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特表2024-529460アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の構造に基づいたデザイン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-08-06
(54)【発明の名称】アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の構造に基づいたデザイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240730BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240730BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240730BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240730BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20240730BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/7088
A61P31/14
A61P43/00 105
C12N15/88 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505032
(86)(22)【出願日】2022-07-22
(85)【翻訳文提出日】2024-03-11
(86)【国際出願番号】 US2022038037
(87)【国際公開番号】W WO2023009396
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】63/226,617
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】グオ， フェン
(72)【発明者】
【氏名】アルムガスワミ， ヴァイティリンガラジャ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB21
4C086ZB33
(57)【要約】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を作製するための構造に基づいたデザイン方法およびこの方法によって作製されたＡＳＯを提供する。ＡＳＯは、広範な疾患と戦うのに特に好適な新たに出現した薬物クラスである。ＡＳＯは、標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出す一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。従来のＡＳＯデザインストラテジーは、この問題に適切に取り組んでいない。本発明は、種々の疾患で必要不可欠なＲＮＡを標的にする構造に基づいたＡＳＯデザインを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を作製するためのプロセスであって、リボヌクレオチド標的配列を選択する工程であって、
前記リボヌクレオチド標的配列が、天然に存在するリボヌクレオチド分子中に存在する配列として選択され；
前記リボヌクレオチド標的配列が、８～３０ヌクレオチド長であり；
前記リボヌクレオチド標的配列が、
前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中のＲＮＡループ構造を形成するリボヌクレオチドのセグメント；または
前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中のヘアピン構造を形成するリボヌクレオチドのセグメントから１～２５ヌクレオチド遠位にあるリボヌクレオチドのセグメント
を含む、選択する工程；および
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を構築する工程であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を、
複数のヌクレオチドを選択することによってアンチセンスオリゴヌクレオチド産物を形成することによって構築し、その結果、
相互に共有結合された場合に、前記複数のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド産物を形成し、ここで、：
（ａ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドが、前記天然に存在するリボヌクレオチド分子内の主溝ＲＮＡ構造または副溝ＲＮＡ構造と結合相互作用を形成するように選択され；そして／または
（ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列とのワトソン・クリック塩基対合および前記天然に存在するリボヌクレオチド分子とのフーグスティーン塩基対合を形成するように選択され；そして／または
（ｃ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列中の少なくとも２つの近位ヌクレオチドと塩基対合相互作用を形成せず、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物と塩基対合相互作用を形成しない前記リボヌクレオチド標的配列中の前記少なくとも２つの近位ヌクレオチドが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物とワトソン・クリック塩基対合を形成する前記リボヌクレオチド標的配列中の複数のヌクレオチドに挟まれている、構築する工程；および
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が作製されるように、前記複数の選択されたヌクレオチドから前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を形成する工程
を含む、プロセス。
【請求項2】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の前記１またはそれを超えるヌクレオチドを、ＡＳＯ結合の自由エネルギーに寄与する前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中の主溝または副溝のＲＮＡ構造と結合相互作用を形成するように選択し；そして／または前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の前記１またはそれを超えるヌクレオチドを、ＡＳＯ結合の自由エネルギーに寄与する前記天然に存在するリボヌクレオチド分子とフーグスティーン塩基対合を形成するように選択する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、１３個と３０個の間のヌクレオチドを含む；または前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、１７～２５個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを、前記リボヌクレオチド標的配列と１００％の相補性を有する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中にポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、前記リボヌクレオチド標的配列とワトソン・クリック結合を形成しない少なくとも１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含み、その結果、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、前記リボヌクレオチド標的配列に１００％相補的ではない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の最初の５個の末端５’および／または３’ヌクレオチドを、前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中で（ｉ）フーグスティーン塩基対合；または（ｉｉ）ＲＮＡ主溝との結合相互作用；または（ｉｉｉ）ＲＮＡ副溝との結合相互作用を形成する少なくとも１つのヌクレオチドを含むように選択する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項6】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、プソイドウリジン；
ホスホロチオアート結合；
モルホリノヌクレオチド；
リボース部分の２’糖位の修飾；
２’－ＭＯＥメトキシエチル部分；
２－フルオロ部分；または
２’－ヒドロキシ部分
のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド産物。
【請求項7】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が１３～３０個のヌクレオチドからなり；前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも５個のヌクレオチドを、前記リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中でポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の末端５’および／または３’の５個のヌクレオチドを、前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中の主溝ＲＮＡ構造または副溝ＲＮＡ構造と結合相互作用を形成する少なくとも１個のヌクレオチドを含むように選択する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項8】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が１７～２５個のヌクレオチドからなり；前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも１０個のヌクレオチドを、前記リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中でポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列とのワトソン・クリック塩基対合および前記天然に存在するリボヌクレオチド分子とのフーグスティーン塩基対合を形成する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項9】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を、リポソームまたはナノ粒子の医薬組成物と組み合わせる工程をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項10】
請求項１に記載のプロセスによって作製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド産物。
【請求項11】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が、１３～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が１７～３０個のヌクレオチドからなり；前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも５個のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中にポリヌクレオチドセグメントを形成し；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の最初の５個の末端５’および／または３’ヌクレオチドが、前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中のＲＮＡ主溝との結合相互作用；または前記天然に存在するリボヌクレオチド分子中のＲＮＡ副溝との結合相互作用を形成する少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が１７～２５個のヌクレオチドからなり；前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも１０個のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中にポリヌクレオチドセグメントを形成し；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドが、前記リボヌクレオチド標的配列とのワトソン・クリック塩基対合および前記天然に存在するリボヌクレオチド分子とのフーグスティーン塩基対合を形成する、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、プソイドウリジン；
ホスホロチオアート結合；
モルホリノヌクレオチド；
リボース部分の２’糖位の修飾；
２’－ＭＯＥメトキシエチル部分；
２－フルオロ部分；または
２’－ヒドロキシ部分
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項15】
医薬品賦形剤、リポソーム、またはナノ粒子のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項16】
前記標的配列が、ウイルス、細菌、または真菌によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
前記標的配列が、ヒト細胞によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項18】
前記標的配列が、ヒト寄生虫によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項19】
標的配列が、ヒトタウ遺伝子；
ヒトベータアミロイド遺伝子；
Ｃｏｖｉｄ１９遺伝子；
ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィ遺伝子；
ヒトＦＡＮＣＤ２／ＦＡＮＣＩ関連ヌクレアーゼ１（ＫＩＡＡ１０１８）遺伝子；または
ヒトｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子
によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド産物。
【請求項20】
前記オリゴヌクレオチドが、以下の配列：5’-CGTTTAGAGAACAGTTTCT-3’（配列番号４１）、
5’-CGTTTAGAGAACAGATTCT-3’（配列番号４２）；
5’-GATGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４３）；
5’-TGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４４）；または
5’-ATGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４５）
を含む、請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２１年７月２８日に出願され、発明の名称が「アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の構造に基づいたデザイン」である本発明の譲受人に譲渡された同時継続中の米国特許仮出願第６３／２２６，６１７号（この出願は、本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２１年７月２８日に出願され、発明の名称が「アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の構造に基づいたデザイン」である本発明の譲受人に譲渡された同時継続中の米国特許仮出願第６３／２２６，６１７号（この出願は、本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する声明
本発明を、米国国立科学財団によって授与された助成金番号１６１６２６５の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明を、米国国立科学財団によって授与された助成金番号１６１６２６５の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本発明の分野は、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物およびその作製および使用のための方法に関する。
本発明の分野は、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物およびその作製および使用のための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出す一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。このテクノロジーの分野の当業者は、ウイルス性疾患、真菌性疾患、および代謝性疾患に関与する遺伝子発現をモジュレートすることができるアンチセンス、三重鎖、および他のオリゴヌクレオチド組成物をデザインしてきており、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの病状の処置における治療剤としての使用が承認されている。例えば、１９９８年に、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド薬ビトラベンン（ＩＳＩＳ２９２２）が、ＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルス網膜炎の処置用としてＦＤＡによって承認された。アンチセンスオリゴヌクレオチドは長年にわたってヒトに安全に投与されている一方で、オリゴヌクレオチドデザイン方法論にはある特定の課題による制約があり、これらの分子に十分な治療ポテンシャルを持たせるまでには至っていない。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出す一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。このテクノロジーの分野の当業者は、ウイルス性疾患、真菌性疾患、および代謝性疾患に関与する遺伝子発現をモジュレートすることができるアンチセンス、三重鎖、および他のオリゴヌクレオチド組成物をデザインしてきており、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの病状の処置における治療剤としての使用が承認されている。例えば、１９９８年に、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド薬ビトラベンン（ＩＳＩＳ２９２２）が、ＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルス網膜炎の処置用としてＦＤＡによって承認された。アンチセンスオリゴヌクレオチドは長年にわたってヒトに安全に投与されている一方で、オリゴヌクレオチドデザイン方法論にはある特定の課題による制約があり、これらの分子に十分な治療ポテンシャルを持たせるまでには至っていない。
【0005】
標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出すようにデザインされたＡＳＯが非常に望ましい。不運なことに、ＲＮＡ分子は、複雑な二次構造を形成する傾向があるために適切な親和性および特異性での所望の標的へのＡＳＯ結合の妨げとなることが、本技術分野での問題となっている。
【0006】
改良されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製方法およびかかる方法によって作製された改良アンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。例えば、種々の病状に関連する三次元ＲＮＡ標的に結合することができるＡＳＯを作製するための新規のテクノロジーは、治療的介入についての、特に、以前は創薬可能ではないと見なされていたタンパク質を産生する遺伝子についての新たな機会を切り開く。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明の概要
上述のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、広範な疾患と戦うのに好適な新たに登場した薬物クラスである。本明細書中に開示の発明は、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するための新規の構造に基づいたデザイン方法論の中核をなすものである。本明細書中に開示の発明の実施形態は、ＡＳＯデザインストラテジーにおいて標的ＲＮＡ構造の三次元構造を考慮した方法を含む。かかる構造に基づいた方法を使用して、種々の病状に極めて重要なＲＮＡを標的にする新規のＡＳＯを作製することができる。この文脈では、本開示は、かかる非従来型のＡＳＯをデザインするために驚異的に有用であることが発見された選択方法を含む。例えば、本明細書中に開示の方法を使用して、テンプレートとアイソステリックであり、ＡＳＯ／標的相互作用を増強するヌクレオチド塩基トリプルおよびフーグスティーン対合などを含むＡＳＯをデザインすることができる。ＡＳＯ標的結合におけるかかる三次相互作用の有用性および重要性を、本明細書中で本発明の例証となるＡＳＯ組成物の生化学的分析によってさらに実証する。
上述のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、広範な疾患と戦うのに好適な新たに登場した薬物クラスである。本明細書中に開示の発明は、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するための新規の構造に基づいたデザイン方法論の中核をなすものである。本明細書中に開示の発明の実施形態は、ＡＳＯデザインストラテジーにおいて標的ＲＮＡ構造の三次元構造を考慮した方法を含む。かかる構造に基づいた方法を使用して、種々の病状に極めて重要なＲＮＡを標的にする新規のＡＳＯを作製することができる。この文脈では、本開示は、かかる非従来型のＡＳＯをデザインするために驚異的に有用であることが発見された選択方法を含む。例えば、本明細書中に開示の方法を使用して、テンプレートとアイソステリックであり、ＡＳＯ／標的相互作用を増強するヌクレオチド塩基トリプルおよびフーグスティーン対合などを含むＡＳＯをデザインすることができる。ＡＳＯ標的結合におけるかかる三次相互作用の有用性および重要性を、本明細書中で本発明の例証となるＡＳＯ組成物の生化学的分析によってさらに実証する。
【0008】
本明細書中に開示の３Ｄ－ＡＳＯの作製プロセスは、典型的には、標的に特異的なＲＮＡ配列を最初に同定することを含むいくつかの工程を含む。これらの標的配列としては、エクソン、ｍＲＮＡスプライス部位、スプライシングに重要なイントロン領域、プログラムされたリボソームフレームシフトエレメント、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位、タンパク質結合部位、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始部位、および５’および３’ＵＴＲ中の他の機能的に重要な部位が挙げられるが、これらに限定されない。この文脈では、標的配列の三次元構造を、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１６およびＭＦＯＬＤ１７などのＲＮＡ二次構造予測プログラムを使用して同定することができる。ＲＮＡ二次構造予測プログラムは、殆どの場合、自由エネルギーレベルの低い一連の構造を提供する。通常、自由エネルギーレベルが低いデザイン可能な標的構造は、ＲＮＡ二次構造予測プログラムを使用して高頻度に同定される。例えば、ＲＮＡループ構造は、本明細書中に開示の３Ｄ－ＡＳＯデザインに非常に望ましい標的と見なされる。対照的に、ＲＮＡ二次構造予測プログラムによって同定された比較的弱いまたは信頼性が低い自由エネルギー構造を、本明細書中に開示のＡＳＯデザイン方法論では無視することができる。さらに、標的ＲＮＡの構造は、遊離状態とＡＳＯ結合状態とで同一でなくてよい。時折、未変性の標的ＲＮＡ構造を破壊することを目的とする。かかる状況では、本明細書中に開示の３Ｄ－ＡＳＯは、例えば、かかる天然に存在するリボヌクレオチド分子の構造の一部を乱すことおよび／または代替構造を形成することによって天然に存在するリボヌクレオチド分子の三次元構造の修飾物質（modulator）として作用することができる。
【0009】
本明細書中に提供した開示は、新規のデザイン方法論を記載し、かかる方法によって作製された一連の例証となる３Ｄ－ＡＳＯ産物をさらに示す。ある特定の例証となる作業実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを標的にすることによるヒト細胞中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製に対するある特定の３Ｄ－ＡＳＯデザインの強力な阻害を示すデータを提供する。このデータは、本明細書中に開示の構造デザイン方法論、ならびに、これらの方法によって作製されたＡＳＯの能力（power）および固有の価値を実証する。
【0010】
本明細書中に開示の方法の詳細な態様を、以下で考察する。典型的には、本発明の方法では、適切なヘアピン構造または二重鎖構造が天然に存在するＲＮＡ分子中のＲＮＡ標的配列として同定されると、この標的に結合する３Ｄ－ＡＳＯ配列をデザインするために、特異的ヌクレオチド選択工程を行う。例えば、以下に考察するように、デザインテンプレートを使用して、天然に存在するＲＮＡ分子と非標準の塩基対合を形成することができるかかるＡＳＯ配列の５’末端および／または３’末端上に配置すべきヌクレオチドを選択することができるのに対して、ＡＳＯ中の他の内部ヌクレオチドを、かかるＲＮＡ分子中の標的オリゴヌクレオチド配列に対するその配列相補性について選択する。２つのＲＮＡ構造が天然に存在する標的ＲＮＡ分子内で適切に離れている場合、ＡＳＯの両末端を、例えば、本明細書中に開示の３Ｄテンプレートを使用して、結合を容易にするように改変し得る。例えば、図１３に示す例証となるテンプレートＡ～Ｄでは、最強の拘束は、主溝セグメントおよび副溝セグメントを架橋しているフーグスティーン対に由来する。したがって、これらのテンプレートに基づいた３Ｄ－ＡＳＯデザインにおける最初の工程は、標的とフーグスティーン対を形成するヌクレオチドを、特異的ＲＮＡを標的にするようにデザインされたＡＳＯ中で操作することができるかどうかを決定することである。できる場合、このデザインの焦点を、主溝および副溝の相互作用を最適にするために、ＡＳＯの一方または両方の末端（例えば、ＡＳＯの５’末端（the 5’ and）の最初の５個のヌクレオチドおよびＡＳＯの３’末端の最後の５個のヌクレオチド）に集中することができる。できない場合、その代わりとして標的ＲＮＡ構造の動的バリアントを調査するか、あるいは主溝セグメントおよび副溝セグメントを架橋するためにフーグスティーン対を必要としない１またはそれを超えるテンプレートＥ～Ｈを適用することができる。テンプレートＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧでは、５’末端ＡＳＯ残基は、標的のその副溝由来のヘリックス構造を認識するが、その配列に対する特異性が制限される。したがって、典型的には、２～３個の３Ｄ－ＡＳＯ残基を、主溝または副溝のトリプルセグメントの相互作用（すなわち、結合相互作用を形成すること）のために割り当てることができる。さらに、選択されたヌクレオチド（図１６に示したヌクレオチドなど）の性質を使用して、標的オリゴヌクレオチド配列の主溝セグメントおよび副溝セグメントとの相互作用のための３Ｄ－ＡＳＯヌクレオチド／配列を選択することができる。テンプレートＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨでは、３’ＡＳＯ残基は、標的のその主溝由来のヘリックス構造および主溝塩基トリプルを介した配列を認識する。
【0011】
上述のように、本発明の典型的な実施形態では、標的配列との非標準的および標準的な塩基対合の両方を形成するために、ヌクレオチドを選択してＡＳＯ中に配置し、例えば、非標準的な塩基対合を、典型的には、ＡＳＯの３’および５’終末端（複数可）中に存在する１～５個のヌクレオチド中に生じるようにデザインし、標準的な塩基対合を、典型的には、これらのＡＳＯの他のヌクレオチド中で生じるようにデザインする。かかる非標準的および標準的な塩基対合の組み合わせにより、予想外に低い自由エネルギープロファイルを有する天然に存在するＲＮＡ分子中の標的配列に結合する新規の３Ｄ－ＡＳＯをデザインすることが可能である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを標的にするようにデザインされたＡＳＯに関連する以下の開示は、本明細書中に開示の構造デザイン方法論、ならびに、これらの方法によって作製されたＡＳＯの能力および固有の価値を実証する。
