特表 2024-529425 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集系のためのガイドＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集系のためのガイドＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240730BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/33

C12N15/09 110

C12N15/55

C12N9/78

C12N9/16 Z

A61K48/00

A61P3/00

A61P1/16

A61K31/7105

A61K31/712

A61K31/7125

A61K38/46

C07K7/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504461

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2024-03-21

(86)【国際出願番号】 US2022074041

(87)【国際公開番号】W WO2023004409

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/255,927

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/225,322

(32)【優先日】2021-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520439645

【氏名又は名称】ビーム セラピューティクス インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】キャファティ、ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】パッカー、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】アラティン－シャウス、イヴォンヌ

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ロー－イ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC22

4C084MA24

4C084NA14

4C084ZA751

4C084ZC211

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA24

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZC21

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA14

4H045BA54

4H045CA01

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、とりわけ、ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたガイドＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）、並びにそれを作製するための方法、及びそれを使用するための方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、化学部分及びペプチドスペーサーを含むリンカーを介して、核局在化配列（ＮＬＳ）のＮ末端にコンジュゲートされる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、リンカーを介して前記ｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、前記リンカーが、前記ｇＲＮＡの３’又は５’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。

【請求項2】

前記ｇＲＮＡが、１つ以上の修飾を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。

【請求項3】

１つ以上の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－フルオロ、又はホスホロチオエート連結である、請求項２に記載のｇＲＮＡ。

【請求項4】

前記ｇＲＮＡが、３’末端及び／又は５’末端に１つ以上の修飾を含む、請求項２又は３に記載のｇＲＮＡ。

【請求項5】

前記１つ以上の修飾が、前記ｇＲＮＡの３’末端から１、２、３、４、及び／又は５個のヌクレオチドで生じる、請求項４に記載のｇＲＮＡ。

【請求項6】

前記１つ以上の修飾が、前記ｇＲＮＡの５’末端から１、２、３、４、及び／又は５個のヌクレオチドで生じる、請求項２～５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項7】

ｇＲＮＡの４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％超のヌクレオチドが、修飾されている、請求項２～６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項8】

前記ＮＬＳが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項9】

前記ＮＬＳが、ＫＫＫＲＫＶ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のｇＲＮＡ。

【請求項10】

前記リンカーが、ペプチドスペーサーを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項11】

前記ペプチドスペーサーが、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のｇＲＮＡ。

【請求項12】

前記リンカーが、前記ｇＲＮＡを、前記ペプチドスペーサー又は前記ＮＬＳにコンジュゲートする化学部分を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項13】

前記化学部分が、前記ペプチドスペーサー若しくは前記ＮＬＳアミノ酸配列のＮ末端、及び／又は前記ｇＲＮＡの３’末端に共有結合している、請求項１２に記載のｇＲＮＡ。

【請求項14】

前記化学部分が、前記ペプチドスペーサー又は前記ＮＬＳのシステイン残基に共有結合している、請求項１２又は１３に記載のｇＲＮＡ。

【請求項15】

前記化学部分が、マレイミド－チオール付加物を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項16】

前記ＮＬＳを含む前記ｇＲＮＡが、前記ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を改善する、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項17】

前記ｇＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡである、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項18】

前記ｇＲＮＡが、ＳａＣａｓ９骨格配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項19】

前記ｇＲＮＡが、ＳａＣａｓ９又はそのバリアントに結合したとき、核酸配列５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’、又は５’－ＧＡＧＡＡＴ－３’に対するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有する、請求項１８に記載のｇＲＮＡ。

【請求項20】

前記ｇＲＮＡが、核酸配列：５’－ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ－３’（配列番号２）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項21】

ｇＲＮＡが、以下の核酸配列：
ＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（配列番号２７）、及び
ＣＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（配列番号２８）のうちの１つを含むか又はそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。

【請求項22】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合しているか又はそれに封入されている先行請求項のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、組成物。

【請求項23】

前記ＬＮＰが、塩基エディターをコードするｍＲＮＡを更に含み、
（ｉ）任意選択的に、前記塩基エディターが、Ｃａｓ９ドメイン及び少なくとも１つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含み、前記アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、以下のアミノ酸配列のアミノ酸位置８２にグリシン（Ｇ）、アミノ酸位置１４７にスレオニン（Ｔ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置１５４にセリン（Ｓ）、並びにアミノ酸位置３６にヒスチジン（Ｈ）、アミノ酸位置７６にチロシン、アミノ酸位置１４９にチロシン、アミノ酸位置１５７にリジン（Ｋ）、及びアミノ酸位置１６７にアスパラギン（Ｎ）のうちの１つ以上を含み、前記アデノシンデアミナーゼが、前記アミノ酸配列
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、若しくは９８％の同一性、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を有し、
（ｉｉ）任意選択的に、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、配列番号３：ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に関して、以下の改変の組み合わせ
ａ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、
ｂ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｃ）Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｄ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｅ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｆ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｇ）Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｈ）Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋ、
ｉ）Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、若しくは
ｊ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎのいずれか、
又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変の組み合わせを含み、
（ｉｉｉ）任意選択的に、前記アデノシンデアミナーゼバリアントが、配列番号３の以下の改変の組み合わせＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を含み。
（ｉｖ）任意選択的に、前記Ｃａｓ９ドメインが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）であり、
（ｖ）任意選択的に、前記ｍＲＮＡが、アミノ酸配列：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＹＤＡＴＬＹＧＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＤＦＹＲＭＰＲＳＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＮＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＫＲＮＹＩＬＧＬＡＩＧＩＴＳＶＧＹＧＩＩＤＹＥＴＲＤＶＩＤＡＧＶＲＬＦＫＥＡＮＶＥＮＮＥＧＲＲＳＫＲＧＡＲＲＬＫＲＲＲＲＨＲＩＱＲＶＫＫＬＬＦＤＹＮＬＬＴＤＨＳＥＬＳＧＩＮＰＹＥＡＲＶＫＧＬＳＱＫＬＳＥＥＥＦＳＡＡＬＬＨＬＡＫＲＲＧＶＨＮＶＮＥＶＥＥＤＴＧＮＥＬＳＴＫＥＱＩＳＲＮＳＫＡＬＥＥＫＹＶＡＥＬＱＬＥＲＬＫＫＤＧＥＶＲＧＳＩＮＲＦＫＴＳＤＹＶＫＥＡＫＱＬＬＫＶＱＫＡＹＨＱＬＤＱＳＦＩＤＴＹＩＤＬＬＥＴＲＲＴＹＹＥＧＰＧＥＧＳＰＦＧＷＫＤＩＫＥＷＹＥＭＬＭＧＨＣＴＹＦＰＥＥＬＲＳＶＫＹＡＹＮＡＤＬＹＮＡＬＮＤＬＮＮＬＶＩＴＲＤＥＮＥＫＬＥＹＹＥＫＦＱＩＩＥＮＶＦＫＱＫＫＫＰＴＬＫＱＩＡＫＥＩＬＶＮＥＥＤＩＫＧＹＲＶＴＳＴＧＫＰＥＦＴＮＬＫＶＹＨＤＩＫＤＩＴＡＲＫＥＩＩＥＮＡＥＬＬＤＱＩＡＫＩＬＴＩＹＱＳＳＥＤＩＱＥＥＬＴＮＬＮＳＥＬＴＱＥＥＩＥＱＩＳＮＬＫＧＹＴＧＴＨＮＬＳＬＫＡＩＮＬＩＬＤＥＬＷＨＴＮＤＮＱＩＡＩＦＮＲＬＫＬＶＰＫＫＶＤＬＳＱＱＫＥＩＰＴＴＬＶＤＤＦＩＬＳＰＶＶＫＲＳＦＩＱＳＩＫＶＩＮＡＩＩＫＫＹＧＬＰＮＤＩＩＩＥＬＡＲＥＫＮＳＫＤＡＱＫＭＩＮＥＭＱＫＲＮＲＱＴＮＥＲＩＥＥＩＩＲＴＴＧＫＥＮＡＫＹＬＩＥＫＩＫＬＨＤＭＱＥＧＫＣＬＹＳＬＥＡＩＰＬＥＤＬＬＮＮＰＦＮＹＥＶＤＨＩＩＰＲＳＶＳＦＤＮＳＦＮＮＫＶＬＶＫＱＥＥＮＳＫＫＧＮＲＴＰＦＱＹＬＳＳＳＤＳＫＩＳＹＥＴＦＫＫＨＩＬＮＬＡＫＧＫＧＲＩＳＫＴＫＫＥＹＬＬＥＥＲＤＩＮＲＦＳＶＱＫＤＦＩＮＲＮＬＶＤＴＲＹＡＴＲＧＬＭＮＬＬＲＳＹＦＲＶＮＮＬＤＶＫＶＫＳＩＮＧＧＦＴＳＦＬＲＲＫＷＫＦＫＫＥＲＮＫＧＹＫＨＨＡＥＤＡＬＩＩＡＮＡＤＦＩＦＫＥＷＫＫＬＤＫＡＫＫＶＭＥＮＱＭＦＥＥＫＱＡＥＳＭＰＥＩＥＴＥＱＥＹＫＥＩＦＩＴＰＨＱＩＫＨＩＫＤＦＫＤＹＫＹＳＨＲＶＤＫＫＰＮＲＥＬＩＮＤＴＬＹＳＴＲＫＤＤＫＧＮＴＬＩＶＮＮＬＮＧＬＹＤＫＤＮＤＫＬＫＫＬＩＮＫＳＰＥＫＬＬＭＹＨＨＤＰＱＴＹＱＫＬＫＬＩＭＥＱＹＧＤＥＫＮＰＬＹＫＹＹＥＥＴＧＮＹＬＴＫＹＳＫＫＤＮＧＰＶＩＫＫＩＫＹＹＧＮＫＬＮＡＨＬＤＩＴＤＤＹＰＮＳＲＮＫＶＶＫＬＳＬＫＰＹＲＦＤＶＹＬＤＮＧＶＹＫＦＶＴＶＫＮＬＤＶＩＫＫＥＮＹＹＥＶＮＳＫＣＹＥＥＡＫＫＬＫＫＩＳＮＱＡＥＦＩＡＳＦＹＮＮＤＬＩＫＩＮＧＥＬＹＲＶＩＧＶＮＮＤＬＬＮＲＩＥＶＮＭＩＤＩＴＹＲＥＹＬＥＮＭＮＤＫＲＰＰＲＩＩＫＴＩＡＳＫＴＱＳＩＫＫＹＳＴＤＩＬＧＮＬＹＥＶＫＳＫＫＨＰＱＩＩＫＫＧＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６５）、又はそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、若しくは９８％同一のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる塩基エディターをコードする、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

ヌクレアーゼ又は前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む組成物。

【請求項25】

ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン又は前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインをコードするｍＲＮＡを更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む組成物。

【請求項26】

前記組成物が、ｇＲＮＡ及び前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１：１～１０：１の比率で含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

前記組成物が、ｇＲＮＡ及び前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１：１の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記組成物が、ｇＲＮＡ及び前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを３：１の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項29】

前記組成物が、ｇＲＮＡ及び前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを９：１の比率で含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項30】

前記ヌクレアーゼ又は前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓタンパク質である、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、又はＣａｓ１３である、請求項３０に記載の組成物。

【請求項33】

前記ヌクレアーゼ又は前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ニッカーゼである、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

前記ヌクレアーゼ又は前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、修飾されている、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

前記ヌクレアーゼ又は前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、異種ポリペプチドに融合している、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記異種ポリペプチドが、デアミナーゼドメインである、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

複合体であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメインであって、前記アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、以下のアミノ酸配列のアミノ酸位置８２にグリシン（Ｇ）、アミノ酸位置１４７にスレオニン（Ｔ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置１５４にセリン（Ｓ）、並びにアミノ酸位置３６にヒスチジン（Ｈ）、アミノ酸位置７６にチロシン、アミノ酸位置１４９にチロシン、アミノ酸位置１５７にリジン（Ｋ）、及びアミノ酸位置１６７にアスパラギン（Ｎ）のうちの１つ以上を含み、前記アデノシンデアミナーゼが、前記アミノ酸配列
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に対して少なくとも約８５％の同一性、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を有する、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメインと、
（ｉｉ）請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、を含む、複合体。

【請求項38】

複合体であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメインであって、前記アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、配列番号３：ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に関して、以下の改変の組み合わせ
ａ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、
ｂ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｃ）Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｄ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｅ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｆ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｇ）Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｈ）Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋ、
ｉ）Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、若しくは
ｊ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎのいずれか、
又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変の組み合わせを含む、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメインと、
（ｉｉ）請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、を含む、複合体。

【請求項39】

前記アデノシンデアミナーゼが、配列番号３に対して少なくとも約９０％又は約９５％の同一性を有する、請求項３７又は３８に記載の複合体。

【請求項40】

前記アデノシンデアミナーゼが、配列番号３を含むか又はそれから本質的になる、請求項３７又は３８に記載の複合体。

【請求項41】

前記アデノシンデアミナーゼバリアントが、配列番号３の以下の改変の組み合わせＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項42】

前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項43】

前記Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、又はヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む、請求項４２に記載の複合体。

【請求項44】

前記Ｃａｓ９が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、又はそれらのバリアントである、請求項４２又は４３に記載の複合体。

【請求項45】

前記アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインに対して内部にある、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項46】

請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３７～４５のいずれか一項に記載の複合体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項47】

疾患又は障害を治療するための薬剤の調製に使用するための、請求項４６に記載の薬学的組成物。

【請求項48】

操作された又は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系を含む組成物であって：
（ａ）Ｃａｓタンパク質、
（ｂ）ｇＲＮＡであって、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、ｇＲＮＡを含み、
前記リンカーが、前記ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、
前記ｇＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに標的化することができる、組成物。

【請求項49】

前記Ｃａｓタンパク質が、異種ポリペプチドに融合している、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

前記異種ポリペプチドが、デアミナーゼドメインである、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

デアミナーゼバリアントドメインが、以下のアミノ酸配列のアミノ酸位置８２にグリシン（Ｇ）、アミノ酸位置１４７にスレオニン（Ｔ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置１５４にセリン（Ｓ）、並びにアミノ酸位置３６にヒスチジン（Ｈ）、アミノ酸位置７６にチロシン、アミノ酸位置１４９にチロシン、アミノ酸位置１５７にリジン（Ｋ）、及びアミノ酸位置１６７にアスパラギン（Ｎ）のうちの１つ以上を含み、アデノシンデアミナーゼが、前記アミノ酸配列
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に対して少なくとも約８５％の同一性、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を有する、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

前記デアミナーゼバリアントドメインが、配列番号３：ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）に関して、以下の改変の組み合わせ
ａ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、
ｂ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｃ）Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｄ）Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｅ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、
ｆ）Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｇ）Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｄ１６７Ｎ、
ｈ）Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋ、
ｉ）Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、若しくは
ｊ）Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎのいずれか、
又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変の組み合わせを含む、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

前記アデノシンデアミナーゼが、配列番号３に対して少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項５１又は５２に記載の組成物。

【請求項54】

前記アデノシンデアミナーゼが、配列番号３に対して少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項５１又は５２に記載の組成物。

【請求項55】

前記アデノシンデアミナーゼが、配列番号３を含むか又はそれから本質的になる、請求項５１又は５２に記載の組成物。

【請求項56】

アデノシンデアミナーゼバリアントが、配列番号３の以下の改変の組み合わせＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変を含む、請求項５１又は５２に記載の組成物。

【請求項57】

Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項58】

前記Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、又はヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

前記Ｃａｓ９が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、又はそれらのバリアントである、請求項５７又は５８に記載の組成物。

【請求項60】

前記ｇＲＮＡが、核酸配列：５’－ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ－３’（配列番号２）を含む、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

アデノシンデアミナーゼバリアントドメインが、前記Ｃａｓタンパク質に対して内部にある、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

前記ｇＲＮＡが、１つ以上の修飾を含む、請求項５１～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

１つ以上の修飾が、２’－ＯＭｅ、２’－フルオロ、又はホスホロチオエート連結である、請求項６２に記載の組成物。

【請求項64】

前記ｇＲＮＡが、３’末端及び／又は５’末端に１つ以上の修飾を含む、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

前記１つ以上の修飾が、前記ｇＲＮＡの３’末端から１、２、３、４、及び／又は５個のヌクレオチドで生じる、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

前記１つ以上の修飾が、前記ｇＲＮＡの５’末端から１、２、３、４、及び／又は５個のヌクレオチドで生じる、請求項６４に記載の組成物。

【請求項67】

ｇＲＮＡの４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％超のヌクレオチドが、修飾されている、請求項５１～６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項68】

前記ＮＬＳが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する、請求項５１～６７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

前記ＮＬＳが、ＫＫＫＲＫＶ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の組成物。

【請求項70】

前記リンカーが、ペプチドスペーサーを更に含む、請求項５１～６９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項71】

前記ペプチドスペーサーが、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

前記リンカーが、前記ｇＲＮＡを、前記ペプチドスペーサー又は前記ＮＬＳにコンジュゲートする化学部分を更に含む、請求項５１～７１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項73】

前記ＮＬＳを含む前記ｇＲＮＡが、前記ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を改善する、請求項５１～７２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項74】

前記ｇＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡである、請求項４０～７３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項75】

遺伝子疾患の治療を必要としている対象において遺伝子疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の複合体、請求項４６若しくは４７に記載の薬学的組成物、又は請求項４８～７４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項76】

グリコーゲン蓄積症１ａ型（ＧＳＤ１ａ）を治療する方法であって、対象に、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、若しくは表７におけるＧ６ＰＣ標的配列の相補体にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡ、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の複合体、請求項４６若しくは４７に記載の薬学的組成物、又は請求項５１～７４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項77】

操作された又は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系を含む組成物であって：
（ａ）ｓａＣａｓ９タンパク質、
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質に融合されたアデノシンデアミナーゼバリアント、
（ｃ）ｇＲＮＡであって、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、ｇＲＮＡを含み、
前記リンカーが、前記ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、
前記ｇＲＮＡが、ｓａＣａｓ９タンパク質と複合体を形成し、前記ｓａＣａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに標的化することができ
前記アデノシンデアミナーゼバリアントが、配列番号３に関して、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含み、
前記ｇＲＮＡが、配列番号２を含む、組成物。

【請求項78】

細胞における標的核酸を修飾する方法であって：
前記細胞を、ヌクレアーゼ及び請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと接触させることを含み、前記ｇＲＮＡが、前記標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含み、
Ｃａｓ９タンパク質が、前記ｇＲＮＡに結合し、前記ｇＲＮＡに相補的な標的核酸配列における修飾を引き起こすことができる、方法。

【請求項79】

真核細胞における標的核酸の発現を改変する方法であって：
前記細胞を、ヌクレアーゼ及び請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと接触させることを含み、ｓＲＮＡが、前記標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含み、
Ｃａｓ９タンパク質が、前記ｇＲＮＡに結合し、前記ｇＲＮＡに相補的な標的核酸配列における修飾を引き起こすことができる、方法。

【請求項80】

前記方法が、遺伝子の塩基編集をもたらす、請求項７８又は７９に記載の方法。

【請求項81】

請求項１～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、操作された天然に生じないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。

【請求項82】

核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むガイドＲＮＡを作製する方法であって：
ｇＲＮＡが前記ＮＬＳにコンジュゲートされるように、３’末端にアミン基を含む前記ｇＲＮＡを、前記ＮＬＳ配列及びＮ末端においてシステイン残基を含むペプチドと接触させることを含む、方法。

【請求項83】

請求項１～２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む組成物であって、前記組成物の核送達が、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約２～５倍増加する、組成物。

【請求項84】

前記ｇＲＮＡが、表８における配列のうちのいずれか１つに対して７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む、請求項８３に記載の組成物。

【請求項85】

遺伝子編集効率が、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約２～５倍増加する、請求項４６～７４及び７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項86】

ｇＲＮＡ標的配列が、配列番号１７に対して７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有する、請求項７６に記載の方法。

【請求項87】

前記ｇＲＮＡが、肝臓、腎臓、脳、及び心臓から選択される臓器のうちの１つ以上を標的とする、請求項７６に記載の方法。

【請求項88】

前記ｇＲＮＡが、肝臓を標的とする、請求項８７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６３／２５５，３２２号、及び２０２１年１０月１４日に出願された同第６３／２５５，９２７号に対する優先権を主張し、これらの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の引用参照
２０２２年７月２２日に作成され、サイズが５９．９キロバイトである「ＢＥＭ－０１１ＷＯ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」という名称のファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集系は、遺伝子編集及び塩基編集を含む関連する系における用途のために、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと関連するガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）及び関連する酵素の使用を含む。簡潔に述べると、１つ以上のｇＲＮＡ分子は、複合体中のＣａｓタンパク質とともに構築され、リボ核酸複合体（ＲＮＰ）を、（例えば、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２系における）特定のＤＮＡ及び／又は（例えば、Ｃａｓ１３系における）ＲＮＡ配列に導く。

【0004】

治療用途に使用されるｇＲＮＡの一般的な形態は、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質とリボ核タンパク質を形成する、およそ１００個のヌクレオチドの単一の非天然ＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集系を新しい技術（例えば、遺伝子編集）に適合させる能力は、所望の編集を可能にするために、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的細胞内で十分に長く持続することを必要とする。ヌクレアーゼによるｇＲＮＡの分解は、所望の編集を達成するための重要な課題である。更に、ｇＲＮＡは、リボ核酸（ＲＮＰに構築され、核に効率的に輸送される必要がある。

【発明の概要】

【0005】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用するためのｇＲＮＡの効力を増強するための、方法、組成物、及びキットが本明細書に提供される。本発明は、一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用するための増加した効力、例えば、成功した編集事象の増加した頻度を有する、ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）を産生する方法を提供する。本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの核へのより良好な輸送を提供して、細胞質ＲＮａｓｅから保護し、ＲＮＰの形成のためのｇＲＮＡのより高い局所濃度を増加させることができる。本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まない対応するｇＲＮＡと比較して顕著により高い効力を有し、また、高度に修飾されたｇＲＮＡと比較してより高い効力を示す。

【0006】

一態様では、本発明は、とりわけ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供し、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含む。

【0007】

一部の実施形態では、リンカーは、Ｎ末端にシステイン残基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ末端にシステイン残基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、リンカー内の内部部位にシステイン残基を含む。

【0008】

一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡの５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡ内の内部領域にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡ内の第１のヘアピン領域にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡ内の第２のヘアピン領域にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡ内のバルジ領域にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’ＯＭｅ修飾である。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’－フルオロ修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ホスホロチオエート連結を含む。

【0009】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、骨格修飾を含まない。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、及び９個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、４、５、６、７、及び８個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、４、５、６、及び７個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、４、５、及び６個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、４、及び５個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、３、及び４個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１、２、及び３個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１及び２個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの３’末端からの１個のヌクレオチドで生じる。

【0010】

一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、及び９個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、４、５、６、７、及び８個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、４、５、６、及び７個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、４、５、及び６個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、４、及び５個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、３、及び４個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１、２、及び３個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１及び２個のヌクレオチドで生じる。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’末端からの１個のヌクレオチドで生じる。

【0011】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡの１０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの２０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの４０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの４５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの６０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの６５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの７０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの７５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８５％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８８％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの９０％超が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの９５％超が修飾されている。

【0012】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡの１０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの２０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの３５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの４０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの４５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの６０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの６５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの７０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの７５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８５％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの８８％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの９０％未満が修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの９５％未満が修飾されている。

【0013】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＮＬＳ配列にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端又はその付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれ以上又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個超若しくはそれ以上のＮＬＳ、５’末端又はその付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれ以上又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個超若しくはそれ以上のＮＬＳ、あるいはこれらの組み合わせ（例えば、３’末端に１つ以上のＮＬＳ、及び５’末端に１つ以上のＮＬＳ）を含み得る。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーに存在し得るように、かつ／又は１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで１つ以上のコピーに存在し得るように、各々が、他とは独立して選択され得る。

【0014】

ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４１）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４２）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４４）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号４５）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号４６）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号４７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号４８）、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号４９）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号５０）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号５１）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号５２）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号５３）、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号５４）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号５５）、並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号５６）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。

【0015】

一部の実施形態では、ＮＬＳは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＫＫＫＲＫＶ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、二分ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳを有する二分ＮＬＳを含む。

【0016】

一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドスペーサーを更に含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、２個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、３個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、４個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、５個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、６個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、７個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、８個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、９個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、１０個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、１２個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、１５個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、１８個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、２０個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、２５個を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、３０個を超えるアミノ酸を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、２～３０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、５～２５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、７～２０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、７～１５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、７～１２個のアミノ酸を含む。

【0018】

一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約７個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約８個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約９個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１１個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１２個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１３個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１４個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１５個のアミノ酸を含む。

【0019】

一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と７０％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と７５％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と８０％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と８５％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と９０％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と９２％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と９５％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と９７％同一である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰのアミノ酸配列と９９％同一である。

【0020】

一部の実施形態では、リンカーは、ｇＲＮＡを、ペプチドスペーサー又はＮＬＳにコンジュゲートする化学部分を更に含む。

【0021】

実施形態では、ｇＲＮＡは、リンカーを介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、当該リンカーは、化学部分（例えば、Ｌ）及び／又はペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）を含む。

【0022】

実施形態では、ｇＲＮＡは、化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳに直接コンジュゲートされる。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、非ペプチド性である。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ｇＲＮＡ及びＮＬＳの両方に共有結合している。

