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特表2024-529385循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の変化を用いて癌治療反応を予測及び／又はモニタリングする方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-06
(54)【発明の名称】循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の変化を用いて癌治療反応を予測及び／又はモニタリングする方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20240730BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240730BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240730BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
G01N33/68
C12Q1/06
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503559
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-03-19
(86)【国際出願番号】 US2022037874
(87)【国際公開番号】W WO2023004038
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/224,166
(32)【優先日】2021-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/240,669
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/317,642
(32)【優先日】2022-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518362775
【氏名又は名称】クリエイティブ マイクロテック インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＲＥＡＴＶ ＭＩＣＲＯＴＥＣＨ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１１６０９ Ｌａｋｅ Ｐｏｔｏｍａｃ Ｄｒｉｖｅ，Ｐｏｔｏｍａｃ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５４， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100113398
【弁理士】
【氏名又は名称】寺崎 直
(72)【発明者】
【氏名】アダムス， ダニエル エル．
(72)【発明者】
【氏名】タン， チャ－メイ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA36
2G045FB03
2G045GC22
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS10
4B063QX01
(57)【要約】
癌に罹患している対象の治療反応を予測するための手段を開示し、その予測は、ベースライン時及び治療導入後の対象の血液等の生体サンプルに認められる循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数及びサイズを比較することに基づく。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記対象から取得された治療前のサンプル（治療前サンプル）及び治療後のサンプル（治療後サンプル）におけるＣＡＭＬのサイズ及び数を判定及び比較し、これに基づいて予測を行うことを含み、前記治療後サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬよりも大きく、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、前記対象は、治療に反応しないと予測する、前記方法。
【請求項2】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない場合、前記対象は、前記治療から利益を得る又は前記治療に反応する可能性がある、前記方法。
【請求項3】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い又は前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、前記対象は、前記治療から利益を得られない又は前記治療に反応しない可能性がある、前記方法。
【請求項4】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同様であり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない又は前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は前記治療に反応しない可能性がある、前記方法。
【請求項5】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同様であり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある、前記方法。
【請求項6】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、ＣＴＣについて前記サンプルをアッセイすることを含み、前記サンプル中に１つ又は複数のＣＴＣが検出された場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある、前記方法。
【請求項7】
癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、（ｉ）前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求め、（ｉｉ）前記治療後サンプル中のＣＴＣの数を判定することを含み、前記ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、及び／又は少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、治療反応を予測する、前記方法。
【請求項8】
前記治療後サンプルにおいて少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＣＡＭＬは、（ａ）約１４～６４μｍのサイズを有する複数の個々の核及び／又は１つ若しくは複数の融合核；
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ；および
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、
の特徴を有する、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＡＭＬは、（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｍ）上皮性癌細胞ＣＫ８、ＣＫ１８、及び／又はＣＫ１９マーカー発現
のうちの１つ又は複数の特徴を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記サンプルのサイズは、５～５０ｍＬである、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記サンプルの供給源は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および凍結保存ＰＢＭＣのうちの１つ又は複数である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記サンプルは、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、子宮癌、尿路上皮癌、膀胱癌、子宮内膜癌、胆管癌、神経内分泌癌、又は他の固形腫瘍癌である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣが、サイズ排除法、免疫捕捉、デンドリマー媒介多価細胞捕捉、親和性に基づく表面捕捉、バイオミメティック表面コーティング捕捉、セレクチンコーティング表面捕捉、その他の機能化表面捕捉、慣性集束チップ、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いてサンプルから単離される、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いてサンプルから単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記マイクロフィルターが、約５μｍから約２０μｍの範囲の孔径を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形、及び／又は長方形の孔形状を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記マイクロフィルターは、精密な孔形状及び均一な孔分布を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記ＣＡＭＬ及び前記ＣＴＣは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介する、マイクロ流体チップを使用して単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＡＭＬ及び前記ＣＴＣは、前記ＣＡＭＬは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記治療は、化学療法、単剤療法、薬剤の併用療法、免疫療法、標的療法、放射線療法、化学放射線療法、放射線と単剤又は複数の薬剤の併用療法、化学放射線療法と単一又は複数の薬剤の併用療法、癌ワクチン療法、および細胞療法のうちから選択される１つ又は複数である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記治療は、癌ワクチンである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、包括的には、固形腫瘍等の癌に罹患している対象における癌治療反応の予測及び／又はモニタリングのための、血液及び他の体液中のバイオマーカーの使用に関する。この情報は、癌治療を計画する際、患者及び癌専門医にとって有用である。
【背景技術】
【0002】
腫瘍細胞は、原発性固形腫瘍から離脱すると、血液又はリンパ液循環に浸透し、最終的には、血流を離れて臓器又は組織のいずれかに入り、転移する。癌に関連する死亡の９０％は、転移プロセスによるものである。最も一般的な転移部位は、肺、肝臓、骨、脳である。循環中に発見される腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）と呼ばれる。多くの研究発表や臨床試験は、（ｉ）血流中のＣＴＣを列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）することにより、予後の生存や癌の再発に関する情報が提供され、及び（ｉｉ）タンパク質の発現レベル、ＣＴＣ中の遺伝子変異や転座の発生を調べることにより、治療に関する情報が提供されるとい点において、ＣＴＣが臨床的に有用であることを示している。しかしながら、ステージＩＶの癌患者であっても、ＣＴＣと、対象の癌の発症及び／又は存在との関連性に一貫性があるわけではない。ＣＴＣは、乳癌、前立腺癌、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）のステージＩＶで最も頻繁に発見されるが、これらの癌の早期ステージでは、稀である。ＣＴＣは、他の癌でも稀である。
【0003】
循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）は、癌に罹患している対象の血液中に認められる他の癌関連細胞である。ＣＡＭＬは、検査された全ての固形腫瘍及び全ての病期の癌と関連している。ＣＡＭＬは、倍数体でサイズが非常に大きく、約２５μｍから約３００μｍ、場合によってはこれ以上である。これらの倍数体細胞は、ＣＤ４５（－）又は（＋）であり、通常ＣＤ１４とＣＤ３１を発現しており、骨髄系であることが確認されている。これらの細胞は、ＣＴＣや細胞残屑を飲み込む過程で発見されることが多い［１－６］。
【0004】
血液やその他の体液中のＣＡＭＬ等のバイオマーカーの同定や特徴付けに関連するアッセイは、予測や予後の情報を提供するために使用できる。本発明は、このようなツールを臨床医及びその他の重要な目的に対して提供するものである。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫等の固形腫瘍を有する対象の血液中に見出される、特異的な特徴を有する細胞の一種を使用する方法に係る。これらの循環細胞は「循環癌関連マクロファージ様細胞」（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）と呼ばれ、癌に罹患している対象の固形腫瘍の存在と関連することが判明している。ＣＡＭＬに関連する５つの形態が特徴付けられ、記述されている［１－３］。ＣＡＭＬは、精密マイクロフィルターを用いたサイズ排除精密濾過により、ステージＩからステージＩＶの固形腫瘍を有する対象の末梢血から一貫して検出されている。
【0006】
ＣＡＭＬに関連する医療用途としては、以下に限定されるものではないが、癌の早期発見や診断、特に癌の再発や再燃の早期発見や診断、癌変異の判定を行うためのバイオマーカーとしての細胞の使用が挙げられる。ＣＡＭＬのサイズは、予後情報を提供することが明らかになっている。７．５ｍＬの血液サンプル中に５０μｍ以上のＣＡＭＬを有する患者は、５０μｍ以上のＣＡＭＬを有さない患者と比較して、無増悪生存期間と全生存期間が短いことが明らかになっている［４］。