【0012】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかとなる。しかしながら、例証のために詳細な説明および具体例を示しており、本発明のいくつかの実施形態を示してはいるが、これらは本発明を制限しないと理解すべきである。本発明の意図から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの変更および修正を行うことが可能であり、本発明は、かかる修正の全てを含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａ～１Ｄは、どのようにしてＡＳＯがシュードノット由来のヘアピンと相互作用するのかを示す絵図を提供する。図１（Ａ）および図１（Ｃ）を、それぞれ図１（Ｂ）および図１（Ｄ）に示したヘアピン－ＡＳＯ対として見なし得る。図１（Ａ）および図１（Ｃ）は、同一のシュードノットを表す。
【図2】図２Ａ～２Ｅは、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＹＭＯ）のＰ２ｂ－Ｐ３シュードノット構造を示す略図を提供する。シュードノットを、２対のヘアピン－ＡＳＯ相互作用（図２（Ａ）ヘアピン１－ＡＳＯ１および図２（Ｂ）ヘアピン２－ＡＳＯ２）として見なすことができる。パネル図２Ａおよび図２Ｂでは、シュードノットの二次構造の描画を左側に示し、３Ｄ構造を右側に示す。シュードノットをヘアピン－ＡＳＯ複合体へと変えるために省略することができる残基を、銀色で示す。青色破線は、パネル図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ中に詳述した三次相互作用を示す。図２（Ｃ）Ａ３５およびＡ３６（パネル図２Ａの３Ｄ構造中に最も容易に認められる）が関与する副溝塩基トリプル。図２（Ｄ）２つの塩基トリプルセグメントを架橋しているフーグスティーン塩基対。図２（Ｅ）主溝塩基トリプル（パネル図２Ｂに最も容易に認められる）。
【図3】図３Ａ～３Ｄは、三次相互作用の重要性を示す略図および親和性測定からのデータを提供する。図３（Ａ）ＡＳＯ１－ヘアピン１および図３（Ｂ）ＡＳＯ２－ヘアピン２構築物。ＡＳＯおよびヘアピンの短縮および変異を、フィッティングから得たこれらのＫｄ±標準誤差と併せて示す。図３（Ｃ、Ｄ）ＷＴ ＡＳＯ１－ヘアピン１およびＡＳＯ２－ヘアピン２についてのＩＴＣによる結合測定。
【図5】図５Ａ～５Ｎは、エテプリルセンを改良するための構造に基づいたデザインの略図を提供する。図５（Ａ）エテプリルセン配列を黒色で示す。エテプリルセン配列はエクソン－５１残基とハイブリッド形成し、ほぼ配列と共にヘアピン構造（緑色）に折りたたまれる。このヘアピン構造は、エテプリルセン結合と適合せず、その親和性を低下させる。図５（Ｂ）デザインＤＭＤ１は、同一のヘアピンに結合する。ヘアピンを破壊する代わりに、ヘアピンは、ＤＭＤ１と広範囲の塩基トリプルおよび非標準的な対（破線で表す）を形成する（パネル図５Ｃ～Ｇに示す）。図５（Ｈ）第２のデザインＤＭＤ２は、ヘアピンループの反対側に結合し、図５Ｉ～Ｎに示す三次相互作用に携わる。ＡＳＯ残基を暗赤色に着色している。ψは、プソイドウリジン（最も豊富に天然に存在するヌクレオチド）を表す。
【図6】図６Ａ～６Ｒは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに対するＡＳＯの構造に基づいたデザインの略図を提供する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ（Ｐｒｅｐｒｉｎｔ）．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８；（本明細書中で参考として援用される）も参照のこと）。図６（Ａ）以前の研究は、転写制御配列に結合することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶを有効に阻害するＰＭＯ ＡＳＯ（ＴＲＳ２）を同定した。図６（Ｂ）ＰＭＯバックボーンを使用した構造に基づくデザイン（ＳＢＤ１）。図６（Ｃ～Ｇ）デザインされたＳＢＤ１と標的との間の三次相互作用。図６（Ｉ）ヘアピンループの３’領域にハイブリッド形成する第２のＰＭＯ ＳＢＤ２のデザイン。図６（Ｊ～Ｏ）予測されるＳＢＤ２についての標的相互作用。「Ｃ＋」は、プロトン化した状態のシトシンを表す。図６（Ｑ、Ｒ）それぞれＳＢＤ１およびＳＢＤ２に類似しているが、ＰＳおよび２’－ＯＭｅバックボーンを有するＳＢＤ３およびＳＢＤ４／ＳＢＤ５。これらは、パネルＨおよびＰに示すさらなる塩基トリプル（ｂａｓｅｄ ｔｒｉｐｌｅ）に携わることができる。ψは、プソイドウリジンを表す。Ｔ塩基およびＵ塩基は、相互にメチル基のみが異なり、これらのデザインにおいて概ね交換可能である。選択は商業的利用可能性によって為され得る。
【図7】図７Ａ～７Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＦＳＥを標的にする３Ｄ－ＡＳＯデザインの略図を提供する。図７（Ａ）滑りやすい部位でリボソーム停止を引き起こすシュードノット構造。図７（Ｂ）ＰＲＦ３ｐＰＭＯ（ＰＭＯバックボーンを有する）を、ステム１および２を破壊するようにデザインする。図７（Ｃ）ＰＲＦ３ｐＰＭＯのギャップマーバリアント。
【図8】図８Ａ～８Ｈは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳを標的にする３Ｄ－ＡＳＯデザインの略図を提供する。図８（Ａ）ＰＭＯバックボーンを有するＳＢＤ１。ＴＲＳコア残基を灰色で示す。図８（Ｂ～Ｆ）デザインされたＳＢＤ１とウイルスＲＮＡとの間の三次相互作用。図８（Ｇ）ＳＢＤ３はＳＢＤ１に類似するが、ＰＳおよび２’－ＯＭｅバックボーンを有する。図８（Ｈ）ＳＢＤ３の残基１３は、副溝塩基トリプルを形成することができる。Ｔ塩基およびＵ塩基は、相互にメチル基のみが異なり、かかるデザインにおいて概ね交換可能である。
【図9】図９Ａ～９Ｆは、ｈＡＣＥ２受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞に基づいた細胞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染アッセイを使用したリード３Ｄ－ＡＳＯ阻害剤の同定からのデータを提供する。データを２４ｈｐｉで得た。図９（Ａ）倍率が１０倍のスパイク抗原について染色した感染細胞のＩＣＣ画像。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質に対するウサギモノクローナル抗体を使用した。スケールバーは２００μｍを表す。図９（Ｂ）スパイク陽性細胞の定量。示したデータは、平均±ＳＤである。図９（Ｃ）ウイルスＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ定量。標準プライマーセットは、Ｎコード配列を増幅する。データを、宿主ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを使用して正規化した。３つの生物学的反復由来の平均±ＳＤを示す。図９（Ｄ、Ｅ）バリアントと共に示したＰＲＦ３ｐおよびＳＢＤ１のそれぞれによる用量依存性阻害。図９（Ｆ）ＭＴＴ細胞生存度アッセイの散布図。水平のバーは平均を示し、エラーバーはＳＤを表す。
【図10】図１０Ａ～１０Ｃは、以下のデザインの略図を提供する。図１０（Ａ）ＡＳＯが標的ＲＮＡのヘアピンループ全体に完全に相補的な２Ｄデザイン。図１０（Ｂ）ＡＳＯ－ループ二重鎖およびヘアピンステムの３Ｄモデルは、不適合である。図１０（Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶを阻害することが以前に報告されたＰＲＥＶと呼ばれるＡＳＯ（空間的に不適合なデザインをあらわすもの）。
【図11】図１１Ａ～１１Ｅは、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＹＭＯ）のＰ２ｂ－Ｐ３シュードノット構造から着想される略図を提供する。シュードノットを、以下の２対のヘアピン－ＡＳＯ相互作用として見なすことができる：図１１（Ａ）ヘアピン１－ＡＳＯ１および図１１（Ｂ）ヘアピン２－ＡＳＯ２。パネルＡおよびＢでは、シュードノットの二次構造の描写を左側に示し、３Ｄ構造を右側に示す。シュードノットをヘアピン－ＡＳＯ複合体へと変えるために省略することができる残基を、銀色で示す。青色破線は、パネル図１１Ｃ、図１１Ｄ、および図１１Ｅ中に詳述した三次相互作用を示す。図１１（Ｃ）Ａ３５およびＡ３６（パネル図１１Ａの３Ｄ構造中に最も容易に認められる）が関与する副溝塩基トリプル。図１１（Ｄ）２つの塩基トリプルセグメントを架橋しているフーグスティーン塩基対。図１１（Ｅ）主溝塩基トリプル（パネル図１１Ｂに最も容易に認められる）。
【図12】図１２Ａ～１２Ｆは、三次相互作用の重要性を示す親和性測定からのデータを提供する。（図１２Ａ、図１２Ｂ）ＡＳＯ１－ヘアピン１およびＡＳＯ２－ヘアピン２についてのＩＴＣ結合測定。（図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ）ＡＳＯおよびヘアピンの短縮および変異が親和性を減少させる。Ｋｄ値を、フィッティングから得た標準誤差と併せて示す。
【図14】図１４Ａ～１４Ｅは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス由来のＰＡＮ ＲＮＡ構造の略図を提供する。図１４（Ａ）ＥＮＥとポリ（Ａ）テールとの間の相互作用を強調するＰＡＮ ＲＮＡの略図。図１４（Ｂ、Ｃ）ポリ（Ａ）テール（赤紫色）を表すＡ９オリゴヌクレオチドと結合したＥＮＥコア（緑色）の結晶構造。灰色の残基は、結晶化を容易にするように操作されている。図１４（Ｄ）主溝トリプルをＬｅｏｎｔｉｓ－Ｗｅｓｔｈｏｆ表記法によって示し、Ａ－副溝相互作用を点線で示した構造の概略図。図１４（Ｅ）Ａ－副溝相互作用は、テロメラーゼシュードノットにおけるそれと幾何形状が異なる。Ｍｉｔｔｏｎ－Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０：１２４４－１２４７（２０１０）も参照のこと。
【図15】図１５Ａ～１５Ｄは、ヒトｌｎｃＲＮＡ ＭＡＬＡＴ１の構造の略図を提供する。図１５（Ａ）ＰＡＮとＭＡＬＡＴ１シュードノットの比較。ＭＡＬＡＴ１コアは、構造決定のために使用される操作された構築物である。図１５（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１コアの結晶構造。図１５（Ｃ）主溝塩基トリプル。図１５（Ｄ）Ａ－副溝相互作用。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６３３－６４０（２０１４）も参照のこと。
【図16】図１６Ａ～１６Ｑは、３Ｄ－ＡＳＯデザインテンプレートと幾何形状が適合する主溝トリプルを示す略図を提供する。この表を使用して、どの残基がβ位で使用され、一方、α位およびγ位の残基が標的ＲＮＡに由来することを決めることができる。非標準的な塩基対に関与するトリプルをボックスで強調し、一方、修飾塩基プソイドウリジン（ψ）を含むトリプルを破線で取り囲んでいる。パネルＧおよびＨは、別の選択肢である。
【図17】図１７Ａ～１７Ｇは、どの残基がα位で使用され（赤色で表示）、一方で、β位およびγ位の残基が標的ＲＮＡに由来すること（緑色で表示）を決めるために使用することができる主溝トリプル表（major-major-groove triple table）を示す略図を提供する。図１７（Ａ～Ｄ）α位にピリミジン残基を有するトリプル。これらのトリプルは、構造テンプレートに対してアイソステリックであり、したがって、好ましい。図１７（Ｅ～Ｇ）α位にプリン残基を有するトリプルも使用され得る。
【図20】図２０Ａ～２０Ｆは、テンプレート図２０Ｂおよび図２０Ｄ中のβ位のＡＳＯ残基を決定するために使用される副溝塩基トリプルのまとめの略図を提供する。ＡＳＯ残基は、化学修飾されたリボースを含むことが多い。いくつかの修飾が選択される。この事実を、図中の未修飾リボース部分の周囲の青色の円によって強調する。副溝トリプルに適合する修飾は、依然として実験によって決定されていない。パネル図２０Ｅおよび図２０Ｆ中に示した相互作用が実行可能であると考えられる。
【図21】図２１Ａ～２１Ｇは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＦＳＥを標的にする３Ｄ－ＡＳＯデザインの略図を提供する。図２１（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの略図。転写制御配列（ＴＲＳ）およびフレームシフト刺激エレメント（ＦＳＥ）を、黒色の水平線で示す。これらの部位を標的にする３Ｄ－ＡＳＯを、太い赤色のバーとして示す。図２１（ｂ）滑りやすい部位（ボックスで示す）でリボソーム停止を引き起こすＦＳＥ中のシュードノット構造。ＯＲＦ１ａのＵＡＡ（配列番号５）終止コドンを黒色斜体で示す。図２１（ｃ）ＰＲＦ３ｐＰＭＯ（ＰＭＯバックボーンを有するＡＳＯ）を、ステム１および２を破壊し、それによりリボソームが終止コドンまで進行して外れるようにデザインする。破線は三次相互作用を表す。図２１（ｄ）ＰＲＦ３ｐＰＭＯとＦＳＥとの間のフーグスティーン対。図２１（ｅ～ｇ）ＰＲＦ３ｐＰＭＯとステム３中のＦＳＥ塩基対との間の主溝塩基トリプル。
【図22】図２２Ａ～２２Ｌは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳを標的にするＳＢＤ１およびＳＢＤ１－Ｔ１５Ａのデザインに関する略図を提供する。図２２（ａ）ＴＲＳ２と呼ばれていたが、本明細書中でＰＲＥＶと命名した以前に報告されたＡＳＯがヘアピンループに結合することをここに提唱した。図２２（ｂ）ＰＭＯバックボーンを有するＳＢＤ１。図２２（ｃ～ｈ）デザインされたＳＢＤ１とウイルスＲＮＡとの間の三次相互作用。図２２（ｉ）最近の研究によって５’－ＵＴＲの代替立体構造が強く示唆されている。パネルｂ中のヘアピン中の残基（緑色で着色）は、３つのステム－ループ構造に関与する。図２２（ｊ）ＳＢＤ１は、ＳＬ３を破壊する必要があるが、ＳＬ２との三次相互作用に携わることができ、これはパネル図２２（ｃ）、図２２（ｄ）、および図２２（ｆ）に示したＳＢＤ１に類似している。図２２（ｋ）ＳＢＤ１－Ｔ１５Ａバリアントは、代替立体構造との相互作用を最適にする。図２２（ｌ）ＳＢＤ１－Ｔ１５Ａは、Ｕ（５’－１）－Ａ（３’＋１）対を破壊すると同時にＡ１５－Ｕ（５’－１）ＷＣ対およびＴ１６－Ａ（３’＋１）フーグスティーン対を形成することによって単一ヘアピンＴＲＳ立体構造と関わる。Ｕ（５’－１）およびＡ（３’＋１）を、中空フォントで強調している。
【図23】図２３Ａ～２３Ｎは、エテプリルセン結合を改良するために使用され得る３Ｄデザインの略図を提供する。図２３（Ａ）エテプリルセン配列を黒色で示す。エテプリルセン配列はエクソン－５１残基とハイブリッド形成し、ほぼ配列と共にヘアピン構造（緑色）に折りたたまれる。このヘアピン構造は、エテプリルセン結合と適合せず、その親和性を低下させる。図２３（Ｂ）デザインされたＤＭＤ１は、ヘアピンループの５’領域に結合する。ヘアピンを破壊する代わりに、ヘアピンは、ＤＭＤ１と塩基トリプルおよび非標準的な塩基対（破線で表す）を形成する（パネル図２３Ｃ～Ｅに示す）。図２３（Ｆ）本発明者らの第２のデザインＤＭＤ２は、ヘアピンループの３’領域に結合し、パネルＧ～Ｎに示す三次相互作用に携わる。３Ｄ－ＡＳＯ残基を暗赤色に着色している。ψは、プソイドウリジンを表す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の詳細な説明
実施形態の説明において、添付の図面を参照することができ、この図面は、本発明の一部を形成し、本発明を実施し得る特定の実施形態の例証を目的として示している。本発明の範囲を逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造を変化させることができると理解すべきである。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語、表記法、および他の科学用語または用語集は、本発明に属する当業者に一般に理解されている意味を有することを意図する。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中に定義し、そのような本明細書中に含まれる定義が、当該分野での一般的な理解を超える実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載されているか参照されている技術および手順の態様の多くは、当業者に十分に理解されており、かつ一般的に使用されている。以下の文章は、本発明の様々な実施形態を考察している。
実施形態の説明において、添付の図面を参照することができ、この図面は、本発明の一部を形成し、本発明を実施し得る特定の実施形態の例証を目的として示している。本発明の範囲を逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造を変化させることができると理解すべきである。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語、表記法、および他の科学用語または用語集は、本発明に属する当業者に一般に理解されている意味を有することを意図する。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中に定義し、そのような本明細書中に含まれる定義が、当該分野での一般的な理解を超える実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載されているか参照されている技術および手順の態様の多くは、当業者に十分に理解されており、かつ一般的に使用されている。以下の文章は、本発明の様々な実施形態を考察している。
【0015】
新規の薬物の型として、ＡＳＯは、革命的な医薬である１、２。ＡＳＯハイブリッド形成は、タンパク質結合表面に対する相補性に依存せず、原理として、ワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に従って任意の配列を標的にすることができる。それ故に、ＡＳＯ治療薬は、小分子を用いて容易に創薬可能ではない細胞経路を制御することができる３。１９７８年に、Ｚａｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎは、ＡＳＯがｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス複製を阻害することができることを実証した４、５。１９９８年に、最初のＡＳＯ薬ホミビルセンが、免疫低下患者におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎の処置用として承認された。ＨＩＶ薬が開発されたことによってＣＭＶ感染症の症例数が劇的に減少したためにその販売承認は後に取り下げられたが、ホミビルセンにより、抗ウイルス剤としてのＡＳＯの実現可能性および潜在性が実証された。２０１３年以来、７つのＡＳＯ薬が、種々の遺伝的障害の処置用として承認された。現在まで、６６種のＡＳＯ薬候補が、広範な疾患６、７（肝炎Ｂについては３種が挙げられる（Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓデータベース））について臨床試験が行われている。
【0016】
ＡＳＯ治療薬は、標的ＲＮＡにハイブリッド形成し、いくつかの機序（細胞ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解の誘導、翻訳阻害、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中のエクソンのインクルージョンまたはスキッピング、ＲＮＡ結合タンパク質およびｍｉｃｒｏＲＮＡの制御の競合、ならびにウイルスＲＮＡの複製、転写、およびウイルス粒子アセンブリの阻害など）を介して治療効果を引き出す８。血清安定性および好ましい薬物動態を達成するために、ＡＳＯ薬を、血清および細胞中に豊富なヌクレアーゼに対する耐性を示すように化学修飾する。これらの化学修飾は、薬物作用機序と適合しなければならない。
【0017】
あるクラスのＡＳＯは、標的ＲＮＡとハイブリッド形成し、細胞ＲＮａｓｅＨによって分解されるＤＮＡ残基を含む。ホミビルセンなどの最初期のＡＳＯは、バックボーン中にホスホロチオアート（ＰＳ）修飾のみを含み、この修飾は、ヌクレアーゼ耐性を増加させるが、ＲＮａｓｅＨ活性を妨害しない。第２世代のＲＮａｓｅＨ依存性ＡＳＯは、２０量体オリゴの１０個の最外側残基中にさらなる２’－Ｏ－（２－メチルオキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を含む。これらの残基は、標的ＲＮＡ結合に寄与するが、ＲＮａｓｅＨ切断に適合しない。ＲＮａｓｅＨ切断の範囲を中心の１０－ヌクレオチド領域に狭めることにより、これらの「ギャップマー」は、特異性が改善されている９。ミポメルセン、イノテルセン、およびボラネソルセンは、ギャップマーである。別のカテゴリーのＡＳＯ（エテプリルセン、ヌシネルセン、ゴロディルセン、およびビルトラルセンなど）は、ＲＮａｓｅＨに依存しないが、その代わりに、標的の細胞機序またはウイルス機序との相互作用を立体的に遮断する。これらの「立体遮断薬」は、２’－ＭＯＥ、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）、または標的結合親和性およびヌクレアーゼ耐性の両方を増強する他のバックボーン修飾を含む２、７。本明細書中に開示の発明は、新規の３Ｄ－ＡＳＯデザインを作製するための本明細書中に開示の方法においてこれらの機序および化学修飾を検討する。
【0018】
本明細書中の本発明の開示は、いくつかの実施形態を有する。本発明の実施形態は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を作製するためのプロセス／方法を含む。典型的には、これらの方法は、ＡＳＯの標的であるリボヌクレオチド標的配列を選択する工程を最初に含む。この選択工程では、リボヌクレオチド標的配列は、天然に存在するリボヌクレオチド分子中に存在する配列として選択される。典型的には、リボヌクレオチド標的配列は、８～３０ヌクレオチド長であり、天然に存在するリボヌクレオチド分子中のＲＮＡループ構造を形成するリボヌクレオチドのセグメントを含むか；あるいは天然に存在するリボヌクレオチド分子中のヘアピン構造を形成するリボヌクレオチドのセグメントに対して１～２５ヌクレオチド３’側もしくは５’側にあるリボヌクレオチドのセグメントを含む。この方法論では、次の工程は、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を構築する工程である。典型的には、本発明の方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を、複数のヌクレオチドを選択することによってアンチセンスオリゴヌクレオチド産物を形成することによって構築し、その結果、相互に共有結合された場合に、複数のヌクレオチドが、（従来のＡＳＯを用いて生じる）リボヌクレオチド標的配列に相補的なポリヌクレオチドのセグメントを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド産物を形成する。しかしながら、この方法論は、このＡＳＯのためにヌクレオチドを選択する工程をさらに含み、その結果、（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドが、天然に存在するリボヌクレオチド分子内の主溝ＲＮＡ三重鎖構造または副溝ＲＮＡ三重鎖構造と結合相互作用を形成するように選択され；そして／または（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドが、リボヌクレオチド標的配列との（例えば、リボヌクレオチド標的配列中の第１のヌクレオチド）とのワトソン・クリック塩基対合および天然に存在するリボヌクレオチド分子との（例えば、天然に存在するリボヌクレオチド分子中の第２のヌクレオチドとの）フーグスティーン塩基対合を形成するように選択され；そして／または（ｃ）アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内のヌクレオチドが、リボヌクレオチド標的配列中の少なくとも２つの近位ヌクレオチドと塩基対合相互作用を形成せず、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物と塩基対合相互作用を形成しないリボヌクレオチド標的配列中の少なくとも２つの近位ヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物とワトソン・クリック塩基対合を形成するリボヌクレオチド標的配列中の複数のヌクレオチドに挟まれている。上記の選択／決定工程後のこの方法論における次の工程は、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物が作製されるように、選択された複数のヌクレオチドから（例えば、従来のポリヌクレオチド合成技術を使用して）アンチセンスオリゴヌクレオチド産物を作製することである。
【0019】
本発明のある特定の実施形態では、ＡＳＯ産物への組み込みのために選択されるヌクレオチドを、種々のＡＳＯヌクレオチドの標的ＲＮＡ構造との三次相互作用の強度（自由エネルギー（ΔＧ）値（解離定数（Ｋｄ）から計算することができる）によって示すことができる強度）を考慮することによって選択することができる。例えば、本発明のある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドを、ＡＳＯ結合の自由エネルギーに寄与する天然に存在するリボヌクレオチド分子（例えば、少なくとも０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、または１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの、結合に対する自由エネルギーに寄与するもの）中の主溝または副溝のＲＮＡ構造と結合相互作用を形成するように選択することができる。本発明のある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物内の１またはそれを超えるヌクレオチドを、ＡＳＯ結合の自由エネルギーに寄与する天然に存在するリボヌクレオチド分子（例えば、少なくとも０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、または１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの、結合に対する自由エネルギーに寄与するもの）とフーグスティーン塩基対合を形成するように選択することができる。
【0020】
多種多様のＡＳＯ産物を、本明細書中に開示の方法を使用して作製することができる。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、１３個と３０個との間のヌクレオチド（例えば、１７～２５個のヌクレオチド）を含む。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを、リボヌクレオチド標的配列と１００％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド産物中にポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、リボヌクレオチド標的配列とワトソン・クリック結合を形成しない少なくとも１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含み、その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、リボヌクレオチド標的配列に１００％相補的ではない。本発明のある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の最初の５個の末端５’および／または３’ヌクレオチドを、天然に存在するリボヌクレオチド分子中で（ｉ）フーグスティーン塩基対合；または（ｉｉ）ＲＮＡ主溝との結合相互作用；または（ｉｉｉ）ＲＮＡ副溝との結合相互作用を形成する少なくとも１つのヌクレオチドを含むように選択する。本発明の１つの例証となる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、１３～３０個のヌクレオチドからなり；ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも５個のヌクレオチドを、リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド産物中でポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の末端５’および／または３’の５個のヌクレオチドを、天然に存在するリボヌクレオチド分子中の主溝ＲＮＡ構造または副溝ＲＮＡ構造と結合相互作用を形成する少なくとも１個のヌクレオチドを含むように選択する。本発明の別の例証となる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、１７～２５個のヌクレオチドのヌクレオチドからなり；ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物中の少なくとも１０個のヌクレオチドを、リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド産物中でポリヌクレオチドセグメントを形成するように選択し；アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド標的配列とのワトソン・クリック塩基対合および天然に存在するリボヌクレオチド分子とのフーグスティーン塩基対合を形成する。