【0023】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、ペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）は、ｇＲＮＡ及びＮＬＳの両方に共有結合している。

【0024】

実施形態では、ｇＲＮＡは、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、かかるコンジュゲートは、化学部分Ｌ（例えば、非ペプチド性の化学部分）がｇＲＮＡ及びペプチドスペーサーに共有結合しており、ペプチドスペーサーがＮＬＳに共有結合している、式（Ｉ）による構造を有することができる。

【化1】

【0025】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチドスペーサー又はＮＬＳアミノ酸配列のＣ末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0026】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチドスペーサー又はＮＬＳアミノ酸配列のＮ末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0027】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してペプチドスペーサー又はＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0028】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してペプチドスペーサー又はＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0029】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのチオール含有残基（例えば、システイン残基）に共有結合している。

【0030】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのセレン含有残基（例えば、セレノシステイン残基）に共有結合している。

【0031】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのアミノ含有残基（例えば、リジン残基）に共有結合している。

【0032】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのフェノール含有残基（例えば、チロシン残基）に共有結合している。

【0033】

実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載のチオール、セレン、アミノ、又はフェノール含有残基）の形成に使用されるアミノ酸残基は、化学修飾を含む。

【0034】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、核酸リンカー配列を更に含む。一部の実施形態では、核酸リンカー配列は、ＲＮＡ配列である。

【0035】

一部の実施形態では、核酸リンカー配列は、ガイドＲＮＡ配列の５’末端及び／又は３’末端に配置されている。

【0036】

一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～５０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～４５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～４０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～３５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～３０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～２５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～１５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～１０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１～５個のヌクレオチドを含む。

【0037】

一部の実施形態では、核酸リンカーは、約５個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約２５個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド、約３５個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチド、約４５個のヌクレオチド、又は約５０個のヌクレオチドを含む。

【0038】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、核酸リンカーを含まない。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約３個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約７個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１３個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１７個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２３個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２５個のヌクレオチドを含む。

【0039】

一部の実施形態では、核酸リンカーは、約５０～１００個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１００～１５０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約１５０～２００個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸リンカーは、約２００～５００個のヌクレオチドを含む。

【0040】

一部の実施形態では、核酸リンカー配列は、直鎖状リンカー配列である。一部の実施形態では、リンカー配列は、非直鎖状配列である。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＲＮＡ二次構造を含む。

【0041】

一部の実施形態では、核酸リンカー配列は、ガイドＲＮＡ配列の３’末端及び／又は５’末端に配置される。

【0042】

一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも１．５倍改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも２倍改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも２．５倍改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも３倍改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも４倍改善する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含むｇＲＮＡは、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡと比較して、塩基編集効率を少なくとも５倍改善する。

【0043】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、天然のＣＲＩＳＰＲ系に見出される直接反復配列を更に含む。

【0044】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡである。

【0045】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、クラスター化して規則的に散在する短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を更に含む。

【0046】

一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、修飾されている。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾されている。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ、及び／又は化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、折り畳みを維持する追加の配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。

【0047】

一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はリンカーに対する修飾は、１）化学修飾、２）二次構造を保存する任意のヌクレオチド置換、３）ＧＣ含有量の改変、４）ｔｒａｃｒＲＮＡの予測される折り畳みを維持するための配列の追加のうちの１つ以上を含む。

【0048】

一部の実施形態では、方法であって、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、伸長ガイドＲＮＡ、又はＣａｓ９ガイドＲＮＡ、又はＣａｓ１３ガイドＲＮＡ、又はＣａｓ１２ガイドＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｃガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｄガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｅガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｆガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｇガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｈガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｉガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｊガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｋガイドＲＮＡである、方法が本明細書に提供される。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、伸長ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｂガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｃガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｄガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｅガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｇガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｈガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｉガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｊガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｋガイドＲＮＡである。

【0049】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、以下、スペーサー、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、及びヘアピンのうちの１つ以上を含む。

【0050】

一部の実施形態では、ステムループは、ＧＣ塩基対を含む。

【0051】

一部の実施形態では、方法であって、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上の収率で産生される、方法が本明細書に提供される。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約５０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約５５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約６０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約６５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約７０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約７５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約８０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約８５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約９０％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約９５％の収率で産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約９９％超の収率で産生される。

【0052】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上改善して産生される。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５０％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が５５％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が６０％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が６５％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が７０％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が７５％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が８０％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が８５％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９０％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９５％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９９％改善して産生される。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、従来の合成方法と比較して、収率が９９％超改善して産生される。

【0053】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約４０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約１２５個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約１７５個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、又は約２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約４０個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約１００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約１２５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約１５０個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約１７５個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約２００個のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、約２００個よりも大きいヌクレオチドの長さを有する。

【0054】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、Ｃａｓ依存性である。例えば、一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａについてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、４０個のヌクレオチドよりも大きい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２３個のヌクレオチドよりも大きい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～２００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～２５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～３００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～３５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～４００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～４５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９についてのＮＬＳ－ｇＲＮＡの長さは、１２５～５００個のヌクレオチドである。

【0055】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、１つ以上の骨格修飾を含む。

【0056】

一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’Ｏ－メチル又はホスホロチオエート修飾を含む。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾を含む。

【0057】

一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’－リボ３’－ホスホロチオエート、２’－フルロ、２’－Ｏ－メトキシエチルモルホリノ（ＰＭＯ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、デオキシ、又は５’ホスフェート修飾から選択される。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の骨格修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’－リボ３’－ホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’－フルロ修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチルモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、ロック核酸（ＬＮＡ）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、デオキシ修飾を含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾は、５’ホスフェート修飾を含む。

【0058】

様々な修飾されたＲＮＡ塩基には、当該技術分野で既知であり、例えば、２－メトキシエトキシＡ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、２－メトキシエトキシＴなどの２’－Ｏ－メトキシ－エチル塩基（２’－ＭＯＥ）を含む。他の修飾された塩基には、例えば、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、及びフルオロ塩基が含まれる。様々なフルオロ塩基が既知であり、例えば、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ塩基が挙げられる。様々な２’－Ｏメチル修飾もまた、本明細書に記載の方法とともに使用され得る。例えば、以下の２’－Ｏメチル修飾のうちの１つ以上を含む以下のＲＮＡを、記載の方法とともに使用することができる：２’－ＯＭｅ－５－メチル－ｒＣ、２’－ＯＭｅ－ｒＴ、２’－ＯＭｅ－ｒＩ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ｒＡ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＣ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｂｒ－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｉ－ｒＵ、２－ＯＭｅ－７－デアザ－ｒＧ。

【0059】

一部の実施形態では、ＲＮＡは、以下の修飾、ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’フルオロ（２’Ｆ）、デオキシのうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、３’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、３’末端及び５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、以下の修飾のうちの１つ以上を含む：２’－Ｏ－２－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ロック核酸、架橋核酸、アンロック核酸、ペプチド核酸、モルホリノ核酸。一部の実施形態では、ＲＮＡは、以下の塩基修飾のうちの１つ以上を含む：２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、シュードウラシル、Ｎ１－メチル－シュードウラシル、５’メチルシトシン、２’ピリミジノン（ゼブラリン）、チミン。他の修飾された塩基としては、例えば、２－アミノプリン、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、ジデオキシ－Ｃ、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、反転ｄＴ、イソ－ｄＧ、イソ－ｄＣ、反転ジデオキシ－Ｔ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（登録商標）、２’－Ｆ－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２’－ＮＨ２－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２，２’－無水－Ｕ、３’－デオキシ－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、３’－Ｏ－メチル－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、ｒＴ、ｒＩ、５－メチル－ｒＣ、２－アミノ－ｒＡ、ｒスペーサー（脱塩基）、７－デアザ－ｒＧ、７－デアザ－ｒＡ、８－オキソ－ｒＧ、５－ハロゲン化－ｒＵ、Ｎ－アルキル化－ｒＮが挙げられる。

【0060】

本明細書では、他の化学的に修飾されたＲＮＡを使用することができる。例えば、ＲＮＡは、例えば、５’Ｉｎｔ，３’アジド（ＮＨＳエステル）、５’ヘキシニル、５’Ｉｎｔ，３’５－オクタジイニルｄＵ、５’，Ｉｎｔビオチン（アジド）、５’，Ｉｎｔ６－ＦＡＭ（アジド）、及び５’，Ｉｎｔ５－ＴＡＭＲＡ（アジド）などの修飾された塩基を含み得る。本明細書に記載の方法とともに使用され得るＲＮＡヌクレオチド修飾の他の例としては、例えば、５’リン酸化及び３’リン酸化などのリン酸化修飾が挙げられる。ＲＮＡはまた、以下の修飾、アミノ修飾、ビオチン化、チオール修飾、アルキン修飾子、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、及びジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）のうちの１つ以上を有し得る。

【0061】

一部の実施形態では、本方法は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％超の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。したがって、一部の実施形態では、本方法は、約５０％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約６０％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約７０％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約８０％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９０％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は９９％超の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９１％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９２％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９３％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９４％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９５％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９６％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９７％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９８％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９９％の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。一部の実施形態では、本方法は、約９９％超の純度でＮＬＳ－ｇＲＮＡを産生する。

【0062】

一態様では、本発明は、とりわけ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供し、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、ＮＬＳ－ガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている。一態様では、本発明は、とりわけ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供し、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、ＮＬＳ－ガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している。

【0063】

一部の実施形態では、組成物は、ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、組成物は、ヌクレアーゼをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。

【0064】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＮＬＳにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳを含まない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳにコンジュゲートされない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＮＬＳを含まない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＮＬＳにコンジュゲートされない。

【0065】

一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを２：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを３：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを４：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを５：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを６：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを７：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを８：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを９：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１０：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１２：１の重量比で含む。一部の実施形態では、組成物は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを１５：１の重量比で含む。

【0066】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＩＩ型酵素である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ Ｖ型酵素である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲクラス２ ＶＩ型酵素。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はそれらの修飾されたバージョンである。したがって、一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ １ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２又はその修飾されたバージョンである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３又はその修飾されたバージョンである。

【0067】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、異種ポリペプチドに融合している。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、核酸（例えば、ＤＮＡ）に修飾を行うことができるエフェクタードメインを含む。例えば、ＤＮＡエフェクタードメインは、シチジンデアミナーゼドメイン、シトシンドメイン、又はアデノシンデアミナーゼドメインなどのデアミナーゼドメインであり得る。ある特定の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ又はＡＩＤシチジンデアミナーゼなどのシチジンデアミナーゼドメインである。シチジンをウリジンに脱アミノ化することができる塩基編集タンパク質について、例えば、ＤＮＡ分子内のＣからＴへの変異を誘導するために、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼからのデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、シチジン又はシトシンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、シトシンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、シチジンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、アデノシン又はアデニンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、アデノシンドメインである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、アデニンドメインである。

【0069】

一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、配列番号３に関して１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｙ１４７Ｔ／Ｄを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｑ１５４Ｓを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｌ３６Ｈを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｉ７６Ｙを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｆ１４９Ｙを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｎ１５７Ｋを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、及びＱ１５４Ｓを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、及びＬ３６Ｈを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、及びＩ７６Ｙを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、及びＦ１４９Ｙを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、及びＤ１６７Ｎを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、及びＱ１５４Ｓを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｌ３６Ｈ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、及びＤ１６７Ｎを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｌ３６Ｈ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、及びＤ１６７Ｎを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、及びＤ１６７Ｎを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｑ１５４Ｓ、及びＮ１５７Ｋを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、及びＱ１５４Ｓを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、変異Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎを含む。

【0070】

一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインのＣ末端に融合している。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインに対して内部にある。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｃａｓ９のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｃａｓ９のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して内部にある。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｃａｓ９のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｃａｓ９のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｃａｓ９に対して内部にある。

【0071】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＩＩ型酵素との使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ Ｖ型酵素との使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＶＩ型酵素との使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はそれらの修飾されたバージョンとの使用に好適である。したがって、一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９又はその修飾されたバージョンとの使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１又はその修飾されたバージョンとの使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９又はその修飾されたバージョンとの使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２又はその修飾されたバージョンとの使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３又はその修飾されたバージョンとの使用に好適である。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ酵素との複合体における。

【0072】

一部の実施形態では、一部のＣａｓ、例えば、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１３のエンドヌクレアーゼ活性によって切断され、Ｃａｓタンパク質との構築前又は構築中にｇＲＮＡを直線化するＲＮＡ配列が含まれる。

【0073】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まないｇＲＮＡと比較して、増加した安定性及び細胞エキソヌクレアーゼに対する耐性を提供する。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集系を使用して、標的細胞において増加した編集事象を提供する。

【0074】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＩＩ型酵素との複合体にある。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ Ｖ型酵素との複合体にある。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＶＩ型酵素との複合体にある。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はそれらの修飾されたバージョンとの複合体にある。

【0075】

一部の態様では、Ｃａｓタンパク質複合体が提供され、複合体は、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＮＬＳ－ｇＲＮＡを含む。

【0076】

一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＩＩ型酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ Ｖ型酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２ ＶＩ型酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はそれらの修飾されたバージョンから選択される。

【0077】

一部の実施形態では、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、又は標的化されたゲノム修飾のための方法が本明細書に提供され、本方法は、真核細胞内に（ａ）ＮＬＳコンジュゲートガイドＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）、（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）及び（ｂ）と染色体ＤＮＡにおける標的配列との相互作用が、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、又は標的化されたゲノム修飾をもたらす。

【0078】

一部の実施形態では、標的化されたＲＮＡ修飾のための方法が本明細書に提供され、本方法は、真核細胞内に（ａ）ＮＬＳコンジュゲートガイドＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）及び（ｂ）と染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡとの相互作用が、染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡの修飾をもたらす。

【0079】

一部の実施形態では、染色体ＤＮＡによって発現されたＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

【0080】

一部の態様では、本発明は、本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

【0081】

一態様では、本発明は、とりわけ、Ｃａｓタンパク質、リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むｇＲＮＡを含む、操作された又は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系を含む組成物を提供し、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに標的化することができる。

【0082】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、核酸配列：５’－ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ－３’（配列番号２）を含む。

【0083】

一態様では、本発明は、とりわけ、（ａ）ｓａＣａｓ９タンパク質、（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質に融合されたアデノシンデアミナーゼバリアント、及び（ｃ）リンカーを介してｇＲＮＡに連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むｇＲＮＡを含む、操作された又は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）系を含む組成物を提供し、リンカーは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたシステイン残基を含み、ｇＲＮＡは、ｓａＣａｓ９タンパク質と複合体を形成し、ｓａＣａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに標的化することができ、アデノシンデアミナーゼバリアントは、配列番号３に関して、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含み、ｇＲＮＡは、配列番号２を含む。

【0084】

一態様では、本発明は、とりわけ、遺伝子疾患の治療を必要としている対象において、対象に本発明の組成物（例えば、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）を投与することによって遺伝子疾患を治療する方法を提供する。

【0085】

一態様では、本発明は、とりわけ、グリコーゲン蓄積症１ａ型（ＧＳＤ１ａ）を治療する方法を提供し、本方法は、対象に本発明の組成物（例えば、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）を投与することを含む。

【0086】

一部の実施形態では、ＮＬＳにコンジュゲートされたｇＲＮＡを含む組成物が本明細書に提供され、組成物の核送達は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約２～５倍増加する。一部の実施形態では、組成物の核送達は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約２倍増加する。一部の実施形態では、組成物の核送達は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約３倍増加する。一部の実施形態では、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約４倍までの増加における核送達。一部の実施形態では、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約５倍までの増加における核送達。一部の実施形態では、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約２倍超までの増加における核送達。一部の実施形態では、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して１．５～１０倍までの増加における核送達。一部の実施形態では、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡを含む組成物に対して約１０倍超までの増加における核送達。

【0087】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して７０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して７５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して８５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して９０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して９５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表８の配列のうちのいずれか１つに対して１００％の同一性を有する配列を含む。

【0088】

一部の実施形態では、ＮＬＳにコンジュゲートされたｇＲＮＡを含む組成物が本明細書に提供され、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約２～５倍増加する。一部の実施形態では、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約２倍増加する。一部の実施形態では、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約３倍増加する。一部の実施形態では、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約４倍増加する。一部の実施形態では、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約５倍増加する。一部の実施形態では、遺伝子編集効率は、ＮＬＳを含まないｇＲＮＡに対して約１．５～１０倍増加する。

【0089】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して７０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して７５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して７０％、８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、配列番号１７に対して１００％の同一性を有する。

【0090】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、肝臓、腎臓、脳、及び心臓から選択される臓器のうちの１つ以上を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、肝臓を標的とする。

【0091】

定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語についての更なる定義は、本明細書全体を通して記載される。

【0092】

Ａ又はＡｎ：「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語のうちの１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0093】

およそ又は約：本明細書で使用される場合、「およそ」又は「約」という用語は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載される参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、別段の記載がない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいか、より小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満内に収まる値の範囲を指す（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

【0094】

～と関連する／会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）：一方の存在、レベル及び／又は形態が、他方の存在、レベル及び／又は形態と相関する場合に用語が本明細書で使用される場合、２つの事象又は実体は、互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル及び／又は形態が（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害若しくは状態の発生率及び／又はその感受性と相関する場合、特定の疾患、障害若しくは状態と関連するとみなされる。一部の実施形態では、２つ以上の実体が、直接的又は間接的に相互作用する場合、それらが互いに物理的に近接し、それを維持するように、物理的に互いに「会合している」。一部の実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体が、互いに共有結合しており、一部の実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体が、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって、非共有結合的に会合している。

【0095】

「アデノシンデアミナーゼ」又は「アデニンデアミナーゼ」とは、アデニン又はアデノシンの加水分解の脱アミノ化を触媒することができるポリペプチド又はその断片を意味する。一部の実施形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシンへの、又はデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解の脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるアデニン又はアデノシンの加水分解の脱アミノ化を触媒する。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、藻類、細菌、菌類、植物、無脊椎動物（例えば、昆虫）、及び脊椎動物（例えば、両生類、哺乳動物）が挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物（例えば、真核生物、原核生物）に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、１つ以上の改変を有するアデノシンデアミナーゼバリアントであり、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）におけるアデニン及びシトシンの両方を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＤＮＡにおけるアデニン及びシトシンの両方を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、一本鎖ＤＮＡにおけるアデニン及びシトシンの両方を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＲＮＡにおけるアデニン及びシトシンの両方を脱アミノ化することができる。

【0096】

「アデノシンデアミナーゼ活性」とは、ポリヌクレオチドにおけるアデニン又はアデノシンのグアニンへの脱アミノ化を触媒することを意味する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼバリアントは、アデノシンデアミナーゼ活性を維持する（例えば、参照アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ＊８．２０又はＴａｄＡ＊８．１９）の活性の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上）。

【0097】

「アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）」とは、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターを意味する。

【0098】

「アデノシン塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリペプチド」又は「ＡＢＥ８」とは、以下の参照配列のアミノ酸位置８２及び／又は１６６に改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、本明細書で定義される塩基エディターを意味する。ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、参照配列に対して、本明細書に記載の更なる改変を含む。

【0099】

「アデノシン塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリヌクレオチド」とは、ＡＢＥ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0100】

「アデノシンデアミナーゼポリヌクレオチド」は、アデノシンデアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼポリヌクレオチドは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントをコードする。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼポリヌクレオチドは、以下の改変の組み合わせのうちの１つを含むアデノシンデアミナーゼバリアントをコードする：Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又はＬ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ。

【0101】

一部の実施形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、又はマウスなどの生物由来の天然に存在するデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、天然に生じない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼ又はデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％同一である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、又はＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓなどの細菌由来である。

【0102】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）デアミナーゼ又はその断片である。一部の実施形態では、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、切断型ｅｃＴａｄＡである。例えば、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して、１つ以上のＮ末端アミノ酸を欠失し得る。一部の実施形態では、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠失し得る。一部の実施形態では、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失し得る。一部の実施形態では、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端メチオニンを含まない。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端切断型ＴａｄＡである。特定の実施形態では、ＴａｄＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＴａｄＡのうちのいずれか１つである。

【0103】

一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むＴａｄＡ＊７．１０である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、以下の中から選択される改変の組み合わせを含むＴａｄＡ＊７．１０である：Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又はＬ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＭＳＰ６０５、ＭＳＰ６８０、ＭＳＰ８２３、ＭＳＰ８２４、ＭＳＰ８２５、ＭＳＰ８２７、ＭＳＰ８２８、又はＭＳＰ８２９である。

【0104】

塩基エディター：「塩基エディター（ＢＥ）」又は「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」は、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態では、塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と併せて、核酸塩基修飾ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）及びポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む。様々な実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）内の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、又はＵ）を修飾することができるドメインを含む生体分子複合体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合又は連結される。一実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有する１つ以上のドメインを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドＲＮＡに連結される（例えば、ガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフ及びデアミナーゼに融合されたＲＮＡ結合ドメインを介して）。一部の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の１つ以上の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内の窒素系塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＲＮＡ内の窒素系塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、リボヌクレオシドを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、デオキシリボヌクレオシドを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シトシンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）又はアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）及びアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）及びシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン、又はｄＩＳＮドメイン）に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン又はｄＩＳＮドメイン）と、を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、脱塩基の塩基エディターである。塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）、及びＲｅｅｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１を参照されたく、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0105】

塩基編集活性：「塩基編集活性」とは、（例えば、塩基を脱アミノ化することによって）ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に変化させるように作用することを意味する。一実施形態では、第１の塩基は、第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシン又はアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換し、かつアデノシン又はアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。

【0106】

塩基エディター系：「塩基エディター系」という用語は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するための系を指す。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）系は、（１）標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼドメイン、及びシチジンデアミナーゼドメイン、並びに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと併せて、１つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）系は、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼから選択される核酸塩基エディタードメイン、及び核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディター系は、（１）標的ヌクレオチド配列中の１つ以上の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及びデアミナーゼドメインを含む塩基エディター（ＢＥ）、並びに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと併せて、１つ以上のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニン又はアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニン又はアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）又はシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。

【0107】

生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という語句は、生物学的系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与される場合、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、ペプチドが生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的に活性」な部分と称される。

【0108】

開裂：本明細書で使用される場合、開裂は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系のヌクレアーゼによって作製される標的核酸の切断を指す。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＲＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＲＮＡ切断である。

【0109】

相補的：「相補的」又は「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン－クリック又はフーグスティーン塩基対形成のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができることを意味する。相補的な塩基対形成は、Ｇ－Ｃ及びＡ－Ｔ塩基対形成だけでなく、イノシンなどの普遍的な塩基を伴う塩基対形成も含む。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）することができる核酸分子内の隣接した残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列に対して塩基対形成される第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０個のヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表す）。相補性パーセントを決定するために、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）することができる核酸分子内の隣接した残基のパーセンテージを計算し、最も近い整数に四捨五入される（例えば、２３個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列に対して塩基対形成される第１のオリゴヌクレオチド中の合計２３個のヌクレオチドのうちの１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチドは、それぞれ、５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、及び７４％を表し、それぞれ、少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、及び７０％の相補性を有する）。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、それらが生物学的な条件下でハイブリダイゼーション可能であるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％の相補性を有する。更に、２つの鎖が、それらのヌクレオチド配列を調べることによって、生物学的な条件下でハイブリダイゼーションすることができるかどうかを決定する技術は、当該技術分野で周知である。

【0110】

クラスター化して間隔を開けた短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）系：本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲエフェクター、ＲＮＡガイド、及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現に関与する、又はその活性を指向する核酸及び／又はタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、操作された天然に生じないＣＲＩＳＰＲ系である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の成分は、系の１つ以上の成分をコードする核酸（複数可）（例えば、ベクター）、タンパク質形態の成分（複数可）、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0111】

ＣＲＩＳＰＲアレイ：「ＣＲＩＳＰＲアレイ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ反復及びスペーサーを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、第１のＣＲＩＳＰＲ反復の第１のヌクレオチドで始まり、最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲ反復の最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲ反復及びスペーサーを含む。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは、２つの反復の間に位置する。「ＣＲＩＳＰＲ反復」又は「ＣＲＩＳＰＲ直接反復」、又は「直接反復」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲアレイ内の配列バリエーションをほとんど示さないか、又は全く示されない複数の短い直接反復配列を指す。

【0112】

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）：「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡガイドによって特定される核酸上の標的部位に酵素活性を行う、及び／又は結合するタンパク質を指す。種々の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及び／又は切除活性を有する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ヌクレアーゼ不活性である。

【0113】

ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の核酸配列を標的化するためにＣＲＩＳＰＲエフェクターによって使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡと二本鎖を形成する配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに結合する。

【0114】

二本鎖：本明細書で使用される場合、「二本鎖」は、２つの一本鎖核酸の相互作用によって形成された二重らせん構造を指す。二本鎖は、典型的には、互いに関して逆平行に配向された２つの一本鎖核酸間の塩基の対水素結合、すなわち、「塩基対形成」によって形成される。二本鎖における塩基対形成は、概して、ワトソン－クリック塩基対形成によって行われ、例えば、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ及びＲＮＡにおけるシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）は、ＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対が形成され得る条件としては、生理学的又は生物学的に関連する条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭのカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭのナトリウムイオン）が含まれる。更に、二本鎖は、隣接するヌクレオチド間の相互作用を積み重ねることによって安定化される。本明細書で使用される場合、二本鎖は、塩基対形成又は相互作用を積み重ねることによって確立され得るか、又は維持され得る。二本鎖は、実質的に相補的であり得るか、又は完全に相補的であり得る２つの相補的核酸鎖によって形成される。いくつかの塩基にわたって塩基対形成する一本鎖核酸は「ハイブリダイゼーションする」と言われる。

