５～２５１５、２４１６～２５１６、２４１７～２５１７、２４１８～２５１８、２４１９～２５１９、２４２０～２５２０、２４２１～２５２１、２４２２～２５２２、２４２３～２５２３、２４２４～２５２４、２４２５～２５２５、２４２６～２５２６、２４２７～２５２７、２４２８～２５２８、２４２９～２５２９、２４３０～２５３０、２４３１～２５３１、２４３２～２５３２、２４３３～２５３３、２４３４～２５３４、２４３５～２５３５、２４３６～２５３６、２４３７～２５３７、２４３８～２５３８、２４３９～２５３９、２４４０～２５４０、２４４１～２５４１、２４４２～２５４２、２４４３～２５４３、２４４４～２５４４、２４４５～２５４５、２４４６～２５４６、２４４７～２５４７、２４４８～２５４８、２４４９～２５４９、２４５０～２５５０、２４５１～２５５１、２４５２～２５５２、２４５３～２５５３、２４５４～２５５４、２４５５～２５５５、２４５６～２５５６、２４５７～２５５７、２４５８～２５５８、２４５９～２５５９、２４６０～２５６０、２４６１～２５６１、２４６２～２５６２、２４６３～２５６３、２４６４～２５６４、２４６５～２５６５、２４６６～２５６６、２４６７～２５６７、２４６８～２５６８、２４６９～２５６９、２４７０～２５７０、２４７１～２５７１、２４７２～２５７２、２４７３～２５７３、２４７４～２５７４、２４７５～２５７５、２４７６～２５７６、２４７７～２５７７、２４７８～２５７８、２４７９～２５７９、２４８０～２５８０、２４８１～２５８１、２４８２～２５８２、２４８３～２５８３、２４８４～２５８４、２４８５～２５８５、２４８６～２５８６、２４８７～２５８７、２４８８～２５８８、２４８９～２５８９、２４９０～２５９０、２４９１～２５９１、２４９２～２５９２、２４９３～２５９３、２４９４～２５９４、２４９５～２５９５、２４９６～２５９６、２４９７～２５９７、２４９８～２５９８、２４９９～２５９９、２５００～２６００、２５０１～２６０１、２５０２～２６０２、２５０３～２６０３、２５０４～２６０４、２５０５～２６０５、２５０６～２６０６、２５０７～２６０７、２５０８～２６０８、２５０９～２６０９、２５１０～２６１０、２５１１～２６１１、２５１２～２６１２、２５１３～２６１３、２５１４～２６１４、２５１５～２６１５、２５１６～２６１６、２５１７～２６１７、２５１８～２６１８、２５１９～２６１９、２５２０～２６２０、２５２１～２６２１、２５２２～２６２２、２５２３～２６２３、２５２４～２６２４、２５２５～２６２５、２５２６～２６２６、２５２７～２６２７、２５２８～２６２８、２５２９～２６２９、２５３０～２６３０、２５３１～２６３１、２５３２～２６３２、２５３３～２６３３、２５３４～２６３４、２５３５～２６３５、２５３６～２６３６、２５３７～２６３７、２５３８～２６３８、２５３９～２６３９、２５４０～２６４０、２５４１～２６４１、２５４２～２６４２、２５４３～２６４３、２５４４～２６４４、２５４５～２６４５、２５４６～２６４６、２５４７～２６４７、２５４８～２６４８、２５４９～２６４９、２５５０～２６５０、２５５１～２６５１、２５５２～２６５２、２５５３～２６５３、２５５４～２６５４、２５５５～２６５５、２５５６～２６５６、２５５７～２６５７、２５５８～２６５８、２５５９～２６５９、２５６０～２６６０、２５６１～２６６１、２５６２～２６６２、２５６３～２６６３、２５６４～２６６４、２５６５～２６６５、２５６６～２６６６、２５６７～２６６７、２５６８～２６６８、２５６９～２６６９、２５７０～２６７０、２５７１～２６７１、２５７２～２６７２、２５７３～２６７３、２５７４～２６７４、２５７５～２６７５、２５７６～２６７６、２５７７～２６７７、２５７８～２６７８、２５７９～２６７９、２５８０～２６８０、２５８１～２６８１、２５８２～２６８２、２５８３～２６８３、２５８４～２６８４、２５８５～２６８５、２５８６～２６８６、２５８７～２６８７、２５８８～２６８８、２５８９～２６８９、２５９０～２６９０、２５９１～２６９１、２５９２～２６９２、２５９３～２６９３、２５９４～２６９４、２５９５～２６９５、２５９６～２６９６、２５９７～２６９７、２５９８～２６９８、２５９９～２６９９、２６００～２７００、２６０１～２７０１、２６０２～２７０２、２６０３～２７０３、２６０４～２７０４、２６０５～２７０５、２６０６～２７０６、２６０７～２７０７、２６０８～２７０８、２６０９～２７０９、２６１０～２７１０、２６１１～２７１１、２６１２～２７１２、２６１３～２７１３、２６１４～２７１４、２６１５～２７１５、２６１６～２７１６、２６１７～２７１７、２６１８～２７１８、２６１９～２７１９、２６２０～２７２０、２６２１～２７２１、２６２２～２７２２、２６２３～２７２３、２６２４～２７２４、２６２５～２７２５、２６２６～２７２６、２６２７～２７２７、２６２８～２７２８、２６２９～２７２９、２６３０～２７３０、２６３１～２７３１、２６３２～２７３２、２６３３～２７３３、２６３４～２７３４、２６３５～２７３５、２６３６～２７３６、２６３７～２７３７、２６３８～２７３８、２６３９～２７３９、２６４０～２７４０、２６４１～２７４１、２６４２～２７４２、２６４３～２７４３、２６４４～２７４４、２６４５～２７４５、２６４６～２７４６、２６４７～２７４７、２６４８～２７４８、２６４９～２７４９、２６５０～２７５０、２６５１～２７５１、２６５２～２７５２、２６５３～２７５３、２６５４～２７５４、２６５５～２７５５、２６５６～２７５６、２６５７～２７５７、２６５８～２７５８、２６５９～２７５９、２６６０～２７６０、２６６１～２７６１、２６６２～２７６２、２６６３～２７６３、２６６４～２７６４、２６６５～２７６５、２６６６～２７６６、２６６７～２７６７、２６６８～２７６８、２６６９～２７６９、２６７０～２７７０、２６７１～２７７１、２６７２～２７７２、２６７３～２７７３、２６７４～２７７４、２６７５～２７７５、２６７６～２７７６、２６７７～２７７７、２６７８～２７７８、２６７９～２７７９、２６８０～２７８０、２６８１～２７８１、２６８２～２７８２、２６８３～２７８３、２６８４～２７８４、２６８５～２７８５、２６８６～２７８６、２６８７～２７８７、２６８８～２７８８、２６８９～２７８９、２６９０～２７９０、２６９１～２７９１、２６９２～２７９２、２６９３～２７９３、２６９４～２７９４、２６９５～２７９５、２６９６～２７９６、２６９７～２７９７、２６９８～２７９８、２６９９～２７９９、２７００～２８００、２７０１～２８０１、２７０２～２８０２、２７０３～２８０３、２７０４～２８０４、２７０５～２８０５、２７０６～２８０６、２７０７～２８０７、２７０８～２８０８、２７０９～２８０９、２７１０～２８１０、２７１１～２８１１、２７１２～２８１２、２７１３～２８１３、２７１４～２８１４、２７１５～２８１５、２７１６～２８１６、２７１７～２８１７、２７１８～２８１８、２７１９～２８１９、２７２０～２８２０、２７２１～２８２１、２７２２～２８２２、２７２３～２８２３、２７２４～２８２４、２７２５～２８２５、２７２６～２８２６、２７２７～２８２７、２７２８～２８２８、２７２９～２８２９、２７３０～２８３０、２７３１～２８３１、２７３２～２８３２、２７３３～２８３３、２７３４～２８３４、２７３５～２８３５、２７３６～２８３６、２７３７～２８３７、２７３８～２８３８、２７３９～２８３９、２７４０～２８４０、２７４１～２８４１、２７４２～２８４２、２７４３～２８４３、２７４４～２８４４、２７４５～２８４５、２７４６～２８４６、２７４７～２８４７、２７４８～２８４８、２７４９～２８４９、２７５０～２８５０、２７５１～２８５１、２７５２～２８５２、２７５３～２８５３、２７５４～２８５４、２７５５～２８５５、２７５６
～２８５６、２７５７～２８５７、２７５８～２８５８、２７５９～２８５９、２７６０～２８６０、２７６１～２８６１、２７６２～２８６２、２７６３～２８６３、２７６４～２８６４、２７６５～２８６５、２７６６～２８６６、２７６７～２８６７、２７６８～２８６８、２７６９～２８６９、２７７０～２８７０、２７７１～２８７１、２７７２～２８７２、２７７３～２８７３、２７７４～２８７４、２７７５～２８７５、２７７６～２８７６、２７７７～２８７７、２７７８～２８７８、２７７９～２８７９、２７８０～２８８０、２７８１～２８８１、２７８２～２８８２、２７８３～２８８３、２７８４～２８８４、２７８５～２８８５、２７８６～２８８６、２７８７～２８８７、２７８８～２８８８、２７８９～２８８９、２７９０～２８９０、２７９１～２８９１、２７９２～２８９２、２７９３～２８９３、２７９４～２８９４、２７９５～２８９５、２７９６～２８９６、２７９７～２８９７、２７９８～２８９８、２７９９～２８９９、２８００～２９００、２８０１～２９０１、２８０２～２９０２、２８０３～２９０３、２８０４～２９０４、２８０５～２９０５、２８０６～２９０６、２８０７～２９０７、２８０８～２９０８、２８０９～２９０９、２８１０～２９１０、２８１１～２９１１、２８１２～２９１２、２８１３～２９１３、２８１４～２９１４、２８１５～２９１５、２８１６～２９１６、２８１７～２９１７、２８１８～２９１８、２８１９～２９１９、２８２０～２９２０、２８２１～２９２１、２８２２～２９２２、２８２３～２９２３、２８２４～２９２４、２８２５～２９２５、２８２６～２９２６、２８２７～２９２７、２８２８～２９２８、２８２９～２９２９、２８３０～２９３０、２８３１～２９３１、２８３２～２９３２、２８３３～２９３３、２８３４～２９３４、２８３５～２９３５、２８３６～２９３６、２８３７～２９３７、２８３８～２９３８、２８３９～２９３９、２８４０～２９４０、２８４１～２９４１、２８４２～２９４２、２８４３～２９４３、２８４４～２９４４、２８４５～２９４５、２８４６～２９４６、２８４７～２９４７、２８４８～２９４８、２８４９～２９４９、２８５０～２９５０、２８５１～２９５１、２８５２～２９５２、２８５３～２９５３、２８５４～２９５４、２８５５～２９５５、２８５６～２９５６、２８５７～２９５７、２８５８～２９５８、２８５９～２９５９、２８６０～２９６０、２８６１～２９６１、２８６２～２９６２、２８６３～２９６３、２８６４～２９６４、２８６５～２９６５、２８６６～２９６６、２８６７～２９６７、２８６８～２９６８、２８６９～２９６９、２８７０～２９７０、２８７１～２９７１、２８７２～２９７２、２８７３～２９７３、２８７４～２９７４、２８７５～２９７５、２８７６～２９７６、２８７７～２９７７、２８７８～２９７８、２８７９～２９７９、２８８０～２９８０、２８８１～２９８１、２８８２～２９８２、２８８３～２９８３、２８８４～２９８４、２８８５～２９８５、２８８６～２９８６、２８８７～２９８７、２８８８～２９８８、２８８９～２９８９、２８９０～２９９０、２８９１～２９９１、２８９２～２９９２、２８９３～２９９３、２８９４～２９９４、２８９５～２９９５、２８９６～２９９６、２８９７～２９９７、２８９８～２９９８、２８９９～２９９９、２９００～３０００、２９０１～３００１、２９０２～３００２、２９０３～３００３、２９０４～３００４、２９０５～３００５、２９０６～３００６、２９０７～３００７、２９０８～３００８、２９０９～３００９、２９１０～３０１０、２９１１～３０１１、２９１２～３０１２、２９１３～３０１３、２９１４～３０１４、２９１５～３０１５、２９１６～３０１６、２９１７～３０１７、２９１８～３０１８、２９１９～３０１９、２９２０～３０２０、２９２１～３０２１、２９２２～３０２２、２９２３～３０２３、２９２４～３０２４、２９２５～３０２５、２９２６～３０２６、２９２７～３０２７、または２９２８～３０２８と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号１１もしくは配列番号１１に相補的な配列の塩基１～１００、２～１０１、３～１０２、４～１０３、５～１０４、６～１０５、７～１０６、８～１０７、９～１０８、１０～１０９、１１～１１０、１２～１１１、１３～１１２、１４～１１３、１５～１１４、１６～１１５、１７～１１６、１８～１１７、１９～１１８、２０～１１９、２１～１２０、２２～１２１、２３～１２２、２４～１２３、２５～１２４、２６～１２５、２７～１２６、２８～１２７、２９～１２８、３０～１２９、３１～１３０、３２～１３１、３３～１３２、３４～１３３、３５～１３４、３６～１３５、３７～１３６、３８～１３７、３９～１３８、４０～１３９、４１～１４０、４２～１４１、４３～１４２、４４～１４３、４５～１４４、４６～１４５、４７～１４６、４８～１４７、４９～１４８、５０～１４９、５１～１５０、５２～１５１、５３～１５２、５４～１５３、５５～１５４、５６～１５５、５７～１５６、５８～１５７、５９～１５８、６０～１５９、６１～１６０、６２～１６１、６３～１６２、６４～１６３、６５～１６４、６６～１６５、６７～１６６、６８～１６７、６９～１６８、７０～１６９、７１～１７０、７２～１７１、７３～１７２、７４～１７３、７５～１７４、７６～１７５、７７～１７６、７８～１７７、７９～１７８、８０～１７９、８１～１８０、８２～１８１、８３～１８２、８４～１８３、８５～１８４、８６～１８５、８７～１８６、８８～１８７、８９～１８８、９０～１８９、９１～１９０、９２～１９１、９３～１９２、９４～１９３、９５～１９４、９６～１９５、９７～１９６、９８～１９７、９９～１９８、１００～１９９、１０１～２００、１０２～２０１、１０３～２０２、１０４～２０３、１０５～２０４、１０６～２０５、１０７～２０６、１０８～２０７、１０９～２０８、１１０～２０９、１１１～２１０、１１２～２１１、１１３～２１２、１１４～２１３、１１５～２１４、１１６～２１５、１１７～２１６、１１８～２１７、１１９～２１８、１２０～２１９、１２１～２２０、１２２～２２１、１２３～２２２、１２４～２２３、１２５～２２４、１２６～２２５、１２７～２２６、１２８～２２７、１２９～２２８、１３０～２２９、１３１～２３０、１３２～２３１、１３３～２３２、１３４～２３３、１３５～２３４、１３６～２３５、１３７～２３６、１３８～２３７、１３９～２３８、１４０～２３９、１４１～２４０、１４２～２４１、１４３～２４２、１４４～２４３、１４５～２４４、１４６～２４５、１４７～２４６、１４８～２４７、１４９～２４８、１５０～２４９、１５１～２５０、１５２～２５１、１５３～２５２、１５４～２５３、１５５～２５４、１５６～２５５、１５７～２５６、１５８～２５７、１５９～２５８、１６０～２５９、１６１～２６０、１６２～２６１、１６３～２６２、１６４～２６３、１６５～２６４、１６６～２６５、１６７～２６６、１６８～２６７、１６９～２６８、１７０～２６９、１７１～２７０、１７２～２７１、１７３～２７２、１７４～２７３、１７５～２７４、１７６～２７５、１７７～２７６、１７８～２７７、１７９～２７８、１８０～２７９、１８１～２８０、１８２～２８１、１８３～２８２、１８４～２８３、１８５～２８４、１８６～２８５、１８７～２８６、１８８～２８７、１８９～２８８、１９０～２８９、１９１～２９０、１９２～２９１、１９３～２９２、１９４～２９３、１９５～２９４、１９６～２９５、１９７～２９６、１９８～２９７、１９９～２９８、２００～２９９、２０１～３００、２０２～３０１、２０３～３０２、２０４～３０３、２０５～３０４、２０６～３０５、２０７～３０６、２０８～３０７、２０９～３０８、２１０～３０９、２１１～３１０、２１２～３１１、２１３～３１２、２１４～３１３、２１５～３１４、２１６～３１５、２１７～３１６、２１８～３１７、２１９～３１８、２２０～３１９、２２１～３２０、２２２～３２１、２２３～３２２、２２４～３２３、２２５～３２４、２２６～３２５、２２７～３２６、２２８～３２７、２２９～３２８、２３０～３２９、２３１～３３０、２３２～３３１、２３３～３３２、２３４～３３３、２３５～３３４、２３６～３３５、２３７～３３６、２３８～３３７、２３９～３３８、２４０～３３９、２４１～３４０、２４２～３４１、２４３～３４２、２４４～３４３、２４５～３４４、２４６～３４５、２４７～３４６、２４８～３４７、２４９～３４８、２５０～３４９、２５１～３５０、２５２～３５１、２５３～３５２、２５４～３５３、２５５～３５４、２５６～３５５、２５７～３５６、２５８～３５７、２５９～３５８、２６０～３５９、２６１～３６０、２６２～３６１、２６３～３６２、２６４～３６３、２６５～３６４、２６６～３６５、２６７～３６６、２６８～３６７、２６９～３６８、２７０～３６９、２７１～３７０、２７２～３７１、２７３～３７２、２７４～３７３、２７５～３７４、２７６～３７５、２７７～３７６、２７８～３７７、２７９～３７８、２８０～３７９、２８１～３８０、または２８２～３８１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0029】