【0021】
本発明のある特定の実施形態では、ＡＳＯを作製するプロセスは、本明細書中に開示のデザインテンプレート（例えば、図１３に示す）および／または本明細書中に開示のヌクレオチド対合相互作用の性質（例えば、図１６に示す）を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物のヌクレオチドおよびリボヌクレオチド標的配列のヌクレオチドの結合エネルギーを試験する工程を含む。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド産物は、プソイドウリジン；ホスホロチオアート結合；モルホリノヌクレオチド；リボース部分の２’糖位の修飾；２’－ＭＯＥメトキシエチル部分；２－フルオロ部分；または２’－ヒドロキシ部分のうちの少なくとも１つを含む。
【0022】
また、本発明の実施形態は、本明細書中に開示のプロセスによってＡＳＯが作製された場合生じる性質を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明の１つのかかる実施形態は、本明細書中に開示のプロセスによって作製されたＡＳＯ産物である。本発明の実施形態は、例えば、（従来のＡＳＯを用いて生じる）リボヌクレオチド標的配列に相補的なポリヌクレオチドのセグメント（例えば、少なくとも５～１０ポリヌクレオチド）ならびに（ａ）天然に存在するリボヌクレオチド分子内の主溝ＲＮＡ構造または副溝ＲＮＡ構造と結合相互作用を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１またはそれを超えるヌクレオチド；および／または（ｂ）リボヌクレオチド標的配列との（例えば、リボヌクレオチド標的配列中の第１のヌクレオチドとの）ワトソン・クリック塩基対合および天然に存在するリボヌクレオチド分子との（例えば、天然に存在するリボヌクレオチド分子中の第２のヌクレオチドとの）フーグスティーン塩基対合を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１またはそれを超えるヌクレオチド；および／または（ｃ）リボヌクレオチド標的配列中の少なくとも２つの近位ヌクレオチドと連続的なワトソン・クリック塩基対合相互作用を形成しないような配置で配置されたアンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドであって、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドと塩基対合相互作用を形成しないリボヌクレオチド標的配列中の少なくとも２つの近位ヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対合を形成するリボヌクレオチド標的配列中の複数のヌクレオチドに挟まれている、ヌクレオチドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【0023】
本発明のある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３～３０個のヌクレオチドから本質的になり；アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも５個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド中にポリヌクレオチドセグメントを形成し；アンチセンスオリゴヌクレオチド中の最初の５個の末端５’および／または３’ヌクレオチドは、主溝塩基トリプル相互作用または副溝塩基トリプル相互作用に関与する少なくとも１個のヌクレオチドを含む。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７～２５個のヌクレオチドからなり；アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも１０個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド標的配列に１００％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド中にポリヌクレオチドセグメントを形成し；アンチセンスオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド標的配列とのワトソン・クリック塩基対合および天然に存在するリボヌクレオチド分子とのフーグスティーン塩基対合を形成する。本発明のある特定の実施形態では、ＡＳＯを、ある特定の選択されたヌクレオチドおよび連結などを含むようにデザインする。例えば、必要に応じて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プソイドウリジン；ホスホロチオアート結合；モルホリノヌクレオチド；リボース部分の２’糖位の修飾；２’－ＭＯＥメトキシエチル部分；２－フルオロ部分；または２’－ヒドロキシ部分のうちの少なくとも１つを含む。
【0024】
また、本発明の実施形態は、以下のうちの少なくとも１つを含むＡＳＯ組成物を含む：医薬品賦形剤、リポソーム、またはナノ粒子。例えば、本発明の組成物のある特定の実施形態は、例えば、医薬品賦形剤（防腐剤、張度調整剤、界面活性剤、粘度調整剤、糖、およびｐＨ調整剤からなる群から選択されるものなど）を含む。ヒトへの投与に好適な組成物について、用語「賦形剤」は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ ｅｄ．（２００６）（その内容が、本明細書中で参考として援用される）に記載の成分が挙げられるが、これらに限定されないことを意味する。
【0025】
本明細書中に開示のＡＳＯを、多種多様の天然に存在するＲＮＡ分子を標的にするようにデザインすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、天然に存在するＲＮＡ中の標的配列は、ウイルス、細菌、または真菌によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する。本発明のある特定の実施形態では、天然に存在するＲＮＡ中の標的配列は、ヒト細胞によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する。本発明のある特定の実施形態では、天然に存在するＲＮＡ中の標的配列は、ヒト寄生虫によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する。本発明の例証となる実施形態では、標的配列は、ヒトタウ遺伝子；ヒトベータアミロイド遺伝子；Ｃｏｖｉｄ１９遺伝子；ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィ遺伝子；ヒトＦＡＮＣＤ２／ＦＡＮＣＩ関連ヌクレアーゼ１（ＫＩＡＡ１０１８）遺伝子；またはヒトｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子によって発現されるリボヌクレオチド中に存在する。
【0026】
本発明の例証となる作業実施形態では、標的配列は、Ｃｏｖｉｄ１９ウイルスによって発現されるリボヌクレオチド中に存在し、ＡＳＯは、以下の配列を含むか、以下の配列からなる：5’-CGTTTAGAGAACAGTTTCT-3’（配列番号４１）；5’-CGTTTAGAGAACAGATTCT-3’（配列番号４２）；5’-GATGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４３）；5’-TGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４４）；または5’-ATGTCAAAAGCCCTGTAGTAC-3’（配列番号４５）。
【0027】
上述のように、本発明の実施形態は、ＡＳＯ中の１またはそれを超えるヌクレオチド（例えば、ＡＳＯの５’末端および３’末端のヌクレオチド）と天然に存在するＲＮＡ分子上の部分（例えば、フーグスティーン対を形成することができる主溝、副溝、およびヌクレオチドなど）との間の非標準的な三次元結合相互作用を考慮する方法を含む。この文脈では、主溝および副溝塩基トリプルならびにフーグスティーン対のＡＳＯ／標的結合相互作用の強度を、等温滴定熱量測定法などの方法を使用した結合親和性の測定によって観察することができる。この態様および以下の節に考察した情報は、Ｖｉｅｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．２００７；１２９（４８）：１４９６６－７３．Ｅｐｕｂ ２００７１１１３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０７４８０９ｏ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７９９７５５５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２５２８５４６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３；５２（４２）：７４７７－８５．Ｅｐｕｂ ２０１３１００９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ４００８２７５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４１０６７８５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８５９４３６；Ｔｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００５；１７（５）：６７１－８２．Ｅｐｕｂ ２００５／０３／０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００５．０１．０１７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５７４９０１７；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９８４；１２（１６）：６６０３－１４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／１２．１６．６６０３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：６４７３１１０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３２００９９（その内容が、本明細書中で参考として援用される）で考察されている。
【0028】
かかる三次相互作用の強度を、解離定数（Ｋｄ）から計算することができる自由エネルギー（ΔＧ）値によって示すことができる。これらの値が、３Ｄ－ＡＳＯ分子がその標的ＲＮＡに対する親和性をどの程度増強することができるのかという情報が当業者に与えられるように細胞内ｐＨおよび塩条件（例えば、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ）に近い溶液中で決定されるべきであることに留意することが重要である。かかる生理学的に類似する条件が、ＲＮＡ塩基対合の自由エネルギーパラメーターが典型的に測定されて得られる「標準的な」高塩条件（１Ｍ ＮａＣｌ）と非常に異なることに留意のこと。塩濃度の低下およびＮａのＫでの置換の両方により、ＲＮＡヘアピンおよび二重鎖形成のΔＧ値を低下させる（例えば、Ｖｉｅｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．２００７；１２９（４８）：１４９６６－７３．Ｅｐｕｂ ２００７１１１３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０７４８０９ｏ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７９９７５５５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２５２８５４６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３；５２（４２）：７４７７－８５．Ｅｐｕｂ ２０１３１００９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ４００８２７５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４１０６７８５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８５９４３６を参照のこと）。その結果として、ΔＧ値は、ＲＮＡ折りたたみ研究およびＲＮＡの二次構造予測で典型的に認められるΔＧ値より小さい。典型的には、１．３６ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギーの獲得が、親和性を１０倍に増強するはずであり、２．７２ｋｃａｌ／ｍｏｌでは親和性を１００倍に増強するはずである。以下の節では、当業者のためのさらなるガイダンスを提供する。
【0029】
主溝塩基トリプル由来の自由エネルギーの獲得
３層の好ましい主溝塩基トリプルは、２ｋｃａｌ／ｍｏｌまでの、結合に対する自由エネルギーに寄与することができる。最も好ましい主溝塩基トリプルとしては、Ｇ●Ａ－Ｇ（Ａ－Ｇは非標準的な塩基対を表し、両方の塩基がそのワトソン・クリック表面を使用して水素結合している）、Ｕ●Ａ－Ｕ、Ｕ●Ａ－Ｇ、Ｃ＋●Ｇ－Ｃ（Ｃ＋はプロトン化したＣを表す）、Ｇ●Ｇ－Ａ、およびＣ＋●Ｇ－Ａが挙げられる
３層の好ましい主溝塩基トリプルは、２ｋｃａｌ／ｍｏｌまでの、結合に対する自由エネルギーに寄与することができる。最も好ましい主溝塩基トリプルとしては、Ｇ●Ａ－Ｇ（Ａ－Ｇは非標準的な塩基対を表し、両方の塩基がそのワトソン・クリック表面を使用して水素結合している）、Ｕ●Ａ－Ｕ、Ｕ●Ａ－Ｇ、Ｃ＋●Ｇ－Ｃ（Ｃ＋はプロトン化したＣを表す）、Ｇ●Ｇ－Ａ、およびＣ＋●Ｇ－Ａが挙げられる
【0030】
２つの副溝塩基トリプルの操作に由来する自由エネルギーの獲得
２つの好ましい副溝塩基トリプルの寄与は、０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると推定される。副溝トリプルの相互作用は、種々の塩基の組み合わせを許容するようであり、最も好ましい組み合わせとしては、Ｇ●Ｇ－Ｃ、Ｃ●Ｇ－Ｃ、Ａ●Ｇ－Ｃ、Ｃ●Ａ－Ｕ、Ａ●Ａ－Ｕ、およびＧ●Ａ－Ｕが挙げられる。
２つの好ましい副溝塩基トリプルの寄与は、０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると推定される。副溝トリプルの相互作用は、種々の塩基の組み合わせを許容するようであり、最も好ましい組み合わせとしては、Ｇ●Ｇ－Ｃ、Ｃ●Ｇ－Ｃ、Ａ●Ｇ－Ｃ、Ｃ●Ａ－Ｕ、Ａ●Ａ－Ｕ、およびＧ●Ａ－Ｕが挙げられる。
【0031】
フーグスティーン対に由来する自由エネルギーの獲得
フーグスティーン対による寄与は、この相互作用の喪失が隣接する主溝および副溝塩基トリプルを破壊する可能性があるので、単独で測定することができない。例えば、Ｕ●Ａフーグスティーン対（直下の図中のパネルＡ）が、中性ｐＨでフーグスティーン対を形成することが不可能であるＣ残基およびＧ残基で置き換えられる場合（例えば、Ｔｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００５；１７（５）：６７１－８２．Ｅｐｕｂ ２００５／０３／０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００５．０１．０１７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５７４９０１７を参照のこと）、ＡＳＯ２とヘアピン２＿Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔの会合を検出することができない。この結果は、少なくとも２ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギーの喪失を示す。しかしながら、参考として最適なＵ●Ａフーグスティーン対を使用すると、Ｇ●ＧおよびＧ●Ａ（直下の図中のパネルＢおよびＣ）は実行可能な代替物質であると決定されており、自由エネルギーがＵ●Ａよりそれぞれ０．２２および０．４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ高い。化学修飾された塩基は、フーグスティーン対合を媒介することができ（直下の図中のパネルＤ～Ｆに示した例、化学修飾の節で詳細に説明されている）、それにより、３Ｄ－ＡＳＯデザインで有用である。
フーグスティーン対による寄与は、この相互作用の喪失が隣接する主溝および副溝塩基トリプルを破壊する可能性があるので、単独で測定することができない。例えば、Ｕ●Ａフーグスティーン対（直下の図中のパネルＡ）が、中性ｐＨでフーグスティーン対を形成することが不可能であるＣ残基およびＧ残基で置き換えられる場合（例えば、Ｔｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００５；１７（５）：６７１－８２．Ｅｐｕｂ ２００５／０３／０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００５．０１．０１７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５７４９０１７を参照のこと）、ＡＳＯ２とヘアピン２＿Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔの会合を検出することができない。この結果は、少なくとも２ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギーの喪失を示す。しかしながら、参考として最適なＵ●Ａフーグスティーン対を使用すると、Ｇ●ＧおよびＧ●Ａ（直下の図中のパネルＢおよびＣ）は実行可能な代替物質であると決定されており、自由エネルギーがＵ●Ａよりそれぞれ０．２２および０．４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ高い。化学修飾された塩基は、フーグスティーン対合を媒介することができ（直下の図中のパネルＤ～Ｆに示した例、化学修飾の節で詳細に説明されている）、それにより、３Ｄ－ＡＳＯデザインで有用である。
【化1】
【0032】
自由エネルギーの獲得による３Ｄ－ＡＳＯデザインのスコアリング機能
ＡＳＯ－標的相互作用の詳細な熱力学的記述は、３Ｄ－ＡＳＯデザインのスコアリングを容易にすることができる。すなわち、総自由エネルギー獲得を、３Ｄ－ＡＳＯデザインで操作された全ての三次相互作用から得た自由エネルギーの総計によって計算することができる。
ＡＳＯ－標的相互作用の詳細な熱力学的記述は、３Ｄ－ＡＳＯデザインのスコアリングを容易にすることができる。すなわち、総自由エネルギー獲得を、３Ｄ－ＡＳＯデザインで操作された全ての三次相互作用から得た自由エネルギーの総計によって計算することができる。
【0033】
例証となるＡＳＯバックボーン修飾
３Ｄ－ＡＳＯデザインで有用なＡＳＯバックボーン修飾としては、ホスホロチオアート（ＰＳ）、ホスホロジチオアート（ＰＳ２）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（図４）が挙げられる。
３Ｄ－ＡＳＯデザインで有用なＡＳＯバックボーン修飾としては、ホスホロチオアート（ＰＳ）、ホスホロジチオアート（ＰＳ２）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（図４）が挙げられる。
【0034】
ホスホロジチオアート結合（ＰＳ２）はアキラルであり、構造生物学法を使用して研究するのが容易である。以前の研究では、ＰＳ２結合を有するＤＮＡがＲＮａｓｅＨ（ギャップマーデザインに有用）を活性化すること、およびＰＳ２が種々のヌクレアーゼによる加水分解に対して完全な耐性を示すことが示されている。
【0035】
例証となるＡＳＯ塩基修飾
プソイドウリジン（Ψ）
プソイドウリジンは、天然ＲＮＡ中で見出される最もよく見られる修飾されたヌクレオシドのうちの１つである。Ｕと比較して、Ψは、フーグスティーン表面上の水素結合ドナー基が増加している（図２８Ａ）。したがって、Ψは、ＣまたはＡのいずれかとフーグスティーン対を形成することができ（図２８Ｂおよび２８Ｃ）、主溝塩基トリプルＣ・Ψ－ＡおよびＡ・Ψ－Ａを形成することができる（図２８Ｄおよび２８Ｅ）。
プソイドウリジン（Ψ）
【化2】
【0036】
Ｎ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）
１位のアデノシンのメチル化により、核酸塩基中の機能が劇的に変化する（図２８Ｆ）。１－メチルアデノシン（ｐＫａ８．２５）は、アデノシン（ｐＫａ３．５）より遥かに強力な塩基であり、したがって、生理学的条件下で正電荷を有する。Ｎ－１メチル化は、そのフーグスティーン表面を使用してＵおよびＧと対合する能力を維持しているが（図２８Ｇおよび２８Ｈ）、そのワトソン・クリック表面を介した非特異的標的との対合能力は排除される。したがって、この修飾は、３Ｄ－ＡＳＯの特異性を増強すると予想される。
【化3】
【0037】
５－メチル－Ｃ（ｍ５Ｃ）
Ｃ●Ｇフーグスティーン対（図２８Ｉ）の形成には、Ｎ３位のＣをプロトン化する必要がある（ダイアグラム中にＣ＋として表される）。しかしながら、溶液中の遊離ＣのｐＫａが４．５であるので生理学的ｐＨ条件下でのプロトン化が困難である。これにより、Ｃ●Ｇ組み合わせが本発明者らの３Ｄ－ＡＳＯデザインテンプレートにおけるフーグスティーンで好ましくない理由が説明される。ｍ５ＣのｐＫａは中性ｐＨにシフトされ、したがって、プロトン化およびＧとのフーグスティーン対の形成がより容易である（図２８Ｊ）（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３；５２（４２）：７４７７－８５．Ｅｐｕｂ ２０１３１００９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ４００８２７５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４１０６７８５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８５９４３６を参照のこと）。さらに、Ｃ●Ｇ－Ｃ主溝塩基トリプルの形成には主溝Ｃがプロトン化される必要があるが、この化学的環境では、ＣのｐＫａは中性ｐＨ付近にシフトされる。３Ｄ－ＡＳＯ中に組み込まれた場合、ｍ５Ｃは、主溝のＧ－Ｃ対との相互作用を簡潔に安定化すると予想される（図２８Ｋ）。
【化4】
【0038】
Ｚヌクレオチド
Ｃ●Ｇフーグスティーン対（図２８Ｉ）およびＣ●Ｇ－Ｃ主溝塩基トリプル中でＣがプロトン化される要件に対して、Ｚヌクレオチド（６－アミノ－５－ニトロ－２（１Ｈ）－ピリドン）（図２８Ｌおよび２８Ｍ）を使用して取り組むことができる。
Ｃ●Ｇフーグスティーン対（図２８Ｉ）およびＣ●Ｇ－Ｃ主溝塩基トリプル中でＣがプロトン化される要件に対して、Ｚヌクレオチド（６－アミノ－５－ニトロ－２（１Ｈ）－ピリドン）（図２８Ｌおよび２８Ｍ）を使用して取り組むことができる。
【0039】
２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰ）
ＤＡＰは、２位にアミノ基を有するＡである。このアミノ基により、ＤＡＰがＵと３つの水素結合を形成し、ワトソン・クリック対合相互作用を強化することが可能である（図２８Ｎおよび２８Ｏ）。また、アミノ基が水素結合ドナーを提供することによって副溝塩基トリプルを強化することがより重要である。
【化5】
【0040】
８－オキソ－Ｇ
８－オキソ－Ｇは、Ａとの対合のためにそのフーグスティーン表面を使用することができる（図２８Ｐ）。さらに、８－オキソ－Ｇは、主溝トリプルＡ●Ｏｘｏ－Ｇ－Ｃを形成することができる（図２８Ｑ）。これらの特徴は、３Ｄ－ＡＳＯデザインに有用である。
８－オキソ－Ｇは、Ａとの対合のためにそのフーグスティーン表面を使用することができる（図２８Ｐ）。さらに、８－オキソ－Ｇは、主溝トリプルＡ●Ｏｘｏ－Ｇ－Ｃを形成することができる（図２８Ｑ）。これらの特徴は、３Ｄ－ＡＳＯデザインに有用である。
【0041】
本発明のさらなる特徴および実施形態を、以下の節で考察する。
【0042】
構造に基づいたＡＳＯのさらなる原理
従来のＡＳＯデザインは、線状標的配列に沿ったワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に厳密に従う。しかしながら、標的ＲＮＡは、ＡＳＯハイブリッド形成を妨害する強力な二次構造および三次構造に折りたたまれることが多い。一本鎖ＲＮＡは分子内塩基対を形成する傾向があり、これらが相互に積み重ねられて二本鎖ヘリックスおよびより高次の構造を形成する。これらの構造は、ＲＮＡ結合タンパク質の動員などの生物学的機能に重要であることが多い１０。例えば、ウイルスは、ウイルスの複製および翻訳に重要なその５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ中１１、ならびに下流ウイルスタンパク質の翻訳の継続を担うリボソームフレームシフト（ＲＦＳ）部位中にＲＮＡヘアピンを含むことが多い。これらの構造は、構造の対合相互作用および３Ｄ幾何形状が相互に適合しないので、ＡＳＯハイブリッド形成を妨げることが多い。従来のＡＳＯデザインストラテジーは、構造化された領域のターゲティングを回避するかこれらの構造を無視し、高親和性結合剤を同定するために多数のＡＳＯのスクリーニングに依存している。この課題によって多くのＡＳＯ候補が失敗に終わり、重要な構造化標的に手が届かないままである。
従来のＡＳＯデザインは、線状標的配列に沿ったワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に厳密に従う。しかしながら、標的ＲＮＡは、ＡＳＯハイブリッド形成を妨害する強力な二次構造および三次構造に折りたたまれることが多い。一本鎖ＲＮＡは分子内塩基対を形成する傾向があり、これらが相互に積み重ねられて二本鎖ヘリックスおよびより高次の構造を形成する。これらの構造は、ＲＮＡ結合タンパク質の動員などの生物学的機能に重要であることが多い１０。例えば、ウイルスは、ウイルスの複製および翻訳に重要なその５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ中１１、ならびに下流ウイルスタンパク質の翻訳の継続を担うリボソームフレームシフト（ＲＦＳ）部位中にＲＮＡヘアピンを含むことが多い。これらの構造は、構造の対合相互作用および３Ｄ幾何形状が相互に適合しないので、ＡＳＯハイブリッド形成を妨げることが多い。従来のＡＳＯデザインストラテジーは、構造化された領域のターゲティングを回避するかこれらの構造を無視し、高親和性結合剤を同定するために多数のＡＳＯのスクリーニングに依存している。この課題によって多くのＡＳＯ候補が失敗に終わり、重要な構造化標的に手が届かないままである。
【0043】
本明細書中に開示の構造に基づいたデザイン方法論は、三次元（３Ｄ）空間で標的構造と適合させ、ＷＣ塩基対合に加えて三次相互作用に携わることによってこの問題を解決する。この方法でデザインされた「３Ｄ－ＡＳＯ」は、三次相互作用の獲得および標的構造を破壊する必要がないことによる自由エネルギーの確保に起因して高められた親和性で標的に結合する。さらに、３Ｄ－ＡＳＯが標的配列だけでなく、形状および水素結合パターンも認識するので、結合特異性が高められる。
【0044】
構造は、首尾の良い創薬に必要不可欠な検討事項である。しかしながら、三次相互作用は、ＡＳＯ薬開発において取り入れられてこなかった。これは、ＲＮＡをヌクレオチドの単純な線とみなす従来の思考に一部起因する。本明細書中に開示の発明は、ＡＳＯ開発分野に対して構造生物学の側面を導入／考慮する。３Ｄを考慮することの重要性は、図１０に示す例で強調される。１Ｄデザインを実施する場合、ヘアピンループ全体をＡＳＯで補完することを望むことが自然である（図１０Ａ）。しかしながら、３Ｄ拘束に起因して全ての塩基対が形成されるわけではない。ヘアピンステム中の塩基対合には、ループの５’および３’のほとんどの残基が相互に近づく（１１Å）ことが必要であるのに対して、ヘアピンループとＡＳＯとの間に形成されるヘリックスは硬い棒のようであり、２１塩基対の二重鎖では５６Åにわたる（図１０Ｂ）。このモデリングの課題から、ＡＳＯがヘアピンループ全体と対合することは望ましくないと結論づけられ、この状況は文献中に認められることが多い（例えば、図１０Ｃ）。
【0045】
構造デザインテンプレート
３Ｄデザインを達成するために、特異的ヘアピンを標的にするための８つの革新的なデザインテンプレートを生成した。デザインテンプレートを、既存のＲＮＡ構造から着想した。これらのテンプレートは、ＡＳＯおよび標的が空間的および構造的に適合すること、および、ＷＣ塩基対合に加えて、これらが広範囲の三次相互作用に携わることを確実にする。これらの三次相互作用はＡＳＯ－標的境界を増加させ、したがって親和性および特異性を高める。かかるデザインテンプレートが構造化ＲＮＡを標的にすることが可能であることが重要である。ヘアピンはＲＮＡ中で最も基本的かつ最も豊富な構造であるので、本テクノロジーは、広範な標的および疾患に広く適用可能である。