【0115】

エクスビボ：本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、多細胞生物内ではなく、外部で増殖した細胞又は組織において生じる事象を指す。

【0116】

機能的同等物又は類似体：本明細書で使用される場合、「機能的同等物」又は「機能的類似体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の状況において、元の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物学的な活性（機能又は構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体又は同等物は、天然誘導体であってもよく、又は合成的に調製されてもよい。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的な活性が保存されることを条件として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と同様の化学物理的特性を有する。同様の望ましい化学物理的特性としては、電荷の類似性、かさ高さ、疎水性、親水性などが含まれる。

【0117】

半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、タンパク質濃度又は活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分に低下するのに必要な時間である。

【0118】

ハイブリダイゼーションする：「ハイブリダイゼーションする」とは、ストリンジェントな様々な条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）又はその一部分の間で二本鎖分子を形成することを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間のワトソン－クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合によって生じる。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的な核酸塩基である。

【0119】

改善する、増加する、又は低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、若しくは「低減する」という用語、又は文法的同等物は、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定値、又は本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（又は複数の対照対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象」は、治療されている対象と同じ形態の疾患に罹患している対象であり、治療されている対象とほぼ同じ年齢である。

【0120】

インデル：本明細書で使用される場合、「インデル」という用語は、核酸配列における塩基の挿入又は欠失を指す。一般的に変異をもたらし、遺伝的バリエーションの一般的な形態である。

【0121】

阻害：本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害する」、及び「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質又は遺伝子の活性及び／又は発現を減少又は低減するプロセス又は方法を指す。典型的には、タンパク質又は遺伝子を阻害することは、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野で認識される１つ以上の方法によって測定される、タンパク質又は遺伝子の発現又は関連する活性を少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上低減させること、又は１倍より大きい、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍若しくはそれ以上の発現又は関連する活性の低下を指す。

【0122】

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養内などにおいて生じる事象を指す。

【0123】

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。

【0124】

リンカー又はスペーサー：リンカー又はスペーサーは、ｇＲＮＡ配列の末端位置をＮＳＬ配列から物理的に分離して、ｇＲＮＡのＣａｓ結合及び機能を可能にするヌクレオチド又はアミノ酸配列である。一部の実施形態では、リンカーは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、リンカーは、化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、リンカーは、化学リンカー、例えば、ＰＥＧ９／１８である。一部の実施形態では、リンカーは、ＤＮＡリンカーである。

【0125】

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、約５～約１００個のヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離されてもよく、又は化学的に合成されてもよい。

【0126】

ＰＡＭ：「ＰＡＭ」又は「プロトスペーサー隣接モチーフ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などの、ＣＲＩＳＰＲ系による開裂の標的となる核酸領域に続く短い核酸配列（通常、２～６個の塩基対の長さ）を指す。Ｃａｓヌクレアーゼが切断するために、ＰＡＭが必要とされる場合があり、概して、切断部位から３～４個のヌクレオチドの下流に見出される。

【0127】

ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介してともに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、用語が長鎖に限定されず、ペプチド結合を介してともに連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に既知のように、ポリペプチドは、処理及び／又は修飾され得る。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、互換的に使用される。

【0128】

予防する：本明細書で使用される場合、「予防する」又は「予防」という用語は、疾患、障害、及び／又は状態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／又は状態を発症するリスクを低減することを指す。

【0129】

タンパク質：「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的又は一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され得る。個別機能単位が、互いに物理的に会合する１つより多くのポリペプチドからなる場合、「タンパク質」という用語は、物理的にカップリングされ、個別単位としてともに機能する複数のポリペプチドを指す。

【0130】

参照：「参照」の実体、系、量、条件のセットなどは、本明細書に記載のように試験の実体、系、量、条件のセットなどと比較されるものである。例えば、一部の実施形態では、「参照」抗体は、本明細書に記載のように操作されていない対照抗体である。

【0131】

ＲＮＡガイド：「ＲＮＡガイド」又は「ガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書に記載のタンパク質の標的核酸への標的化を促進するＲＮＡ分子を指す。例示的な「ＲＮＡガイド」又は「ガイドＲＮＡ」としては、同族のｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせたｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。後者は、独立したＲＮＡであってもよく、又はリンカー（ｓｇＲＮＡ）を使用して単一のＲＮＡとして融合されてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、化学的又は生化学的修飾を含むように操作され、一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。「ＲＮＡガイド」又は「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡも指す。

【0132】

一本鎖リガーゼ：本明細書で使用される場合、「一本鎖リガーゼ」という用語は、そのライゲーション活性のためにオリゴヌクレオチドスプリント又はテンプレートを必要としないリガーゼを意味する。

【0133】

スプリント又はオリゴヌクレオチドスプリント：「スプリント」又は「オリゴヌクレオチドスプリント」という用語は、少なくとも２つ、３つ、又はそれ以上の一本鎖ＲＮＡヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができる一本鎖ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は他のポリマーを指す。例えば、スプリントは、オリゴヌクレオチドスプリントを指し得る。

【0134】

対象：「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、診断、予後、又は療法が望まれる任意の対象を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類（類人猿、サル、オランウータン、又はチンパンジーなど）、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、又はウシ（ｃｏｗ）であり得る。

【0135】

ｓｇＲＮＡ：「ｓｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、又は「ガイドＲＮＡ」という用語は、（ｉ）ガイド配列（ｃｒＲＮＡ配列）及び（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼリクルーティング配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有する、シングルガイドＲＮＡを指す。

【0136】

実質的な同一性：「実質的な同一性」という語句は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者に理解されるように、２つの配列は、概して、対応する位置に同一の残基を含有する場合、「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得、それは、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む。例示的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載される。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列が、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、関連するひと続きの残基にわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連するひと続きは、完全な配列である。一部の実施形態では、関連するひと続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００又はそれ以上の残基である。

【0137】

標的核酸：「標的核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系が結合する任意の長さのヌクレオチド（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかを指す。標的核酸は、コーディング領域又は非コーディング領域を含み得る三次元構造を有し得、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、プラスミド、ベクター、外因性配列、内因性配列を含み得る。標的核酸は、修飾されたヌクレオチド、メチル化されたヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体を含み得る。標的核酸は、非核酸成分とともに散布されてもよい。標的核酸は、一本鎖、二本鎖、若しくは多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、若しくは他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーであるが、これらに限定されない。

【0138】

治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比で治療される対象に治療効果を与える治療分子（例えば、本明細書に記載の操作された抗体）の量を指す。治療効果は、客観的であり得る（すなわち、何らかの試験又はマーカーによって測定可能である）、又は主観的であり得る（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、又は効果を感じる）。特に、「治療有効量」とは、疾患と関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防又は遅延させること、及び／又は疾患の症状の重症度若しくは頻度を減少させることなどによって、特定の疾患若しくは状態を治療、改善、若しくは予防するのに有効であるか、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに有効である治療分子又は組成物の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投与レジメンで投与することができる。任意の特定の治療分子について、治療有効量（及び／又は有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、又は他の薬剤との組み合わせに依存して変動し得る。また、任意の特定の対象に対する特定の治療有効量（及び／又は単位用量）は、治療されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の薬剤の活性；用いられる特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；用いられる特定の治療分子の投与時間、投与経路、及び／又は排泄若しくは代謝速度；治療期間；並びに医学分野で周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存し得る。

【0139】

ｔｒａｃｒＲＮＡ：「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲｌＳＰＲ関連タンパク質が特定された標的核酸に結合するのに必要な構造を形成する配列を含むＲＮＡを指す。

【0140】

治療：本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」又は「治療すること」も）という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴の発症を部分的に又は完全に緩和、改善、軽減、阻害、遅延、それらの重症度の低減、及び／又はそれらの発生率を低減する治療分子（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ治療タンパク質又は系）の任意の投与を指す。そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／若しくは状態の兆候を示していない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の早期兆候のみを示している対象の治療であり得る。代替的又は追加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであってもよい。

【0141】

図面は、限定のためではなく、例示の目的のみのためである。

【図面の簡単な説明】

【0142】

【図1】ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡの例示的な概略図である。この特定の設計では、ｇＲＮＡの３’末端は、ペプチドスペーサーのＮ末端、続いてＳＶ４０に由来するＮＬＳ配列にコンジュゲートされる。

【図2】ｓｐＣａｓ９のＮ末端に融合したアデニンデアミナーゼを含む塩基エディターで達成されるアデニンのグアニン塩基への（ＡからＧへの）変換パーセンテージの結果を示す例示的なグラフである。ＡからＧへの変換パーセンテージ（ｙ軸）は、塩基エディターをコードするｍＲＮＡの様々な比率（１：１、１：３、及び１：９）で、ＮＬＳの有無にかかわらず、様々なガイドＲＮＡについてプロットされる。「リポ対照」は、リポフェクタミン中の塩基エディターｇＲＮＡ（ＮＬＳを含まない）をコードするｍＲＮＡを含む。「リポ対照」は、ＬＮＰ群に対するトランスフェクション対照として機能するように製剤化した。

【図3A】異なる修飾を有するｇＲＮＡの例示的な概略図である。「ＥＭ」（末端修飾）ｇＲＮＡは、２’ＯＭｅ修飾を有する３’及び５’末端の両方に３個のヌクレオチドを有する。「ＨＭ１」（重度修飾１）は、４７％の２’ＯＭｅ修飾で修飾されたｇＲＮＡを有する。「ＨＭ２」（重度修飾２）は、６０％の２’ＯＭｅ修飾で修飾されたｇＲＮＡを有する。「ＨＭ３」（重度修飾３）は、８８％の２’ＯＭＥ及び２’Ｆ修飾で修飾されたｇＲＮＡを有する。実施例２に使用されるＮＬＳ－ｇＲＮＡは、末端修飾を含む。

【図3B】マウスにおいてｓｐＣａｓ９のＮ末端に融合したアデニンデアミナーゼを含む塩基エディターで達成されるアデニンのグアニン塩基への（ＡからＧへの）変換パーセンテージの結果を示す例示的なグラフである。ＡからＧへの変換パーセンテージ（ｙ軸）は、ＮＬＳの有無にかかわらず、及びｇＲＮＡにおける様々な修飾の有無にかかわらず、様々なガイドＲＮＡについてプロットされる。

【図4A】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてｓｐＣａｓ９のＮ末端に融合したアデニンデアミナーゼを含む塩基エディターで達成される塩基編集効率の結果を示す例示的なグラフである。肝臓における塩基編集効率（ｙ軸）は、ＮＬＳの有無にかかわらず、及びｇＲＮＡにおける様々な修飾の有無にかかわらず、様々なガイドＲＮＡについてプロットされる。

【図4B】毒性学結果を示す一連の例示的なグラフである。ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを投与後２４時間で測定し、異なるｇＲＮＡを含む製剤による投与前のＡＳＴ／ＡＬＴレベルと比較して、倍率変化を示す。

【図5】マウスにおいてｓａＣａｓ９のＮ末端に融合したアデニンデアミナーゼを含む塩基エディターで達成されるアデニンのグアニン塩基への（ＡからＧへの）変換パーセンテージの結果を示す例示的なグラフである。オンターゲット及びバイスタンダー編集の両方についてのＡからＧへの変換パーセンテージ（ｙ軸）を、様々な純度及び修飾を有する様々なガイドＲＮＡについてプロットした。

【図6A】ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してヘテロ接合性のトランスジェニックマウスモデルの肝臓抽出物におけるＧＳＤ１ａ変異のインビボ修正を示す。図６Ａは、インビボワークフローを示す概略図である。塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを担持する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、Ｒ８３Ｃ変異を保有するｈｕＧ６ＰＣ（ｈｕＲ８３Ｃ ＨＥＴ）に対してヘテロ接合性のトランスジェニックマウスにおいて、ＩＶ注射を介して投与した。

【図6B】ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してヘテロ接合性のトランスジェニックマウスモデルの肝臓抽出物におけるＧＳＤ１ａ変異のインビボ修正を示す。図６Ｂは、バイスタンダー編集に対してオンターゲットを比較するＭＳＰ８２８を使用するＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃ変異のＡからＧへの塩基編集効率を示す棒グラフである。

【図6C】ＴａｄＡアデノシンデアミナーゼバリアントＭＳＰ６０５、ＭＳＰ８２４、ＭＳＰ８２５、ＭＳＰ６８０、ＭＳＰ８２８、及びＭＳＰ８２０を使用する、Ｒ８３Ｃ変異を保有するｈｕＧ６ＰＣに対してヘテロ接合性のトランスジェニックマウスモデルにおけるＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃ変異の修正を示す棒グラフである。インビトロスクリーニングを実行して、Ｒ８３Ｃ修正のための所望の塩基エディターを選択した。ｇＲＮＡ及び代表的な塩基エディターのＬＮＰ共製剤を、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してヘテロ接合性のトランスジェニックマウスにおいて、（１ｍｐｋの亜飽和用量で）インビボで投与した。ＬＮＰ治療されたｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃヘテロ接合体トランスジェニック動物の肝臓におけるＲ８３Ｃ修正のためのバリアントの塩基編集効力を図６Ｃに示す。バリアントＭＳＰ８２８は、これらの条件下で高レベルのオンターゲット活性をもたらした。ＡからＧへの塩基編集効率は、オンターゲット及びバイスタンダー編集について示される。

【図7】正常及び機能喪失ｇ６ｐｃ機能並びに関連する転帰を示す概略図を示す。ＧＳＤ－Ｉａ（又は本明細書におけるＧＳＤ１ａ）は、ｇ６ｐｃ遺伝子における変異によって引き起こされる常染色体劣性障害である。酵素の活性部位に位置するＲ８３Ｃは、白人ＧＳＤ－Ｉａ患者において特定された最も広く見られる病原性変異であり、Ｇ６Ｐａｓｅの不活性化と関連している。Ｇ６Ｐａｓｅ機能の喪失は、生命を脅かす低血糖、発作、及び更には死亡をもたらす可能性がある。低血糖を緩和するために、患者は、昼夜を通して、ゆっくりとしたグルコース放出処方によって、グルコース補充の厳格かつ頻繁な遵守を維持しなければならない。１回の用量の見逃し又は遅延が、緊急の低血糖を引き起こす可能性がある。多くの合併症の中で、肝臓の拡大、尿酸、乳酸、及び脂質の蓄積は、ＧＳＤ－Ｉａ患者で一般的である。

【図8】本明細書に記載の塩基エディターが、編集ウィンドウ内で永続的な、予測されるヌクレオチド置換を生成することを示す概略図を示す。Ｒ８３Ｃ変異は、ｇ６ｐｃ遺伝子において単一のＧ＞Ａ変換を導入する。アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ゲノムＤＮＡにおけるＡからＧへのプログラマブル変換を可能にし、したがって、この変異を修正するために使用され得る。図８は、本明細書に記載のＡＢＥ及び塩基編集の有用性を示す。ＡＢＥは、ガイドＲＮＡに相補的である標的ＤＮＡに結合し、一本鎖ＤＮＡの伸長を曝露する。デアミナーゼは、標的アデニンをイノシンに変換し、Ｃａｓ酵素は、反対側の鎖をニックし、次いで修復され、塩基対の変換を完了する。点変異の直接的な修復は、遺伝子機能の回復のための可能性を有する。

【図9A】標的ヌクレオチド部位、並びにバイスタンダー及びＰＡＭヌクレオチドの描写、かつ不死化ＨＥＫ２９３細胞に使用されるＡＢＥが、Ｒ８３Ｃの顕著な正確な修正率をもたらすことを示す棒グラフを提供する。ｇ６ｐｃ遺伝子におけるＡからＧへの変換についての塩基エディターを、Ｒ８３Ｃの修正のために最適化した。図９Ａには、ＧＳＤ－Ｉａ Ｒ８３Ｃ変異についての標的ＤＮＡ配列（ＣＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴ（配列番号１７））及び基礎となるアミノ酸翻訳（ＷＷＹＰＣＱＧＦＬＩ、配列番号１８）が示されている。標的編集は、位置１２で二重下線により示される。編集ウィンドウはまた、位置６で一重下線により示される可能性のあるバイスタンダーを含み、同義変換をもたらし得る編集が位置１０に示される。スクリーニングのために、ＨＥＫ２９３細胞株を生成して、Ｒ８３Ｃ変異を保有するｇ６ｐｃ導入遺伝子を発現させ、塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡでトランスフェクトした。対立遺伝子頻度を、高スループット標的化アンプリコン次世代配列決定（ＮＧＳ）によって評価した。

【図9B】標的ヌクレオチド部位、並びにバイスタンダー及びＰＡＭヌクレオチドの描写、かつ不死化ＨＥＫ２９３細胞に使用されるＡＢＥが、Ｒ８３Ｃの顕著な正確な修正率をもたらすことを示す棒グラフを提供する。ｇ６ｐｃ遺伝子におけるＡからＧへの変換についての塩基エディターを、Ｒ８３Ｃの修正のために最適化した。バリアント１～５は、最適化された標的修正のために操作された、ｇＲＮＡ及び塩基エディターＲＮＡの組み合わせを表す。バリアント５は、限定的なバイスタンダー編集を用いるＲ８３Ｃ修正のためのおよそ６０％の標的化された塩基編集効率をもたらした（図９Ｂ）。

【図10】３週間齢のホモ接合ｈｕＲ８３Ｃ（Ｈｏｍ ｈｕＲ８３Ｃ）マウスが、ＧＳＤ－１ａの予想される成長障害及び代謝欠陥の特徴を示したことを実証する写真画像及び棒グラフを提示する。実験のために、マウスＧ６ＰＣの代わりにヒトＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃ導入遺伝子を発現するＧＳＤ－Ｉａマウスを生成して、インビボでの塩基編集を検証した。示された結果は、ｈｕＲ８３Ｃに対してホモ接合のマウスが出生後の致死性を示したことを確認し、それらは死産であったか、又は２４時間以内に死亡した。グルコース補充療法において、動物は少なくとも３週齢まで生存し、同腹仔対照と比較して、体重の低減、肝臓の拡大、顕著なＧ６Ｐａｓｅ阻害、及び血清代謝産物の異常を伴うＧＳＤ－Ｉａの特徴的な病理学的兆候を明らかにした。臨床及び公表された報告と一致する表現型。

【図11A】本明細書に記載の塩基エディター（ＡＢＥ）によって達成されるインビボ修正のドットプロットを示す。図１１Ａは、成体及び新生のヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスの肝臓における、効率的な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性塩基編集（ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃ修正）を示す。インビボでのＲ８３Ｃ修正のための塩基編集効率を検証するために、ＬＮＰ媒介性送達を、ｈｕＲ８３Ｃに対してヘテロ接合性のより少ない脆弱性のトランスジェニックマウスにおいて最初に最適化した。図６Ａにおける概略図は、ＩＶ注射を介して投与した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又は塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのＬＮＰ共製剤を用いる、これらの実験のためのインビボワークフローを示す。ホモ接合マウスの新生児の致死性を考慮して、ＬＮＰ投与は、出生直後のヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスの側頭静脈を介して用いられ、活性は、尾静脈を介して投与されたＬＮＰを受けた成体ヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスで見られた活性と比較された。全肝臓抽出物のＮＧＳ分析は、より広い範囲の効率を有する、成体でおよそ４０％の塩基編集効率及び新生児で最大約６０％の効率を明らかにした。バイスタンダー編集は、成体及び新生児において低いままであった。

【図11B】本明細書に記載の塩基エディター（ＡＢＥ）によって達成されるインビボ修正のドットプロットを示す。図６Ａにおける概略図は、ＩＶ注射を介して投与した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又は塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのＬＮＰ共製剤を用いる、これらの実験のためのインビボワークフローを示す。ホモ接合マウスの新生児の致死性を考慮して、ＬＮＰ投与は、出生直後のヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスの側頭静脈を介して用いられ、活性は、尾静脈を介して投与されたＬＮＰを受けた成体ヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスで見られた活性と比較された。全肝臓抽出物のＮＧＳ分析は、より広い範囲の効率を有する、成体でおよそ４０％の塩基編集効率及び新生児で最大約６０％の効率を明らかにした。バイスタンダー編集は、成体及び新生児において低いままであった。図１１Ｂは、肝臓におけるＬＮＰ媒介性Ｒ８３Ｃ修正が、新生児のホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウス及び同腹仔ヘテロ接合性ｈｕＲ８３Ｃマウスの生存と関連することを示す。簡潔に述べると、ｈｕＲ８３Ｃに対してホモ接合の新生児マウスを、ガイドＲＮＡ及びＡＢＥをコードするｍＲＮＡを含有するＬＮＰで治療した。治療されたマウスは、グルコース療法の不在下で、低血糖誘発性発作を伴わずに正常に３週齢まで成長した。治療されたホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウスは、ｈｕＲ８３Ｃに対してヘテロ接合性であった同腹子対照と一致して、総肝臓抽出物において最大約６０％の編集効率（すなわち、約６０％のＲ８３Ｃ修正）を示した。

【図12A】ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合のマウスにおける本明細書に記載の塩基編集を示す棒グラフ及び免疫組織化学染色画像を示し、ＧＳＤ－Ｉａ病態を逆転させるために、ほぼ正常な代謝機能を回復させる。図１２Ａにおけるグラフ中の最も暗い棒によって示されるように、３週間で、治療されたホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウスが、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、乳酸、及び尿酸を含むほぼ正常な血清代謝産物マーカーの回復を伴って、適切な代謝機能を示したことを検証した。更に、ＬＮＰ治療ホモ接合ｈｕＲ８３ＣマウスにおけるＧ６ＰＣ活性の生化学的アッセイ（生化学的に及び鉛－ホスフェート染色を介して評価される）は、同腹仔対照のものと一致した。ＧＳＤ－Ｉａの別の臨床的提示である肝腫大は、主に、過剰なグリコーゲン及び脂質沈着によって引き起こされる。

【図12B】ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合のマウスにおける本明細書に記載の塩基編集を示す棒グラフ及び免疫組織化学染色画像を示し、ＧＳＤ－Ｉａ病態を逆転させるために、ほぼ正常な代謝機能を回復させる。免疫組織化学分析は、ＬＮＰ治療マウスにおける正常な肝細胞サイズ及び脂質沈着を明らかにした（図１２Ｂ）。結果は、Ｒ８３Ｃ変異及びＧＳＤ－Ｉａと関連する代謝欠陥を修正するための塩基編集の可能性を実証する。

【図13】本明細書に記載の塩基編集を介する２４時間の絶食チャレンジ中に、ホモ接合ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃマウスにおける単回ＬＮＰ用量投与が正常血糖を維持したことを示す棒グラフを示す。

【図14】カプラン－マイヤー生存曲線を生成して、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合の新生トランスジェニックマウスの生存を、ＡＢＥ ｍＲＮＡを介する塩基編集後又は未治療のいずれかで推定したことを示す。新生マウスを、以下のプライマー、ユニバーサルフォワードプライマー（５’－ＡＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴ－３’（配列番号６１））、マウス特異的リバースプライマー（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴ－３’（配列番号６２））、ヒト特異的リバースプライマー１（５’－ＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴ－３’（配列番号６３）、及びヒト特異的リバースプライマー２（５’－ＡＧＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＧＧ－３’（配列番号６４））を使用して、ゲノムテールＤＮＡにおいてＰＣＲ分析を介して遺伝子型決定した。生存は、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合のトランスジェニックマウスについて注目された。未治療マウスは、死産（ｎ＝６）であったか、又は８時間（ｎ＝６）及び２４時間（ｎ＝１）で死亡したかのいずれかであった。１５％グルコース注射の投与は、生存を３２時間（ｎ＝５）、４８時間（ｎ＝２）、及び５６時間（ｎ＝２）に延長した。ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合の全てのＡＢＥ治療マウスは、３週間における研究の終了まで生存した。

【図15A】Ｃｙ５染料で蛍光タグ付けされたｇＲＮＡの概略図である。

【図15B】Ｃｙ５染料で蛍光タグ付けされたＮＬＳにコンジュゲートされたｇＲＮＡの概略図である。

【図15C】Ｎｕｃ Ｂｌｕｅによる核染色を示す。

【図15D】Ｃｙ５による核染色及びＡＬＡＳ１／ｓｇ２３ ｇＲＮＡの局在化を示す。

【図15E】ＮＬＳ－ｇＲＮＡの増強された核局在化を示す。

【図15F】ＰＸＢ細胞におけるｇＲＮＡ及びＮＬＳ－ｇＲＮＡの核局在化を示すグラフである。ＮＬＳにコンジュゲートされたとき、ｇＲＮＡは、核に効果的に局在化された。ＡＢＥ８．８．