Ｂ．トランスファープラスミド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸スタッファー配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、治療用ペプチド、調節領域、もしくはベクターバックボーン、またはそれらの組合せをコードする発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ核酸ベクターは、一本鎖または自己相補的組換えウイルスゲノムなどの一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターを含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、配列番号３２と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、配列番号３２と同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、配列番号３３と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、配列番号３３と同一の配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続グアニン塩基を有する配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ＩＴＲの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００個またはそれ以上の核酸塩基内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超える連続グアニン塩基を有する配列を含まない。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、本明細書に記載の発現カセット、少なくとも１つのＩＴＲ、およびバックボーンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、順に、第１のＩＴＲ、発現カセット、第２のＩＴＲ、およびバックボーンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ＩＴＲ、プロモーター、スプライスドナー／スプライスアクセプター部位、治療用ペプチド、ポリＡ配列、ＩＴＲ、第１のスタッファー配列、複製起点、選択マーカー、および第２のスタッファー配列を含有する。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列、第２のスタッファー配列、または第１のスタッファー配列と第２のスタッファー配列の両方は、ＣｐＧアイランドを含まず、第１のスタッファー配列、第２のスタッファー配列、または第１のスタッファー配列と第２のスタッファー配列の両方は、同じ同一性の４個を超える連続核酸塩基を含まず、第１のスタッファー配列、第２のスタッファー配列、または第１のスタッファー配列と第２のスタッファー配列の両方は、約４０％～約５０％のＧＣ含量を含み、第１のスタッファー配列、第２のスタッファー配列、または第１のスタッファー配列と第２のスタッファー配列の両方は、２０アミノ酸より大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードせず、ならびに／あるいは、第１のスタッファー配列、第２のスタッファー配列、または第１のスタッファー配列と第２のスタッファー配列の両方は、制限酵素切断部位を含まない。