３Ｄデザインを達成するために、特異的ヘアピンを標的にするための８つの革新的なデザインテンプレートを生成した。デザインテンプレートを、既存のＲＮＡ構造から着想した。これらのテンプレートは、ＡＳＯおよび標的が空間的および構造的に適合すること、および、ＷＣ塩基対合に加えて、これらが広範囲の三次相互作用に携わることを確実にする。これらの三次相互作用はＡＳＯ－標的境界を増加させ、したがって親和性および特異性を高める。かかるデザインテンプレートが構造化ＲＮＡを標的にすることが可能であることが重要である。ヘアピンはＲＮＡ中で最も基本的かつ最も豊富な構造であるので、本テクノロジーは、広範な標的および疾患に広く適用可能である。
【0046】
本明細書中に開示の３Ｄ－ＡＳＯの鍵となる特徴は、３Ｄ－ＡＳＯが配列中の標的と完全には相補的でないという点である。この特徴により、このテクノロジーは、産学両方における多数のＡＳＯ薬開発プログラムとは明確に異なる。したがって、このプラットフォームを使用して、既存のＡＳＯを改良するか、あるいはより良いＡＳＯをｄｅ ｎｏｖｏで開発することができる。これらの３Ｄ－ＡＳＯは標的配列と完全には相補的でなく、したがって、３Ｄ－ＡＳＯが従来のデザインと異なる明確な特徴を有することが重要である。
【0047】
テロメラーゼシュードノット構造由来の４つのデザインテンプレート
本明細書中に開示の発明は、ＡＳＯと構造化標的ＲＮＡの相互作用方法の理解によって組み立てられている。しかしながら、不運なことに、必要とされる構造の情報が不足している（すなわち、ＡＳＯとの複合体中のＲＮＡヘアピンの３Ｄ構造はほとんど利用できない）。したがって、本発明の態様は、ＡＳＯとヘアピンとの間の会合に類似するＲＮＡ構造（シュードノットなど）の調査から着手している。シュードノットは、上流または下流の鎖とのループ対合を有するＲＮＡヘアピンを指し、ＡＳＯと等価と見なされ得る（図１１Ａ、Ｂ）。実際には、各シュードノットは、最小限の２つの対合領域を含む。いずれかの一方をヘアピンステムと見なし得るのに対して、他方をヘアピンループとＡＳＯとの間に形成された二重鎖と見なし得る。
本明細書中に開示の発明は、ＡＳＯと構造化標的ＲＮＡの相互作用方法の理解によって組み立てられている。しかしながら、不運なことに、必要とされる構造の情報が不足している（すなわち、ＡＳＯとの複合体中のＲＮＡヘアピンの３Ｄ構造はほとんど利用できない）。したがって、本発明の態様は、ＡＳＯとヘアピンとの間の会合に類似するＲＮＡ構造（シュードノットなど）の調査から着手している。シュードノットは、上流または下流の鎖とのループ対合を有するＲＮＡヘアピンを指し、ＡＳＯと等価と見なされ得る（図１１Ａ、Ｂ）。実際には、各シュードノットは、最小限の２つの対合領域を含む。いずれかの一方をヘアピンステムと見なし得るのに対して、他方をヘアピンループとＡＳＯとの間に形成された二重鎖と見なし得る。
【0048】
９３種のシュードノット構造は、広範囲の三次相互作用（主溝および副溝塩基トリプル（第３の塩基がそれぞれ主溝側または副溝側由来の塩基対に接触している、例えば、図３Ｅおよび３Ｃを参照のこと）、非ＷＣ塩基対、および塩基スタッキングが挙げられる）を観察するための試験物質（examiner）であった。これらのうちで、テロメラーゼＲＮＡシュードノット構造は、最も広範囲の三次相互作用を有するものとして際立っている。いくつかのシュードノット構造を、ＡＳＯ－ヘアピン対をデザインし、次いで、その結合を試験するために選択した。実際には、テロメラーゼシュードノットに由来するＡＳＯ－ヘアピン対は、高い結合親和性を示した（図１２）。したがって、この構造を、その後の生化学的特徴付けおよびＡＳＯデザイン作業のためのテンプレートとして使用した。
【0049】
テロメラーゼＲＮＡシュードノット構造から、ＡＳＯがヘアピン標的に結合することができる２つの異なる方法が示唆される（図１１Ａ、Ｂ）。ＡＳＯ１は、主にヘアピン１ループの３’領域と対合する（図１１Ａ）。２つのＡ残基は、ＡＳＯ１の５’末端（シュードノットナンバリングでのＡ３５およびＡ３６）で突出し、副溝側由来のヘアピンステム中の塩基対と接触する（図１１Ｃ）。かかる相互作用はＡ－副溝相互作用（ＲＮＡの折りたたみに重要であり、グループＩイントロンおよびリボゾームＲＮＡなどのＲＮＡで広く認められる三次相互作用型）と呼ばれる１２、１３。ＡＳＯ２は、主に、ヘアピン２ループの５’領域と対合する（図１１Ｂ）。ＡＳＯ２の３’末端の３つのオーバーハンギングＵ残基（シュードノットナンバリング中のＵ８～Ｕ１０）は、主溝側由来のヘアピン２ステム中の塩基対と接触する（図１１Ｅ）。これらのＡＳＯ残基はＷＣ対合に関与していないにしても、それらは別の方法で広範囲の水素結合に携わり、塩基トリプルの連続層が互いに重なり合う。これらの三次相互作用は、結合親和性および構造特異性に寄与するはずである。いくつかの塩基の組み合わせのみが塩基トリプルと適合するので、これらのＡＳＯ残基も直接接触する標的配列の認識に役立つと予想される。「ステムトリプル」の両方の型が、比較的短いループを有するヘアピンを標的にするのに特に有用である。
【0050】
２つのさらなる特徴がＡＳＯデザインに重要である。第１に、副溝および主溝の相互作用の両方が、各ＡＳＯ－ヘアピン対中に存在する。ＡＳＯ１ ５’オーバーハング残基（Ａ３５およびＡ３６；図１１Ａ）が関与する副溝トリプルは、ヘアピン２中の３’ループ残基と、ＡＳＯ２とヘアピン２ループとの間に形成された二重鎖との間に生じる（図１１Ｂ）。同様に、ＡＳＯ２の３’オーバーハング（Ｕ８～Ｕ１０）（図１１Ｂ）が関与する主溝トリプルは、ＡＳＯ１－ヘアピン１ループ二重鎖（図１１Ａ）に携わるためにヘアピン１の５’ループ残基によって使用される。第２の特徴は、フーグスティーン対（Ｕ７とＡ３７との間、シュードノットナンバリング）が二重層の副溝トリプルおよび三重層の主溝トリプルを架橋することである（図１１Ｄ）。このフーグスティーン対は、２つの隣接するセグメントを接続するのに適切な幾何形状のために重要である。
【0051】
塩基トリプルの相互作用は、高親和性結合に不可欠である
ＡＳＯ－ヘアピン対中の塩基トリプルを破壊し、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を使用してその親和性を測定した（図１２Ａ～Ｄ）。Ｋｄ値は、ＡＳＯ１／ヘアピン１については７０±１０ｎＭであり、ＡＳＯ２／ヘアピン２については２８±４ｎＭである（図１２Ａ、Ｂ）。２つの５’Ａオーバーハングを欠失させると、ヘアピン１へのＡＳＯ１結合が１／８まで低下し、副溝トリプルの重要性が示された（図１２Ｃ）。ヘアピン１ループの５’末端の３つのＵ残基をＣに変異させると、結合が１／１０超まで減少し、ＡＳＯ１－ヘアピン１結合への主溝トリプルの重大な寄与が強調された。ＡＳＯ２中の３つのＵオーバーハンギング残基を短縮すると、ヘアピン２への結合が１／２０に低下した（図１２Ｄ）。したがって、置換（ヘアピン１中）および短縮（ＡＳＯ２中）の両方は、主溝塩基トリプルの重要性を実証している。ヘアピン２ループ中のＡ３６およびＡ３７を２つのＣ残基で置換すると、ＡＳＯ２結合が１／１３０に劇的に破壊された。このことにより副溝塩基トリプルの重要性が確認され、副溝トリプルはヘアピンループ中に生じるときの方が貢献度が高いことを証明している。２つのヘアピン－ＡＳＯ対についての変異誘発の結果は、シュードノット構造中に認められる塩基トリプルがＡＳＯ－ヘアピン複合体中で保存されている可能性があることを示唆している。
ＡＳＯ－ヘアピン対中の塩基トリプルを破壊し、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を使用してその親和性を測定した（図１２Ａ～Ｄ）。Ｋｄ値は、ＡＳＯ１／ヘアピン１については７０±１０ｎＭであり、ＡＳＯ２／ヘアピン２については２８±４ｎＭである（図１２Ａ、Ｂ）。２つの５’Ａオーバーハングを欠失させると、ヘアピン１へのＡＳＯ１結合が１／８まで低下し、副溝トリプルの重要性が示された（図１２Ｃ）。ヘアピン１ループの５’末端の３つのＵ残基をＣに変異させると、結合が１／１０超まで減少し、ＡＳＯ１－ヘアピン１結合への主溝トリプルの重大な寄与が強調された。ＡＳＯ２中の３つのＵオーバーハンギング残基を短縮すると、ヘアピン２への結合が１／２０に低下した（図１２Ｄ）。したがって、置換（ヘアピン１中）および短縮（ＡＳＯ２中）の両方は、主溝塩基トリプルの重要性を実証している。ヘアピン２ループ中のＡ３６およびＡ３７を２つのＣ残基で置換すると、ＡＳＯ２結合が１／１３０に劇的に破壊された。このことにより副溝塩基トリプルの重要性が確認され、副溝トリプルはヘアピンループ中に生じるときの方が貢献度が高いことを証明している。２つのヘアピン－ＡＳＯ対についての変異誘発の結果は、シュードノット構造中に認められる塩基トリプルがＡＳＯ－ヘアピン複合体中で保存されている可能性があることを示唆している。
【0052】
ヘアピン構造はＡＳＯ標的結合および特異性に重要である
３Ｄ構造（図１１Ａ）は、ＡＳＯとの三次相互作用には標的ＲＮＡがヘアピン立体構造で存在することが必要であることを示唆している。研究において、ヘアピン１ステムを６塩基対から４塩基対に短縮することによって安定なヘアピンステムがその相互作用に重要であるかどうかを試験した（図１２Ｃ）。驚くべきことに、ＡＳＯ１と短縮ヘアピン１との間に結合は検出できなかった。この結果は、ＡＳＯ１は欠失された残基に直接接触しない場合でさえもヘアピン１構造を認識することを示唆している。したがって、構造に基づいたＡＳＯデザインでは、この間接的読み出しが標的－結合特異性をさらに高める。
３Ｄ構造（図１１Ａ）は、ＡＳＯとの三次相互作用には標的ＲＮＡがヘアピン立体構造で存在することが必要であることを示唆している。研究において、ヘアピン１ステムを６塩基対から４塩基対に短縮することによって安定なヘアピンステムがその相互作用に重要であるかどうかを試験した（図１２Ｃ）。驚くべきことに、ＡＳＯ１と短縮ヘアピン１との間に結合は検出できなかった。この結果は、ＡＳＯ１は欠失された残基に直接接触しない場合でさえもヘアピン１構造を認識することを示唆している。したがって、構造に基づいたＡＳＯデザインでは、この間接的読み出しが標的－結合特異性をさらに高める。
【0053】
ヘアピン隣接領域に結合する３Ｄ－ＡＳＯデザインテンプレート
ＡＳＯ１およびＡＳＯ２は、それぞれ、ヘアピン１および２の末端ループに結合する（図１３Ａ、Ｂ）。これらは、本明細書中でテンプレートＡおよびＢと称される。類似の三次相互作用セットを、標的ヘアピンに隣接するＲＮＡ鎖にハイブリッド形成するＡＳＯに操作することができる。標的ＲＮＡ鎖の再接続により、それぞれＡＳＯ１およびＡＳＯ２に同様に結合することができるヘアピン１再接続（Ｈａｉｒｐｉｎ１Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔ）およびヘアピン２再接続（Ｈａｉｒｐｉｎ２Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔ）を誘導した（図１３Ｃ、Ｄ）。実際には、これらは結合はしたが１／３～１／６に親和性が減少し、これは、トポロジー拘束における変化に寄与する。本明細書中でテンプレートＣおよびＤと称されるこれらの誘導デザインテンプレートは、本発明者らの３Ｄデザイン法の利用可能性を広げる。４つのさらなるデザインテンプレートは、図１３に示すテロメラーゼシュードノット構造（合計８つのテンプレート）に由来する。
ＡＳＯ１およびＡＳＯ２は、それぞれ、ヘアピン１および２の末端ループに結合する（図１３Ａ、Ｂ）。これらは、本明細書中でテンプレートＡおよびＢと称される。類似の三次相互作用セットを、標的ヘアピンに隣接するＲＮＡ鎖にハイブリッド形成するＡＳＯに操作することができる。標的ＲＮＡ鎖の再接続により、それぞれＡＳＯ１およびＡＳＯ２に同様に結合することができるヘアピン１再接続（Ｈａｉｒｐｉｎ１Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔ）およびヘアピン２再接続（Ｈａｉｒｐｉｎ２Ｒｅｃｏｎｎｅｃｔ）を誘導した（図１３Ｃ、Ｄ）。実際には、これらは結合はしたが１／３～１／６に親和性が減少し、これは、トポロジー拘束における変化に寄与する。本明細書中でテンプレートＣおよびＤと称されるこれらの誘導デザインテンプレートは、本発明者らの３Ｄデザイン法の利用可能性を広げる。４つのさらなるデザインテンプレートは、図１３に示すテロメラーゼシュードノット構造（合計８つのテンプレート）に由来する。
【0054】
テンプレートＡ～Ｄは、フーグスティーン対（図１３Ａ～Ｄ、黒色の実線）の形成を必要とし、それらが標的配列に適用することができるかどうかについて実質的な制限が課される。本開示は、テロメラーゼシュードノットの構造全体に類似しているが、フーグスティーン対の代わりに主溝セグメントおよび副溝セグメントに接続するためにジヌクレオチドバルジを使用する２つのＲＮＡ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアクセッションコード３Ｐ２２および４ＰＬＸ）に基づいた４つのさらなる３Ｄ－ＡＳＯデザインテンプレートを提供する（図１３Ｅ～Ｈ）。ポリアデニル化核（ＰＡＮ）ＲＮＡは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス由来の非コードＲＮＡである。ＰＡＮは、３’末端でポリ（Ａ）テールに結合し、共にシュードノットを形成し、その減衰を防止する発現および核内繋留エレメント（ＥＮＥ）を含む（図１４）。第２の構造は、転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）と呼ばれるヒト長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の一部である。ＭＡＬＡＴ１の３’領域では、ステムループは、下流Ａリッチトラクトに結合し、それにより、シュードノットを形成する。
【0055】
ＰＡＮ構造およびＭＡＬＡＴ１構造は、テロメラーゼシュードノット中の主溝塩基トリプルとほぼ同一の幾何形状を有する少なくとも５層の主溝塩基トリプルを含む。したがって、８つ全てのデザインテンプレートの主溝セグメントは同一である。ＰＡＮおよびＭＡＬＡＴ１の副溝塩基トリプルもＡ－副溝相互作用であるが、幾何形状は、テロメラーゼシュードノット中の副溝塩基トリプルとは異なる（図６Ｅおよび７Ｄ）。
【0056】
図１３中の８つのデザインテンプレートは、ほとんどの基本的なＲＮＡ構造エレメント（二重鎖）を標的にする。二重鎖は、図１３に例証したＲＮＡヘアピンの一部であることが多いが、テンプレートＣ、Ｄ、Ｇ、およびＨは、任意の二重鎖に適用可能である。二重鎖は機能的に重要であり得るが、機能的に重要な部位の近くに存在しても良い（意図せず存在してもよい）。二重鎖は進化的に保存され得るが、１つの種に特異的でもよい。したがって、本発明は、ＡＳＯ開発に広く適用可能である。
【0057】
３Ｄ－ＡＳＯデザインテンプレートに適合する塩基トリプル
どの配列が構造テンプレートと適合するのかを評価するために、文献およびＲＮＡ Ｂａｓｅ Ｔｒｉｐｌｅ Ｄａｔａｂａｓｅを調査し１４、１５、主溝および副溝塩基トリプルならびにフーグスティーン対を、構造テンプレートで見出された幾何形状に類似する幾何形状を用いて同定した。３Ｄ－ＡＳＯデザイン中のこれらの適合する塩基トリプルの使用は、本発明の重要部分である。
どの配列が構造テンプレートと適合するのかを評価するために、文献およびＲＮＡ Ｂａｓｅ Ｔｒｉｐｌｅ Ｄａｔａｂａｓｅを調査し１４、１５、主溝および副溝塩基トリプルならびにフーグスティーン対を、構造テンプレートで見出された幾何形状に類似する幾何形状を用いて同定した。３Ｄ－ＡＳＯデザイン中のこれらの適合する塩基トリプルの使用は、本発明の重要部分である。
【0058】
本開示では、塩基トリプルをα・β－γとして表示し、ここで、残基βおよびγはＷＣ塩基対を形成し、残基αはいずれかの溝由来のβ－γ対（主に残基βまたはβおよびγの両方）と接触する。３Ｄ－ＡＳＯ残基は、使用したテンプレートおよびテンプレート中のこれらの残基の位置に応じてαまたはβの位置を取る。
【0059】
主溝塩基トリプル
テンプレートＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧの主溝トリプルセグメントでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基はβ位を占有するのに対して、標的ＲＮＡ残基は、α位およびγ位を取る。これらの３Ｄ－ＡＳＯ残基を決定するために、図６に示すように主溝塩基トリプルの表を作成し、表中、各横列は同一のα残基を有し、各縦列は同一のγ残基を有し（共に緑色で示す）、β残基を赤色で示す。これらの塩基トリプルは、塩基トリプルデータベースから同定された全ての適合可能なα／γ組み合わせを対象にしている。
テンプレートＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧの主溝トリプルセグメントでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基はβ位を占有するのに対して、標的ＲＮＡ残基は、α位およびγ位を取る。これらの３Ｄ－ＡＳＯ残基を決定するために、図６に示すように主溝塩基トリプルの表を作成し、表中、各横列は同一のα残基を有し、各縦列は同一のγ残基を有し（共に緑色で示す）、β残基を赤色で示す。これらの塩基トリプルは、塩基トリプルデータベースから同定された全ての適合可能なα／γ組み合わせを対象にしている。
【0060】
いくつかの主溝塩基トリプルは、非ＷＣ対または修飾された塩基に関与する。Ａ－Ｇ対は、ＵまたはＧのいずれかと主溝トリプルを形成することができる（図１６Ｄ、Ｍ）。同様に、Ｇ－Ａ対は、ＣおよびＧと主溝トリプルを形成することができる（図１６Ｈ、Ｌ）。Ｇ－Ｕゆらぎ対は、Ａと主溝トリプルを形成することができる（図１６Ｍ）。さらに、プソイドウリジン（ψ）は、水素結合ドナーを導入することによってフーグスティーン表面にＵを富化する。ψはウリジンの異性体であり、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してウラシル塩基がリボースに付着している。ψは、ｔＲＮＡなどの天然ＲＮＡ中に見出される最も一般的な修飾塩基である。グリコシド結合から開放された窒素は、フーグスティーン表面上に存在し、水素結合ドナーとしての機能を果たすことができる。それにより、Ｕ－Ａ対中でＵをψで置き換えると、ψはＣおよびＡと主溝トリプルを形成することが可能である（図１６Ｇ、Ｐ）。三次相互作用を媒介するためのＡＳＯへの非標準的な対および修飾された塩基の導入は、本発明の革新的な態様である。これらの特徴は必ずしもあらゆる３Ｄ－ＡＳＯデザインで使用されないが、これらの特徴が含まれる場合、これらの特徴により、本明細書中に開示の方法を使用してデザインされたＡＳＯに従来のデザインを超える重要な特徴が提供される。
【0061】
テンプレートＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨの主溝セグメントでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基はα位を占める。これらの３Ｄ－ＡＳＯ残基を決定するために、図１７に示すように主溝塩基トリプルの表を作成し、この表は、図１６に示したトリプルのサブセットを含む。これらのトリプルは、構造テンプレートとアイソステリックである。
【0062】
フーグスティーン対
テンプレートＡ～Ｄ中のフーグスティーン対を満たすために、核酸データベースを調査して、類似の幾何形状と対合する塩基組み合わせの群を同定した（図１８）。Ｇは、そのＷＣ表面を、ＡまたはＧのフーグスティーン表面と対合するために使用することができる（図１８Ｂ、Ｃ）。同様に、プロトン化したＣ（Ｃ＋）は、Ｇと対合することができる（図１８Ｄ）。プロトン化は、Ｃ－Ｇ相互作用をｐＨ依存性にし、中性ｐＨで比較的弱くするのに必要である（１８）。さらに、ＡのＷＣ表面と対合することができるフーグスティーン表面を有する残基が望ましい。１つの解決法は、ＣおよびＡの両方とフーグスティーン対を形成することができるプソイドウリジン（ψ）を使用することである（図１７Ｅ、Ｆ）。
テンプレートＡ～Ｄ中のフーグスティーン対を満たすために、核酸データベースを調査して、類似の幾何形状と対合する塩基組み合わせの群を同定した（図１８）。Ｇは、そのＷＣ表面を、ＡまたはＧのフーグスティーン表面と対合するために使用することができる（図１８Ｂ、Ｃ）。同様に、プロトン化したＣ（Ｃ＋）は、Ｇと対合することができる（図１８Ｄ）。プロトン化は、Ｃ－Ｇ相互作用をｐＨ依存性にし、中性ｐＨで比較的弱くするのに必要である（１８）。さらに、ＡのＷＣ表面と対合することができるフーグスティーン表面を有する残基が望ましい。１つの解決法は、ＣおよびＡの両方とフーグスティーン対を形成することができるプソイドウリジン（ψ）を使用することである（図１７Ｅ、Ｆ）。
【0063】
テンプレートＡ～Ｄについての副溝塩基トリプル
テンプレートＡおよびＣでは、ＡＳＯ１の５’領域は、ヘアピンステムと副溝トリプルを形成する（図１３Ａ、Ｃ）。この位置では、（図１９）。テンプレートＢでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基は、標的ヘアピンループの５’側と対合し、他方との副溝塩基トリプルに携わる（図１３Ｂ）。テンプレートＤでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基は、二重鎖の３’隣接領域と対合し、５’隣接鎖と副溝塩基トリプルを形成する（図１３Ｄ）。これらの塩基トリプルでは、ＡＳＯ残基はβ位を取る。そうでなければ、副溝塩基トリプルの本質的に同一のリストを使用することができる（図２０）。ＡＳＯバックボーンを化学修飾する。一般的に使用される修飾としては、ホスホロチオアート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。どのようにしてこれらの修飾がこれらの副溝相互作用に影響を与えるのかについては、依然として実験によって決定されていない。
テンプレートＡおよびＣでは、ＡＳＯ１の５’領域は、ヘアピンステムと副溝トリプルを形成する（図１３Ａ、Ｃ）。この位置では、（図１９）。テンプレートＢでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基は、標的ヘアピンループの５’側と対合し、他方との副溝塩基トリプルに携わる（図１３Ｂ）。テンプレートＤでは、３Ｄ－ＡＳＯ残基は、二重鎖の３’隣接領域と対合し、５’隣接鎖と副溝塩基トリプルを形成する（図１３Ｄ）。これらの塩基トリプルでは、ＡＳＯ残基はβ位を取る。そうでなければ、副溝塩基トリプルの本質的に同一のリストを使用することができる（図２０）。ＡＳＯバックボーンを化学修飾する。一般的に使用される修飾としては、ホスホロチオアート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。どのようにしてこれらの修飾がこれらの副溝相互作用に影響を与えるのかについては、依然として実験によって決定されていない。
【0064】
テンプレートＥ～Ｈについての副溝塩基トリプル
これらの塩基トリプルは、Ａ－副溝相互作用にも属するが、テンプレートＡ～Ｄとは異なる幾何形状を有する。特定の理論に拘束されないが、Ａ残基のみがかかる相互作用を媒介することができる場合がある。
これらの塩基トリプルは、Ａ－副溝相互作用にも属するが、テンプレートＡ～Ｄとは異なる幾何形状を有する。特定の理論に拘束されないが、Ａ残基のみがかかる相互作用を媒介することができる場合がある。
【0065】
３Ｄ－ＡＳＯデザインのための例証となる方法
３Ｄ－ＡＳＯをデザインするための手順は、典型的には、以下の工程を含む：
３Ｄ－ＡＳＯをデザインするための手順は、典型的には、以下の工程を含む：
【0066】
標的に対するＲＮＡ配列を同定する
これらの配列としては、エクソン、ｍＲＮＡスプライス部位、スプライシングに重要なイントロン領域、プログラムされたリボソームフレームシフトエレメント、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位、タンパク質結合部位、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始部位、および５’および３’ＵＴＲ中の他の機能的に重要な部位が挙げられるが、これらに限定されない。この工程は、従来のＡＳＯデザイン方法および構造に基づいたＡＳＯデザイン方法の両方において一般的な手法である。
これらの配列としては、エクソン、ｍＲＮＡスプライス部位、スプライシングに重要なイントロン領域、プログラムされたリボソームフレームシフトエレメント、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位、タンパク質結合部位、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始部位、および５’および３’ＵＴＲ中の他の機能的に重要な部位が挙げられるが、これらに限定されない。この工程は、従来のＡＳＯデザイン方法および構造に基づいたＡＳＯデザイン方法の両方において一般的な手法である。
【0067】
標的ＲＮＡの構造を同定する
これらの構造は、以前の報告に由来するか、あるいはＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１６およびＭＦＯＬＤ１７などのＲＮＡ二次構造予測プログラムを使用して予想することができる。三次元構造が歓迎されるが、必要ではない。ＲＮＡ二次構造予測プログラムは、殆どの場合、自由エネルギーレベルの低い一連の構造を提供する。通常、ＲＮＡ構造は、上位の予測の間で高頻度に生じる。これらの構造は信頼性が高く、それにより、３Ｄ－ＡＳＯデザインの適切な標的と見なされる。比較的弱いまたは信頼性が低い構造は、デザインプロセスにおいて無視される。
これらの構造は、以前の報告に由来するか、あるいはＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１６およびＭＦＯＬＤ１７などのＲＮＡ二次構造予測プログラムを使用して予想することができる。三次元構造が歓迎されるが、必要ではない。ＲＮＡ二次構造予測プログラムは、殆どの場合、自由エネルギーレベルの低い一連の構造を提供する。通常、ＲＮＡ構造は、上位の予測の間で高頻度に生じる。これらの構造は信頼性が高く、それにより、３Ｄ－ＡＳＯデザインの適切な標的と見なされる。比較的弱いまたは信頼性が低い構造は、デザインプロセスにおいて無視される。
【0068】
さらに、標的ＲＮＡの構造は、遊離状態とＡＳＯ結合状態とで同一である必要はない。時折、以下に示す例のような標的ＲＮＡ構造を破壊することを目的とする（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプログラムされたリボソームフレームシフトエレメントを標的にする３Ｄ－ＡＳＯ）。かかる状況では、３Ｄ－ＡＳＯは、前述の構造の一部または別の構造上に存在することができる。
【0069】
デザインテンプレートを適用する
本開示は、一般的な手順および検討事項を記載する。適切なヘアピン構造または二重鎖構造が同定された時点で、デザインテンプレートを適用して３Ｄ－ＡＳＯ配列を生成することができる。デザインテンプレートから５’末端または３’末端の配列のいずれかを得ることができるのに対して、残りを配列相補性によって決定する。２つのＲＮＡ構造が標的中で適切に離れている場合、図１３に示した３Ｄテンプレートを使用してＡＳＯの両方の末端をデザインし得る。
本開示は、一般的な手順および検討事項を記載する。適切なヘアピン構造または二重鎖構造が同定された時点で、デザインテンプレートを適用して３Ｄ－ＡＳＯ配列を生成することができる。デザインテンプレートから５’末端または３’末端の配列のいずれかを得ることができるのに対して、残りを配列相補性によって決定する。２つのＲＮＡ構造が標的中で適切に離れている場合、図１３に示した３Ｄテンプレートを使用してＡＳＯの両方の末端をデザインし得る。
【0070】
テンプレートＡ～Ｄについて、最強の拘束は、主溝セグメントおよび副溝セグメントを架橋しているフーグスティーン対に由来する。したがって、これらのテンプレートに基づいた３Ｄ－ＡＳＯデザインにおける最初の工程は、フーグスティーン対を操作することができるかどうかを確かめることである。できる場合、主溝および副溝の相互作用を最適にするために、このデザインをいずれかのサイドに広げる。できない場合、標的ＲＮＡ構造の動的バリアントを調査するか（以下を参照のこと）、あるいは、主溝セグメントおよび副溝セグメントを架橋するためにフーグスティーン対を必要としないテンプレートＥ～Ｈを適用する。
【0071】
テンプレートＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧでは、５’末端ＡＳＯ残基は、標的のその副溝由来のヘリックス構造を認識するが、その配列に対する特異性が制限される。したがって、典型的には、副溝トリプルセグメント中の２～３個の３Ｄ－ＡＳＯ残基のみを専用にし得る。図１６中の情報を使用して、主溝セグメント中の３Ｄ－ＡＳＯ配列を決定することができる。
【0072】
テンプレートＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨでは、副溝セグメントの層の数は、標的中の特定の位置のＡ（またはＣ）残基の存在に大きく左右される。図１７中の情報を使用して、主溝セグメント中の３Ｄ－ＡＳＯ配列を決定することができる。
【0073】
標的ＲＮＡ構造の動的バリアント：ＲＮＡ構造は、動的であり、ヘアピンまたは二重鎖の末端の塩基対が頻繁に開閉することが知られている。いくつかの環境では、さらなる塩基対（非標準的および標準的）を付加することができる。この性質により、低い自由エネルギーコストでこれらのバリアントを標的にする３Ｄ－ＡＳＯをデザインすることが可能となる。動的バリアントの標的例を、デュシェンヌ型筋ジストロフィ治療のための３Ｄ－ＡＳＯに見出すことができる（図２５Ｂ～Ｄ）。