【0007】
ここに初めて報告されることとして、癌患者の血液中に見出されるＣＡＭＬに関連する他の特性、並びに同じサンプル中に見出される循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）に関連する特性は、患者のケアに重要な予測及び予後の両方の情報を提供するために使用できる。例えば、ある治療計画から得られた臨床データに、バイオマーカー陽性群とバイオマーカー陰性群の両方が含まれる場合、（１）バイオマーカー陰性群が治療反応者と非反応者を層別化できない場合、データは、予測的であり、（２）バイオマーカー陽性コホートとバイオマーカー陰性コホートの両方でバイオマーカーが反応者を層別化できる場合、データは、予測的であると共に予後的であり得る［７］。
【0008】
本発明は、これらの特性を利用し、第１の実施形態において、同一患者からの少なくとも２つのサンプルにおけるＣＡＭＬのサイズ及び数を判定及び比較することによって、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法を提供し、第１の患者サンプルは、治療前に得られ（すなわち、治療前サンプル）、第２の患者サンプルは、治療後に得られる（すなわち、治療後サンプル）。ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ：ＢＬ）は、第１の（治療前の）患者サンプルによって提供される。本発明のいくつかの局面において、治療後サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬよりもサイズが大きく、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、対象は、治療に反応しないと予測する。
【0009】
本実施形態の第１の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、治療反応を予測する。差異は、ＣＡＭＬのサイズの変化、ＣＡＭＬの数の変化、又はその両方でありうる。ＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の全てのＣＡＭＬについて算出された平均サイズの変化であってもよく、またはサンプル中の最大のＣＡＭＬのサイズの変化であってもよい。サイズの変化は、サイズの増加であってもよく、またはサイズの減少であってもよい。
【0010】
本実施形態の第２の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない場合、対象は、治療から利益を得る又は治療に反応する可能性がある。
【0011】
本実施形態の第３の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い又は治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0012】
本実施形態の第４の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較してサイズが増加している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数以下である又は治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0013】
本実施形態の第５の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0014】
第２の実施形態において、本発明は、癌に罹患している対象からのサンプル中のＣＴＣをアッセイすることによって、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法に係り、癌治療後のサンプル（すなわち、治療後サンプル）中に１つ又は複数のＣＴＣが存在することは、対象が治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性があることを示唆する。転移性乳癌、前立腺癌、大腸癌、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）を除き、癌患者の血液中にＣＴＣが見出されることは稀であるが、一部のサンプルにおけるＣＴＣの存在を確認することによって治療反応を予測できる。
【0015】
この実施形態の１つの特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、ＣＴＣについてサンプルをアッセイすることを含み、サンプル中に１つ又は複数のＣＴＣが検出された場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0016】
第３の実施形態において、本発明は、第１及び第２の実施形態の特徴を組み合わせた方法に係る。
【0017】
また、この第３の実施形態の方法は、癌に罹患している対象における治療反応を予測するために使用できる。本方法は、（ｉ）少なくとも２つの患者サンプルにおけるＣＡＭＬのサイズ及び数を比較することであって、第１の患者サンプル（すなわち、治療前サンプル）が治療前に取得され、第２の患者サンプル（すなわち、治療後サンプル）が治療後に取得されることと、（ｉｉ）治療後に得られた第２の患者サンプル（すなわち、治療後サンプル）中のＣＴＣの数を判定することとを含む。
【0018】
この実施形態の１つの特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、（ｉ）治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることと、（ｉｉ）治療後サンプル中のＣＴＣの数を判定することとを含み、ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、及び／又は少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、治療反応を予測する。一例として、治療後サンプルにおいて少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0019】
上記の実施形態と同様に、差異は、ＣＡＭＬのサイズの変化、ＣＡＭＬの数の変化、又はその両方であってもよい。ＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の全てのＣＡＭＬについて算出された平均サイズの変化であってもよく、またはＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の最大のＣＡＭＬのサイズの変化であってもよい。サイズの変化は、サイズの増加であってもよく、またはサイズの減少であってもよい。
【0020】
本発明の各実施形態及び局面において、ＣＡＭＬは、以下の各特徴を有するものとして定義できる。
（ａ）約１４～６４μｍのサイズの大きな非定型倍数体核（ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）又はこれ以上のサイズの核、又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ（より大きいサイズの可能性もある）
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形（ｏｂｌｏｎｇ）、２本脚、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
（ａ）約１４～６４μｍのサイズの大きな非定型倍数体核（ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）又はこれ以上のサイズの核、又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ（より大きいサイズの可能性もある）
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形（ｏｂｌｏｎｇ）、２本脚、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
【0021】
本発明の実施形態のいくつかの局面において、ＣＡＭＬは更に、以下の付加的な特徴の１つ又は複数を有する可能性があると定義できる。
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
【0022】
本発明の各局面及び実施形態において、サンプルは、生体サンプルであり、サンプルは、以下に限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）、及び凍結保存ＰＢＭＣのうちの１つ又は複数であってもよい。生体サンプルが血液である場合、血液は、例えば、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であってもよい。サンプルは、新鮮なサンプルであってもよく、適切に調製された凍結保存サンプルを解凍したものであってもよい。本発明のいくつかの局面において、サンプルは、血液サンプルであり、血液サンプルのサイズは、５～５０ｍＬである。
【0023】
本発明の各局面及び実施形態において、癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、子宮癌、尿路上皮癌、膀胱癌、子宮内膜癌、胆管癌、神経内分泌癌、又は他の固形腫瘍癌である。
【0024】
本発明の実施形態のいくつかの局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、サイズ排除法、免疫捕捉、デンドリマー媒介多価細胞捕捉、親和性に基づく表面捕捉、バイオミメティック表面コーティング捕捉、セレクチンコーティング表面捕捉、その他の機能化表面捕捉、慣性集束チップ、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー法、磁気浮上、各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いてサンプルから単離される。
【0025】
本発明の一局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いてサンプルから単離してもよい。マイクロフィルターは、ＣＴＣとＣＡＭＬの両方を捕捉するために、約５μｍから約１０μｍの範囲の孔径を有してもよく、マイクロフィルターは、主にＣＡＭＬを捕捉するために、約２０μｍの範囲の孔径を有してもよい。マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形及び／又は長方形の孔形状を有していてもよい。マイクロフィルターは、精密な孔形状及び／又は均一な孔分布を有していてもよい。
【0026】
本発明の他の局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介して、マイクロ流体チップを使用してサンプルから単離してもよい。
【0027】
本発明の更なる局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、生体サンプルから単離できる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】治療後における治療前サンプルからのＣＡＭＬのサイズと数の変化を示す図である。（ｉ）治療後サンプル中のＣＡＭＬが治療前サンプルより増加し、かつ最大ＣＡＭＬのサイズが治療前サンプルより増加した場合、その患者を「ＣＡＭＬ増加」に分類する。（ｉｉ）治療後サンプル中のＣＡＭＬが治療前サンプルより増加し、かつ最大ＣＡＭＬのサイズが治療前サンプルより増加していない場合、その患者を「ＣＡＭＬ混在」に分類する。（ｉｉｉ）治療後サンプル中のＣＡＭＬが増加せず、かつ最大ＣＡＭＬのサイズが治療前サンプルの細胞より増加した場合も、その患者を「ＣＡＭＬ混在」に分類する。（ｉｖ）治療後サンプル中のＣＡＭＬが減少し、最大のＣＡＭＬのサイズが治療前サンプルより減少した場合、患者を「ＣＡＭＬ減少」に分類する。
【0029】
【図2A】１つの薬物治療試験について、ＣＡＭＬのサイズ又は数の変化に基づいて層別化した無増悪生存期間（ＰＦＳ）を示す図である。
【0030】
【図2B】１つの薬物治療試験において、ＣＡＭＬのサイズ又は数の変化に基づいて層別化した全生存期間（ＯＳ）を示す図である。
【0031】
【図3】ＣＡＭＬのサイズ又は数の変化に基づく治療後の転移性乳癌患者グループの腫瘍サイズの変化のスパイダープロットを示す図である。
【0032】
【0033】
【図5A】ＣＡＭＬのサイズと数、ＣＴＣの存在を考慮した転移性乳癌患者のＰＦＳのカプランマイヤープロットを示し、ベースライン時と治療後のＣＴＣ及びＣＡＭＬの情報を比較して示す図である。
【0034】
【図5B】ＣＡＭＬのサイズと数、ＣＴＣの存在を考慮した転移性乳癌患者のＯＳのカプランマイヤープロットを示し、ベースライン時と治療後のＣＴＣ及びＣＡＭＬ情報を比較して示す図である。
【0035】
【図6A】ＣＡＭＬのサイズと数、ＣＴＣの存在を考慮した多数の異なる癌種を有する２２０人の転移性癌患者のＰＦＳのカプランマイヤープロットを示し、ベースライン時と治療後のＣＴＣ及びＣＡＭＬ情報を比較して示す図である。
【0036】
【図6B】ＣＡＭＬのサイズと数、ＣＴＣの存在を考慮した多数の異なる癌種を有する２２０人の転移性癌患者のＯＳのカプランマイヤープロットを示し、ベースライン時と治療後のＣＴＣ及びＣＡＭＬ情報を比較して示す図である。
【0037】
【図7A】治療後に５０μｍ以上のＣＡＭＬを有し、ＣＴＣが存在する患者を考慮した多数の異なる癌種を有する２２０人の転移性癌患者のＰＦＳのカプランマイヤープロットを示す図である。
【0038】
【図7B】治療後に５０μｍ以上のＣＡＭＬを有し、ＣＴＣが存在する患者を考慮した多数の異なる癌種を有する２２０人の転移性癌患者のＯＳのカプランマイヤープロットを示す図である。
【0039】