【0033】

発現カセット
いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置する異種配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、２つのＩＴＲ配列の間に位置する異種配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、Ｌ－ＩＴＲ（左のＩＴＲ）とＲ－ＩＴＲ（右のＩＴＲ）との間に位置する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、Ｌ－ＩＴＲ、異種配列、およびＲ－ＩＴＲを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、発現カセットは、約３０００～約６０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、約４０００～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、約４５００～約５０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、自己相補的であるベクターであって、ベクターの発現カセットが約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有するようにスタッファー配列を含む、ベクターが提供される。

【0035】

いくつかの実施形態では、発現カセットはスタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、約１０００～約１００００、約１０００～約９０００、約１０００～約８０００、約１０００～約７０００、約１０００～約６０００、約１０００～約５０００、約１０００～約４０００、約１０００～約３０００、または約１０００～約２０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第のスタッファー配列は、約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、２２３５核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第のスタッファー配列は、配列番号７の少なくとも１００個の連続する塩基対配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、配列番号と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、発現カセットは治療用ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つの調節領域を含む。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、治療用ペプチドと調節領域との間に位置する。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドは、スタッファー配列とＲ－ＩＴＲとの間に位置する。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、治療用ペプチドとＬ－ＩＴＲとの間に位置する。

【0037】

ａ．治療用ペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶプラスミドは、診断用もしくは治療用タンパク質、ポリペプチド、または分子マーカー、 感光性オプシン、アドレナリン作動性アゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、細胞毒素、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経因子、神経因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制因子、またはそれらの任意の組合せの生物学的に活性な断片をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、感光性オプシンは、ロドプシン、メラノプシン、錐体オプシン、チャネルロドプシン、または細菌、古細菌関連オプシン、これらのいずれかの生物学的に活性な断片、またはその組合せを含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶプラスミドは、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＮＢＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＢＣＡ４、またはフラタキシンからなる群から選択される治療用ペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、ポリペプチドＲＰＥ６５、ベストロフィン（ＢＥＳＴ１）、ＲＥＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＳＯＤ２、ＭＹＯ６Ａ、ＭＦＲＰ、ＬＲＡＴ、ＫＣＮＪ１３、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＩＬ６、ＬＩＦ、ＸＩＡＰ、ＳＴＡＴＳ、ナクタロピン（ｎｙｘ）、代謝型グルタミン酸受容体６－ｍＧｌｕＲ６（Ｇｒｍ６）、一過性受容体潜在的メラスタチン１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ １）（ＴＲＰＭ１）、Ｇタンパク質共役受容体１７９（ＧＰＲ１７９）、およびＧタンパク質、Ｇβ５、βＰ３、Ｇα０_１／２、Ｇγ１３、ＲＧＳ７、ＲＧＳ１１、ＲＥＡＰ、ＭＹＯ７Ａ、ＯＰＮ１ＭＷ、ＯＰＮ１ＬＷ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ１、Ｒｈｏ、ＰＤＥ６ｂ、ＰＤＥ６ａ、ＧＮＡＴ２、ＰＤＥ６ｃ、ＲＰＧＲ、ＲＰＧＲ－ＯＲＦ１５、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＬＲＮ１、Ｕｓｈ１ｃ／Ｈａｒｍｏｎｉｎ、Ｍｔ－ＮＤ４、Ｐ１－ＮＤ４、ＣＹＰ４Ｖ２、それらの任意の組合せまたはペプチド断片をコードする核酸セグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶプラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶプラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系をコードする配列を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、治療用ペプチドをコードする配列は、配列番号４の少なくとも１００個の連続する塩基対配列と、約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４の少なくとも５０個の連続するアミノ酸とほぼ同一もしくは少なくともほぼ同一の配列を含む治療用ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３４と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３４を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３５と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３５を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３６と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３６を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３７と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３７を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３８と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号３９と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号３９を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４０と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号４０を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号４１を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４２と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号４２を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４３と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号４３を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４４と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号番号４４を含む。

【0040】

ｂ．調節領域
本開示のベクター系のいずれかは、ベクターが発現されることが意図される宿主細胞において機能的である調節エレメントを含み得る。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化エレメントが挙げられる。

【0041】

本開示のベクター系のいずれかは、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。本開示における使用が企図されるプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトミオシン７ａ遺伝子由来プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、キメラＣＭＶ／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）およびＣＢＡの切断型（ｓｍＣＢＡ）（例えば、Ｈａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２００６および米国特許８，２９８，８１８を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーター、シナプシンプロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、桿体特異的ＩＲＢＰプロモーター、ＶＭＤ２（硝子体型黄斑ジストロフィー／ベスト疾患）プロモーター、ＲＰＥ特異的硝子体型黄斑ジストロフィー２［ＶＭＤ２］プロモーター、ＥＦ１－αプロモーター配列、ＰＧＫプロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓ「ＰｌｅＸＸＸ」プロモーター、赤色／緑色錐体オプシンプロモーターＰＲ２．１およびＰＲ１．７もまた、本開示の種々の態様の実施において有用であると想定される。例示的な光受容体細胞特異的プロモーターとしては、ｈＧＲＫ１、ＩＲＢＰ、桿体オプシン、ＮＲＬ、ＧＮＡＴ２ｅ－ＩＲＢＰ、Ｌ／Ｍオプシン、および錐体アレスチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0042】

特定の実施形態では、プロモーターはキメラＣＭＶ－βアクチンプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、１つまたは１群の組織において選択的活性を示すが、他の組織では活性が低いかまたは活性がない組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは光受容体特異的プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、好ましくは、錐体細胞特異的プロモーターもしくは桿体細胞特異的プロモーター、またはそれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子のプロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、錐体トランスデューシンα（ＴαＣ）遺伝子由来プロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトＧＮＡＴ２由来プロモーターである。本開示の範囲内で企図される他のプロモーターとしては、限定されないが、ロドプシンプロモーター（ヒトまたはマウス）、ｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター、色素性網膜炎特異的プロモーター、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター［例えば、硝子体型黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（Ｂｅｓｔ１）（Ｅｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）］、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0043】

プロモーターは、分子生物学および／またはウイルス学の分野の当業者に公知の標準的な技術を用いてベクターに組み込むことができる。プロモーターの複数のコピーおよび／または複数の別個のプロモーターを本開示のベクターにおいて使用することができる。１つのそのような実施形態では、プロモーターは、その天然の遺伝的環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ転写開始部位からの距離に位置付けられ得るが、当然ながら、プロモーター活性の実質的な減少なしに、この距離におけるいくらかの変動が許容される。本開示の実施において、１つ以上の転写開始部位は、典型的には、開示されるベクター内に含まれる。

【0044】

本開示のベクターは、１つ以上の転写終結配列、１つ以上の翻訳終結配列、１つ以上のシグナルペプチド配列、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／または１つ以上のエンハンサー要素、またはそれらの任意の組合せをさらに含み得る。転写終結領域は、典型的には、真核生物またはウイルス遺伝子配列の３’非翻訳領域から得ることができる。転写終結配列は、効率的な終結を提供するために、コード配列の下流に位置し得る。いくつかの実施形態では、ベクターは自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、複数の同時発現を可能にする。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａ自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａを含む。