【0074】
ヘアピンループを標的にする場合の検討事項：ＲＮＡヘアピンループは、タンパク質の結合およびｍｉｃｒｏＲＮＡの変異の制御などの重要な生物学的機能を媒介することが示されている。しかしながら、二次構造予測プログラムは、必ずしも安定ではないループ領域中に塩基対を導入する傾向がある。典型的な実施形態では、通常、ヘアピンステムから離れた塩基対を無視することができる。これにより、十分な長さ（１３ｎｔ超）を有する３Ｄ－ＡＳＯをデザインすることができるほどの長さのいくつかのヘアピンループがもたらされる。ヒトゲノムは、１０９塩基対を含む。意図しないマッチ、ひいては非特異的結合を回避するために少なくとも１３ｎｔを必要とすると推定される。
【0075】
一連の３Ｄ－ＡＳＯデザイン
本明細書中に開示の構造に基づいたデザイン方法により、種々の開発段階のＡＳＯ薬および薬物候補を改良することが可能となる。以下の開示は、一連の３Ｄ－ＡＳＯデザインを例として提供する。以下に認められるように、３Ｄ－ＡＳＯは、幾何学的適合性および三次相互作用を最適にするようにデザインされた非標準的な対であることに起因して、その標的に対して配列が完全に相補的ではない。これは、本明細書中に開示のデザイン方法の特徴である。また、これらのデザインは、プソイドウリジン（ψ）などの修飾塩基を含む。
本明細書中に開示の構造に基づいたデザイン方法により、種々の開発段階のＡＳＯ薬および薬物候補を改良することが可能となる。以下の開示は、一連の３Ｄ－ＡＳＯデザインを例として提供する。以下に認められるように、３Ｄ－ＡＳＯは、幾何学的適合性および三次相互作用を最適にするようにデザインされた非標準的な対であることに起因して、その標的に対して配列が完全に相補的ではない。これは、本明細書中に開示のデザイン方法の特徴である。また、これらのデザインは、プソイドウリジン（ψ）などの修飾塩基を含む。
【0076】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを標的にする３Ｄ－ＡＳＯ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写制御配列（ＴＲＳ）およびフレームシフト刺激エレメント（ＦＳＥ）との広範囲の塩基トリプル相互作用およびフーグスティーン塩基対合相互作用を構築するいくつかの３Ｄ－ＡＳＯをデザインした（図２１ａ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写制御配列（ＴＲＳ）およびフレームシフト刺激エレメント（ＦＳＥ）との広範囲の塩基トリプル相互作用およびフーグスティーン塩基対合相互作用を構築するいくつかの３Ｄ－ＡＳＯをデザインした（図２１ａ）。
【0077】
ＦＳＥを標的にするＰＲＦ３ｐ
コロナウイルスには、プログラムされた－１リボゾームフレームシフト（ＰＲＦ）を導入し、かつ必要不可欠なＯＲＦ１ｂを翻訳するためのＦＳＥが必要である。ＦＳＥは、滑りやすい配列およびアテニュエーターヘアピンに先行するシュードノット構造を含む（図２１ｂ）。翻訳中に、リボソームは、シュードノットによって滑りやすい部位で停止させられ、このプロセスがリボソームに１ヌクレオチド分スリップバックする機会を与え、その後にシュードノットを破壊し、翻訳を継続することができる１８。フレームシフトがない場合、リボソームは下流終止コドンと遭遇して外れ、タンパク質１ａが産生される。フレームシフトがある場合、リボゾームはＯＲＦ１ｂの翻訳を完了してタンパク質１ａ－１ｂを生成する。
コロナウイルスには、プログラムされた－１リボゾームフレームシフト（ＰＲＦ）を導入し、かつ必要不可欠なＯＲＦ１ｂを翻訳するためのＦＳＥが必要である。ＦＳＥは、滑りやすい配列およびアテニュエーターヘアピンに先行するシュードノット構造を含む（図２１ｂ）。翻訳中に、リボソームは、シュードノットによって滑りやすい部位で停止させられ、このプロセスがリボソームに１ヌクレオチド分スリップバックする機会を与え、その後にシュードノットを破壊し、翻訳を継続することができる１８。フレームシフトがない場合、リボソームは下流終止コドンと遭遇して外れ、タンパク質１ａが産生される。フレームシフトがある場合、リボゾームはＯＲＦ１ｂの翻訳を完了してタンパク質１ａ－１ｂを生成する。
【0078】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に必要不可欠なＰＲＦを排除することを目的とした、シュードノット構造を破壊する３Ｄ－ＡＳＯをデザインした。このシュードノットは、ステム１～３を含む（図２１ｂ）。この実施形態は、リボソームが滑りやすい部位の下流の位置で停止しないか、停止するようにステム１および２を破壊するようにデザインされる。図２１ｃに示したデザインＰＲＦ３ｐは、テンプレートＤに随伴する。この２２－ｎｔオリゴは、ステム３の３’側のすぐ隣接する領域にハイブリッド形成し、３つの主溝塩基トリプル、５つの副溝塩基トリプル、およびその間のフーグスティーン対に携わる（図２１ｄ～ｇ）。承認薬で示されたその並外れた安定性、中性のバックボーン、および安全性のために、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）修飾を選択した１９。
【0079】
ＴＲＳを標的にするＳＢＤ１およびＳＢＤ１－Ｔ１５Ａ
テンプレートＢを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳを標的にする３Ｄ－ＡＳＯをデザインした。これらの３Ｄ－ＡＳＯは、以前に報告された１Ｄデザインを改良したものである。２００５年に、Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡを標的にする９つのＡＳＯをデザインし、そのうちのいくつかが培養細胞中でのウイルスの様々な程度の抑制に有効であることを見出した２０。最も有効なもの（文献ではＴＲＳ２と称されているが、本発明ではＴＲＳ（転写制御配列の略語）との混同を避けるためにＰＲＥＶと呼ぶ）は、１０～２０μＭでＴＲＳへの結合によってウイルスを抑制する。著者らは、標的ＴＲＳ領域がヘアピンに折りたたまれていることを提案していた。しかしながら、２１－ｎｔ ＰＲＥＶは、ヘアピンループのほぼ全体と相補的である（図２１ａ）。結果として、相当な数のＰＲＥＶ塩基が標的にハイブリッド形成できないか、あるいは、ヘアピンステムを破壊するのに必要な自由エネルギーを消費してハイブリッド形成する。いずれの場合にも、ＰＲＥＶは、意図する結合親和性および結合特異性を達成することができず、任意の非対合ＰＲＥＶ残基のみが非特異的結合に寄与する。
テンプレートＢを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳを標的にする３Ｄ－ＡＳＯをデザインした。これらの３Ｄ－ＡＳＯは、以前に報告された１Ｄデザインを改良したものである。２００５年に、Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡを標的にする９つのＡＳＯをデザインし、そのうちのいくつかが培養細胞中でのウイルスの様々な程度の抑制に有効であることを見出した２０。最も有効なもの（文献ではＴＲＳ２と称されているが、本発明ではＴＲＳ（転写制御配列の略語）との混同を避けるためにＰＲＥＶと呼ぶ）は、１０～２０μＭでＴＲＳへの結合によってウイルスを抑制する。著者らは、標的ＴＲＳ領域がヘアピンに折りたたまれていることを提案していた。しかしながら、２１－ｎｔ ＰＲＥＶは、ヘアピンループのほぼ全体と相補的である（図２１ａ）。結果として、相当な数のＰＲＥＶ塩基が標的にハイブリッド形成できないか、あるいは、ヘアピンステムを破壊するのに必要な自由エネルギーを消費してハイブリッド形成する。いずれの場合にも、ＰＲＥＶは、意図する結合親和性および結合特異性を達成することができず、任意の非対合ＰＲＥＶ残基のみが非特異的結合に寄与する。
【0080】
ＳＢＤ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを標的にするためにＰＲＥＶから改変された３Ｄ－ＡＳＯであった。ＴＲＳ領域中の配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間でほとんど同一であり、一塩基置換によりＵ－Ｇ対がＵ－Ａ対に変化している（図２２ａ）。したがって、ＴＲＳを標的にするＡＳＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を同様に抑制するはずである。ＳＢＤ１は、ＰＲＥＶと１４個のヌクレオチドを共有し、これらのヌクレオチドがループの５’領域とＷＣ塩基対を形成し、それにより、９個の３’－ループ残基がヘアピンステムに接続し直すようにする（図２２ｂ）。また、ＳＢＤ１は、ヘアピンステム塩基対との主溝塩基トリプルおよびループの３’末端（３’－１）Ａ残基とのフーグスティーン対を形成する５個の残基（3′-TCTTT（配列番号２５））を含む（図２２ｃ～ｆ）。３’ループ領域の２つのさらなるＡ残基（３’－２および３’－３）は、ＳＢＤ１－ループ二重鎖と副溝塩基トリプルを形成することができる（図２２ｇ、ｈ）。これらの塩基トリプルおよびフーグスティーン対合相互作用は、ＡＳＯ－ヘアピン複合体をさらに安定化する強力な塩基スタッキングを伴う。他のＳＢＤ１残基は、ＴＲＳヘアピンループ（コアＴＲＳ配列ACGAAC（配列番号６）の３個の５’残基を含む）とＷＣ対を形成する。したがって、ＳＢＤ１は、不連続転写を中断させると予想される。
【0081】
ＴＲＳ領域を標的にするための３Ｄ－ＡＳＯのデザインは、代替二次構造によって複雑になる。ＲＮＡが代替構造に折りたたまれることは珍しくない；したがって、構造に基づいたＡＳＯデザイン法は、これらの全てを考慮しなければならない。二次構造の予測およびＳＨＡＰＥ分析では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ゲノムＲＮＡの５’領域が４つのステムループ構造を含む構造に折りたたまれることを強く示唆していた（図２２ｉ）２１～２６。Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．が提唱したＴＲＳヘアピンに折りたたまれる配列は、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４の５’領域、およびこれらの間のリンカーを占める。
【0082】
ＳＢＤ１は、代替構造のＳＬ２と広範囲の三次相互作用を構築することができる（図２２ｊ）。ＳＬ２は、５塩基対ステムおよびペンタループを含む。テンプレートＡを介してＳＢＤ１に結合するために、ＳＬ２、Ｇ４５－Ｃ５９、およびＡ４６－Ｕ５８の塩基での２つの塩基対を、ＳＢＤ１との相互作用（ＳＬ２－Ａ２４６とＳＢＤ１－Ｔ１６との間のフーグスティーン対、ＳＬＣ２－Ｕ５８とＳＢＤ１－Ｔ１５との間の非標準的な対、およびＳＬ２－Ｃ５９とＳＢＤ１－Ｇ１４との間のＷＣ対を含む）で置き換える。ＳＢＤ１の３’末端の３個の残基（Ｔ１９、Ｃ１８、およびＴ１７）がＳＬ２ステムと主溝塩基トリプルを形成し、予想されるＴＲＳヘアピンとの相互作用に類似する構造（図２２ｊの図１３ｂとの比較）を認識することができることが重要である。強力な副溝相互作用は予想されない。この代替の結合様式では、ＳＬ３は、ヘプタループを有する４個の塩基対のみを含み、非常に不安定であるとは予想されない。ＳＢＤ１は、ＷＣ塩基対合を介してＳＬ２を破壊するようにデザインされている。概して、標的構造の一部を破壊しなければならず、かつ代替構造との三次相互作用がより少ないにもかかわらず、ＳＢＤ１は、両方の潜在的な構造に顕著に結合することができる。
【0083】
ＳＢＤ１のバリアントであるＴ１５Ａもデザインした。代替ＴＲＳ構造に結合する場合、Ｔ１５Ａ変異は、非標準的なＴ・Ｕ対をＡ－Ｕ対で置き換える（図２２ｋ）。単一ヘアピン構造に結合する場合、Ａ１５残基は、３’－１位のＡとのフーグスティーン対を媒介することができない。その代わりとして、Ａ１５は、５’－１位のＵと対合し、次いで、Ａ（３’＋１）とのその対合を破壊することができる（図２２ｌ）。次いで、ＳＢＤ１－Ｔ１５ＡのＴ１６残基は、Ａ（３’＋１）とフーグスティーン対を形成することができ、Ｔ１７～Ｔ１９はＳＢＤ１と同様に主溝塩基トリプルを形成することが可能である。概して、ＳＢＤ１－Ｔ１５Ａバリアントは、両方のＴＲＳ構造との三次相互作用を構築することができ、代替標的構造との相互作用をより最適にすることができる。
【0084】
デュシェンヌ型（Ｄｕｃｈｅｎｅ）筋ジストロフィを処置するための３Ｄ－ＡＳＯデザイン
デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、ほぼ例外なく男児が罹患する進行性の筋力低下および筋肉疲労を特徴とする稀な遺伝的障害である。ＮＩＨ遺伝・希少疾患（ＧＡＲＤ）情報センターによれば、ＤＭＤは、全世界の出生男児３，５００～５，０００人におよそ１人が罹患する。治癒はない。症状の管理および生活の質の改善のために理学療法およびホルモン剤が使用される。近年は治療法が改善されているにもかかわらず、患者はローティーンで車椅子に拘束されるようになり、非常に短命で、典型的には３０代で死亡する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、ほぼ例外なく男児が罹患する進行性の筋力低下および筋肉疲労を特徴とする稀な遺伝的障害である。ＮＩＨ遺伝・希少疾患（ＧＡＲＤ）情報センターによれば、ＤＭＤは、全世界の出生男児３，５００～５，０００人におよそ１人が罹患する。治癒はない。症状の管理および生活の質の改善のために理学療法およびホルモン剤が使用される。近年は治療法が改善されているにもかかわらず、患者はローティーンで車椅子に拘束されるようになり、非常に短命で、典型的には３０代で死亡する。
【0085】
ＤＭＤは、筋繊維の強度を支持するジストロフィンと呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子の変異に原因する。この３年間で、ＡＳＯ薬は、ＤＭＤが処置される見込みを示した。４つのＡＳＯ薬がＤＭＤ処置用として米国ＦＤＡに承認されている。
【0086】
エテプリルセンおよびゴロディルセン
エテプリルセンおよびゴロディルセンは、ジストロフィン翻訳の読み枠を変化させる変異に原因する特定のＤＭＤ型を処置するためにＳａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された。約１３％および８％のＤＭＤ患者がこれらのカテゴリーに含まれる。エテプリルセンは、エクソン５１に結合してｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中にエクソン５１がスキップされ、それにより、適切な翻訳読み枠が修復される３０－ヌクレオチドＡＳＯである。この「エクソンスキッピング治療」は、部分的に機能するジストロフィンタンパク質を産生し、疾患の重症度を低下させる。ゴロディルセンは、エクソン５３に結合してスキップさせる２５－ヌクレオチドＡＳＯである。
エテプリルセンおよびゴロディルセンは、ジストロフィン翻訳の読み枠を変化させる変異に原因する特定のＤＭＤ型を処置するためにＳａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された。約１３％および８％のＤＭＤ患者がこれらのカテゴリーに含まれる。エテプリルセンは、エクソン５１に結合してｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中にエクソン５１がスキップされ、それにより、適切な翻訳読み枠が修復される３０－ヌクレオチドＡＳＯである。この「エクソンスキッピング治療」は、部分的に機能するジストロフィンタンパク質を産生し、疾患の重症度を低下させる。ゴロディルセンは、エクソン５３に結合してスキップさせる２５－ヌクレオチドＡＳＯである。
【0087】
２０１６年のエテプリルセンの迅速承認は、刺激的かつ論争の的となった。この薬物は、ジストロフィンタンパク質産生を部分的に修復することができた。このクラスにおける先駆者として、新規のエクソンスキッピング機構が作用することが証明された。しかしながら、エテプリルセンは、臨床的にほんのわずかしか有効でなく、標準的な歩行試験において有意な改善を示さない。２人のＦＤＡ調査委員会のメンバーが抗議のために辞任した。２０１８年に、欧州医薬品庁は、その承認を拒否した。さらに、エテプリルセンは高額であり、患者あたり年間３００，０００ドルの費用がかかる。したがって、有効性が高いデザインに改良し、費用を下げることが重要である。
【0088】
エクソン５１をスキップするための３Ｄ－ＡＳＯデザイン
エクソン－５１上のエテプリルセン結合部位および周囲の配列は、信頼性が高いと予想されるヘアピン構造に折りたたまれる（図２３Ａ）。エテプリルセンとその標的との間の塩基対合は、ヘアピン立体構造と構造的に適合しない（すなわち、エテプリルセンは、ヘアピン中の塩基対を破壊しなければならず、その後にエクソンと完全に結合することができる）。それを行うために消費されるエネルギーは、その結合親和性および結合特異性を低下させる。
エクソン－５１上のエテプリルセン結合部位および周囲の配列は、信頼性が高いと予想されるヘアピン構造に折りたたまれる（図２３Ａ）。エテプリルセンとその標的との間の塩基対合は、ヘアピン立体構造と構造的に適合しない（すなわち、エテプリルセンは、ヘアピン中の塩基対を破壊しなければならず、その後にエクソンと完全に結合することができる）。それを行うために消費されるエネルギーは、その結合親和性および結合特異性を低下させる。
【0089】
ヘアピン構造と適合するだけでなく、広範囲のさらなる三次相互作用も構築する２つの３Ｄ－ＡＳＯ（ＤＭＤ１およびＤＭＤ２）をデザインした（図２３Ｂ～Ｎ）。ＤＭＤ１およびＤＭＤ２は、それぞれヘアピンループの５’および３’領域に結合する（図２３Ｂ、Ｈ）。これらの両方は、標的ＲＮＡとの水素結合を、ＷＣ塩基対中で認められる水素結合よりも多数形成する（図２３Ｃ～Ｅ、２３Ｇ～Ｎ）。これらのさらなる相互作用から獲得され、ヘアピンステムを破壊する必要性がないことによって確保される自由エネルギーにより、本発明者らのＡＳＯは、それらがより短かったとしても（それぞれＤＭＤ１およびＤＭＤ２について１９および１８ヌクレオチド）、高い親和性および特異性で標的ＲＮＡに結合することが可能なはずである。より短い配列は、大きな利点（送達がより容易なこと、合成コストがより低いこと、および先天免疫を引き起こす機会がより低いことが挙げられる）もある。
【0090】
エクソン４４をスキップするための３Ｄ－ＡＳＯデザイン
ヒトＤＭＤエクソン４４配列（１４８ｎｔ）は、以下である。
２００７年にＷｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２７によって報告され、その後にＣａｒｒｉｅ Ｍｉｃｅｌｉのグループ２８によって研究された２４－ｎｔ Ｈ４４Ａ ＡＳＯは、以下の配列を有する：
ヒトＤＭＤエクソン４４配列（１４８ｎｔ）は、以下である。
【化6】
【化7】
【0091】
Ｈ４４Ａは、エクソン残基６１～８４にアニールする。
エクソン４４の二次構造予測から、図２７Ａに示した構造（残基４８～１１６）が得られる：
エクソン４４の二次構造予測から、図２７Ａに示した構造（残基４８～１１６）が得られる：
【0092】
エクソン４４中の位置を得るために図面中のナンバリングに４７が付加される必要があることに留意のこと。
Ｈ４４Ａは１４～３７位にアニールし、その最も近い残基は、第３のステムループから２ヌクレオチド離れている（図２４ａも参照のこと）。
Ｈ４４Ａは１４～３７位にアニールし、その最も近い残基は、第３のステムループから２ヌクレオチド離れている（図２４ａも参照のこと）。
【0093】
ＤＭＤ４４－３Ｄ１およびＤＭＤ４４－３Ｄ２を、それぞれテンプレートＣおよびＧに基づいてデザインした（図２４ｂ、ｃ）。
【0094】
さらに、本明細書中に開示の方法は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの文脈においてＡＳＯ結合部位の折りたたみを考慮することができる。これを、本発明の典型的な方法で日常的に行う。３’イントロンの存在により、図２７Ｂに示した代替構造を得た：
【0095】
グラフ上の残基８８で終結するエクソン４４中の位置を得るためにナンバリングに６０が付加される必要があることに留意のこと。残基８９以降は、イントロン４４～４５に属する。
ＤＭＤ４４－３Ｄ３およびＤＭＤ４４－３Ｄ４を、それぞれテンプレートＣおよびＧに基づいてデザインした（図２４ｄ、ｅ）。
ＤＭＤ４４－３Ｄ３およびＤＭＤ４４－３Ｄ４を、それぞれテンプレートＣおよびＧに基づいてデザインした（図２４ｄ、ｅ）。
【0096】
ＤＭＤエクソン４５をスキップするための３Ｄ－ＡＳＯデザイン
ヒトエクソン４５配列（１７６ｎｔ）は、以下である。
ヒトエクソン４５配列（１７６ｎｔ）は、以下である。
【化8】
【0097】
直近の５’イントロン５０－ｎｔ配列は以下である。
【化9】
【0098】
２００７年にＷｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２７によって報告され、その後にＭｉｃｅｌｉのグループ２８によって研究された２６－ｎｔ Ｈ４５Ａ ＡＳＯは、５’スプライス部位にアニールし、下線をつけた残基は隣接するイントロンと対合する（図２５ａ）。Ｈ４５Ａと比較して、ＦＤＡ承認を受けたアモンディス４５（カシメルセン）は、５’末端上のＣおよび３’末端上のＵＡＡ（配列番号５）が除去されている。これは、５’－イントロンにアニールする塩基をわずか３つしか持たない。かかるイントロンとの短い対合でエクソン４５スキッピングを生じるのに十分である。
【0099】
各隣接領域上の５０ｎｔを用いたエクソン４５の二次構造の予測により、上位２０の予測された構造のうちの１９の構造中に常に存在するヘアピンが明らかとなった。上で示したエクソン４５配列中のこのヘアピン配列に下線を引いている。この構造の文脈では、Ｈ４５Ａの５’末端のＣ残基を除去することにより、ヘアピンの５’末端のＧとの結合の競合が回避され、アモンディス４５－標的ＲＮＡ二重鎖をヘアピンと積み重ねることが可能である。したがって、アモンディス４５は２Ｄデザインである。
【0100】
いくつかの３Ｄ－ＡＳＯを、アモンディス４５を改良するようにデザインした（図２５ｂ～ｆ）。ＤＭＤ４５－３Ｄ１は、テンプレートＣを予想されるヘアピンに適用することによるデザインである（図２５ｂ）。ＤＭＤ４５－３Ｄ１では、第３の位置のψは、ヘアピンに隣接する３’Ａとフーグスティーン対を形成する。５’末端の２つのＡ残基は、ヘアピンステムと副溝塩基トリプルを形成する。５層の主溝塩基トリプルは、ＤＭＤ４５－３Ｄ１の残基４～８と標的ＲＮＡとの間に形成される。アモンディス４５からの正味の変化は、５’末端のCAAT（配列番号８）をAAψAGGψ（配列番号７）で置き換えることである。
【0101】
ＤＭＤ４５－３Ｄ２およびＤＭＤ４５－３Ｄ３に対して、ＲＮＡヘリックスの順応性を調査する。ＤＭＤ４５－３Ｄ２は、Ｇ－Ａの非標準的な対によってヘアピンステムを伸長することができると仮定する（図２５ｃ）。そのようなものとして、フーグスティーン対は、ＤＭＤ４５－３Ｄ２の第３の位置のＡおよび標的ヘアピンの３’側のＧによって媒介される。ＤＭＤ４５－３Ｄ１と比較して、ＤＭＤ４５－３Ｄ２は、５’末端のAAψA（配列番号９）をAAA（配列番号１０）で置き換える。ＤＭＤ４５－３Ｄ３は、ヘアピンステムを２つのさらなる塩基対Ｕ・ＧおよびＵ－Ａによってさらに伸長することができると仮定する（図２５ｄ）。ＤＭＤ４５－３Ｄ１と比較して、ＤＭＤ４５－３Ｄ３は、５’末端のAAψA（配列番号９）をAAAψ（配列番号１１）で置き換える。
【0102】
ＤＭＤ４５－３Ｄ４－１および－２は、テンプレートＧをヘアピンに適用することによるデザインである（図２５ｅ、ｆ）。両方の３Ｄ－ＡＳＯでは、２つの５’Ａ残基は、ヘアピンステムと副溝塩基トリプルを形成する。ヘアピンに隣接する２つの５’残基（ＵＧ）ははみ出している。この２つの３Ｄ－ＡＳＯは、主溝塩基トリプルの操作数が互いに異なる。ＤＭＤ４５－３Ｄ４－１は、標的ＲＮＡと７層の主溝塩基トリプルを形成し、そのうちの３つは非標準的な塩基対に関与する（図２５ｅ）。ＤＭＤ４５－３Ｄ４－２は、あまり野心的でないデザインであり、５層の主溝塩基トリプルが２つの非標準的な塩基対に関与する（図２５ｆ）。生化学アッセイおよび機能アッセイを使用して、これらのデザインを比較し、どのデザインが最も強力であるかを決定することができる。
【0103】
ヒトＦＡＮ１を制御するための３Ｄ－ＡＳＯ
ＦＡＮ１は、ファンコニ関連ヌクレアーゼ１である。これは、ＫＩＡＡ１０１８、ＭＴＭＲ１５、ＦＡＮＣＤ２／ＦＡＮＣ１関連ヌクレアーゼ１とも呼ばれる。ＦＡＮ１は、ＤＮＡ鎖間架橋修復に必要であるが、ＤＮＡ二本鎖切断反応に関与しない。ＦＡＮ１は、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２によってＤＮＡ損傷部位に動員される。ＦＡＮ１は、Ｎ末端にＵＢＺ型ユビキチン結合ドメイン、中間にＳＡＰ型ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣ末端に「ＶＲＲ＿ｎｕｃ」ドメインと称されるヌクレアーゼドメインを有する。ＦＡＮ１は、５’フラップに対するエンドヌクレアーゼ活性および５’－３’エキソヌクレアーゼ活性（ＶＲＲ＿ｎｕｃドメインを必要とする）を有する。
ＦＡＮ１は、ファンコニ関連ヌクレアーゼ１である。これは、ＫＩＡＡ１０１８、ＭＴＭＲ１５、ＦＡＮＣＤ２／ＦＡＮＣ１関連ヌクレアーゼ１とも呼ばれる。ＦＡＮ１は、ＤＮＡ鎖間架橋修復に必要であるが、ＤＮＡ二本鎖切断反応に関与しない。ＦＡＮ１は、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２によってＤＮＡ損傷部位に動員される。ＦＡＮ１は、Ｎ末端にＵＢＺ型ユビキチン結合ドメイン、中間にＳＡＰ型ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣ末端に「ＶＲＲ＿ｎｕｃ」ドメインと称されるヌクレアーゼドメインを有する。ＦＡＮ１は、５’フラップに対するエンドヌクレアーゼ活性および５’－３’エキソヌクレアーゼ活性（ＶＲＲ＿ｎｕｃドメインを必要とする）を有する。
【0104】
ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに示されるように、ＦＡＮ１タンパク質は、２つの主要なイソ型で発現される。イソ型１は、１０１７ａ．ａ．および全ての機能ドメインを含む全長タンパク質である。イソ型２は、５３３ａ．ａ．を含み、１～５２６はイソ型１と同一であり、残基５２７～５３３は、イソ型１中のAKALAGQ（配列番号１２）からFCWLLLQ（配列番号１３）に変えられている。イソ型２は、ＶＲＲ－ｎｕｃドメインを含む全長タンパク質中の残基５３４～１０１７を欠き、したがって、機能しないと予想される。したがって、ＲＮＡプロセシング中にイソ型２のｍＲＮＡをイソ型１に転換することによって機能的なＦＡＮ１の発現レベルを増加させることが可能なはずである。４３０、２３７、５７３、３１８、５８７、１０３、および２９８ａ．ａ．長を含む７つのさらなるイソ型をコンピュータによって予測する。
【0105】
より短いタンパク質イソ型をコードするｍＲＮＡイソ型が、選択的スプライシングではなく選択的ポリアデニル化によって生成されることが認められた。ヒトタンパク質アトラスの検索によって、以下の５つのｍＲＮＡバリアントが見出された：
１．ＦＡＮ１－２０１（ＥＮＳＴ０００００３６２０６５．８）は、１０１７ａ．ａ．をコードする（４，８９１ｎｔ長の１５個のエクソン（１３コーディング）を含む）。エクソンおよびイントロンの長さ（ｎｔ）を以下に示し、括弧内の数字はイントロンの長さを示す。
１３９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）２０２（３，０４２）２３４．．．（４３０６）１，５４３
最後のエクソン（１，５４３ｎｔ）は、ポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）配列の複数のコピーを含む。
２．ＦＡＮ１－２０２（ＥＮＳＴ０００００５６１５９４．５）は、５３３ａ．ａ．（イソ型２）をコードする（２，７３８ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
３６（６２６）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，１７５
エクソン４は、１，１７５ｎｔを有し、これは、ＦＡＮ１－２０１中に２０２ｎｔのエクソン４および９７３ｎｔのイントロン４～５を含む。コーディングは、TAA（配列番号１４）終止コドンに到達する前に２２ｎｔ伸長する。これは、ＦＡＮ１－２０１のイントロン４～５またはエクソン５の３’領域を含まない。エクソン４の残基１１４９～１１５４が３’末端（切断部位）から約２０ｎｔであるＰＡＳ（AUUAAA（配列番号１５）、ＰＡＳ１）を含む（ＦＡＮ１－２０２が選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。
３．ＦＡＮ１－２０３（ＥＮＳＴ０００００５６１６０７．５）は、５３３残基のイソ型２をコードする（２，６９０ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
１３３（４８７）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，０３０
エクソン４は１，０３０ｎｔを含み、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２のエクソン４と同一である。エクソン４の残基９９５～１０００が３’末端から約３０ｎｔにＰＡＳ（AAUAAA、（配列番号１６）ＰＡＳ２）を含む（ＦＡＮ１－２０３がこの部位での選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。このＰＡＳもＦＡＮ１－２０２中に存在することに留意のこと。