【図8】ＣＣＲ５製剤投与３０日後に解析したトリプルネガティブ乳癌（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ＴＮＢＣ）患者２５人の（Ａ）ＰＦＳと（Ｂ）ＯＳを、ベースラインからのＣＡＭＬのサイズと数の変化に基づいて層別化した図である。
【0040】
【図9】ＣＣＲ５薬剤投与３０日後に解析したトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者２５人の（Ａ）ＰＦＳと（Ｂ）ＯＳを層別化した図である。ＣＣＲ５薬剤による治療を受けたが、治療後３０日のデータがない４人のＴＮＢＣ患者が含まれている。これら４人の患者については、ベースライン時にＣＡＭＬが５０μｍ未満であった患者をＣＡＭＬ減少群とした。
【0041】
【図10】ＣＡＭＬのサイズが３５μｍ変化した場合のＰＦＳとＯＳを示す図である。（ａ）及び（ｂ）は、ＮＳＣＬＣ全患者ｎ＝１８２人のＰＦＳ及びＯＳである。（ｃ）及び（ｄ）は、ＩＭＴ集団（ｎ＝９１、緑）及びＣＲＴ単独集団（ｎ＝９１）のＰＦＳ及びＯＳである。
【0042】
【図11】ＣＴＣ、ＣＡＭＬ及び上皮間葉転換細胞（ＥＭＴ）におけるＣＸＣＲ４発現の効果を示す図である。ＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＥＭＴ発現のＰＦＳ及びＯＳのカプランマイヤーグラフ。（ａ．）ＣＴＣにおけるＣＸＣＲ４発現のＰＦＳ。（ｂ．）ＣＴＣにおけるＣＸＣＲ４発現のＯＳ。（ｃ．）ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現のＰＦＳ。（ｄ．）ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現のＯＳ。（ｅ．）ＥＭＴにおけるＣＸＣＲ４発現のＰＦＳ。（ｆ．）ＥＭＴにおけるＣＸＣＲ４発現のＯＳ。
【0043】
【図12】化学放射線療法（ＣＲＴ）後に免疫療法を受けたＮＳＣＬＣ患者の（Ａ）ＰＦＳと（Ｂ）ＯＳの層別化を、ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現と比較して示す図である。
【0044】
【図13】化学放射線療法（ＣＲＴ）後に免疫療法を受けたＮＳＣＬＣ患者の（Ａ）ＰＦＳと（Ｂ）ＯＳの層別化を、ＰＤ－Ｌ１発現とＣＡＭＬのサイズの組み合わせによってグループ化した図である。非応答者は、ＰＤ－Ｌ１が低く、１つ又は複数のＣＡＭＬが５０μｍ以上の患者グループに属する。
【0045】
【図14】化学放射線療法（ＣＲＴ）を受けたＮＳＣＬＣ患者のうち、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１免疫療法を追加した患者（ｎ＝４１）又は追加しなかった患者（ｎ＝４１）の（Ａ）ＰＦＳ及び（Ｂ）ＯＳの層別化を、ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現の高低で比較して示す図である。
【0046】
【図15】化学放射線療法（ＣＲＴ）を受けたＮＳＣＬＣ患者のうち、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１免疫療法を追加した患者（ｎ＝４１）又は追加しなかった患者（ｎ＝４１）の（Ａ）ＰＦＳ及び（Ｂ）ＯＳの層別化を、治療前及び治療後のＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現の変化を比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0047】
詳細な説明
本明細書で定義される詳細な構成及び要素等の事項は、本発明の包括的な理解を補助するために提示しているに過ぎない。したがって、本発明の範囲及び思想から逸脱することなく、ここに記載された実施形態を様々に変更及び修正できることは、当業者にとって明らかである。
本明細書で定義される詳細な構成及び要素等の事項は、本発明の包括的な理解を補助するために提示しているに過ぎない。したがって、本発明の範囲及び思想から逸脱することなく、ここに記載された実施形態を様々に変更及び修正できることは、当業者にとって明らかである。
【0048】
癌は、世界で最も恐れられている病気の１つであり、あらゆる国のあらゆる人口及び民族構成に影響を及ぼしている。男女ともに約４０％が一生のうちに癌を発症する。米国のみでも、常時１，２００万人以上の癌患者がおり、２０１８年には、新たに１７０万人の癌患者が発生し、６０万人以上が死亡すると推定されている。世界の癌死亡者数は、年間約８００万人と推定され、そのうち３００万人は、患者が治療を受けられる先進国で発生している。
【0049】
選択した治療法が有効かどうかを迅速に判断できる診断法が存在することが理想的である。また、その診断法は、血液検査であることが理想的である。
【0050】
本開示では、ステージＩ～ＩＶの固形腫瘍患者の血液中に、他のどの癌関連細胞よりも一貫して見出される細胞型を提示する。これらの循環細胞は、原発腫瘍と同じ腫瘍マーカーを含むマクロファージ様細胞であり、ここでは、循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）と称する。
【0051】
癌に罹患している患者からの生体サンプル中に存在するＣＡＭＬは、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）とともに、例えば、精密濾過法を含むサイズ排除法の使用によって単離し、特徴付けることができる。マイクロフィルターは、ＣＴＣやＣＡＭＬ等の大きな細胞を保持しながら、赤血球や大部分の白血球を通過させるのに十分なサイズの孔を持つように形成できる。採取された細胞は、フィルター上で直接、あるいは、他の手段によって、特性解析できる。
【0052】
ＣＡＭＬは、単独で使用される場合、多くの臨床的有用性を有する。更に、生体サンプル中のＣＡＭＬの特性解析は、ＣＴＣ、無細胞ＤＮＡ、血液中の遊離タンパク質等の他のマーカーのアッセイと組み合わせることで、診断技術の感度と特異性を更に向上させることができる。ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、同じ手段で同時に単離及び同定できるため、上記の特徴は、特に、ＣＡＭＬ及びＣＴＣに当てはまる。
【0053】
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）
ここで定義するように、本発明の方法で使用される循環細胞は「ＣＡＭＬ」と称することができる。ＣＡＭＬは、以下の特徴の１つ又は複数を有する。
・ＣＡＭＬは、大きな非定型倍数体核又は複数の個別核を有し、多くの場合、細胞内に散在しているが、拡大した融合核小体（ｅｎｌａｒｇｅｄ ｆｕｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｌｉ）が共通している。ＣＡＭＬの核のサイズは、一般的に直径約１０μｍ～約７０μｍ、より一般的には、直径約１４μｍ～約６４μｍである。
・ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性又はＣＤ４５陰性でありえ、本発明は、両方のタイプのＣＡＭＬの使用を包含する。
・ＣＡＭＬは、大きく、長径が約２０μｍから約３００μｍである。
・ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、無定形等、多数の異なる形態学的形状で見出される。
・癌腫由来のＣＡＭＬは、通常、拡散したサイトケラチンを有する。
・ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現している場合、ＥｐＣＡＭは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に亘って略均一であるが、腫瘍によっては、ＥｐＣＡＭの発現が非常に低いか全くないため、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するわけではない。
・ＣＡＭＬがマーカーを発現している場合、そのマーカーは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に略均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同じ強度で発現するわけではない。
・ＣＡＭＬは腫瘍由来のマーカーに関連するマーカーを発現することが多い。例えば、腫瘍が前立腺癌由来でＰＳＭＡを発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓由来でＰＤＸ－１を発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。更なる例として、癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現している場合、そのような患者由来のＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。上皮性癌に関連するＣＡＭＬは、ＣＫ８、ＣＫ１８又はＣＫ１９、ビメンチン等を発現することがある。肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫の場合、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の代わりに癌に関連する他のマーカーを使用できる。
・癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬも薬物標的のバイオマーカーを発現する。このような免疫療法のバイオマーカーの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
・ＣＡＭＬは、単球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）や内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。
・ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片を結合する能力を有する。
ここで定義するように、本発明の方法で使用される循環細胞は「ＣＡＭＬ」と称することができる。ＣＡＭＬは、以下の特徴の１つ又は複数を有する。
・ＣＡＭＬは、大きな非定型倍数体核又は複数の個別核を有し、多くの場合、細胞内に散在しているが、拡大した融合核小体（ｅｎｌａｒｇｅｄ ｆｕｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｌｉ）が共通している。ＣＡＭＬの核のサイズは、一般的に直径約１０μｍ～約７０μｍ、より一般的には、直径約１４μｍ～約６４μｍである。
・ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性又はＣＤ４５陰性でありえ、本発明は、両方のタイプのＣＡＭＬの使用を包含する。
・ＣＡＭＬは、大きく、長径が約２０μｍから約３００μｍである。
・ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、無定形等、多数の異なる形態学的形状で見出される。
・癌腫由来のＣＡＭＬは、通常、拡散したサイトケラチンを有する。
・ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現している場合、ＥｐＣＡＭは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に亘って略均一であるが、腫瘍によっては、ＥｐＣＡＭの発現が非常に低いか全くないため、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するわけではない。
・ＣＡＭＬがマーカーを発現している場合、そのマーカーは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に略均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同じ強度で発現するわけではない。
・ＣＡＭＬは腫瘍由来のマーカーに関連するマーカーを発現することが多い。例えば、腫瘍が前立腺癌由来でＰＳＭＡを発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓由来でＰＤＸ－１を発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。更なる例として、癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現している場合、そのような患者由来のＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。上皮性癌に関連するＣＡＭＬは、ＣＫ８、ＣＫ１８又はＣＫ１９、ビメンチン等を発現することがある。肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫の場合、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の代わりに癌に関連する他のマーカーを使用できる。
・癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬも薬物標的のバイオマーカーを発現する。このような免疫療法のバイオマーカーの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
・ＣＡＭＬは、単球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）や内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。
・ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片を結合する能力を有する。
【0054】
ＣＡＭＬは、Ｈ＆Ｅ等の比色染色、あるいは、特定のマーカーの蛍光染色によって可視化できる。細胞質については、ＣＤ３１が最も陽性の表現型である。ＣＤ３１単独、又は他の陽性マーカー、あるいは、腫瘍に関連する癌マーカーとの併用が推奨される。
【0055】