【0045】

開示されるポリヌクレオチドベクターのいずれも、１つ以上の転写後調節配列または１つ以上のポリアデニル化シグナル（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＲＰＥ）、ポリアデニル化シグナル配列、もしくはイントロン／エキソン接合部／スプライシングシグナルが挙げられるが、これらに限定されない）、あるいはそれらの任意の組合せをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号５と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ｐＧＨ ｐｏｌｙＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｐＧＨ ｐｏｌｙＡ配列は、配列番号６と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、イントロン／エキソン接合部／スプライシングシグナルは、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡは、配列番号３４と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0046】

シグナルペプチド配列は、例えば、特定の細胞小器官区画、またはタンパク質合成および／もしくは活性の部位、さらには細胞外環境を含む、１つ以上の翻訳後細胞目的地に操作可能に連結されるポリペプチドの位置にとって決定的な情報をコードするアミノ末端ペプチド配列である。

【0047】

エンハンサー（遺伝子転写を増加させるシス作用調節エレメント）もまた、開示されるＡＡＶベースのベクター系の１つに含まれ得る。様々なエンハンサーエレメントが関連技術分野の当業者に公知であり、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメント、ＳＶ４０エンハンサーエレメント、ならびにそれらの組合せおよび／または誘導体を含むがこれらに限定されない。目的の構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのポリアデニル化を導くまたは調節する１つ以上の核酸配列もまた、本開示のベクターの１つ以上に任意選択で含まれ得る。

【0048】

バックボーン
いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドはバックボーンを含む。いくつかの実施形態では、バックボーンは、ＩＴＲの外側のプラスミドの領域を含む。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、発現カセットの外側に位置する。いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、少なくとも約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、または約１００００核酸塩基である。いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、約４０００～約１００００、約４０００～約９０００、約４０００～約８０００、約４０００～約７０００、約４０００～約６０００、または約４０００～約５０００核酸塩基である。いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、約５０００～約１００００、約５０００～約９０００、約５０００～約８０００、約５０００～約７０００、または約５０００～約６０００核酸塩基である。いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、約１０００～約８０００、約２０００～約８０００、約３０００～約８０００、約４０００～約８０００、約５００～約８０００、または約６０００～約８０００核酸塩基である。いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、ＡＡＶ粒子への逆パッケージングを防ぐために充分に大きい。

【0049】

いくつかの実施形態では、バックボーンは複製起点を含むいくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、複製起点の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、複製起点とＩＴＲとの間に位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約２０００～約４０００核酸塩基離れるように位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約１０００～約４０００核酸塩基離れるように位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約３０００～約３５００核酸塩基離れるように位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００核酸塩基超離れるように位置する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００核酸塩基未満離れるように位置する。いくつかの実施形態では、スタッファー配列は、ＩＴＲが複製起点から約３１２４核酸塩基離れるように位置する。

【0050】

いくつかの実施形態では、バックボーン配列は、２つのスタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、Ｒ－ＩＴＲと複製起点との間に位置する。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、Ｒ－ＩＴＲと抗生物質耐性遺伝子との間に位置する。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、複製起点とＬ－ＩＴＲとの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、抗生物質耐性遺伝子とＬ－ＩＴＲとの間に位置する。いくつかの実施形態では、バックボーンは、５’から３’の順序で、第１のスタッファー配列、複製起点、抗生物質耐性遺伝子、および第２のスタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、バックボーンは、３’から５’の順序で、第１のスタッファー配列、複製起点、抗生物質耐性遺伝子、および第２のスタッファー配列を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、約１０００～約１００００、約２０００～約９０００、約３０００～約８０００、約４０００～約６０００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、約３０００～約３５００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３０２８核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、配列番号８の少なくとも１００個の連続する塩基対配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスタッファー配列は、配列番号８と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、約１００～約１０００、約１００～約９００、約１００～約８００、約１００～約７００、約１００～約６００、約１００～約５００、約１００～約４００、約１００～約３００、または約１００～約２００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、約１００～約５００核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸スタッファー配列は、約３８１核酸塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、配列番号１１の少なくとも１００個の連続する塩基対配列と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のスタッファー配列は、配列番号１１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、抗生物質遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶプラスミドは、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子を含まない。

【0054】

いくつかの実施形態では、選択マーカーは、非抗生物質選択系である。いくつかの実施形態では、非抗生物質選択系は、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列およびＲ６Ｋ配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、バックボーンは、１つ以下の複製起点を有する。いくつかの実施形態では、バックボーンは、Ｍ１３複製起点を有していない。

【0056】

ＩＴＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプラスミドは、逆位反復（ＩＴＲ）を含む少なくとも１つの配列を含む。ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来し得るか、または複数の血清型に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの実施形態では、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来する。他の実施形態では、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０に由来する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、カプシド（例えば、ＡＡＶ３ ＩＴＲ配列およびＡＡＶ３カプシドなど）と同じ血清型である。

【0057】

ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは当該技術分野で公知であり、市販で入手可能である（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．； Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．； Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａ；およびＡｄｄｇｅｎｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．による製品とサービスが利用可能であり、および骨格筋への遺伝子送達は、治療用タンパク質の持続的発現と全身送達とをもたらしたことを参考にされたい）。いくつかの実施形態では、核酸ベクトルはｐＴＲ－ＵＦ－１１プラスミドバックボーンを含み、それはＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するプラスミドである。このプラスミドはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販で入手可能である（ＡＴＣＣ ＭＢＡ－３３１）。

【0058】

いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号５１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。

【0059】

Ｃ．トリプルトランスフェクション系
ある態様では、ＡＡＶプラスミドの産生のためのトリプルプラスミドトランスフェクション系が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、トリプルプラスミドトランスフェクション系は、本明細書に記載のＡＡＶベクタープラスミド、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドおよびヘルパープラスミドを含む。

【0060】

ある態様では、ＡＡＶプラスミドの産生のためのダブルプラスミドトランスフェクション系が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ダブルプラスミドトランスフェクション系は、本明細書に記載のＡＡＶベクタープラスミド（トランスファープラスミドとも呼ばれる）およびヘルパープラスミドを含み、ヘルパープラスミドはｒｅｐ／ｃａｐ配列を含む。

【0061】

単に例示として、トリプルプラスミド系またはダブルプラスミドトランスフェクション系のいずれかを使用して、同じＡＡＶプラスミドを産生することができる。一例では、トリプルトランスフェクション系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたｐＴＲ－ＵＦ１１（ＣＢＡ－ＧＦＰ）（配列番号４５）、ヘルパープラスミドｐＡＬＤ－Ｘ８０（配列番号４７）、およびｒｅｐ／ｃａｐプラスミドｐＡＣＧ２（配列番号４６）を含む。別の実施形態では、２プラスミド系は、ｐＴＲ－ＵＦ１１（ＣＢＡ－ＧＦＰ）（配列番号４５）およびｐＤＧ（配列番号４８）からなる。プラスミドｐＤＧは、ＡＡＶ２ ｒｅｐ／ｃａｐの発現を駆動するエレメントも含有するヘルパープラスミドである。これらの３プラスミド系および２プラスミド系の結果は、同じＡＡＶ２－ＧＦＰ産物をもたらす。

【0062】

ヘルパープラスミド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、ヘルパープラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ、ｅ３遺伝子、Ｅ５遺伝子、Ｆｉｂｅｒ遺伝子、もしくはＶＡ遺伝子、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、変異Ｆｉｂｅｒ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｉｂｅｒ遺伝子は、配列番号１２に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｉｂｅｒ遺伝子は、配列番号１３に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドはＦｉｂｅｒ遺伝子を含まない。

【0063】

いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、またはｐＤＰ８．ａｐｅプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは、配列番号４７に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドは配列番号４７を含む。

【0064】

Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の系は、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（本明細書に記載の改変ＶＰ３領域を含めて、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする）を含むｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは、ｒＡＡＶ粒子がパッケージングされ、続いて精製され得るように、プロデューサー細胞株にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは、配列番号４６に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは配列番号４６を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１２に由来するｒｅｐ遺伝子である。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ２－６である。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子は、配列番号４９に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子は配列番号４９を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ１２に由来する。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質を産生するように遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０を含む。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、配列番号５０に対して約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子は配列番号５０を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない多数の異なる血清型に由来する改善されたｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１に明記される。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を備える。

【0068】

いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号２２に明記される野生型ＡＡＶ２カプシドのアミノ酸残基に非天然アミノ酸置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸置換は、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号２６に明記される野生型ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸残基に非天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸置換は、Ｙ４４５Ｆ、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、Ｔ４９２Ｖ、Ｓ６６３Ｖまたはそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ２の変異体であるＡＡＶ２Ｇ９を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号２８に明記される野生型ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸残基５３３に非天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸置換は、Ｅ５３３Ｋ、Ｙ７３３Ｆ、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８の変異体であるＡＡＶ７ＢＰ２を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号２２に明記される野生型ＡＡＶ２カプシドの非天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、

【0072】

（ａ）Ｙ４４４Ｆ、

【0073】

（ｂ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ、

【0074】

（ｃ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ、

【0075】

（ｄ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ、または

【0076】

（ｅ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ、あるいは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３０にそれぞれ明記される野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のカプシドタンパク質のいずれか１つにおいてこれらに対応する等価なアミノ酸位置のうちの１つ以上を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、カプシドは、配列番号２６に明記される野生型ＡＡＶ６カプシドの非天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、