【図16】３’末端でｓａＣａｓ９エフェクターに結合したＮＬＳコンジュゲートのモデルである。

【図17A】例示的な５％の末端修飾ｇＲＮＡ及び例示的な２５％の重度修飾ｓａＨＭ０３ ｇＲＮＡの配列を提供する。

【図17B】末端修飾ｇＲＮＡ及び重度修飾ｓａＨＭ０３ ｇＲＮＡに対する例示的なＮＬＳコンジュゲートｇＲＮＡのＡからＧへの塩基編集効率の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0143】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用するためのｇＲＮＡの効力を増強するための、方法、組成物、及びキットが本明細書に提供される。本発明は、一部の態様では、成功した編集事象の頻度を増加する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用するための増加した効力を有する、ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）を産生する方法を提供する。本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの核へのより良好な輸送を提供して、細胞質ＲＮａｓｅから保護し、ＲＮＰの形成のためのｇＲＮＡのより高い局所濃度を増加させることができる。本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まない対応するｇＲＮＡと比較して顕著により高い効力を有し、また、高度に修飾されたｇＲＮＡと比較してより高い効力を示す。

【0144】

ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）は、例えば、増加した効力を含む潜在的な多数の利点を有する。例えば、本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まないその対応するｇＲＮＡに対して、顕著により高い塩基編集効率を提供する。更に、末端修飾を有する（例えば、３’末端及び／又は５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む）ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、高度に修飾されている（例えば、４０％超、６０％超、又は８８％超の修飾された）ｇＲＮＡと比較して、より高い効力を提供する。

【0145】

本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意図するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願では、「又は」の使用は、別段明記されない限り、「及び／又は」を意味する。

【0146】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で使用される場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、別段注記されない限り、ＮＬＳ配列にコンジュゲートされたガイドＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）も指す。ｇＲＮＡは、標的配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡは、標的核酸配列とハイブリダイゼーションし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸への配列特異的結合を指向する。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的核酸配列に対して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相補性を有する。

【0147】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０個のヌクレオチド～２５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０個のヌクレオチド～５００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０個のヌクレオチド～１，０００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、又は２５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約５０～７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約７５～１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１００～１２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１２５～１５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１５０～１７５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約１７５～２００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２００～２２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２２５～２５０ヌクレオチド長である。

【0148】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ライゲーションされたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、とりわけ、いくつかのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２）、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２と関連したものである。

【0149】

ｇＲＮＡは、任意の標的配列を標的化するように設計され得る。最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒアルゴリズム、ＣｌｕｓｔｌＷ、ＣｌｕｓｔｌＸ、ＢＬＡＳＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＳＯＡＰ、Ｍａｑ及びＥＬＡＮＤを含む配列をアラインメントするための任意のアルゴリズムを使用して決定される。

【0150】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞のゲノム内の独自の標的配列を標的化するように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列を欠くように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ｍＦｏｌｄ又はＧｅｎｅｉｏｕｓを含む折り畳みアルゴリズムを使用して、最適な二次構造を有するように設計される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの発現は、誘導性プロモーター、例えば、ホルモン誘導性、テトラサイクリン又はドキシサイクリン誘導性、アラビノース誘導性、又は光誘導性の下であり得る。

【0151】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成し、いずれの実質的なヌクレアーゼ活性もなしに特定の標的に結合し得る「死んだｃｒＲＮＡ」、「死んだガイド」、又は「死んだガイド配列」である。

【0152】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、糖ホスフェート骨格又は塩基において化学修飾されている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性又は塩基対形成を改善するための、以下の修飾２’Ｏ－メチル、２’－Ｆ又はロック核酸のうちの１つ以上を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２－チオウリジン又はＮ６－メチルアデノシンなどの修飾された塩基を含有し得る。

【0153】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、他のオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、タグ、色素、又はポリエチレングリコールとコンジュゲートされている。

【0154】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、三次元構造に起因して特定の標的分子に結合するアプタマー又はリボスイッチ配列を含む。

【0155】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２、３、４、又は５個のヘアピンを有する。

【0156】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、６個のヌクレオチドを含むポリＴ配列を含む転写終結配列を含む。

【0157】

ｇＲＮＡの核局在化（ＮＬＳ）配列へのコンジュゲーション
一態様では、本発明は、ｇＲＮＡの３’末端を介してＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡを提供する。一態様では、本発明は、ｇＲＮＡの５’末端を介してＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡを提供する。一態様では、本発明は、ｇＲＮＡの内部部位を介してＮＬＳ配列にコンジュゲートされたｇＲＮＡを提供する。

【0158】

実施形態では、ｇＲＮＡは、リンカーを介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、当該リンカーは、化学部分（例えば、Ｌ）及び／又はペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）を含む。

【0159】

実施形態では、ｇＲＮＡは、化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳに直接コンジュゲートされる。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、非ペプチド性である。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ｇＲＮＡ及びＮＬＳの両方に共有結合している。

【0160】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、ペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）は、ｇＲＮＡ及びＮＬＳの両方に共有結合している。

【0161】

実施形態では、ｇＲＮＡは、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、かかるコンジュゲートは、化学部分Ｌ（例えば、非ペプチド性の化学部分）がｇＲＮＡ及びペプチドスペーサーに共有結合しており、ペプチドスペーサーがＮＬＳに共有結合している、式（Ｉ）による構造を有することができる。

【化2】

【0162】

一部の実施形態では、ＮＬＳ配列のＮ末端は、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＮＬＳ配列のＣ末端は、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してｇＲＮＡの５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＮＬＳ配列中の内部アミノ酸は、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＮＬＳ配列中の内部アミノ酸は、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してｇＲＮＡの５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＮＬＳ配列中の内部アミノ酸は、化学部分（例えば、Ｌ）及びペプチド部分（例えば、ペプチドスペーサー）の両方を含むリンカーを介してｇＲＮＡの内部ヌクレオチドにコンジュゲートされる。

【0163】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチドスペーサー又はＮＬＳアミノ酸配列のＣ末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0164】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ペプチドスペーサー又はＮＬＳアミノ酸配列のＮ末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0165】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してペプチドスペーサー又はＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0166】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に共有結合した化学部分（例えば、Ｌ）を介してペプチドスペーサー又はＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0167】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのチオール含有残基（例えば、システイン残基）に共有結合している。

【0168】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのセレン含有残基（例えば、セレノシステイン残基）に共有結合している。

【0169】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのアミノ含有残基（例えば、リジン残基）に共有結合している。

【0170】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳのフェノール含有残基（例えば、チロシン残基）に共有結合している。

【0171】

実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載のチオール、セレン、アミノ、又はフェノール含有残基）の形成に使用されるアミノ酸残基は、化学修飾を含む。

【0172】

一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、還元的アミノ化を介してＮＬＳにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＮＬＳ天然化学ライゲーションにコンジュゲートされる。ｇＲＮＡは、チオールエンクリックを介してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0173】

リンカーの調製に有用な例示的な化学物質が本明細書に記載されている。本明細書に記載の化学部分は、下部構造Ｌ^１及び／又はＬ^２を更に含んでもよく、Ｌ^１及びＬ^２は、各々独立して、Ｃ_１～１２アルキレン又はＣ_２～１２ヘテロアルキレンである任意選択的に置換された基である。実施形態では、Ｌ^１及びＬ^２は、オキソ（＝Ｏ）置換基（例えば、１つ又は２つのオキソ置換基）を含む。

【0174】

マレイミド－チオール／マレイミド－セレノール付加物
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、マレイミド－チオール付加物を含む。

【0175】

実施形態では、ｇＲＮＡは、マレイミド基とチオール基との間の付加反応又はチオール－エンクリック反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0176】

実施形態では、マレイミド－チオール付加物含有部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びマレイミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、マレイミド－チオール付加物含有部分は、マレイミド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0177】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、マレイミド－セレノール付加物を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、マレイミド基とセレノール基との間の付加反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、マレイミド－セレノール付加物含有部分は、セレノール基を含むｇＲＮＡ、及びマレイミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、マレイミド－セレノール付加物含有部分は、マレイミド基を含むｇＲＮＡ、及びセレノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0178】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化3】

を含み、式中、Ｙは、Ｓ又はＳｅである。

【0179】

実施形態では、Ｙは、Ｓである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化4】

を含む。実施形態では、

【化5】

部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びマレイミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、マレイミド－チオール付加物含有部分は、マレイミド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0180】

実施形態では、Ｙは、Ｓｅである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化6】

を含む。実施形態では、

【化7】

部分は、セレノール基を含むｇＲＮＡ、及びマレイミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、マレイミド－セレノール付加物含有部分は、マレイミド基を含むｇＲＮＡ、及びセレノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0181】

実施形態では、化学部分Ｌは、以下の構造（Ａ）を有し、式中、Ｙは、Ｓ又はＳｅである、

【化8】

【0182】

実施形態では、Ｙは、Ｓである。実施形態では、＊は、ｇＲＮＡへの共有結合を表す。実施形態では、＊＊は、ペプチドスペーサー又はＮＬＳへの共有結合を表す。実施形態では、＊＊は、ペプチドスペーサーへの共有結合を表す。

【0183】

チオエーテル／セレノエーテル
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、チオエーテル基を含む。

【0184】

実施形態では、ｇＲＮＡは、ヨードアセトアミド基とチオール基との間のコンジュゲーション反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0185】

実施形態では、チオエーテル含有部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びヨードアセトアミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、チオエーテル含有部分は、ヨードアセトアミド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0186】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、セレノエーテル部分を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、ヨードアセトアミド基とセレノール基との間のコンジュゲーション反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、セレノエーテル含有部分は、セレノール基を含むｇＲＮＡ、及びヨードアセトアミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、セレノエーテル含有部分は、ヨードアセトアミド基を含むｇＲＮＡ、及びセレノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0187】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化9】

を含み、式中、Ｙは、Ｓ又はＳｅである。

【0188】

実施形態では、Ｙは、Ｓである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化10】

を含む。実施形態では、

【化11】

部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びヨードアセトアミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化12】

部分は、ヨードアセトアミド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0189】

実施形態では、Ｙは、Ｓｅである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化13】

を含む。実施形態では、

【化14】

部分は、セレノール基を含むｇＲＮＡ、及びヨードアセトアミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化15】

部分は、ヨードアセトアミド基を含むｇＲＮＡ、及びセレノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0190】

ジスルフィド（チオール－ジスルフィド交換化学）
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ジスルフィド基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、ジスルフィド含有基とチオール基との間のチオール－ジスルフィド交換反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0191】

実施形態では、ジスルフィド含有部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びジスルフィド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、ジスルフィド含有部分は、ジスルフィド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0192】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化16】

を含む。実施形態では、

【化17】

部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びジスルフィド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化18】

部分は、ジスルフィド基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0193】

オキサジアゾールチオエーテル
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、オキサジアゾールチオエーテル基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、チオール基とスルホニルオキサジアゾール基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0194】

実施形態では、オキサジアゾールチオエーテル含有部分は、スルホニルオキサジアゾール基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、オキサジアゾールチオエーテル含有部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びスルホニルオキサジアゾール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0195】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化19】

を含む。実施形態では、

【化20】

部分は、スルホニルオキサジアゾール基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化21】

部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びスルホニルオキサジアゾール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0196】

尿素／チオ尿素／ジチオカルバメート（イソ（チオ）シアネート化学）
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、尿素基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、アミノ（例えば、一級アミン）基とイソシアネート基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0197】

実施形態では、尿素含有部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びイソシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、尿素含有部分は、イソシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0198】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、チオ尿素基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、アミノ（例えば、一級アミン）基とイソチオシアネート基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、チオ尿素含有部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びイソチオシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、チオ尿素含有部分は、イソチオシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0199】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化22】

を含み、式中、Ｘは、Ｓ又はＯである。

【0200】

実施形態では、Ｘは、Ｏである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化23】

を含む。実施形態では、

【化24】

部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びイソシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化25】

部分は、イソシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0201】

実施形態では、Ｘは、Ｓである。実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化26】

を含む。実施形態では、

【化27】

部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びイソチオシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化28】

部分は、イソチオシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0202】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ジチオカルバメート基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、チオール基とイソチオシアネート基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0203】

実施形態では、ジチオカルバメート含有部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びイソチオシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、ジチオカルバメート含有部分は、イソチオシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0204】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化29】

を含む。実施形態では、

【化30】

部分は、チオール基を含むｇＲＮＡ、及びイソチオシアネート基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化31】

部分は、イソチオシアネート基を含むｇＲＮＡ、及びチオール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0205】

ジアゼニルフェノール
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ジアゼニルフェノール基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、フェノール基とジアゾニウム基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0206】

実施形態では、ジアゼニルフェノール含有部分は、フェノール基を含むｇＲＮＡ、及びジアゾニウム基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、ジアゼニルフェノール含有部分は、ジアゾニウム基を含むｇＲＮＡ、及びフェノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0207】

実施形態では、実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化32】

を含む。実施形態では、

【化33】

部分は、フェノール基を含むｇＲＮＡ、及びジアゾニウム基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化34】

部分は、ジアゾニウム基を含むｇＲＮＡ、及びフェノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0208】

トリアゾリジンジオニルフェノール
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、トリアゾリジンジオニルフェノール基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、フェノール基と環状ジアゾジカルボキサミド基との間の反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0209】

実施形態では、トリアゾリジンジオニルフェノール含有部分は、フェノール基を含むｇＲＮＡ、及び環状ジアゾジカルボキサミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、トリアゾリジンジオニルフェノール含有部分は、環状ジアゾジカルボキサミド基を含むｇＲＮＡ、及びフェノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0210】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化35】

を含む。実施形態では、

【化36】

部分は、フェノール基を含むｇＲＮＡ、及び環状ジアゾジカルボキサミド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化37】

部分は、環状ジアゾジカルボキサミド基を含むｇＲＮＡ、及びフェノール基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0211】

トリアゾール（クリック化学）
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、トリアゾール基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、アルキン基とアジド基との間の１，３－双極子付加環化を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0212】

実施形態では、トリアゾール含有部分は、アルキン基を含むｇＲＮＡ、及びアジド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、トリアゾール含有部分は、アジド基を含むｇＲＮＡ、及びアルキン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、１，３－双極子付加環化は、銅触媒付加環化である。実施形態では、１，３－双極子付加環化は、歪み促進付加環化である。

【0213】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化38】

を含む。実施形態では、

【化39】

部分は、アルキン基を含むｇＲＮＡ、及びアジド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化40】

部分は、アジド基を含むｇＲＮＡ、及びアルキン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0214】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化41】

を含み、環Ａ及び環Ｂの各々が、任意選択的に置換されたアリール基である。実施形態では、環Ａは、存在する。実施形態では、環Ａは、存在しない。実施形態では、環Ｂは、存在する。実施形態では、環Ｂは、存在しない。実施形態では、環Ａ及び環Ｂの両方が存在する。実施形態では、環Ａ及び環Ｂの両方が存在しない。実施形態では、

【化42】

部分は、アルキン基を含むｇＲＮＡ、及びアジド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化43】

部分は、アジド基を含むｇＲＮＡ、及びアルキン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0215】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化44】

を含み、環Ａ及び環Ｂの各々が、任意選択的に置換されたアリール基である。実施形態では、環Ａは、存在する。実施形態では、環Ａは、存在しない。実施形態では、環Ｂは、存在する。実施形態では、環Ｂは、存在しない。実施形態では、環Ａ及び環Ｂの両方が存在する。実施形態では、環Ａ及び環Ｂの両方が存在しない。実施形態では、

【化45】

部分は、アルキン基を含むｇＲＮＡ、及びアジド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化46】

部分は、アジド基を含むｇＲＮＡ、及びアルキン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0216】

ジアザノルカラジエン
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、ジアザノルカラジエン基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、シクロプロペン基とテトラジン基との間のディールス・アルダー反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0217】

実施形態では、ジアザノルカラジエン含有部分は、シクロプロペン基を含むｇＲＮＡ、及びテトラジン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、ジアザノルカラジエン含有部分は、テトラジン基を含むｇＲＮＡ、及びシクロプロペン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0218】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化47】

を含み、式中、Ｒは、Ｃ_１～６アルキルである。実施形態では、

【化48】

部分は、シクロプロペン基を含むｇＲＮＡ、及びテトラジン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化49】

部分は、テトラジン基を含むｇＲＮＡ、及びシクロプロペン基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0219】

アミド／スルホンアミド
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、アミド基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、カルボキシル基とアミノ基（例えば、一級アミン）との間のコンジュゲーション反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。

【0220】

実施形態では、アミド含有部分は、カルボキシル基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、アミド含有部分は、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むｇＲＮＡ、及びカルボキシル基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、カルボキシル基は、活性化カルボキシル基である。実施形態では、カルボキシル基は、１－エチル－３－（３－ジメチル－アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミドによって活性化される。実施形態では、カルボキシル基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体（例えば、スルホ－ＮＨＳ）によって活性化される。

【0221】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化50】

を含む。実施形態では、

【化51】

部分は、カルボキシル基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化52】

部分は、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むｇＲＮＡ、及びカルボキシル基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0222】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、スルホンアミド基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、スルホニル基とアミノ（例えば、一級アミン）基との間のコンジュゲーション反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、スルホンアミド含有部分は、スルホニル基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、アミド含有部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びスルホニル基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0223】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化53】

を含む。実施形態では、

【化54】

部分は、スルホニル基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化55】

部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びスルホニル基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0224】

アミン（グルタルアルデヒド化学）
実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、アミノ基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、アミノ基（例えば、一級アミン）とアルデヒド基との間のコンジュゲーション反応、続いて還元反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされ、アミン含有部分を形成する。

【0225】

実施形態では、アミン含有部分は、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むｇＲＮＡ、及びアルデヒド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、アミン含有部分は、アルデヒド基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ基（例えば、一級アミン）を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0226】

実施形態では、アミン含有部分は、二官能性架橋試薬（例えば、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド）から形成される。実施形態では、アミン含有部分は、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むｇＲＮＡ、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）、及びジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）から形成される。実施形態では、アミン含有部分は、アルデヒド基を含むｇＲＮＡ、アルデヒド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）、及びジアミノアルカンから形成される。

【0227】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化56】

を含み、式中、Ｌ^３は、Ｃ_１～６アルキルである。実施形態では、

【化57】

部分は、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むｇＲＮＡ、アミノ基（例えば、一級アミン）を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）、及びジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）から形成される。実施形態では、

【化58】

部分は、アルデヒド基を含むｇＲＮＡ、アルデヒド基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）、及びジアミノアルカンから形成される。

【0228】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、アミノ基を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、アミノ（例えば、一級アミン）基とトレシル（２，２，２－トリフルオロエタンスルホニル）基との間のコンジュゲーション反応を使用してＮＬＳにコンジュゲートされる。実施形態では、アミン部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びトレシル（２，２，２－トリフルオロエタンスルホニル）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、アミン含有部分は、トレシル（２，２，２－トリフルオロエタンスルホニル）基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0229】

実施形態では、化学部分（例えば、Ｌ）は、

【化59】

を含む。実施形態では、

【化60】

部分は、アミノ（例えば、一級アミン）基を含むｇＲＮＡ、及びトレシル（２，２，２－トリフルオロエタンスルホニル）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。実施形態では、

【化61】

部分は、トレシル（２，２，２－トリフルオロエタンスルホニル）基を含むｇＲＮＡ、及びアミノ（例えば、一級アミン）基を含むＮＬＳ（又はペプチドスペーサー）から形成される。

【0230】

一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びＮＬＳ－ｇＲＮＡを含む。

【0231】

一部の実施形態では、直鎖状ガイドＲＮＡは、最初に合成される。このアプローチでは、２つ以上の別個のＲＮＡは、一緒にライゲーションされる。一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、第２のＲＮＡは、クラスター化して規則的に散在する短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。

【0232】

一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分が５’末端にホスフェートを含有するように合成される。このアプローチでは、２つの形態のライゲーションが可能であり、これらの両方は、ステムループ領域内に見出される。第１の形態のライゲーションは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１の天然な部位であるヘアピンの末端ループ内で生じる。第２の形態のライゲーションは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２及びＤＮＡリガーゼの天然物である二本鎖内で生じる。この形態のライゲーションの利点のうちの１つは、融合ｇＲＮＡと断片不純物との間の溶出時間の顕著な差異のために、断片不純物が容易に除去可能であることである。

【0233】

化学的に修飾されたＮＬＳ－ｇＲＮＡ
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、その骨格又はその塩基のうちの１つ以上に対する化学修飾を含む。例えば、化学的に修飾されたＲＮＡは、化学合成を含むことができ、天然ヌクレオチドに類似しない修飾された糖、塩基、骨格、又は官能基を含む高度に修飾されたモノマーを導入するために使用することができる。

【0234】

したがって、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、修飾された塩基を含む。一部の実施形態では、修飾されたＲＮＡとしては、以下、２－メトキシエトキシＡ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、２－メトキシエトキシＴなどの２’－Ｏ－メトキシ－エチル塩基（２’－ＭＯＥ）のうちの１つ以上が挙げられる。他の修飾された塩基としては、例えば、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、及びフルオロ塩基が挙げられる。様々なフルオロ塩基が既知であり、例えば、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ塩基が挙げられる。様々な２’－Ｏ－メチル修飾もまた、本明細書に記載の方法とともに使用され得る。例えば、以下の２’Ｏメチル修飾のうちの１つ以上を含む以下のＲＮＡを、記載の方法とともに使用することができる：２’－ＯＭｅ－５－メチル－ｒＣ、２’－ＯＭｅ－ｒＴ、２’－ＯＭｅ－ｒＩ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ｒＡ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＣ、アミノリンカー－Ｃ６－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｂｒ－ｒＵ、２’－ＯＭｅ－５－Ｉ－ｒＵ、２－ＯＭｅ－７－デアザ－ｒＧ。

【0235】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、以下の修飾、ホスホロチオエート、２’Ｏ－メチル、２’フルオロ（２’Ｆ）、ＤＮＡのうちの１つ以上を含む。

【0236】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、３’及び５’末端に２’ＯＭｅ修飾を含む。

【0237】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、以下の修飾のうちの１つ以上を含む：２’－Ｏ－２－メトキシエチル（ＭＯＥ）、ロック核酸、架橋核酸、アンロック核酸、ペプチド核酸、モルホリノ核酸。

【0238】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、以下の塩基修飾のうちの１つ以上を含む：２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、シュードウラシル、Ｎ１－メチル－シュードウラシル、５’メチルシトシン、２’ピリミジノン（ゼブラリン）、チミン。

【0239】

他の修飾された塩基には、例えば、２－アミノプリン、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、ジデオキシ－Ｃ、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、反転ｄＴ、イソ－ｄＧ、イソ－ｄＣ、反転ジデオキシ－Ｔ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、Ｓｕｐｅｒ Ｔ（登録商標）、２’－Ｆ－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２’－ＮＨ２－ｒ（Ｃ、Ｕ）、２，２’－無水－Ｕ、３’－デソキシ－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、３’－Ｏ－メチル－ｒ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、ｒＴ、ｒＩ、５－メチル－ｒＣ、２－アミノ－ｒＡ、ｒスペーサー（脱塩基）、７－デアザ－ｒＧ、７－デアザ－ｒＡ、８－オキソ－ｒＧ、５－ハロゲン化－ｒＵ、Ｎ－アルキル化－ｒＮが含まれる。

【0240】

本明細書では、他の化学的に修飾されたＲＮＡを使用することができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の末端及び／又はガイドＲＮＡの第２の末端は、例えば、５’，Ｉｎｔ，３’アジド（ＮＨＳエステル）、５’ヘキシニル、５’，Ｉｎｔ，３’５－オクタジイニルｄＵ、５’，Ｉｎｔビオチン（アジド）、５’，Ｉｎｔ６－ＦＡＭ（アジド）、及び５’，Ｉｎｔ５－ＴＡＭＲＡ（アジド）などの修飾された塩基を含み得る。本明細書に記載の方法とともに使用され得るＲＮＡヌクレオチド修飾の他の例としては、例えば、５’リン酸化及び３’リン酸化などのリン酸化修飾が挙げられる。ＲＮＡはまた、以下の修飾、アミノ修飾、ビオチン化、チオール修飾、アルキン修飾子、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、及びジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）のうちの１つ以上を有し得る。

【0241】

核酸塩基エディター
ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、修飾、又は改変する核酸塩基エディターは、本明細書に記載の方法及び組成物において有用である。本明細書に記載の核酸塩基エディターは、典型的には、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン及び核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ）を含む。ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、結合したガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）と併せた場合、標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、それによって、塩基エディターを編集されることが望まれる標的核酸配列に局在化することができる。

【0242】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される核酸塩基エディターは、塩基編集活性を改善する１つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される核酸塩基エディターのいずれかは、低減したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸塩基エディターのいずれかは、ヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、又はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在により、標的化された核酸塩基の反対側の非編集（例えば、脱アミノ化されていない）鎖を切断するＣａｓ９の活性が維持される。触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０へ）は、標的化された残基（例えば、Ａ又はＣ）を含有する編集された（例えば、脱アミノ化された）鎖の切断を防止する。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡが規定する標的配列に基づいて、特定の位置で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、非編集鎖の修復をもたらし、最終的には、非編集鎖上で核酸塩基の変化をもたらす。

【0243】

ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合する。塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、それ自体、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のヌクレアーゼドメイン）を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼを含み得る。エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の一本鎖、又は二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの０、１、又は２本の鎖を切断することができる。

【0244】

内部挿入を有する融合タンパク質
核酸プログラマブル核酸結合タンパク質、例えば、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書に提供される。異種ポリペプチドは、天然又は野生型ｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチド配列に見出されないポリペプチドであり得る。異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端でｎａｐＤＮＡｂｐに融合され得るか、又はｎａｐＤＮＡｂｐの内部の位置に挿入され得る。