本発明の様々な実施形態及び局面において、ＣＡＭＬは、以下の特徴を有する細胞として定義できる。（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核、又は単一細胞内に複数の核を有する。（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ。（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状。更なる実施形態において、ＣＡＭＬは、以下の付加的な特性の１つ又は複数をも有するものとして定義できる。（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型。（ｅ）ＣＤ４５発現。（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現。（ｇ）ビメンチン発現。（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現。（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現。（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現。（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現。（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現。
【0056】
循環腫瘍細胞
ここで定義するように、癌腫に関連するＣＴＣは、多くのサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９は、ＣＴＣによって最も一般的に発現され、診断において使用されるサイトケラチンであるが、調査では、これらのマーカーのみに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、通常、上皮細胞接着分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は、一様ではなく、一貫しているわけでもない。ＣＴＣは、ＣＤ４５を発現しないが、これは、ＣＤ４５が白血球マーカーであるためである。ＣＴＣやＣＡＭＬ等の腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９等の固形腫瘍に関連するマーカーに対する抗体、あるいは、ＣＤ４５やＤＡＰＩに対する抗体を用いれば十分である。染色技術を形態学と組み合わせることによって、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎａｂｌｅ ＣＴＣ：ＰＤＣＴＣ）、アポトーシスＣＴＣ、ＣＡＭＬを同定できる［３］。
ここで定義するように、癌腫に関連するＣＴＣは、多くのサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９は、ＣＴＣによって最も一般的に発現され、診断において使用されるサイトケラチンであるが、調査では、これらのマーカーのみに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、通常、上皮細胞接着分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は、一様ではなく、一貫しているわけでもない。ＣＴＣは、ＣＤ４５を発現しないが、これは、ＣＤ４５が白血球マーカーであるためである。ＣＴＣやＣＡＭＬ等の腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９等の固形腫瘍に関連するマーカーに対する抗体、あるいは、ＣＤ４５やＤＡＰＩに対する抗体を用いれば十分である。染色技術を形態学と組み合わせることによって、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎａｂｌｅ ＣＴＣ：ＰＤＣＴＣ）、アポトーシスＣＴＣ、ＣＡＭＬを同定できる［３］。
【0057】
固形腫瘍に関連するＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９を発現し、以下の特徴によって同定及び定義される。
・ＤＡＰＩで染色された「癌様」核。核は、通常大きく、ドットパターンを有する。ただし、細胞分裂中は、例外である。核が凝縮していることもある。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９のうちの１つ又は複数の発現。上皮癌からのＣＴＣは、通常、少なくともＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９を発現する。サイトケラチンは、糸状パターンを有する。
・ＣＤ４５の発現の欠如。
・ＤＡＰＩで染色された「癌様」核。核は、通常大きく、ドットパターンを有する。ただし、細胞分裂中は、例外である。核が凝縮していることもある。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９のうちの１つ又は複数の発現。上皮癌からのＣＴＣは、通常、少なくともＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９を発現する。サイトケラチンは、糸状パターンを有する。
・ＣＤ４５の発現の欠如。
【0058】
癌腫に関連するアポトーシスＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９を発現し、以下の特徴により同定及び定義される：
・劣化した核。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の１つ又は複数の発現。全てのサイトケラチンのパターンが糸状ではなく、一部又は全体が斑点状に断片化されている。
・ＣＤ４５発現の欠如。
・劣化した核。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の１つ又は複数の発現。全てのサイトケラチンのパターンが糸状ではなく、一部又は全体が斑点状に断片化されている。
・ＣＤ４５発現の欠如。
【0059】
上に示唆したように、ここに開示するＣＡＭＬ及びＣＴＣのユニークな特徴は、癌等の疾患のスクリーニング及び診断、治療のモニタリング、疾患の進行及び再発のモニタリング、並びに治療反応の予測の方法を含む臨床用途での使用に適している。
【0060】
治療反応を予測する方法
本発明は、これらの特性を利用し、第１の実施形態において、同一患者からの少なくとも２つのサンプルにおけるＣＡＭＬのサイズ及び数を判定及び比較することによって、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法を提供し、第１の患者サンプルは、治療前に得られ（すなわち、治療前サンプル）、第２の患者サンプルは、治療後に得られる（すなわち、治療後サンプル）。ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ：ＢＬ）は、第１の（治療前の）患者サンプルによって提供される。本発明のいくつかの局面において、治療後サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬよりもサイズが大きく、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、対象は、治療に反応しないと予測する。
本発明は、これらの特性を利用し、第１の実施形態において、同一患者からの少なくとも２つのサンプルにおけるＣＡＭＬのサイズ及び数を判定及び比較することによって、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法を提供し、第１の患者サンプルは、治療前に得られ（すなわち、治療前サンプル）、第２の患者サンプルは、治療後に得られる（すなわち、治療後サンプル）。ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ：ＢＬ）は、第１の（治療前の）患者サンプルによって提供される。本発明のいくつかの局面において、治療後サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬよりもサイズが大きく、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、対象は、治療に反応しないと予測する。
【0061】
本実施形態の第１の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、治療反応を予測する。差異は、ＣＡＭＬのサイズの変化、ＣＡＭＬの数の変化、又はその両方でありうる。ＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の全てのＣＡＭＬについて算出された平均サイズの変化であってもよく、またはサンプル中の最大のＣＡＭＬのサイズの変化であってもよい。サイズの変化は、サイズの増加であってもよく、またはサイズの減少であってもよい。
【0062】
本実施形態の第２の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない場合、対象は、治療から利益を得る又は治療に反応する可能性がある。
【0063】
本実施形態の第３の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い又は治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0064】
本実施形態の第４の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較してサイズが増加している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、治療前サンプル中のＣＡＭＬの数以下である又は治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0065】
本実施形態の第５の特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同様であり、治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0066】
第２の実施形態において、本発明は、癌に罹患している対象からのサンプル中のＣＴＣをアッセイすることによって、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法を提供し、癌治療後のサンプル（すなわち、治療後サンプル）中に１つ又は複数のＣＴＣが存在することは、対象が治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性があることを示唆する。転移性乳癌、前立腺癌、大腸癌、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）を除き、癌患者の血液中にＣＴＣが見出されることは稀であるが、一部のサンプルにおけるＣＴＣの存在を確認することによって治療反応を予測できる。
【0067】
この実施形態の１つの特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、ＣＴＣについてサンプルをアッセイすることを含み、サンプル中に１つ又は複数のＣＴＣが検出された場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0068】
第３の実施形態において、本発明は、第１及び第２の実施形態の特徴を組み合わせた方法に係る。
【0069】
この第３の実施形態の方法もまた、癌に罹患している対象における治療反応を予測するために使用できる。本方法は、（ｉ）少なくとも２つの患者サンプルにおけるＣＡＭＬのサイズ及び数を比較することであって、第１の患者サンプル（すなわち、治療前サンプル）が治療前に取得し、第２の患者サンプル（すなわち、治療後サンプル）が治療後に取得されることと、（ｉｉ）治療後に得られた第２の患者サンプル（すなわち、治療後サンプル）中のＣＴＣの数を判定することとを含む。
【0070】
この実施形態の１つの特定の局面は、癌に罹患している対象における治療反応を予測する方法であって、癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、（ｉ）治療前サンプルと治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることと、（ｉｉ）治療後サンプル中のＣＴＣの数を判定することとを含み、ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、及び／又は少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、治療反応を予測する。この実施形態の一局面では、治療後サンプルにおいて少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。
【0071】
上記の実施形態と同様に、差異は、ＣＡＭＬのサイズの変化、ＣＡＭＬの数の変化、又はその両方であってもよい。ＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の全てのＣＡＭＬについて算出された平均サイズの変化であってもよく、またはＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の最大のＣＡＭＬのサイズの変化であってもよい。サイズの変化は、サイズの増加であってもよく、またはサイズの減少であってもよい。
【0072】