【0078】

（ａ）Ｙ４４５Ｆ、

【0079】

（ｂ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ、

【0080】

（ｃ）Ｔ４９２Ｖ、

【0081】

（ｄ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ、

【0082】

（ｅ）Ｓ６６３Ｖ、または

【0083】

（ｆ）Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ
のうちの１つ以上を含む。

【0084】

様々な実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下のカプシド、すなわち、ＡＡＶ２のカプシド変異体、ＤＧＥ－ＤＦ（「Ｖ１Ｖ４ ＶＲ－Ｖ」としても知られる）、Ｐ２－Ｖ２、Ｐ２－Ｖ３、Ｐ２－Ｖ１（ＭＥ－Ｂとしても知られる）およびＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）の１つを含む。ＤＧＥ－ＤＦカプシド変異体は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸位置４９２、４９３、４９４、４９９、および５００に、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびフェニルアラニンを含有する。Ｐ２－Ｖ２カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の位置２６３、４９０、４９２、４９９、５００、および５３０に、アラニン、トレオニン、プロリン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸を含有する。Ｐ２－Ｖ３カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の位置２６３、２６４、４４４、４５１、４５４、４５５、４５９、５２７、５３０、および５３１に、アスパラギン、アラニン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、バリン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン酸、およびアスパラギン酸を含有する。ＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１（配列番号２２）の位置４９２、４９３、４９４、４９９、および５００に、それぞれアスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびフェニルアラニンを、ＡＡＶ２ ＶＰ１の位置５４６～５５６にＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ（配列番号５２）を、ならびに以下の置換、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、およびＴ４９１Ｖを、含有する。

【0085】

他の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ６（３ｐＭｕｔ）、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹＦ＋Ｔ－Ｖ）、またはＡＡＶ２（ｔｒｐＹＦ）から選択されるカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、国際公開ＷＯ２０１８／１５６６５４に記載されるカプシド変異体のいずれかを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、網膜細胞における上記ｒＡＡＶ粒子の増強された形質導入のためのＤＧＥ－ＤＦカプシド、Ｐ２－Ｖ２カプシド、Ｐ２－Ｖ３カプシド、またはＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）カプシドを含むカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）およびＡＡＶ２（Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ）、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｓ６６３Ｖ）、ＡＡＶ６（Ｔ４９２Ｖ）、またはＡＡＶ６（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）から選択されるカプシドを含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶポリヌクレオチドまたは核酸ベクターは、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、またはＡＡＶ血清型１０、ＡＡＶ４４９．５（Ｅ５３１Ｄ）、またはウイルス分野の当業者に公知の任意の他の血清型からなる群から選択される血清型を有するビリオン内に含まれ得る。

【0088】

産生
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子産生の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘルパープラスミドが産生または獲得される。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドおよびｒｅｐ／ｃａｐプラスミドが産生または獲得される。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘルパープラスミドは、所望のＡＡＶ血清型ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子のためのｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、所望のＡＡＶ血清型ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦは、それらの天然プロモーターの転写制御下にある。いくつかの実施形態では、ｃａｐ ＯＲＦは、本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質を生成するための１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）は、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー分子を介して、ヘルパープラスミドおよび本明細書に記載の核酸ベクターを含有するプラスミドをトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも約６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ粒子産生を可能にする。いくつかの実施形態では、次いで細胞を少なくとも６０時間インキュベートしてｒＡＡＶ粒子産生を可能にする。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は精製される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、イオジキサノール段階勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって精製される。

【0089】

ＩＩ．方法
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子治療および本開示のＡＡＶベースのデュアルベクター系を使用して、ヒトまたは動物における眼疾患などの疾患または疾病を処置または改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、本開示の方法は、疾患または疾病の処置または改善に寄与するポリペプチドをコードする本開示のベクター系を投与する工程を含む。特定の実施形態では、本開示のベクターは、ＡＡＶウイルスまたはビリオンにおいて提供される。ベクター系は、インビボまたはエクスビボで投与することができる。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター構築物は、硝子体内注射、網膜下注射、経口、非経口、眼内、静脈内、鼻腔内、関節内、筋肉内、皮下、ｓｕｂＩＬＭ（ベクターは内境界膜と網膜との間に配置される）、またはそれらの組合せを介して投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター構築物は、対象に単回投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター構築物は、１つ以上の投与期間、例えば、少なくとも１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、または少なくとも１年に１回、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターベースの治療薬は、処置または処置される疾患もしくは障害の１つ以上の症状の改善を達成するのに必要であり得るとき、毎、毎週、毎月、またはより少ない頻度の間隔で１回以上、継続して提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、単回または複数回、例えば、毎日、毎週、隔週、または毎月、毎時間投与され得るか、あるいは処置される疾患、障害、または疾病の再発、ぶり返し、または進行時に投与される。

【0091】

いくつかの実施形態では、ベクター系は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．３９４（２０２０）１０７８８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、重力に敏感な２つの嚢様耳石器官のうちの１つである卵形嚢への注射によって、例えば耳の有毛細胞に投与される。例えば、耳の有毛細胞への投与は、正円窓注射によるか、または蝸牛インプラント手術中であり得る。特定の実施形態では、本開示のベクター系は、眼内、硝子体内、または網膜下注射によってヒトまたは動物に投与される。

【0092】

いくつかの実施形態では、開示されるベクター、ビリオン、または組成物のいずれかの、必要とする対象への投与は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるメラノソーム遊走の部分的または完全な回復をもたらす。例示的な実施形態において、ポリヌクレオチドベクター系、ビリオン、または組成物のいずれかの投与は、視力喪失の部分的または完全な回復をもたらす。

【0093】

いくつかの実施形態では、記載のｒＡＡＶ粒子またはベクター、ビリオン、発現系、組成物、および宿主細胞の使用の方法であって、動物の、具体的には眼における、疾患、機能不全、障害、異常状態、欠陥、損傷、または外傷の少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、処置、または改善するための、医薬の調製における、使用の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、方法は、必要とする哺乳動物の片眼または両眼の硝子体に、記載のベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、組成物、またはその複数種の１つ以上を、罹患した当該動物の片眼または両眼におけるそのような疾患、機能障害、障害、異常状態、欠陥、損傷、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、処置、または軽減するのに充分な量および時間で直接投与することを含む。

【0094】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の粒子、ベクター、ビリオン、発現系、組成物、および宿主細胞の使用の方法であって、哺乳動物の眼における様々な欠陥、具体的にはヒト光受容体もしくはＲＰＥ細胞における１つ以上の欠陥の、症状を処置もしくは改善するための方法における、または症状を処置もしくは改善するための医薬の調製における、使用の方法を提供する。いくつかの実施形態では、症状の処置または改善の対象となる眼の疾患および障害（例えば、ＰＲまたはＲＰＥ細胞における１つ以上の遺伝的欠陥によって引き起こされる）は、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ベスト病、シュタルガルト病、アッシャー症候群、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜症、アクロマトーシス、コレドール血症、バルデット・ビール症候群、常染色体優性臍帯筋ジストロフィー（ＣＯＲＤ６）、原発性開放隅角緑内障を含む緑内障、フライドリヒ運動失調症、グリコーゲン蓄積症（眼症状）、先天性定常夜盲、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、またはビッティ結晶ジストロフィーを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の記載の粒子ベクター、ビリオン、宿主細胞、または組成物を、罹患した哺乳動物におけるそのような欠陥の症状を処置または改善するのに充分な量および時間で、必要とする対象の片眼または両眼へ硝子体内投与または網膜下投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、そのような疾病を有することが疑われる動物の予防的処置、またはそのような疾病を発症するリスクがある動物へのそのような組成物の、診断後または症状発症前における、投与を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、キメラウイルス／非ウイルスナノ粒子中に含まれない。

【0095】

ＩＩＩ．医薬組成物
注射または注入に適した医薬剤形としては、活性成分を含む滅菌水溶液または分散液または滅菌粉末が挙げられ得、これらは、任意選択でリポソーム中に封入された滅菌注射用または注入用溶液または分散液の即時調製に適合される。最終的な剤形は、製造および保存の条件下で、無菌、流動性、および安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどの）ポリオール、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。任意選択で、微生物の作用の防止は、様々な他の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。

【0096】

本開示はまた、本開示のベクター系を薬学的に許容可能な担体と組合せて含む医薬組成物を提供する。ある量の化合物を含んで局所または非経口投与に適合された医薬組成物は、本開示の好ましい実施形態を構成する。本開示の文脈において患者、特にヒトに投与される用量は、致死的な毒性を伴わずに、好ましくは引き起こす副作用または罹病が許容可能なレベル以下で、患者において妥当な時間枠にわたって治療応答を達成するのに充分であるべきである。当業者は、投与量が、対象の状態（健康）、対象の体重、（もしあれば）併用処置の種類、処置の頻度、治療可能比（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｔｉｏ）、ならびに病理学的状態の重症度および段階を含む、種々の要因に依存することを認識するであろう。