【0245】

一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐの内部の位置に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ）又はその機能的断片である。例えば、融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片及びＣ末端断片に隣接するデアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ）を含み得る。融合タンパク質中のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０又はそのバリアント）である。

【0246】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、構造：
ＮＨ２－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片］－［デアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ９のＮ末端断片］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９のＣ末端断片］－ＣＯＯＨを含み、
式中、「］－［」の各事例は、任意選択的なリンカーである。

【0247】

デアミナーゼは、循環順列変異体（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）デアミナーゼであり得る。例えば、デアミナーゼは、循環順列変異体アデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、デアミナーゼは、循環順列変異体ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列において番号付けされているアミノ酸残基１１６で循環順列変異されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは、循環順列変異体ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列において番号付けされているアミノ酸残基１３６で循環順列変異されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは、循環順列変異体ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列において番号付けされているアミノ酸残基６５で循環順列変異されている。

【0248】

融合タンパク質は、２つ以上のデアミナーゼを含み得る。融合タンパク質は、例えば、１、２、３、４、５個、又はそれ以上のデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つのデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのデアミナーゼを含む。融合タンパク質中の２つ以上のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、又はそれらの組み合わせであり得る。２つ以上のデアミナーゼは、ホモ二量体であり得る。２つ以上のデアミナーゼは、ヘテロ二量体であり得る。２つ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにおいて直列に挿入され得る。一部の実施形態では、２つ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにおいて直列ではない場合がある。

【0249】

一部の実施形態では、融合タンパク質中のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ポリペプチド又はその断片である。Ｃａｓ９ポリペプチドは、バリアントＣａｓ９ポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ポリペプチド又はその断片である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチド又はその断片である。融合タンパク質中のＣａｓ９ポリペプチドは、全長Ｃａｓ９ポリペプチドであり得る。場合によっては、融合タンパク質中のＣａｓ９ポリペプチドは、全長Ｃａｓ９ポリペプチドではない場合がある。Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然に存在するＣａｓ９タンパク質に対して、Ｎ末端又はＣ末端で切断され得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、循環順列変異されたＣａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、標的ポリヌクレオチド及びガイド核酸配列に依然として結合することができる、Ｃａｓ９ポリペプチドの断片、部分、又はドメインであり得る。

【0250】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、又はそれらの断片若しくはバリアントである。

【0251】

Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片及びＣ末端断片に隣接する異種触媒ドメインを含む融合タンパク質は、本明細書に記載の方法における塩基編集にも有用である。Ｃａｓ９及び１つ以上のデアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼを含むか、又はＣａｓ９配列に隣接するアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質は、標的配列の非常に特異的かつ効率的な塩基編集にも有用である。ある実施形態では、キメラＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチド内に挿入された異種触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、又はアデノシンデアミナーゼ及びシチジンデアミナーゼ）を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメイン及びシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。

【0252】

アデノシンデアミナーゼ及びシチジンデアミナーゼ並びにＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、又は
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。

【0253】

一部の実施形態では、上記の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意選択的なリンカーの存在を示す。

【0254】

様々な実施形態では、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのＤＮＡ修飾活性（例えば、デアミナーゼ活性）を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、ＴａｄＡバリアントは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、ＴａｄＡバリアントは、Ｎ末端に融合される。ＴａｄＡバリアント及びシチジンデアミナーゼ並びにＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡバリアント）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡバリアント）］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡバリアント］－ＣＯＯＨ、又は
ＮＨ２－［ＴａｄＡバリアント］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。

【0255】

一部の実施形態では、上記の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意選択的なリンカーの存在を示す。

【0256】

他の実施形態では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（例えば、二分核局在化シグナル）を含有する。他の実施形態では、核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４）である。上記の態様の他の実施形態では、核局在化シグナルは、以下の配列によってコードされる：
ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣ（配列番号５）。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインの触媒活性をサイレンシングする変異を含有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、Ｄ５７４Ａ、Ｄ８２９Ａ、及び／又はＤ９５２Ａ変異を含有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、タグ（例えば、インフルエンザヘマグルチニンタグ）を更に含有する。

【0257】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン（例えば、Ｃａｓ１２由来ドメイン）を含み、内部融合された核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼドメインの全部又は一部）を有する。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｂである。

【0258】

非限定的な例として、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ＊８．１３）をＢｈＣａｓ１２ｂに挿入して、核酸配列を効果的に編集する融合タンパク質（例えば、ＴａｄＡ＊８．１３－ＢｈＣａｓ１２ｂ）を産生することができる。

【0259】

ｇＲＮＡを使用する遺伝子編集
本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、標的化された遺伝子編集のための好適な遺伝子編集系とともに使用することができ、これは、遺伝子サイレンシング事象、又は所望の標的遺伝子の発現における発現の改変（例えば、増加又は減少）をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、又は標的化されたゲノム修飾のための方法において使用することができ、本方法は、真核細胞内に、（ａ）本明細書で定義されるＮＬＳ－ｇＲＮＡ、（ｂ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を導入することを含み、（ａ）及び（ｂ）と染色体ＤＮＡにおける標的配列との相互作用が、標的化された転写活性化、標的化された転写抑制、標的化されたエピゲノム修飾、又は標的化されたゲノム修飾をもたらす。

【0260】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、以下を含む遺伝子編集系において使用することができる。本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡであって、ＲＮＡガイドが、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含む、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ；遺伝子編集タンパク質であって、遺伝子編集酵素が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列の切断を引き起こすことができる、遺伝子編集タンパク質。

【0261】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、以下を含む遺伝子編集系において使用することができる。本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡであって、ＲＮＡガイドが、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含む、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ；並びに遺伝子編集タンパク質；遺伝子編集タンパク質が、デアミナーゼに融合されており、遺伝子編集タンパク質融合が、ＲＮＡガイドに結合し、ＲＮＡガイドに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

【0262】

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞内の標的核酸の発現を改変する方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質及び本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡと接触させることを含み、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに結合し、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに相補的な標的核酸配列の切断を引き起こすことができる。

【0263】

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞内の標的核酸の発現を改変する方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質及び本明細書に記載の合成ＮＬＳ－ｇＲＮＡと接触させることを含み、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに結合し、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

【0264】

一部の実施形態では、本発明は、真核細胞内の標的核酸を修飾する方法を提供し、細胞を遺伝子編集タンパク質及び本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡと接触させることを含み、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができる直接反復配列及びスペーサー配列を含み、遺伝子編集タンパク質が、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに結合し、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに相補的な標的核酸配列を編集することができる。

【0265】

一部の実施形態では、遺伝子編集方法又は系は、部位特異的な様式で標的ＤＮＡを修飾するエフェクターを有する融合タンパク質を含み、修飾活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、又はヌクレアーゼ活性を含み、これらのうちのいずれかは、ＤＮＡ又はＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＤＮＡ結合タンパク質）を修飾することができる。

【0266】

一部の実施形態では、遺伝子編集方法又は系は、アデノシン又はシトシン塩基を修飾することができ、部位特異的塩基エディターとして機能することができるデアミナーゼ酵素を含む、ヌクレオチド塩基を化学的に修飾することによって、ＤＮＡ配列を編集することができる酵素を有する融合タンパク質を含む。例えば、通常、ＲＮＡを基質として使用する、ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９に融合しているとき、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡに標的化することができ、シチジンをウリジンに直接変換し、ＡＤＡＲ酵素は、アデノシンをイノシンに脱アミノ化する。したがって、デアミナーゼを使用する「塩基編集」は、１つの標的ＤＮＡ塩基の別の塩基へのプログラマブル変換を可能にする。様々な塩基エディターは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載の方法及び系において使用することができる。例示的な塩基エディターは、例えば、Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１８，１９（１２）：７７０－７８８に記載されており、その内容は本明細書に組み込まれる。

【0267】

一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子をサイレンシングするための終止コドンの導入をもたらす。一部の実施形態では、塩基編集は、アミノ酸配列を改変することによって、改変されたタンパク質機能をもたらす。

【0268】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの転写を調節する遺伝子編集方法又は系において使用することができる。一部の実施形態では、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び長ｎｃＲＮＡを含む標的非コードＲＮＡの発現を調節する遺伝子編集方法又は系において使用することができる。

【0269】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、好適な遺伝子編集系を使用してクロマチンループ構造の標的化された操作のために使用される。調節ゲノム領域間のクロマチンループの標的化された操作は、遺伝的欠陥を克服するか、又は異常なエンハンサー－プロモーター接続を阻害するために、内因性クロマチン構造を操作し、新しいエンハンサー－プロモーター接続の形成を可能にする手段を提供する。

【0270】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、有益な臨床バリアント又は抑制変異の挿入による病原性変異の修正のための遺伝子編集系と併せて使用される。

【0271】

ＡからＧへの編集
一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼドメインを含む。塩基エディターのかかるアデノシンデアミナーゼドメインは、アデニン（Ａ）核酸塩基のグアニン（Ｇ）核酸塩基への編集を、Ａを脱アミノ化してイノシン（Ｉ）（これは、Ｇの塩基対合特性を示す）を形成することによって、促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化する（すなわち、アミン基を除去する）ことができる。一部の実施形態では、ＡからＧへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害因子、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメイン又は触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼを更に含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＵＧＩドメイン又は触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化アデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害又は防止することができ、これは、塩基エディターの活性又は効率を改善することができる。

【0272】

アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、ＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含むことができる。ある実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ、例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）又はｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）の全部又は一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＤＮＡポリヌクレオチドのＡ核酸塩基を脱アミノ化することができる可能性もある。ある実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＴがＤＮＡにおける標的Ａを脱アミノ化することを可能にする１つ以上の変異を含むＡＤＡＴの全部又は一部を含む。例えば、塩基エディターは、以下の変異のうちの１つ以上を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＡＤＡＴ（ＥｃＴａｄＡ）の全部又は一部を含むことができる：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５６Ｆ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異。

【0273】

一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼバリアントドメイン）を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントドメインは、ＴａｄＡ＊７．１０アミノ酸配列における改変の組み合わせを含有し、その組み合わせは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０アミノ酸配列における改変の組み合わせは、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、若しくはＬ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する改変である。塩基エディターのかかるアデノシンデアミナーゼドメインは、アデニン（Ａ）核酸塩基のグアニン（Ｇ）核酸塩基への編集を、Ａを脱アミノ化してイノシン（Ｉ）（これは、Ｇの塩基対合特性を示す）を形成することによって、促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化する（すなわち、アミン基を除去する）ことができる。

【0274】

一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸塩基エディターは、１つ以上のタンパク質ドメインを一緒に融合することによって作製することができ、それによって、融合タンパク質が生成される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性（例えば、効率、選択性、及び特異性）を改善する１つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、低減したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、又はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在により、標的化されたＡの反対側のＴを含有する非編集（例えば、脱アミノ化されていない）鎖を切断するＣａｓ９の活性が維持される。Ｃａｓ９の触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０へ）により、標的化されたＡ残基を含有する編集された鎖の開裂が防止される。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡが規定する標的配列に基づいて、特定の位置で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、非編集鎖の修復をもたらし、最終的には、非編集鎖上でＴからＣへの変化をもたらす。一部の実施形態では、ＡからＧへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害因子、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメイン又は触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼを更に含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＵＧＩドメイン又は触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化アデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害又は防止することができ、これは、塩基エディターの活性又は効率を改善することができる。

【0275】

アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、ＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含むことができる。ある実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ、例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）に作用するアデノシンデアミナーゼの全部又は一部を含む。別の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）の全部又は一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＤＮＡポリヌクレオチドのＡ核酸塩基を脱アミノ化することができる可能性もある。ある実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＴがＤＮＡにおける標的Ａを脱アミノ化することを可能にする１つ以上の変異を含むＡＤＡＴの全部又は一部を含む。例えば、塩基エディターは、以下の変異のうちの１つ以上を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＡＤＡＴ（ＥｃＴａｄＡ）の全部又は一部を含むことができる：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５６Ｆ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異。

【0276】

アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。任意の相同タンパク質における対応する残基は、例えば、配列整列及び相同残基の決定によって特定することができる。本明細書に記載の変異のいずれか（例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれか）に対応する、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼにおける（例えば、ｅｃＴａｄＡに対して相同性を有する）変異は、それに応じて生成することができる。

【0277】

アデノシンデアミナーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、１つ以上のアデノシンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基におけるアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し得る。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、例えば、配列整列及び相同残基の決定によって、任意の相同タンパク質における対応する残基を特定することができるであろう。したがって、当業者は、本明細書に記載の変異のいずれか、例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれかに対応する、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼにおける（例えば、ｅｃＴａｄＡに対して相同性を有する）変異を生成することができるであろう。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。

【0278】

増加した効率（＞５０～６０％）及び特異性を有するアデノシンデアミナーゼバリアントが本明細書に提供され、記載される。特に、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアントは、ポリヌクレオチド内で所望の塩基を編集する可能性が高く、改変されることが意図されない塩基（すなわち、「バイスタンダー」）を編集する可能性が低い。

【0279】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼ由来である。特定の実施形態では、ＴａｄＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＴａｄＡのうちのいずれか１つである。

【0280】

野生型ＴａｄＡ（ｗｔ）アデノシンデアミナーゼは、以下の配列（ＴａｄＡ参照配列とも称される）を有する：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号６）

【0281】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、全長Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＲＲＡＦＩＴＧＶＦＦＬＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号７）。

【0282】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。

【0283】

しかしながら、本出願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼが当業者には明らかであり、かつ本開示の範囲内であることを理解されたい。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）のホモログであり得る。限定されるものではないが、例示的なＡＤ ＡＴホモログのアミノ酸配列には、以下が挙げられる：

【0284】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＴａｄＡ：
ＭＧＳＨＭＴＮＤＩＹＦＭＴＬＡＩＥＥＡＫＫＡＡＱＬＧＥＶＰＩＧＡＩＩＴＫＤＤＥＶＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＬＱＱＰＴＡＨＡＥＨＩＡＩＥＲＡＡＫＶＬＧＳＷＲＬＥＧＣＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＴＩＶＭＳＲＩＰＲＶＶＹＧＡＤＤＰＫＧＧＣＳＧＳＬＭＮＬＬＱＱＳＮＦＮＨＲＡＩＶＤＫＧＶＬＫＥＡＣＳＴＬＬＴＴＦＦＫＮＬＲＡＮＫＫＳＴＮ（配列番号８）

【0285】

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡ：
ＭＴＱＤＥＬＹＭＫＥＡＩＫＥＡＫＫＡＥＥＫＧＥＶＰＩＧＡＶＬＶＩＮＧＥＩＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＥＱＲＳＩＡＨＡＥＭＬＶＩＤＥＡＣＫＡＬＧＴＷＲＬＥＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＰＭＣＡＧＡＶＶＬＳＲＶＥＫＶＶＦＧＡＦＤＰＫＧＧＣＳＧＴＬＭＮＬＬＱＥＥＲＦＮＨＱＡＥＶＶＳＧＶＬＥＥＥＣＧＧＭＬＳＡＦＦＲＥＬＲＫＫＫＫＡＡＲＫＮＬＳＥ（配列番号９）

【0286】

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡ：
ＭＰＰＡＦＩＴＧＶＴＳＬＳＤＶＥＬＤＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＨＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＬＱＮＹＲＬＬＤＴＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＩＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＩＥＧＶＬＲＤＥＣＡＴＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＬＫＫＡＤＲＡＥＧＡＧＰＡＶ（配列番号１０）

【0287】

Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡ：
ＭＤＥＹＷＭＱＶＡＭＱＭＡＥＫＡＥＡＡＧＥＶＰＶＧＡＶＬＶＫＤＧＱＱＩＡＴＧＹＮＬＳＩＳＱＨＤＰＴＡＨＡＥＩＬＣＬＲＳＡＧＫＫＬＥＮＹＲＬＬＤＡＴＬＹＩＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＡＲＶＶＹＧＡＲＤＥＫＴＧＡＡＧＴＶＶＮＬＬＱＨＰＡＦＮＨＱＶＥＶＴＳＧＶＬＡＥＡＣＳＡＱＬＳＲＦＦＫＲＲＲＤＥＫＫＡＬＫＬＡＱＲＡＱＱＧＩＥ（配列番号１１）

【0288】

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｆ３０３１（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＴａｄＡ：
ＭＤＡＡＫＶＲＳＥＦＤＥＫＭＭＲＹＡＬＥＬＡＤＫＡＥＡＬＧＥＩＰＶＧＡＶＬＶＤＤＡＲＮＩＩＧＥＧＷＮＬＳＩＶＱＳＤＰＴΑΗＡＥＩＩＡＬＲＮＧＡＫＮＩＱＮＹＲＬＬＮＳＴＬＹＶＴＬＥＰＣＴＭＣＡＧＡＩＬＨＳＲＩＫＲＬＶＦＧＡＳＤＹＫＴＧＡＩＧＳＲＦＨＦＦＤＤＹＫＭＮＨＴＬＥＩＴＳＧＶＬＡＥＥＣＳＱＫＬＳＴＦＦＱＫＲＲＥＥＫＫＩＥＫＡＬＬＫＳＬＳＤＫ（配列番号１２）

【0289】

Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡ：
ＭＲＴＤＥＳＥＤＱＤＨＲＭＭＲＬＡＬＤＡＡＲＡＡＡＥＡＧＥＴＰＶＧＡＶＩＬＤＰＳＴＧＥＶＩＡＴＡＧＮＧＰＩＡＡＨＤＰＴＡＨＡＥＩＡＡＭＲＡＡＡＡＫＬＧＮＹＲＬＴＤＬＴＬＶＶＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＩＳＨＡＲＩＧＲＶＶＦＧＡＤＤＰＫＧＧＡＶＶＨＧＰＫＦＦＡＱＰＴＣＨＷＲＰＥＶＴＧＧＶＬＡＤＥＳＡＤＬＬＲＧＦＦＲＡＲＲＫＡＫＩ（配列番号１３）

【0290】

Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡ：
ＭＳＳＬＫＫＴＰＩＲＤＤＡＹＷＭＧＫＡＩＲＥＡＡＫＡＡＡＲＤＥＶＰＩＧＡＶＩＶＲＤＧＡＶＩＧＲＧＨＮＬＲＥＧＳＮＤＰＳＡＨＡＥＭＩＡＩＲＱＡＡＲＲＳＡＮＷＲＬＴＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＬＭＣＭＧＡＩＩＬＡＲＬＥＲＶＶＦＧＣＹＤＰＫＧＧＡＡＧＳＬＹＤＬＳＡＤＰＲＬＮＨＱＶＲＬＳＰＧＶＣＱＥＥＣＧＴＭＬＳＤＦＦＲＤＬＲＲＲＫＫＡＫＡＴＰＡＬＦＩＤＥＲＫＶＰＰＥＰ（配列番号１４）

【0291】

Ｅ．Ｃｏｌｉ ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）のある実施形態は、以下を含む：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）

【0292】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのうちのいずれかに記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼが、１つ以上の変異（例えば、本明細書に提供される変異のいずれか）を含み得ることを理解されたい。本開示は、特定の同一性パーセント、加えて、本明細書に記載の変異のいずれか又はそれらの組み合わせを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列又は本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、又はそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野で既知であるか、又は本明細書に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、又は少なくとも１７０個の同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

【0293】

本明細書に提供される変異のいずれか（例えば、ＴａｄＡ参照配列に基づく）が、他のアデノシンデアミナーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）、又は他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）に導入され得ることを理解されたい。本明細書に提供されるように変異され得る相同アミノ酸残基を特定するために、追加のデアミナーゼを同様に整列させることができることは、当業者には明らかであろう。したがって、ＴａｄＡ参照配列において特定された変異のいずれかは、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄａ）において作製され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ＴａｄＡ参照配列又は別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個別に、又は任意の組み合わせで作製され得ることも理解されたい。

【0294】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８Ａ、若しくはＤ１０８Ｙ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。しかしながら、本明細書に提供されるように変異され得る相同アミノ酸残基を特定するために、追加のデアミナーゼを同様に整列させることができることを理解されたい。

【0295】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0296】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、又はＥ１５５Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0297】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１４７Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１４７Ｙ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0298】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、又はＤ１４７Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、又はＥ１５５Ｖ変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄ１４７Ｙを含む。

【0299】

本明細書に提供される変異のいずれか（例えば、ＴａｄＡ参照配列のｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）が、他のアデノシンデアミナーゼ、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）、又は他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）に導入され得ることを理解されたい。ｅｃＴａｄＡにおける変異残基に対してどの程度相同であるかは、当業者には明らかであろう。したがって、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれかは、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼにおいて作製され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ｅｃＴａｄＡ又は別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個別に、又は任意の組み合わせで作製され得ることも理解されたい。

【0300】

例えば、アデノシンデアミナーゼは、変異の組み合わせ（例えば、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、又はＬ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ）を含有し、かつ１つ以上の追加の変異を含有し得る。追加の変異としては、例えば、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、及び／若しくはＤ１４７Ｙ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異が挙げられる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列における以下の変異群（変異群は、「；」によって分離される）、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む：Ｄ１０８Ｎ及びＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８Ｎ及びＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ及びＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ及びＥ１５５Ｖ；Ａ１０６Ｖ及びＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５Ｖ及びＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、及びＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、及びＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ１５５Ｖ、及びＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、及びＤ１４７Ｙ；並びにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、及びＤ１４７Ｙ。しかしながら、本明細書に提供される対応する変異の任意の組み合わせが、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において作製され得ることを理解されたい。

【0301】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｔ１７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、及び／若しくはＫ１５７Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６Ｅ、若しくはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５Ｋ、若しくはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｃ、若しくはＲ１０７Ｈ、若しくはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８Ｇ、若しくはＤ１０８Ｎ、若しくはＤ１０８Ｖ、若しくはＤ１０８Ａ、若しくはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０Ｉ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄ、及び／又はＫ１５７Ｒ変異のうちの１つ以上、あるいは別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

【0302】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、及び／若しくはＮ１２７Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘは、任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、及び／若しくはＮ１２７Ｓ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

【0303】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘ、及び／若しくはＴ１６６Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、若しくはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５Ｇ、若しくはＥ１５５Ｖ、若しくはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈ、及び／又はＴ１６６Ｐ変異のうちの１つ以上、あるいは別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

【0304】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、及びＱ１５４Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、及びＱ１６３Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、及びＴ１６６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0305】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、及びＤ１０８Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、及びＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0306】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、及びＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、若しくは７個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、及びＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0307】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、及びＱ１５４Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５Ｇ、及びＱ１６３Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｖ、及びＴ１６６Ｐからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｄ、及びＫ１６１Ｑからなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、及びＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、及びＥ１５５Ｇからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における変異を含む。

【0308】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異のうちの１つ以上又は１つ以上の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、若しくはＤ１０８Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ及びＤ１０８Ｎ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｃ及びＤ１０８Ｎ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、及びＱ１５４Ｈ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、及びＥ１５５Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、及びＥ１５５Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、及びＮ１２７Ｓ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、及びＥ１５５Ｖ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0309】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｈ８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、及び／若しくはＫ１６０Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆ、及び／若しくはＫ１６０Ｓ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における１つ以上の対応する変異を含む。

【0310】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｌ８４Ｘ変異アデノシンデアミナーゼを含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0311】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｙ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0312】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｆ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0313】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、及びＩ１５６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、若しくは７個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、及びＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、及びＫ１６０Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0314】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、及びＩ１５６Ｆからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、若しくは７個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、及びＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、又は６個の変異を含む。

【0315】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、及びＫ１６０Ｓからなる群から選択される１、２、３、４、若しくは５個の変異、又は対応する変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける変異を含む。

【0316】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘ、及び／若しくはＡ１４３Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型のアデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、及び／若しくはＡ１４３Ｒ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に対応する本明細書に記載の変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

【0317】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、若しくはＥ２５Ｙ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0318】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、若しくはＲ２６Ｋ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0319】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、若しくはＲ１０７Ｓ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0320】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0321】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、及び／若しくはＡ１４３Ｒ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

【0322】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、及び／若しくはＫ１６１Ｘ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ１４６Ｒ、Ｓ１４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎ、及び／若しくはＫ１６１Ｔ変異のうちの１つ以上、又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における１つ以上の対応する変異を含む。

【0323】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0324】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７Ｔ若しくはＮ３７Ｓ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0325】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｔ若しくはＰ４８Ｌ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0326】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１Ｈ若しくはＲ５１Ｌ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0327】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６Ｒ若しくはＳ１４６Ｃ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0328】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｎ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0329】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、若しくはＰ４８Ａ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0330】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0331】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３Ｒ若しくはＷ２３Ｌ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0332】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２Ｘ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２Ｐ若しくはＲ５２Ｈ変異、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

【0333】

一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、変異Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、及びＫ１５７Ｎを含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に対する以下の変異の組み合わせを含み、組み合わせの各変異は、「＿」によって区切られ、変異の各組み合わせは、括弧の間にある：
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｒ１０７Ｃ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｋ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｉ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｆ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ ｃａｔ ｄｅａｄ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｙ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｇ２２Ｐ＿Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ＿Ｓ１３８Ａ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｍ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｐ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｃ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ａ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｎ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｎ３７Ｔ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｍ７０Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｅ１３４Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｒ５１Ｈ＿Ｄ７７Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｈ９６Ｌ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６０Ｅ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｇ６７Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｔ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｑ７１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｌ１３７Ｍ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ９１Ｔ＿Ｆ１０４Ｉ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｄ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｇ１２５Ａ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｓ９７Ｃ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｗ２３Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ）、（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ａ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ｒ９８Ｑ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｒ１２９Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｌ１５７Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）。