本発明の更なる局面において、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルも、治療前後のサンプルにおいて採取されたＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣに基づいて判定できる。ここに提示し、後述する実験的証拠に示されるように、ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現も、癌に罹患している対象、特に免疫療法によって治療される対象における治療反応を予測するために有用な情報を提供することができる。一般的に、ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現のレベルが高いほど、対象が治療から利益を得る又は治療に反応する確率が高くなる。したがって、ここに明示される各実施形態で概説される方法は、治療前サンプルと治療後サンプルとの間でＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現のレベルを比較して差異を求めるステップを含むことによっても実施できる。一局面において、治療後サンプルのＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルが、治療前サンプルの発現レベルよりも低い場合、対象は、治療から利益を得られない、又は治療に反応しない可能性がある。別の局面において、治療後サンプルのＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルが、治療前サンプルの発現レベルよりも高い場合、対象は、治療から利益を得る又は治療に反応する可能性がある。
【0073】
本発明の更なる局面において、ＣＸＣＲ４の発現レベルは、治療前サンプル及び治療後サンプルにおいて採取されたＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣにおいても判定できる。ここに提示し、後述する実験的証拠に示されるように、ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現も、癌に罹患している対象における治療反応を予測するために有用な情報を提供し得る。一般的に、ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現のレベルが低いほど、対象が治療から利益を得る又は治療に反応する確率が高くなる。したがって、ここに明示される各実施形態で概説される方法は、治療前サンプルと治療後サンプルとの間でＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現のレベルを比較して差異を求めるステップを含むことによっても実施できる。一局面において、治療後サンプルのＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現レベルが治療前サンプルの発現レベルよりも高い場合、対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性がある。別の局面において、治療後サンプルのＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４発現レベルが治療前サンプルの発現レベルより低い場合、対象は、治療から利益を得る又は治療に反応する可能性がある。
【0074】
本発明の実施形態及び局面のそれぞれにおいて、ＣＡＭＬは、以下の特徴のそれぞれを有するものとして定義できる。
（ａ）約１４～６４μｍのサイズの大きな非定型倍数体核又はこれ以上のサイズの核、又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ（より大きいサイズの可能性もある）
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
（ａ）約１４～６４μｍのサイズの大きな非定型倍数体核又はこれ以上のサイズの核、又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ（より大きいサイズの可能性もある）
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
【0075】
本発明の実施形態のいくつかの局面において、ＣＡＭＬは更に、以下の付加的な特徴の１つ又は複数を有する可能性があると定義できる。
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
【0076】
ここで用いられる、「可能性がある」という用語は、５０％以上の確率があることを意味する。したがって、「可能性がある」とは、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の確率を意味しうる。
【0077】
ここで用いられる、「治療反応」という用語は、治療を受ける対象による反応を意味する。治療反応は、対象が治療されている癌に対して、治療がポジティブな効果を有する（例えば、腫瘍のサイズを縮小させる又は成長を遅らせる）ポジティブ反応であったり、対象が治療されている癌に対して、治療がネガティブな効果を有する（例えば、腫瘍サイズを増大させる、又は成長を速める）ネガティブ反応であったり、あるいは、対象が治療されている癌に対して、治療が明白な効果を有さない中立的反応であったりしうる。これに代えて又はこれに加えて、治療反応は、無増悪生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ＰＦＳ）又は全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ＯＳ）、あるいはその両方の変化であってもよい。治療反応は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）若しくは全生存期間（ＯＳ）の増加、又はその両方ということもありうる。治療反応は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）若しくは全生存期間（ＯＳ）の減少、又はその両方ということもありうる。
【0078】
本発明の各方法において、無増悪生存期間（ＰＦＳ）若しくは、全生存期間（ＯＳ）、又はその両方は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０箇月、又はこれ以上の期間である。本発明の一局面において、ＰＦＳ若しくは、ＯＳ、又はその両方は、少なくとも約２４箇月である。
【0079】
本明細書において、「無増悪生存期間（ＰＦＳ）」という用語は、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による定義に従い、すなわち、癌等の疾患の治療中及び治療後において、患者が疾患とともに生存し、疾患が悪化しない期間の長さである。また、ＰＦＳは、治療を開始した日や、癌の進行を評価するために治療前の血液を採取した日等の選択された日から、癌を有する対象が生存し、癌が悪化又は進行していない期間の長さとして定義することもできる。
【0080】
ここで用いられる、「全生存期間（ＯＳ）」という用語は、米国国立癌研究所による定義に従い、すなわち、癌等の疾患の診断日又は治療開始日のいずれかから、その疾患と診断された患者が生存している期間の長さである。ＯＳとは、治療開始日又は治療前の採血日からの期間のことである。
【0081】
ここで用いられる、「治療から利益を得る」という表現は、治療を受ける対象が、治療中の状態又は治療中の状態の症状の改善を経験することを意味する。
【0082】
ここで用いられる、「治療に反応する」という表現は、治療を受ける対象が、治療中の状態又は治療中の状態の症状の改善を示すことを意味する。
【0083】
ここで用いられる、「治療前サンプル」という用語は、対象に特定の治療が施される前に対象から得られる生体サンプルを意味する。特定の治療は、対象に投与される最初又は唯一の治療ではなくてもよい。但し、この治療は、対象における治療反応に関する情報が望まれる治療である。ここで用いられる、「治療後サンプル」という用語は、対象に特定の治療が施された後に対象から得られる生体サンプルを意味する。複数の治療が対象に施される場合、複数の「治療後サンプル」が存在してもよい。
【0084】
ここで用いられる、「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、又はイヌ、ネコ、げっ歯類等の伴侶動物、又は他の哺乳動物である。
【0085】
ここで用いられる、例えば、患者サンプル、治療前サンプル、治療後サンプル等の「サンプル」は、生体サンプルであり、サンプルは、以下に限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）、凍結保存ＰＢＭＣのうちの１つ又は複数であってもよい。生体サンプルが血液である場合、血液は、例えば、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であってもよい。サンプルは、新鮮なサンプルであってもよく、適切に調製された凍結保存サンプルを解凍したものであってもよい。
【0086】
本発明の各方法において、細胞（ＣＡＭＬ及びＣＴＣ）がアッセイされるサンプルの量は、様々であり得ることは明らかである。しかしながら、細胞のサイズを判定することに基づく方法の場合、関連する細胞数を得るためには、サンプルは、少なくとも約２．５ｍＬであるべきである。また、サンプルの量は、少なくとも約３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１７．５、１８、１９、２０、２１、２２、２２．５、２３、２４、２５、２６、２７、２７．５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍＬ、又はこれ以上であってもよい。また、サンプルの量は、約２．５～５０ｍＬ、約２．５～２０ｍＬ、約５～１５ｍＬ、又は約５～１０ｍＬであってもよい。本発明の一局面では、サンプルは、約７．５ｍＬである。本発明のいくつかの局面では、サンプルは、血液サンプルであり、血液サンプルのサイズは、７．５ｍＬである。
【0087】
サンプル中の循環細胞（ＣＡＭＬ及びＣＴＣ）数に基づいて癌に罹患している対象のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関して、癌に罹患している対象からのサンプルの選択された体積中の循環細胞の比率が判定される。様々な量のサンプルを用いることができるが、サンプルのサイズに対するサンプル中の細胞数の比率が判定され、対象間で比較されることは明らかである。例えば、１５ｍＬのサンプルに８個の細胞という比率は、７．５ｍＬのサンプルに４個の細胞、３．７５ｍＬのサンプルに２個の細胞に相当する。
【0088】
ここで用いられる、「癌」とは、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、子宮癌、尿路上皮癌、膀胱癌、子宮内膜癌、胆管癌、神経内分泌癌、又は他の固形腫瘍癌である。本発明の方法が特定の形態又はタイプの癌に限定されず、多種多様な癌に関連して実施され得ることは当業者にとって明らかである。
【0089】
癌に罹患している対象は、治療を受けていてもよい。ここで、癌に罹患している対象との関連において、「治療」又は「治療する」とは、癌の増殖又は広がりの減少、癌の増殖又は広がりの阻止、又は癌を治癒させることのいずれかに使用できる任意の治療用分子、物質、化学物質、抗体、細胞、デバイス、薬剤、状態又は手順への言及である。適切な治療としては、以下に限定されるものではないが、化学療法、単剤療法、薬剤併用療法、免疫療法、標的療法、放射線療法、化学放射線療法、放射線と単剤又は複数の薬剤との併用療法、化学放射線と単剤又は複数の薬剤との併用療法、化学放射線と単剤又は複数の免疫治療薬との併用療法、癌ワクチン、細胞療法の１つ又は複数が挙げられる。適切な治療分子としては、以下に限定されるものではないが、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、およびペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）が挙げられる。特定の非限定的な例では、治療は、乳癌に対する癌ワクチンである。
【0090】
治療前からの治療後におけるＣＡＭＬの数又はサイズの変化に関して、その差は、ＣＡＭＬのサイズの変化、ＣＡＭＬの数の変化、又はその両方であってもよい。ＣＡＭＬのサイズの変化は、サンプル中の全てのＣＡＭＬについて算出された平均サイズの変化であってもよく、ＣＡＭＬのサイズの変化は、２つ以上のサンプル中の最大のＣＡＭＬのサイズの変化であってもよい。サイズの変化は、増加又は減少である。ＣＡＭＬの形状は様々であるため、ＣＡＭＬのサイズは、セル上の最も離れた２点間の距離を測定することによって把握されるべきである。ＣＡＭＬが円形又は略円形の場合、セルのサイズは、セルの直径としてもよい。
【0091】
本発明の各実施形態及び局面において、細胞は、サイズ排除法、免疫捕捉、デンドリマー媒介多価細胞捕捉、親和性に基づく表面捕捉、バイオミメティック表面コーティング捕捉、セレクチンコーティング表面捕捉、その他の機能化表面捕捉、慣性集束チップ、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組合せを用いてサンプルから単離してもよい。
【0092】
本発明の一局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いてサンプルから単離してもよい。孔は、全ての赤血球と大部分の白血球を除去するのに十分な大きさを有する必要がある。また、孔は、ＣＡＭＬとＣＴＣを一貫して捕捉するのに十分な小ささを有する必要がある。マイクロフィルターは、ＣＴＣとＣＡＭＬの両方を捕捉するために、約５μｍから約１０μｍの範囲の孔径を有してもよく、マイクロフィルターは、主にＣＡＭＬを捕捉するために、約２０μｍの範囲の孔径を有してもよい。幾つかの具体例では、孔径を約５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、又はこれ以上まで大きくして、より大きなサイズのＣＡＭＬのみを捕捉することもできる。マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形及び／又は長方形の孔形状を有していてもよい。マイクロフィルターは、精密な孔形状及び／又は均一な孔分布を有していてもよい。
【0093】