【0097】

本開示はまた、１つ以上の容器中に本開示のベクター系を含むキットを提供する。本開示のキットは、薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を任意選択で含むことができる。特定の実施形態では、本開示のキットは、本明細書に記載されるような１つ以上の他の成分、アジュバント、またはアジュバントを含む。特定の実施形態では、本開示のキットは、選択された哺乳動物レシピエントにキット内に包含されたベクター系を投与する方法を記載する説明書または包装材料を含む。

【0098】

開示されるキットの容器は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属等、および任意の好適なサイズ、形状、または構成であってもよい。特定の実施形態では、本開示のベクター系は、キット内に固体として提供される。別の実施形態では、本開示のベクター系は、キット内に液体または溶液として提供される。いくつかの実施形態では、キットは、適切な液体または溶液の形態で本開示のベクター系を収容する１つ以上のアンプルまたはシリンジを含み得る。

【0099】

開示されるデュアルベクター（前半ベクターおよび後半ベクター）のいずれかの予備混合物を含有するキットが、本明細書においてさらに企図される。これらの予備混合物は、適切な液体または溶液形態の単一の容器および／または単一の薬物製品中にあってもよい。

【0100】

本開示はまた、疾病、障害、もしくは機能不全の処置、防止、および／または予防、ならびにそのような疾患、障害、もしくは機能不全の１つ以上の症状の改善を含めて、しかしこれらに限定されずに、疾病、障害、機能不全、損傷、もしくは外傷の症状を処置するか、予防するか、改善するための薬物の製造における本開示のバッファーおよび組成物の使用を提供する。

【0101】

ＡＡＶ組成物の量およびそのような組成物の投与時間は、本発明の教示の利益を有する当業者の権限の内にある。開示される組成物の治療有効量の投与は、単回投与、例えば、そのような処置を受ける患者に治療的利益を提供するのに充分な数の感染性粒子の単回注射によって達成され得る。あるいは、いくつかの状況において、このような組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い期間にわたってか、比較的長い期間にわたってかのいずれかで、ＡＡＶベクター組成物の複数回または連続投与を提供することが望ましくあり得る。

【0102】

例えば、哺乳動物に投与される感染性粒子の数は、およそ１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、またはさらに高い感染性粒子数／ｍＬであり得、処置される特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得るように、単回用量として（または２回以上の投与に分割されるなどのいずれかで）与えられ得る。実際、いくつかの実施形態では、特定のレジメンまたは治療の所望の効果を達成するために、２つ以上の異なるｒＡＡＶ粒子またはベクターベースの組成物を、それらだけで、または１つ以上の他の診断剤、薬物、生物活性剤などと組合せて、投与することが望ましい場合がある。

【0103】

本開示に従って治療剤を発現させるために、１つ以上のプロモーターの制御下にある、治療剤をコードする核酸セグメントを含むｒＡＡＶ粒子を調製し得る。配列をプロモーター「の制御下」に置くために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、一般には選択されたプロモーターの約１～約５０ヌクレオチド「下流」（例えば、その３’）に位置させる。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたポリペプチドの発現を促進する。これが、この文脈における「組換え発現」の意味である。いくつかの実施形態では、組換えベクター構築物は、１つ以上の診断剤および／または治療剤をコードする少なくとも１つの核酸セグメントに操作可能に連結されたＲＰＥ細胞特異的プロモーターまたは光受容体細胞特異的プロモーターを含有するカプシド－タンパク質修飾ｒＡＡＶベクターを含むものである。

【0104】

このようなベクターの使用が、１つ以上の外因性タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ベクターでトランスフェクトされる特定の細胞への導入のために企図される場合、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを選択された宿主細胞に、例えば、哺乳動物の眼内の１つ以上の選択された細胞に送達するために、本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子を採用してもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、網膜神経節細胞、ミュラーグリア、双極細胞、星状細胞、アマクリン細胞、小柱網細胞、光受容体細胞、または網膜色素上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は光受容体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。

【0105】

いくつかの実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子の数は、１０^６～１０^１４粒子／ｍｌの範囲または１０^３～１０^１５粒子／ｍｌの範囲のオーダーであり得る。一実施形態では、１０^１３粒子／ｍｌより高い数のウイルス粒子が投与され得る。いくつかの実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子の数は、１０^６～１０^１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍｌの範囲または１０^３～１０^１５ｖｇｓ／ｍｌの範囲のオーダーであり得る。一実施形態では、１０^１３ｖｇｓ／ｍｌより高い数のウイルス粒子が投与される。ウイルス粒子は、処置される特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得る場合、単回用量として投与され得るか、または２回以上の投与に分割され得る。

【0106】

いくつかの実施形態では、本開示は、薬学的に許容可能な溶液中の、本明細書に記載の１つ以上のウイルスベースの組成物の製剤であって、単独または１つ以上の他の治療モダリティとの組合せのいずれかで、細胞または動物に投与するための、特に、ヒト細胞、組織、およびヒトに影響を及ぼす疾患の治療のための、製剤を提供する。

【0107】

所望される場合、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子は、例えば、タンパク質もしくはポリペプチドもしくは様々な薬学的に活性な薬剤などの、他の薬剤と組合せて同様に投与され得、治療用ポリペプチド、生物学的に活性な断片、またはそれらの変異体の１以上の全身または局所の投与を含む。実際に、追加の薬剤が標的細胞または宿主組織との接触時に有意な有害作用を引き起こさないとした場合、含まれてもよい他の成分には事実上制限はない。したがって、ｒＡＡＶ粒子は、特定の場合において必要とされる様々な他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製されてもよく、あるいは本明細書に記載されるように化学的に合成されてもよい。

【0108】

薬学的に許容可能な緩衝剤、賦形剤、および担体溶液の製剤化は、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載の特定の組成物の使用にとってふさわしい投与量および処置レジメンの開発として当業者に周知であり、例えば、経口、非経口、眼内（例えば、網膜下または硝子体内）、静脈内、鼻内、関節内、卵形嚢内、蝸牛内および筋肉内投与および製剤化が挙げられる。

【0109】

典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を含有し得るが、活性成分のパーセンテージは、当然ながら変動し得、都合よく、全製剤の重量または体積の約１もしくは２％～約７０％もしくは８０％、またはそれ以上であり得る。当然ながら、調製され得る各治療的に有用な組成物中の治療剤の量は、適切な投与量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるようなものである。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、ならびに他の薬理学的考慮事項などの因子は、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。

【0110】

用語「賦形剤」は、それと共にｒＡＡＶ粒子が投与される希釈剤、アジュバント、担体、またはビヒクルを指す。このような薬学的賦形剤は、水および油などの滅菌液体であり得、鉱油などの石油、落花生油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油を含む。生理食塩水溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として用いることができる。例示的な賦形剤およびビヒクルとしては、ＨＡ、ＢＳＳ、人工ＣＳＦ、ＰＢＳ、乳酸リンゲル液、ＴＭＮ２００溶液、ポリソルベート２０、およびポロキサマー１００が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

ｒＡＡＶ粒子組成物の量およびそのような組成物の投与時間は、本発明の教示の利益を有する当業者の権限の内にある。しかし、開示される組成物の治療有効量の投与は、単回投与、例えば、そのような処置を受ける患者に治療的利益を提供するのに充分な数のウイルス粒子の単回注射によって達成される可能性が高い。あるいは、いくつかの状況において、このような組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い期間にわたってか、比較的長い期間にわたってかのいずれかで、組成物の複数回または連続投与を提供することが望ましくあり得る。

【0112】

例示的な組成物は、ｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターを、単独で、または天然もしくは組換えの供給源から取得され得るかもしくは化学的に合成され得る１つ以上のさらなる活性成分との組合せでのいずれかで含み得る。

【0113】

ＩＶ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、ならびに他の技術用語および科学用語または用語は、特許請求される主題が関係する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、通常に理解される意味を有する用語が、明確にするために、および／または容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書でのそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野で一般に理解されるものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。

【0114】

本出願を通して、様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示していると見なすべきである。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。

【0115】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示がない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「試料」は、複数の試料、それらの混合物を含む。

【0116】

用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「査定する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、および「分析する（ａｎａｌｙｚｉｎｇ）」は、しばしば、測定の形態に言及するために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、要素が存在するか否かを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的、定性的、または定量的かつ定性的な決定を含むことができる。査定することは、相対的または絶対的であり得る。「存在を検出すること」は、文脈に応じて、存在しているかまたは存在していないかを決定することに加えて、存在する何かの量を決定することを含むことができる。

【0117】

用語「対象」、「個体」、または「患者」は、しばしば、本明細書において互換的に使用される。「対象」は、発現された遺伝物質を含む生物学的実体であり得る。生物学的実体は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、および原生動物を含む、植物、動物、または微生物であり得る。対象は、インビボで得られるかまたはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫であり得る。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。対象は、疾患の危険性が高いと診断または疑われ得る。場合によっては、被験体は、必ずしも疾患の危険性が高いと診断または疑われない。