【0334】

一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ＊７．１０ドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、ヘテロ二量体を形成することができる、ＴａｄＡ＊７．１０及びＴａｄＡ（ｗｔ）を含む。一実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼに結合した、ＴａｄＡ＊７．１０に結合した野生型ＴａｄＡを含む。

【0335】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、少なくとも１つの改変を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列における改変を含む：
ＴａｄＡ＊７．１０

【0336】

ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３）

【0337】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、アミノ酸８２及び／又は１６６における改変を含む。特定の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、以下の改変のうちの１つ以上を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、及び／又はＱ１５４Ｒ。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０のバリアントは、以下の群から選択される改変の組み合わせを含む：Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。

【0338】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０のバリアントは、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及び／又はＤ１６７Ｎの群から選択される１つ以上の改変を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０のバリアントは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０のバリアントは、以下の群から選択される改変の組み合わせを含む：Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ。

【0339】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡバリアント）は、欠失を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｃ末端の欠失を含む。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、及び１５７で始まるＣ末端の欠失を含む。

【0340】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、及び／若しくはＱ１５４Ｒのうちの１つ以上を含む単量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ＊８）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される改変の組み合わせを含む単量体である。

【0341】

他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）単量体を含む、本開示の塩基エディター。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ＊８）単量体は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、及びＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含む。

【0342】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＭＳＰ８２８）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含む単量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＭＳＰ８２８）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含む単量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡバリアント）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含む単量体である。

【0343】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、及び／又はＱ１５４Ｒのうちの１つ以上を有する。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される改変の組み合わせを有する。

【0344】

他の実施形態では、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）ホモ二量体を含む、本開示の塩基エディター。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、及びＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを有する。

【0345】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を有する。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを有する。

【0346】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、及び／又はＱ１５４Ｒのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。

【0347】

他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、及びＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む。

【0348】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）とのヘテロ二量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を有するアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）とを含むヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）とのヘテロ二量体である。

【0349】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、及び／又はＱ１５４Ｒのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。

【0350】

他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、及びＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む。

【0351】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、及び／又はＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）とのヘテロ二量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下の改変、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、並びにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、及びＤ１６７Ｎのうちの１つ以上を有するアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）とを含むヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）とのヘテロ二量体である。

【0352】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、表８Ａ、１０、１１、又は１３に示されるバリアントである。表８Ａ、１０、１１、及び１３は、ＴａｄＡアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置の番号、及びＴａｄＡ－７．１０アデノシンデアミナーゼにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸を示す。表８Ａ、１０、１１、及び１３はまた、その全容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚに記載されているファージ補助非連続的進化（ＰＡＮＣＥ）及びファージ補助連続的進化（ＰＡＣＥ）後のＴａｄＡ－７．１０に対するＴａｄＡバリアントのアミノ酸変化を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ａ、ＴａｄＡ＊８ｂ、ＴａｄＡ＊８ｃ、ＴａｄＡ＊８ｄ、又はＴａｄＡ＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ｅである。

【0353】

特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼヘテロ二量体は、ＴａｄＡ＊８ドメインと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＴａｄＡ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｆ３０３１（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＴａｄＡ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡ、又はＴａｄＡ＊７．１０から選択されるアデノシンデアミナーゼドメインとを含むことができる。

【0354】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８である。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列又はその断片を含むか又はそれから本質的になるＴａｄＡ＊８である：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号１６）

【0355】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は切断される。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡ＊８は、全長ＴａｄＡ＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、又は２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡ＊８は、全長ＴａｄＡ＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、又は２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、全長ＴａｄＡ＊８である。

【0356】

一実施形態では、本明細書に記載及び／又は例示される融合タンパク質は、野生型ＴａｄＡを含み、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）に連結され、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ＊８ドメインを含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、ヘテロ二量体を形成することができる。

【0357】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、又はＴａｄＡ＊８．２４である

【表1】

【0358】

一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、表６に示されるバリアントである。表６は、ＴａｄＡアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置の番号、及びＴａｄＡ＊７．１０アデノシンデアミナーゼにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＭＳＰ６０５、ＭＳＰ６８０、ＭＳＰ８２３、ＭＳＰ８２４、ＭＳＰ８２５、ＭＳＰ８２７、ＭＳＰ８２８、又はＭＳＰ８２９である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＭＳＰ８２８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＭＳＰ８２９である。

【表2】

【0359】

一実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、野生型ＴａｄＡを含み、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアントに連結され、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のバリアントＴａｄＡドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、ヘテロ二量体を形成することができるバリアントＴａｄＡ及びＴａｄＡ（ｗｔ）を含む。

【0360】

一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは切断される。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡは、全長ＴａｄＡバリアントに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、又は２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡバリアントは、全長ＴａｄＡバリアントに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、又は２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、全長ＴａｄＡバリアントである。

【0361】

特定の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、太字で示される以下の位置のいずれかにおいて、１つ以上の変異を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、下線で示される位置のいずれかにおいて、１つ以上の変異を含む：

【0362】

例えば、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、以下、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、及び／又はＱ１５４Ｒのうちのいずれか１つ以上を単独で又は組み合わせて、アミノ酸位置８２及び／又は１６６（例えば、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ）に改変を含む。

【0363】

特定の実施形態では、改変の組み合わせは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列、又は別のＴａｄＡにおける対応する変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変のうちの１つ以上を含む：Ｒ２１Ｎ、Ｒ２３Ｈ、Ｅ２５Ｆ、Ｎ３８Ｇ、Ｌ５１Ｗ、Ｐ５４Ｃ、Ｍ７０Ｖ、Ｑ７１Ｍ、Ｎ７２Ｋ、Ｙ７３Ｓ、Ｖ８２Ｔ、Ｍ９４Ｖ、Ｐ１２４Ｗ、Ｔ１３３Ｋ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１３９Ｍ、Ｃ１４６Ｒ、及びＡ１５８Ｋ。１つ以上の改変が、下線及び太字フォントで上記の配列に示されている。

【0364】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｉ７６Ｙ＿Ｖ８２Ｓ＿Ｙ１２３Ｈ＿Ｙ１４７Ｒ＿Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｈ１２３Ｈ、及びＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ。

【0365】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｐ１２４Ｗ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＭ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。

【0366】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、及びＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、Ｍ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｍ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、及びＭ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、単量体として発現される。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヘテロ二量体として発現される。一部の実施形態では、デアミナーゼ又は他のポリペプチド配列は、例えば、融合タンパク質の成分として含まれる場合、メチオニンを欠く。これにより、位置の番号付けが変化する場合がある。しかしながら、当業者は、かかる対応する変異が、同じ変異（例えば、Ｙ７３Ｓ及びＹ７２Ｓ、並びにＤ１３９Ｍ及びＤ１３８Ｍ）を指すことを理解するであろう。

【0367】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、単量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、野生型ＴａｄＡアデノシンデアミナーゼを有するヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、別のＴａｄＡバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８、ＴａｄＡ＊９）を有するヘテロ二量体である。ＴａｄＡ＊９アデノシンデアミナーゼの追加の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０２０／０４９９７５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、野生型ＴａｄＡを含み、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡバリアント）に連結され、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡバリアントドメインを含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、ヘテロ二量体を形成することができる。

【0368】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡバリアントドメインを含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヘテロ二量体としてのＴａｄＡバリアントに連結された野生型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ（ｗｔ））を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヘテロ二量体としてのＴａｄＡバリアントに連結されたＴａｄＡ＊７．１０を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴａｄＡバリアント単量体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴａｄＡバリアントとＴａｄＡ（ｗｔ）とのヘテロ二量体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴａｄＡバリアントとＴａｄＡ＊７．１０とのヘテロ二量体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのＴａｄＡバリアントのヘテロ二量体を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、表５、６、以下、又は本明細書に提供される任意の他のＴａｄＡバリアントから選択される。

【0369】

一部の実施形態では、デアミナーゼ又は他のポリペプチド配列は、例えば、融合タンパク質の成分として含まれる場合、メチオニンを欠く。これにより、位置の番号付けが変化する場合がある。しかしながら、当業者は、かかる対応する変異が、同じ変異を指すことを理解するであろう。

【0370】

本明細書に提供される変異のいずれか、及び任意の追加の変異（例えば、ｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）は、任意の他のアデノシンデアミナーゼに導入され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ＴａｄＡ参照配列又は別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において、個別に、又は任意の組み合わせで作製され得る。

【0371】

ＡからＧへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）及びＧａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ，５５１，４６４－４７１（２０１７）に記載されており、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0372】

Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるヌクレオチドを標的とするための核酸塩基エディターの使用
Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるヌクレオチドを標的とする核酸塩基エディターの適合性は、本明細書に記載されるように評価される。。

【0373】

核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載のように、すなわち、標的遺伝子を配列決定して標的配列における改変を検出することによって評価される。サンガー配列決定について、精製されたＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローニングし、形質転換し、ミニプレップし、単一のプライマーを用いて配列決定する。配列決定は、次世代配列決定技術を使用して行ってもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、３００～５００ｂｐであり得、非対称に配置された意図された切断部位を有する。ＰＣＲ後、次世代配列決定のアダプター及びバーコード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａマルチプレックスアダプター及びインデックス）を、例えば、高スループット配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）に使用するために、アンプリコンの末端に追加してもよい。

【0374】

一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、目的のポリヌクレオチドを標的とするために使用される。一実施形態では、本明細書に記載の核酸塩基エディターは、核酸配列、例えば、ＧＳＤ１ａ関連変異を保有するＧ６ＰＣポリヌクレオチドを標的とするために使用されるガイドＲＮＡと併せて、細胞（例えば、肝細胞）に送達され、それによって、標的遺伝子、すなわち、Ｇ６ＰＣを改変する。

【0375】

一部の実施形態では、塩基エディターは、ガイドＲＮＡによって標的化され、目的の遺伝子（例えば、Ｇ６ＰＣ）の配列に１つ以上の編集を導入する。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、Ｒ８３Ｃである。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、Ｑ３４７Ｘである。一部の実施形態では、改変は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＡＡＡ１６２２２．１の下に見出される、代表的なホモサピエンスＧ６ＰＣタンパク質に導入される。一部の実施形態では、改変は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列番号Ｕ０１１２０．１の下に見出される、代表的なホモサピエンスＧ６ＰＣ核酸配列に導入される。

【0376】

治療用途
本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、様々な治療用途のための遺伝子編集系において使用することができる。したがって、一部の実施形態では、障害又は疾患の治療を必要としている対象において障害又は疾患を治療する方法が提供され、本方法は、対象に、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡを遺伝子編集系とともに投与することを含む。様々な遺伝子編集系が当該技術分野で既知であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２が挙げられる。本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、任意の遺伝子編集系とともに使用することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒ ａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、又はＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む属からの生物に由来する。特定の実施形態では、Ｃｐｆｌエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、又はＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから選択される属からの生物から選択される。

【0377】

Ｃａｓ種の非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｈａｒｐｅａ ｓｐｐ．分離株ＲＵＧ０１７、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ、Ｅｚａｋｉｅｌｌａ ｐｅｒｕｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ株ＡＦ１５－４０ＬＢ、及びＰｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３７６１が挙げられる。

【0378】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、様々な疾患及び障害、例えば、遺伝的障害（例えば、単一遺伝子疾患）、ヌクレアーゼ活性によって治療され得る疾患、並びに様々ながんなどを治療し得る。

【0379】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、（例えば、１つ以上の核酸残基を挿入、欠失、又は変異させることによって）標的核酸を修飾するために標的核酸を編集し得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡとともに使用され、所望の核酸配列を含む外因性ドナーテンプレート核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）を含む。ＣＲＩＳＰＲ系で誘導される開裂事象が解消されると、細胞の分子機構は、開裂事象の修復及び／又は解消において外因性ドナーテンプレート核酸を利用するであろう。代替的に、細胞の分子機構は、開裂事象の修復及び／又は解消において内因性テンプレートを利用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、標的核酸を変化させ、挿入、欠失、及び／又は点変異をもたらす）。一部の実施形態では、挿入は、瘢痕のない挿入である（すなわち、開裂事象の解決時に追加の意図されない核酸配列をもたらさない標的核酸への意図された核酸配列の挿入）。ドナーテンプレート核酸は、二本鎖又は一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であり得る。

【0380】

一態様では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＲＮＡ、毒性ＲＮＡ、及び／又は変異ＲＮＡ（例えば、スプライシング欠陥又は切断）の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するために遺伝子編集系と併せて使用することができる。

【0381】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、様々な疾患を引き起こすＲＮＡ依存性機能に影響を及ぼすトランス作用変異を標的とすることができる。

【0382】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、スプライシング欠陥及び疾患を引き起こし得るシス作用スプライシングコードを破壊する変異を標的とすることができる。

【0383】

本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、抗ウイルス活性、特にＲＮＡウイルスに対する遺伝子編集系と併せて使用することができる。例えば、ウイルスＲＮＡ配列を標的とするために選択された好適なＮＬＳ－ｇＲＮＡを使用して、ウイルスＲＮＡを標的とする。

【0384】

本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんを治療することができる。例えば、異常である（例えば、点変異を含む、又は代替的にスプライシングされる）ＲＮＡ分子を標的化することにより、がん細胞における細胞死（例えば、アポトーシスを介して）を誘発することが見出される。

【0385】

本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、対象における感染性疾患を治療することができる。例えば、感染体細胞における細胞死を標的化し、誘導するために、感染体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫又は原生動物）によって発現されるＲＮＡ分子を標的化することによる。本明細書に記載の合成ガイドＲＮＡは、遺伝子編集系と併せて使用され、細胞内感染体が宿主対象の細胞に感染する疾患を治療し得る。

【0386】

ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列中に挿入することが望ましい用途においては、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に提供される。「ドナー配列」又は「ドナーポリヌクレオチド」とは、部位指向性修飾ポリペプチドによって誘導される開裂部位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、開裂部位でのゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、開裂部位に隣接する、例えば、開裂部位の約５０塩基以下以内、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内、又は開裂部位に直接隣接するヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相同性を含有し、それと相同性を有するゲノム配列との間の相同性指向性修復を支持する。約２５、５０、１００、若しくは２００ヌクレオチド、又は２００ヌクレオチド超の、ドナーとゲノム配列との間の配列相同性（又は１０～２００ヌクレオチド以上の任意の整数値）は、相同性指向性修復を支持するであろう。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上などであり得る。

【0387】

ドナー配列は、典型的には、置換するゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性指向性修復を支持するのに十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して、少なくとも１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、又は転位を含み得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向性修復が標的領域に非相同配列の挿入をもたらすように、２つの相同領域と隣接する非相同配列を含む。ドナー配列はまた、目的のＤＮＡ領域に相同ではなく、目的のＤＮＡ領域への挿入を意図していない配列を含有するベクター骨格を含んでもよい。概して、ドナー配列の相同領域（複数可）は、組換えが所望されるゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％～１００％の任意の値の配列同一性が存在し得る。

【0388】

ドナー配列は、ゲノム配列と比較して特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、開裂部位でのドナー配列の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的化されたゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る。場合によっては、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の差異は、アミノ酸配列を変化させないか、又はサイレントアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造又は機能に影響を与えない変化）を行うであろう。代替的に、これらの配列の差異には、マーカー配列の除去のために後で活性化され得るＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。

【0389】

ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。細胞内に直鎖状形態又は環状形態で導入され得る。直鎖状形態で導入された場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレオチド分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、及び／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが一方若しくは両方の末端にライゲーションされる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、並びに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるが、これらに限定されない。直鎖状ドナー配列の末端を保護する代替として、配列の追加の長さは、組換えに影響を与えることなく分解され得る相同性の領域の外側に含まれてもよい。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ並びに／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／若しくはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について上に記載されるように、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。

【0390】

上に記載の方法に従って、エクスビボで目的のＤＮＡ領域を開裂及び修飾、すなわち、「遺伝子組換え」し得る。一部の実施形態では、選択可能なマーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されている場合と同様に、細胞の集団は、遺伝子組換え細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子組換えを含むものに対して濃縮され得る。濃縮する前に、「遺伝子組換え」細胞は、細胞集団の約１％以上（例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、又は２０％以上）しか構成しない可能性がある。「遺伝子組換え」細胞の分離は、使用される選択可能なマーカーに適切な任意の好都合な分離技術によって達成され得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞選別によって分離され得、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、親和性分離技術、例えば、磁気分離、親和性クロマトグラフィー、固体マトリックスに親和性試薬が結合した「パニング」、又は他の好都合な技術によって、不均一集団から分離され得る。正確な分離を提供する技術としては、蛍光活性化細胞選別機が挙げられ、これは、複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の洗練を有することができる。細胞は、死細胞と関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。遺伝子修飾された細胞の生存率に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。修飾されたＤＮＡを含む細胞に対して高度に濃縮された細胞組成物は、この様式で達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子組換え細胞が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、約９５％以上、又は９８％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子組換え細胞の実質的に純粋な組成物であり得る。

【0391】

本明細書に記載の方法によって産生される遺伝子組換え細胞は、直ちに使用され得る。代替的に、細胞を、液体窒素温度で凍結し、長時間保管し、解凍して再利用可能であり得る。かかる場合、細胞は、通常、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝培地、又はかかる凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般的に使用されるいくつかの他のかかる溶液中で凍結され、凍結された培養細胞を解凍するために当該技術分野で一般的に既知の様式で解凍される。

【0392】

遺伝子組換え細胞は、様々な培養条件下で、インビトロで培養され得る。細胞は、培養で増殖し得る、すなわち、細胞の増殖を促進する条件下で増殖し得る。培地は、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含有する液体又は半固体であり得る。細胞集団は、通常、ウシ胎仔血清（約５～１０％）、

【0393】

Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、及び抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが補充された、Ｉｓｃｏｖｅの改変ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０などの適切な栄養培地に懸濁され得る。培養物は、制御性Ｔ細胞が応答性である成長因子を含有し得る。本明細書で定義される成長因子は、膜貫通受容体に対する特定の効果を介して、培養物中又は無傷の組織中のいずれかで、細胞の生存、増殖及び／又は分化を促進することができる分子である。成長因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。

【0394】

このように遺伝子組換えされた細胞は、例えば、疾患を治療するために、若しくは抗ウイルス薬、抗病原薬、又は抗がん治療薬として、遺伝子治療などの目的のために、農業における遺伝子組換え生物の産生のために、又は生物学的研究のために、対象に移植され得る。対象は、新生児、若年者、又は成人であり得る。特に目的であるのは、哺乳動物の対象である。本方法で治療され得る哺乳動物種としては、イヌ及びネコ、ウマ、ウシ、ヒツジなど、並びに霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラゴモルファ（例えば、ウサギ）など）を実験調査のために使用してもよい。

【0395】

細胞は、対象に単独で、又は、例えば、細胞が移植される組織内の細胞の成長及び／又は組織化を支持するための好適な基質若しくはマトリックスとともに、提供され得る。通常、少なくとも１×１０^３個の細胞、例えば、５×１０^３個の細胞、１×１０^４個の細胞、５×１０^４個の細胞、１×１０^５個の細胞、１×１０^６個の細胞又はそれ以上が投与される。細胞は、以下の経路、非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、又は脊髄液中のうちのいずれかを介して対象に導入され得る。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。細胞はまた、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を生成する目的のために、胚（例えば、胚盤胞）に導入されてもよい。

【0396】

対象への治療の投与回数は変動し得る。遺伝子組換え細胞を対象内に導入することは、１回の事象であってもよいが、特定の状況においては、かかる治療は、限られた期間にわたって改善を誘発し、一連の継続的な反復治療を必要とする場合がある。他の状況においては、効果が観察される前に、遺伝子修飾細胞の複数回投与が必要とされる場合がある。正確なプロトコルは、疾患又は状態、疾患のステージ、及び治療される個々の対象のパラメータに依存する。

【0397】

本発明の他の態様では、例えば、疾患を治療するために、又は抗ウイルス薬、抗病原薬、若しくは抗がん治療薬として、遺伝子治療などの目的のために、農業における遺伝子組換え生物の産生のために、又は生物学的研究のために、再び、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドが用いられ、細胞ＤＮＡをインビボで修飾する。これらのインビボ実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドは、個体に直接投与される。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドは、ペプチド、小分子及び核酸の対象への投与のための当該技術分野におけるいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって投与され得る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドは、様々な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドは、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤との組み合わせによって薬学的組成物に製剤化され得る。

【0398】

薬学的調製物は、薬学的に許容されるビヒクルに存在する１つ以上のＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドを含む組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」とは、連邦又は州政府の規制機関によって承認された、又は米国においてリスト化されたビヒクルであり得る。

【0399】

薬局方又はヒトなどの哺乳動物において使用するための他の一般に認められた薬局方。「ビヒクル」という用語は、哺乳動物に投与するために本発明の化合物が製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は担体を指す。かかる薬学的ビヒクルは、脂質、例えば、リポソーム、例えば、リポソームデンドリマー；水、並びに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源、又は合成起源のものを含む油、生理食塩水などの液体；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用してもよい。薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化され得る。したがって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内などの投与を含む様々な方式で達成され得る。活性剤は、投与後に全身性であってもよく、又は、局所投与の使用、壁内投与、又は移植部位に活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局所的であってもよい。活性剤は、即時活性のために製剤化され得るか、又は持続放出のために製剤化され得る。

【0400】

いくつかの状態、特に中枢神経系の状態の場合、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するための薬剤を製剤化する必要がある場合がある。血液脳関門（ＢＢＢ）を介した薬物送達のための１つの戦略は、マンニトール又はロイコトリエンなどの浸透手段によって、又は生化学的にブラジキニンなどの血管作用性物質の使用によってのいずれかで、ＢＢＢの破壊を伴う。ＢＢＢ開口部を使用して特定の薬剤を脳腫瘍に標的化する可能性も１つの選択肢である。ＢＢＢ破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与されるときに、本発明の治療用組成物と共投与され得る。ＢＢＢを通過するための他の戦略には、カベオリン１媒介性トランスサイトーシス、グルコース及びアミノ酸担体などの担体媒介性トランスポーター、インスリン又はトランスフェリンの受容体媒介性トランスサイトーシス、並びにｐ－糖タンパク質などの活性流出トランスポーターを含む、内因性トランスポーター系の使用を伴ってもよい。血管の内皮壁を横断する輸送を容易にするために、能動輸送部分もまた本発明において使用するための治療用化合物にコンジュゲートされてもよい。

【0401】

代替的に、ＢＢＢの背後への治療薬の薬物送達は、局所送達、例えば、くも膜下腔内送達によってであってもよい。

【0402】

典型的には、有効量のＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドが提供される。エクスビボ方法に関して上で考察されたように、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの有効量又は有効用量は、陰性対照、例えば、空のベクター又は無関係なポリペプチドと接触させた細胞と比較して、２つの相同配列間で観察される組換えの量の２倍以上の増加を誘導する量である。組換えの量は、例えば、上に記載され、当該技術分野において知られる、任意の便利な方法によって測定され得る。投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの有効量又は有効用量の計算は、当業者の技能の範囲内であり、当業者にとっては日常的である。投与される最終量は、投与経路及び治療される障害又は状態の性質に依存する。一部の実施形態では、約０．０１～１ｍｐｋの例示的な用量が使用される。

【0403】

特定の患者に与えられる有効量は、様々な要因に依存し、そのうちのいくつかは患者ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じて疾患状態の進行を停止又は逆転させるために、患者に投与する治療剤の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、及び薬剤についての利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療用組成物が投与される流体のより大きい体積を考えると、髄腔内投与される用量よりも多い場合がある。同様に、治療濃度を維持するために、身体から急速に除去される組成物は、より高い用量で、又は反復用量で投与されてもよい。通常の技術を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。

【0404】

薬剤に含めるために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドは、好適な商業的供給源から入手し得る。一般的な提案として、用量当たりの非経口的に投与されるＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの総薬学的有効量は、用量応答曲線によって測定され得る範囲にある。

【0405】

ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドに基づく療法、すなわち、治療的投与に使用されるＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの調製物は、無菌である必要がある。滅菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２μｍ膜）を通した濾過によって容易に達成される。治療用組成物は、概して、滅菌取り出し口を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルに配置される。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドに基づく療法は、水溶液として、又は再構築のための凍結乾燥製剤として、単位用量又は複数用量容器、例えば、密封アンプル又はバイアルに保管され得る。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルを、５ｍｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）の化合物の水溶液で充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。

【0406】

薬学的組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される希釈剤の薬学的に許容される非毒性の担体を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。加えて、薬学的組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤並びに洗剤などの、生理学的条件に近似する追加の物質を含み得る。

【0407】

組成物はまた、例えば抗酸化物質などの様々な安定化剤のうちのいずれも含み得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を増強するか、又はそれ以外の場合、その薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させ、その毒性を低減し、溶解性又は取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体化され得る。そのような修飾又は複合体化剤の例としては、サルフェート、グルコネート、シトレート及びホスフェートが挙げられる。組成物の核酸又はポリペプチドはまた、それらのインビボ属性を増強する分子と複合体化され得る。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が含まれる。