４．ＦＡＮ１－２０５（ＥＮＳＴ０００００５６２８９２）は、１０５－ａ．ａ．タンパク質をコードする（３４４ｎｔ長の３個のエクソン（全てコーディング）を含む）。
８１（３，５２７）１４１（２，３５５）１２２
エクソン３は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０１、－２０２、および－２０３バリアントのエクソン４と同一である１２２ｎｔを含む。このバリアントは、終止コドン（コード領域で終結する）を持たず、３’末端が不完全のようである。
５．ＦＡＮ１－２０７（ＥＮＳＴ０００００５６５４６６）は、５３３－ａ．ａ．タンパク質をコードする（２，３０４ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
１１９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）６５８
エクソン４は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２および－２０３のエクソン４と同一である６５８ｎｔを含む。ＰＡＳ配列がこの部位で選択的アデニル化を指示するかは不明である。
要するに、転写物ＦＡＮ１－２０２およびＦＡＮ１－２０３の産生は、２つの選択的ＰＡＳ配列によって指示されることが明らかであり、それにより、創薬の機会が提供される。
１．ＦＡＮ１－２０１（ＥＮＳＴ０００００３６２０６５．８）は、１０１７ａ．ａ．をコードする（４，８９１ｎｔ長の１５個のエクソン（１３コーディング）を含む）。エクソンおよびイントロンの長さ（ｎｔ）を以下に示し、括弧内の数字はイントロンの長さを示す。
１３９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）２０２（３，０４２）２３４．．．（４３０６）１，５４３
最後のエクソン（１，５４３ｎｔ）は、ポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）配列の複数のコピーを含む。
２．ＦＡＮ１－２０２（ＥＮＳＴ０００００５６１５９４．５）は、５３３ａ．ａ．（イソ型２）をコードする（２，７３８ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
３６（６２６）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，１７５
エクソン４は、１，１７５ｎｔを有し、これは、ＦＡＮ１－２０１中に２０２ｎｔのエクソン４および９７３ｎｔのイントロン４～５を含む。コーディングは、TAA（配列番号１４）終止コドンに到達する前に２２ｎｔ伸長する。これは、ＦＡＮ１－２０１のイントロン４～５またはエクソン５の３’領域を含まない。エクソン４の残基１１４９～１１５４が３’末端（切断部位）から約２０ｎｔであるＰＡＳ（AUUAAA（配列番号１５）、ＰＡＳ１）を含む（ＦＡＮ１－２０２が選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。
３．ＦＡＮ１－２０３（ＥＮＳＴ０００００５６１６０７．５）は、５３３残基のイソ型２をコードする（２，６９０ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
１３３（４８７）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，０３０
エクソン４は１，０３０ｎｔを含み、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２のエクソン４と同一である。エクソン４の残基９９５～１０００が３’末端から約３０ｎｔにＰＡＳ（AAUAAA、（配列番号１６）ＰＡＳ２）を含む（ＦＡＮ１－２０３がこの部位での選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。このＰＡＳもＦＡＮ１－２０２中に存在することに留意のこと。
４．ＦＡＮ１－２０５（ＥＮＳＴ０００００５６２８９２）は、１０５－ａ．ａ．タンパク質をコードする（３４４ｎｔ長の３個のエクソン（全てコーディング）を含む）。
８１（３，５２７）１４１（２，３５５）１２２
エクソン３は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０１、－２０２、および－２０３バリアントのエクソン４と同一である１２２ｎｔを含む。このバリアントは、終止コドン（コード領域で終結する）を持たず、３’末端が不完全のようである。
５．ＦＡＮ１－２０７（ＥＮＳＴ０００００５６５４６６）は、５３３－ａ．ａ．タンパク質をコードする（２，３０４ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
１１９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）６５８
エクソン４は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２および－２０３のエクソン４と同一である６５８ｎｔを含む。ＰＡＳ配列がこの部位で選択的アデニル化を指示するかは不明である。
要するに、転写物ＦＡＮ１－２０２およびＦＡＮ１－２０３の産生は、２つの選択的ＰＡＳ配列によって指示されることが明らかであり、それにより、創薬の機会が提供される。
【0106】
最近の論文において、ＡＳＯを使用してより短い転写物のポリアデニル化を阻害し、より長いＲＮＡの産生を増加させることができることが報告されている２９。ＦＡＮ１のポリアデニル化および有効な全長タンパク質発現を潜在的にモジュレートする４つの１Ｄ－ＡＳＯ配列をデザインした。
3’-AAAUUACAAAUGAACGAAUAUUUUA-5’（配列番号１７）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１５４～１１２９）
5’-UUUAAUGUUUACUUGCUUAUAAAAU-3’（配列番号１８）（ＦＡＮ１ＡＳＯ１、２５ｎｔ）
3’-GUCGGUCUCCCACCGAUUUAAAUUA-5’（配列番号１９）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１７３～１１４９）
5’-CAGCCAGAGGGUGGCUAAAUUUAAU-3’（配列番号２０）（ＦＡＮ１ＡＳＯ２、２５ｎｔ）
3’-AAAUAACUUCAUGAAAAAUUUUUAG-5’（配列番号２１）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０００～９７６）
5’-UUUAUUGAAGUACUUUUUAAAAAUC-3’（配列番号２２）（ＦＡＮ１ＡＳＯ３、２５ｎｔ）
3’-UAAUUAAUGUUCAUACAUUAAAUAA-5’（配列番号２３）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０２１～９９５）
5’-AUUAAUUACAAGUAUGUAAUUUAUU-3’（配列番号２４）（ＦＡＮ１ＡＳＯ４、２５ｎｔ）
3’-AAAUUACAAAUGAACGAAUAUUUUA-5’（配列番号１７）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１５４～１１２９）
5’-UUUAAUGUUUACUUGCUUAUAAAAU-3’（配列番号１８）（ＦＡＮ１ＡＳＯ１、２５ｎｔ）
3’-GUCGGUCUCCCACCGAUUUAAAUUA-5’（配列番号１９）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１７３～１１４９）
5’-CAGCCAGAGGGUGGCUAAAUUUAAU-3’（配列番号２０）（ＦＡＮ１ＡＳＯ２、２５ｎｔ）
3’-AAAUAACUUCAUGAAAAAUUUUUAG-5’（配列番号２１）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０００～９７６）
5’-UUUAUUGAAGUACUUUUUAAAAAUC-3’（配列番号２２）（ＦＡＮ１ＡＳＯ３、２５ｎｔ）
3’-UAAUUAAUGUUCAUACAUUAAAUAA-5’（配列番号２３）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０２１～９９５）
5’-AUUAAUUACAAGUAUGUAAUUUAUU-3’（配列番号２４）（ＦＡＮ１ＡＳＯ４、２５ｎｔ）
【0107】
３Ｄ－ＡＳＯデザインを実施するために、本明細書中に開示の方法の実施形態は、ＲＮＡ構造を用いてＦＡＮ１－２０２ｍＲＮＡおよびＦＡＮ－２０３ｍＲＮＡの両方のエクソン４についての二次構造予測を実施することを含み、両方のＰＡＳ配列が信頼性の高いヘアピン構造の一部として存在することを見出した。上位２０個の予測配列の全てに存在するヘアピンについての残基１１０５～１１５５。ＰＡＳ配列（AUUAAA（配列番号１５））は、３’末端に存在する（残基１１４９～１１５４）。
【0108】
残基９９３～１０２２は、ＦＡＮ１－２０３エクソン４については上位１９個の予測配列に、ならびに、より長いＦＡＮ１－２０２エクソン４については上位２０個の予測配列のうちの１９個の予測配列に現れるヘアピンを形成する。ＰＡＳ（AAUAA（配列番号２６））は、５’末端に配置されている（残基９９５～１０００）。
【0109】
これらの構造は、潜在的に、ＰＡＳを隔離し、ｍＲＮＡ切断およびポリアデニル化機構によるアクセスを防止することができる。この所見は、これらのＰＡＳ部位がわずかな時間しか使用されない理由を説明し得る。これらの構造およびその隣接領域を標的にするいくつかのＡＳＯ配列をデザインしている（図２６）。
【0110】
効能
２つのリード３Ｄ－ＡＳＯ配列（ＳＢＤ１およびＰＲＦ３ｐＰＭＯ）は、培養ＨＥＫ２９３細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を強力に阻害する。フレームシフティング刺激エレメントに対するＰＲＦ３ｐＰＭＯおよびそのバリアントの阻害活性を、デュアルルシフェラーゼレポートアッセイを使用してさらに確認する。ＭＴＴアッセイは、これらの３Ｄ－ＡＳＯが細胞障害性でないか（ＳＢＤ１）、あるいは、非常に高濃度でのみ毒性である（ＰＲＦ３ｐＰＭＯ）ことを示した。
２つのリード３Ｄ－ＡＳＯ配列（ＳＢＤ１およびＰＲＦ３ｐＰＭＯ）は、培養ＨＥＫ２９３細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を強力に阻害する。フレームシフティング刺激エレメントに対するＰＲＦ３ｐＰＭＯおよびそのバリアントの阻害活性を、デュアルルシフェラーゼレポートアッセイを使用してさらに確認する。ＭＴＴアッセイは、これらの３Ｄ－ＡＳＯが細胞障害性でないか（ＳＢＤ１）、あるいは、非常に高濃度でのみ毒性である（ＰＲＦ３ｐＰＭＯ）ことを示した。
【0111】
上記文章由来の参考文献
【化10-1】
【化10-2】
【化10-3】
【化10-4】
【0112】
以下に詳細に考察するように、本開示は、治療薬および生物医学研究のためにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を構造に基づいてデザインする方法を提供する。これらの方法の中心概念は、結合親和性および特異性を高めるために、ＡＳＯデザイン中に塩基トリプルおよび非標準的な塩基対を組み込むことである。本開示は、様々な価値の高い標的のためのこの方法論の原理のガイドおよびＡＳＯ配列の例証となるデザインを提供する。
【0113】
本明細書中に開示の方法の核心は、構造に基づいたＡＳＯデザインのための一連の指針である。設計原理を、既存のＲＮＡ構造から着想した。本開示は、例えば、モデル系としてヒトテロメラーゼＲＮＡ由来の配列を使用して、これらの設計原理をさらに立証する。短縮および変異の分析は、三次相互作用がＡＳＯ－ヘアピン会合に必要不可欠であることを明確に示している。本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを標的にするＡＳＯのデザインを例示し、設計原理および検証を記載している原稿は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ［プレプリント］．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８（本明細書中で参考として援用される）に見出される。
【0114】
ＲＮＡが生物学および疾患のほぼ全ての態様に関与するので、本明細書中に開示の方法は、ほとんど全ての標的ＲＮＡを特異的に制御するために広く適用可能である。
【実施例】
【0115】
実施例１：表題：アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の構造に基づいたデザイン
本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のための構造に基づいたデザイン方法を提供し、これらの発見を、広範な疾患（ＣＯＶＩＤ－１９が挙げられる）を処置するためのＡＳＯ薬を開発するために使用する。ＡＳＯは新興感染症と戦うのに特に有用な新規の薬物クラスである。ＡＳＯは、標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出す一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。最近、いくつかのＡＳＯ薬が米国食品医薬品局によって承認されており、開発４０年後にしてこのテクノロジーの時代が到来している。原理上、ＡＳＯを、任意の病原性配列を標的にするように迅速に開発することができ、それにより、広範な疾患（デュシェンヌ型筋ジストロフィおよび新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）が挙げられる）を処置することができる。さらに、ＡＳＯ配列を、薬物耐性ウイルス株に対抗するように容易に修飾することができる。
本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のための構造に基づいたデザイン方法を提供し、これらの発見を、広範な疾患（ＣＯＶＩＤ－１９が挙げられる）を処置するためのＡＳＯ薬を開発するために使用する。ＡＳＯは新興感染症と戦うのに特に有用な新規の薬物クラスである。ＡＳＯは、標的ＲＮＡに特異的に結合して所望の生物学的効果および治療効果を引き出す一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。最近、いくつかのＡＳＯ薬が米国食品医薬品局によって承認されており、開発４０年後にしてこのテクノロジーの時代が到来している。原理上、ＡＳＯを、任意の病原性配列を標的にするように迅速に開発することができ、それにより、広範な疾患（デュシェンヌ型筋ジストロフィおよび新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）が挙げられる）を処置することができる。さらに、ＡＳＯ配列を、薬物耐性ウイルス株に対抗するように容易に修飾することができる。
【0116】
従来のＡＳＯデザインは、線状標的配列に沿ったワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に厳密に従う。通常、十分な親和性および特異性を達成するために１８～２５ヌクレオチドを必要とする。しかしながら、ウイルスＲＮＡは、二次構造および三次構造に折りたたまれることが多く、それによりＡＳＯハイブリッド形成を妨害することができる。したがって、従来のＡＳＯデザイストラテジーは、構造化領域を標的にすることを回避するか、あるいは、これらの構造を単純に無視し、高親和性結合剤を同定するために多数のＡＳＯのスクリーニングに依存する。本明細書中に開示のデザインは、三次元（３Ｄ）空間における標的構造と適合し、ＷＣ塩基対合に加えて三次相互作用に携わる。この方法でデザインされたＡＳＯは、三次相互作用の獲得および標的構造を破壊する必要がないことによる自由エネルギーの確保に起因して高められた親和性で標的に結合する。さらに、ＡＳＯが標的配列だけでなく、形状および水素結合パターンも認識するので、結合特異性を、ＷＣ対合相互作用のみによって達成することができる結合特異性を超えて高める。本開示は、構造に基づいてＡＳＯをデザインする方法に関する一連の原理および同定された２つのデザインテンプレートを提供する。結合研究により、これらのデザインにおける三次相互作用の重要性が確認された。
【0117】
新規の薬物型として、ＡＳＯは、革命的な医薬である（１、２）。ＡＳＯハイブリッド形成は、タンパク質結合表面に対する相補性に依存せず、原理として、ワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に従って任意の配列を標的にすることができる。それ故に、ＡＳＯ治療薬は、小分子を用いて容易に創薬可能ではない細胞経路を制御することができる（３）。１９７８年に、Ｚａｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎは、ＡＳＯがｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス複製を阻害することができることを実証した（４、５）。１９９８年に、最初のＡＳＯ薬ホミビルセンが、免疫低下患者におけるサイトメガロウイルス網膜炎（ＣＭＶ）の処置用として承認された。ＨＩＶ薬が開発されたことによってＣＭＶ感染症の症例数が劇的に減少したためにその販売承認は後に取り下げられたが、ホミビルセンにより、抗ウイルス剤としてのＡＳＯの実現可能性および潜在性が実証された。２０１３年以来、６つのＡＳＯ薬が、種々の遺伝的障害の処置用として承認された（ホミビルセン、ミポビルセン、エテプリルセン、ヌシネルセン、イノテルセン、ボランソルセン、およびゴロディルセン）。現在まで、６６種のＡＳＯ薬候補が、広範な疾患（６、７）（肝炎Ｂについては３種が挙げられる（Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓデータベース））について臨床試験が行われている。
【0118】
ＡＳＯ治療薬は、標的ＲＮＡにハイブリッド形成し、いくつかの機序（細胞ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解の誘導、翻訳阻害、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中のエクソンのインクルージョンまたはスキッピング、ＲＮＡ結合タンパク質およびｍｉｃｒｏＲＮＡとの制御に関する競合、ならびにウイルスＲＮＡの複製、転写、およびウイルス粒子アセンブリの阻害など）を介して所望の治療効果を引き出す。血清安定性および好ましい薬物動態学的を達成するために、ＡＳＯ薬を、血清および細胞中に豊富なヌクレアーゼに対する耐性を示すように化学修飾する。これらの化学修飾は、作用機序と適合しなければならない。
【0119】
あるクラスのＡＳＯは、標的とＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成し、細胞ＲＮａｓｅＨによって分解されるＤＮＡオリゴである。ホミビルセンなどの最初期のＡＳＯは、バックボーン中にホスホロチオアート（ＰＳ）修飾のみを含み、この修飾は、ヌクレアーゼ耐性を増加させるが、ＲＮａｓｅＨ活性を妨害しない。第２世代のＲＮａｓｅＨ依存性ＡＳＯは、２０量体オリゴの１０個の最外側残基中にさらなる２’－Ｏ－（２－メチルオキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を含む。これらの残基は、標的ＲＮＡ結合に寄与するが、ＲＮａｓｅＨ切断に適合しない。ＲＮａｓｅＨ切断の範囲を中心の１０－ヌクレオチド領域に狭小化することにより、これらの「ギャップマー」は、特異性が改善されている。ミポメルセン、イノテルセン、およびボラネソルセンは、ギャップマーである。別のカテゴリーのＡＳＯ（エテプリルセン、イノテルセン、およびゴロディルセンなど）は、ＲＮａｓｅＨに依存しないが、その代わりに、標的の細胞機序またはウイルス機序との相互作用を立体的に遮断する。これらの「立体遮断薬」は、２’－ＭＯＥ、ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）、または標的結合親和性およびヌクレアーゼ耐性の両方を増強する他のバックボーン修飾を含む（２、７）。これらの機序および化学修飾は、構造に基づいたＡＳＯデザインで意図される。
【0120】
一本鎖ＲＮＡは分子内塩基対を形成する傾向があり、これらが相互に積み重ねられて二本鎖ヘリックスおよびより高次の構造を形成する。これらの構造は、ＲＮＡ結合タンパク質の動員などの生物学的機能に重要であることが多い（８）。ウイルスは、ウイルスの複製および翻訳に重要なその５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ中、ならびに下流ウイルスタンパク質の翻訳の継続を担うリボソームフレームシフト（ＲＦＳ）部位中にＲＮＡヘアピンを含むことが多い。これらの構造は、構造の対合相互作用および３Ｄ幾何形状が相互に適合しないので、ＡＳＯハイブリッド形成を妨げることが多い。この課題によって多くのＡＳＯ候補が失敗に終わり、重要な構造化標的に手が届かないままである。本明細書中に開示の構造に基づいたデザインは、この問題を解決する。
【0121】
本発明の構造に基づいたデザインストラテジーは、ＡＳＯの治療特性を実質的に改善する潜在性を有する。現在のＦＤＡ承認されたＡＳＯは１８～３０ヌクレオチド長であるが、デザインおよび予備的結合研究から、より短いＡＳＯが、標的との三次相互作用に携わることによって十分な親和性および特異性を達成することができる場合があるということが証明されている。ＡＳＯサイズが減少すると、より効率的な細胞送達、より好ましい生体内分布、製造コストの低下が可能となる。
【0122】
１．例証となる研究
本開示は、構造に基づいたＡＳＯデザインのための一般原理および方法工程を提供し、構造デザインテンプレートを同定し、このテンプレートにおける三次相互作用の重要性を実証し、デザインの基本要素としての塩基トリプルの予備的「用語集」を作成する。これらの結果は、両方の目的の基礎としての機能を果たす。
本開示は、構造に基づいたＡＳＯデザインのための一般原理および方法工程を提供し、構造デザインテンプレートを同定し、このテンプレートにおける三次相互作用の重要性を実証し、デザインの基本要素としての塩基トリプルの予備的「用語集」を作成する。これらの結果は、両方の目的の基礎としての機能を果たす。
【0123】
２ａ．構造に基づいたＡＳＯデザインについての一般原理
これらの一般原理は、構造生物学における常識および既存のＲＮＡ構造からの学習に基づく。これらの原理は、３Ｄ空間における標的構造との適合性および三次相互作用における操作としてまとめられ得る。
これらの一般原理は、構造生物学における常識および既存のＲＮＡ構造からの学習に基づく。これらの原理は、３Ｄ空間における標的構造との適合性および三次相互作用における操作としてまとめられ得る。
【0124】
原理番号１：ヘアピンループ全体と対合するＡＳＯを決してデザインしない。１Ｄデザインを実施する場合、ヘアピンループ全体をＡＳＯで補完することを望むことが自然である。しかしながら、３Ｄ拘束に起因して全ての塩基対が形成されるわけではない。ヘアピンステム中の塩基対合には、ループの５’および３’のほとんどの残基が相互に近づくことが必要であるのに対して、ヘアピンループとＡＳＯとの間に形成されるヘリックスは硬い棒のようであり、ターン（１１ｂｐ）あたり約３０Åにわたる。これが構造生物学における常識である。
【0125】
原理番号２：ＡＳＯおよび標的ＲＮＡによって形成されたヘリックスを、ヘアピンステムとの塩基スタッキングによって安定化することができる。塩基スタッキングは、核酸の構造を安定性させるための主な原動力である。
【0126】
原理番号３：ＡＳＯのその標的に対する親和性および特異性は、塩基トリプルおよび非標準的な対合相互作用によって増強され得る。これらの三次相互作用は、折りたたまれたＲＮＡ分子の３Ｄ構造でよく見られる。塩基トリプルは、ＷＣ塩基対（ＡＳＯとヘアピンループとの間）と「非対合」ループ残基との間に形成され得る。ある意味では、これらの「ループトリプル」は、幾何学的拘束に起因して「浪費された」非対合塩基を代償する。
【0127】
２ｂ．シュードノット構造由来のデザインテンプレート
当業者は、ＡＳＯおよび構造化標的ＲＮＡがどのようにして相互作用するのかを理解することを目的とする。しかしながら、必要とされる構造の情報が不足している（すなわち、ＡＳＯとの複合体中のＲＮＡヘアピンの３Ｄ構造はほとんど利用できない）。本明細書中に開示されるように、当業者は、ＡＳＯとヘアピンとの間の会合に類似するＲＮＡ構造（シュードノットなど）の調査から着手することができる。シュードノットは、上流または下流の鎖とのループ対合を有するＲＮＡヘアピンを指し、ＡＳＯと等価と見なされ得る（図１Ａ、Ｂ）。実際には、各シュードノットは、最小限の２つの対合領域（Ｐ１およびＰ２）を含む。いずれかの一方をヘアピンステムと見なし得るのに対して、他方をヘアピンループとＡＳＯとの間に形成された二重鎖と見なし得る（図１Ａ、Ｃ）。したがって、各シュードノット構造は、潜在的なヘアピン－ＡＳＯ相互作用についての２つの知識を本発明者らに教示する（図１Ｂ、Ｄ）。
当業者は、ＡＳＯおよび構造化標的ＲＮＡがどのようにして相互作用するのかを理解することを目的とする。しかしながら、必要とされる構造の情報が不足している（すなわち、ＡＳＯとの複合体中のＲＮＡヘアピンの３Ｄ構造はほとんど利用できない）。本明細書中に開示されるように、当業者は、ＡＳＯとヘアピンとの間の会合に類似するＲＮＡ構造（シュードノットなど）の調査から着手することができる。シュードノットは、上流または下流の鎖とのループ対合を有するＲＮＡヘアピンを指し、ＡＳＯと等価と見なされ得る（図１Ａ、Ｂ）。実際には、各シュードノットは、最小限の２つの対合領域（Ｐ１およびＰ２）を含む。いずれかの一方をヘアピンステムと見なし得るのに対して、他方をヘアピンループとＡＳＯとの間に形成された二重鎖と見なし得る（図１Ａ、Ｃ）。したがって、各シュードノット構造は、潜在的なヘアピン－ＡＳＯ相互作用についての２つの知識を本発明者らに教示する（図１Ｂ、Ｄ）。
【0128】
本発明の例証となる実施形態では、９３種のシュードノット構造を着想し、広範囲の三次相互作用（主溝および副溝塩基トリプル（第３の塩基が、それぞれ主溝側または副溝側由来の塩基対と接触している、例えば、図２Ｅおよび２Ｃを参照のこと）、非ＷＣ塩基対、および塩基スタッキングが挙げられる）が認められた。いくつかのシュードノット構造を、ＡＳＯ－ヘアピン対をデザインし、その結合を試験するために選択した。これらのうちで、テロメラーゼＲＮＡシュードノット構造は、最も広範囲の三次相互作用を有するものとして際立っており、誘導されたＡＳＯ－ヘアピン対は、高い結合親和性を示した。したがって、この構造を、その後の生化学的特徴付けおよびＡＳＯデザイン作業のためのテンプレートとして使用した。
【0129】
テロメラーゼＲＮＡシュードノット構造は、ＡＳＯがヘアピン標的に結合することができる２つの異なる方法を示唆している（図２Ａ、Ｂ）。ＡＳＯ１は、主にヘアピン１ループの３’領域と対合する（図２Ａ）。２つのＡ残基は、ＡＳＯ１の５’末端（シュードノットナンバリングでのＡ３５およびＡ３６）で突出し、副溝側由来のヘアピンステム中の塩基対と接触する（図２Ｃ）。かかる相互作用はＡ－副溝相互作用（ＲＮＡの折りたたみに重要であり、グループＩイントロンおよびリボゾームＲＮＡなどのＲＮＡで広く認められる三次相互作用型）と呼ばれる（９、１０）。ＡＳＯ２は、主に、ヘアピン２ループの５’領域と対合する（図２Ｂ）。ＡＳＯ２の３’末端の３つのオーバーハンギングＵ残基（シュードノットナンバリング中のＵ８～Ｕ１０）は、主溝側由来のヘアピン２ステム中の塩基対と接触する（図２Ｅ）。これらのＡＳＯ残基はＷＣ対合に関与していないにしても、それらは別の方法で広範囲の水素結合に携わり、塩基トリプルの連続層が互いに重なり合う。これらの三次相互作用は、結合親和性および構造特異性に寄与するはずである。一部の塩基の組み合わせのみが塩基トリプルと適合するので、これらのＡＳＯ残基もこれらのＡＳＯ残基が直接接触する標的配列の認識に役立つと予想される。両方の「ステムトリプル」型が、比較的短いループを有するヘアピンを標的にするのに特に有用である。
【0130】
２つのさらなる特徴がＡＳＯデザインに重要である。第１に、副溝および主溝の相互作用の両方が、各ＡＳＯ－ヘアピン対中に存在する。ＡＳＯ１ ５’オーバーハング残基（Ａ３５およびＡ３６）（図２Ａ）が関与する副溝トリプルは、ヘアピン２中の３’ループ残基と、ＡＳＯ２とヘアピン２ループとの間に形成された二重鎖との間に生じる（図２Ｂ）。同様に、ＡＳＯ２の３’オーバーハング（Ｕ８～Ｕ１０）が関与する主溝トリプル（図２Ｂ）は、ＡＳＯ１－ヘアピン１ループ二重鎖（図２Ａ）に携わるためにヘアピン１の５’ループ残基によって使用される。第２の特徴は、フーグスティーン対（Ｕ７とＡ３７との間、シュードノットナンバリング）が二重層の副溝トリプルおよび三重層の主溝トリプルを架橋することである（図２Ｄ）。このフーグスティーン対は、２つの隣接するセグメントを接続する適切な幾何形状のために重要である。
【0131】
２ｃ．生化学分析により、塩基トリプルおよび構造認識の重要性を確認した
ｉ．塩基トリプルの相互作用は、高親和性結合に不可欠である