【0118】

用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。

【0119】

用語「エクスビボ」は、対象の体外で起こる事象を説明するために使用される。エクスビボアッセイは、対象に対して実施されない。むしろ、それは、対象から分離された試料に対して行われる。試料に対して行われるエクスビボアッセイの例は、「インビトロ」アッセイである。

【0120】

用語「インビトロ」は、材料が得られる生物学的供給源から分離されるように、実験室試薬を保持するための容器に収容されて起こる事象を記載するために使用される。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が用いられる細胞ベースのアッセイを包含し得る。インビトロアッセイはまた、完全な細胞を使用しない無細胞アッセイを包含し得る。

【0121】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、その数±その数の１０％を指す。用語「約」は、ある範囲の最低値の１０％マイナスおよび最高値の１０％プラスの範囲を指す。

【0122】

本明細書中で使用される場合、用語「処置」または「処置する」は、レシピエントにおいて有益なまたは所望の結果を得るための薬学的レジメンまたは他の介入レジメンに関して使用される。有益なまたは所望の結果には、治療的利益および／または予防的利益が含まれるが、これらに限定されない。治療的利益は、処置される症状または基礎疾患の根絶または改善を指し得る。また、治療的利益は、対象が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、基礎障害に関連する生理学的症状の１つまたは複数の根絶または改善によって達成することができる。予防的効果には、疾患または疾病の出現の遅延、予防、または排除、疾患または疾病の症状の発症の遅延または排除、疾患または疾病の進行の遅延、停止、または逆転、またはそれらの任意の組合せが含まれる。予防的利益のために、特定の疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象が、たとえこの疾患の診断が行われていないとしても、処置を受ける場合がある。

【0123】

本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、転写を調節する核酸配列の領域または複数の領域を指す。

【0124】

「調節エレメント」という用語は、本明細書で使用する場合、転写を調節する核酸配列の領域または複数の領域を指す。例示的な調節エレメントとしては、エンハンサー、転写後エレメント、転写制御配列などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞内で複製する能力がある、および／または別の核酸セグメントが、付着セグメントの複製をもたらすように操作可能にそこに連結され得る、核酸分子（典型的には、ＤＮＡから構成される）を指す。プラスミド、コスミド、またはウイルスは、例示的なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶプラスミドである。

【0126】

本明細書で使用される場合、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列、またはタンパク質配列の文脈における「実質的に同一」または「実質的に同一性」という語句は、最大の対応について比較およびアラインメントしたとき、後述の配列比較アルゴリズムの１つを使用する測定、または目視検査による測定で、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１ ％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１ ％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基同一性を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0127】

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法のなどのツールによって、ならびに任意選択でＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）の一部として入手可能なＴＦＡＳＴＡなどの、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によって行われる。試験配列および参照配列のアラインメントされたセグメントの「同一性画分」は、２つのアラインメントされた配列によって共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分中の成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性画分に１００を乗じたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその部分、またはより長いポリヌクレオチド配列に対する比較である。いくつかの例では、「同一性パーセント」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０およびポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される。

【0128】

参照ポリペプチド配列に対するパーセント（％）配列同一性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、公知の様々な方法で達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、％アミノ酸配列同定値は、配列比較プログラムＡＬＩＧＮ２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、米国著作権局（Ｕ．Ｓ． Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ）、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９にユーザ文書とともに提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ カリフォルニア州サンフランシスコから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティング系での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。

【0129】

ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、に対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、一定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、に対する、同一性と言い換えられる）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙを１００倍し、式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢの配列において同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。なお、アミノ酸配列Ａの長さは、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくはなく、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくならないことは、理解されよう。特に断らない限り、本明細書で使用される全て％アミノ酸配列の同一性値は、すぐ前の段落で説明されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0130】

本明細書で使用される節見出しは、編成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0131】

以下の実施例は、例示目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0132】

実施例１ アンピシリンおよび抗生物質耐性細胞におけるＩＴＲの喪失
ＩＴＲプラスミドの産生は、複製エラーに対して脆弱である。ＩＴＲは、カナマイシン耐性適合細胞株において非常に不安定である。ＩＴＲを含有するＡＡＶプラスミドを、カナマイシン耐性Ｅｎｄｕｒａ細胞およびアンピシリン耐性ＳＵＲＥ細胞において増幅した。精製されたプラスミドをＳｍａＩで線状化し、図１Ａのレーン１によって示されるように、２０００から３０００塩基対の間の２つのバンドおよび５００から７００塩基対の間の３つのバンドを得た。プラスミド内のＩＴＲの喪失は、５０００ｂｐのバンドに表れる。アンピシリン耐性細胞において増幅されたプラスミド（図１Ｂ）は、カナマイシン耐性細胞において増幅されたプラスミド（図１Ｃ）よりも、５０００ｂｐのバンドによって示されるように、ＩＴＲのより強い低下を示した。

【0133】

図２Ａ（矢印）に示すｐｏｌｙＧ／Ｃ配列をカナマイシン耐性プラスミドから除去した。さらに、Ｒ－ＩＴＲに隣接するｐｏｌｙＣランを除去した。プラスミドをＳｍａＩで消化し、ゲル上で泳動して、ＩＴＲＳの安定性を同定した。図２Ｂに示されるように、ＩＴＲ安定性は、ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列の除去によって改善された（図２Ｂを図１Ｂと比較せよ）。

【0134】

実施例２ スタッファー配列を用いた逆パッケージングの防止
ｒＡＡＶカセットをパッケージングする効率は、図３に示されるように、空カプシドおよび逆パッケージングされたバックボーン配列の産生によって低下する。スタッファー配列は、バックボーンのサイズを増大させて逆パッケージングを低減するように設計した。まず、スタッファーＤＮＡ配列をランダムに生成した。次に、２０アミノ酸より大きい全てのオープンリーディングフレームを変異させた。次に、ＣｐＧアイランドがもはや検出可能でなくなるまで、ＣｐＧアイランドを変異させた。次に、大部分の制限酵素部位を除去した。次に、４核酸塩基を超える反復ストリングを除去した。

【0135】

図４Ａに示すように、スタッファー配列を、起点の５’に位置する部位でバックボーンに挿入した。プラスミドを単離し、ＳｍａＩで消化して、ＩＴＲ安定性に対する効果を特定した。図４Ｂに示すように、より大きなＩＴＲ損失が観察された。

【0136】

第２のプラスミドを、図５Ａに示すように設計した。スタッファーは複製起点の３’に位置する。耐性遺伝子を標準化ＫａｎＲに改変した。Ｍ１３複製起点を除去した。ＩＴＲ安定性を決定するために、プラスミドを単離し、ＳｍａＩで消化した。図５Ｂに示すように、ＩＴＲ損失はほとんどまたは全く観察されなかった。

【0137】

ｐｏｌｙＧ／Ｃ配列を、図５Ｂに示すプラスミドに再導入した。プラスミドをカナマイシン耐性細胞中で増幅し、単離し、ＳｍａＩで消化した。図６に示すように、ＩＴＲ損失が観察された。これは、スタッファー配置およびｐｏｌｙＧ／Ｃ除去の両方がＩＴＲ安定性の増強のために必要であることを示す。

【0138】

実施例３ 修飾されたトランスファープラスミドバックボーンの安定性
元のトランスファープラスミドをＳＵＲＥ細胞中で増幅した。最終トランスファープラスミド（図５Ａ）をＥｎｄｕｒａ細胞中で増幅した。１０ｍｇのＤＮＡを産生し、単離した。プラスミドをＳｍａＩまたはＡｄｈＩのいずれかで消化した。元のＳｍａＩプラスミドは、図７に示すように、修飾プラスミドよりも大きな損失を示した。

【0139】

実施例４ ヒトレチノスキシンの発現のための３－プラスミド系の使用
トランスファープラスミド
このプラスミドは、網膜においてヒトレチノシシン（ｈＲＳ１）を発現するように設計された一本鎖ｒＡＡＶゲノムを生成する。制限酵素分子クローニングを容易にするために、４つの同義置換を含むデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成ＲＳ１ ｃＤＮＡを作製した。ヒトＲＳ１の発現は、ＳＶ４０イントロンの除去後に細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進するＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプターに連結されたｈＧＲＫ１プロモーターによって桿体および錐体光受容体において特異的に駆動される。翻訳は、ｈＲＳ１ｓｙｎ開始コドンの直前へのコンセンサス配列であるコザック配列の組み込みによって増強され、転写物の安定性は、ｈＲＳ１ｓｙｎオープンリーディングフレームの直後にＷＰＲＥを含めることによって増強される。使用したＷＰＲＥのバージョンは、推定Ｘタンパク質ＯＲＦ１４、１５の発現を除去するように設計された変異を含有する。発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）で終わる。