【0408】

薬学的組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。活性成分の毒性及び治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物及び／又は実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指標を示す療法が好ましい。

【0409】

細胞培養及び／又は動物研究から得られたデータを、ヒトについての投薬量の範囲の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、低毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内のラインである。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。

【0410】

薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、高純度であることが好ましく、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、概して少なくとも分析グレード、及びより典型的には少なくとも医薬グレード）。更に、インビボでの使用を意図した組成物は、通常、無菌である。所与の化合物を使用する前に合成しなければならない範囲で、得られる産物は、典型的には、合成又は精製プロセス中に存在し得る任意の潜在的な毒性剤、特に任意のエンドトキシンを実質的に含まない。親投与のための組成物はまた、無菌であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。

【0411】

送達系
本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡを、所望の遺伝子編集系成分とともに、ベクター、担体、例えば、脂質ナノ粒子などの様々な送達系によって、目的の細胞に送達することができる。

【0412】

本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡを、有機又は無機であり得るナノ粒子によって送達することができる。ナノ粒子は、当該技術分野で周知である。任意の好適なナノ粒子設計を使用して、ゲノム編集系の成分、又はかかる成分をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば脂質及び／又はポリマー）ナノ粒子は、本開示のある特定の実施形態では、送達ビヒクルとして使用するのに好適であり得る。ナノ粒子製剤、及び／又は遺伝子導入における使用のための例示的な脂質を表２（以下）に示す。

【表3-1】

【表3-2】

【0413】

表３は、遺伝子導入及び／又はナノ粒子製剤における使用のための例示的なポリマーを列挙する。

【表4-1】

【表4-2】

【0414】

表４は、本明細書に記載されるＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドのための送達方法を要約する。

【表5-1】

【表5-2】

【0415】

別の態様では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡを含むゲノム編集系の送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成され得る。ＲＮＰは、標的ｇＲＮＡとの複合体中に、核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ＲＮＰは、例えば、Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：７３－８０によって報告されているように、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、又はカチオン性脂質媒介性の方法などの既知の方法を使用して細胞に送達され得る。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集系での使用に有利であり、特に、トランスフェクトが困難な細胞（例えば、初代細胞）に有利である。加えて、ＲＮＰはまた、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミドにおいて使用され得る真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶ又はＥＦ１Ａ）が十分に発現していない場合、細胞内のタンパク質発現で生じ得る困難を緩和することができる。有利には、ＲＮＰの使用は、細胞内への外来ＤＮＡの送達を必要としない。更に、核酸結合タンパク質とｇＲＮＡ複合体とを含むＲＮＰは、時間とともに分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性がある。プラスミドベースの技術の場合と同様の様式で、ＲＮＰを使用して、結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント）を送達し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導することができる。

【0416】

ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書に記載の合成ｇＲＮＡを含む）を駆動するために使用されるプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。これは、ベクター内の空間を占有し得る追加のプロモーターエレメントの必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加の空間を使用して、追加のエレメント（例えば、ガイド核酸又は選択可能なマーカー）の発現を駆動することができる。ＩＴＲ活性は比較的弱いため、選択されたヌクレアーゼの過剰発現による潜在的な毒性を低減するために使用することができる。

【0417】

任意の好適なプロモーターを使用して、Ｃａｓ９及び該当する場合、ガイド核酸の発現を駆動し得る。遍在的な発現の場合、使用され得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖などが挙げられる。脳又は他のＣＮＳ細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、全てのニューロンに対してシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対してＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対してＧＡＤ６７若しくはＧＡＤ６５又はＶＧＡＴなどが挙げられ得る。肝細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、ＳＰ－Ｂが挙げられ得る。内皮細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＣＡＭが挙げられ得る。造血細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＦＮβ又はＣＤ４５が挙げられ得る。骨芽細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＯＧ－２が挙げられ得る。

【0418】

場合によっては、別個のプロモーターが、同じ核酸分子内の塩基エディター及び適合するガイド核酸の発現を駆動する。例えば、ベクター又はウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に結合された第１のプロモーターと、ガイド核酸に作動可能に結合された第２のプロモーターとを含むことができる。

【0419】

ガイド核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーターとしては、Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられ得る ｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を発現するには、ＰｏｌＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用。

【0420】

Ｃａｓ９は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを使用して、特に、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスのための製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号（ＡＡＶのための製剤、用量）、及び米国特許第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）、並びにレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスを伴う臨床試験に関する臨床試験及び刊行物からの製剤及び用量を使用して送達され得る。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号及びＡＡＶを伴う臨床試験と同様であり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号及びアデノウイルスを伴う臨床試験と同様であり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号及びプラスミドを伴う臨床試験と同様であり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づくか、又は推定され得、患者、対象、異なる体重及び種の哺乳動物に対して調整され得る。投与頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者若しくは対象の他の状態、及び対処される特定の状態若しくは症状を含む通常の要因に応じて、医師又は獣医（例えば、医師、獣医）の範疇である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射され得る。細胞型特異的塩基編集の場合、塩基エディター及び任意選択的なガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。

【0421】

インビボでの送達の場合、ＡＡＶは、他のウイルスベクターよりも有利であり得る。場合によっては、ＡＡＶは低毒性を可能にし、これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る。場合によっては、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入変異誘発を引き起こす可能性が低くなる。

【0422】

ＡＡＶは、４．５又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂを超える構築物は、ウイルス産生の著しい低下をもたらし得る。例えば、ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶへのパッケージングが困難になる。したがって、本開示の実施形態は、従来のＣａｓ９よりも長さが短い開示されるＣａｓ９の利用を含む。

【0423】

ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶのタイプを選択することができ、例えば、脳又は神経細胞を標的化するためのＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ、心組織を標的化する場合、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の作表は、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８））に見出すことができる。

【0424】

レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、分裂細胞と分裂終了細胞の両方において感染し、それらの遺伝子を発現する能力を有する。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範囲の細胞型を標的化する。

【0425】

レンチウイルスは、以下のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス転写プラスミド骨格を含む）をクローニングした後、トランスフェクションの前日に、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で、Ｔ－７５フラスコ内で５０％コンフルエンスに播種した。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を、１０μｇのレンチウイルス導入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトする：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地を、１０％胎仔ウシ血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換する。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法が好ましい。

【0426】

レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収する。上清は、最初にデブリを除去し、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次いで、超遠心分離機で、２４，０００ｒｐｍで２時間スピンする。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中に、４℃で一晩再懸濁する。次いで、それらをアリコートし、－８０℃ですぐに凍結する。

【0427】

別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）は、ウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであり、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現し、これは、網膜下注射によって送達されることが企図される。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が企図される。

【0428】

系の任意のＲＮＡ、例えば、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ又はＣａｓ９コードｍＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達され得る。Ｃａｓ９コードｍＲＮＡは、インビトロ転写を使用して生成することができる。例えば、Ｃａｓ９のｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる：Ｔ７プロモーター、任意選択的なｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、及びβグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲ。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、Ｔ７プロモーター、続いて、配列「ＧＧ」、及びガイドポリヌクレオチド配列を含むカセットからのインビトロ転写を使用して転写することもできる。

【0429】

発現を増強し、可能性のある毒性を低減するために、Ｃａｓ９配列及び／又はガイド核酸は、例えば、シュードＵ又は５－メチルＣを使用して、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むように修飾され得る。

【0430】

本開示は、一部の実施形態では、細胞又は生物を修飾する方法を包含する。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の多くは、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類、又はマウス細胞である。本開示の塩基エディター、組成物、及び方法によって細胞に導入される修飾は、抗体、デンプン、アルコール、又は他の所望の細胞出力などの生物学的産物の産生の改善のために細胞及び細胞の子孫が改変されるようにすることができる。本開示の方法により細胞に導入される修飾は、細胞及び細胞の子孫が、産生された生物学的産物を変化させる改変を含むようにすることができる。

【0431】

系は、１つ以上の異なるベクターを含むことができる。一態様では、Ｃａｓ９は、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又はヒト細胞の発現のために、コドン最適化される。

【0432】

概して、「コドン最適化」とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０若しくはそれ以上又は約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０超若しくはそれ以上のコドン）において、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における発現を増強させるための核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、これは次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用率表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に参照）で入手可能な「コドン使用率データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方式で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列を最適化するためのコドンに関するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれ以上のコドン、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。

【0433】

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞又はＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージング及び組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージングすることができる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染され得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。場合によっては、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために、かなりの量でパッケージ化されない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。

【0434】

薬学的組成物
本開示の他の態様は、（例えば、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡを含む）遺伝子編集系を含む薬学的組成物に関する。「薬学的組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的使用のために製剤化された組成物を指す。一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、追加の薬剤（例えば、特異的送達用、半減期の増加、又は他の治療用化合物）を含む。

【0435】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、化合物を体のある部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織、又は体の一部分）に運搬若しくは輸送することに関与する、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛、又は立体酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、又は溶媒封入材などの、薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものであり、対象の組織に害を及ぼさない（例えば、生理学的に適合性、無菌性、生理学的ｐＨなど）。

【0436】

薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（１）乳糖、グルコース及びスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）粉末トラガント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクなどの潤滑剤、（８）ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ酸無水物、（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの膨張剤、（２３）エタノールなどの血清アルコール、並びに（２３）薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、及び抗酸化剤も、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。

【0437】

薬学的組成物は、製剤のｐＨを、生理学的ｐＨを反映する所定のレベルで、例えば、約５．０～約８．０の範囲に維持するために、１つ以上のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸、又はアミノ酸の混合物（例えば、ヒスチジン、又はヒスチジン及びグリシンなどのアミノ酸の混合物）であり得る。代替的に、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持し、かつカルシウムイオンをキレートしない薬剤である。かかるｐＨ緩衝化合物の例示的な例としては、イミダゾール及び酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに好適な任意の量で存在してもよい。

【0438】

薬学的組成物はまた、１つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、製剤の浸透圧特性（例えば、張力、オスモラリティ、及び／又は浸透圧）を、レシピエント個体の血流及び血液細胞で許容されるレベルに調節する化合物を含み得る。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する、当業者に既知又は利用可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の製剤で使用される所与の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。好適なタイプの浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩（例えば、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウム）、糖（例えば、スクロース、デキストロース、及びマンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、並びにこれらの薬剤及び／又は薬剤のタイプのうちの１つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤（複数可）は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在してもよい。

【0439】

一部の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、遺伝子編集のために、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載の薬学的組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0440】

一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、疾患部位に局所的に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、又はインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜又は繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、又はゲル状物質である。

【0441】

他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、制御放出系において送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｈ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。他の制御放出系は、例えば、上記のＬａｎｇｅｒで考察されている。

【0442】

一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト）への静脈内又は皮下投与に適した組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための薬学的組成物は、可溶化剤としての滅菌等張使用における溶液、及び注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔剤である。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどの密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、別々に又は単位剤形で一緒に混合されてのいずれかで供給される。医薬品が注入によって投与される場合、医薬品は、滅菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注され得る。薬学的組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【0443】

全身投与のための薬学的組成物は、液体、例えば、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲル溶液、又はハンクス溶液であってもよい。加えて、薬学的組成物は、固体形態であってもよく、使用の直前に再溶解又は懸濁され得る。凍結乾燥形態も企図される。薬学的組成物は、脂質粒子又は小胞（例えば、非経口投与にも好適なリポソーム又は微結晶）内に含まれ得る。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）又は多層（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ）などの任意の好適な構造の粒子であり得る。化合物は、融合脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０ｍｏｌ％）の陽イオン性脂質を含む「安定化プラスミド脂質粒子」（ＳＰＬＰ）に封入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｐ．ｅｔ ａｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，６：１４３８－４７）。かかる粒子及び小胞には、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルサルフェート又は「ＤＯＴＡＰ」などの正に帯電した脂質が特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は周知である。例えば、米国特許第４，８８０，６３５号、同第４，９０６，４７７号、同第４，９１１，９２８号、同第４，９１７，９５１号、同第４，９２０，０１６号、及び同第４，９２１，７５７号を参照されたい（それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0444】

本明細書に記載の薬学的組成物は、例えば、単位用量として投与又は包装され得る。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として好適な物理的に分離された単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体又はビヒクル）と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性物質を含む。

【0445】

更に、薬学的組成物は、薬学的キットとして提供され得、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含む容器、及び（ｂ）薬学的に許容される希釈剤（例えば、本発明の凍結乾燥化合物の再構築又は希釈に使用される滅菌物）を含む第２の容器を含む。任意選択的に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定される形式の通知が、かかる容器（複数可）に付随してもよく、通知は、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関による承認を反映する。

【0446】

別の態様では、上に記載の疾患の治療に有用な材料を含む製造品（ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）が含まれる。一部の実施形態では、製造品は、容器及びラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成され得る。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載の疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内輸液バッグ又はバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上の、又は容器に付随するラベルは、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、又はデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含み得る。これには、商業及び使用者の観点から望ましい他の材料が更に含まれ得、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書が挙げられる。

【0447】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書に記載のＣａｓ９を含む）は、薬学的組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかを含む（例えば、ＬｕｂＣａｓ９を含む、本明細書に記載の核酸塩基エディターを含む）。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡとカチオン性脂質との複合体を形成するＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。

【0448】

キット
一態様では、本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡは、上記の方法及び組成物に開示されるエレメントのうちのいずれか１つ以上を含有するキットによって提供され得、及び又は産生され得る。例えば、キットは、ＮＬＳ－ｇＲＮＡ、リガーゼ、及び好適な緩衝試薬を含み得る。

【0449】

一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターを更に含む。

【0450】

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のエレメントのうちの１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器に提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応又は保管緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態、又は使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮物又は凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨが、約７～約１０である。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを作動可能に連結するように、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。

【0451】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。別途明示されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が本明細書に記載されている。

【実施例】

【0452】

以下の実施例は、本発明の作製及び実施の好ましいモードのいくつかを説明する。しかしながら、これらの実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【0453】

実施例１：ＮＬＳ－ｇＲＮＡのエクスビボ有効性
この実施例は、本発明のＮＬＳにコンジュゲートされた例示的なｇＲＮＡ（ＮＬＳ－ｇＲＮＡ）及びそのエクスビボでの有効性を説明する。固相ペプチド合成によって、ＮＬＳ配列及びペプチドスペーサーを含むペプチドを合成した。合成されたペプチドを、図１に示すように、チオール基を介してｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートした。当業者が理解するように、リンカー及びペプチドスペーサーを、本発明の実施において修飾することができる。更に、ＮＬＳ、ｇＲＮＡ、及び／又はリンカーの配列を修飾することができる。

【0454】

ＮＬＳ－ｓｇＲＮＡを調製し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９塩基エディターをコードするｍＲＮＡを有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を、３つの異なる比率のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ（１：１、３：１、及び９：１）で肝細胞に送達した。図２に示すように、ＮＬＳ－ｓｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まないｇＲＮＡと比較して、顕著により高い塩基編集効率を示した。

【0455】

この実施例におけるデータは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、塩基編集）を、ＮＬＳ配列にコンジュゲートされるｇＲＮＡを使用することによって改善することができることを示す。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の改善は、細胞質ＲＮａｓｅからｇＲＮＡを保護する核へのＮＬＳ－ｇＲＮＡのより良好な輸送、ｇＲＮＡの局所濃度の増加、したがってリボ核酸複合体（ＲＮＰ）の形成、及び核へのより高い移入速度に部分的に起因し得る。更に、カチオン性ＮＬＳ配列は、エンドソームエスケープを促進することによって部分的に作用し得る。

【0456】

実施例２：ＮＬＳ－ｇＲＮＡのインビボ有効性
この実施例は、高度に修飾されたｇＲＮＡと比較しても、ＮＬＳ－ｇＲＮＡがインビボでの塩基編集を顕著に改善することを示す。この実施例では、ｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡを、ｓｐＣａｓ９ニッカーゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）とともに使用した。

【0457】

様々な修飾を有するｇＲＮＡを調製した。図３Ａに示すように、末端修飾（ＥＭ）ｇＲＮＡは６％の修飾を含み、重度修飾１（ＨＭ１）ｇＲＮＡは４７％の修飾を含み、重度修飾２（ＨＭ２）ｇＲＮＡは６０％の修飾を含み、重度修飾３（ＨＭ３）ｇＲＮＡは８８％の修飾を含む。ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端にコンジュゲートされたＮＬＳ配列及び６％の修飾を含む。両方とも同じ塩基エディターをコードする２つの異なるｍＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡ２と比較して、ｍＲＮＡ１は、３’及び５’ＵＴＲ配列でコドン最適化される。ｍＲＮＡ１又はｍＲＮＡ２のいずれかとのｇＲＮＡの様々な組み合わせをＬＮＰ中で製剤化し、図３Ｂに示すように、０．０３ｍｐｋ又は０．０１ｍｐｋの亜飽和用量でマウスに送達した。

【0458】

結果は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、全てのＥＭ、ＨＭ１、ＨＭ２、又はＨＭ３ ｇＲＮＡと比較して、より高い塩基編集有効性を示したことを示す。特に、超低用量（０．０１ｍｐｋ）であっても、塩基編集は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに対して可視であり、重度に修飾された（ＨＭ１、ＨＭ２、及びＨＭ３）ｇＲＮＡよりも顕著に高かった。更に、ＮＬＳ－ｇＲＮＡをより低い効力のｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ２）と組み合わせることで、ｍＲＮＡの品質を補った。末端修飾ｇＲＮＡを用いるｍＲＮＡ２の塩基編集効率は約５％であったのに対し、ｇＲＮＡをＮＬＳ－ｇＲＮＡで置き換えることで、塩基編集効率を３０％超まで増加させた。

【0459】

実施例３：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＮＬＳ－ｇＲＮＡの有効性
この実施例は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡを使用することによる塩基編集効率の改善がＮＨＰにおいても観察されることを示す。この実施例では、ｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡを、ｓｐＣａｓ９ベースのアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）とともに使用した。

【0460】

塩基エディターをコードする様々なｇＲＮＡ及びｍＲＮＡを、図４Ａに示すように、脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を１．０ｍｐｋでＮＨＰに送達し、塩基編集効率を肝臓で決定した。結果は、ｍＲＮＡ１を有するＮＬＳ－ｇＲＮＡ（ｇ５－ＢＶＮ）及びｍＲＮＡ１を有するＨＭ３ ｇＲＮＡ（ｇ４－ＢＶＢ）が、最も高い塩基編集効率を示し、続いてｇ２－ＢＶＩ、ｇ３－ＢＶＶ、及びｇ１－ＢＶＥであった。特に、末端修飾を有するＮＬＳ－ｇＲＮＡ（ｇ１－ＢＶＮ及びｇ７－ＢＧ３ＩＮ）は、ＮＬＳを含まないそれぞれの末端修飾ｇＲＮＡと比較して（それぞれ、ｇ１－ＢＶＥ及びｇ６－ＢＧ３ＩＥと比較する）、２倍超の塩基編集効率を示した。

【0461】

次に、ＮＨＰにおいて毒性学研究を行った。臨床病態を評価するために、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴのより高いレベルは、肝臓の損傷と相関している。図４Ｂに示すように、全ての試験品について、投与後２４時間に、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴの最小～軽度の増加が観察された。特に、末端修飾を有するＮＬＳ－ｇＲＮＡを含むｇ５－ＢＶＮは、最も低いＡＳＴ及びＡＬＴの増加を示した。更に、臨床病態パラメータの他の顕著な変化は観察されなかった。

【0462】

全体として、この実施例におけるデータは、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、減少した毒性で、ＮＨＰにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、塩基編集効率）を改善することを示す。

【0463】

実施例４：ｓａＣａｓ９におけるＮＬＳ－ｇＲＮＡの用途
この実施例は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが様々なＣａｓタンパク質に適用され得ることを示す。この特定の実施例では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）を使用した。特に、ｓａＣａｓ９は、以前の実施例に示されているｓｐＣａｓ９編集と適合性のない独自のガイドを必要とする。

【0464】

グリコーゲン蓄積症１ａ型（ＧＳＤ１ａ）は、ＧＳＤ１ａを有する患者の約８０％に影響を及ぼすグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）遺伝子における変異によって引き起こされる。Ｒ８３Ｃ変異は、グリコーゲン蓄積症１ａ型（ＧＳＤ１ａ）と診断された毎年約９００人の米国患者に影響を及ぼす。この変異は、Ｇ６ＰＣタンパク質の位置８３（Ｒ８３Ｃ）にシステインを導入する単一塩基置換である。Ｒ８３Ｃの正確な修正は、Ｇ６ＰＣの発現を回復し、グルコース代謝を正常化する可能性が高いであろう。

【0465】

ｇＲＮＡを調製し、その純度を決定した。２つの異なる骨格化学を有するｇＲＮＡを研究に使用した（ｓｇ０２９対ｓｇ０９３）。Ｓｇ０９３ガイドは、２’－ＯＭｅ及びホスホチオエート修飾による末端修飾を有する）。塩基エディターをコードする様々なｇＲＮＡ及びｍＲＮＡを、ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡの１：１の比率でＬＮＰ中で製剤化した。ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してヘテロ接合性の成体トランスジェニックマウスに、１ｍｐｋの亜飽和用量でＬＮＰ製剤を投与した。

【0466】

図５は、８０％の純度が最大の塩基編集レベルをもたらす、塩基編集効率とｇＲＮＡの純度との間の相関を示す。更に、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、ＮＬＳ配列を含まない他のｓｇ０９３ガイドに対して、ｓｐＣａｓ９タンパク質での効力の改善を示し、本発明のＮＬＳ－ｇＲＮＡが複数のＣａｓタンパク質にわたって適用され得ることを示した。

【0467】

実施例５：ＮＬＳ－ｇＲＮＡを使用するＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃマウスにおける代謝欠陥のインビボ塩基編集修正
この実施例では、ＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃマウスにおける代謝欠陥を修正するために、ＮＬＳ－ｇＲＮＡに関連して、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）のバリアントを使用した。Ｒ８３Ｃ変異は、ｇ６ｐｃ遺伝子において単一のＧ＞Ａ変換を導入する。本明細書に記載のＮＬＳ－ｇＲＮＡと組み合わせたＡＢＥは、ゲノムＤＮＡにおけるＡからＧへのプログラマブル変換をもたらし、したがって、この変異を修正するためのそれらの有用性を支持している。

【0468】

Ｇ６ＰＣ ｇＲＮＡ配列は、以下に示されるＧ６ＰＣ標的配列の相補体にハイブリダイゼーションする：

【0469】

ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列（すなわち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９））は、上記に下線が引かれている。ｇＲＮＡ配列は、以下のとおりである：ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ（配列番号２）。

【0470】

ＴａｄＡバリアントＭＳＰ６０５、ＭＳＰ８２４、ＭＳＰ８２５、ＭＳＰ６８０、ＭＳＰ８２８、及びＭＳＰ８２９（表１を参照されたい）を使用するアデノシンデアミナーゼ塩基エディター（ＡＢＥ）並びにｓａＣａｓ９ｎの塩基編集効率を、ｈｕＧ６ＰＣに対してヘテロ接合性であり、グリコーゲン蓄積症１ａ型（ＧＳＤ１ａ）についてのＲ８３Ｃ変異を保有するトランスジェニックマウスモデルを使用してインビボで評価した（図６Ｂ及び６Ｃ）。インビボでの効率的なゲノム編集のためのｓａＣａｓ９の使用、及びｓａＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ足場の例示は、Ａ．Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２０，ｐａｇｅｓ １８６－１９１）に記載されている。

【表6】

【0471】

図６Ａは、塩基エディターをトランスジェニックマウスに導入するために使用されるインビボワークフローを示す。塩基エディターｍＲＮＡ及びＮＬＳ－ｇＲＮＡを担持する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、静脈内（ＩＶ）注射を介して１ｍｇ／ｋｇの用量でトランスジェニックマウスに投与した。全肝臓抽出物からの次世代配列決定データは、Ｒ８３Ｃについて顕著な修正を明らかにした（図６Ｂ及び６Ｃ）。ＴａｄＡバリアントＭＳＰ８２８は、低いバイスタンダー編集で、Ｒ８３Ｃ変異の約４０％の正確な修正を示した。このレベルの変異修正は、グルコース恒常性を回復することが期待される。

【0472】

実施例６：ＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃマウスにおける代謝欠陥のインビボ塩基編集修正
ＧＳＤ１ａの概要
図７に概略的に示すように、（ＧＳＤ１ａ）は、Ｇ６ＰＣ遺伝子における変異によって引き起こされる常染色体劣性障害である。白人のＧＳＤ１ａ患者において特定された最も広く見られる病原性変異は、酵素の活性部位に位置し、Ｇ６Ｐａｓｅの不活性化と関連するＲ８３Ｃである。Ｇ６Ｐａｓｅ機能の喪失は、生命を脅かす低血糖、発作、及び更には死亡をもたらす可能性がある。低血糖を緩和するために、患者は、昼夜を通して、ゆっくりとしたグルコース放出処方によって、グルコース補充の厳格かつ頻繁な遵守を維持しなければならない。１回の用量の見逃し又は遅延が、緊急の低血糖を引き起こす可能性がある。多くの合併症の中で、肝臓の拡大、尿酸、乳酸、及び脂質の蓄積は、ＧＳＤ１ａ患者で一般的である。