ＡＳＯ－ヘアピン対中の塩基トリプルを破壊し、次いで、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を使用してその親和性を測定した（図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。Ｋｄ値は、ＡＳＯ１／ヘアピン１については７０±１０ｎＭであり、ＡＳＯ２／ヘアピン２については２８±４ｎＭである（図３Ｃ、Ｄ）。２つの５’Ａオーバーハングを欠失させると、ヘアピン１へのＡＳＯ１結合が１／８まで低下し、副溝トリプルの重要性を示す（図３Ａ）。ヘアピン１ループの５’末端の３つのＵ残基をＣに変異させると、結合が１／１０超まで減少し、ＡＳＯ１－ヘアピン１結合への主溝トリプルの重大な寄与が強調された。ＡＳＯ２中の３つのＵオーバーハンギング残基を短縮すると、ヘアピン２への結合が１／２０に低下する（図３Ｂ）。したがって、置換（ヘアピン１中）および短縮（ＡＳＯ２中）の両方は、主溝塩基トリプルの重要性を実証している。ヘアピン２ループ中のＡ３６およびＡ３７を２つのＣ残基で置換すると、ＡＳＯ２結合が１／１３０に劇的に破壊される。この結果により副溝塩基トリプルの重要性が確認され、副溝トリプルはヘアピンループ中に生じるときの方が貢献度が高いことを示唆している。２つのヘアピン－ＡＳＯ対についての変異誘発の結果は、シュードノット構造中に認められる塩基トリプルがＡＳＯ－ヘアピン複合体中で保存されている可能性があることを示唆している。
ｉ．塩基トリプルの相互作用は、高親和性結合に不可欠である
ＡＳＯ－ヘアピン対中の塩基トリプルを破壊し、次いで、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を使用してその親和性を測定した（図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。Ｋｄ値は、ＡＳＯ１／ヘアピン１については７０±１０ｎＭであり、ＡＳＯ２／ヘアピン２については２８±４ｎＭである（図３Ｃ、Ｄ）。２つの５’Ａオーバーハングを欠失させると、ヘアピン１へのＡＳＯ１結合が１／８まで低下し、副溝トリプルの重要性を示す（図３Ａ）。ヘアピン１ループの５’末端の３つのＵ残基をＣに変異させると、結合が１／１０超まで減少し、ＡＳＯ１－ヘアピン１結合への主溝トリプルの重大な寄与が強調された。ＡＳＯ２中の３つのＵオーバーハンギング残基を短縮すると、ヘアピン２への結合が１／２０に低下する（図３Ｂ）。したがって、置換（ヘアピン１中）および短縮（ＡＳＯ２中）の両方は、主溝塩基トリプルの重要性を実証している。ヘアピン２ループ中のＡ３６およびＡ３７を２つのＣ残基で置換すると、ＡＳＯ２結合が１／１３０に劇的に破壊される。この結果により副溝塩基トリプルの重要性が確認され、副溝トリプルはヘアピンループ中に生じるときの方が貢献度が高いことを示唆している。２つのヘアピン－ＡＳＯ対についての変異誘発の結果は、シュードノット構造中に認められる塩基トリプルがＡＳＯ－ヘアピン複合体中で保存されている可能性があることを示唆している。
【0132】
ｉｉ．ヘアピン構造はＡＳＯ標的結合および特異性に重要である
３Ｄ構造（図２Ａ）は、ＡＳＯとの三次相互作用には標的ＲＮＡがヘアピン立体構造で存在することが必要であることを示唆している。ヘアピン１ステムを６塩基対から４塩基対に短縮することによって安定なヘアピンステムがその相互作用に重要であるかどうかを試験した（図３Ａ）。驚くべきことに、ＡＳＯ１と短縮ヘアピン１との間に結合は検出できなかった。この結果は、ＡＳＯ１は欠失された残基に直接接触しない場合でさえもヘアピン１構造を認識することを示唆している。したがって、構造に基づいたＡＳＯデザインでは、三次相互作用およびヘアピン構造の全てが、標的結合特異性に寄与している。
３Ｄ構造（図２Ａ）は、ＡＳＯとの三次相互作用には標的ＲＮＡがヘアピン立体構造で存在することが必要であることを示唆している。ヘアピン１ステムを６塩基対から４塩基対に短縮することによって安定なヘアピンステムがその相互作用に重要であるかどうかを試験した（図３Ａ）。驚くべきことに、ＡＳＯ１と短縮ヘアピン１との間に結合は検出できなかった。この結果は、ＡＳＯ１は欠失された残基に直接接触しない場合でさえもヘアピン１構造を認識することを示唆している。したがって、構造に基づいたＡＳＯデザインでは、三次相互作用およびヘアピン構造の全てが、標的結合特異性に寄与している。
【0133】
２ｄ．バックボーン修飾
ＡＳＯのバックボーン修飾により、そのｉｎ ｖｉｖｏ安定性が増加し、標的親和性が増強され、毒性が低下する。デザインされたＡＳＯは、一般的に使用される修飾を含む（図４）。
ＡＳＯのバックボーン修飾により、そのｉｎ ｖｉｖｏ安定性が増加し、標的親和性が増強され、毒性が低下する。デザインされたＡＳＯは、一般的に使用される修飾を含む（図４）。
【0134】
ホスホロチオアート（ＰＳ）は、ホスホジエステルの非架橋酸素原子が硫黄に置換されたバックボーン修飾である。この修飾は、実質的に、ヌクレアーゼ耐性を改良し、ＡＳＯの血清タンパク質への結合を強化し、送達に有利である。この修飾は、核酸の幾何形状を劇的に変化させない。ＰＳ修飾は骨格の幾何形状をわずかに変化させるだけであり、それにより、全てのＡＳＯの位置で十分に許容されると予想される。
【0135】
リボース修飾２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）を、第２世代のＲＮＡ／ＤＮＡに基づいたＡＳＯで使用する。これらの修飾は、標的に対するハイブリッド形成親和性を増加し、ヌクレアーゼ耐性を増強し、免疫刺激活性を低下させる。未変性ＲＮＡと比較して、２’－ＯＭｅおよび２’－ＭＯＥは、２’－官能基をより嵩高くする。３Ｄ構造では、２’－ＯＨは、ほとんどのＡＳＯの位置で溶媒を受け入れやすく、したがって、２’－ＭＯＥおよび２’－ＯＭｅは十分に許容される。唯一の例外はＡＳＯ２中の残基４～７であり（図４Ｂ）、その２’－ＯＨは、比較的密集した周辺部に配置されている。これらの位置について、２’－ＭＯＥではなく２’－ＯＭｅが良いはずである。ある特定の実施形態は、別の選択肢としてこれらの位置に２’－フルオロ修飾を含むことができる。
【0136】
ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、ホスホロジアミダート結合を有する６員モルホリノ環を含む核酸アナログである（図４）（１１）。ＰＭＯバックボーンは、ヌクレアーゼに対する耐性が高い。ＰＭＯバックボーンの別の特徴は、負電荷を欠き、電荷間の反発が低下するので、標的に対する親和性が増加する。ＰＭＯは、そのバックボーンに沿った共有結合数がＲＮＡ中の共有結合数と同一である。モルホリノ部分は、非水素原子数がリボースと同一であり、環内に余剰の原子を有するが、２’－ＯＨを欠く。ホスファート上のジメチルアミン基は、未変性核酸中の単一の非架橋酸素より嵩高いが、全てのＡＳＯの位置で十分に適応されるはずである。
【0137】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、２’－Ｏおよび４’－Ｃを共有結合性に連結しているメチレン架橋を有する（図４）（１２）。架橋は、Ａ形態のヘリックス中に見出される立体構造中のリボースを固定し（１３～１５）、それ故に、標的親和性が増強される。２’－ＯＭｅについて上記で説明した理由のために、ＬＮＡが開示のＡＳＯデザインと適合すると予想される。
【0138】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）アナログは、側鎖としての核酸塩基およびバックボーンとしてのペプチド結合で連結されたＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位を有する（１６）。ＰＮＡ ＡＳＯは、ヌクレアーゼ分解およびプロテアーゼ分解の両方に高い耐性を示す。ＰＭＯと同様に、ＰＮＡは、中性バックボーンを有し、ＤＮＡまたはＲＮＡより高い親和性で標的に結合する。以前に決定された構造は、ＰＮＡおよび相補的ＲＮＡがハイブリッド形成して、ＰＮＡ鎖がより可動性であるＡ形態のヘリックス立体構造を取ることが示された（１７、１８）。ＰＮＡをデザインテンプレートに適合させることができる可能性がある。
【0139】
２．デュシェンヌ型筋ジストロフィ
デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、ほぼ例外なく男児が罹患する進行性の筋力低下および筋肉疲労を特徴とする稀な遺伝的障害である。ＮＩＨ遺伝・希少疾患（ＧＡＲＤ）情報センターによれば、ＤＭＤは、全世界の出生男児３，５００～５，０００人におよそ１人が罹患する。治癒はない。症状の管理および生活の質の改善のために理学療法およびホルモン剤が使用される。近年は治療法が改善されているにもかかわらず、患者はローティーンで車椅子に拘束されるようになり、非常に短命で、典型的には３０代で死亡する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、ほぼ例外なく男児が罹患する進行性の筋力低下および筋肉疲労を特徴とする稀な遺伝的障害である。ＮＩＨ遺伝・希少疾患（ＧＡＲＤ）情報センターによれば、ＤＭＤは、全世界の出生男児３，５００～５，０００人におよそ１人が罹患する。治癒はない。症状の管理および生活の質の改善のために理学療法およびホルモン剤が使用される。近年は治療法が改善されているにもかかわらず、患者はローティーンで車椅子に拘束されるようになり、非常に短命で、典型的には３０代で死亡する。
【0140】
ＤＭＤは、筋繊維の強度を支持するジストロフィンと呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子の変異に原因する。この２年間で、２つのＡＳＯ薬がＤＭＤ処置用として米国ＦＤＡに承認されている。
【0141】
３ａ．エテプリルセンおよびゴロディルセン
エテプリルセンおよびゴロディルセンは、ジストロフィン翻訳の読み枠を変化させる変異に原因する特定のＤＭＤ型を処置するためにＳａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された。約１３％および８％のＤＭＤ患者がこれらのカテゴリーに含まれる。エテプリルセンは、エクソン５１に結合してｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中にエクソン５１がスキップされ、それにより、適切な翻訳読み枠が修復される３０－ヌクレオチドＡＳＯである。この「エクソンスキッピング治療」は、部分的に機能するジストロフィンタンパク質を産生し、疾患の重症度を低下させる。ゴロディルセンは、エクソン５３に結合してスキップさせる２５－ヌクレオチドＡＳＯである。
エテプリルセンおよびゴロディルセンは、ジストロフィン翻訳の読み枠を変化させる変異に原因する特定のＤＭＤ型を処置するためにＳａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された。約１３％および８％のＤＭＤ患者がこれらのカテゴリーに含まれる。エテプリルセンは、エクソン５１に結合してｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中にエクソン５１がスキップされ、それにより、適切な翻訳読み枠が修復される３０－ヌクレオチドＡＳＯである。この「エクソンスキッピング治療」は、部分的に機能するジストロフィンタンパク質を産生し、疾患の重症度を低下させる。ゴロディルセンは、エクソン５３に結合してスキップさせる２５－ヌクレオチドＡＳＯである。
【0142】
２０１６年のエテプリルセンの迅速承認は、刺激的かつ論争の的となった。この薬物は、ジストロフィンタンパク質産生を部分的に修復することができた。このクラスにおける先駆者として、新規のエクソンスキッピング機構が作用することが証明された。しかしながら、エテプリルセンは、臨床的にほんのわずかしか有効でなく、標準的な歩行試験において有意な改善を示さない。２人のＦＤＡ調査委員会のメンバーが抗議のために辞任した。２０１８年に、欧州医薬品庁は、その承認を拒否した。さらに、エテプリルセンは高額であり、患者あたり年間３００，０００ドルの費用がかかる。
【0143】
３ｂ．構造に基づいたデザイン
構造に基づいたデザイン方法により、エテプリルセン、ゴロディルセン、および種々の開発段階のＡＳＯ薬候補を大幅に改善することが可能である。それ故に、ここでは、エテプリルセンを例として使用する。エテプリルセン結合部位およびエクソン５１上の取り囲まれている配列は、信頼性が高いと予想されるヘアピン構造に折りたたまれる（図５Ａ）。エテプリルセンとその標的との間の塩基対合は、ヘアピン立体構造と構造的に不適合である（すなわち、エテプリルセンは、ヘアピン中の塩基対を破壊しなければならず、その後にエクソンと完全に結合することができる）。それを行うために消費されるエネルギーは、その結合親和性および結合特異性を低下させる。
構造に基づいたデザイン方法により、エテプリルセン、ゴロディルセン、および種々の開発段階のＡＳＯ薬候補を大幅に改善することが可能である。それ故に、ここでは、エテプリルセンを例として使用する。エテプリルセン結合部位およびエクソン５１上の取り囲まれている配列は、信頼性が高いと予想されるヘアピン構造に折りたたまれる（図５Ａ）。エテプリルセンとその標的との間の塩基対合は、ヘアピン立体構造と構造的に不適合である（すなわち、エテプリルセンは、ヘアピン中の塩基対を破壊しなければならず、その後にエクソンと完全に結合することができる）。それを行うために消費されるエネルギーは、その結合親和性および結合特異性を低下させる。
【0144】
ヘアピン構造と適合するだけでなく、広範囲のさらなる相互作用も構築する２つのＡＳＯ（ＤＭＤ１およびＤＭＤ２）をデザインした（図５Ｂ～Ｎ）。ＤＭＤ１およびＤＭＤ２は、それぞれヘアピンループの５’および３’領域に結合する（図５Ｂ、Ｈ）。これらの両方は、標的ＲＮＡとの水素結合を、ＷＣ塩基対中で認められる水素結合よりも多数形成する（図５Ｃ～Ｇ、５Ｉ～Ｎ）。これらのさらなる相互作用から獲得され、ヘアピンステムを破壊する必要性がないことによって確保される自由エネルギーにより、ＡＳＯは、それらがより短かったとしても（それぞれＤＭＤ１およびＤＭＤ２について１８および１７ヌクレオチド）、高い親和性および特異性で標的ＲＮＡに結合することが可能なはずである。より短い配列は、大きな利点（送達がより容易なこと、合成コストがより低いこと、および先天免疫を引き起こす機会がより低いことが挙げられる）もある。
【0145】
ＡＳＯデザインは、知的所有権を得るのに好ましい特徴を有する。比較的短い長さに加えて、ＡＳＯは、幾何学的適合性および三次相互作用を最適にするようにデザインされた非標準的な対であることに起因して、その標的に対して配列が完全に相補的ではない（図５Ｂ、Ｈ）。プソイドウリジン（ψ）などの天然に存在する修飾塩基も含めることができる。
【0146】
３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを抑制するＡＳＯ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ［Ｐｒｅｐｒｉｎｔ］．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８も参照のこと）
コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、新規に発見された重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染症である。大流行以来、この感染症は、致死性および接触感染性のために、重大な世界的パンデミックに急速に展開していった。５月２７日の時点で、５６００万人の感染が確認され、全世界で３５０，０００人超が死亡した。毎日確認される新規の症例数および死亡者数は、それぞれ、およそ１００，０００人および１，５００人に達する。一般的な症状としては、発熱、身体の痛み、乾性咳嗽、疲労、悪寒、頭痛、咽喉痛、および嗅覚喪失が挙げられる。重症例では、高熱、重症の咳、および息切れを生じる。また、患者によっては神経学的および／または胃腸の症状を経験するか、あるいは、卒中のリスクが高まる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の封じ込めにおける大きな難題は、およそ４２％の感染患者が無症候であるが、他者に感染させることができるという点である（１９）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主に、液滴、エアロゾル、および感染表面との接触を介して人から人へ拡大する。有効なワクチンが利用できるようになる時期は不明である。レムデシビルはＣＯＶＩＤ－１９処置用に認可を受けた唯一の薬物であるが、その利益は十分とは言えない。
コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、新規に発見された重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染症である。大流行以来、この感染症は、致死性および接触感染性のために、重大な世界的パンデミックに急速に展開していった。５月２７日の時点で、５６００万人の感染が確認され、全世界で３５０，０００人超が死亡した。毎日確認される新規の症例数および死亡者数は、それぞれ、およそ１００，０００人および１，５００人に達する。一般的な症状としては、発熱、身体の痛み、乾性咳嗽、疲労、悪寒、頭痛、咽喉痛、および嗅覚喪失が挙げられる。重症例では、高熱、重症の咳、および息切れを生じる。また、患者によっては神経学的および／または胃腸の症状を経験するか、あるいは、卒中のリスクが高まる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の封じ込めにおける大きな難題は、およそ４２％の感染患者が無症候であるが、他者に感染させることができるという点である（１９）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主に、液滴、エアロゾル、および感染表面との接触を介して人から人へ拡大する。有効なワクチンが利用できるようになる時期は不明である。レムデシビルはＣＯＶＩＤ－１９処置用に認可を受けた唯一の薬物であるが、その利益は十分とは言えない。
【0147】
呼吸器疾患を引き起こすウイルスを標的にするＡＳＯおよび他の合成オリゴヌクレオチド薬を開発する努力がなされている（２０）。以前から標的にされているウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、インフルエンザＡ型、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、およびアデノウイルスが挙げられる。最先端のものは、胚移植患者のＲＳＶ感染を処置するためにＡｌｓｙｌａｍによって開発されたＲＳＶ０１と呼ばれる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である（２１）。励みになるのは、その第ＩＩｂ相試験において、３～６ヶ月間ＲＳＶ感染を予防するという有意な有効性が示されたことである。また、この臨床試験は、ｓｉＲＮＡが鼻噴霧を介して送達され、投与が非常に容易であるという点が興味深い。ｓｉＲＮＡは短い合成オリゴヌクレオチドでもあるので、ＡＳＯ薬候補は、鼻噴霧または静脈内のいずれかとして投与される。鼻噴霧製剤の利便性は、この薬物が医療サービスを十分に受けていない／不利な境遇の集団により容易に受け入れやすくなり、ＩＶ送達に必要な管理の行き届いた医療環境以外で投与可能であるので、特に魅力的である。ｓｉＲＮＡは、解かれる必要がある二本鎖ＲＮＡであり、活性になる前にアルゴノートと呼ばれる細胞エフェクタータンパク質にガイド鎖が組み込まれなければならない。ヌクレアーゼ耐性に必要なバックボーン修飾がアルゴノート－ｓｉＲＮＡ相互作用を妨害し、それにより、ｓｉＲＮＡが制約を受けることもあるので、ＡＳＯ経路がある程度好ましい。
【0148】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、非常に巨大なゲノムを有するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスであり、特にＡＳＯ薬に感受性を示す。１５年前に、Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡを標的にする９つのＡＳＯをデザインし、そのうちのいくつかが培養細胞中でのウイルスの様々な程度の抑制に有効であることを見出した（２２）。最も有効なもの（図６Ａ中に示すようにＴＲＳ２と呼ばれる）は、１０～２０μＭでウイルスを抑制し、転写制御配列（ＴＲＳ）に結合する。ＴＲＳ領域は、ヘアピンに折りたたまれると予想され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で本質的に同一である。したがって、ＴＲＳを標的にするＡＳＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を同様に抑制するはずである。しかしながら、２１－ｎｔ ＴＲＳ２は、ヘアピンループのほぼ全体と相補的である。これらが形成するＡ形態のヘリックスは５５Åにわたって伸びており、ヘアピンステムの上部で隣接残基が対合することを不可能にしている。結果として、全てのＴＲＳ２塩基が標的とハイブリッド形成することができるわけではないか、あるいは、自由エネルギーを犠牲にしてヘアピンステム中の塩基対合を破壊する必要があるかのいずれかである。いずれの場合にも、ＴＲＳ２は、意図する結合親和性および結合特異性を達成することができない。任意の非対合ＴＲＳ２残基のみが、非特異的結合に寄与する。
【0149】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳヘアピンと空間的に適合し、かつ結合親和性および結合特異性を最大にするために三次相互作用の力を利用する４つのＡＳＯをデザインした。ＳＢＤ１は、ＴＲＳ２と１４個のヌクレオチドを共有し、これらのヌクレオチドがループの５’領域とＷ－Ｃ塩基対を形成し、それにより９個の３’－ループ残基がヘアピンステムに接続し直すようにする（図６Ｂ）。また、ヘアピンステム塩基対との主溝塩基トリプルおよびループの３’末端（３’－１）Ａ残基とのフーグスティーン対を形成する４個の残基（３’－ＣＴＴＴ（配列番号２７））を含んでいた（図６Ｃ～Ｆ）。３’ループ領域（３’－２）のさらなるＡ残基は、ＳＢＤ１－ループ二重鎖と副溝塩基トリプルを形成することができる（図６Ｇ）。これらの塩基トリプルおよびフーグスティーン対合相互作用は、ＡＳＯ－ヘアピン複合体をさらに安定にする強力な塩基スタッキングを伴う。幾何学的に適合するこれらの広範囲の三次相互作用は、ＳＢＤ１がより高い親和性および特異性でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに結合するという強い希望を本発明者らに与える。
【0150】
ＳＢＤ２は、主に、ＴＲＳヘアピンループの３’領域中の１２個の残基にハイブリッド形成する（図６Ｉ）。このデザインでは、７個の５’ループ残基（５’＋２から５’＋８まで）は、主溝塩基トリプルの連続層を形成することができる（図６Ｋ～Ｐ）。塩基トリプルの非常に大きな連続層は、このＡＳＯが十分な親和性および特異性を達成するには１５ヌクレオチドで十分であるという大きな希望を発明者らに与える。このデザインの別の革新的な態様は、５位での非ＷＣ対の導入である。さらに、２個のＡ残基を、Ａ－副溝相互作用を介してヘアピンステムに結合させるためにＳＢＤ２の５’末端に付加し、５’＋１ループ位でＣとのフーグスティーン対を形成するために第３の残基Ｇを付加した（図６Ｊ）。
【0151】
ＳＢＤ１およびＳＢＤ２は、ほとんどの核酸バックボーンにおいて負電荷を欠くＰＭＯオリゴである。標的ＲＮＡとのその会合は、電荷間の反発を克服する必要がない。他方では、ＰＭＯオリゴは、１つの企業（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）のみから入手可能であり、彼らが提供する塩基は、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧに制限される。
【0152】
ＳＢＤ１およびＳＢＤ２に類似しているが、ＰＳおよび２’－ＭＯＥ（または類似の２’－ＯＭｅ）で修飾されている３つのさらなるＡＳＯ（ＳＢＤ３、ＳＢＤ４、およびＳＢＤ５）をデザインした（図６Ｑ、Ｒ）。このバックボーン立体配置は、４つの承認されたＡＳＯ薬と同一である。さらに、ＳＢＤ４中に架橋フーグスティーン対および主溝塩基トリプルを最適に適応させるために、４、６、１１、および１２位にプソイドウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎ）を使用する。ＳＢＤ５は、ＳＢＤ４の代替物であり、３位にψを有する。得られたＣ－ψフーグスティーン対は、ＳＢＤ４－標的複合体中のＣ－Ｇフーグスティーン対において見られるようにＣをプロトン化する必要がない。
【0153】
本明細書中に提供した開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防および処置の両方が可能な薬物の産生を容易にする。かかる薬物を、鼻噴霧としてか、静脈内注射を介して投与し得る。鼻噴霧製剤は、高リスクか、容易に医療を受けられないか、症状を示し初めたばかりの人々に容易に投与することができるので、特に魅力的である。
【0154】
実施例１の参考文献
【化11-1】
【化11-2】
【化11-3】
【化11-4】
【0155】
実施例２：コロナウイルス感染症の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ［プレプリント］．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８（本明細書中で参考として援用される）で詳細に考察されるように、新規のコロナウイルスである重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列が同定されている。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ［プレプリント］．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８（本明細書中で参考として援用される）で詳細に考察されるように、新規のコロナウイルスである重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列が同定されている。
【0156】
以下の文章は、方法を簡潔に記載し、２つのデザインおよび結果（これらの配列についての抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を実証するもの）を詳述する。
【0157】
構造に基づいたＡＳＯデザイン法の簡潔な説明
従来のＡＳＯデザインは、線状標的配列に沿ったワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に厳密に従う。しかしながら、ウイルスＲＮＡは、ＡＳＯハイブリッド形成を妨害する強力な二次構造および三次構造に折りたたまれることが多い。従来のＡＳＯデザインストラテジーは、この問題に適切に取り組んでいない。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にするために標的ＲＮＡ構造を活用し、構造に基づいたＡＳＯデザインを使用する。このデザインは、三次元（３Ｄ）空間で標的構造と適合し、ＷＣ塩基対合に加えて三次相互作用に携わる。この方法でデザインされた「３Ｄ－ＡＳＯ」は、三次相互作用の獲得および標的構造を破壊する必要がないことによる自由エネルギーの確保に起因して高められた親和性で標的に結合する。さらに、３Ｄ－ＡＳＯが標的配列だけでなく、形状および水素結合パターンも認識するので、結合特異性が高められる。
従来のＡＳＯデザインは、線状標的配列に沿ったワトソン・クリック（ＷＣ）塩基対合則に厳密に従う。しかしながら、ウイルスＲＮＡは、ＡＳＯハイブリッド形成を妨害する強力な二次構造および三次構造に折りたたまれることが多い。従来のＡＳＯデザインストラテジーは、この問題に適切に取り組んでいない。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にするために標的ＲＮＡ構造を活用し、構造に基づいたＡＳＯデザインを使用する。このデザインは、三次元（３Ｄ）空間で標的構造と適合し、ＷＣ塩基対合に加えて三次相互作用に携わる。この方法でデザインされた「３Ｄ－ＡＳＯ」は、三次相互作用の獲得および標的構造を破壊する必要がないことによる自由エネルギーの確保に起因して高められた親和性で標的に結合する。さらに、３Ｄ－ＡＳＯが標的配列だけでなく、形状および水素結合パターンも認識するので、結合特異性が高められる。
【0158】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、巨大なゲノムを有するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスであり、特にＡＳＯ薬に感受性を示す。３Ｄ－ＡＳＯは、それぞれフレームシフト刺激エレメント（ＦＳＥ）および転写制御配列（ＴＲＳ）を標的にする。
【0159】
ＦＳＥを標的にするＰＲＦ３ｐＰＭＯ
コロナウイルスには、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、レプリカーゼと転写酵素の複合体の触媒サブユニットであるＯＲＦ１ｂを翻訳するためのプログラムされた－１リボゾームシフティング（－１ＰＲＦ）が必要である。したがって、ＰＲＦは、ウイルス複製に絶対に不可欠である。ＦＳＥは、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂとの間の接合部に存在する。ＦＳＥは、滑りやすい配列およびアテニュエーターヘアピンに先行するシュードノット構造を含む。翻訳中に、リボソームは、シュードノットによって滑りやすい部位で停止させられ、このプロセスがリボソームに１ヌクレオチド分スリップバックする機会を与え、その後にシュードノットを破壊し、翻訳を継続することができる。スリッピングがない場合、リボソームは下流終止コドンと遭遇して外れ、タンパク質１ａが産生される。スリッピングがある場合、リボゾームはＯＲＦ１ｂの翻訳を完了してタンパク質１ａ－１ｂを生成する。