本発明の他の局面において、細胞は、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介する、マイクロ流体チップを用いてサンプルから単離される。細胞の捕捉効率は、採取方法によって異なり得る。また、異なるプラットフォームで捕捉できる循環細胞（ＣＡＭＬ及びＣＴＣ）のサイズも異なり得る。循環細胞サイズを予後や生存の判定に用いる原理は同じであっても、統計が異なることもある。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターを用いた循環細胞の採取は、１００％の捕捉効率と高品質の細胞を提供する。
【0094】
本発明の他の局面において、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介する、マイクロ流体チップを使用してサンプルから単離してもよい。
【0095】
本発明の他の局面では、血液は、採血管を用いて採取される。ＣｅｌｌＳａｖｅ採血管（Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、安定した細胞形態とサイズを提供する。他の採血管では、細胞の安定性が得られない。他のほとんどの採血管では、細胞が増大し、破裂して採取されることさえある。
【0096】
本発明の更なる一局面では、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、生体サンプルからＣＡＭＬとＣＴＣを分離する。
【0097】
本発明の他の局面は、サンプル中の大きな細胞を同定することであり、細胞をこれ自体ＣＡＭＬ細胞として特異的に同定することに代えて、単に細胞質と核のサイズに基づいて細胞を同定する。このような技術の例としては、Ｈ＆Ｅ染色等のカラーメトリック染色を使用すること又は単にＣＫ（＋）細胞を見ること等が含まれる。
【0098】
サンプルの採取及び処理の例
以下に提供し概説する各実験例では、末梢血をＣｅｌｌＳａｖｅ採血管（Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に採取し、９６時間以内に処理した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）精密濾過技術を用いて、血液サンプル中の癌関連細胞（ＣＴＣ、ＥＭＴ、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、ＣＡＭＬ）を全て採取した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターは、９ｍｍの領域内に７μｍの孔径で１６０，０００個以上の孔が均一に配列されている。試薬は、前処理バッファー（ｐｒｅｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、後処理バッファー（ｐｏｓｔｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、透過化バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、抗体カクテルを含む。濾過には、５ｍＬ／ｍｉｎのシリンジポンプ又は真空ポンプを用いた［８］。濾過工程は、７．５ｍＬの血液を７．５ｍＬの前処理バッファーで前処理した後、フィルターに通すことによって開始した。その後、濾過及び捕捉された細胞に、洗浄、後固定、洗浄、透過化、洗浄を施した。次に、フィルター上の捕捉細胞をＦＩＴＣ－抗サイトケラチン８、１８、１９、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＥｐＣＡＭ、及びＣｙ５－抗ＣＤ４５（５）からなる抗体カクテルで染色した後、洗浄した。フィルターを顕微鏡スライドに置き、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ／ＤＡＰＩ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でカバースリップした。カールツァイスＡｘｉｏＣａｍ付きオリンパスＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を使用し、特定の蛍光キューブとモノクロカメラを用いて細胞を画像化した。細胞間のシグナルを等しく比較するため、露光は、３秒（Ｃｙ５）、２秒（ＰＥ）、１００～７５０ミリ秒（ＦＩＴＣ）、１０～５０ミリ秒（ＤＡＰＩ）にプリセットした。画像処理には、Ｚｅｎ２０１１Ｂｌｕｅ（カールツァイス社）を使用した。
以下に提供し概説する各実験例では、末梢血をＣｅｌｌＳａｖｅ採血管（Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に採取し、９６時間以内に処理した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）精密濾過技術を用いて、血液サンプル中の癌関連細胞（ＣＴＣ、ＥＭＴ、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、ＣＡＭＬ）を全て採取した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターは、９ｍｍの領域内に７μｍの孔径で１６０，０００個以上の孔が均一に配列されている。試薬は、前処理バッファー（ｐｒｅｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、後処理バッファー（ｐｏｓｔｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、透過化バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、抗体カクテルを含む。濾過には、５ｍＬ／ｍｉｎのシリンジポンプ又は真空ポンプを用いた［８］。濾過工程は、７．５ｍＬの血液を７．５ｍＬの前処理バッファーで前処理した後、フィルターに通すことによって開始した。その後、濾過及び捕捉された細胞に、洗浄、後固定、洗浄、透過化、洗浄を施した。次に、フィルター上の捕捉細胞をＦＩＴＣ－抗サイトケラチン８、１８、１９、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＥｐＣＡＭ、及びＣｙ５－抗ＣＤ４５（５）からなる抗体カクテルで染色した後、洗浄した。フィルターを顕微鏡スライドに置き、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ／ＤＡＰＩ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でカバースリップした。カールツァイスＡｘｉｏＣａｍ付きオリンパスＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を使用し、特定の蛍光キューブとモノクロカメラを用いて細胞を画像化した。細胞間のシグナルを等しく比較するため、露光は、３秒（Ｃｙ５）、２秒（ＰＥ）、１００～７５０ミリ秒（ＦＩＴＣ）、１０～５０ミリ秒（ＤＡＰＩ）にプリセットした。画像処理には、Ｚｅｎ２０１１Ｂｌｕｅ（カールツァイス社）を使用した。
【0099】
【0100】
例１
以下の例は、転移性トリプルネガティブ乳癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｍＴＮＢＣ）に対するヒト化モノクローナル抗体レロンリマブによる治療後の治療反応の予測を示している。レロンリマブ（ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ）は、腫瘍のＣＣＲ５マーカーを標的とする。ＣＡＭＬのサイズと数の変化に基づく薬剤効果の中間解析により、治療反応を予測できることが判明した。具体的には、２２人の患者のコホートからベースライン（治療前）の血液サンプルと治療後の血液サンプルが提供された。２２人の患者のうち、２０人は、ＣＡＭＬのサイズに変化がみられ、２人は、ＣＡＭＬのサイズに変化はみられなかったが、ＣＡＭＬの数に変化がみられた。図２の「ＣＡＭＬ減少」と「ＣＡＭＬ増加／混在」は、図１に示す定義に基づいている。「ＣＡＭＬ減少」を示した患者は、「ＣＡＭＬ増加／混在」を示した患者と比較して、ＰＦＳ及びＯＳが増加した（図２Ａ及び２Ｂ参照）。
以下の例は、転移性トリプルネガティブ乳癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｍＴＮＢＣ）に対するヒト化モノクローナル抗体レロンリマブによる治療後の治療反応の予測を示している。レロンリマブ（ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ）は、腫瘍のＣＣＲ５マーカーを標的とする。ＣＡＭＬのサイズと数の変化に基づく薬剤効果の中間解析により、治療反応を予測できることが判明した。具体的には、２２人の患者のコホートからベースライン（治療前）の血液サンプルと治療後の血液サンプルが提供された。２２人の患者のうち、２０人は、ＣＡＭＬのサイズに変化がみられ、２人は、ＣＡＭＬのサイズに変化はみられなかったが、ＣＡＭＬの数に変化がみられた。図２の「ＣＡＭＬ減少」と「ＣＡＭＬ増加／混在」は、図１に示す定義に基づいている。「ＣＡＭＬ減少」を示した患者は、「ＣＡＭＬ増加／混在」を示した患者と比較して、ＰＦＳ及びＯＳが増加した（図２Ａ及び２Ｂ参照）。
【0101】
例２
更なる実験として、ＣＡＭＬとＣＴＣの両方からのデータを組み合わせたアルゴリズムを適用して、治療法の種類に関係なく、患者の治療反応を判定できる。
更なる実験として、ＣＡＭＬとＣＴＣの両方からのデータを組み合わせたアルゴリズムを適用して、治療法の種類に関係なく、患者の治療反応を判定できる。
【0102】
以下は、６つの異なる治療法で治療された８３人の転移性乳癌患者のデータを、上述の方法で解析したものである。治療には、以下が含まれる。
・レロンリマブを基本療法とし、担当腫瘍医の判断に基づき、一部の患者には、カルボ（Ｃａｒｂｏ）を、他の患者には、レロンリマブを投与
・ＢｒｉａＶａｘ、担当腫瘍医の判断に基づき、一部の患者には、ペムブロ（ｐｅｍｂｒｏ）を投与
・ペムブロとビニメチニブ（ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）の併用療法
・Ｈｅｒ２療法
・エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）
・トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）による化学療法
・レロンリマブを基本療法とし、担当腫瘍医の判断に基づき、一部の患者には、カルボ（Ｃａｒｂｏ）を、他の患者には、レロンリマブを投与
・ＢｒｉａＶａｘ、担当腫瘍医の判断に基づき、一部の患者には、ペムブロ（ｐｅｍｂｒｏ）を投与
・ペムブロとビニメチニブ（ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）の併用療法
・Ｈｅｒ２療法
・エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）
・トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）による化学療法
【0103】
図３は、各グループを色分けして、既知のＰＥＴ／ＣＴスキャン（ＲＥＣＩＳＴ１．１）による腫瘍サイズの変化を示すスパイダープロットである。この図からわかるように、腫瘍サイズの縮小とＣＡＭＬのサイズ及び数の減少には相関性がある。
【0104】
図４は、治療導入前後のＣＡＭＬの変化に基づく転移性乳癌患者８３人のＰＦＳのカプランマイヤープロットであり、図１に記載した「ＣＡＭＬ減少」と「ＣＡＭＬ増加／混在」のデータが示されている。この図からわかるように、ＰＦＳとＣＡＭＬのサイズ及び数の減少には相関性がある。
【0105】
図５Ａは、転移性乳癌（ｍＢＣ）患者（ｎ＝１０１）において、ＣＴＣとＣＡＭＬの変化を新たな治療ライン導入の前後で評価するために実施した２年間の前向き単盲検多施設共同研究から得られた結果のＰＦＳのカプランマイヤープロットであり、図５Ｂは、そのＯＳのカプランマイヤープロットである。新たな治療導入前にベースライン（ＢＬ）血液サンプルを採取し、全身療法開始後（約３０日）に２回目のサンプル（Ｔ１）を採取した。ＬｉｆｅＴｒａｃＤｘｘ（登録商標）液体生検検査を実施し、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターを用いてＣＴＣとＣＡＭＬを採取した。ＣＴＣとＣＡＭＬの量とサブタイプを解析した。無増悪生存期間（ＰＦＳ）の定義にはＲＥＣＩＳＴｖ１．１を使用し、２年間の打ち切り単変量解析と多変量解析によってハザード比（ＨＲ）を求めた。
【0106】
ｍＢＣ患者が治療導入後のサンプル（７．５ｍＬの血液）中にＣＴＣを１つのみでも有していた場合、そのＰＦＳとＯＳは、ＣＴＣのない患者よりも有意に短かった（図５Ａ及び図５Ｂ）。ＣＡＭＬのサイズと数が減少した患者は、ＣＡＭＬのサイズと数が増加した患者と、結果が混在する患者よりもＰＦＳとＯＳが良好であった（図５Ａ及び図５Ｂ）。特に、ＣＴＣは、ベースライン時（ＢＬ）で患者の３５％（ｎ＝３５／１０１）、治療後のサンプル採取時（Ｔ１）で患者の２６％（ｎ＝２６／１０１）において同定された。Ｔ１時点での単一のＣＴＣは、ＰＦＳ ＨＲ＝６．５、ｐ＜０．０００１、ＯＳ ＨＲ＝５．２、ｐ＝０．００１８８の予後不良を強く示唆した。ＣＡＭＬは、ＢＬでは、患者の９３％（ｎ＝９４／１１）、Ｔ１では、患者の８６％（ｎ＝８７／１０１）に認められた。ＣＡＭＬ減少（すなわち、サイズ／数）は、ＣＴＣがない場合のＰＦＳの有意の予後改善（ＨＲ＝２．８、ｐ＝０．０００２９、ＯＳ ＨＲ＝２．６、ｐ＝０．０１８９５）を示唆した。Ｔ１で１個以上のＣＴＣを有する患者（ｎ＝２６）のＰＦＳ中央値は、２．４箇月、ＯＳ中央値は、４．７箇月であった。ＣＴＣがなく、ＣＡＭＬの増加／混在を認めた患者（ｎ＝３６）のＰＦＳ中央値は、５．９箇月、ＯＳ中央値は、１４．１箇月であった。ＣＴＣなく、ＣＡＭＬの減少が認められた患者（ｎ＝３９）のＰＦＳ中央値は、１５．０箇月、ＯＳ中央値は、１８．８箇月であった。
【0107】