【0473】

永続的かつ予測可能な単一ヌクレオチド置換を生成するための記載された塩基エディターの有用性
Ｒ８３Ｃ変異は、ｇ６ｐｃ遺伝子において単一のＧ＞Ａ変換を導入する。本明細書に記載のアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ゲノムＤＮＡにおけるＡからＧへのプログラマブル変換をもたらし、したがって、この変異を修正するためのそれらの有用性を支持している。図８に概略的に示すように、アデニン塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に接続された進化したＴａｄＡデアミナーゼを含有する融合タンパク質である。塩基エディターは、（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素上に重なり合った）ガイドＲＮＡに相補的である標的ＤＮＡに結合し、一本鎖ＤＮＡの伸長を曝露する。デアミナーゼは、標的アデニンをイノシンに変換し、Ｃａｓ酵素は、反対側の鎖をニックし、次いで修復され、塩基対の変換を完了する。したがって、点変異の直接的な修復は、遺伝子機能の回復のための可能性を有する。

【0474】

この実施例では、ｇ６ｐｃ遺伝子におけるＡ＞Ｇ変換についての塩基エディターを、Ｒ８３Ｃの修正のために最適化した。図９Ａには、ＧＳＤ１ａ Ｒ８３Ｃ変異（ＷＷＹＰＣＱＧＦＬＩ、配列番号１８）についての標的ＤＮＡ配列（ＣＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴ（配列番号１７））及び基礎となるアミノ酸翻訳が示されている。編集される標的核酸塩基は、位置１２で二重下線で表される。編集ウィンドウはまた、位置６で一重下線で表されて示される、可能性のあるバイスタンダーを含む。同義変換をもたらし得る編集は、位置１０に示される。

【0475】

スクリーニングのために、Ｒ８３Ｃ変異を保有するＧ６ＰＣ導入遺伝子を発現したＨＥＫ２９３細胞株を生成し、塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡでトランスフェクトした。対立遺伝子頻度を、高スループット標的化アンプリコン次世代配列決定によって評価した。バリアント１～５は、最適化された標的修正のために操作された、ｇＲＮＡ及び塩基エディターＲＮＡの組み合わせを表す。バリアント５は、Ｒ８３Ｃ修正及び限定的なバイスタンダー編集のためのおよそ６０％の標的化された塩基編集効率をもたらした（図９Ｂ）。

【0476】

マウスインビボ疾患モデル及びＲ８３Ｃ単一ヌクレオチド変異のインビボ修正の実証
Ｒ８３Ｃ塩基編集のインビボ修正
インビボでのＲ８３Ｃ修正のための塩基編集効率を検証するために、マウスＧ６ｐｃの代わりにヒトＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃ導入遺伝子を発現する新規ＧＳＤ１ａマウスを生成した。ｈｕＲ８３Ｃに対してホモ接合のマウスは、出生後の致死性を示し、離乳（２１日）までほとんど生存しなかったことが確認された。グルコース補充療法において、動物は少なくとも３週齢まで生存し、同腹仔対照と比較して、体重の低減、肝臓の拡大、顕著なＧ６Ｐａｓｅ阻害、及び血清代謝産物の異常などの、ＧＳＤ１ａの特徴的な病理学的兆候を明らかにした（図７）。この表現型は、ヒトにおける公表された及び臨床報告と一致する。

【0477】

インビボ実験について、ホモ接合マウスの新生児の致死性のために、ｈｕＲ８３Ｃに対してヘテロ接合性であったトランスジェニックマウスにおいてＬＮＰ媒介性送達を試験した。図６Ａにおける概略図は、ＩＶ注射を介して投与した、脂質ナノ粒子、又は塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのＬＮＰ共製剤を用いるインビボワークフローを示す。ホモ接合マウスの新生児の致死性を考慮して、出生直後に側頭静脈を介してＬＮＰ投与を行い、活性を成体マウスにおけるものと比較した。全肝臓抽出物の次世代配列決定（ＮＧＳ）分析は、より広い範囲の効率を有する、成体でおよそ４０％の塩基編集効率及び新生児で最大約６０％の効率を明らかにした（図１１Ａ）。バイスタンダー編集は、成体及び新生児において低いままであった。（図１１Ａ）。

【0478】

ｈｕＲ８３Ｃに対してホモ接合の新生マウスを、ガイドＲＮＡ及びＡＢＥをコードするｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で治療した。治療されたマウスは、グルコース療法の不在下で、低血糖誘発性発作を伴わずに、生存し、正常に３週齢まで成長したことが見出された。治療されたホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウスは、ｈｕＲ８３Ｃに対してヘテロ接合性であった同腹子対照と一致して、総肝臓抽出物において最大約６０％の編集効率を示した（図１１Ｂ）。したがって、ＬＮＰ媒介性Ｒ８３Ｃ修正が、ホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウスの生存と関連していたことが実証された。

【0479】

インビボでのＲ８３Ｃの修正のための塩基編集によるＧＳＤ－１ａ病態の逆転

【0480】

３週間で、治療されたホモ接合ｈｕＲ８３Ｃマウスが、対照と比較して、図１２Ａにおいてより暗い色の棒によって実証されるように、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、乳酸、及び尿酸を含むほぼ正常な血清代謝産物の回復を伴って、適切な代謝機能を示したことを検証及び確認した。更に、ＬＮＰ治療ホモ接合ｈｕＲ８３ＣマウスにおけるＧ６ＰＣ活性の生化学的アッセイの結果（生化学的に及び鉛－ホスフェート染色を介して評価される）は、同腹仔対照のものと一致した。（図１２Ａ）。

【0481】

肝腫大は、ＧＳＤ１ａの別の臨床的提示であり、主に、肝臓における過剰なグリコーゲン及び脂質沈着によって引き起こされる。塩基編集後のホモ接合ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃマウスにおける肝腫大の程度を評価するために、３週齢の新生児マウスから肝臓切片を採取し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにオイルレッドＯ染色を介して免疫組織化学分析を実施した（図１２Ｂ）。ＧＳＤ－１ａと一致して、無視できるＧ６Ｐａｓｅ活性（図１２Ｂ、中央パネル、Ｈ＆Ｅ）を示すホモ接合マウスからの肝臓切片において、顕著な脂質沈着（重度のＨ＆Ｅ染色）及び拡大した肝細胞が可視化された。回復したＧ６ＰＣ活性を示す塩基編集されたホモ接合ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃマウス（「ＨＯＭ ｈｕＲ８３Ｃ」、右パネル、図１２Ｂ）の場合、脂質沈着は顕著に低減し、対照（左パネル）（図１２Ｂ、脂質）と一致し、肝細胞サイズの回復は明らかであった。したがって、免疫組織化学分析は、ＬＮＰ治療マウスにおける正常な肝細胞サイズ及び脂質沈着を明らかにした。（図１２Ｂ）。まとめると、データは、Ｒ８３Ｃ変異を修正し、ＧＳＤ１ａと関連する代謝欠陥及び病態を逆転させる塩基編集の能力を実証する。加えて、これらのデータは、ＧｓＤ－１ａについての塩基編集を介して、機能回復及び陽性の臨床転帰の更なる支持を与える。

【0482】

この実施例に記載されるように、インビトロ及びインビボでＲ８３Ｃの正確な修正を達成した新規のアデニン塩基エディター及びガイドＲＮＡを生成し、検証した。ＡＢＥ及びｇＲＮＡのＬＮＰ媒介性送達は、対照と一致する肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性及び代謝機能の回復を伴い、顕著な塩基編集効率、すなわち、最大約６０％の塩基編集効率をもたらした。

【0483】

単回ＬＮＰ用量投与は、塩基編集を介する２４時間の絶食チャレンジ中に正常血糖を維持する。
ＧＳＤ－１ａ病態の特徴的な症状は、空腹時低血糖であり、数分以内に血糖値が急激に低下する。ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合のＧＳＤ－１ａトランスジェニックマウスにおいて、本明細書に記載の塩基編集治療後、動物が２４時間（ｈｒ）の絶食を維持できるかどうかを試験するために、完全な概念実証研究を実施した。この研究では、ＬＮＰ治療された（１．５ｍｐｋ）ＧＳＤ－１ａ動物及び健康な対照において、１００％の動物生存を２４時間の絶食期間後に達成した。加えて、正常な空腹時グルコースレベルが、対照マウス及び治療されたマウスにおいて２４時間の空腹時前後に測定され、これは低血糖治療閾値（＞６０ｍｇ／ｄＬ）を上回るレベルを維持していた（図１３）。

【0484】

Ｒ８３Ｃ変異を修正するための塩基エディターでの使用のためのＧ６ＰＣ標的配列
実施例１に記載のＧ６ＰＣ標的配列及びガイドＲＮＡに加えて、本明細書に記載のＲ８３Ｃ変異を修正するための塩基編集をもたらすための塩基エディターと併せて使用され得る代替Ｇ６ＰＣ標的配列としては、表７に示されるものが含まれる。示されるように、標的配列は、使用に好適なＰＡＭ及び塩基エディター、例えば、本明細書に記載のＩＢＥの種類を含む。表７におけるプロトスペーサー配列では、標的化された「Ａ」ヌクレオチド（すなわち、Ａ８～Ａ１５）の位置は太字／下線で示される。Ｇ６ＰＣ ｇＲＮＡ配列は、表７に示されるＧ６ＰＣ標的配列の相補体にハイブリダイゼーションする。ＰＡＭ配列（例えば、ＳｐＣａｓ９）は、表７に下線が引かれている。

【0485】

表７に記載されるインレイド塩基エディター（ＩＢＥ）は、デアミナーゼドメインがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９に対して内部にある（内部に埋め込まれた）アーキテクチャを有するＣａｓ９及びＴａｄＡの構造を指す。ＩＢＥアーキテクチャは、他の塩基エディターと比較してより大きい幅の潜在的な塩基編集標的を可能にし、好適に配置されるＣａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ配列の要件によって制限されない。かかるＩＢＥは、シフトされた編集ウィンドウを示し、より高い編集効率を示し、したがって、ＤＮＡ及びＲＮＡオフターゲット編集頻度を低減した正準編集ウィンドウの外側の標的の編集を可能にした。したがって、ＩＢＥは、ＤＮＡを標的とするために使用される任意の所与のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に対して作成され得る編集ウィンドウの範囲を拡大することによって、潜在的な塩基編集標的の幅を拡大する。デアミナーゼを異なる戦略的位置でＣＲＩＳＰＲタンパク質に挿入することによって、デアミナーゼの活性部位を再配置することができ、ＩＢＥを従来の編集ウィンドウの外で編集することができるようにする。ＩＢＥアーキテクチャは、上記及びＳ．Ｈａｉｈｕａ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２；２０２１年４月２０日にオンラインで公開（ＤＯＩ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０２０．０１４４）に記載されている。

【表7】

【0486】

表７のＧ６ＰＣ標的配列の相補体にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡ配列は、以下のとおりである（５’から３’に）：ＣＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣ（配列番号１９）、ＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣ（配列番号２０）、ＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡ（配列番号２１）、ＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡ（配列番号２２）、ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ（配列番号２３）、ＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧ（配列番号２４）、ＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号２５）、及びＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＡＧ（配列番号２６）。

【0487】

本明細書に記載の生成物、組成物、及び方法に使用するためのプロトスペーサー及びＰＡＭ配列は、（５’から３’に）、

であり、ＰＡＭ配列、

は下線が引かれている。上記に提示されるように、標的配列の相補体にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡ配列は、ＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡ（上記の配列に示す３’ＰＡＭ配列ＧＡＧＡＡＴ）（配列番号２）である。

【0488】

本明細書に記載の方法で使用されるｇＲＮＡ配列は、以下を含むか又はそれからなる：
ＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（配列番号２７）、又は
ＣＣＡＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（配列番号２８）。

【0489】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｇＲＮＡ配列は、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。２つの例示的な配列を以下に提供する：

【0490】

ｓｇＲＮＡ＿０９６：２３ｎｔプロトスペーサー
ｍＣｓｍＡｓｍＣｓＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡｍＵｓｍＵｓｍＵｓＵ（配列番号２９）

【0491】

ｓｇＲＮＡ＿０９７：３４ｎｔプロトスペーサー
ｍＣｓｍＣｓｍＡｓＣＣＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＣＵＧＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡｍＵｓｍＵｓｍＵｓＵ（配列番号３０）。

【0492】

ＲＮＡ修飾の文脈では、「ｓ」は、先行するヌクレオチドが３’ホスホチオエートを有することを示し、「ｍ」は、次のヌクレオチドが２’ＯＭｅであることを示す。例えば、ホスホチオエート及び２’ＯＭｅを有するヌクレオチドは、形態「ｍＮｓ」を有する。ホスホチオエート及び２’ＯＭｅの両方を有する２つの連続したヌクレオチドがある場合、それは「ｍＮｓｍＮｓ」と表記される。

【0493】

実施例７：材料及び方法
上記に記載される実施例及びその中の実験に利用される材料及び方法は、以下に記載される。

【0494】

動物飼育
全ての動物研究は、Ｔａｃｏｎｉｃの除外植物相健康基準（Ｅｘｃｌｕｄｅｄ Ｆｌｏｒａ ｈｅａｌｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ）の下で実施した。ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃマウスの生存を維持するために、マウス１匹当たり１００～１５０ｕｌの１５％グルコースの毎日投与される皮下注射からなるグルコース療法。グルコース注射は、塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡによるＬＮＰ治療後にマウスに投与しなかった。

【0495】

インビボＬＮＰ投与ワークフロー
ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃホモ接合マウスにおけるｐ．Ｒ８３Ｃ変異を修正するために、塩基エディターｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのＬＮＰ共製剤を、出生直後のＰ１歳におけるマウスの側頭静脈を介して１．５ｍｐｋ（キログラム当たりのミリグラム）の用量で投与した。グルコース療法は、ＬＮＰ治療マウスに投与しなかった。ＬＮＰ治療マウスは、離乳（２１日）まで、それぞれの生母によって同腹仔対照と並行して飼育され続け、その時点で、それらを表現型解析した。全ての研究について、年齢一致の野生型及びヘテロ接合性ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃ同腹仔を対照として使用した。２１日目に、肝臓から採取したゲノムＤＮＡ、成長特徴、並びに血清及び肝臓マーカーを分析した。

【0496】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤
塩基エディター（塩基エディターをコードするｍＲＮＡ）及びガイドＲＮＡを、脂質ナノ粒子中で１：１の重量比で共封入した。ＬＮＰは、４つの脂質成分：イオン化可能な脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び脂質アンカーＰＥＧを含有するエタノール溶液と、３．０のｐＨでのＲＮＡの水溶液を急速に混合することによって生成した。２つの溶液を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓからのベンチトップマイクロ流体デバイスを使用して混合した。混合後、製剤を、１×ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９４１５８）に対して、４℃で一晩透析した。その後、それらを１００Ｋ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＵＦＣ９１００９６）を使用して濃縮し、０．２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｅｒａｔｉｏｎ、カタログ番号４６０２）で濾過した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ１１４９１）を使用して総ＲＮＡ濃度を決定し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して粒径を決定した。

【0497】

次世代配列決定（ＮＧＳ）
次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して、ＬＮＰ治療動物の全肝臓抽出物からのゲノムＤＮＡ中の塩基編集された対立遺伝子の頻度を決定した。ＬＮＰ治療後、マウスを安楽死させ、肝臓全体を除去し、液体窒素中でスナップ凍結した。凍結マウス肝臓を、Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ ２０１０（Ｏｐｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して粉末形態に粉砕し、ゲノムＤＮＡを、製造業者の仕様に従ってＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ溶解緩衝液を使用して肝臓粉末から単離した。ゲノムＤＮＡを、プライマー対：フォワードプライマー、ＧＧＧＣＡＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧ（配列番号３１）及びリバースプライマー、ＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＡ（配列番号３２）を使用して、ｈｕＧ６ＰＣエクソン２を保有する約１７０ヌクレオチド断片を産生するために、後続のＰＣＲ増幅ステップにおいて直接使用した。ＮＧＳアダプターを追加し、得られたアンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器を使用して配列決定した。

【0498】

血清代謝産物
血清代謝産物を測定するために、Ｒ８３Ｃヒト化トランスジェニックマウスから血液を採取した。次いで、血清を分離し、全血から抽出し、その後、代謝産物アッセイに使用した。関連する包括的な研究後評価のために、血清グルコース、血清コレステロール、及び血清トリグリセリドを全て分析した。血清グルコース及び血清コレステロールを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号：ＴＲ１５４２１）及びＩｎｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号：ＴＲ１３４２１）をそれぞれ含む肝細胞培地を使用して調製した。血清トリグリセリドを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からのＳｅｒｕｍ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＭＡＫ２６６）を使用して測定した。尿酸を、製造業者の仕様（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に従ってＵｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して測定した。血清乳酸を、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＥｎｚｙＦｌｕｏ Ｌ－Ｌａｃｔａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して分析した。

【0499】

マウスの空腹時血糖分析は、食物剥奪後の前後２４時間に尾静脈を介する血液サンプリングを伴った。血糖値を、ＨｅｍｏＣｕｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０１ Ｓｙｓｔｅｍ（ＨｅｍｏＣｕｅ Ａｍｅｒｉｃａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。

【0500】

ホモ接合ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃマウスについてのカプラン－マイヤー生存推定値
カプラン－マイヤー生存曲線を生成して、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合の新生トランスジェニックマウスの生存を、ＡＢＥ ｍＲＮＡを介する塩基編集後（緑色がかった青色）又は未治療（灰色、図１４）のいずれかで推定した。新生マウスを、以下のプライマー、ユニバーサルフォワードプライマー（５’－ＡＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴ－３’（配列番号５９））、マウス特異的リバースプライマー（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴ－３’（配列番号６０））、ヒト特異的リバースプライマー１（５’－ＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴ－３’（配列番号６１））、及びヒト特異的リバースプライマー２（５’－ＡＧＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＧＧ－３’（配列番号６２））を使用して、ゲノムテールＤＮＡにおいてＰＣＲ分析を介して遺伝子型決定した。生存は、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合のトランスジェニックマウスについて注目された。未治療マウスは、死産（ｎ＝６）であったか、又は８時間（ｎ＝６）及び２４時間（ｎ＝１）で死亡したかのいずれかであった。１５％グルコース注射の投与は、生存を３２時間（ｎ＝５）、４８時間（ｎ＝２）、及び５６時間（ｎ＝２）に延長した。ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃに対してホモ接合の全てのＡＢＥ治療マウスは、３週間における研究の終了まで生存した。

【0501】

グルコース－６－ホスファターゼ－アルファ活性アッセイ
Ｌｅｉ，Ｋ．－Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３（２）：２０３－９により記載されるように、肝臓ミクロソーム単離及びミクロソームホスホヒドロラーゼアッセイを行った。Ａｒｎａｏｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０２１，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ ４）におけるアッセイ方法論は、以下のように記載されている。「Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ－１ａ ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３，２０３－２０９）。ホスホイドロラーゼアッセイにおいて、５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのグルコース－６－ホスフェート（Ｇ６Ｐ）、及び適切な量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物（５０ｕＬ）を３０℃で１０分間インキュベートした。破壊されたミクロソーム膜を、０．２％デオキシコレート中で無傷の膜を２０分間、４℃でインキュベートすることによって調製した。非特異的ホスファターゼ活性は、破壊されたミクロソーム調製物をｐＨ５で１０分間、３７℃でプレインキュベートして、酸不安定性Ｇ６Ｐａｓｅ－アルファを不活性化することによって推定した。Ｇ６Ｐａｓｅ－アルファ活性の１単位は、１ｍｇのミクロソームタンパク質当たりの１分当たりの１ｎｍｏｌのＧ６Ｐ加水分解を表す。ミクロソームＧ６Ｐａｓｅ－アルファアッセイについてのより低いレベルの定量化は、２単位である。」

【0502】

Ｇ６Ｐａｓｅ－アルファの酵素組織化学分析は、Ｌｅｅ，Ｙ．Ｍ．，Ｊｕｎ，Ｈ．Ｓ．Ｐａｎ，Ｃ．－Ｊ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｂ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｈｏｕ，Ｊ．Ｙ．（２０１２）に記載されるように行った。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｅｌｌｕｌａｒ ａｄｅｎｏｍａ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ｉａ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６，１７１９－１７２９。Ａｒｎａｏｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０２１，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ ４）に記載されるように、１０μｍ厚の肝臓組織切片を、４０ｍＭのトリスマレイン酸塩（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＧ６Ｐ、３００ｍＭのスクロース、及び３．６ｍＭの硝酸鉛を含有する溶液中で、室温で１０分間インキュベートした。すすぎ後、肝臓切片を０．０９％硫化アンモニウム溶液中で室温で２分間インキュベートし、捕捉されたリン酸鉛が褐色の硫化鉛に変換した後、可視化された。

【0503】

免疫組織化学
免疫組織化学的手順を、Ａｒｎａｏｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ ４に記載されるように行った。簡潔には、Ｈ＆Ｅ染色を、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存された肝臓切片上で行い、オイルレッドＯ染色を、標準的な手順に従って、凍結保存された最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋された肝臓切片上で行った。染色された切片は、Ａｘｉｏｃａｍ ５０６カメラ及びＺｅｎ ２．６ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）を備えるＩｍａｇｅｒ Ａ２ｍ顕微鏡を使用して可視化された。

【0504】

実施例８：ＮＬＳはガイドＲＮＡの核移入を促進する
この実施例では、ガイドＲＮＡの核移入に対する核局在化シグナルの効果を評価した。

【0505】

簡潔に述べると、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドに融合したｇＲＮＡ（図１５Ａ）及びＮＬＳを含まない同族対照ｇＲＮＡ（図１５Ｂ）を、Ｃｙ５．５染料で蛍光標識した。ヒト肝細胞を、未修飾及びＮＬＳ修飾ｇＲＮＡでリポフェクションし、リポフェクション後２４時間及び４８時間で蛍光を顕微鏡的に測定した。定量化のためにＮｕｃＢｌｕｅ染色を使用して、核エンベロープを青色に対比染色した（図１５Ｃ）。

【0506】

結果は、ＮＬＳペプチドにコンジュゲートされていないｇＲＮＡ（図１５Ｄ）と比較して、ｇＲＮＡがＮＬＳペプチドにコンジュゲートされたときに核により効率的に局在化されることを示した（図１５Ｅ）。

【0507】

相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、図１５Ｆに示すように定量化した。結果は、ＡＢＥ８．８単独で観察されたＭＦＩがＰＢＳ治療でのバックグラウンド蛍光に匹敵する一方で、ｇＲＮＡでのＡＢＥ８．８が約３００ＭＦＩ単位への蛍光の増加を示したことを示した。しかしながら、ｇＲＮＡをＮＬＳにコンジュゲートした場合、約５００ＭＦＩ単位の増加した蛍光が存在した。ｇＲＮＡ単独では約３００ＭＦＩ単位の蛍光を示したが、ＮＬＳコンジュゲートｇＲＮＡを添加すると、約５５０ＭＦＩ単位の増加した蛍光をもたらした。

【0508】

全体として、この研究からの結果は、ＮＬＳにコンジュゲートした場合、ｇＲＮＡが核に効果的に局在化されたことを示した。

【0509】

実施例９：ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、マウスの肝臓において高い効力の遺伝子編集を示す
この実施例では、低用量のＮＬＳ ｇＲＮＡを投与されたｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃホモ接合マウスの肝臓において、遺伝子編集の能力を調べた。

【0510】

簡潔に述べると、ｈｕＧ６ＰＣ－Ｒ８３Ｃホモ接合マウスにおけるｐ．Ｒ８３Ｃ変異を修正するために、実施例７に先に記載されている方法を使用して、１型末端修飾（ＥＭ１）を有するＮＬＳ－ｇＲＮＡを、出生直後のＰ１歳におけるマウスの側頭静脈を介して０．２５ｍｐｋ（キログラム当たりのミリグラム）用量の亜飽和用量で投与した。ＮＬＳコンジュゲートは、３’末端にコンジュゲートされたときにｓａＣａｓ９エフェクターと適合することが見出される（図１６）。この実施例では、５％の末端修飾ｇＲＮＡ及び／又は２５％の重度修飾ｓａＨＭ０３ ｇＲＮＡも並行して試験した。配列を以下及び図１７Ａに提供する。

【0511】

【表8】

【0512】

図１７Ｂにおける結果に示されるように、ＮＬＳ－ｇＲＮＡは、末端修飾ｇＲＮＡ又は重度修飾ｓａＨＭ０３での５％未満に対して、１０％よりも大きいＡからＧへの塩基編集を示した。

【0513】

全体として、結果は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが、末端修飾ｇＲＮＡに対して、効力において２倍を超えるブーストをもたらすことを示した。結果は、ＮＬＳ－ｇＲＮＡが高い効力の遺伝子編集をもたらしたことを実証した。

【0514】

他の実施形態
前述の説明から、本明細書に記載の実施形態に変形及び修正を加えて、様々な用法及び条件に採用することができることは明らかであろう。かかる実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

【0515】

本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素として、又はリストされた要素の組み合わせ（又は副組み合わせ）として、その変数の定義を含む。本明細書におけるある実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態若しくはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。

【0516】

本明細書に言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的かつ個別に、参照により援用されることが示されているかのように、参照により本明細書に援用される。任意の別段の指示がない場合、本明細書に述べられている刊行物、特許、及び特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0517】

同等物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は通常の実験を超えない実験を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9A-B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【配列表】

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【国際調査報告】