コロナウイルスには、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、レプリカーゼと転写酵素の複合体の触媒サブユニットであるＯＲＦ１ｂを翻訳するためのプログラムされた－１リボゾームシフティング（－１ＰＲＦ）が必要である。したがって、ＰＲＦは、ウイルス複製に絶対に不可欠である。ＦＳＥは、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂとの間の接合部に存在する。ＦＳＥは、滑りやすい配列およびアテニュエーターヘアピンに先行するシュードノット構造を含む。翻訳中に、リボソームは、シュードノットによって滑りやすい部位で停止させられ、このプロセスがリボソームに１ヌクレオチド分スリップバックする機会を与え、その後にシュードノットを破壊し、翻訳を継続することができる。スリッピングがない場合、リボソームは下流終止コドンと遭遇して外れ、タンパク質１ａが産生される。スリッピングがある場合、リボゾームはＯＲＦ１ｂの翻訳を完了してタンパク質１ａ－１ｂを生成する。
【0160】
ＰＲＦを排除することを目的とした、シュードノット構造を破壊する３Ｄ－ＡＳＯをデザインした。このシュードノットは、ステム１～３を含む（図７Ａ）。この着想は、リボソームが滑りやすい部位で停止するか、停止しないように、構造の一部を破壊することである。ＰＲＦ３ｐＰＭＯと呼ばれるこのＡＳＯを、図７Ｂに示す。この２２－ｎｔ ＰＭＯオリゴは、ステム３の３’側の領域にハイブリッド形成し、３つの主溝塩基トリプル、５つの副溝塩基トリプル、およびその間のフーグスティーン対に携わる。
【0161】
ＴＲＳを標的にするＳＢＤ１
ＳＢＤ１は、標的ヘアピンループの５’領域と１４個のＷ－Ｃ塩基対を形成し、それにより、９個の３’－ループ残基がヘアピンステムに接続し直すようにする（図８Ａ）。また、ＳＢＤ１は、ヘアピンステム塩基対との主溝塩基トリプルおよびループの３’末端（３’－１）Ａ残基とのフーグスティーン対を形成する５個の残基（３’－3′-TCTTT（配列番号２５））を含む（図８Ｂ～Ｅ）。３’ループ領域（３’－２）のさらなるＡ残基は、ＳＢＤ１－ループ二重鎖と副溝塩基トリプルを形成することができる（図８Ｆ）。これらの塩基トリプルおよびフーグスティーン対合相互作用は、ＡＳＯ－ヘアピン複合体をさらに安定にする強力な塩基スタッキングを伴う。
ＳＢＤ１は、標的ヘアピンループの５’領域と１４個のＷ－Ｃ塩基対を形成し、それにより、９個の３’－ループ残基がヘアピンステムに接続し直すようにする（図８Ａ）。また、ＳＢＤ１は、ヘアピンステム塩基対との主溝塩基トリプルおよびループの３’末端（３’－１）Ａ残基とのフーグスティーン対を形成する５個の残基（３’－3′-TCTTT（配列番号２５））を含む（図８Ｂ～Ｅ）。３’ループ領域（３’－２）のさらなるＡ残基は、ＳＢＤ１－ループ二重鎖と副溝塩基トリプルを形成することができる（図８Ｆ）。これらの塩基トリプルおよびフーグスティーン対合相互作用は、ＡＳＯ－ヘアピン複合体をさらに安定にする強力な塩基スタッキングを伴う。
【0162】
培養されたヒト細胞中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抑制するリードＡＳＯの同定
ＰＭＯバックボーンを用いて合成ＡＳＯを生成し、培養したＨＥＫ２９３－ｈＡＣＥ２細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の抑制能を試験した。生きているウイルスを含む全ての実験を、ＵＣＬＡ ＢＳＬ３高封じ込め施設で行う。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の細胞モデルが確立されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）を、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ＮＩＡＩＤから入手した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞中で１回継代し、ウイルスストックを等分し、－８０℃で保存する。
ＰＭＯバックボーンを用いて合成ＡＳＯを生成し、培養したＨＥＫ２９３－ｈＡＣＥ２細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の抑制能を試験した。生きているウイルスを含む全ての実験を、ＵＣＬＡ ＢＳＬ３高封じ込め施設で行う。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の細胞モデルが確立されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）を、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ＮＩＡＩＤから入手した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞中で１回継代し、ウイルスストックを等分し、－８０℃で保存する。
【0163】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に対するＡＳＯの効果を評価するために、ヒトアンギオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＡＳＯでトランスフェクトした。翌日に、ウイルス接種材料を、無血清培地中のトランスフェクトした細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）ＭＯＩ ０．１で添加した。接種１時間後、接種材料を、血清補充培地で置き換えた。感染２４時間後（ｈｐｉ）に、細胞をメタノールで固定してウイルスを不活化し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な抗体を使用した免疫細胞化学（ＩＣＣ）を用いてウイルス感染を試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原を、偽トランスフェクション（ＡＳＯなし）を用いた感染細胞中で検出することができ、活性ウイルス感染が確認された（図９Ａ）。ＰＲＦ３ｐＰＭＯおよびＳＢＤ１が強力な阻害を示し、ウイルスシグナルはＩＣＣ画像上で検出可能レベル未満であることが認められた。Ｓｉｔｅ１ｐ５ＰＭＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳおよび周囲の領域に完全に相補的であるように従来の方法でデザインされた２４量体のＰＭＯ ＡＳＯである。Ｓｉｔｅ１ｐ５ＰＭＯは、ウイルス抑制をほとんど示さなかった。以前に報告されたＡＳＯであるＰＲＥＶは、軽度のウイルス抑制を示した。
【0164】
３Ｄ－ＡＳＯのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害活性を確認するために、総ＲＮＡを感染細胞から抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してウイルスおよび宿主のＲＮＡを定量した。ＩＣＣの結果と一致して、ＰＲＦ３ｐＰＭＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を強力に阻害し、２４ｈｐｉ後の非特異的な標準対照ＰＭＯと比較して１４％（１０μＭ ＡＳＯ）および４％（２０μＭ ＡＳＯ）のウイルスＲＮＡが検出された（図９Ｂ）。１０μＭおよび２０μＭの濃度で、ＳＢＤ１は、ウイルスＲＮＡを、それぞれ、標準対照のそれの４４％および１７％まで低下させた。これらの結果は、統計的に有意に高い。ｑＲＴ－ＰＣＲデータから、ＰＲＥＶの軽度の阻害活性が確認され、Ｓｉｔｅ１ｐ５ＰＭＯについては活性はなかった。まとめると、さらなる前臨床の安全性および毒性研究のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗ウイルス活性を有するリードＡＳＯ候補が同定された。
【0165】
３Ｄ－ＡＳＯデザインの拡張
ＰＲＦ３ｐＰＭＯおよびＳＢＤ１はＰＭＯである。３Ｄ－ＡＳＯがデザインされる方法のために、代替バックボーンを有する類似のＡＳＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害で活性な場合があると合理的に予想することができる。当業者は、どのようにこれらの修飾がリード３Ｄ－ＡＳＯのその標的への結合に影響を及ぼすのかについてさらに決定することができる。
ＰＲＦ３ｐＰＭＯおよびＳＢＤ１はＰＭＯである。３Ｄ－ＡＳＯがデザインされる方法のために、代替バックボーンを有する類似のＡＳＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害で活性な場合があると合理的に予想することができる。当業者は、どのようにこれらの修飾がリード３Ｄ－ＡＳＯのその標的への結合に影響を及ぼすのかについてさらに決定することができる。
【0166】
ＰＲＦ３ｐＧａｐｍｅｒと呼ばれるＰＲＦ３ｐＰＭＯのギャップマーバージョン（図７Ｃ）をデザインした。ギャップマーは、シュードノットの破壊に加えてＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの分解を誘導するＡＳＯの内部領域にＤＮＡ残基を含む。ＰＲＦ３ｐＧａｐｍｅｒ中の残基４～１３は、ＤＮＡ残基である。残基１～３および１４～２２は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾を含む。ＰＲＦ３ｐＧａｐｍｅｒは、その配列の至る所にホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を有する。
【0167】
ＳＢＤ３は、ＳＢＤ１に類似しているが、ＰＳおよび２’－ＯＭｅまたは類似の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有する（図８Ｇ）。このバックボーン立体配置は、４つのＦＤＡ承認ＡＳＯ薬に使用されている。ＳＢＤ３は、各々が密集した残基４～７領域に２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾のいずれかを有する２つのハイブリッドバージョンを有する。２’－ＭＯＥが２’－ＯＭｅよりエクソンスキッピングの誘発において有効であり、かつ炎症誘発の影響が少ない場合があると報告されているので、これらのハイブリッドオリゴは、２’－ＭＯＥが有用である機会を最大化する。そのバックボーンに起因して、図８Ｈに示すように、ＳＢＤ３はさらなる副溝塩基トリプルを形成することができる。ＰＲＦ３ｐＰＭＯ、ＰＲＦ３ｐＧａｐｍｅｒ、ＳＢＤ１、およびＳＢＤ３に類似する３Ｄ－ＡＳＯは、これらの配列中のＬＮＡ修飾およびＰＮＡ修飾を使用して合成される。
【0168】
実施例３：ヒトＦＡＮ１の発現を上方制御するＡＳＯのデザイン
この実施例は、ＦＡＮ１（ファンコニ関連ヌクレアーゼ１）を標的にする本発明の実施形態を例証する。
この実施例は、ＦＡＮ１（ファンコニ関連ヌクレアーゼ１）を標的にする本発明の実施形態を例証する。
【0169】
ＦＡＮ１は、ＫＩＡＡ１０１８、ＭＴＭＲ１５、ＦＡＮＣＤ２／ＦＡＮＣ１関連ヌクレアーゼ１とも呼ばれる。ＦＡＮ１は、ＤＮＡ鎖間架橋修復に必要であるが、ＤＮＡ二本鎖切断反応に関与しない。ＦＡＮ１は、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２によってＤＮＡ損傷部位に動員される。ＦＡＮ１は、Ｎ末端にＵＢＺ型ユビキチン結合ドメイン、中間にＳＡＰ型ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣ末端に「ＶＲＲ＿ｎｕｃ」ドメインと称されるヌクレアーゼドメインを有する。ＦＡＮ１は、５’フラップに対するエンドヌクレアーゼ活性および５’－３’エキソヌクレアーゼ活性（ＶＲＲ＿ｎｕｃドメインを必要とする）を有する。
【0170】
ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに示されるように、ＦＡＮ１タンパク質は、２つの主要なイソ型で発現される。イソ型１は、１０１７ａ．ａ．および全ての機能ドメインを含む全長タンパク質である。イソ型２は、５３３ａ．ａ．を含み、残基１～５２６はイソ型１と同一であり、残基５２７～５３３はイソ型１中のＡＫＡＬＡＧＱからＦＣＷＬＬＬＱに変わっている。イソ型２は、ＶＲＲ－ｎｕｃドメインを含む全長タンパク質中の残基５３４～１０１７を欠き、したがって、機能しないと予想される。したがって、ＲＮＡプロセシング中にイソ型２のｍＲＮＡをイソ型１に転換することによって機能的なＦＡＮ１の発現レベルを増加させることが可能である。４３０、２３７、５７３、３１８、５８７、１０３、および２９８ａ．ａ．長を含む７つのさらなるイソ型をコンピュータによって予測する。
【0171】
より短いタンパク質イソ型をコードするｍＲＮＡイソ型が、選択的スプライシングではなく選択的ポリアデニル化によって生成されることが認められた。ヒトタンパク質アトラスの検索によって、以下の５つのｍＲＮＡバリアントが見出された：
【0172】
ＦＡＮ１－２０１（ＥＮＳＴ０００００３６２０６５．８）は、１０１７ａ．ａ．をコードする（４，８９１ｎｔ長の１５エクソン（１３コーディング）を含む）。エクソンおよびイントロンの長さ（ｎｔ）を以下に示し、括弧内の数字はイントロンの長さを示す。１３９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）２０２（３，０４２）２３４．．．（４３０６）１，５４３。最後のエクソン（１，５４３ｎｔ）は、ポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）配列の複数のコピーを含む。
【0173】
ＦＡＮ１－２０２（ＥＮＳＴ０００００５６１５９４．５）は、５３３ａ．ａ．（イソ型２）をコードする（２，７３８ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。３６（６２６）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，１７５。エクソン４は１，１７５ｎｔを有し、この中に２０２ｎｔのエクソン４および９７３ｎｔのイントロン４～５を含む
【0174】
ＦＡＮ１－２０１。コーディングは、TAA（配列番号１４）終止コドンに到達する前に２２ｎｔ伸長する。これは、ＦＡＮ１－２０１のイントロン４～５またはエクソン５の３’領域を含まない。エクソン４の残基１１４９～１１５４が３’末端（切断部位）から約２０ｎｔであるＰＡＳ（AUUAAA、（配列番号１５）ＰＡＳ１）を含む（ＦＡＮ１－２０２が選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。
【0175】
ＦＡＮ１－２０３（ＥＮＳＴ０００００５６１６０７．５）は、５３３残基のイソ型２をコードする（２，６９０ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。
１３３（４８７）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，０３０。エクソン４は１，０３０ｎｔを含み、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２のエクソン４と同一である。エクソン４の残基９９５～１０００が３’末端から約３０ｎｔであるＰＡＳ（AAUAAA、（配列番号１６）ＰＡＳ２）を含む（ＦＡＮ１－２０３がこの部位での選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。このＰＡＳもＦＡＮ１－２０２中に存在することに留意のこと。
１３３（４８７）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）１，０３０。エクソン４は１，０３０ｎｔを含み、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２のエクソン４と同一である。エクソン４の残基９９５～１０００が３’末端から約３０ｎｔであるＰＡＳ（AAUAAA、（配列番号１６）ＰＡＳ２）を含む（ＦＡＮ１－２０３がこの部位での選択的ポリアデニル化によって生成されることを示す）ことが重要である。このＰＡＳもＦＡＮ１－２０２中に存在することに留意のこと。
【0176】
ＦＡＮ１－２０５（ＥＮＳＴ０００００５６２８９２）は、１０５－ａ．ａ．タンパク質をコードする（３４４ｎｔ長の３個のエクソン（全てコーディング）を含む）。８１（３，５２７）１４１（２，３５５）１２２。エクソン３は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０１、－２０２、および－２０３バリアントのエクソン４と同一である１２２ｎｔを含む。このバリアントは、終止コドン（コード領域を終結する）を持たず、３’末端が不完全のようである。
【0177】
ＦＡＮ１－２０７（ＥＮＳＴ０００００５６５４６６）は、５３３－ａ．ａ．タンパク質をコードする（２，３０４ｎｔ長の４個のエクソン（３コーディング）を含む）。１１９（５００）１，３８６（２，２２０）１４１（２，３５５）６５８。エクソン４は、より短いことを除き、ＦＡＮ１－２０２および－２０３のエクソン４と同一である６５８ｎｔを含む。ＰＡＳ配列がこの部位で選択的アデニル化を指示するかは不明である。要するに、転写物ＦＡＮ１－２０２およびＦＡＮ１－２０３の産生は、２つの選択的ＰＡＳ配列によって指示されることが明らかであり、それにより、創薬の機会が提供される。；
【0178】
最近の論文（Ｎａｖｅｅｄ ｅｔ ａｌ．”ＮＥＡＴ１ ｐｏｌｙＡ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｏｔｈ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ” Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０２０）において、ＡＳＯを使用してより短い転写物のポリアデニル化を阻害し、より長いＲＮＡの産生を増加させることができることが報告されている。この論文によれば、ＦＡＮ１のポリアデニル化および有効な全長タンパク質発現を潜在的にモジュレートする４つのＡＳＯ配列をデザインした。
3’-AAAUUACAAAUGAACGAAUAUUUUAC-5’ （配列番号３１）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１５４～１１２９）
5’-UUUAAUGUUUACUUGCUUAUAAAAUG-3’ （配列番号３２）（ＦＡＮ１ＡＳＯ１、２６ｎｔ、１３Ｕ、８Ａ、５ＧＣ）
3’-GUCGGUCUCCCACCGAUUUAAAUUA-5’ （配列番号３３）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１７３～１１４９）
5’-CAGCCAGAGGGUGGCUAAAUUUAAU-3’ （配列番号３４）（ＦＡＮ１ＡＳＯ２、２５ｎｔ、バランスの良い配列）
3’-AAAUAACUUCAUGAAAAAUUUUUAG-5’ （配列番号３５）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０００～９７６）
5’-UUUAUUGAAGUACUUUUUAAAAAUC-3’ （配列番号３６）（ＦＡＮ１ＡＳＯ３、２５ｎｔ、１２Ｕ、９Ａ、４ＧＣ）
3’-GUUAAUUAAUGUUCAUACAUUAAAUAA-5’ （配列番号３７）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０２１～９９５）
5’-CAAUUAAUUACAAGUAUGUAAUUUAUU-3’ （配列番号３８）（ＦＡＮ１ＡＳＯ４、２７ｎｔ、１２Ｕ、１１Ａ、４ＧＣ）
3’-AAAUUACAAAUGAACGAAUAUUUUAC-5’ （配列番号３１）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１５４～１１２９）
5’-UUUAAUGUUUACUUGCUUAUAAAAUG-3’ （配列番号３２）（ＦＡＮ１ＡＳＯ１、２６ｎｔ、１３Ｕ、８Ａ、５ＧＣ）
3’-GUCGGUCUCCCACCGAUUUAAAUUA-5’ （配列番号３３）（標的ＰＡＳ１エクソン４残基１１７３～１１４９）
5’-CAGCCAGAGGGUGGCUAAAUUUAAU-3’ （配列番号３４）（ＦＡＮ１ＡＳＯ２、２５ｎｔ、バランスの良い配列）
3’-AAAUAACUUCAUGAAAAAUUUUUAG-5’ （配列番号３５）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０００～９７６）
5’-UUUAUUGAAGUACUUUUUAAAAAUC-3’ （配列番号３６）（ＦＡＮ１ＡＳＯ３、２５ｎｔ、１２Ｕ、９Ａ、４ＧＣ）
3’-GUUAAUUAAUGUUCAUACAUUAAAUAA-5’ （配列番号３７）（標的ＰＡＳ２エクソン４残基１０２１～９９５）
5’-CAAUUAAUUACAAGUAUGUAAUUUAUU-3’ （配列番号３８）（ＦＡＮ１ＡＳＯ４、２７ｎｔ、１２Ｕ、１１Ａ、４ＧＣ）
【0179】
ＦＡＮ１－２０２ ｍＲＮＡおよびＦＡＮ－２０３ ｍＲＮＡの両方のエクソン４の二次構造の予測を、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅオンラインサーバを使用して行い、両方のＰＡＳ配列が信頼性の高いヘアピン構造の一部として存在することが見出された。上位２０個の予測配列の全てに存在するヘアピンの残基１１０５～１１５５。ＰＡＳ配列（AUUAAA、（配列番号１５））は、３’末端に存在する（残基１１４９～１１５４）。
【0180】
残基９９３～１０２２は、ＦＡＮ１－２０３エクソン４については上位１９個の予測配列中、同様に、より長いＦＡＮ１－２０２エクソン４については上位２０個の予測配列中の１９個の予測配列中に現れるヘアピンを形成する。ＰＡＳ（AAUAA、（配列番号４０））は、５’末端に配置されている（残基９９５～１０００）。
【0181】
これらの構造は、潜在的に、ＰＡＳを隔離し、ｍＲＮＡ切断およびポリアデニル化機構によるアクセスを防止することができる。この所見は、これらのＰＡＳ部位がわずかな時間しか使用されない理由を説明し得る。これらの構造およびその隣接領域を標的にするいくつかのＡＳＯ配列をデザインしている（図２６）。
【0182】
実施例４：ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１３～１４中のｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５を標的にするために３Ｄ－ＡＳＯをデザインする
この実施例は、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１３～１４（エクソン１３と１４との間）中の推定ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピン（ｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５、ゲノム座標Ｘ３２，５８３，６５６～３２，５８３，７５２）を標的にする本発明の実施形態を例証する。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、転写終結シグナルとしての機能を果たすことが示されている１。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡプロセシング機序（マイクロプロセッサ複合体）によるＭＩＲ３９１５ヘアピンの切断が、ジストロフィン転写を終結させ、それにより、ジストロフィン発現を制御するための機序であるという仮説がある。この着想と一致して、２つのＤＭＤ転写物であるＤＭＤ－２２３およびＤＭＤ－２１４は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５のすぐ下流で終結している。ＤＭＤ－２１４およびＤＭＤ－２２３は、機能的ジストロフィンタンパク質を産生すると予想されない。特定の理論や作用機序に拘束されないが、この機序は、マイクロプロセッサ複合体によるｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５切断の阻害によって転写終結を軽減し、未熟な転写終結を軽減し、したがって、より長く機能的なジストロフィンタンパク質の産生を増加させるための３Ｄ－ＡＳＯを開発することができることを示唆している。
この実施例は、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１３～１４（エクソン１３と１４との間）中の推定ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピン（ｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５、ゲノム座標Ｘ３２，５８３，６５６～３２，５８３，７５２）を標的にする本発明の実施形態を例証する。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、転写終結シグナルとしての機能を果たすことが示されている１。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡプロセシング機序（マイクロプロセッサ複合体）によるＭＩＲ３９１５ヘアピンの切断が、ジストロフィン転写を終結させ、それにより、ジストロフィン発現を制御するための機序であるという仮説がある。この着想と一致して、２つのＤＭＤ転写物であるＤＭＤ－２２３およびＤＭＤ－２１４は、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５のすぐ下流で終結している。ＤＭＤ－２１４およびＤＭＤ－２２３は、機能的ジストロフィンタンパク質を産生すると予想されない。特定の理論や作用機序に拘束されないが、この機序は、マイクロプロセッサ複合体によるｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５切断の阻害によって転写終結を軽減し、未熟な転写終結を軽減し、したがって、より長く機能的なジストロフィンタンパク質の産生を増加させるための３Ｄ－ＡＳＯを開発することができることを示唆している。
【0183】
３Ｄ－ＡＳＯをデザインするために、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３９１５の二次構造予測を、図２７Ｃおよび２７Ｄに示すように最初に行った。
【0184】
３Ｄ－ＡＳＯデザイン
図２７Ｄを参照のこと。
図２７Ｄを参照のこと。
【0185】
実施例４の参考文献
１．Ｄｈｉｒ，Ａ．，Ｄｈｉｒ，Ｓ．，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．＆Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｈｏｓｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２，３１９－３２７（２０１５）。
１．Ｄｈｉｒ，Ａ．，Ｄｈｉｒ，Ｓ．，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．＆Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｈｏｓｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２，３１９－３２７（２０１５）。
【0186】
本明細書中で言及した全ての刊行物（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ ［プレプリント］．２０２１ Ａｕｇ ２４：２０２１．０８．２３．４５７４３４．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０８．２３．４５７４３４．ＰＭＩＤ：３４４６２７４６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８４０４８８８；２０２０年１１月１９日に出願され，発明の名称が「ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ－ＢＡＳＥＤ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＲＮＡ ＨＡＩＲＰＩＮ ＬＯＯＰＳ」であるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／６１２９９号，カナダ特許第２，４５９，３４７号、およびＧｅｎｎｅｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１３，ｅａｂｅ９１１７（２０２１）１２ Ｍａｙ ２０２１）は、引用した刊行物と併せて態様、方法、および／または材料を開示し説明するために本明細書中で参考として援用される。
【0187】
本明細書中に開示のプロセスによって作製された例証となる３Ｄ－ＡＳＯ産物
【化12-1】
【化12-2】
【化12-3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図28】
【国際調査報告】