更に、図１で使用したアルゴリズムは、多種多様な固形腫瘍に適用できることがわかった。図６Ａは、治療導入前後のＣＡＭＬの変化とフォローアップ時のＣＴＣの存在に基づく転移性癌患者２２０人のＰＦＳのカプランマイヤープロットであり、図６Ｂは、そのＯＳのカプランマイヤープロットである。患者らは、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膵臓癌、肉腫、及び肝臓癌の癌患者である。治療導入後のサンプル（血液７．５ｍＬ）にＣＴＣが１つでもあれば、ＰＦＳとＯＳは、ＣＴＣのない患者より有意に短かった。ＣＡＭＬのサイズと数が減少した患者は、ＣＡＭＬのサイズと数が増加した患者と混在した患者よりもＰＦＳとＯＳが良好であった。
【0108】
図６で使用した同じ患者グループのデータを、ＣＡＭＬのサイズ≧５０μｍ又は＜５０μｍ、及びフォローアップ時のＣＴＣの有無に基づいて再解析した。図７Ａは、図６と同じ２２０人の転移性癌患者のＰＦＳのカプランマイヤープロットであり、図７Ｂは、ＯＳのカプランマイヤープロットである。治療導入後、サンプル中にＣＡＭＬ≧５０μｍ又は少なくとも１つのＣＴＣのいずれかを有する患者は、ＰＦＳ及びＯＳが不良である。
【0109】
例３
腫瘍上のＣＣＲ５マーカーを標的とする薬剤を用いたＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）臨床試験を実施した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）アッセイを実施し、これらの細胞上のＣＣＲ５マーカーの染色を含むＣＴＣ及びＣＡＭＬに関する情報を得た。ＣＣＲ５薬剤は、腫瘍を死滅させない。臨床試験終了時、データの初期解析から、異なる情報の組み合わせにより、薬剤反応性の有用な層別化が可能であることが判明した。
腫瘍上のＣＣＲ５マーカーを標的とする薬剤を用いたＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）臨床試験を実施した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）アッセイを実施し、これらの細胞上のＣＣＲ５マーカーの染色を含むＣＴＣ及びＣＡＭＬに関する情報を得た。ＣＣＲ５薬剤は、腫瘍を死滅させない。臨床試験終了時、データの初期解析から、異なる情報の組み合わせにより、薬剤反応性の有用な層別化が可能であることが判明した。
【0110】
２５人の患者のＰＦＳ及びＯＳを示す図８Ａからわかるように、ベースラインを基準として、ＣＣＲ５薬剤の初回治療サイクル後約３０日目におけるＣＡＭＬのサイズの減少及びＣＡＭＬの数の減少は、薬剤に対する反応者及び非反応者の層別化に有益であった。
【0111】
４人の患者は、ＣＣＲ５治療薬の初回治療後３０日目のフォローアップ採血を受けなかった。ＣＡＭＬが５０μｍ未満の患者は、ＣＡＭＬが大きい患者よりも良好な結果が得られる確率が高い傾向があるため、これら４名のベースライン時のＣＡＭＬのサイズを以下の方法でデータに含ませた。３０日目のフォローアップがなく、全てのＣＡＭＬが５０μｍ未満であった患者は、ＣＣＲ５薬の初回治療サイクル後３０日目にＣＡＭＬのサイズが減少した又はＣＡＭＬの数が減少した１８人の患者と同じグループにグループ化した。図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ修正されたＰＦＳ及びＯＳを示している。
【0112】
これらの２つの例は、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）血液検査が、単一のマーカーを単独で解析するよりも、癌及び／又は薬剤に対する反応について、より有用な情報を提供できることを示している。
【0113】
例４
ＣＡＭＬは、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）患者の循環中に広く存在し、炎症性腫瘍微小環境を表す巨大な貪食マクロファージとして出現する。治療後に５０μｍ以上の肥大したＣＡＭＬを有する患者は、予後不良であることが以前に示されている。しかしながら、化学放射線療法（ＣＲＴ）や免疫療法（ＩＭＴ）等の治療に対するＣＡＭＬの動的な経時的変化の解析は、これまで評価されていない。ＣＲＴ単独（ｎ＝９１）又はＩＭＴ併用（ｎ＝９１）治療を受けた切除不能ＮＳＣＬＣステージＩＩ／ＩＩＩ患者ｎ＝１８２人のモニタリングを行い、無増悪生存期間（ＰＦＳ）又は全生存期間（ＯＳ）に関連するＣＲＴ導入前後のＣＡＭＬの変化を評価した。
ＣＡＭＬは、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）患者の循環中に広く存在し、炎症性腫瘍微小環境を表す巨大な貪食マクロファージとして出現する。治療後に５０μｍ以上の肥大したＣＡＭＬを有する患者は、予後不良であることが以前に示されている。しかしながら、化学放射線療法（ＣＲＴ）や免疫療法（ＩＭＴ）等の治療に対するＣＡＭＬの動的な経時的変化の解析は、これまで評価されていない。ＣＲＴ単独（ｎ＝９１）又はＩＭＴ併用（ｎ＝９１）治療を受けた切除不能ＮＳＣＬＣステージＩＩ／ＩＩＩ患者ｎ＝１８２人のモニタリングを行い、無増悪生存期間（ＰＦＳ）又は全生存期間（ＯＳ）に関連するＣＲＴ導入前後のＣＡＭＬの変化を評価した。
【0114】
具体的には、ＣＲＴ単独治療（ｎ＝９１）、ＣＲＴ及びアテゾリズマブ同時併用治療（ｎ＝４０、臨床試験ＮＣＴ０２５２５７５７）、デュルバルマブ同時併用治療（ｎ＝５１）の３つの異なるレジームから患者をプロスペクティブに用意した。病理学的にステージＩＩ／ＩＩＩと確定された切除不能ＮＳＣＬＣ患者１８２人を集めた。治療開始前のベースライン時（ＢＬ）とＣＲＴ導入後約５週間（Ｔ１）に合計１５ｍＬの血液サンプルを採取した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）フィルターを用いて血液濾過を行い、ＣＡＭＬを同定及び測定し、２年後のＰＦＳとＯＳのハザード比（ＨＲ）を単変量解析と多変量解析で評価した。解析では、ＣＡＭＬのサイズが閾値より増加した患者と、ＣＡＭＬのサイズが減少した患者やＣＡＭＬに変化がない患者を含む、変化が閾値以下の患者を比較した。
【0115】
その結果、ＢＬとＴ１の間でＣＡＭＬのサイズが１０～５０μｍ増加した症例は、ＰＦＳとＯＳの短縮と相関した（データ非表示）。ＢＬとＴ１間のＣＡＭＬのサイズ３５μｍの増加は、ＰＦＳとＯＳの観点から患者を層別化するのに最適であった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。３５μｍのＣＡＭＬのサイズの増加は、ＣＲＴで治療された患者のＰＦＳとＯＳを有意に層別化したが、ＩＭＴで治療された患者では有意ではなかった（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
【0116】
例５
ＣＡＭＬのサイズと数に加え、腫瘍の特性の幾つかは、癌の攻撃性を示すこともある。その一例がマーカーＣＸＣＲ４である。３０人の膵臓癌患者の末梢血をＣＸＣＲ４の発現について解析した。ＣＴＣ、ＣＡＭＬ、ＥＭＴのＰＦＳ及びＯＳのカプランマイヤープロットをＣＸＣＲ４発現について解析した。ＣＴＣにおけるＣＸＣＲ４は、進行の有意な予測因子（ＨＲ＝１．６、９５％ＣＩ０．４－５．４、ｐ＝０．６４５）（図１１Ａ）でもＯＳの有意な予測因子（ＨＲ＝１．７、９５％ＣＩ０．５－５．６、ｐ＝０．４９７）（図１１Ｂ）でもないことが判明した。一方、ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４の高発現は、有意に速い進行（ＨＲ＝４．０、９５％ＣＩ１．５－１０．５、ｐ＝０．０１２）（図１１Ｃ）と有意に高い死亡率（ＨＲ＝４．８、９５％ＣＩ１．７－１３．１、ｐ＝０．００６）（図１１Ｄ）と関連していた。更に、ＥＭＴにおけるＣＸＣＲ４の発現も進行と生存に関連していると考えられ、ＥＭＴにＣＸＣＲ４を高発現している患者は、進行が有意に速く（ＨＲ＝４．６、９５％ＣＩ１．３－１５．４、ｐ＝０．０３３）（図１１Ｅ）、死亡率が高い（ＨＲ＝５．４、９５％ＣＩ１．５－１９．２、ｐ＝０．０２１）（図１１Ｆ）。
ＣＡＭＬのサイズと数に加え、腫瘍の特性の幾つかは、癌の攻撃性を示すこともある。その一例がマーカーＣＸＣＲ４である。３０人の膵臓癌患者の末梢血をＣＸＣＲ４の発現について解析した。ＣＴＣ、ＣＡＭＬ、ＥＭＴのＰＦＳ及びＯＳのカプランマイヤープロットをＣＸＣＲ４発現について解析した。ＣＴＣにおけるＣＸＣＲ４は、進行の有意な予測因子（ＨＲ＝１．６、９５％ＣＩ０．４－５．４、ｐ＝０．６４５）（図１１Ａ）でもＯＳの有意な予測因子（ＨＲ＝１．７、９５％ＣＩ０．５－５．６、ｐ＝０．４９７）（図１１Ｂ）でもないことが判明した。一方、ＣＡＭＬにおけるＣＸＣＲ４の高発現は、有意に速い進行（ＨＲ＝４．０、９５％ＣＩ１．５－１０．５、ｐ＝０．０１２）（図１１Ｃ）と有意に高い死亡率（ＨＲ＝４．８、９５％ＣＩ１．７－１３．１、ｐ＝０．００６）（図１１Ｄ）と関連していた。更に、ＥＭＴにおけるＣＸＣＲ４の発現も進行と生存に関連していると考えられ、ＥＭＴにＣＸＣＲ４を高発現している患者は、進行が有意に速く（ＨＲ＝４．６、９５％ＣＩ１．３－１５．４、ｐ＝０．０３３）（図１１Ｅ）、死亡率が高い（ＨＲ＝５．４、９５％ＣＩ１．５－１９．２、ｐ＝０．０２１）（図１１Ｆ）。
【0117】
このように、ＣＸＣＲ４発現は、ＣＡＭＬ＜５０μｍグループ又はＣＡＭＬ減少グループの患者のうち、早く進行するか早く死亡する患者を更に層別化するために用いることができる。
【0118】
例６
単盲検、複数年のプロスペクティブスタディを行って、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＰＦＳ／ＯＳを得るためのＰＤ－Ｌ１発現とＣＡＭＬのサイズの関係を検証した。９６人の患者が化学放射線療法（ＣＲＴ）後に免疫療法を受けた。これには、アテゾリズマブ（プロスペクティブシングルアームＮＣＴ０２５２５７５７）ｎ＝３９人、デュルバルマブｎ＝５２人、ペムブロリズマブｎ＝５人が含まれた。血液サンプル（７．５ｍＬ）は、ベースライン時（ＢＬ）、ＣＲＴ終了時（Ｔ１）、及び免疫療法後のＣＲＴから約１箇月後（Ｔ２）に採取した。血液は、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）で濾過した。ＣＡＭＬのサイズとＰＤ－Ｌ１発現を解析した。ＣＲＴ後に免疫療法を１－２治療サイクル行った後にＰＦＳ及びＯＳのデータを解析した。Ｔ２時点の患者数は、８０人に減少した。
単盲検、複数年のプロスペクティブスタディを行って、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＰＦＳ／ＯＳを得るためのＰＤ－Ｌ１発現とＣＡＭＬのサイズの関係を検証した。９６人の患者が化学放射線療法（ＣＲＴ）後に免疫療法を受けた。これには、アテゾリズマブ（プロスペクティブシングルアームＮＣＴ０２５２５７５７）ｎ＝３９人、デュルバルマブｎ＝５２人、ペムブロリズマブｎ＝５人が含まれた。血液サンプル（７．５ｍＬ）は、ベースライン時（ＢＬ）、ＣＲＴ終了時（Ｔ１）、及び免疫療法後のＣＲＴから約１箇月後（Ｔ２）に採取した。血液は、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）で濾過した。ＣＡＭＬのサイズとＰＤ－Ｌ１発現を解析した。ＣＲＴ後に免疫療法を１－２治療サイクル行った後にＰＦＳ及びＯＳのデータを解析した。Ｔ２時点の患者数は、８０人に減少した。
【0119】
７．５ｍＬの血液中に５０μｍ以上の大きなＣＡＭＬが１つでも認められた患者は、ＰＦＳとＯＳが短かった（データ非表示）。このスタディは、免疫療法に関するものであったため、図１２に示すように、ＰＤ－Ｌ１発現によってＰＦＳとＯＳをよりよく層別化できた。ＰＤ－Ｌ１発現が中等度から高度の患者は、免疫療法から有意な利益を得た。
【0120】
ＣＡＭＬのサイズとＰＤ－Ｌ１発現の両方が同じＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）アッセイから得られたので、データは、（１）ＰＤ－Ｌ１低ＣＡＭＬ小、（２）ＰＤ－Ｌ１低ＣＡＭＬ大、（３）ＰＤ－Ｌ１高ＣＡＭＬ小、（４）ＰＤ－Ｌ１高ＣＡＭＬ大の４つのカテゴリーにまとめて解析することもできる。「ＣＡＭＬ大」とは、サンプル中の１つ又は複数のＣＡＭＬが５０μｍ以上であることを意味する。「ＣＡＭＬ小」とは、サンプル中の全てのＣＡＭＬが５０μｍ未満であることを意味する。図１３に示すように、ＰＤ－Ｌ１が低くＣＡＭＬが大きい患者は、ＰＦＳとＯＳが有意に不良であった。ＰＦＳについては、グループ２と、グループ１、３、４とを比較し、ＨＲ＝９．０（９５％Ｃｌ３．５－２２．９）、ｐ＜０．００００１であった。ＯＳについては、グループ２と、グループ１、３、４とを比較し、ＨＲ＝１４．７（９５％Ｃｌ４．８－４４．８１）、ｐ＜０．００００１であった。
【0121】
このアッセイは、１－２回の免疫療法を行った直後に免疫療法に反応しない患者を判定するのに非常に有用であった。
【0122】
例７
ＣＡＭＬは、腫瘍微小環境のリアルタイムの炎症性ＰＤ－Ｌ１の状態と並行していると考えられる。これまでに、局所非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、ＣＡＭＬ上のＰＤ－Ｌ１発現は動的であり、無増悪生存期間（ＰＦＳ）と全生存期間（ＯＳ）に基づき、後続するサンプリングにおける化学療法導入後（約３０日）のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１免疫療法（ＩＭＴ）に対する反応を予測できることが実証されている。しかしながら、これは、再発ＮＳＣＬＣでは、検証されていなかった。そこで、化学療法導入前後（約３０日）のＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現をモニタリングし、ＩＭＴを併用又は非併用で治療した再発ＮＳＣＬＣ患者におけるＣＡＭＬのＰＤ－Ｌ１予測能を評価した。
ＣＡＭＬは、腫瘍微小環境のリアルタイムの炎症性ＰＤ－Ｌ１の状態と並行していると考えられる。これまでに、局所非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、ＣＡＭＬ上のＰＤ－Ｌ１発現は動的であり、無増悪生存期間（ＰＦＳ）と全生存期間（ＯＳ）に基づき、後続するサンプリングにおける化学療法導入後（約３０日）のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１免疫療法（ＩＭＴ）に対する反応を予測できることが実証されている。しかしながら、これは、再発ＮＳＣＬＣでは、検証されていなかった。そこで、化学療法導入前後（約３０日）のＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現をモニタリングし、ＩＭＴを併用又は非併用で治療した再発ＮＳＣＬＣ患者におけるＣＡＭＬのＰＤ－Ｌ１予測能を評価した。