【0140】

プラスミドの最初の構築は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ｈＧＲＫ１プロモーター、ＳＶ４０ ＳＤ／ＳＡ、およびｂＧＨ ｐｏｌｙＡを含有する先に使用したＡＡＶベクタープラスミドへの先述のヒトＲＳ１ｓｙｎ中へのクローニングによって開始した。後にＷＰＲＥをｐＪＥＴ－ＷＰＲＥの位置にクローニングして、ｐＴＲ－Ｘ００２（ｐＴＲ－ＧＲＫ１－ＲＳ１ ｓｙｎ－ＷＰＲＥ）を作製した。小さいサイズのベクター（２，３１ｌｂｐ）は、異常なパッケージングの可能性のために望ましくなく、したがって、不活性スタッファー配列をｂＧＨ ｐｏｌｙＡに３’付加して、野生型ＡＡＶゲノムの最適なパッケージングサイズに近い４，５４９ｂｐベクターカセットを作製した。２，２３４ｂｐのスタッファー配列は、ランダムＤＮＡジェネレーター（ｍｏｌｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ）を使用してインシリコ設計し、そしてセンス／アンチセンス鎖両方における２０アミノ酸より大きいすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を除外し、ＣｐＧアイランドを枯渇させ、４ヌクレオチドより大きい反復配列を除外するようにキュレーションした。この配列をデノボ合成し、ＳａｃＥＳｐｈＩ制限酵素クローニングを用いてクローニングし、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡの３’末端にスタッファー配列を配置してｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ（図８Ｂ）を作製した。次いでこのカセットをＡＡＶ．ＳＰＲにパッケージングし、ＲＳ１ＫＯマウスモデルにおいて元のスタッファーなし（ｕｎｓｔｕｆｆｅｄ）カセットと比較して有効性の改善があることを判定した。最終バージョンのプラスミド（ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲ）を作製するために、カナマイシン耐性バックボーン（ｐＵＣ５７－ＫａｎＲ由来）をデノボ合成して追加のスタッファー配列（内部ｒＡＡＶカセットスタッファーとは区別される）を含有させ、２つのＰａｃＩ制限部位を使用してクローニングした。この大きなバックボーン（５，８０８ｂｐのＩＴＲ－ＩＴＲ）は、ｒＡＡＶパッケージングの容量を超過することによって逆パッケージングを防止するように設計された。Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ配列決定コア（マサチューセッツ州ボストン）にて完全プラスミド次世代シーケンシングによって全プラスミドを配列検証した。ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲプラスミドの注釈付きマップを（図８Ａ）に示し、クローニング戦略を説明する図解を図８Ｂに示す。

【0141】

ベクタースタッファー分子配列
２，２３４ｂｐスタッファー配列は、Ａｔｓｅｎａ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにてランダムＤＮＡジェネレーター（ｍｏｌｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ）を使用してインシリコ設計し、そしてセンス／アンチセンス鎖両方における２０アミノ酸より大きいすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を除外し、ＣｐＧアイランドを枯渇させ、４ヌクレオチドより大きい反復配列を除外するようにキュレーションした。このスタッファー配列とバックボーンスタッファー配列は、ランダムＤＮＡジェネレーターの異なるランに由来する別個のものである。

【0142】

ＡＡＶ－ＳＰＲ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド ｐＣ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｒ
前駆ＡＡＶ２ ｒｅｐ－ＡＡＶ．ＳＰＲプラスミドであるｐＣＡＡＶ．ＳＰＲを構築した。ＡＡＶ２ ＶＰ１コード配列がＡＡＶ．ＳＰＲコード配列に置換されたｐＡＣＧ２からｐＣＡＡＶ．ＳＰＲを構築した。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は両方とも、内因性ＡＡＶプロモーターエレメントの制御下にある。ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３をコードするＡＡＶ．ＳＰＲ ｃａｐ配列はデノボ合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＮＪ）によって作製された。

【0143】

元のｐＣＡＡＶ．ＳＰＲバックボーンは、アンピシリン選択マーカー（ＡｍｐＲ）およびｐＡＣＧ２の構築に関連する不要なレガシー配列を含有した。制限酵素クローニングおよびライゲーション非依存性クローニング法を用いてプラスミドを改変して、不必要な配列を除去し、複製起点およびＡｍｐＲをカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子およびｐＵＣ５７－ＫａｎＲ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）由来の複製起点で置き換えた。この最終的なｐＣＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｒプラスミド（図８Ｃ）は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌシーケンシングコアでの次世代シーケンシングによって完全に検証され、正確にパッケージングすることが小規模モデルにおいて検証されている。ｐＣＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｒプラスミドの注釈付きマップを図８Ｃに示す。

【0144】

ヘルパープラスミド ｐＡＬＤ－Ｘ８０
ヘルパープラスミドＤＮＡは、野生型ウイルス共感染を必要とせずにベクター産生を支援するように、細胞にアデノウイルス５型由来のＥ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡヘルパー遺伝子を提供した。ｐＡＬＤ－Ｘ８０プラスミドの注釈付きマップを図８Ｄに示す。

【0145】

実施例５ スタッファー配列を有するｈＲＳ１含有ｒＡＡＶベクターの評価
この研究は、効率的なパッケージングをもたらすゲノムサイズを有する最適化されたｈＲＳ１含有ＡＡＶ．ＳＰＲベクターを評価するために行われた。目標は、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１と少なくとも同程度に有効である構築物を同定することであった。

【0146】

ｐＴＲ－Ｘ００１の小さいパッケージングサイズ（１７２３ｂｐ）および異種ゲノムパッケージングの可能性のために、ＡＡＶの天然の担持用量（ＩＴＲカセットに対して約４．７ＫｂのＩＴＲ）に迫るカセットサイズを有するいくつかの新しい構築物を設計した。これは、ベクターカセット内に５’から（Ｘ００１－５ｐ）、または３’から（Ｘ００１－３ｐ）のいずれからｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１－ｓｙｎ－ｂＧＨ ｐｏｌｙＡまで挿入される不活性スタッファー配列（それぞれｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐおよびｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ）の添加によって達成された。スタッファーＤＮＡはデノボ合成された（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）。さらに、ｈＲＳ１ｓｙｎとｂＧＨ ｐｏｌｙＡとの間に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を組み込んだバージョン（ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ）を作製した。使用されたＷＰＲＥの変異型は、他の眼の遺伝子治療臨床試験において使用されたＡＡＶベクターに以前組み込まれている。ｒＡＡＶ．ＳＰＲベクターは、これらの発現カセットをパッケージングすることによって産生され、ベクターゲノムは、４５３４～４５４９ヌクレオチドのサイズの範囲であった。評価した複数の構築物を図９Ａ～９Ｃに示す。

【0147】

ＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜構造／機能の回復を試験するために、２つのベクター用量を用いた３ヶ月間の非臨床試験を行った。先に記載したＲＳ１ＫＯマウス研究において網膜構造／機能をレスキューした「スタッファーなし」ベクターｐＴＲ－Ｘ００１（ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１）を比較対照として含めた。

【0148】

カセット選択研究設計の概要を表１に示す。ＲＳ１ＫＯマウスに、ビヒクル（群１）、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１（群２および３）、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１－３ｐ（群４および５）、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１－５ｐ（群６および７）、またはｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００２－３ｐ（群８および９）ベクターのいずれかを片眼で網膜下注射した。ベクターを１．０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのいずれかで送達した；１．０ｘ１０^８ｖｇ／眼（群２、４、６、８）または５．０ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ；５．０ｘ１０^８ｖｇ／眼（群３、５、７、９）。対側の眼は注射されないままであった。網膜の構造および機能を、注射後約１ヶ月および２ヶ月で、それぞれＯＣＴおよびＥＲＧによって査定した。注射の約３ヶ月後に動物を安楽死させた。安楽死後、網膜を凍結切片化し、免疫組織化学を介してＲＳ１発現について評価した。

【0149】

【表1】

【0150】

ＯＣＴ分析は、ベクター処置眼における分離腔の解決を明らかにした（図１０）。低用量のｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００１－５ｐで処置し、注射の１ヶ月後に評価した眼を除いて、両方の時点でビヒクル処置した眼とベクターで処置した眼との間で網膜分離症スコアに静的有意差があった。１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ（１．０×１０^８ｖｇ／眼）の濃度で、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００２－３ｐは、ビヒクル単独を注射した眼と比較して、桿体と錐体との媒介機能の有意な改善をもたらした（図１１Ａ）。より高い濃度の５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ（５．０×１０^８ｖｇ／眼）では、３つのスタッファー構築物はすべて、ビヒクル注射対照と比較して網膜機能の有意な改善を与えた（図１１Ｂ）。スタッファーあり構築物を担持するｒＡＡＶ．ＳＰＲを注射した眼とスタッファーなし構築物を担持するｒＡＡＶ．ＳＰＲを注射した眼との間のＥＲＧ振幅の有意差は、このより高い用量では観察されなかった。

【0151】

免疫組織化学分析は、ｒＡＡＶ．ＳＰＲ－Ｘ００２－３ｐで処置したＲＳ１ＫＯマウス眼由来の網膜の光受容体内部セグメントにおけるＲＳ１発現の存在を明らかにした。ＲＳ１発現は、対側の未処置眼およびビヒクルのみで処置した眼には存在しなかった（図１２Ａ～図１２Ｂ）。

【0152】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替形態が、本発明を実施する際に採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

【0153】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

【表2-15】

【表2-16】

【表2-17】

【表2-18】

【表2-19】

【表2-20】

【表2-21】

【表2-22】

【表2-23】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【配列表】

2024529369000001.xml

【国際調査報告】