【0123】
単盲検複数年プロスペクティブスタディを実施して、再発ｍＮＳＣＬＣにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ＩＭＴを追加投与した場合（ｎ＝４１）又は追加投与しない場合（ｎ＝４１）のＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１発現と化学療法導入前後のＰＦＳ及びＯＳとの関係を検証した。これには、アテゾリズマブ（ｎ＝４）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ｎ＝８）、ペムブロリズマブ（ｎ＝２９）である３つのＩＭＴが含まれた。新たに再発した疾患に対する治療前に病理学的に再発が確認されたＮＳＣＬＣ患者８２人を集めた。血液サンプル（１５ｍＬ）は、ベースライン（ＢＬ）、化学療法前、及び化学療法後約３０日目（Ｔ１）に採取した。血液をＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）で濾過し、ＣＡＭＬ発現を高スコアと低スコアの２値に分け、２４箇月後のＰＦＳとＯＳのハザード比（ＨＲ）を打切り単変量解析と多変量解析で評価した。
【0124】
その結果、ＣＡＭＬは、入手可能な全サンプルの９７％に認められ、ＢＬでは、９４％、Ｔ１では、１００％であった（図１４、図１５）。ＢＬにおいて、ＩＭＴ治療を受けなかった患者におけるＰＤ－Ｌ１高値は、ＰＦＳ（ｐ＝０．８２５）及びＯＳ（ｐ＝０．５１８）に対して有意ではなかった。Ｔ１では、ＩＭＴ治療を受けなかった患者におけるＰＤ－Ｌ１高値は、ＰＦＳ（ＨＲ＝１．１０、ｐ＝０．９３７）、ＯＳ（ＨＲ＝１．７５、ｐ＝０．２９８）ともに有意ではなかった。Ｔ１では、ＩＭＴ治療を受けた患者におけるＰＤ－Ｌ１高値患者は、ＰＦＳ（ＨＲ＝３．１９、ｐ＝０．０１１２）が有意に良好であり、ＯＳ（ＨＲ＝２．３７、ｐ＝０．０８０９）は、境界域であった。ＢＬとＴ１の間でＰＤ－Ｌ１発現が増加した患者は、ＰＦＳ（ＨＲ＝３．４９、ｐ＝０．０００９）とＯＳ（ＨＲ＝２．８８、ｐ＝０．０４３０）が有意に良好であった。
【0125】
したがって、再発ＮＳＣＬＣにおいて、ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１高発現は、ＩＭＴ使用による予後を示し、ＣＲＴ後の併用されたＩＭＴに対する反応を予測する。ＣＡＭＬにおけるＰＤ－Ｌ１の動的変化のモニタリングにより、再発ＮＳＣＬＣにおける免疫療法の有効性を予測できると考えられる。
【0126】
引用
１． Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. PNAS 2014, 111(9):351-3519.
２． International Patent Appln. Publn. No. WO 2013/181532, dated December 5, 2013.
３． International Patent Appln. Publn. No. WO 2016/33103, dated March 3, 2016.
４． International Patent Appln. Publn. No. WO 2018/151865, dated August 23, 2018.
５． International Patent Appln. Publn. No. WO 2019/178226, dated September 19, 2019.
６． International Patent Appln. Publn. No. WO 2018/184005, dated October 4, 2018.
７． Ballman, K.V., Biomarker: Predictive or Prognostic? J. Clin. Oncol. 2015, 33(33):3968-3972.
８． Adams DL, et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv 2014, 4:4334-4342.
１． Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. PNAS 2014, 111(9):351-3519.
２． International Patent Appln. Publn. No. WO 2013/181532, dated December 5, 2013.
３． International Patent Appln. Publn. No. WO 2016/33103, dated March 3, 2016.
４． International Patent Appln. Publn. No. WO 2018/151865, dated August 23, 2018.
５． International Patent Appln. Publn. No. WO 2019/178226, dated September 19, 2019.
６． International Patent Appln. Publn. No. WO 2018/184005, dated October 4, 2018.
７． Ballman, K.V., Biomarker: Predictive or Prognostic? J. Clin. Oncol. 2015, 33(33):3968-3972.
８． Adams DL, et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv 2014, 4:4334-4342.
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記対象から取得された治療前のサンプル（治療前サンプル）及び治療後のサンプル（治療後サンプル）におけるＣＡＭＬのサイズ及び数を判定及び比較し、これに基づいて予測を行うことを含み、前記治療後サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬよりも大きく、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数よりも多い場合、前記対象は、治療に反応しないと予測する情報を提供する、前記方法。
【請求項2】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同じであり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない場合、前記対象は、前記治療から利益を得る又は前記治療に反応する可能性があるとの情報を提供する、前記方法。
【請求項3】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが減少している又はサイズが同じであり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い又は前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、前記対象は、前記治療から利益を得られない又は前記治療に反応しない可能性があるとの情報を提供する、前記方法。
【請求項4】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同じであり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が、前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より少ない又は前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数と同じである場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は前記治療に反応しない可能性があるとの情報を提供する、前記方法。
【請求項5】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求めることを含み、前記治療後サンプル中の最大のＣＡＭＬが、前記治療前サンプル中の最大のＣＡＭＬと比較して、サイズが増加している又はサイズが同じであり、前記治療後サンプル中のＣＡＭＬの数が前記治療前サンプル中のＣＡＭＬの数より多い場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性があるとの情報を提供する、前記方法。
【請求項6】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、ＣＴＣについて前記サンプルをアッセイすることを含み、前記サンプル中に１つ又は複数のＣＴＣが検出された場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性があるとの情報を提供する、前記方法。
【請求項7】
癌に罹患している対象における治療反応を予測するための情報を提供する方法であって、前記癌に罹患している対象から少なくとも１つの治療前サンプルを取得し、前記対象から少なくとも１つの治療後サンプルを取得し、（ｉ）前記治療前サンプルと前記治療後サンプルとの間のＣＡＭＬの数及びサイズを比較して差異を求め、（ｉｉ）前記治療後サンプル中のＣＴＣの数を判定することを含み、前記ＣＡＭＬの数及び／又はサイズに差異が認められた場合、及び／又は少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、治療反応を予測する情報を提供する、前記方法。
【請求項8】
前記治療後サンプルにおいて少なくとも１つのＣＴＣが検出された場合、前記対象は、治療から利益を得られない又は治療に反応しない可能性があるとの情報を提供する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＣＡＭＬは、（ａ）１４～６４μｍのサイズを有する複数の個々の核及び／又は１つ若しくは複数の融合核；
（ｂ）２０～３００μｍの細胞サイズ；および
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、
の特徴を有する、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＡＭＬは、（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｍ）上皮性癌細胞ＣＫ８、ＣＫ１８、及び／又はＣＫ１９マーカー発現
のうちの１つ又は複数の特徴を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記サンプルのサイズは、５～５０ｍＬである、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記サンプルの供給源は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、尿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および凍結保存ＰＢＭＣのうちの１つ又は複数である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記サンプルは、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、子宮癌、尿路上皮癌、膀胱癌、子宮内膜癌、胆管癌、神経内分泌癌、又は他の固形腫瘍癌である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣが、サイズ排除法、免疫捕捉、デンドリマー媒介多価細胞捕捉、親和性に基づく表面捕捉、バイオミメティック表面コーティング捕捉、セレクチンコーティング表面捕捉、その他の機能化表面捕捉、慣性集束チップ、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ分離、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いてサンプルから単離される、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いてサンプルから単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記マイクロフィルターが、５μｍから２０μｍの範囲の孔径を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形、及び／又は長方形の孔形状を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記マイクロフィルターは、精密な孔形状及び均一な孔分布を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記ＣＡＭＬ及び前記ＣＴＣは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介する、マイクロ流体チップを使用して単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＡＭＬ及び前記ＣＴＣは、前記ＣＡＭＬは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記治療は、化学療法、単剤療法、薬剤の併用療法、免疫療法、標的療法、放射線療法、化学放射線療法、放射線と単剤又は複数の薬剤の併用療法、化学放射線療法と単一又は複数の薬剤の併用療法、癌ワクチン療法、および細胞療法のうちから選択される１つ又は複数である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記治療は、癌ワクチンである、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】